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EP3250704A1 - Procede de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en proteines - Google Patents

Procede de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en proteines

Info

Publication number
EP3250704A1
EP3250704A1 EP16705227.3A EP16705227A EP3250704A1 EP 3250704 A1 EP3250704 A1 EP 3250704A1 EP 16705227 A EP16705227 A EP 16705227A EP 3250704 A1 EP3250704 A1 EP 3250704A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biomass
microalgae
seconds
chlorella
soluble fraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP16705227.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Samuel PATINIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corbion Biotech Inc
Original Assignee
Roquette Freres SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres SA filed Critical Roquette Freres SA
Publication of EP3250704A1 publication Critical patent/EP3250704A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types

Definitions

  • the present invention relates to a method for fractionating biomass components of microalgae rich in proteins.
  • chlorella is a potential source of food because it is rich in protein and other essential nutrients.
  • microalgae proteins Given their abundance and their amino acid profile, microalgae proteins are thus considered as an alternative source of soy protein or peas in Food.
  • the protein fraction can also be promoted as a functional agent in the cosmetic or even pharmaceutical industries.
  • these proteins must be extracted from microalgae without impacting their molecular structure.
  • an efficient disintegration process preserving the integrity of the cellular components must maximize not only the yield but also the quality of the extracted products.
  • an optimized wall disintegration method must for example avoid:
  • the cells are agitated in suspension with small spherical particles.
  • the breaking of the cells is caused by shear forces, grinding between the balls, and collisions with beads.
  • This emulsion is generally atomized and the water is removed, leaving a dry powder containing however a heterogeneous mixture consisting of cell debris, interstitial soluble compounds and oil.
  • the difficulty to solve in the use of these cell disruption technologies is the isolation of the only intracellular content (excluding membrane debris, sugars, fibers and fats) and the preservation, inter alia, of the quality protein load.
  • the exposure of biological cells to a pulsed electric field of high intensity can indeed alter the structure of the cell membrane.
  • the external field causes the loading of the membrane.
  • a sufficient transmembrane voltage 0.5-1 V
  • the molecular arrangement of the phospholipids changes, which leads to the membrane losing its role as a barrier, making it permeable.
  • this membrane permeabilization may be reversible or irreversible.
  • This rupture of the membrane then facilitates the release of the cellular contents and, when using a complementary solvent extraction technique, also facilitates the penetration of the solvent into the cell.
  • the Applicant Company has found that this need could be satisfied by combining a thermal permeabilization process of the microalgae cells with centrifugation and precipitation steps by modulating the properties of the medium.
  • the Applicant company thus goes against a technical prejudice that thermal methods of cell disruption, like the shear forces caused by mechanical disintegration, are rather implemented technologies for degrading or denaturing products derived from microalgae. (Richmond, 1986, Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc. - Molina Grima et al., 2003, Recovery of Microalgal Biomass and Metabolites: Process Options and economiess, Biotechnol. Adv. 20: 491-515).
  • the present invention therefore relates to a method of fractionating biomass components of microalgae rich in proteins:
  • the process according to the invention is a process for fractionating the components of a biomass of microalgae rich in proteins of the Chlorella genus, characterized in that it comprises the following steps:
  • thermal permeabilization of the biomass at a temperature between 50 and 150 ° C, preferably between about 80 and 150 ° C, for a period of between about 10 seconds and about 5 minutes, preferably for a period of time between about 5 seconds and about 1 minute, separation between the biomass thus permeabilized and the soluble fraction by a centrifugation technique, more particularly multi-stage centrifugation, - optionally, recovery and clarification of the soluble fraction thus obtained by microfiltration so as to rid it of residual insolubles, purification of the preceding soluble fraction by precipitation, in order to obtain a peptide isolate and a peptide concentrate.
  • a centrifugation technique more particularly multi-stage centrifugation, - optionally, recovery and clarification of the soluble fraction thus obtained by microfiltration so as to rid it of residual insolubles, purification of the preceding soluble fraction by precipitation, in order to obtain a peptide isolate and a peptide concentrate.
  • microalgae of the genus Chlorella are selected from the group consisting of Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana and Chlorella protothecoides, and are more particularly Chlorella protothecoides.
  • the strain is Chlorella protothecoides
  • strain UTEX 250 The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA.
  • the strain is CCAP21 strain 1 / 8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).
  • Cultivation under heterotrophic conditions and in the absence of light typically leads to the production of a biomass of chbrelles having a protein content (evaluated by measurement of the nitrogen content N x 6.25) of 45 to 70% by weight. dry cell weight.
  • a biomass of microalgae enriched in proteins for example having a protein content, expressed in N 6.25 greater than 60%.
  • the applicant company recommends using an original process that it has developed, and which includes:
  • the biomass is then collected by solid-liquid separation, by frontal or tangential filtration or by any other means known to those skilled in the art.
  • the applicant company then recommends washing the biomass so as to eliminate the interstitial soluble compounds by a succession of concentration (by centrifugation) / dilution of the biomass.
  • interstitial soluble compounds means all the soluble organic contaminants of the fermentation medium, for example the water-soluble compounds such as salts, residual glucose, oligosaccharides of degree of polymerization (or DP) 2 or 3 or the peptides.
  • This biomass thus purified of its interstitial soluble compounds is then adjusted preferably to a solids content of between 15 and 30% by weight, preferably at a solids content of between 20 and 30%.
