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EP2689027A1 - Detection de bacteries presentant une resistance enzymatique aux carbapenemes - Google Patents

Detection de bacteries presentant une resistance enzymatique aux carbapenemes

Info

Publication number
EP2689027A1
EP2689027A1 EP12714800.5A EP12714800A EP2689027A1 EP 2689027 A1 EP2689027 A1 EP 2689027A1 EP 12714800 A EP12714800 A EP 12714800A EP 2689027 A1 EP2689027 A1 EP 2689027A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
beta
cloxacillin
pabetan
carbapenemase
strains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12714800.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sandrine GHIRARDI
John Perry
Gilles Zambardi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2689027A1 publication Critical patent/EP2689027A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and identifying carbapenem-resistant bacteria. More specifically, the method according to the present invention aims to detect bacteria having an enzymatic resistance to carbapenems.
  • beta-lactam antibiotics such as penicillins and cephalosporins
  • antibiotics are then replaced by other broad-spectrum antimicrobials.
  • carbapenems have gained prominence, particularly for treating hospitalized patients. Carbapenems are active against most Gram-positive and Gram-negative aerobic bacteria as well as some anaerobic bacteria.
  • the bacteria concerned are, in a non-exhaustive manner, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Comamonas sp., Aeromonas sp. Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.
  • the reduced susceptibility to carbapenems may be due to:
  • carbapenemases are combined with changes in cell wall permeability (impermeability resistance) and / or active efflux of antibiotics (Pages et al., 2009; PloS ONE, 4 (3)); and or • the existence of carbapenem-degrading enzymes, called carbapenemases.
  • the carbapenemase genes are likely to be present in chromosomes and / or in plasmids. Because of this presence in the form of plasmids, these enzymatic type resistances are likely to spread very significantly and therefore have a major risk in terms of epidemiology. Resistance due to membrane impermeability to carbapenems is not likely to spread, it is recommended, in the context of diagnosis, monitoring of carriage or hygiene, to be able to distinguish between the two types of resistance .
  • the Applicant has shown that it is possible to improve the direct distinction, in particular in a single detection device, between the enzymatic resistance and the resistance by other mechanisms, among which impermeability, by inhibition of the strains exhibiting impermeability or other non-enzymatic resistance mechanism, without affecting the growth and detection of resistant strains by carbapenemase production.
  • the Applicant has surprisingly observed an impact of cloxacillin, with or without PAbetaN, on carbapenem-resistant strains that do not produce carbapenemase and do not produce AmpC.
  • the present invention relates to a method for detecting and / or identifying, in a biological sample, bacteria exhibiting carbapenem resistance, comprising the steps of:
  • reaction medium comprising at least one antibiotic of the class of carbapenems, and cloxacillin
  • the medium used in step a) also comprises phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide (PAbetaN).
  • the Applicant has surprisingly shown that the addition of cloxacillin or a combination of cloxacillin and PAbetaN in a chromogenic or non-chromogenic medium comprising carbapenems makes it possible to improve the sensitivity and the specificity of the detection of bacteria.
  • carbapenem-resistant by producing carbapenemases and more specifically identifying carbapenemase-producing strains.
  • the method according to the invention makes it possible to differentiate, among the carbapenem-resistant bacterial strains, the carbapenemase-producing strains, the strains exhibiting resistance by impermeability or another non-enzymatic resistance mechanism.
  • the hygiene measures necessary to prevent the transmission of strains with enzymatic resistance can be implemented without delay.
  • the present invention corresponds to a method for detecting and / or identifying, in a biological sample, bacteria exhibiting carbapenem resistance by producing carbapenemase, comprising the steps of:
  • reaction medium comprising at least one antibiotic of the class of carbapenems, and cloxacillin
  • the medium used in step a) also comprises phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide (PAbetaN).
  • PAbetaN phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide
  • the present invention corresponds to a method for detecting and / or identifying, in a biological sample, bacteria exhibiting carbapenem resistance by producing carbapenemase, comprising the steps of: a) contacting said sample with a reaction medium comprising at least one chromogenic substrate, at least one antibiotic of the carbapenem class, and cloxacillin;
  • the medium used in step a) also comprises phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide (PAbetaN).
  • PAbetaN phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide
  • Biological sample means a small or small amount isolated from an entity for analysis. It can be a clinical sample, human or animal, from a biological fluid sample, or a food sample, from any type of food, or a sample from the food production or processing environment. This sample can be liquid or solid. There may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of whole blood, serum, plasma, urine, faeces, nose samples, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample of water, beverages such as milk, fruit juice, yogurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese, fish ..., a food sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample derived from animal meal, a sample for surface control or water. This sample can be used as it is or, prior to the analysis, undergo an enrichment-type preparation, dilution, extraction, concentration, purification, according to methods known to those skilled in the art.
  • reaction medium a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin, agarose or other natural or artificial gelling agents.
  • a number of preparations are commercially available, such as Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Mueller Hinton agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, etc.
  • the medium may also comprise a dye.
  • dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green , one or more metabolic indicators, one or more metabolic regulators ...
  • the reaction medium may be a revelation medium or a culture and revelation medium.
  • the culture of the microorganisms is carried out before seeding, and in the second case, the detection and / or identification medium also constitutes the culture medium.
  • Those skilled in the art can also use a bi-box, which makes it easy to compare two media, comprising different substrates or different selective mixtures, on which a same biological sample has been deposited.
  • the reaction medium may comprise one or more selective agents.
  • selective agent is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a microorganism other than the target microorganism. Without being limiting, a concentration of between 0.01 mg / l and 5 g / l is particularly suitable for the present invention.
