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EP3389373A1 - Modèle d'étude animal du cancer - Google Patents

Modèle d'étude animal du cancer

Info

Publication number
EP3389373A1
EP3389373A1 EP16809852.3A EP16809852A EP3389373A1 EP 3389373 A1 EP3389373 A1 EP 3389373A1 EP 16809852 A EP16809852 A EP 16809852A EP 3389373 A1 EP3389373 A1 EP 3389373A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
embryo
cells
grafted
cancer cells
gallinaceous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP16809852.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Valérie CASTELLANI-LINCONTANG
Céline Delloye-Bourgeois
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to EP22212642.7A priority Critical patent/EP4166653B1/fr
Publication of EP3389373A1 publication Critical patent/EP3389373A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a model for the animal study of cancer cells, especially from solid human tumors, and more particularly melanoma, primary and secondary brain tumors, lung tumors and mammary tumors.
  • the animal models developed for the study of tumors and currently used are essentially murine models.
  • the preparation of these models involves a relatively long realization time, and a significant cost.
  • certain types of cancer cells can not implant in murine animal models.
  • the gallinaceous embryo is an interesting model for performing ex vivo experiments, particularly for the study of embryonic development and for xenotransplantation experiments. It is indeed inexpensive, very accessible and easy to handle. It is a model of choice for the study of proliferation, differentiation and cell migration. This animal model can also be used for the study of tumors.
  • a classical model of the study on the gallinaceous embryo is the transplantation of exogenous cells in the appendages of the embryo, more precisely on the chorioallantoic membrane (CAM).
  • the tumor cells are implanted on the membrane of the chicken embryo. After incubation for about 2 days, a tumor is formed.
  • This tumor benefits from the vascular network of the membrane of the embryo, particularly developed, to grow.
  • Such a system has made it possible to reproduce in vivo human tumors, in particular glioblastoma tumors, exhibiting cellular characteristics and Molecules similar to those observed in tumors in vivo. (Hagedorn et al, 2005)
  • chorio-allantoic membrane cancerous cell transplants were used in particular to determine the metastatic potential of the cancer cells, the grafted cells passing through the membrane being considered most likely to metastasize (US 6,228,345).
  • This chorioallantoic membrane graft model is also widely used to screen therapeutic molecules, especially molecules intended to inhibit tumor angiogenesis (see for example WO 2015/074050).
  • US patent application 2013/0171680 describes the xenografting of human malignant hematopoietic cells in other embryonic appendages: the cancerous cells are injected into the amniotic sac, into the yolk sac, or into the blood vessels of the CAM membrane.
  • Carter et al. (Oncogenesis, 2012) injected human neuroblastoma cells into the blood vessels of a chicken embryo, at the development stage between 3 and 6 days. In contact with the embryonic microenvironment, the cells re-program themselves into a more benign phenotype, especially when they are fixed in the neuronal tissues.
  • the implanted cancer cells are not able to reproduce tumors, nor are they able to reproduce tumors in tissues homologous to those from which said tumors originate.
  • the gallinaceous embryo is an animal model of choice for the ex vivo study of human tumors, the models developed so far do not allow to study the migration of cancer cells within a living organism. or to study tumors in a tissue microenvironment homologous to that of the tumor in vivo.
  • the present invention relates to the development of an animal model for the study of cancers, in particular human cancers, in which cancer cells grafted into a gallinaceous embryo will migrate and create cancerous foci in patients. tissues of the embryo corresponding to the tissues from which the cancer cells are derived (orthoptic grafts), or in other tissues (heterotopic grafts).
  • the present invention relates to a gallinaceous embryo, preferably chicken or quail, in which have been grafted within the tissues of the embryo, in specific sites, cancer cells, said cancer cells not being cancerous cells. neuroblastoma cells, and said tumor-forming cells within the embryo.
  • the graft is characterized in that it is carried out at a determined moment in the development of the embryo, namely at a time between stages HH10 and HH25, and more specifically between stages HH13 and HH15.
  • Such a transplanted embryo is an animal model for studying cancers, making it possible to monitor the migration of cancer cells and the development of tumors within tissues homologous to the tissues from which the cancer cells originate, and / or where these cancerous cells tend to create secondary cancerous foci, that is, to metastasize.
  • transplanted embryo is also an animal model for studying cancers that can implant and / or develop in different tissues of the embryo in a heterotopic manner.
  • the present invention relates to a gallinaceous embryo in which cancer cells have been grafted into the tissues of the embryo, characterized in that the embryo is at a stage of development between the HH10 stage and the HH25 stage. at the time of the transplant, and said cancer cells not being neuroblastoma cells.
  • the present invention relates to a gallinaceous embryo comprising at least one tumor composed of cancerous cells which have been grafted into the tissues of the embryo, characterized in that the embryo is at a stage of development comprised between the stage HHIO and the HH25 stage at the time of transplantation, and said cancer cells not being neuroblastoma cells.
  • the present invention also relates to a method for preparing a gallinaceous embryo in which cancer cells have been grafted and have formed tumors within said embryo, comprising the following steps:
  • the present invention also relates to a method of monitoring a patient having a tumor, comprising:
  • the present invention also relates to a method for screening therapeutic molecules for the treatment of cancer, consisting of the following steps:
  • the present invention also relates to a method for preparing tumors composed of cancer cells, comprising the following steps:
  • cancer cells i. transplanting cancer cells into the tissues of a developing-stage gallinaceous embryo between the HH10 stage and the HH25 stage at the time of transplantation, said cancer cells not being neuroblastoma cells,
  • tumors produced in the embryo can be reused as would be an initial tumor sample, for example for carrying out cell cultures, for implantation into another animal model of cancer, or for biochemical and / or molecular biology analyzes. on said tumors.
  • Figure 1 Representation of the early stages of chicken embryo development, from HH12 (14 somites) to HH25 (52-54 somites).
  • Figure 3 Longitudinal section of a stage 28 chicken embryo at HH16 stage. The extent of the preferred graft sites for each type of cancer cell is shown to the right of the figure.
  • FIG. 1 Graft embryo cross-section.
  • Figure 5 Longitudinal section of transplanted embryo. Localization of cancerous foci 48 hours after the transplantation of human glioma or meduUoblastoma cells over an area ranging from the cervical neural crest (next to somites 1-4) to the tissues bordering the cerebral ventricles of the different brain regions: the cells grafts form tumor masses in the brain tissue.
  • Figure 7 Longitudinal section of embryo grafted after transplantation of human lung cancer cells.
  • Figure 8 Longitudinal section of embryo grafted after transplantation of human breast cancer cells.
  • Extra-cerebral localization of cancerous foci 48 hours after transplantation of human breast cancer cells into areas covering the main presumptive sites of metastases of human breast cancers (periorbital tissue, first branchial arch, hepatic outline, limb outline - sclerotome / dermamyotome): the grafted cells form tumor masses in the cartilage and the bones of the face (periorbital grafts and in the first branchial arch), in the embryonic liver (graft in the hepatic preform) and in tissues derived from somites such as bone tissue (graft into the sclerotome / dermamyotome).
  • gallinaceous refers to a bird of the order Galliformes (or gallinaceous) which includes chickens, quails, turkeys, pheasants, peacocks, guinea fowl, and other barnyard animals.
  • the embryo will be derived from a chicken (gallus gallus) or a quail (Coturnix japonica), two species frequently used in the laboratory.
  • gallinaceous embryo refers to a fertilized gallinaceous egg in which an embryo develops normally, under the appropriate conditions, including being placed in a heated incubator at a temperature between 37 ° C and 39 ° C. The incubation time required to hatch the egg is 21 days.
  • the "recipient” or “receptor” embryo designates a gallinaceous embryo before the graft stage.
  • the embryo “grafted” or “in which cancer cells have been grafted” designates a gallinaceous embryo after the grafting step, and more particularly refers to the embryo grafted after at least 24 hours. incubation hours, in which at least one tumor composed of grafted cancer cells has developed.
  • This grafted embryo object of the invention is a model of animal study of cancer.
  • cancer is meant the pathology characterized by the presence in an organism of malignant cells formed from the transformation, by mutations or genetic instability, of initially normal cells of the body affected by this pathology.
  • graft embryo or “embryo in which cancer cells have been grafted” designates, for the purposes of the invention, a “chimeric embryo”, ie an embryo possessing cells from at least two different organisms: gallinaceous cells, and cancer cells from another organism, becoming part of the embryo following their acceptance as a graft, and continuing their development by forming one or more solid tumors and / or continuing to develop according to a unregulated by the normal controls of cell division, within the tissues of the recipient gallinaceous embryo.
  • the embryo graft is a chimeric embryo since it comprises two cell types from two different organisms; however, it is not a "chimera" in the true sense, the embryo is not intended to develop sufficiently to create an adult organism, but only to support the cancer cells for a short time of time. In any case, it is understood that this embryo of gallinaceous will not give birth to a chimeric living organism, but will be destroyed as soon as the study of the fate of the grafted cancer cells has been completed.
  • graft or “transplantation” refers to the introduction of exogenous cells into a recipient organism into embryonic tissues.
  • this term does not refer to an introduction of exogenous cells into embryonic appendages, such as chorioallantoic membrane, yolk sac or amniotic sac.
  • this term does not refer to an injection of cells into the bloodstream of the embryo.
  • the present application relates in particular to xenografts, which term designates the fact that the cells introduced into the recipient embryo originate from an organism of a species different from that of the recipient embryo.
  • cancer cells The transplantation of cancer cells is carried out under appropriate conditions allowing said cells to reproduce, migrate, and form tumors within the recipient embryo, at relevant sites, either in agreement with their tissue origin or in tissues. different from those usually colonized by this type of cancer cells.
  • These "appropriate conditions” allow the reproduction, within an animal model, of certain aspects of the disease called “cancer", and in particular the formation of tumors.
  • transplant site makes it possible in particular to determine the migration of cancer cells and their implantation in different tissues to form cancerous foci.
  • these cancerous foci are solid tumors.
  • the cancer cells grafted into a tissue will be able to migrate into the grafted embryo according to this graft site and implant in a second tissue distinct from the site.
  • graft hereinafter referred to as "implantation tissue” or “implantation site”, to form at least one tumor.
  • the cells will migrate very locally and establish themselves near the transplant site.
  • orthoptic grafts corresponding to the establishment of cancerous foci in tissues homologous to those in which the cancerous cells in question form primary cancerous foci in the organism from which they arise.
  • These cancerous foci can result either from a direct transplant in the targeted territory, or from a transplant in a migration route leading cells in this territory.
  • the choice of certain specific graft sites makes it possible to direct such targeting of the cancerous cells towards implantation tissues, as exemplified in the present application;
  • втори ⁇ ии ⁇ иров in tissues in which the cancerous cells tend to metastasize can also be desired to reproduce so-called secondary cancerous foci in tissues in which the cancerous cells tend to metastasize; here too, these secondary cancerous foci can be obtained by practicing either a direct graft in the targeted territory, or a transplant in a migration pathway leading the cells in this territory, implantation site;
  • 'heterotopic' grafts correspond to the implantation of a cancerous in a tissue that is distinct from that which houses the cancer cells in the organism from which they originate, whether they come from a primary or secondary tumor (from a metastasis).
  • Such an animal model thus makes it possible to study both the migration of cancer cells and their implantation within specific tissues, or to study cancerous foci formed within hetero tissue tissues.