  • the heat treatment is then carried out at a temperature of between 50 and 150 ° C., preferably between approximately 80 and 150 ° C., for a duration of between approximately 10 seconds and approximately 5 minutes, preferably for a duration of between approximately 5 seconds. and about 5 minutes, preferably for about 10 seconds to about 1 minute.
  • the heat treatment is conducted at a temperature of about 140 ° C for about 10 seconds.
  • the heat treatment is conducted at a temperature of about 85 ° C for about 1 minute.
  • This treatment makes it possible to allow the intracellular components to diffuse into the reaction medium.
  • the biomass is preferably cooled to a temperature below 40 ° C, or even chilled around 4 ° C.
  • the applicant company considers that the heat treatment, performed under these operating conditions, could thus act as a membrane embrittlement process that allows the spontaneous release of soluble components of the intracellular compartment, or even the extracellular matrix.
  • organic substances such as carbohydrates (predominantly DP1 and DP2), peptides and polypeptides are drained out of the cell.
  • the process according to the invention therefore does not lead to the formation of an emulsion, but to an aqueous suspension.
  • a lag time may be necessary to allow sufficient diffusion after the heat treatment which permeabilizes the membrane.
  • the permeabilized biomass and the soluble fraction are then separated by a centrifugation technique, more particularly multi-stage centrifugation.
  • the soluble fraction thus obtained may be clarified by microfiltration so as to rid it of the residual insolubles and according to its dry matter, a concentration by evaporation or by any means known to those skilled in the art may be carried out before purification which follows.
  • the resulting soluble fraction is ultimately composed essentially of proteins (50-80% w / w) and carbohydrates (5-25% w / w).
  • the residual biomass from which the solubles have been separated can be valued as a complete ingredient with a rebalanced nutritional profile.
  • the protein content is decreased - because partly driven in the form of peptides in the soluble - and this rebalances the balance in favor of the carbohydrate and lipid fraction.
  • the residual biomass after separation by centrifugation can also be milled (depending on the desired application properties), preferably mechanical grinding.
  • the biomass is stabilized (pH readjusted (around 7), addition of antioxidants 7), it is then heat treated (pasteurization for bacteriological control purposes) before spray drying.
  • a concentration step by evaporation can precede the heat treatment (optimization coupled with drying).
  • the method of the invention leads here to the isolation of peptides of interest, by precipitation by modulating the properties of the medium.
  • the cooling temperature is below 10 ° C, preferably below 4 ° C.
  • the pH in addition to the temperature, the pH must be between 2.5 and 6.5 and preferably be close to pHi, ie between 3 and 5.
  • the ionic strength of the medium can be adapted to promote precipitation.
  • the phenomenon of "salting in” can be attenuated and thus the solubility of the proteins can be reduced (by reducing the solvation layer).
  • a demineralization operation prior to precipitation can be added. This is carried out on cationic and anionic resins, dialysis, filtration or by any means known to those skilled in the art. Conversely, by increasing strongly the ionic strength, the available water decreases by the phenomenon of "Salting out", in this way the proteins tend to precipitate. This mode is not preferred since a pronounced demineralization would then be necessary on the protein isolate thus extracted.
  • the polarity of the medium can be decreased (with dehydration of the medium) by adding an ethanol-type solvent which will generate a more quantitative precipitation of the protein fraction by greatly reducing its solubility. by recovering the precipitated fraction which is then optionally concentrated before drying
  • the separation of the precipitated fraction is carried out by simple decantation and recovery of the heavy phase or optionally by centrifugation under optimum temperature conditions.
  • the pH may be readjusted before drying.
  • the drying is carried out by atomization, lyophilization or by any means known to those skilled in the art.
  • the soluble phase (light phase after separation) can be valorized as such as a protein concentrate (according to its residual protein content) or undergo a purification process again to extract the residual peptides. .
  • the residual peptides can be extracted by modulation of the physico-chemical environment in the same manner as described for the protein isolate.
  • the incorporation of an ethanol-type solvent can be carried out at this stage to generate a precipitation of this residual protein fraction by greatly reducing its solubility.
  • the action of the solvent will be all the more effective if the residue is dehydrated beforehand. This can be done up to a certain dry matter by evaporation or until a complete drying (for example, by atomization).
  • the pH of this fraction may optionally be readjusted then, a concentration by evaporation (which may allow the recycling of the solvent) is optionally performed before spray drying, lyophilization or by any means known to those skilled in the art.
  • strain CCAP21 1 / 8D The Culture Collection ofAlgae and Protozoa, Scotland, UK.
  • Composition of the medium 40 g / l of glucose + 10 g / l of yeast extract.
  • diammonium phosphate 20 g / l
  • magnesium sulfate heptahydrate 12 g / l
  • This fermentation line makes it possible to obtain a biomass having more than 65% of proteins expressed in N, 6.25.
  • the biomass produced according to Example 1 is harvested at a dry cell solids content of 105 g / L with a purity of 80% (purity defined by the ratio between the dry matter of the biomass on total dry matter).
  • the heat treatment is carried out at a moderate scale to limit the partial solubilization of the biomass which sees its purity decrease to 68%.
  • composition of the biomass is as follows:
  • the separation of the solubles resulting from the release by thermal permeabilization of biomass is carried out by centrifugal separation.