  • antibiotics we mean any compound that can prevent or slow down the growth of a bacteria. They belong especially to the beta-lactam groups, glycopeptides, aminoglycosides, polypeptides, sulfonamides, quinolones.
  • antifungal any compound that can prevent or slow the growth of yeast or mold.
  • amphotericin B fluconazole, itraconazole, voriconazole, cycloheximide.
  • the carbapenems used in the medium used in step a) are stable in a reaction medium.
  • they are selected from: meropenem, ertapenem, doripenem, faropenem, thienamycin, biapenem, lenapenem, panipenem, razupenem, tomopenem, tebipenem, sulopenem, beta-methyl carbapenems described by Choi et al. . in the US application 2010/0160284 A1 More preferentially, they are selected from: meropenem, ertapenem, doripenem and faropenem.
  • the carbapenem concentrations are between 0.05 and 32 mg / L.
  • the concentrations of carbapenems are between 2 and 32 mg / L for faropenem, between 0.05 and 2 mg / L for doripenem, between 0.05 and 2 mg / L for meropenem, between 0.05 and 12 mg / L for the ertapenem.
  • Cloxacillin is an antibiotic of the penicillin class. It is used in vitro to inhibit certain beta-lactamases (Giske et al., 2010, supra). Dicloxacillin and flucloxacillin are advantageously considered equivalent to cloxacillin. Preferably, cloxacillin is used at a concentration of between 25 and 300 mg / l.
  • PABN or PAbetaN corresponds to phenylalanine-arginine-beta-naphthylamide.
  • This compound is known as an inhibitor of efflux pumps, making it possible, for example, to reduce the minimum inhibitory concentration (MIC) of chloramphenicol with respect to strains of Enterobacter aerogenes (Mallea et al., 2002, Biochemical and Biophysical Research Communications 293). : 1370-3).
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • PAbetaN is used at a concentration of between 1 and 50 mg / l.
  • chromogenic substrate a substrate allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity of the target microorganisms by means of a detectable signal directly or indirectly.
  • this substrate may be bound to a fluorescent or colored marker moiety (Orenga et al., 2009, J. Microbiol Methods, 79 (2): 139-55).
  • the reaction medium according to the invention may additionally comprise a pH indicator, sensitive to the pH variation induced by the consumption of the substrate and revealing the metabolism of the target microorganisms.
  • the said pH indicator may be a chromophore or a fluorophore.
  • chromophores examples include bromocresol purple, bromothymol blue, neutral red, aniline blue, bromocresol blue.
  • the fluorophores include, for example, 4-methylumbelliferone, hydroxycoumarin derivatives or resorufin derivatives.
  • the chromogenic substrate is preferably chosen from substrates based on Indoxyl (3-lndoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-lodo-3-indoxyl,
  • the enzymatic activities targeted by the chromogenic substrates may belong to the group of hydrolases, preferentially to the groups of osidases, esterases or peptidases.
  • the enzymatic activities targeted by the chromogenic substrates are chosen from: glucuronidase, glucosidase, galactosidase, esterase, sulphatase and deaminase.
  • the substrates used for the detection of beta- glucuronidase activity may in particular be 4-methylumbelliferyl-beta-glucuronide,
  • the substrates used for the detection of a beta-galactosidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside or 5-Bromo-6-chloro. -3-indolyl-beta-galactoside, the
  • the substrates used for the detection of a beta-glucosidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside or 5-Bromo-4-chloro.
  • 3-indolyl-N-methyl-beta-glucoside 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, Alizarin-beta-glucoside, Cyclohexenoesculetin-beta-glucoside, Nitrophenyl-beta-glucoside, Dichloroaminophenyl-glucoside or their salts.
  • the substrates used for the detection of an esterase activity may in particular be saturated or unsaturated linear fatty acid esters, having between 6 and 14 carbons, preferably between 7 and 9 carbons, and
  • 4- Methylumbelliferone, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-3-indolyl or Alizarin or their salts Preferably, they are chosen from 4-methylumbellifl-octanoate, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-octanoate, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-octanoate, 6-chloro-3-indoxyl-octanoate, 5-Bromo-3-indolyloctanoate or Alizarin-octanoate.
  • the substrates used for the detection of a deaminase activity may in particular be L-Tryptophan, L-Phenylalanine, L-Tyrosine and L-Histidine.
  • the substrates used for the detection of a sulphatase activity may especially be 4-methylumbelliferyl sulphate, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl sulphate,
  • the chromogenic substrate is chosen from: 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucopyranoside (X-glucoside), 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D- Galactopyranoside (Magenta beta-Gal), 6-Chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide (Rose beta Gur), 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-beta-D-glucopyranoside (Green A beta Glu), Methyl-beta-D-glucopyranoside (methyl beta D glucoside), L-Tryptophan.
  • Incubate is meant to carry and maintain between 1 and 48 hours, preferably between 4 and 24 hours, more preferably between 16 and 24 hours, at an appropriate temperature, generally between 20 and 50 ° C, preferably between 30 and 40 ° C .
  • detection it is meant to detect with the naked eye or with the aid of an optical device the existence of a growth of the target bacteria.
  • the detection may also allow identification of the target bacteria. The detection is done with an optical device for fluorescent substrates, or with the naked eye or with an optical device for colored substrates.
  • a more specific identification corresponds to a reduction in the number of false positives linked to strains that do not express carbapenemase, without claiming to inhibit all of these strains.
  • sensitivity is meant the ability to give a positive result when the target bacterial strain is present in the sample.
  • carbapenem enzymatic resistance is meant, as indicated supra, the carbapenem antibiotic resistance due to the expression of carbapenemases by the target bacteria.
  • carbapenem-resistant bacteria are, as indicated supra: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii , Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.