  • this animal model can initiate the development of certain tumors that can be removed and then transplanted into another animal model, such as a mouse, or be regrafted in the embryo, or be used for the production of crops. and ex vivo 3D models, or to perform biochemical and molecular analyzes.
  • FIG. 1 and 2 stages of development of the gallinaceous embryo have been defined and are shown in Figures 1 and 2. These stages were defined according to the post-fertilization incubation time, and determined according to the criteria defined by Hamburger and Hamilton ( 1951, J Morphol.). Moreover, somites appear as development progresses, each stage is also characterized by a number of somites present.
  • the embryo of gallinaceous, in particular chicken or quail is at a stage of development between stage HH10 and stage HH25.
  • the HH10 stage is observed at about 33 to 38 hours of incubation, and is characterized by the presence of 10 somites.
  • the HH25 stage is observed between 102 and 108 hours of incubation, and is characterized by the presence of 52 to 54 somites (see Figure 1).
  • the gallinaceous embryo in particular chicken or quail, is at a stage of development between the HH12 stage and the HH25 stage, ie at one of the stages shown in FIG.
  • This stage of embryonic development taking place between 40h and 4.5 days post-fertilization, is characterized by many key events of embryogenesis, including the appearance of somites, the subdivision of large brain areas, curvatures different areas of the embryo, and the formation of many organs.
  • the gallinaceous embryo is at a stage of development between the HH10 stage and the HH18 stage, between the HH10 stage and the HH15 stage. between HH12 and HH16.
  • the transplantation of cancer cells is carried out on a recipient gallinaceous embryo at a developmental stage between the HH13 and HH15 stages, ie between 48 and 55 hours post-fertilization, and preferably between 50 and 53 hours post-fertilization (HH14 stage). ).
  • the chicken or quail embryo comprises between 19 and 27 somites.
  • cancer cells refers to malignant cells, that is to say capable of dividing without being subjected to the normal controls of regulation of cell division. Most cancer cells have abnormal characters called 'cyto logical malignancy'.
  • These cells may form one or more growths known in the present application as 'tumors', 'neo-tumors', 'tumor foci', 'cancerous foci', 'tumor clusters' or 'tumor masses', developing within a tumor. or several tissues.
  • tumor is meant excessive cell proliferation resulting in a tissue mass, tending to persist and grow, testifying to its biological autonomy.
  • the present invention relates more particularly to malignant tumors. Malignant tumors usually grow rapidly, and tend to recur after local eradication. Malignant tumors are poorly limited, not encapsulated; their contours are irregular.
  • a living organism with such cancer cells is diagnosed as having cancer.
  • the cancer cells intended to be grafted into the tissues of a recipient embryo originate from a solid malignant tumor or are cancerous hematopoietic cells.
  • these are cancer cells derived from solid malignant tumors.
  • the grafted cancer cells originate from non-pediatric solid tumors.
  • the grafted cancer cells are derived from human malignant tumors developing in adult individuals.
  • the invention relates preferably to an animal model for studying human tumors, the cells are therefore preferably human cancer cells. It is nevertheless possible to use the animal model of the invention for the study of non-human animal tumors, particularly for the study of tumors developing in other mammals than humans.
  • the grafted cancer cells are selected from the group consisting of: melanoma cells, cells derived from primary or secondary brain tumors, pulmonary cancer cells and breast cancer cells.
  • cancer cells selected from HER2 + / ER + mammary tumor cells, prostate cancer cells, sarcoma cells, pediatric glioma cells, and EGFR type lung cancer cells. mutated ".
  • the grafted cancer cells are not melanoma cells.
  • the grafted cancer cells are selected from the group consisting of: cells derived from primary or secondary brain tumors, pulmonary cancer cells and breast cancer cells.
  • the cancer cells can be grafted in the form of:
  • graft in the remainder of the present description a set of cancer cells introduced in a grouped form in the recipient embryo.
  • the grafting of the cancerous cells in the recipient gallinaceous embryo is carried out according to the methods well known to those skilled in the art.
  • the gallinaceous embryo is indeed easily accessible, after making a small opening in the egg shell.
  • the grafting of the cancerous cells is carried out using a micro-injector under pressure (Picopump PV830, World Precision Instruments).
  • Picopump PV830 World Precision Instruments
  • Other cell transplantation techniques within the gallinaceous embryo have been described in the prior art, for example by Kulesa et al. (PNAS, 2006) or by Boulland et al. (JVE, 2010).
  • the cancer cells are grafted in an amount of at least about 1000 cells per graft.
  • the graft comprises an amount of at least 5,000, 10,000, or 15,000 cancer cells per graft.
  • the graft will comprise an amount of cancer cells ranging from about 5,000 to about 75,000 cells per graft, from about 10,000 to about 75,000 cells per graft, or from about 15,000 cells to about 75,000 cells per graft.
  • the graft will comprise about 15,000, about 20,000, about 25,000, about 30,000, about 35,000, about 40,000, about 45,000, about 50,000, about 55,000, about 60,000, about 65,000, about 70,000, or about 75,000 cancer cells.
  • the method for counting cells is well known to those skilled in the art.
  • the number of cells grafted with the microinjector is determined in advance of the graft by counting, using a Malassez counting cell, the number of cells ejected from the capillary, for a time and at a given pressure. .
  • grafts each comprising at least 1000 cancer cells are transplanted on a single receiving embryo.
  • at least two, three, four, five or six grafts are transplanted to a single recipient embryo at appropriate sites.
  • the grafted cancer cells are human cancer cells.
  • the grafted cancer cells are human cells derived from a patient's tumor, that is to say a human individual suffering from cancer.
  • the cancer cells were removed by techniques well known to those skilled in the art, such as biopsy and microsurgery.
  • the grafted cells are advantageously labeled with a dye or express a marker protein.
  • the cells can in particular be labeled with vital dyes such as carbocyanides which have an affinity for the cellular membranes, to which they are incorporated, conferring the cells a red fluorescence.
  • vital dyes such as carbocyanides which have an affinity for the cellular membranes, to which they are incorporated, conferring the cells a red fluorescence.
  • the succinimidyl carboxyfluorescein ester (CFSE) dyes, which emit green fluorescence when they react with intracellular proteins, may also be used.
  • the grafted cancer cells express a marker protein.
  • a marker protein designates a protein encoded by an exogenous gene introduced into the cell by conventional methods of genetic engineering, the expression of this gene being under the control of an active promoter in this cell, and this protein being visible, or being able to react with a chemical reagent to become visible.
  • Many marker proteins are known such as Green Fluorescent Protein (GFP).
  • the gallinaceous embryo is incubated for at least 24 hours according to a standard technique, in a humidity-saturated incubator, at a temperature of between 37 ° C. and 39 ° C., and preferably at about 38 ° C., 5 ° C.
  • the first tumors composed of grafted cancer cells are observed within the grafted embryo.
  • the embryo is incubated after the transplantation of cancer cells for at least 36 hours, at least 48 hours, at least 60 hours, at least 72 hours, at least 4 days, at least 5 days. at least 6 days, at least 7 days, at least 8 days, and up to 20 days in the case of the study of cancer cells migrating slowly and / or having longer kinetics for the formation of tumors, within the transplanted embryo.
  • the embryo is incubated for about 48 to 52 hours after the graft, preferably at a temperature between 37 C and 39 C.
  • the cancer cells are grafted into the recipient embryo at the level of the neural tube, between the somites 1 to 24, and / or in the brain tissues.
  • the neural tube includes the primitive nervous system of embryos. Somites refer to embryonic structures located on both sides of the neural tube and the chord, and are composed of repeating units along the anteroposterior axis of the embryo.
  • the gallinaceous embryo comprises from 19 to 27 somites.
  • the terms “in the neural tube” or “at the level of the neural tube” are synonymous and mean that the cancerous cells are introduced into the tissues constituting the neural tube, and not in the neural tube lumen. (which includes the cerebral ventricles and the central canal of the spinal cord, in which circulates the cerebrospinal fluid).
  • the cancerous cells are grafted within the tissues constituting the neural tube, between the somites 1 to 24.
  • the cancer cells are grafted into the brain tissue.
  • Brain tissue is understood to mean tissue layers composed of neurons, areas bordering the ventricles in which neurons, choroid plexi, and external membranes isolating the brain from outside such as pia mater and arachnoid arise.
  • Brain tissues refer to different brain areas such as: telencephalon, diencephalon, midbrain, cerebral mesenchyme and brainstem.
  • the cancerous cells are grafted into the recipient embryo within the tissues constituting the neural tube, between the somites 1 to
  • the animal model consisting of a gallinaceous embryo grafted with cancer cells is suitable for the study of any type of cancer cells.
  • the animal model is however mainly intended for the study of solid human malignant tumors.
  • cancer cells denotes any type of cancer cells with the exception of neuroblastoma cells, and includes cancerous haematopoietic cells. According to another aspect of the invention, the term “cancer cells” refers to any type of cancer cells with the exception of neuroblastoma cells and melanoma cells, and includes cancerous hematopoietic cells.
  • the cancer cells are selected from the group consisting of: cells derived from primary or secondary brain tumors, lung cancer cells and breast cancer cells.
  • the skilled person is able to determine the optimal transplant site, to guide the migration of cancer cells to a tumor development site is in line with the type of cell, or to to obtain a heterotopic neo-tumor, developing in tissues different from those of origin of the cancerous cells.
  • the cancerous cells can be grafted at certain well-defined sites, in order to be specifically "addressed" in certain tissues of the embryo, where they will implant and form tumors in tissues equivalent to the tissues from which they originate. come, or in tissues where metastatic secondary tumors tend to appear.
  • the cancer cells are grafted into a first tissue distinct from the implantation tissue where the tumor or tumors are formed, the graft in the first tissue directing the grafted cancer cells to the implantation tissue where they constitute the tumor or tumors, in other words where the tumors are established.
  • cancer cells selected from the group consisting of: melanoma cells, cells derived from primary or secondary brain tumors, lung cancer cells and breast cancer cells.
  • the grafted cancer cells are melanoma cells, and are grafted into the dorsal roof of the neural tube or in its lateral proximity, between the so-called 18 to 24 sites.
  • this specific location of the graft makes it possible, after at least 24 hours of incubation, to obtain a grafted embryo where tumors composed of transplanted cells migrate and then develop specifically under the skin, thus reproducing the tissue environment of melanoma cells when they are in their initial organism.
  • grafted cancer cells migrate within the recipient embryo to form neo-tumors in tissues equivalent to the human tissues from which they originate.
  • the cancer cells are derived from primary or secondary brain tumors, and are grafted into the neural tube between the somites 1 to 4, and / or in the brain tissues.
  • cancer cells originating from primary or secondary brain tumors are grafted into the neural tube between somites 1 to 4, or at the level of the brain tissues, in the thickness of the brain tissue or at the border of the cerebral ventricles. .
  • Brain tissue is understood to mean tissue layers composed of neurons, areas bordering the ventricles in which neurons, choroid plexi, and external membranes isolating the brain from outside such as pia mater and arachnoid arise.
  • At least two grafts of cancer cells derived from primary or secondary brain tumors are grafted into the neural tube between the somites 1 to 4 and the other at the level of the brain tissues.
  • primary brain tumors refers in particular to tumors such as those observed in glioma, glioblastoma or medulloblastoma.