  • a slight dilution [0.5: 1] (VeauVmout) is performed online on the second stage (on a configuration with two Alfa Laval FEUX 510 centrifuges in series) with recycling. from the supernatant of the second stage to the first. The supernatant of the first stage is thus recovered and concentrates the clarified solubles.
  • a sample of solubles taken after separation is used for purification to obtain the protein isolate.
  • the pH of the crude solubles is adjusted to 4.5 with phosphoric acid.
  • the heavy phase is then extracted by simple phase separation into a separating funnel with a mass yield of 28% and has a solids content of 37.2%.
  • the distribution of the amino acid profile of the protein isolate is as follows:
  • the isolate is therefore characterized by a richness of about 95% in amino acids consisting essentially of arginine and glutamic acid (based on the analysis of the distribution of total amino acids). Purification of the residue
  • the light phase, after precipitation and separation of the isolate can be purified in order to concentrate the protein fraction having not precipitated (lower molecular weight).
  • this phase is concentrated by evaporation (15mBar - 43 ° C. in the Buchi -215 laboratory rotavapor) to a solids content of 45%. , 4% in order to partially dehydrate the medium to then promote the action of ethanol.
  • the concentrate has the following composition:
  • the pellet is recovered by centrifugation at 4000 g for 10 minutes (Beckman Coulter Avanti J-20 XP).
  • This extract can then be promoted as a protein concentrate.
  • Example 2 The crude solubles obtained in Example 2, which are rich in proteins, are separated from the residual biomass that can be treated by a process that allows its recovery.
  • the biomass extracted to a dry cell solids content of 22% is milled on a Bead Mill horizontal ball mill (NETZSCH LME 500 - 0.6 mm zirconium silicate beads) at a milling rate of 85%.
  • NETZSCH LME 500 - 0.6 mm zirconium silicate beads The biomass extracted to a dry cell solids content of 22% is milled on a Bead Mill horizontal ball mill (NETZSCH LME 500 - 0.6 mm zirconium silicate beads) at a milling rate of 85%.
  • the pH of the cell grind is then adjusted to 7 at 50% potash.
  • Concentration on forced flow evaporator SPX is carried out by continuous feed of a loop where the temperature is adjusted to 75 ° C before the entry of the flash under vacuum with the temperature maintained at 40 ° C where the evaporation takes place.
  • the concentrated biomass is continuously withdrawn from the flash to the UHT SPX module to perform a heat treatment with preheating at 70 ° C and then direct steam injection on a scale of about ten seconds at 140 ° C and cooling at 40 ° C by flash at empty.
  • the biomass is then atomized to a dry matter of 95% on a type GEA Filtermat FMD 200 atomizer.
  • the biomass thus obtained has the following composition:
  • the biomass thus obtained has the advantage of having a balanced nutritional profile at the level of the carbohydrate, protein and lipid fraction.
  • the amino acid profile is, moreover, rebalanced by the elimination upstream of the soluble fraction that is selectively rich in arginine and glutamic acid.
  • the distribution of amino acids in biomass is as follows:

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Abstract

L'invention est relative à un procédé de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en protéines du genre Chlorella, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - fourniture d'une biomasse de microalgues produite par fermentation, - de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels, - perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 0 et 150°C, de préférence 100 et 150°C, pendant une durée comprise entre secondes et 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre 5 secondes et 1 minute, - séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique de centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, - de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, - séparation de la fraction soluble précédente par précipitation, afin d'obtenir un isolat peptidique et un concentrat peptidique.

Description

PROCEDE DE FRACTIONNEMENT DES COMPOSANTS D'UNE BIOMûvSSE DE
MICROALGUES RICHES EN PROTEINES
La présente invention concerne un procédé de fractionnement des composants de la biomasse de microalgues riches en protéines.
Présentation de l'état de l'art
Il est bien connu de l'homme du métier que les chlorelles sont une source potentielle de nourriture, car elles sont riches en protéines et autres nutriments essentiels.
Elles sont décrites comme renfermant 45% de protéines, 20% de matières grasses,
20% de glucides, 5% de fibres et 10% de minéraux et de vitamines.
Etant donné leur abondance et leur profil en acides aminés, les protéines de microalgues sont ainsi considérées comme une source alternative aux protéines de soja ou de pois en Alimentation.
La fraction protéique peut être également valorisée comme agent fonctionnel dans les industries cosmétiques, voire pharmaceutiques.
Cependant, les développements en applications alimentaires des protéines de microalgues n'ont pas été significatifs, car la présence, dans lesdites fractions, de composés indésirables (telle la chlorophylle) conduit à des changements non souhaités de couleur, goût et structure des compositions alimentaires en contenant.
Pour augmenter leur potentialité en applications alimentaires et pour augmenter également leur valeur commerciale, ces protéines doivent donc être extraites des microalgues sans impacter leur structure moléculaire.
Les techniques « douces » d'extraction seraient donc nécessaires pour isoler les protéines de grandes solubilités et de bonnes propriétés technico-fonctionnelles, mais la rigidité des parois des microalgues, notamment des microalgues vertes, s'y oppose fondamentalement car elle perturbe l'extraction et l'intégrité des protéines intracellulaires.
C'est ainsi qu'au contraire des conditions physiques ou chimiques classiquement « dures » sont mises en œuvre pour rompre la paroi des microalgues.