  • the present invention also relates to a culture medium for detecting and / or identifying bacteria having an enzymatic resistance to carbapenems, said culture medium corresponding to a basic culture medium, further comprising at least one chromogenic substrate, at least one carbapenem, cloxacillin or a combination of cloxacillin and PAbetaN.
  • the present invention relates to the use of cloxacillin or a combination of cloxacillin and PAbetaN for specifically detecting and / or identifying bacteria having carbapenem enzyme resistance.
  • MIC Minimal Inhibitory Concentrations
  • Test B100904 the 19 strains resistant to impermeability (RI) belong to the following species: Enterobacter aerogenes, 2 Enterobacter cloacae, 1 Citrobacter freundii, 1 Pseudomonas aeruginosa, 3 Proteus mirabilis and 2 Morganella morganii.
  • Test B101001 Twenty-nine carbapenemase-producing strains are distributed as follows: 27 KPC strains KPC (KPC) and 2 strains respectively Klebsiella pneumoniae and Citrobacter freundii producing class B carbapenemase (type NDM) -1). This test also included an Escherichia coli ESBL strain.
  • PabetaN on MICs of RI or carbapenemase-producing strains (Petri dish 90 mm).
  • Table III Impact of cloxacillin and / or PAbetaN on the MICs of the carbapenemase-producing strains (comparison with the MICs of the medium without cloxacillin and PAbetaN).
  • cloxacillin in the Mueller Hinton medium makes it possible to very clearly reduce (by more than 2 no concentration) the MICs to ertapenem of the majority of the RI strains tested (16/19).
  • the addition of PAbetaN alone has no impact on the majority of the RI strains tested.
  • the addition of PAbetaN to a medium containing cloxacillin reinforces the effect of the latter by further decreasing the MICs of the RI strains significantly (by more than 2 no concentration for 7 strains) or more moderate (2 no concentration or less for 5 strains).
  • Cloxacillin has no impact (9 strains) on MICs on ertapenem-producing strains of carbapenemases (NDM or KPC) or tends to reduce them slightly (16 strains).
  • NDM or KPC carbapenemases
  • PAbetaN alone in the Mueller Hinton medium tends to increase slightly (15 strains) or very clearly (7 strains) MICs to ertapenem of these strains.
  • the combination of cloxacillin and PAbetaN allows results similar to PAbetaN alone, although the positive effect of PAbetaN on MICs is slightly decreased by the negative effect of cloxacillin.
  • cloxacillin alone (200 mg / l) makes it possible to significantly reduce the MICs to ertapenem of the majority of the R1 strains tested.
  • PAbetaN reinforces this effect of cloxacillin.
  • cloxacillin + PAbetaN allows an increase (moderate to high) of the MICs to ertapenem of the carbapenemase producing strains.
  • cloxacillin alone or in combination with PabetaN makes it possible to better inhibit the undesirable growth of the IRs, while having no effect, or a slightly positive effect on the growth of the carbapenemase producing strains.
  • Class B carbapenemase other than NDM (Class B) 6
  • the chromogenic media are divided into 120x120 square boxes.
  • Seeding is carried out from 24 h pre-cultures at 37 ° C. on trypcase soya agar. For each strain, a 0.5 McF suspension in physiological saline is performed. Each suspension is inoculated spot (1 to 2 ⁇ ) on each medium using a multipoint inoculator according to the agar dilution method (DEG). Readings are taken after 24 hours of incubation at 37 ° C.
  • DEG agar dilution method
  • An absence of bacterial growth or a number of colonies of less than or equal to 3 are considered as corresponding to a growth inhibition.
  • the presence of 4 or more colonies is considered posiive growth.
  • Table VI impact of cloxacillin and / or PAbetaN on the growth (number of developing strains) of the carbapenemase or beta-lactam resistant strains due to another resistance mechanism, in the presence of faropenem T 1 5 9 2 6 10 3 7 1 1 4 8 12 13 16 19 14 17 20 15 18 2
  • Table VII Sensitivity and specificity of media containing faropenem in the presence of cloxacillin, combined or with PAbetaN, vis-à-vis carbapenemase-producing or beta-lactam-resistant strains due to another resistance mechanism.
  • Table VI II effects of cloxacillin, with or without PAbetaN, on the growth of the 19 R1 strains tested. mg / L) 0 25
  • Inhibition of RI strains is observed as soon as 50 mg / L of cloxacillin is added, even more marked for the highest concentrations of faropenem tested (16 and 32 mg / L).
  • This inhibitory effect increases with the concentration of cloxacillin (for example, for a concentration of 16 mg / L of faropenem, the addition of cloxacillin at 50 mg / L or 200 mg / L respectively allows the inhibition of 6 and 9 strains of Additional IRs).
  • a combined effect of the concentration of faropenem and that of cloxacillin on the RI strains is observed.

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Abstract

La présente invention porte sur un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline; b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries; c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes. Avantageusement, le milieu mis en œuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).

Description

Détection de bactéries présentant une résistance enzymatique aux
carbapénèmes
La présente invention porte sur un procédé de détection et d'identification de bactéries résistantes aux carbapénèmes. Plus précisément, le procédé selon la présente invention a pour but de détecter les bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.
L'augmentation de la résistance aux antibiotiques de type beta-lactames, tels les pénicillines et les céphalosporines, rend complexe le traitement des infections causées par des souches de bactéries Gram négatives. Ces antibiotiques sont alors remplacés par d'autres antimicrobiens à large spectre. Parmi ces antimicrobiens à large spectre, les carbapénèmes ont pris une place importante, en particulier pour traiter des patients hospitalisés. Les carbapénèmes sont actifs contre la majorité des bactéries aérobies Gram positives et Gram négatives ainsi que sur certaines bactéries anaérobies.