  • secondary brain tumor is meant a tumor formed in the brain following the dissemination of metastatic cancer cells from a so-called 'primary' tumor. This primary tumor can be found in different organs.
  • the following cancers are those that spread most often to the brain: lung, breast, melanoma, kidney, testis, colorectal, bronchial tubes, lymphoma (especially non-Hodgkin's lymphoma) and leukemia.
  • these two specific locations of the graft make it possible, after at least 24 hours of incubation, to obtain a grafted embryo where tumors composed of transplanted cells develop specifically in the brain tissues, thus reproducing the environment. Tissue glioma cells, glioblastoma or medulloblastoma, when these are in their initial organism.
  • the cancer cells are derived from pulmonary tumors and are grafted into the neural tube between the so-called 4 to 24 sites.
  • this specific location of the graft makes it possible, after at least 24 hours of incubation, to obtain a grafted embryo where tumors composed of transplanted cells develop specifically in the ventral horn of the neural tube and the adjoining mesenchyme.
  • This formation site which corresponds to a region of the central nervous system, is an alternative to the site of formation of brain metastases. It is therefore representative of the implantation of a secondary cancerous tumor in the nervous system.
  • the cancer cells are derived from mammary tumors (breast cancer) and are grafted into the neural tube between somites 4 to 24.
  • this specific location of the graft makes it possible, after at least 24 hours of incubation, to obtain a grafted embryo where tumors composed of transplanted cells develop specifically in the brain tissues, especially near the layer. skin.
  • the present invention also relates to a method for preparing a gallinaceous embryo in which cancer cells have been grafted and have formed tumors within said embryo, comprising the following steps:
  • HH10 and the HH25 stage at the time of transplantation and said cancer cells not being neuroblastoma cells.
  • the graft is made in the neural tube between the somites 1 to
  • the grafted embryo is incubated for about 48 to 52 hours after the graft, at a temperature between 37 ° C and 39 ° C.
  • the cancer cells are derived from a tumor taken from a patient, and are grafted in an amount of at least 1000 cells / graft.
  • the graft is performed according to the particular conditions detailed above.
  • the present invention also relates to a method of monitoring a patient having cancer, comprising:
  • the present invention also relates to a method for monitoring a patient presenting a tumor, in particular a solid malignant tumor, comprising:
  • tumor patient a human being afflicted with cancer and having a solid tumor on a given organ.
  • Such a method makes it possible to follow, ex vivo, the development of the solid tumor of a patient, and in particular the tumorigenesis index of its cancerous cells at an instant TB (for example, before the start of a treatment) and a moment Tl, T2, T3 (for example, a few months after the start of treatment of the patient).
  • the method can of course be repeated the number of times necessary to follow the evolution of the tumor in a given patient.
  • the present invention also relates to a method for screening therapeutic molecules for the treatment of cancer, consisting of the following steps:
  • candidate therapeutic molecule a chemical or biological molecule potentially effective for treating the cancer concerned.
  • Step b) can be performed in several ways: the molecule can be administered to the embryo before or after the cancer cell transplant has been performed.
  • the therapeutic molecule can be injected into the vascular network of the embryo, can be incorporated into the yolk sac, or can be used on the graft before or at the time of performing the transplant.
  • the cancer cells to be grafted onto the recipient embryo are incubated with a therapeutic molecule before / during the transplant on the recipient embryo.
  • the assessment of the malignancy of the cancer cells is carried out by the approaches described above, after removal of the cancer cells developing in the transplanted embryo.
  • this molecule can be carried out for different durations, especially for at least 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, and up to 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days. , 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days until the egg hatches, provided that the tumors are always present in the gallinaceous embryo.
  • the present invention also relates to the use of a gallinaceous embryo according to the invention, to allow the development of tumors composed of cancer cells.
  • liver cancer cells liver cancer cells, prostate cancer cells, and cells derived from low proliferative cancers such as HER2 + / ER + mammary tumor cells, sarcoma cells and pediatric brain tumor cells.
  • the present animal model advantageously allows the development of tumors composed of cancer cells, said cancer cells generally having difficulty to implant after being grafted into a mammalian animal model.
  • the present invention therefore relates to a method for preparing tumors composed of cancer cells, comprising the following steps:
  • the tumors thus harvested can then be used as would be an initial tumor sample, for example for carrying out cell cultures, to be implanted in another animal model, or for performing biochemical and / or molecular biology analyzes of said tumors.
  • the grafted cancer cells are not neuroblastoma cells or melanoma cells.
  • the grafted cancer cells are chosen from the group consisting of: cells derived from primary or secondary brain tumors, pulmonary cancer cells and breast cancer cells.
  • the grafted cancer cells are chosen from: HER2 + / ER + mammary tumor cells, prostate cancer cells, sarcoma cells, pediatric glioma cells, and "mutated EGFR" lung cancer cells.
  • Human lung cancer cells (A549 line), melanoma line (A375P line), glioblastoma (U251 line), meduUoblastoma line (DEV line) and breast cancer (MDA line MB 436) were genetically engineered to stably express the GFP fluorescent protein.
  • Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) were purchased from a supplier (EARL Morizeau, Dangers, France) and kept at 14 ° C until use. The eggs were incubated at 38.5 ° C for 52 hours in a saturated humidity incubator, to obtain embryos at the HH14 development stage.
  • the cell suspension was inserted into a glass microcapillary and cells were deposited using a micro-injector under pressure in each embryo (Picopump PV830, World Precision Instruments).
  • the eggs were then returned to the incubator at 38.5 C for 48 hours.
  • HH10 (10 somites), HH11 (13 somites) and HH14 (22 somites).
  • Embryos were harvested and fixed in 4% paraformaldehyde, on the night at
  • the embryos were cut for longitudinal cross-sections and sagittal sections.
  • the sections were kept in PBS at 4 C in the dark until use.
  • the localization of the tumors was studied by different markings and / or detection of the fluorescence of the cancer cells previously transformed to express the GFP (green fluorescent protein).
  • the labeling consists of incubating the cells in a vital fluorescent dye, CFSE, prior to transplantation. Several concentrations of this vital dye have been tested, making it possible to optimize the detection of the tumor masses formed in the embryo after the transplant.
  • CFSE vital fluorescent dye
  • the tumors are removed by microdissection and subjected to various analyzes:
  • the sections were analyzed using a confocal microscope (Olympus 1X81). The entire image of the section has been reconstructed using the XuvTools software.
  • the embryos were also analyzed using a LaVision Biotec ultramicroscope. The embryos were scanned and the tumor restored in 3D, allowing an analysis of volume and anatomical location.
  • human lung cancer cells (line A549), melanoma (line A375P), glioblastoma (line U251), medulloblastoma (line DEV) and breast cancer (line MDA MB 436) , expressing GFP or labeled with a vital stain, were grafted into a stage HH14 chicken embryo. Additional experiments were performed at earlier stages, HH10, HH11 and HH13.
  • the melanoma cells were grafted at the dorsal roof of the neural tube, between sites 18 to 24.
  • the glioblastoma and medulloblastoma cells were grafted on an area ranging from the cervical neural crest (next to somites 1-4) to the brain tissue bordering the cerebral ventricles of the different brain regions.
  • the glioblastoma and medulloblastoma cells form tumor masses in the brain, as well as in the tissue lining the cerebral ventricles. These tumors are established in the brain, similar to the tumors observed in patients. (Figure 5). Cancer cells migrate into the brain to establish new foci. Pulmonary cancer cells have been transplanted into the brain, in different parts of the brain territories. These cells were also grafted into the lateral mesenchyme opposite the vagal and truncal neural ridges (so-called 4 to 24).
  • the somite-grafted lung cancer cells form tumor clusters in the ventral horn of the neural tube and its adjacent lateral territory.
  • Figure 6 and Figure 7A Cancer cells grafted into brain tissue establish tumor masses in the brain, from which metastases that colonize new areas of the brain and more rostral territories of the embryo develop.
  • Figure 7B illustrates lung tumor cell transplantation in areas covering the main presumptive sites of human lung cancer metastasis:
  • the cells thus grafted form tumor masses in the cartilage and the bones of the face (periorbital grafts and in the first branchial arch), in the embryonic liver (graft in the hepatic preform) and in tissues derived from somites such as the bone tissue (graft in the sclerotome / dermamyotome). These grafts are called 'heterotopic' because the tumors are formed in tissues different from those of which they originate.
  • Figure 8B illustrates mammary tumor cell transplantation in areas covering the main presumptive sites of human mammary cancer metastasis: - periorbital tissue,
  • the grafted cells form tumor masses in the cartilage and the bones of the face (periorbital grafts and in the first branchial arch), in the embryonic liver (graft in the hepatic preform) and in tissues derived from somites such as tissue. bone (graft in the sclerotome / dermamyotome). These grafts are called 'hetero topical' since the tumors are formed in tissues different from those of which they originate.
  • grafted cancer cells were tested for each type of cancer cells, including amounts of 1000 cells, 3000 cells and 10,000 cells per graft. Tumor formations were observed at each of these concentrations, after 24 and 48 hours of development of the embryo grafted into the egg after transplantation.

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Abstract

La présente invention est relative à un embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées au sein des tissus de l'embryon, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome, et lesdites cellules formant des tumeurs au sein de l'embryon.

Description

MODELE D'ETUDE ANIMAL DU CANCER
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un modèle d'étude animal des cellules cancéreuses, notamment issues de tumeurs solides humaines, et plus particulièrement du mélanome, des tumeurs cérébrales primaires et secondaires, des tumeurs pulmonaires et des tumeurs mammaires.
INTRODUCTION
La modélisation des cancers humains chez l'animal de laboratoire est une problématique centrale dans le cadre des tests précliniques accompagnant le développement de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les critères majeurs retenus pour les modèles animaux développés en ce sens sont la fiabilité du modèle, la rapidité d'exécution et le coût de réalisation.
Les modèles animaux développés pour l'étude des tumeurs et actuellement utilisés sont essentiellement des modèles murins. La préparation de ces modèles implique un temps de réalisation relativement long, et un coût important. De plus, certains types de cellules cancéreuses ne peuvent pas s'implanter dans des modèles animaux murins.
L'embryon de gallinacé, notamment de poulet ou de caille, est un modèle intéressant pour réaliser des expériences ex vivo, en particulier pour l'étude du développement embryonnaire et pour des expériences de xéno-transplantation. Il est en effet peu onéreux, très accessible et facile à manipuler. C'est un modèle de choix pour l'étude de la prolifération, de la différentiation et de la migration cellulaire. Ce modèle animal peut aussi être utilisé pour l'étude des tumeurs.
Un modèle classique d'étude sur l'embryon de gallinacé est la greffe de cellules exogènes au niveau des annexes de l'embryon, plus précisément sur la membrane chorio-allantoïdienne (CAM). Les cellules tumorales sont implantées sur la membrane de l'embryon de poulet. Après incubation d'environ 2 jours, une tumeur se forme. Cette tumeur profite du réseau vasculaire de la membrane de l'embryon, particulièrement développé, pour croître. Un tel système a permis de reproduire in vivo des tumeurs humaines, notamment de glioblastome, présentant des caractéristiques cellulaires et moléculaires semblables à celles observées dans les tumeurs in vivo. (Hagedorn et al, 2005)
Ces greffes de cellules cancéreuses sur la membrane chorio-allantoïdienne ont notamment été utilisées pour déterminer le potentiel métastatique des cellules cancéreuses, les cellules greffées traversant la membrane étant jugées les plus susceptibles de métastaser (US 6,228,345).