De nombreuses études proposent ainsi des technologies de type dissolution alcaline, extraction par solvants organiques, ou homogénéisation haute pression.
Dans ces choix technologiques, la dénaturation des protéines n'était cependant pas considérée comme gênante, puisque la plupart de ces méthodes étaient développées pour des finalités d'analyses ou destinées à fournir un substrat pour la digestion enzymatique productrice d'hydrolysats protéiques.
Or, un procédé de désintégration efficace préservant l'intégrité des composants cellulaires se doit de maximaliser non seulement le rendement mais aussi la qualité des produits extraits. En d'autres termes, un procédé de désintégration optimisé de la paroi doit par exemple éviter :
la contamination chimique des produits ciblés,
la mise en œuvre d'énergie de rupture trop importante ; celle-ci pouvant occasionner une dégradation ou dénaturation irréversible des molécules intracellulaires d'intérêt.
Par ailleurs, pour des productions à grande échelle, il est important que le procédé choisi soit transposable à cette échelle.
Enfin, l'introduction de cette étape de désintégration cellulaire doit être aisée et ne doit pas avoir un impact négatif sur les étapes de procédé/traitement subséquentes.
Toutes ces limitations influencent l'efficacité du procédé de désintégration et par là- même sa consommation énergétique.
C'est la raison pour laquelle la technologie de broyage à billes est préférée, car elle est considérée comme efficace pour libérer les protéines intracellulaires sous leur forme native.
Dans un broyeur à billes, les cellules sont agitées en suspension avec de petites particules sphériques. Le cassage des cellules est provoqué par les forces de cisaillement, le broyage entre les billes, et les collisions avec des billes.
La description d'un broyeur à billes approprié est par exemple faite dans le brevet US 5.330.913. Ces billes cassent les cellules pour en libérer le contenu cellulaire. On obtient alors une suspension de particules de plus petite taille que les cellules d'origine sous la forme d'une émulsion « huile dans eau ».
Cette émulsion est généralement atomisée et l'eau est éliminée, laissant une poudre sèche contenant cependant un mélange hétérogène composé de débris cellulaires, de composés solubles interstitiels et d'huile.
La difficulté à résoudre dans l'emploi de ces technologies de désintégration cellulaire est l'isolement du seul contenu intracellulaire (à l'exclusion des débris membranaires, des sucres, des fibres et des matières grasses) et la préservation, notamment, de la qualité de la charge protéique.
Dans le cas de la microalgue du genre Tetraselmis sp, Anja Schwenzfeier et al
(Bioresource Technology, 201 1 , 102, 9121 - 9127) ont proposé un procédé garantissant la solubilité et la qualité de l'aminogramme des protéines isolées et débarrassées des contaminants (telles les substances colorantes) comprenant les étapes suivantes :
désintégration cellulaire par broyage à billes,
- centrifugation de la suspension de microalgues broyées,
dialyse du surnageant,
passage sur résine échangeuse d'ions,
dialyse de l'éluat, décoloration, puis
lavage et remise en solution.
Cependant, ce procédé de laboratoire (pour traiter 24 g de biomasse) n'est pas transposable à l'échelle industrielle, où le procédé de broyage à billes est plutôt mis en œuvre pour récupérer une biomasse complète.
Des solutions alternatives ont été proposées en changeant complètement la technologie de libération du contenu intracellulaire des microalgues, comme le traitement électrique à champ puisé.
L'exposition des cellules biologiques à un champ électrique puisé de haute intensité peut en effet altérer la structure de la membrane cellulaire.
Le champ externe provoque le chargement de la membrane. A une tension transmembranaire suffisante (0,5-1 V), l'arrangement moléculaire des phospholipides change, ce qui conduit à faire perdre à la membrane son rôle de barrière, la rendant perméable. En fonction des conditions mises en œuvre, cette perméabilisation membranaire peut être réversible ou irréversible.
Pour une extraction efficace des composés intracellulaires, il reste cependant conseillé à l'homme du métier utilisateur de cette technologie de provoquer une perméabilisation irréversible de la membrane, ce qui conduit à sa désintégration.
Cette rupture de la membrane facilite alors la libération du contenu cellulaire et, en cas d'utilisation d'une technique complémentaire d'extraction par solvant, facilite également la pénétration du solvant dans la cellule.
Cette technique, quoique prometteuse, n'est malheureusement pas extrapolable à une échelle industrielle pour traiter une biomasse produite en réacteur de 1 à 200 m3.
Il résulte qu'il demeure un besoin non satisfait de disposer d'une technologie de fragilisation des parois des microalgues apte à libérer le contenu intracellulaire sans désintégrer la cellule ni altérer la qualité de ses composants. Objet de l'invention
La société Demanderesse a trouvé que ce besoin pouvait être satisfait en combinant un procédé de perméabilisation thermique des cellules de microalgues avec des étapes de centrifugation et de précipitation en modulant les propriétés du milieu. La société Demanderesse va ainsi à rencontre d'un préjugé technique qui veut que les méthodes thermiques de disruption cellulaire, tout comme les forces de cisaillement provoquées par la désintégration mécanique, soient des technologies plutôt mises en œuvre pour dégrader ou dénaturer les produits issus des microalgues (Richmond, 1986, Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc - Molina Grima et al., 2003, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and économies, Biotechnol. Adv. 20:491-515).