Cependant, de plus en plus de souches résistantes aux carbapénèmes apparaissent chez des patients hospitalisés.
Les bactéries concernées sont, de façon non exhaustive, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.
La susceptibilité réduite aux carbapénèmes peut être due :
• à l'expression d'un gène de résistance aux beta-lactamines :
(i) hyperproduction des beta-lactamases de type ampC, et/ou
(ii) ESBL (ou BLSE, beta-lactamase à spectre étendu),
combinée avec des modifications de la perméabilité de la paroi cellulaire (résistance par imperméabilité) et/ou avec l'efflux actif des antibiotiques (Pages et al., 2009 ; PloS ONE, 4 (3)); et/ou • à l'existence d'enzymes dégradant les carbapénèmes, appelées carbapénémases.
Les gènes de carbapénémases sont susceptibles d'être présents dans les chromosomes et/ou dans des plasmides. Du fait de cette présence sous forme de plasmides, ces résistances de type enzymatiques sont susceptibles de se disséminer de façon très importante et présentent, en conséquence, un risque majeur en terme d'épidémiologie. Les résistances dues à une imperméabilité membranaire aux carbapénèmes n'étant pas susceptibles de se disséminer, il est recommandé, dans le cadre du diagnostic, de la surveillance du portage ou de l'hygiène, de pouvoir faire la distinction entre les deux types de résistance.
Face à des souches de bactéries résistantes aux carbapénèmes, l'homme du métier a des difficultés pour différencier aisément les souches productrices de carbapénémases des souches résistantes par imperméabilité. Les deux types de bactéries étant capables de se développer en présence d'un carbapénème, le seul moyen de les différencier à ce jour consiste à réaliser des tests complémentaires. Parmi ces tests complémentaires, on citera : le test de Hodge modifié (CLSI M100- S20: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Informational Supplement.January 2010. Supplemental Table2A-S2), des tests de synergie par diffusion (ou disques combinés) en gélose, employant des inhibiteurs combinés au carbapénème, par exemple l'EDTA pour les carbapénémases de classe B, l'acide phenyl-boronique pour la détection des carbapénémases de classe A. Il est ainsi connu d'utiliser des disques combinant meropenem et composés de type acide boronique, à titre d'inhibiteurs des beta-lactamases, pour la détection phénotypique des carbapénémases de type KPC (Pournaras et al., 2010 ; J. Antimicrob. Chemotherapy, 65(7): 1319-1321 ). De même, Giske et al. ont testé l'impact de la cloxacilline sur la discrimination entre les souches productrices de KPC et les souches combinant perte de porines et hyperproduction d'AmpC (Giske et al., 2010 ; Clin. Microbiol. Infect. ; 17 (4) : 552-6). Dans ce cas, la discrimination repose sur l'action inhibitrice de la cloxacilline sur les céphalosporinases codées par le gène AmpC restaurant l'action des beta-lactamines. Cependant, le résultat de ces tests doit souvent être confirmé par des techniques de biologie moléculaire (par exemple amplification par PCR ciblant les gènes de résistance aux carbapénèmes). Une méthode de caractérisation par utilisation d'un milieu chromogène comprenant du méropénème et/ou de l'ertapénème a été proposée dans la demande WO 2010/010083 et mise en œuvre dans les milieux CHROMagar® KPC (Samra et al., 2008 ; J. Clin. Microbiol., 46 (9) : 31 10-31 1 1 ; CHROMagar™, Paris, France) et COLOREX™ KPC (BioMed Diagnostics Inc). Ce milieu ne permet pas la détection de l'ensemble des souches productrices de carbapénémases, notamment de métallo-beta-lactamases (Nordmann et al., 201 1 ; J Clin Microbiol., 49(2) : 718-721 ).
Dans le contexte épidémiologique actuel, et notamment avec l'émergence de nouvelles résistances telles que les NDM-1 , il reste à améliorer, en sensibilité et/ou en spécificité, le criblage de l'ensemble des mécanismes de résistance liés à la production des différents types de carbapénémases.
La Demanderesse a montré qu'il est possible d'améliorer la distinction directe, autrement dit notamment dans un dispositif unique de dépistage, entre la résistance enzymatique et la résistance par d'autres mécanismes parmi lesquels l'imperméabilité, par inhibition des souches présentant une résistance par imperméabilité ou un autre mécanisme de résistance non enzymatique, sans affecter la croissance et la détection des souches résistantes par production de carbapénémase. La Demanderesse a observé de façon surprenante un impact de la cloxacilline, associée ou non au PAbetaN, sur des souches résistantes aux carbapénèmes ne produisant pas de carbapénémase et ne produisant pas d'AmpC.
A cet égard, la présente invention est relative à un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes, comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ;
b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ;
c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes. Avantageusement, le milieu mis en œuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).
La Demanderesse a montré, de façon surprenante, que l'addition de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN dans un milieu, chromogène ou non, comprenant des carbapénèmes permet d'améliorer la sensibilité et la spécificité de la détection des bactéries résistantes aux carbapénèmes par production de carbapénémases et d'identifier plus spécifiquement les souches productrices de carbapénémases. Plus particulièrement, la méthode selon l'invention permet de différencier, parmi les souches bactériennes résistantes aux carbapénèmes, les souches productrices de carbapénémases, des souches présentant une résistance par imperméabilité ou un autre mécanisme de résistance non enzymatique. Ainsi, de façon concrète, les mesures d'hygiène nécessaire pour prévenir la transmission des souches présentant une résistance enzymatique peuvent être mises en œuvre sans délai.