Ce modèle de greffe sur membrane chorio-allantoïdienne est également largement utilisé pour cribler des molécules thérapeutiques, notamment des molécules destinées à inhiber l'angiogenèse tumorale (voir par exemple WO 2015/074050).
La demande de brevet US 2013/0171680 décrit la xénogreffe de cellules hématopoïétiques humaines malignes dans d'autres annexes embryonnaires : les cellules cancéreuses sont injectées dans le sac amniotique, dans le sac vitellin, ou dans les vaisseaux sanguins de la membrane CAM.
Jusqu'à présent, peu de travaux ont été réalisés sur des modèles d'embryon de gallinacé greffé avec des cellules cancéreuses au sein des tissus de l'embryon, et non dans ses annexes.
Carter et al. (Oncogenesis, 2012) ont injecté des cellules humaines de neuroblastome dans les vaisseaux sanguins d'un embryon de poulet, au stade de développement compris entre 3 et 6 jours. Au contact du micro-environnement embryonnaire, les cellules se re-programment en un phénotype plus bénin, notamment lorsqu'elles se fixent dans les tissus neuronaux.
Kulesa et collaborateurs (PNAS, 2006) ont décrit la greffe de cellules humaines de mélanome, au niveau des crêtes neurales, dans des embryons de poulet à un stade de développement indiqué comme étant de « 6-8 somites » qui correspond à un stade compris entre HH8.5 et HH9.5 selon la nomenclature de référence. A ce stade de développement de l'embryon, les cellules transplantées ne forment pas de tumeurs, se reprogramment en cellules bénignes et s'intègrent dans des tissus selon le profil de migration des mélanocytes.
Dans ces deux modèles, les cellules cancéreuses implantées ne sont pas capables de reproduire des tumeurs, a fortiori ne sont pas capables de reproduire des tumeurs dans des tissus homologues à ceux dont sont issues lesdites tumeurs. Ainsi, bien que l'embryon de gallinacé soit un modèle animal de choix pour l'étude ex vivo des tumeurs humaines, les modèles développés jusqu'à maintenant ne permettent pas d'étudier la migration des cellules cancéreuses au sein d'un organisme vivant, ni d'étudier les tumeurs dans un micro-environnement tissulaire homologue à celui de la tumeur in vivo.
La présente invention est relative à la mise au point d'un modèle animal pour l'étude des cancers, notamment des cancers humains, dans lequel des cellules cancéreuses greffées au sein d'un embryon de gallinacé vont migrer et créer des foyers cancéreux dans des tissus de l'embryon correspondants aux tissus dont les cellules cancéreuses sont issues (greffes orthoptiques), ou dans d'autres tissus (greffes hétérotopiques).
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un embryon de gallinacé, préférentiellement de poulet ou de caille, dans lequel ont été greffées, au sein des tissus de l'embryon, dans des sites spécifiques, des cellules cancéreuses, lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome, et lesdites cellules formant des tumeurs au sein de l'embryon.
La greffe est caractérisée en ce qu'elle est effectuée à un moment déterminé du développement de l'embryon, à savoir à un moment compris entre les stades HH10 et HH25, et plus spécifiquement entre les stades HH13 et HH15.
Un tel embryon greffé est un modèle animal d'étude des cancers, permettant de suivre la migration des cellules cancéreuses et le développement de tumeurs au sein de tissus homologues aux tissus dont proviennent les cellules cancéreuses, et/ou où ces cellules cancéreuses ont tendance à créer des foyers cancéreux secondaires, c'est-à-dire à métastaser.
Un tel embryon greffé est également un modèle animal d'étude des cancers qui peuvent s'implanter et/ou se développer dans différents tissus de l'embryon, de manière hétérotopique.
Ainsi, la présente invention concerne un embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées au sein des tissus de l'embryon, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome.
Autrement dit, la présente invention concerne un embryon de gallinacé comprenant au moins une tumeur composée de cellules cancéreuses qui ont été greffées au sein des tissus de l'embryon, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HHIO et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées puis ont formé des tumeurs au sein dudit embryon, comprenant les étapes suivantes :
• greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus dudit embryon, et
• incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HHIO et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome.
La présente invention concerne également un procédé de suivi d'un patient présentant une tumeur, comprenant :
a) la préparation d'un premier embryon greffé selon le procédé décrit ci- dessus, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant Ti, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce premier embryon,
b) la préparation d'un second embryon greffé selon le procédé décrit ci-dessus, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant T2, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce second embryon,
c) la comparaison entre la tumorigenèse des tumeurs se développant dans le premier embryon greffé et dans le second embryon greffé.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage de molécules thérapeutiques destinées au traitement d'un cancer, consistant en les étapes suivantes :
a) préparation d'un embryon greffé selon le procédé décrit ci-dessus ; b) administration à cet embryon greffé d'une molécule thérapeutique candidate;
c) appréciation de la malignité des cellules cancéreuses présentes dans cet embryon greffé après administration de ladite molécule candidate.
La présente invention est également relative à un procédé de préparation de tumeurs composées de cellules cancéreuses, comprenant les étapes suivantes :
i. greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus d'un embryon de gallinacé à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome,
ii. incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, et iii. prélèvement desdites tumeurs formées au sein de l'embryon.
Ces tumeurs produites dans l'embryon peuvent être réutilisées comme le serait un prélèvement tumoral initial, par exemple pour la réalisation de cultures cellulaires, pour une implantation dans un autre modèle animal de cancer, ou pour des analyses de biochimie et/ou de biologie moléculaire sur lesdites tumeurs.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1. Représentation des premiers stades de développement de l'embryon de poulet, de HH12 (14 somites) à HH25 (52-54 somites).
Figure 2. Tableau de correspondance des premiers stades de développement des embryons de caille {Japanese quail) et de poulet {chick) en fonction du temps écoulé depuis la fertilisation.
Figure 3. Coupe longitudinale d'un embryon de poulet au stade 28 somites, soit au stade HH16. L'étendue des sites de greffe préférés, pour chaque type de cellules cancéreuses, est présentée à droite de la figure.
Figure 4. Coupe transversale d'embryon greffé.
Localisation des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de mélanome : les cellules greffées au niveau du toit dorsal du tube neural, entre les somites 18 à 24, forment des amas tumoraux au niveau sous-cutané ainsi que dans le mésenchyme bordant le tube neural (Cercles en pointillés).
Figure 5. Coupe longitudinale d'embryon greffé. Localisation des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de gliome ou de méduUoblastome sur une zone allant de la crête neurale cervicale (en regard des somites 1 à 4) jusque dans les tissus bordant les ventricules cérébraux des différents territoires du cerveau: les cellules greffées forment des amas tumoraux dans les tissus cérébraux.
Figure 6. Coupe transversale d'embryon greffé.
Localisation des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de tumeur pulmonaire : les cellules greffées dans le mésenchyme latéral en regard des crêtes neurales vagales et troncales (somites 4 à 24) forment des amas tumoraux dans la corne ventrale du tube neural et le mésenchyme latéral. (Cercles en pointillés).
Figure 7. Coupe longitudinale d'embryon greffé après la greffe de cellules humaines de cancer pulmonaire.
A. Localisation cérébrale des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de cancer pulmonaire sur une zone allant de la crête neurale cervicale (en regard des somites 1 à 4) jusque dans les tissus bordant les ventricules cérébraux des différents territoires du cerveau : les cellules greffées forment des amas tumoraux dans les tissus cérébraux, à l'image des métastases pulmonaires cérébrales chez l'homme.
B. Localisation extra-cérébrale des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de cancer pulmonaire dans des zones couvrant les sites présomptifs principaux de métastases des cancers pulmonaires humains (tissu périorbitaire, premier arc branchial, ébauche hépatique, ébauche des membres - sclérotome/dermamyotome): les cellules greffées forment des amas tumoraux dans le cartilage et les os de la face (greffes périorbitaire et dans le premier arc branchial), dans le foie embryonnaire (greffe dans l'ébauche hépatique) et dans les tissus dérivant des somites tels que le tissu osseux (greffe dans le sclérotome/dermamyotome).
Figure 8. Coupe longitudinale d'embryon greffé après la greffe de cellules humaines de cancer du sein.
A. Localisation cérébrale des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de cancer du sein sur une zone allant de la crête neurale cervicale (en regard des somites 1 à 4) jusque dans les tissus bordant les ventricules cérébraux des différents territoires du cerveau : les cellules greffées forment des amas tumoraux dans les tissus cérébraux. B. Localisation extra-cérébrale des foyers cancéreux 48h après la greffe de cellules humaines de cancer du sein dans des zones couvrant les sites présomptifs principaux de métastases des cancers mammaires humains (tissu périorbitaire, premier arc branchial, ébauche hépatique, ébauche des membres - sclérotome/dermamyotome): les cellules greffées forment des amas tumoraux dans le cartilage et les os de la face (greffes périorbitaire et dans le premier arc branchial), dans le foie embryonnaire (greffe dans l'ébauche hépatique) et dans les tissus dérivant des somites tels que le tissu osseux (greffe dans le sclérotome/dermamyotome).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les termes suivants sont définis pour une meilleure compréhension de l'invention.
Le terme « gallinacé » désigne un oiseau de l'ordre des galliformes (ou gallinacés) qui comprend les poulets, cailles, dindes, faisans, paons, pintades, et d'autres animaux de basse-cour. Préférentiellement, l'embryon sera issu d'un poulet (gallus gallus) ou d'une caille {Coturnix japonica), deux espèces fréquemment utilisées en laboratoire.
Le terme « embryon de gallinacé » désigne un œuf de gallinacé fécondé et dans lequel un embryon se développe normalement, dans les conditions adéquates, notamment en étant placé dans un incubateur chauffé à une température comprise entre 37 °C et 39 °C. Le temps d'incubation nécessaire pour aboutir à l'éclosion de l'œuf est de 21 jours.
Dans le cadre de la présente invention, l'embryon « receveur » ou « récepteur » désigne un embryon de gallinacé avant l'étape de la greffe.
Dans le cadre de la présente invention, l'embryon « greffé » ou « dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées » désigne un embryon de gallinacé après l'étape de la greffe, et plus particulièrement désigne l'embryon greffé après au moins 24 heures d'incubation, dans lequel au moins une tumeur composée de cellules cancéreuses greffées s'est développée. Cet embryon greffé objet de l'invention est un modèle d'étude animal du cancer.
Par « cancer » on entend la pathologie caractérisée par la présence dans un organisme de cellules malignes formées à partir de la transformation, par mutations ou instabilité génétique, de cellules initialement normales de l'organisme atteint par cette pathologie. Le terme « embryon greffé » ou « embryon dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées » désigne au sens de l'invention un « embryon chimérique » c'est à dire un embryon possédant des cellules issues d'au moins deux organismes différents : des cellules de gallinacé, et des cellules cancéreuses issues d'un autre organisme, devenant partie intégrante de l'embryon suite à leur acceptation comme greffon, et poursuivant leur développement en formant une ou des tumeurs solides et/ou en continuant à se développer selon un mode non régulé par les contrôles normaux de la division cellulaire, au sein des tissus de l'embryon de gallinacé receveur.