Par ailleurs, une fois libérées du compartiment intracellulaire, la récupération de l'isolât peptidique est réalisée aisément, étant donné que le traitement thermique développé par la société Demanderesse ne conduit pas à la désintégration de la paroi cellulaire.
Enfin, le procédé de l'invention permet surtout de récupérer et de valoriser la biomasse résiduelle, de même que les coproduits de l'isolât peptidique. Description détaillée de l'invention
La présente invention est donc relative à un procédé de de fractionnement des composants de la biomasse de microalgues riches en protéines :
par la mise en œuvre d'un procédé de perméabilisation thermique de la membrane cellulaire, suivi
- de la récupération et de la valorisation de la bbmasse résiduelle ainsi perméabilisée et de ses coproduits.
Plus précisément, le procédé selon l'invention est un procédé de Procédé de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en protéines du genre Chlorella, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
fourniture d'une biomasse de microalgues produite par fermentation, de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels,
perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150°C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 1 minute, séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique de centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, - de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, purification de la fraction soluble précédente par précipitation, afin d'obtenir un isolât peptidique et un concentrât peptidique.
Par « environ » est entendu une gamme de valeur comprenant + ou - 10 % de la valeur indiquée, de préférence + ou - 5 % de celle-ci. Par exemple, environ 10 signifie entre 9 et 1 1 , de préférence entre 9,5 et 10,5. Choix de la microalgue
De préférence, les microalgues du genre Chlorella sont choisies dans le groupe constitué de Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorella protothecoides.
Dans un mode de réalisation particulier, la souche est Chlorella protothecoides
(souche UTEX 250 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA). Dans un autre mode de réalisation, la souche est la souche CCAP21 1/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).
Choix des conditions de fermentation
La culture en conditions hétérotrophiques et en l'absence de lumière conduit classiquement à la production d'une biomasse de chbrelles présentant une teneur en protéines (évaluée par la mesure du taux d'azote N x 6,25) de 45 à 70 % en poids de cellules sèches.
Il est préféré de partir d'une biomasse de microalgues enrichies en protéines, par exemple présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 %. En ce cas, la société Demanderesse recommande d'utiliser un procédé original qu'elle a développé, et qui comprend :
une première étape de fermentation, limitée en azote, où la régulation du pH est réalisée par un mélange NH3/KOH puis,
une deuxième étape de levée de cette limitation en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul.
Ces conditions opératoires permettent ainsi d'obtenir rapidement une biomasse présentant une teneur en protéines supérieure à 60 % en N.6,25, de l'ordre de 65 % en N.6,25, et une faible coloration. Le rendement est de 45 à 50 % en poids de matière sèche, et la concentration finale en biomasse est comprise entre 80 et 120 g/l.
Traitement de la biomasse
La biomasse est ensuite collectée par séparation solide-liquide, par filtration frontale ou tangentielle ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
De manière optionnelle, la société Demanderesse recommande ensuite de laver la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels par une succession de concentration (par centrifugation) / dilution de la biomasse.
Au sens de l'invention, on entend par « composés solubles interstitiels » tous les contaminants organiques solubles du milieu de fermentation, par exemple les composés hydrosolubles tels les sels, le glucose résiduel, les oligosaccharides de degré de polymérisation (ou DP) 2 ou 3 ou les peptides. Cette biomasse ainsi purifiée de ses composés solubles interstitiels est ensuite ajustée préférentiellement à une matière sèche comprise entre 15 et 30 % en poids, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %. Perméabilisation thermique de la biomasse
On réalise alors le traitement thermique à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150°C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute. Dans un mode de réalisation préféré, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 140°C pendant environ 10 secondes. Dans un autre mode de réalisation préféré, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C pendant environ 1 minute.
Ce traitement permet de laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel.
Enfin, au terme de ces étapes, la biomasse est refroidie de préférence à une température inférieure à 40°C, voire réfrigérée autour de 4°C.
Sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse considère que le traitement thermique, réalisé dans ces conditions opératoires, pourrait agir ainsi comme un procédé de fragilisation membranaire qui autorise le relargage spontané des composants solubles du compartiment intracellulaire, voire de la matrice extracellulaire.
En plus des substances ioniques, des substances organiques tels que les hydrates de carbone (majoritairement DP1 et DP2), les peptides et les polypeptides sont drainés hors de la cellule.
Au contraire, les lipides et composés organiques hydrophobes restent dans les cellules, ce qui démontre bien que les cellules sont perméabilisées et non lysées ou détruites.
Le procédé selon l'invention ne conduit donc pas à la formation d'une émulsion, mais bien à une suspension aqueuse.
Le relargage de toutes ces substances solubles à travers la membrane perméabilisée s'apparente à un procédé de diffusion libre de type dialyse.
Par voie de conséquence, un temps de latence peut être nécessaire pour permettre une diffusion suffisante après le traitement thermique qui perméabilise la membrane.
Dans la littérature, le procédé de perméabilisation par champ puisé des membranes de levures pour en extraire les protéines demande de 4 h à 6 h (Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84). Selon l'invention, un temps de réaction beaucoup plus court est mis en œuvre, compris entre environ 5 secondes et environ 5 minutes.
Séparation de la biomasse perméabilisée et de la fraction soluble
On procède ensuite à la séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée.
Si nécessaire, la fraction soluble ainsi obtenue peut être clarifiée par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels et selon sa matière sèche, une concentration par évaporation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier peut être réalisée avant la purification qui s'en suit.