Selon un premier mode de réalisation, la présente invention correspond à un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ;
b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ;
c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.
Avantageusement, le milieu mis en œuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).
Selon un second mode de réalisation, la présente invention correspond à un procédé de détection et/ou d'identification, dans un échantillon biologique, de bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un substrat chromogène, au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ;
b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ;
c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.
Avantageusement, le milieu mis en œuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).
Par échantillon biologique, on entend une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. Ce peut être un échantillon clinique, humain ou animal, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment, ou un échantillon de l'environnement de production ou de transformation d'aliments. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide. On peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang total, de sérum, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peau, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage, de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales, un échantillon pour contrôle de surface ou d'eau. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel ou, préalablement à l'analyse, subir une préparation de type enrichissement, dilution, extraction, concentration, purification, selon des méthodes connues de l'homme du métier.
Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Mueller Hinton ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press). Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines ... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant, un ou plusieurs indicateurs métaboliques, un ou plusieurs régulateurs métaboliques...
Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture.
L'homme du métier peut également utiliser une bi-boite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats ou différents mélanges sélectifs, sur lesquels on aura déposé un même échantillon biologique.
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs agents sélectifs. Par agent sélectif, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme autre que le microorganisme cible. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 0,01 mg/l et 5 g/l est particulièrement adaptée à la présente invention.
On peut citer comme agent sélectif, les antibiotiques, les antifongiques, les sels biliaires, le crystal violet, la fushine basique, le vert brillant, ... Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des beta-lactamines, des glycopeptides, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques cefotaxime, cefsulodine, ceftazidime, cefoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, vancomycine, gentamicine, Triméthoprime, tobramycine, moxalactam, fosfomycine, D-cylcosérine, Polymixine, Colistine, les quinolones telles que l'acide nalidixique.
Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide.
De façon préférentielle, les carbapénèmes utilisés dans le milieu mis en œuvre à l'étape a) sont stables dans un milieu réactionnel. De façon préférentielle, ils sont choisis parmi : le meropenem, l'ertapenem, le doripenem, le faropenem, la thiénamycine, le biapenem, le lenapenem, le panipenem, la razupenem, le tomopenem, le tebipenem, le sulopenem, les beta-méthyle carbapénèmes décrits par Choi et al. dans la demande US 2010/0160284 A1 Plus préférentiellement, ils sont choisis parmi : le meropenem, l'ertapenem, le doripenem et le faropenem.
Préférentiellement, les concentrations en carbapénèmes sont comprises entre 0.05 et 32 mg/L.
Plus préférentiellement, les concentrations en carbapénèmes sont comprises entre 2 et 32 mg/L pour le faropenem, entre 0.05 et 2 mg/L pour le doripenem, entre 0.05 et 2 mg/L pour le meropenem, entre 0.05 et 12 mg/L pour l'ertapenem.
La cloxacilline correspond à un antibiotique de la classe des pénicillines. Elle est utilisée in vitro pour inhiber certaines beta-lactamases (Giske et al., 2010, supra). La dicloxacilline et la flucloxacilline sont avantageusement considérées comme équivalentes à la cloxacilline. De façon préférentielle, la cloxacilline est utilisée à une concentration comprise entre 25 et 300 mg/L.
Le PABN ou PAbetaN correspond au phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide. Ce composé est connu comme inhibiteur des pompes à efflux, permettant par exemple de diminuer la concentration minimale inhibitrice (CMI) du chloramphenicol vis-à-vis des souches ô'Enterobacter aerogenes (Mallea et al., 2002 ; Biochemical and Biophysical Research Communications 293 : 1370-3). De façon préférentielle, le PAbetaN est utilisé à une concentration comprise entre 1 et 50 mg/L.
Par substrat chromogène, on entend un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou coloré (Orenga et al., 2009 ; J. Microbiol. Methods ; 79(2):139-55). Pour une détection indirecte, le milieu réactionnel selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant le métabolisme des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le bromocresol pourpre, le bleu de bromothymol, le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de l'hydroxycoumarine ou les dérivés de la résorufine. Selon la présente invention, le substrat chromogène est préférentiellement choisi parmi les substrats à base d'Indoxyl (3-lndoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-lodo-3-indoxyl,
4- Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6- Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl- 3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, Aldol™ ...) ; d'umbelliférone (4-Méthylumbelliférone, Cyclohexenoesculétine, ...) ; d'Alizarine; de p-Naphtolbenzéine; de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) ; d'Hydroxyquinoline; de Cathécol (Cathécol, Dihydroxyflavone, Hydroxyflavone, ...) ; de Résorufine; de Chlorophénol Red; de Fluorescéine; d'Aminophénol (para-Aminophénol, Dichloro-aminophénol, ...) ; de Naphtol (alpha-Naphtol, 2-Naphtol, Naphtol-ASBI, ...) ; d'Aminocoumarine (7-Amino-4-méthyl-coumarine, ...) ; de Naphtylamide; d'Acridine (Amino-phényl- acridine...) ; d'Amino-phénoxazine (Amino-benzophénoxazinone, Amino-pentyl- resorufine, ...).
A titre indicatif, les activités enzymatiques ciblées pas les substrats chromogènes peuvent appartenir au groupe des hydrolases, préférentiellement aux groupes des osidases, des estérases ou des peptidases. Préférentiellement, les activités enzymatiques ciblées par les substrats chromogènes sont choisies parmi : la glucuronidase, la glucosidase, la galactosidase, l'estérase, la sulfatase et la désaminase.
A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta- glucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le
5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta- glucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels.
Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le
6- Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels.
Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucoside, le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-N-méthyl-beta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucoside, l'Alizarine-beta-glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucoside, le Nitrophényl- beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels.