Il est entendu que l'embryon greffé est un embryon chimérique puisqu'il comprend deux types cellulaires issus de deux organismes différents ; cependant, il ne s'agit pas d'une « chimère » au sens propre, l'embryon n'étant pas destiné à se développer suffisamment de manière à créer un organisme adulte, mais servant uniquement de support aux cellules cancéreuses pendant un court laps de temps. En tout état de cause, il est entendu que cet embryon de gallinacé ne donnera pas naissance à un organisme vivant chimérique, mais sera détruit dès que l'étude du devenir des cellules cancéreuses greffées aura été complétée.
Au sens de l'invention, le terme « greffe » ou « transplantation » désigne l'introduction de cellules exogènes dans un organisme récepteur, au sein de tissus de l'embryon. En particulier, ce terme ne désigne pas une introduction de cellules exogènes dans des annexes de l'embryon, telles que la membrane chorio-allantoïdienne, le sac vitellin ou le sac amniotique. De plus, ce terme ne désigne pas une injection de cellules dans la circulation sanguine de l'embryon.
La présente demande est en particulier relative à des xénogreffes, ce terme désignant le fait que les cellules introduites dans l'embryon receveur sont issues d'un organisme d'une espèce différente de celle de l'embryon receveur.
La greffe de cellules cancéreuses est réalisée dans des conditions appropriées permettant auxdites cellules de se reproduire, de migrer, et de former des tumeurs au sein de l'embryon receveur, à des sites pertinents, soit en accord avec leur origine tissulaire soit dans des tissus différents de ceux habituellement colonisés par ce type de cellules cancéreuses. Ces « conditions appropriées » permettent la reproduction, au sein d'un modèle animal, de certains aspects de la maladie dénommée 'cancer', et notamment la formation de tumeurs.
Ces « conditions appropriées » sont basées sur le stade de développement de l'embryon receveur au moment où la greffe est réalisée, et sur le site de la greffe.
Le choix du site de greffe permet notamment de déterminer la migration des cellules cancéreuses et leur implantation dans différents tissus, pour y former des foyers cancéreux. Préférentiellement ces foyers cancéreux sont des tumeurs solides.
Ainsi, selon une mise en œuvre de l'invention, les cellules cancéreuses greffées dans un tissu (site de greffe) vont pouvoir migrer dans l'embryon greffé en fonction de ce site de greffe et s'implanter dans un second tissu distinct du site de greffe, ci-après dénommé « tissu d'implantation » ou « site d'implantation », pour former au moins une tumeur. Dans certains territoires, les cellules vont migrer très localement et s'implanter à proximité du site de greffe.
Plusieurs cas sont à considérer :
- il peut être souhaitable de pratiquer des greffes dites Orthoptiques' correspondant à l'établissement de foyers cancéreux dans des tissus homologues à ceux dans lesquels les cellules cancéreuses considérées forment des foyers cancéreux primaires dans l'organisme dont elles sont issues. Ces foyers cancéreux peuvent résulter soit d'une greffe directe dans le territoire ciblé, soit d'une greffe dans une voie de migration conduisant les cellules dans ce territoire. Le choix de certains sites spécifiques de greffe permet d'orienter un tel adressage des cellules cancéreuses vers des tissus d'implantation, comme cela est exemplifié dans la présente demande ;
- il peut également être désiré de reproduire des foyers cancéreux dits secondaires, au sein de tissus dans lesquels les cellules cancéreuses ont tendance à métastaser ; là aussi, ces foyers cancéreux secondaires peuvent être obtenus en pratiquant soit une greffe directe dans le territoire ciblé, soit une greffe dans une voie de migration conduisant les cellules dans ce territoire, site d'implantation ;
- enfin, il peut être simplement souhaité de créer des foyers cancéreux s'implantant et se développant dans d'autres types de tissus que ceux d'origine des cellules cancéreuses. Ces greffes dites 'hétérotopiques' correspondent à l'implantation d'un foyer cancéreux dans un tissu qui est distinct de celui qui héberge les cellules cancéreuses dans l'organisme dont elles sont issues, qu'elles soient issues d'une tumeur primaire ou secondaire (issues d'une métastase).
Un tel modèle animal permet donc d'étudier à la fois la migration des cellules cancéreuses et leur implantation au sein de tissus spécifiques, ou d'étudier des foyers cancéreux formés au sein de tissus hétéro logues.
Les principaux avantages de ce modèle animal sont, outre la spécificité des sites d'implantation des foyers cancéreux, son faible coût de revient et sa rapidité de préparation.
En outre, ce modèle animal permet d'initier le développement de certaines tumeurs qui pourront être prélevées puis transplantées dans un autre modèle animal, comme par exemple une souris, ou être regreffées dans l'embryon aviaire, ou encore servir pour la réalisation de cultures et de modèles ex vivo 3D, ou encore pour réaliser des analyses biochimiques et moléculaires.
Stade de développement de l'embryon receveur
Plusieurs stades de développement de l'embryon de gallinacé ont été définis et sont représentés dans les figures 1 et 2. Ces stades ont été définis en fonction du temps d'incubation post-fécondation, et déterminé selon les critères définis par Hamburger et Hamilton (1951, J Morphol.). Par ailleurs, les somites apparaissant au fur et à mesure du développement, chaque stade est également caractérisé par un nombre de somites présentes.
Il est entendu que le développement de l'embryon ne commence que lorsque l'embryon est incubé dans de bonnes conditions, notamment à une température comprise entre 37°C et 39°C. Ainsi, un stade de développement « entre 48 et 55 heures » signifie que l'œuf a été maintenu cette durée dans les conditions optimales pour son développement. Un œuf fertilisé peut être maintenu à 14°C avant d'être placé dans des conditions optimales pour son développement ; cette période d'attente à 14°C n'est pas à prendre en compte dans la durée indiquée ci-dessous.
Selon l'invention, au moment de la greffe, l'embryon de gallinacé, notamment de poulet ou de caille, est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25. Le stade HH10 est observé à environ 33 à 38 heures d'incubation, et est caractérisé par la présence de 10 somites.
Le stade HH25 est observé entre 102 et 108 heures d'incubation, et est caractérisé par la présence de 52 à 54 somites (voir figure 1).
Entre ces deux stades, un événement important est la courbure de l'embryon.
En effet, à partir de l'apparition du 19ème somite (stade HH13), soit environ après 48 heures d'incubation post- fertilisation, la tête de l'embryon ébauche un mouvement de torsion lévogyre qui se propage pendant l'organogenèse, jusqu'à l'extrémité postérieure de l'embryon. La progression de ce mouvement est bien perceptible entre 55 et 68 heures d'incubation.
De préférence, au moment de la greffe, l'embryon de gallinacé, notamment de poulet ou de caille, est à un stade de développement compris entre le stade HH12 et le stade HH25, soit à l'un des stades présentés en figure 1.
Cette phase du développement de l'embryon, prenant place entre 40h et 4.5 jours post-fécondation, est caractérisé par de nombreux événements clefs de l'embryogenèse, parmi lesquels l'apparition des somites, la subdivision des grands territoires du cerveau, les courbures de différents domaines de l'embryon, et la formation de nombreux organes.
Selon un autre aspect préféré, au moment de la greffe, l'embryon de gallinacé, notamment de poulet ou de caille, est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH18, entre le stade HH10 et le stade HH15 ou entre le stade HH12 et le stade HH16.
De préférence, la greffe de cellules cancéreuses est effectuée sur un embryon de gallinacé receveur à un stade de développement compris entre les stades HH13 et HH15 soit entre 48 et 55 heures post-fécondation, et de préférence entre 50 et 53 heures postfécondation (stade HH14).
A ce stade de développement HH13-HH15, l'embryon de poulet ou de caille comprend entre 19 et 27 somites.
Cellules cancéreuses
Au sens de l'invention, le terme « cellules cancéreuses » désigne des cellules malignes, c'est-à-dire capables de se diviser sans être soumises aux contrôles normaux de régulation de la division cellulaire. La plupart des cellules cancéreuses présentent des caractères anormaux dits 'caractères cyto logiques de malignité'.
Ces cellules peuvent former une ou des excroissances appelées dans la présente demande indifféremment 'tumeurs', 'néo-tumeurs', 'foyers tumoraux' 'foyers cancéreux', 'amas tumoraux' ou 'masses tumorales', se développant au sein d'un ou plusieurs tissus.
Par « tumeur » on désigne une prolifération cellulaire excessive aboutissant à une masse tissulaire, ayant tendance à persister et à croître, témoignant de son autonomie biologique. La présente invention concerne plus particulièrement les tumeurs malignes. Les tumeurs malignes ont habituellement une croissance rapide, et ont tendance à récidiver après éradication locale. Les tumeurs malignes sont mal limitées, non encapsulées ; leurs contours sont irréguliers.
Dans le cas des cellules cancéreuses circulantes, notamment sanguines, ces cellules sont caractérisées par une capacité de croissance et de division anarchique, non contrôlée.
Un organisme vivant présentant de telles cellules cancéreuses est diagnostiqué comme présentant un cancer.
Au sens de l'invention, les cellules cancéreuses destinées à être greffées dans les tissus d'un embryon receveur sont issues d'une tumeur maligne solide ou sont des cellules hématopoïétiques cancéreuses.
Selon un aspect préféré de l'invention, il s'agit de cellules cancéreuses issues de tumeurs malignes solides.
Il est entendu qu'au sens de l'invention, toutes les cellules cancéreuses sont concernées, à l'exception des cellules de neuroblastome.
Selon un aspect préféré de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont issues de tumeurs solides non pédiatriques.
Selon un aspect de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont issues de tumeurs malignes humaines se développant chez des individus adultes.
L'invention concerne de manière préférée un modèle animal destiné à étudier des tumeurs humaines, les cellules sont donc de manière préférée des cellules cancéreuses humaines. Il est néanmoins envisageable d'utiliser le modèle animal de l'invention pour l'étude de tumeurs animales non humaines, notamment pour l'étude de tumeurs se développant chez d'autres mammifères que l'être humain. Selon un aspect de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont choisies parmi le groupe constitué de : des cellules de mélanome, des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
II pourra également s'agir de cellules cancéreuses choisies parmi des cellules de tumeur mammaire HER2+/ER+, des cellules de cancer de la prostate, des cellules de sarcomes, des cellules de gliomes pédiatriques, et des cellules de cancer de poumon de type « EGFR muté ».
Selon un aspect de l'invention, les cellules cancéreuses greffées ne sont pas des cellules de mélanome.
Selon encore un autre aspect de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont choisies parmi le groupe constitué de : des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
Pour la préparation de l'embryon de gallinacé greffé, les cellules cancéreuses peuvent être greffées sous la forme de :
cellules en suspension, injectées dans les tissus cibles ;
- morceau solide (bloc) de tissu tumoral ;
aggrégat / homogénat de cellules cancéreuses isolées.
On entend par « greffon » dans la suite de la présente description un ensemble de cellules cancéreuses introduites sous forme groupée dans l'embryon receveur.