La fraction soluble résultante est finalement composée essentiellement de protéines (50 - 80 % p/p) et d'hydrates de carbone (5 - 25 % p/p).
Valorisation de la biomasse résiduelle
La biomasse résiduelle dont les solubles ont été séparés peut faire l'objet d'une valorisation en tant qu'ingrédient complet dont le profil nutritionnel est rééquilibré.
En effet, la teneur en protéines est diminué - car en partie entraînée sous forme de peptides dans les solubles - et cela rééquilibre la balance au profit de la fraction glucidique et lipidique.
La biomasse résiduelle après séparation par centrifugation peut être «également broyée (selon les propriétés applicatives recherchées), préférentiellement broyage mécanique.
Classiquement, la biomasse est stabilisée (pH réajusté (autour de 7), ajout d'antioxydants...), elle est ensuite traitée thermique (pasteurisation à vocation de maîtrise bactériologique) avant séchage par atomisation. Une étape de concentration par évaporation peut précéder le traitement thermique (optimisation couplé avec le séchage).
Purification de l'isolât protéique par précipitation
Le procédé de l'invention conduit ici à l'isolement de peptides d'intérêt, par précipitation en modulant les propriétés du milieu.
La société Demanderesse recommande ainsi de procéder comme suit :
en favorisant la précipitation de tout ou partie de la fraction peptidique en modulant les propriétés physico-chimiques du milieu.
Le refroidissement des solubles bruts, obtenus comme décrit dans les étapes précédentes, enclenche un phénomène de précipitation d'une partie des peptides solubles. Il est observé que la précipitation est plutôt sélective sur les plus hauts poids moléculaires. La température de refroidissement est inférieure à 10°C, de préférence, inférieure à 4°C.
Certaines conditions opératoires permettent de favoriser ce phénomène : outre la température, le pH doit être situé entre 2,5 et 6,5 et de préférence être proche du pHi, soit entre 3 et 5.
De la même manière la force ionique du milieu peut être adaptée pour favoriser la précipitation. Ainsi, en diminuant fortement la force ionique, on peut atténuer le phénomène de « Salting in » et ainsi diminuer la solubilité des protéines (par diminution de la couche de solvatation).
Ainsi, une opération de déminéralisation préalable à la précipitation peut être ajoutée. Celle-ci est réalisée sur résines cationiques et anioniques, dialyse, filtration ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. Inversement, en augmentant fortement la force ionique, l'eau disponible diminue par le phénomène de « Salting out », de cette manière les protéines ont tendance à précipiter. Ce mode n'est pas préféré puisqu'une déminéralisation prononcée serait ensuite nécessaire sur l'isolât protéique ainsi extrait.
Dans la même optique de modulation de la couche de solvatation, la polarité du milieu peut être diminuée (avec déshydratation du milieu) par ajout d'un solvant de type éthanol qui permettra de générer une précipitation plus quantitative de la fraction protéique en diminuant fortement sa solubilité. en récupérant la fraction précipitée qui est ensuite éventuellement concentrée avant séchage
La séparation de la fraction précipitée est réalisée par simple décantation et récupération de la phase lourde ou éventuellement par centrifugation dans les conditions de température optimales.
Le pH peut éventuellement être réajusté avant séchage.
Le séchage est effectuée par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
Préalablement au séchage, l'incorporation d'une étape de concentration par évaporation peut permettre d'optimiser énergétiquement l'opération. Elle peut être notamment justifiée si un solvant du type éthanol est utilisé pour permettre son recyclage.
L'exploitation de ces voies permet de purifier une fraction à haute teneur en peptides et polypeptides des sels et sucres résiduels.
On obtient alors un isolât de protéines solubles supérieur à 90 % en poids. Valorisation du résidu
Lorsque l'isolât a ainsi été extrait, la phase soluble (phase légère après séparation) peut être valorisé en tant que telle comme concentrât protéique (selon sa teneur résiduelle en protéines) ou subir à nouveau un processus de purification pour en extraire les peptides résiduels.
Cela peut notamment être justifié selon les conditions expérimentales lorsque la précipitation est partielle (ex. précipitation partielle en phase aqueuse). Dans ce cas, les peptides résiduels, généralement de plus faible poids moléculaire (plus solubles) peuvent être extraits par modulation de l'environnement physico-chimique de la même manière que décrit pour l'isolât protéique.
Par exemple, l'incorporation d'un solvant du type éthanol peut être réalisée à ce stade pour générer une précipitation de cette fraction protéique résiduelle en diminuant fortement sa solubilité.
L'action du solvant sera d'autant plus efficace que le résidu est déshydraté au préalable. Cela peut être effectué jusqu'à une certaine matière sèche par évaporation ou jusqu'à un séchage complet (par exemple, par atomisation).
Après précipitation, le pH de cette fraction peut éventuellement être réajusté puis, une concentration par évaporation (qui peut permettre le recyclage du solvant) est éventuellement opérée avant séchage par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels veulent illustratifs et non limitatifs.
EXEMPLES
Exemple 1. : Production de Chlorella protothecoides à haute teneur en protéines
La souche utilisée est une Chlorella protothecoides (souche CCAP21 1/8D - The Culture Collection ofAlgae and Protozoa, Scotland, UK).
Préculture :
- 150 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ;
Composition du milieu : 40 g/L de glucose + 10 g/L d'extrait de levure.