A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité estérase peuvent notamment être les esters d'acides gras linéaires saturés ou insaturés, ayant entre 6 et 14 carbones, préférentiellement entre 7 et 9 carbones et de
4- Méthylumbelliférone, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-3-indolyl ou d'Alizarine ou leurs sels. Préférentiellement, ils sont choisis parmi 4-Méthylumbellifyl-octanoate, 5-Bromo-4-chloro- 3-indoxyl-octanoate, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-octanoate, 6-Chloro- 3-indoxyl-octanoate, 5-Bromo-3-indolyl-octanoate ou d'Alizarine-octanoate.
Les substrats utilisés pour la détection d'une activité désaminase peuvent notamment être le L-Tryptophane, la L-Phénylalanine, la L-Tyrosine et la L-Histidine. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité sulfatase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-sulfate, le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-sulfate, le
5- Bromo-6-chloro-3-indoxyl-sulfate, le 3-lndoxyl-sulfate, le Phenolphtaléine-disulfate ou leurs sels.
Préférentiellement, le substrat chromogène est choisi parmi : le 5-Bromo-4-chloro- 3-indoxyl-beta-D-glucopyranoside (X-glucoside), le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl- beta-D-galactopyranoside (Magenta beta-Gal), le 6-Chloro-3-indoxyl- beta-D-glucuronide (Rose beta Gur), le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl- beta-D-glucopyranoside (Green A beta Glu), le Méthyl-beta-D-glucopyranoside (methyl beta D glucoside), le L-Tryptophane.
Par incuber, on entend porter et maintenir entre 1 et 48 heures, préférentiellement entre 4 et 24 heures, plus préférentiellement entre 16 et 24 heures, à une température appropriée, généralement comprise entre 20 et 50 °C, préférentiellement entre 30 et 40 °C.
Par détecter, on entend déceler à l'œil nu ou à l'aide d'un appareil optique l'existence d'une croissance des bactéries cibles. Avantageusement, lorsque le milieu mis en œuvre comprend un substrat chromogène, la détection peut également permettre une identification des bactéries cibles. La détection se fait à l'aide d'un appareil optique pour les substrats fluorescents, ou à l'œil nu ou à l'aide d'un appareil optique pour les substrats colorés.
Par spécificité, on entend la capacité du procédé ou du milieu réactionnel à donner un résultat négatif lorsque la souche bactérienne cible n'est pas présente. En d'autres termes, selon la présente invention, une identification plus spécifique correspond à une réduction du nombre de faux positifs liés aux souches n'exprimant pas de carbapénémase, sans prétendre inhiber l'ensemble de ces souches.
Par sensibilité, on entend la capacité à donner un résultat positif lorsque la souche bactérienne cible est présente dans l'échantillon.
Par résistance enzymatique aux carbapénèmes, on entend, tel qu'indiqué supra, la résistance aux antibiotiques de type carbapénèmes due à l'expression de carbapénémases par les bactéries cibles.
Les bactéries résistantes aux carbapénèmes les plus fréquemment rencontrées sont, tel qu'indiqué supra : Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.
La présente invention porte également sur un milieu de culture pour détecter et/ou identifier des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes, ledit milieu de culture correspondant à un milieu de culture de base, comprenant en outre au moins un substrat chromogène, au moins un carbapénème, de la cloxacilline ou une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN.
Enfin, la présente invention porte sur l'utilisation de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN pour détecter et/ou identifier spécifiquement des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.
Les exemples développés ci-dessous ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention. Ils sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. EXEMPLES
Exemple 1
Impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des souches résistantes par imperméabilité (RI) ou présentant un autre mécanisme de résistance non enzymatique, ou productrices de carbapénémases, en présence d'ertapenem.
L'effet de la cloxacilline et du PAbetaN sur les CMI des souches à l'ertapénème a été évalué dans un premier temps à l'aide de bandelettes E-test® en milieu Mueller Hinton. Dans un premier essai, l'impact sur les CMI à l'ertapénème de 19 souches présentant une résistance aux carbapénèmes non enzymatique (appelées résistantes par imperméabilité (RI) par la suite) a été évalué. Le second essai a consisté à évaluer l'impact de ces 2 composés sur les CMI à l'ertapénème de 29 souches productrices de carbapénémases (+ 1 BLSE).
1 . Milieux et microorganismes
Essai B100904 : les 19 souches résistantes par imperméabilité (RI) appartiennent aux espèces suivantes : 10 Enterobacter aerogenes, 2 Enterobacter cloacae, 1 Citrobacter freundii, 1 Pseudomonas aeruginosa, 3 Proteus mirabilis et 2 Morganella morganii.
Essai B101001 : vingt-neuf souches productrices de carbapénémases se répartissent de la façon suivante : 27 souches Klebsiella pneumoniae productrices de carbapénémase de classe A type KPC (KPC) et 2 souches respectivement Klebsiella pneumoniae et Citrobacter freundii productrices de carbapénémase de classe B (type NDM-1 ). Cet essai comprenait également une souche Escherichia coli BLSE.
Les E-tests ont été réalisés en milieu Mueller-Hinton supplémenté ou non en cloxacilline et/ou PAbetaN selon le Tableau I : Tableau I : milieux testés en vue d'évaluer l'impact de la cloxacilline et/ou du
PabetaN sur les CMI des souches RI ou productrices de carbapénémases (boite de Pétri 90 mm).
J A B C
Mueller Hinton Taux de reconstitution 38g/l
Cloxacilline (concentration en mg/l) - 200 - 200 PAbetaN^^
2. Essai o Réalisation pour chaque souche d'une suspension à environ 0,5 McF en ampoule NaCI 0,85%.
o Ensemencement des 4 milieux par écouvillonnage semi-automatique, o Séchage des boîtes à température ambiante 5 à 15 min.
o Dépôt de la bandelette E-test® ertapénème.
o Incubation 16 à 20 heures à 37°C.
3. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le Tableau II pour les souches RI et dans le Tableau III pour les souches productrices de carbapénémases.
Tableau II : impact de la cloxacilline (CLX) et/ ou du PAbetaN sur les CMI des souches RI (comparaison par rapport aux CMI du milieu sans cloxacilline ni PAbetaN).
CLX PAbetaN CLX+PAbetaN
Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de
CM I CMI CM I CM I CMI CMI
Dbacter 1 - 1 1 10 - 2 - - 12 acter - - 1 1 - - - - 1
JS - - 3 3 - - - - 3 inella - - 2 2 - - - - 2
Jomonas - 1 - 1 - - - 1 -
,L 1 1 17 17 0 2 0 1 18
* ou impact non mesurable dans la gamme de concentration en ertapénème testée
(cas des CMI > 32)
Dans tous les cas (sauf 1 ) où la cloxacilline et/ou le PAbetaN ont un impact de plus de 2 pas sur les CMI des souches RI testées, (les « pas » de CMI sont définis comme des dilutions de 2 en 2), il s'agit d'une diminution des CMI à l'ertapénème. Dans un cas (souche E. aerogenes 9306074), la CMI a augmenté en présence de PAbetaN seul (CMI=6 sans PAbetaN et CMI>32 en présence de PAbetaN).
Pour les 17 souches dont les CMI sont déjà diminuées de plus de 2 pas en présence de cloxacilline, l'effet du PAbetaN est le suivant (par rapport aux CMI avec cloxacilline) :
o 7 ont des CMI diminuées de 2 pas de CMI supplémentaires en présence de cloxacilline + PAbetaN
o 5 ont des CMI diminuées de façon moins significative (≤ 2 pas de CMI)
o 1 n'est pas impactée
o pour 4 souches, l'impact n'est pas évaluable dans la gamme de concentration en ertapénème testée (CMI <0,002 en présence de cloxacilline seule, ou combinée au PAbetaN) Pour les 2 dernières souches (peu ou pas impactées par la cloxacilline seule), une n'est pas affectée par l'ajout de PAbetaN en plus de la cloxacilline (P. aeruginosa), tandis que l'autre (E. cloacae) voit sa CMI très réduite en présence de cloxacilline+PAbetaN (CMI >32 si cloxacilline seule, et CMI=0,023 si cloxacilline+PAbetaN).
Tableau III : impact de la cloxacilline et/ ou du PAbetaN sur les CMI des souches productrices de carbapénémases (comparaison par rapport aux CMI du milieu sans cloxacilline ni PAbetaN).
CLX PAbetaN CLX + PAbetaN
Pas < 2 pas > 2 pas de CMI Pas < 2 pas de CMI > 2 pas Pas < 2 pas de CMI > 2 pas impact* de CMI impact* de CMI impact* de CMI
"M\ négatif positif négatif positif négatif - positif positif négatif positif
2 - - - 2 - - - 2 - - -
7 16 2 1 3 14 2 7 2 17 3 4
10 16 2 1 5 15 2 7 4 18 3 4 ou impact non mesurable dans la gamme de concentration en ertapénème testée
(cas des CMI > 32)
4. Interprétation
L'ajout de cloxacilline dans le milieu Mueller Hinton permet de réduire très nettement (de plus de 2 pas de concentration) les CMI à l'ertapénème de la majorité des souches RI testées (16/19). L'ajout de PAbetaN seul n'a pas d'impact sur la majorité des souches de RI testées. A l'inverse, l'ajout de PAbetaN à un milieu contenant de la cloxacilline vient renforcer l'effet de celle-ci en diminuant encore les CMI des souches RI de façon significative (de plus de 2 pas de concentration pour 7 souches) ou plus modérée (2 pas de concentration ou moins pour 5 souches).
La cloxacilline n'a pas d'impact (9 souches) sur les CMI à l'ertapénème des souches productrices de carbapénémases (NDM ou KPC) ou tend à les réduire faiblement (16 souches). A l'inverse, l'ajout de PAbetaN seul dans le milieu Mueller Hinton tend à augmenter légèrement (15 souches) ou très nettement (7 souches) les CMI à l'ertapénème de ces souches. Le fait d'associer la cloxacilline et le PAbetaN permet d'avoir des résultats similaires au PAbetaN seul, même si l'effet positif du PAbetaN sur les CMI est légèrement diminué par celui négatif de la cloxacilline.
5. Conclusion
L'utilisation de la cloxacilline seule (200mg/L) permet de diminuer significativement les CMI à l'ertapénème de la majorité des souches RI testées. L'ajout de PAbetaN vient renforcer cet effet de la cloxacilline.
A l'inverse, l'association cloxacilline + PAbetaN permet une augmentation (modérée à forte) des CMI à l'ertapénème des souches productrices de carbapénémases.
Ainsi, dans le cadre d'un milieu de criblage pour des souches productrices de carbapénémases, l'ajout de cloxacilline seule ou combinée avec le PabetaN permet de mieux inhiber la croissance indésirable des RI, tout en n'ayant pas d'effet, ou un effet légèrement positif, sur la croissance des souches productrices de carbapénémases.
Exemple 2
Impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des souches résistantes par imperméabilité (RI) ou présentant un autre mécanisme de résistance non enzymatique, ou productrices de carbapénémases, en présence de faropenem.