La greffe des cellules cancéreuses dans l'embryon de gallinacé receveur s'effectue selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. L'embryon de gallinacé est en effet facilement accessible, après avoir réalisé une petite ouverture dans la coquille de l'œuf En particulier, la greffe des cellules cancéreuses est réalisée à l'aide d'un micro- injecteur sous pression (Picopump PV830, World Précision Instruments). D'autres techniques de transplantation de cellules au sein de l'embryon de gallinacé ont été décrites dans l'art antérieur, par exemple par Kulesa et al. (PNAS, 2006) ou par Boulland et al. (JVE, 2010).
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées en une quantité d'au moins environ 1000 cellules par greffon. Alternativement, le greffon comprend une quantité d'au moins 5000, 10000, ou 15000 cellules cancéreuses par greffon.
Selon une autre alternative, le greffon comprendra une quantité de cellules cancéreuses allant d'environ 5000 à environ 75000 cellules par greffe, d'environ 10000 à environ 75000 cellules par greffe, ou d'environ 15000 cellules à environ 75000 cellules par greffe.
En particulier le greffon comprendra environ 15000, environ 20000, environ 25000, environ 30000, environ 35000, environ 40000, environ 45000, environ 50000, environ 55000, environ 60000, environ 65000, environ 70000, ou encore environ 75000 cellules cancéreuses.
La méthode permettant de comptabiliser les cellules est bien connue de l'homme du métier. En particulier, le nombre de cellules greffées avec le micro -injecteur est déterminé au préalable de la greffe en comptabilisant à l'aide d'une cellule de comptage de Malassez le nombre de cellules éjectées du capillaire, pendant un temps et à une pression donnée.
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, plusieurs greffons comprenant chacun au moins 1000 cellules cancéreuses sont transplantés sur un seul embryon récepteur. En particulier, au moins deux, trois, quatre, cinq ou six greffons sont transplantés sur un seul embryon récepteur, en des sites appropriés.
Selon un mode préféré de mise en œuvre de l'invention les cellules cancéreuses greffées sont des cellules cancéreuses humaines.
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention les cellules cancéreuses greffées sont des cellules humaines issues d'une tumeur de patient, c'est-à- dire d'un individu humain atteint d'un cancer.
Les cellules cancéreuses ont été prélevées par des techniques bien connues de l'Homme du métier, telles que la biopsie et la micro-chirurgie.
Afin de distinguer les cellules cancéreuses greffées au sein de l'embryon de gallinacé, et notamment de suivre leur dispersion et leur capacité de multiplication, les cellules greffées sont avantageusement marquées par un colorant ou expriment une protéine marqueur.
Un tel marquage peut être réalisé à l'aide de colorants. Les cellules peuvent en particulier être marquées grâce à des colorants vitaux tels que des carbocyanides qui ont une affinité pour les membranes cellulaires, auxquelles ils s'incorporent, conférant aux cellules une fluorescence rouge. Les colorants de type succinimidyl esters de carboxyfluorescéine (CFSE), qui émettent une fluorescence verte lorsque qu'ils réagissent avec les protéines intracellulaires pourront également être utilisés.
Selon un aspect particulier de l'invention, les cellules cancéreuses greffées expriment une protéine marqueur.
Une protéine marqueur désigne une protéine codée par un gène exogène introduit dans la cellule par les méthodes classiques de génie génétique, l'expression de ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur actif dans cette cellule, et cette protéine étant visible, ou étant capable de réagir avec un réactif chimique pour devenir visible. De nombreuses protéines marqueurs sont connues telles que la Green Fluorescent Protein (GFP).
Incubation de l'embryon greffé
Suite à la greffe, l'embryon de gallinacé est incubé pendant au moins 24 heures selon une technique standard, dans un incubateur saturé en humidité, à une température comprise entre 37 °C et 39 °C, et de manière préférée à environ 38,5 °C.
Dès 24 heures d'incubation, les premières tumeurs composées de cellules cancéreuses greffées sont observées au sein de l'embryon greffé.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'embryon est incubé après la greffe de cellules cancéreuses pendant au moins 36 heures, au moins 48 heures, au moins 60 heures, au moins 72 heures, au moins 4 jours, au moins 5 jours, au moins 6 jours, au moins 7 jours, au moins 8 jours, et jusqu'à 20 jours dans le cas de l'étude de cellules cancéreuses migrant de façon lente et/ou ayant une cinétique plus longue pour la formation de tumeurs, au sein de l'embryon greffé.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'embryon est incubé pendant environ 48 à 52 heures après la greffe, préférentiellement à une température comprise entre 37 C et 39 C.
Site de la greffe
Selon un aspect préféré de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées dans l'embryon receveur au niveau du tube neural, entre les somites 1 à 24, et/ou dans les tissus cérébraux. Le tube neural comprend le système nerveux primitif des embryons. Les somites désignent les structures embryonnaires situées de part et d'autre du tube neural et de la chorde, et sont composées d'unités répétées le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon. Au stade de développement compris entre 48 et 55 heures post-fécondation, c'est-à-dire entre les stades HH13 et HH15, l'embryon de gallinacé comprend de 19 à 27 somites. Une représentation de l'embryon de poulet à différents stades de développement, allant de 14 à 54 somites, est présentée en figure 1.
Au sens de l'invention, les expressions « dans le tube neural » ou « au niveau du tube neural » sont synonymes et signifient que les cellules cancéreuses sont introduites au sein des tissus constituant le tube neural, et non dans la lumière du tube neural (qui comprend les ventricules cérébraux et le canal central de la moelle épinière, dans lesquels circule le liquide céphalo-rachidien).
Selon un premier aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées au sein des tissus constituant le tube neural, entre les somites 1 à 24.
Selon un deuxième aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées dans les tissus cérébraux. On entend par « tissus cérébraux » les couches de tissus composés des neurones, les zones bordant les ventricules dans lesquels naissent les neurones, les plexi choroïdes et les membranes externes isolant le cerveau de l'extérieur comme la pie-mère et l'arachnoïde.
Les tissus cérébraux désignent les différents territoires du cerveau tels que: télencéphale, diencéphale, mésencéphale, mésenchyme cérébral et tronc cérébral.
Selon un troisième aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées dans l'embryon receveur au sein des tissus constituant le tube neural, entre les somites 1 à
24, et sont également greffées dans les tissus cérébraux.
Selon la présente invention, le modèle animal constitué d'un embryon de gallinacé greffé avec des cellules cancéreuses est adapté pour l'étude de tout type de cellules cancéreuses. Le modèle animal est cependant principalement destiné à l'étude des tumeurs malignes solides humaines.
Il est rappelé qu'au sens de l'invention, le terme « cellules cancéreuses » désigne tout type de cellules cancéreuses à l'exception des cellules de neuroblastome, et inclut les cellules hématopoïétiques cancéreuses. Selon un autre aspect de l'invention, le terme « cellules cancéreuses » désigne tout type de cellules cancéreuses à l'exception des cellules de neuroblastome et des cellules de mélanome, et inclut les cellules hématopoïétiques cancéreuses.
Selon encore un autre aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont choisies parmi le groupe constitué de : des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
Pour chaque type de cellules cancéreuses, l'Homme du métier est en mesure de déterminer le site de greffe optimal, afin d'orienter la migration des cellules cancéreuses vers un lieu de développement de tumeur soit en adéquation avec le type cellulaire concerné, soit afin d'obtenir une néo-tumeur hétérotopique, se développant dans des tissus différents de ceux d'origine des cellules cancéreuses.
En particulier, les cellules cancéreuses peuvent être greffées en certains sites bien définis, afin d'être « adressées » spécifiquement dans certains tissus de l'embryon, où elles s'implanteront et formeront des tumeurs dans des tissus équivalents aux tissus d'où elles proviennent, ou dans des tissus où des tumeurs secondaires métastatiques ont tendance à apparaître.
Selon un aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont greffées dans un premier tissu distinct du tissu d'implantation où se forme la ou les tumeurs, la greffe dans le premier tissu orientant les cellules cancéreuses greffées vers le tissu d'implantation où elles constituent la ou les tumeurs, autrement dit là où les tumeurs s'établissent.
Plusieurs types cellulaires ont été greffés dans un embryon de gallinacé receveur, selon le procédé décrit dans la présente demande, et notamment des cellules cancéreuses choisies parmi le groupe constitué de : des cellules de mélanome, des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
Ainsi :
Selon un premier aspect de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont des cellules de mélanome, et sont greffées dans le toit dorsal du tube neural ou dans sa proximité latérale, entre les so mites 18 à 24.
Comme représenté en figure 4, cet emplacement spécifique de la greffe permet d'obtenir, après au moins 24 heures d'incubation, un embryon greffé où des tumeurs composées de cellules transplantées migrent puis se développent spécifiquement sous la peau, reproduisant ainsi l'environnement tissulaire des cellules de mélanome lorsque celles-ci sont dans leur organisme initial.
Ainsi, les cellules cancéreuses greffées migrent au sein de l'embryon receveur afin de former des néo -tumeurs dans les tissus équivalents aux tissus humains dont elles sont issues.
Selon un second aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, et sont greffées dans le tube neural entre les somites 1 à 4, et/ou dans les tissus cérébraux.
Dans cette mise en œuvre particulière, les cellules cancéreuses issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires sont greffées dans le tube neural entre les somites 1 à 4, ou au niveau des tissus cérébraux, dans l'épaisseur du tissu cérébral ou en bordure des ventricules cérébraux.
On entend par « tissus cérébraux » les couches de tissus composés des neurones, les zones bordant les ventricules dans lesquels naissent les neurones, les plexi choroïdes et les membranes externes isolant le cerveau de l'extérieur comme la pie-mère et l'arachnoïde.
Dans une mise en œuvre particulière, au moins deux greffons de cellules cancéreuses issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires sont greffées l'un dans le tube neural entre les somites 1 à 4, et l'autre au niveau des tissus cérébraux.
Le terme « tumeurs cérébrales primaires» désigne notamment des tumeurs telles que celles observées dans le gliome, le glioblastome ou le médulloblastome.
Par « tumeur cérébrale secondaire », on entend une tumeur formée dans le cerveau, suite à la dissémination de cellules cancéreuses métastatiques issues d'une tumeur dite 'primaire'. Cette tumeur primaire peut se trouver dans différents organes. Les cancers suivants sont ceux qui se propagent le plus souvent au cerveau : poumon, sein, mélanome, rein, testicule, colorectal, bronches, lymphome (surtout le lymphome non hodgkinien) et leucémie.
Comme représenté en figure 5, ces deux emplacements spécifiques de la greffe permettent d'obtenir, après au moins 24 heures d'incubation, un embryon greffé où des tumeurs composées de cellules transplantées se développent spécifiquement dans les tissus cérébraux, reproduisant ainsi l'environnement tissulaire des cellules de gliome, glioblastome ou de médulloblastome, lorsque celles-ci sont dans leur organisme initial. Selon un troisième aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont issues de tumeurs pulmonaires et sont greffées dans le tube neural entre les so mites 4 à 24.
Comme représenté en figures 6 et 7 A, cet emplacement spécifique de la greffe permet d'obtenir, après au moins 24 heures d'incubation, un embryon greffé où des tumeurs composées de cellules transplantées se développent spécifiquement dans la corne ventrale du tube neural et le mésenchyme attenant. Ce site de formation, qui correspond à une région du système nerveux central, est une alternative au site de formation des métastases cérébrales. Il est donc représentatif de l'implantation d'une tumeur cancéreuse secondaire dans le système nerveux.