L'incubation se déroule dans les conditions suivantes :
durée : 72 h ; - température : 28°C ;
agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).
Culture en mode batch puis fed batch
Préparation et milieu batch initial
- préparer et filtrer un mélange KOH à 400 g/l (41 %) / NH3 à 20 % v/v (59 %) ;
- stériliser fermenteur 20 L à 121 °C/ 20 min ;
inoculer avec 2 erlenmeyers de préculture de 500 ml (ϋθβοο nm de 15) ;
- mise au pH de 4,5 avec NH3 20% v/v ;
- agitation de 300 rpm départ ;
aération : 20 L/min d'air ;
régulation pÛ2 à 30 % ;
Alimentation
glucose : 500 g/l
- sulfate d'ammonium : 5 g/l
phosphate de diammonium : 20 g/l
acide phosphorique : 16 g/l
sulfate de magnésium heptahydrate : 12 g/l
sulfate de fer : 170 mg/l
- calcium nitrate : 610 mg/l
solution d'oligoéléments : 45 ml/l
solution de vitamines : 4,5 ml/l
Il est important de noter que la charge en sels d'ammonium, sels de magnésium et acide phosphorique a été élaborée de manière à limiter la teneur en sels du milieu de fermentation et a été optimisée de manière à maintenir la teneur en N.6,25 de la biomasse finale décolorée.
Solution de vitamines
Ingrédients (g/i)
Thiamine HCI 2,25
Biotine 0,11
Pyridoxine 1.1 Conduite de la fermentation
apporter l'équivalent de 20 g/l avant inoculation
quand la concentration en glucose est = 0 g/l, démarrer l'alimentation en profil exponentiel (μ = 0,07 h"1) ;
- régulation du pH à 5,2 avec le mélange 41 % KOH / 59 % NH3
quand 2 kg de glucose sont consommés par la microalgue, on passe en régulation du pH par NH3 seul. Résultats :
Cette conduite de fermentation permet d'obtenir une biomasse présentant plus de 65 % de protéines exprimées en N.6,25.
Exemple 2. Perméabilisation thermique de la biomasse de Chlorella protothecoides et récupération de la fraction soluble par précipitation
La biomasse produite selon l'exemple 1 est récoltée à une matière sèche cellulaire de 105 g/L avec une pureté de 80% (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale).
Elle est alors :
lavée et concentrée par dilution en ligne [1 :1] (VeauVmoût) et centrifugée sur centrifugeuse à assiettes Alfa Laval FEUX 510 et amenée à une matière sèche de 220 g/l et à une pureté de 93 % (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale), puis
- le pH est ajusté à 7 à la potasse
traitée thermiquement par HTST sur échangeur à plaques à vapeur indirecte amenant la biomasse à 85°C maintenue 1 minute par chambrage puis refroidissement à 4°C sur échangeur à plaques à eau glycolée.
Le traitement thermique est réalisé à un barème modéré pour limiter la solubilisation partielle de la biomasse qui voit sa pureté diminuer à 68%.
Par définition, le relargage de solubles dans le milieu extracellulaire entraine une diminution de la fraction de matière sèche cellulaire par rapport à la matière sèche totale.
A ce stade, la composition de la biomasse est la suivante :
acides aminés totaux : 48,73 %
- sucres totaux : 27,02 %
acides gras totaux : 15,10 %
cendres et autres : 9,15 %. Séparation des solubles bruts
La séparation des solubles issus du relargage par perméabilisation thermique de biomasse est effectuée par séparation centrifuge.
Afin d'optimiser le rendement et la qualité de la séparation, une légère dilution [0,5 :1 ] (VeauVmoût) est effectuée en ligne sur le deuxième étage (sur une configuration à deux centrifugeuses Alfa Laval FEUX 510 en série) avec recyclage du surnageant du deuxième étage vers le premier. Le surnageant du premier étage est ainsi récupéré et concentre les solubles clarifiés.
Ces solubles « brut » ont la composition suivante :
- acides aminés totaux : 77,3 %
sucres totaux : 17,6 %
cendres et autres : 5,1 %
Purification de l'isolât protéique
Un échantillon de solubles prélevé après séparation est utilisé pour une purification visant à obtenir l'isolât protéique.
Afin de précipiter sélectivement la fraction peptidique, 750 g de solubles brut à une matière sèche de 9,5% sont placés dans un réacteur double enveloppe sous agitation.
Le pH des solubles bruts est ajusté à 4,5 à l'acide phosphorique.
Après arrêt de l'agitation, la température est abaissée à 4°C.
Ces conditions sont maintenues pendant 8h.
Ainsi s'opère la décantation de la phase lourde enrichie en peptides de plus haut poids moléculaire.
La phase lourde est alors extraite par simple séparation de phase en ampoule à décanter avec un rendement massique de 28% et présente une matière sèche de 37,2%.
Cet extrait est lyophilisé à une matière sèche de 97%.
La composition de cet isolât est détaillée ci-dessous :
acides aminés totaux : 95,9 %
sucres totaux : 2,44 %
- cendres et autres : 1 ,66 %
La répartition du profil des acides aminés de l'isolât protéique est le suivant :
acide glutamique : 49,9 %
- arginine : 47,21 %
- autres : 2,89 %
L'isolât est donc caractérisé par une richesse de l'ordre de 95% en acides aminés essentiellement constitué d'arginine et d'acide glutamique (sur la base de l'analyse de répartition des acides aminés totaux). Purification du résidu
La phase légère, après précipitation et séparation de l'isolât peut faire l'objet d'une purification afin de concentrer la fraction protéique n'ayant pas précipité (de plus faible poids moléculaire).