Selon un quatrième aspect de l'invention, les cellules cancéreuses sont issues de tumeurs mammaires (de cancer du sein) et sont greffées dans le tube neural entre les somites 4 à 24.
Comme représenté en figure 7B, cet emplacement spécifique de la greffe permet d'obtenir, après au moins 24 heures d'incubation, un embryon greffé où des tumeurs composées de cellules transplantées se développent spécifiquement dans les tissus cérébraux, notamment à proximité de la couche cutanée.
Procédés
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées puis ont formé des tumeurs au sein dudit embryon, comprenant les étapes suivantes :
• greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus d'un embryon de gallinacé, et
• incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade
HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome.
Avantageusement, la greffe est réalisée dans le tube neural entre les somites 1 à
24 et/ou dans les tissus cérébraux.
Avantageusement, l'embryon greffé est incubé pendant environ 48 à 52 heures après la greffe, à une température comprise entre 37 °C et 39 °C. Avantageusement, les cellules cancéreuses sont issues d'une tumeur prélevée sur un patient, et sont greffées en une quantité d'au moins 1000 cellules / greffon.
Avantageusement, la greffe est effectuée selon les conditions particulières détaillées précédemment.
La présente invention concerne également un procédé de suivi d'un patient présentant un cancer, comprenant :
a) la préparation d'un premier embryon greffé selon le procédé précédemment décrit, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant Ti, et l'appréciation de l'indice de malignité des cellules cancéreuses se développant dans ce premier embryon, b) la préparation d'un second embryon greffé selon le procédé précédemment décrit, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant T2, et l'appréciation de l'indice de malignité des cellules cancéreuses se développant dans ce second embryon, c) la comparaison entre l'indice de malignité des cellules cancéreuses se développant dans le premier embryon et dans le second embryon.
« L'appréciation de l'indice de malignité» est effectuée par plusieurs approches complémentaires ; après prélèvement des cellules cancéreuses se développant dans l'embryon greffé, celles-ci sont soumises à différentes analyses :
- des études biochimiques et transcriptomiques, et
- des études in vitro via leur remise en culture.
Ces différentes analyses permettent notamment de déterminer l'indice de malignité relatif aux facteurs suivants :
• Détermination de l'index prolifératif des cellules cancéreuses par détection du marqueur Ki67 ;
• Détermination de l'index de mort cellulaire des cellules par détection des événements de mort cellulaire (fragmentation de l'ADN, nécrose, relargage du cytochrome c, activation des protéases pro-apoptotiques)
• Analyse du transcriptome et du protéome des cellules ;
• Etude du comportement cellulaire après remise en culture.
L'analyse combinée de tous ces facteurs, bien connus de l'homme du métier, permet de déterminer un 'indice de malignité' qui permet de quantifier la gravité et l'agressivité du cancer. En effet, l'ensemble de ces paramètres permet d'évaluer l'état de différenciation des cellules cancéreuses ainsi que leur capacité à proliférer et à se disséminer dans l'organisme. Ces paramètres font partie intégrante de la classification anatomo-pathologique des cellules cancéreuses sur lesquels s'appuient les cliniciens pour orienter la prise en charge thérapeutique.
La présente invention concerne également un procédé de suivi d'un patient présentant une tumeur, notamment une tumeur maligne solide, comprenant :
a) la préparation d'un premier embryon greffé selon le procédé précédemment décrit, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant Ti, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce premier embryon,
b) la préparation d'un second embryon greffé selon le procédé précédemment décrit, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant T2, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce second embryon,
c) la comparaison entre la tumorigenèse des tumeurs se développant dans le premier embryon et dans le second embryon.
Par « patient présentant une tumeur», on entend un être humain affecté d'un cancer et présentant une tumeur solide sur un organe donné.
« L'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs » est effectuée par plusieurs approches complémentaires ; après prélèvement des tumeurs apparues dans l'embryon greffé par microdissection, celles-ci sont soumises à différentes analyses :
- des études biochimiques et transcriptomiques, et
- des études in vitro via leur remise en culture.
Ces différentes analyses permettent notamment de déterminer les « facteurs de tumorigenèse » suivants :
• Localisation des foyers tumoraux par analyse histologique ;
• Mesure du volume tumoral à partir d'images reconstruites en 3 dimensions ;
· Détermination de l'index prolifératif au sein des foyers tumoraux par détection du marqueur Ki67 ; • Détermination de l'index de vascularisation des foyers tumoraux par détection de marqueurs d'angiogenèse ;
• Détermination de l'index de mort cellulaire au sein des foyers tumoraux par détection des événements de mort cellulaire (fragmentation de l'ADN, nécrose, relargage du cytochrome c, activation des protéases pro- apoptotiques)
• Analyse du transcriptome et du protéome des tumeurs extraites in situ ;
• Etude du comportement cellulaire après remise en culture.
L'analyse combinée de tous ces facteurs, bien connus de l'homme du métier, permet de déterminer un 'indice de tumorigenèse' qui permet de quantifier la gravité et l'agressivité de la tumeur. En effet, l'ensemble de ces paramètres permet d'évaluer l'état de différenciation des cellules cancéreuses ainsi que leur capacité à proliférer et à se disséminer dans l'organisme. Ces paramètres font partie intégrante de la classification anatomo-pathologique des tumeurs sur lesquels s'appuient les cliniciens pour orienter la prise en charge thérapeutique.
Ainsi, il est possible de distinguer :
- des tumeurs se développant suite à la greffe, dans un embryon de gallinacé, de cellules cancéreuses issues d'un patient à un instant Tl, et
- des tumeurs se développant suite à la greffe, dans un embryon de gallinacé, de cellules cancéreuses issues d'un patient à un instant T2.
Un tel procédé permet de suivre de manière ex vivo le développement de la tumeur solide d'un patient, et notamment l'indice de tumorigenèse de ses cellules cancéreuses à un instant To (par exemple, avant le début d'un traitement) et à un instant Tl, T2, T3 (par exemple, quelques mois après le début du traitement du patient).
Le procédé peut naturellement être répété le nombre de fois nécessaire pour suivre l'évolution de la tumeur chez un patient donné.
La présente invention concerne également un procédé de criblage de molécules thérapeutiques destinées au traitement d'un cancer, consistant en les étapes suivantes :
a) préparation d'un embryon greffé selon le procédé précédemment décrit; b) administration à cet embryon d'une molécule thérapeutique candidate; c) appréciation de la malignité des cellules cancéreuses présentes dans cet embryon après administration de ladite molécule candidate. Par « molécule thérapeutique candidate » on entend une molécule chimique ou biologique potentiellement efficace pour traiter le cancer concerné.
L'étape b) peut être réalisée de plusieurs manières : la molécule peut être administrée à l'embryon avant ou après que la greffe de cellules cancéreuses ait été effectuée. En particulier, la molécule thérapeutique peut être injectée dans le réseau vasculaire de l'embryon, peut être incorporée dans le sac vitellin, ou peut être utilisée sur le greffon avant ou au moment de la réalisation de la greffe.
Selon cet aspect de l'invention, les cellules cancéreuses destinées à être greffées sur l'embryon receveur sont incubées avec une molécule thérapeutique avant/pendant la greffe sur l'embryon receveur.
L'appréciation de la malignité des cellules cancéreuses est effectuée par les approches décrites ci-dessus, après prélèvement des cellules cancéreuses se développant dans l'embryon greffé. La comparaison de la malignité des cellules cancéreuses au temps T0 et des cellules cancéreuses après au moins 24 heures, et en particulier après 1 (Tl), 2 (T2) ou 3 (T3) jours d'administration de la molécule testée, permet de déterminer l'effet de la molécule thérapeutique administrée.
Naturellement l'administration de cette molécule peut être réalisée pendant différentes durées, notamment pendant au moins 24h, 48 h, 72 h, 96 h, et jusqu'à 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 16 jours, 17 jours, 18 jours, 19 jours, 20 jours, 21 jours soit jusqu'à l'éclosion de l'œuf, sous réserve que les tumeurs soient toujours présentes dans l'embryon de gallinacé.
Il est entendu qu'après les différents tests effectués, l'embryon est sacrifié selon les règles éthiques en vigueur.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un embryon de gallinacée selon l'invention, pour permettre le développement de tumeurs composées de cellules cancéreuses.
Notamment, il est possible d'obtenir le développement in vivo de tumeurs composées de cellules cancéreuses dans l'embryon de gallinacé selon l'invention, alors que ces cellules cancéreuses ont des difficultés pour s'implanter et former des tumeurs dans des modèles animaux mammifères, tels que par exemple dans des souris.
En particulier, il a été observé que les cellules cancéreuses suivantes s'implantent difficilement, après un greffe dans des tissus d'animaux mammifères : les cellules de cancer du foie, les cellules de cancer de la prostate, et les cellules issues de cancers peu prolifératifs telles que les cellules issues des tumeurs mammaires HER2+/ER+, les cellules de sarcomes et les cellules de tumeurs cérébrales pédiatriques.
Le présent modèle animal permet avantageusement le développement de tumeurs composées de cellules cancéreuses, lesdites cellules cancéreuses ayant généralement des difficultés pour s'implanter après avoir été greffées dans un modèle animal mammifère.
La présente invention concerne donc un procédé de préparation de tumeurs composées de cellules cancéreuses, comprenant les étapes suivantes :
· greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus d'un embryon de gallinacé à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome,
• incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, et
· prélèvement desdites tumeurs formées au sein de l'embryon.
Les tumeurs ainsi prélevées pourront ensuite être utilisées comme le serait un prélèvement tumoral initial, par exemple pour la réalisation de cultures cellulaires, pour être implantées dans un autre modèle animal, ou pour effectuer des analyses biochimiques et/ou de biologie moléculaire desdites tumeurs.
Selon une mise en œuvre de ce procédé de l'invention, les cellules cancéreuses greffées ne sont pas des cellules de neuroblastome, ni des cellules de mélanome.
Selon encore une autre mise en œuvre du procédé de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont choisies parmi le groupe constitué de : des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
Selon encore une autre mise en œuvre du procédé de l'invention, les cellules cancéreuses greffées sont choisies parmi : des cellules de tumeur mammaire HER2+/ER+, des cellules de cancer de la prostate, des cellules de sarcomes, des cellules de gliomes pédiatriques, et des cellules de cancer de poumon de type « EGFR muté ».
Comme préalablement indiqué, il est entendu qu'après la réalisation des différents procédés selon l'invention, l'embryon de gallinacée est sacrifié selon les règles éthiques en vigueur. EXEMPLES
Les exemples ci-dessous ont pour seule vocation d'illustrer l'invention, et en aucun cas ne limite l'invention aux mises en œuvre particulières décrites ci-dessous. MATERIEL ET METHODES
Lignées cellulaires cancéreuses humaines
Des cellules cancéreuses humaines pulmonaires (lignée A549), de mélanome (lignée A375P), de glioblastome (lignée U251) de méduUoblastome (lignée DEV) et de cancer du sein (lignée MDA MB 436) ont été manipulées génétiquement pour exprimer de façon stable la protéine fluorescente GFP.
Embryons de poulet
Les œufs de poulet {Gallus gallus) fertilisés ont été achetés auprès d'un fournisseur (EARL Morizeau, Dangers, France) et maintenus à 14 °C jusqu'à utilisation. Les œufs ont été incubés à 38,5 °C pendant 52 heures dans un incubateur au taux d'humidité saturé, de façon à obtenir des embryons au stade de développement HH14.
Greffes de lignées cancéreuses humaines dans l'embryon de poulet
5x106 cellules cancéreuses ont été récoltées et re-suspendues dans 30 de milieu.
Après 52 heures d'incubation à 38,5 C, une fenêtre a été découpée dans la coquille afin de visualiser et d'accéder à l'embryon. La membrane vitelline a été découpée au niveau du tube neural et une blessure a été réalisée au niveau du toit du tube neural, face aux somites 20 et 21.
La suspension de cellules a été insérée dans un micro-capillaire en verre et des cellules déposées à l'aide d'un micro-injecteur sous pression dans chaque embryon (Picopump PV830, World Précision Instruments).
Les œufs ont ensuite été replacés dans l'incubateur à 38,5 C pendant 48 heures.
Autres conditions
Plusieurs quantités de cellules cancéreuses greffées dans un embryon ont été testées pour réaliser la greffe : 1000 cellules, 3000 cellules, 10.000 (104) cellules et 5.106 cellules. Différents stades de développement de l'embryon receveur ont également été testés pour le moment de la greffe : stades HH10 (10 somites), HH11 (13 somites) et HH14 (22 somites).
Coupes d'embryons de poulet
Les embryons ont été récoltés et fixés en paraformaldéhyde 4 %, sur la nuit à
4 C. Selon le type d'analyse souhaitée, les embryons ont été coupés pour la réalisation de coupes transversales et sagittales longitudinales. Les coupes ont été maintenues en PBS à 4 C à l'abri de la lumière jusqu'à utilisation. La localisation des tumeurs a été étudiée par différents marquages et/ou détection de la fluorescence des cellules cancéreuses préalablement transformées pour exprimer la GFP (green fluorescent protein).
Le marquage consiste en l'incubation des cellules dans un colorant fluorescent vital, le CFSE, préalablement à la greffe. Plusieurs concentrations de ce colorant vital ont été testées, permettant d'optimiser la détection des masses tumorales formées dans l'embryon après la greffe.
Prélèvement des tumeurs in situ et analyse
Les tumeurs sont prélevées par microdissection et soumises à différentes analyses :
• des études biochimiques et transcriptomiques (caractérisation et recherche de marqueurs moléculaires connus ou nouveaux), et
• des études in vitro via leur remise en culture.
Prise d'images et traitement
Les coupes ont été analysées à l'aide d'un microscope confocal (Olympus 1X81). L'image intégrale de la coupe a été reconstituée en utilisant le logiciel XuvTools.
La tumorigenèse a été appréciée à l'aide de différentes analyses :
• Détermination de la localisation des foyers tumoraux par analyse histologique ;
• Mesure du volume tumoral à partir des images reconstruites en 3 dimensions ;
· Détermination de l'index prolifératif au sein des foyers tumoraux par détection du marqueur Ki67 ; • Détermination de l'index de vascularisation des foyers tumoraux par détection de marqueurs d'angiogenèse ;
• Détermination de l'index de mort cellulaire au sein des foyers tumoraux par détection des événements de mort cellulaire (fragmentation de l'ADN, nécrose, relargage du cytochrome c, activation des protéases pro-apoptotiques) ;
• Analyse du transcriptome et du protéome des tumeurs extraites in situ ;
• Etude du comportement cellulaire après remise en culture.
Les embryons ont également été analysés à l'aide d'un ultramicroscope de marque LaVision Biotec. Les embryons ont été scannées et la tumeur restituée en 3D, permettant une analyse de volume et de localisation anatomique.
RESULTATS
Selon le protocole expérimental décrit ci-dessus, des cellules cancéreuses humaines pulmonaires (lignée A549), de mélanome (lignée A375P), de glioblastome (lignée U251), de médulloblastome (lignée DEV) et de cancer de sein (lignée MDA MB 436), exprimant la GFP ou marquées par un colorant vital, ont été greffées dans un embryon de poulet au stade HH14. Des expériences complémentaires ont été réalisées à des stades plus précoces, HH10, HH11 et HH13.
Les cellules de mélanomes ont été greffées au niveau du toit dorsal du tube neural, entre les so mites 18 à 24.
48 heures après la greffe, les cellules de mélanomes forment des amas tumoraux au niveau sous-cutané ainsi que dans le mésenchyme bordant le tube neural. (Figure 4)
Les cellules de glioblastome et de médulloblastome ont été greffées sur une zone allant de la crête neurale cervicale (en regard des somites 1 à 4), jusqu'aux tissus cérébraux bordant les ventricules cérébraux des différents territoires du cerveau.
48 heures après la greffe, les cellules de glioblastome et de médulloblastome forment des amas tumoraux dans le cerveau, ainsi que dans le tissu bordant les ventricules cérébraux. Ces tumeurs s'établissent dans le cerveau, de façon comparable aux tumeurs observées chez les patients. (Figure 5). Les cellules cancéreuses migrent dans le cerveau pour établir de nouveaux foyers. Les cellules cancéreuses pulmonaires ont été greffées dans le cerveau, en différents endroits des territoires cérébraux. Ces cellules ont également été greffées dans le mésenchyme latéral en regard des crêtes neurales vagales et troncales (so mites 4 à 24).
48 heures après la greffe, les cellules cancéreuses pulmonaires greffées au niveau des somites forment des amas tumoraux dans la corne ventrale du tube neural et son territoire latéral adjacent. (Figure 6 et figure 7A). Les cellules cancéreuses greffées dans les tissus cérébraux établissent des masses tumorales dans le cerveau, à partir desquelles se développent des métastases qui colonisent de nouvelles zones du cerveau ainsi que des territoires plus rostraux de l'embryon.
La figure 7B illustre la greffe de cellules tumorales pulmonaires dans des zones couvrant les sites présomptifs principaux de métastases des cancers pulmonaires humains :
- tissu périorbitaire,
- premier arc branchial,
- ébauche hépatique, et
- ébauche des membres - sclérotome/dermamyotome.
Les cellules ainsi greffées forment des amas tumoraux dans le cartilage et les os de la face (greffes périorbitaire et dans le premier arc branchial), dans le foie embryonnaire (greffe dans l'ébauche hépatique) et dans les tissus dérivant des somites tels que le tissu osseux (greffe dans le sclérotome/dermamyotome). Ces greffes sont dites 'hétérotopiques' puisque les tumeurs se forment dans des tissus différents de ceux dont elles sont originaires.
Les cellules cancéreuses de sein ont été greffées dans le cerveau, en différents endroits. 48h après la greffe, des amas tumoraux sont formés dans les tissus cérébraux. Un deuxième foyer de migration plus rostral que les sites de greffes est présent en superficie du cerveau, à proximité de la couche cutanée (Figure 8A).
Les cellules cancéreuses de sein ont été greffées dans le cerveau d'embryons à différents stades de développement : HH10, HH13 et HH14. Des foyers tumoraux ont été observés dans les tissus cérébraux sur chacun des embryons greffés, environ 48 heures après la greffe.
La figure 8B illustre la greffe de cellules tumorales mammaires dans des zones couvrant les sites présomptifs principaux de métastases des cancers mammaires humains : - tissu périorbitaire,
- premier arc branchial,
- ébauche hépatique,
- ébauche des membres - sclérotome/dermamyotome.
Les cellules greffées forment des amas tumoraux dans le cartilage et les os de la face (greffes périorbitaire et dans le premier arc branchial), dans le foie embryonnaire (greffe dans l'ébauche hépatique) et dans les tissus dérivant des somites tels que le tissu osseux (greffe dans le sclérotome/dermamyotome). Ces greffes sont dites 'hétéro topiques' puisque les tumeurs se forment dans des tissus différents de ceux dont elles sont originaires.
Pour chaque type de cellules cancéreuses, plusieurs quantités de cellules cancéreuses greffées ont été testées, notamment des quantités de 1000 cellules, 3000 cellules et 10.000 cellules par greffon. Des formations de tumeurs ont été observées à chacune de ces concentrations, après 24 et 48h de développement de l'embryon greffé dans l'œuf après la greffe.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées au sein des tissus de l'embryon, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome, et lesdites cellules formant des tumeurs au sein de l'embryon.
2. Embryon de gallinacé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre les stades HH13 et HH15 au moment de la greffe.
3. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'embryon est incubé pendant au moins 24 heures après la greffe.
4. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses sont greffées en une quantité d'au moins 1000 cellules par greffe.
5. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses greffées sont des cellules humaines issues d'une tumeur de patient.
6. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses greffées sont marquées par un colorant ou expriment une protéine marqueur.
7. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses sont greffées dans un premier tissu distinct du tissu d'implantation où se forment les tumeurs, la greffe dans le premier tissu orientant les cellules cancéreuses greffées vers le tissu d'implantation où les tumeurs s'établissent.
8. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses sont greffées dans le tube neural entre les somites 1 à 24 et/ou dans les tissus cérébraux.
9. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses sont greffées dans les tissus cérébraux.
10. Embryon de gallinacé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses greffées sont choisies parmi le groupe constitué de : des cellules de mélanome, des cellules issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, des cellules cancéreuses pulmonaires et des cellules de cancer du sein.
1 1. Embryon de gallinacé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses greffées sont des cellules de mélanome, et sont greffées dans le toit dorsal du tube neural ou dans sa proximité latérale, entre les so mites 18 à 24.
12. Embryon de gallinacé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules cancéreuses greffées sont issues de tumeurs cérébrales primaires ou secondaires, et sont greffées dans le tube neural entre les somites 1 à 4, et/ou dans les tissus cérébraux.
13. Procédé de préparation d'un embryon de gallinacé dans lequel des cellules cancéreuses ont été greffées puis ont formé des tumeurs au sein dudit embryon, comprenant les étapes suivantes :
• greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus d'un embryon de gallinacé, et
• incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, caractérisé en ce que l'embryon est à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, et lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome.
14. Procédé de suivi d'un patient présentant une tumeur, comprenant :
a) la préparation d'un premier embryon greffé selon le procédé de la revendication 13, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant Ti, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce premier embryon,
b) la préparation d'un second embryon greffé selon le procédé de la revendication 13, avec des cellules cancéreuses issues dudit patient à un instant T2, et l'appréciation de la tumorigenèse des tumeurs se développant dans ce second embryon,
c) la comparaison entre la tumorigenèse des tumeurs se développant dans le premier embryon greffé et dans le second embryon greffé.
15. Procédé de criblage de molécules thérapeutiques destinées au traitement d'un cancer, consistant en les étapes suivantes :
a) préparation d'un embryon greffé selon le procédé de la revendication 13 ;
b) administration à cet embryon greffé d'une molécule thérapeutique candidate;
c) appréciation de la malignité des cellules cancéreuses présentes dans cet embryon greffé après administration de ladite molécule candidate.
16. Procédé de préparation de tumeurs composées de cellules cancéreuses, comprenant les étapes suivantes :
• greffe de cellules cancéreuses au sein des tissus d'un embryon de gallinacé à un stade de développement compris entre le stade HH10 et le stade HH25 au moment de la greffe, lesdites cellules cancéreuses n'étant pas des cellules de neuroblastome,
• incubation de l'embryon greffé pendant au moins 24 heures, et
• prélèvement desdites tumeurs formées au sein de l'embryon.
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