Après séparation (avec un rendement massique de 72%), cette phase, initialement à 8,9% de matière sèche est concentrée par évaporation (15mBar - 43°C au rotavapor de laboratoire Buchi -215) jusqu'à une matière sèche de 45,4% afin de déshydrater partiellement le milieu pour favoriser ensuite l'action de l'éthanol.
A ce stade, le concentrât présente la composition suivante :
acides aminés totaux : 68,5 %
sucres totaux : 23,46 %
cendres et autres : 8,04 % Afin de précipiter la fraction protéique, une déshydratation par l'ajout d'éthanol est effectuée.
Un volume d'éthanol (par volume de concentrât) est ajouté, l'agrégation des protéines suite à la perte de solubilité dans le milieu s'opère quasi instantanément.
Le culot est récupéré par centrifugation à 4000g pendant 10 minutes (Beckman Coulter Avanti J-20 XP).
Il est ensuite séché à une matière sèche de 92,3% à l'étuve sous vide pendant
24 h.
La composition de l'extrait ainsi obtenu est détaillée ci-dessous :
acides aminés totaux : 73,19 %
- sucres totaux : 20,45 %
cendres et autres : 6,36 %.
Cet extrait peut alors être valorisé en tant que concentrât protéique.
Exemple 3. Traitement de la biomasse résiduelle après solubilisation
Les solubles bruts obtenus dans l'exemple 2, riches en protéines, sont séparés de la biomasse résiduelle qui peut être traitée par un procédé permettant sa valorisation.
La biomasse extraite à une matière sèche cellulaire de 22% est broyée sur un module de broyage à bille horizontal « Bead Mill » (NETZSCH LME 500 - billes de silicate de zirconium 0,6 mm) à un taux de broyage de 85%.
Le pH du broyât cellulaire est alors ajusté à 7 à la potasse 50%. Une concentration sur évaporateur à flux forcé SPX est effectuée par alimentation continue d'une boucle où la température est ajustée à 75°C avant l'entrée du flash sous vide avec la température maintenue à 40°C où s'effectue l'évaporation.
La biomasse concentrée est continuellement soutirée du flash vers le module UHT SPX pour réaliser un traitement thermique avec préchauffage à 70°C puis injection vapeur direct sur un barème d'une dizaine de secondes à 140°C et refroidissement à 40°C par flash au vide.
La biomasse est alors atomisée à une matière sèche de 95% sur un atomiseur de type GEA Filtermat FMD 200.
La biomasse ainsi obtenue présente la composition suivante :
acides aminés totaux : 27,1 %
acides gras totaux : 27,1 %
sucres totaux : 35.8 %
cendres et autres : 10 %
La biomasse ainsi obtenue a l'avantage de présenter un profil nutritionnel équilibré au niveau de la fraction glucidique, protéique et lipidique. Comme présenté ci-dessous, le profil d'acides aminés est d'ailleurs rééquilibré par l'élimination en amont de la fraction soluble sélectivement riche en arginine et acide glutamique
La répartition des acides aminés dans la biomasse est la suivante :
- acide aspartique : 6,05
- thréonine : 3,91 %
sérine : 3,56 %
acide glutamique : 23,84 %
glycine : 3,56 %
- alanine : 5,69 %
- valine : 4,27 %
isoleucine : 2,31 %
leucine : 5,87 %
- tyrosine : 2,49 %
- phénylalanine : 3,20 %
- lysine : 3,74 %
- histidine : 1 ,60 %
- arginine : 25,98 %
- proline : 3,91 %

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en protéines du genre Chlorella, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
fourniture d'une biomasse de microalgues produite par fermentation, de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels,
perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150°C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 1 minute,
séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique de centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, purification de la fraction soluble précédente par précipitation, afin d'obtenir un isolât peptidique et un concentrât peptidique.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les microalgues du genre Chlorella sont choisies dans le groupe constitué de Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorella protothecoides.
3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la biomasse de microalgues riches en protéines est préparée par un procédé qui comprend :
une première étape de fermentation, carencée en azote, où la régulation du pH est réalisée par un mélange NH3/KOH puis,
- une deuxième étape de levée de cette carence en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le traitement thermique à une température comprise entre environ 80 et 150°C, pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C pendant environ 1 minute ou à une température d'environ 140°C pendant environ 10 secondes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la biomasse perméabilisée est traitée ultérieurement par :
broyage, préférentiellement broyage mécanique,
stabilisation à pH 7,
pasteurisation,
atomisation.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la purification de fraction soluble est réalisée par
- précipitation à une température de refroidissement inférieure à 10°C, de préférence inférieure à 4°C, avec optionnellement, ajustement du pH à une valeur comprise entre 2,5 et 6,5, de préférence entre 3 et 5,
- centrifugation ou décantation, afin d'obtenir une phase lourde correspondant à l'isolât peptidique, et une phase légère,
- concentration et séchage de l'isolât peptidique ainsi obtenu.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on extrait les peptides résiduels de la phase légère par précipitation éthanolique.
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