1 . Milieux et microorganismes
Soixante dix-sept souches de bactéries Gram négatives, dont 71 entérobactéries et 6 non entérobactéries (bactéries non fermentant), dont les caractéristiques de résistances sont détaillées dans le Tableau IV, ont été testées sur des milieux contenant différentes concentrations de faropénème et de cloxacilline, avec ou sans PAbetaN, afin d'établir la sensibilité et la spécificité de chaque formulation. Les milieux testés sont décrits dans le Tableau V.
Tableau IV : mécanismes de résistance aux antibiotiques caractérisant les souches testées. Nombre de souches
BLSE (7), Céphalosporinase AmpC (9) 16
Carbapénémase de Classe A type KPC (KPC) 10
Carbapénémase de Classe A autre que KPC (Class A) 5
Carbapénémase de Classe B type NDM-1 (NDM) 15
Carbapénémase de Classe B autre que NDM (Class B) 6
Carbapénémase de Classe D type OXA (OXA) 6
Résistance par imperméabilité RI] 19
Tableau V : composition des milieux testés
T 1 5 9 2 6 10 3 7 1 1 4 12 13 16 19 14 17 20 15 18 2
ie(mg/L) eJj^JLsdL JL 16 32 8 I 16 I 32 32 16 16 8 llll3
2. Essai
Les milieux chromogéniques sont répartis en boîtes carrées 120x120.
L'ensemencement est effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37 °C sur gélose trypcase soja. Pour chaque souche, une suspension à 0,5 McF en eau physiologique est réalisée. Chaque suspension est ensemencée en spot (1 à 2 μί) sur chaque milieu à l'aide d'un inoculateur multi-points selon la méthode de dilution en gélose (DEG). Des lectures sont effectuées après 24 heures d'incubation à 37°C.
3. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le Tableau VI.
Une absence de croissance bactérienne ou un nombre de colonies inférieur ou égal à 3 sont considérés comme correspondant à une inhibition de croissance. La présence de 4 colonies ou plus est considérée comme croissance posiive.
Tableau VI : impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur la croissance (nombre de souches se développant) des souches productrices de carbapénémases ou résistantes aux beta-lactamines du fait d'un autre mécanisme de résistance, en présence de faropénème T 1 5 9 2 6 10 3 7 1 1 4 8 12 13 16 19 14 17 20 15 18 2
0 25
mg/L) C ) 50 100 200 50 100 200 ie(mg/L) 0 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 3
BLSE 7 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 3 1 0 1 0 0 1 0
AmpC 9 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 4 3 2 3 2 2 2 2
Rl 19 16 15 10 14 9 4 11 6 2 11 6 1 11 10 5 10 5 1 7 1
Total non
35 20 18 12 17 11 6 14 8 4 14 8 2 18 14 7 14 7 3 10 3 inémases
Classe A 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Classe B 6 4 3 3 4 4 3 3 3 3 3 3 3 5 3 2 4 2 2 4 2
KPC 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
NDM 15 12 8 8 12 8 6 12 9 7 12 8 7 14 12 8 12 12 6 10 9
OXA 6 4 4 2 4 4 1 4 3 2 4 4 1 5 4 0 5 4 0 5 4
Total
42 35 30 28 35 31 25 34 30 27 34 30 26 39 34 25 36 33 23 34 30 2 inémases
4. Interprétation
Tableau VII : sensibilité et spécificité de milieux contenant du faropénème en présence de cloxacilline, combinée ou on au PAbetaN, vis-à-vis de souches productrices de carbapénèmases ou résistantes aux beta-lactamines du fait d'un autre mécanisme de résistance.
T 1 5 9 2 6 10 3 7 1 1 4 8 12 13 16 19 14 17 20 15 18 21
I (mg/L) 0 25
cilline
0 50 100 200 50 100 200
)
lénème
0 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 )
bilité (%)
100 83 71 67 83 74 60 81 71 64 81 71 62 93 81 60 86 79 55 81 71 55 ficité (%) 0 43 49 66 51 69 83 60 77 89 60 77 94 49 60 80 60 80 91 71 91 97
4a. Impact de la cloxacilline et du PAbetaN sur les souches Rl
Tableau VI II : effets de la cloxacilline associée ou non au PAbetaN sur la croissance des 19 souches Rl testées. mg/L) 0 25
mg/L) c 50 100 200 50 100 200 ie(mg/L) 0 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 3 veloppant
j o 6 6 jo Le faropénème seul a peu d'impact sur ces souches, jusqu'à une concentration de 16 mg/L
On observe une inhibition des souches RI dès ajout de 50 mg/L de cloxacilline, encore plus marquée pour les concentrations les plus élevées en faropénème testées (16 et 32 mg/L). Cet effet inhibiteur augmente avec la concentration de cloxacilline (par exemple, pour une concentration de 16 mg/L de faropénème, l'ajout de cloxacilline à 50 mg/L ou 200 mg/L permet respectivement l'inhibition de 6 et 9 souches de RI supplémentaires). On observe un effet combiné de la concentration en faropénème et de celle en cloxacilline sur les souches RI.
Ces résultats confirment également la meilleure inhibition des souches RI en présence de cloxacilline + PAbetaN. Cet effet est visible pour la plupart des concentrations de cloxacilline et faropénème testées, mais est très nettement marqué en présence de 200 mg/L de cloxacilline (quelle que soit la concentration en faropénème).
4b. Impact de la cloxacilline et du PAbetaN sur les souches productrices de carbapénémases
Les résultats obtenus en présence de faropénème confirment que la cloxacilline seule a peu ou pas d'impact sur la croissance des souches productrices de carbapénémases (aux 3 concentrations de faropénème testées). Ils confirment également que le fait d'associer le PAbetaN à la cloxacilline permet d'augmenter la CMI de certaines souches aux carbapénèmes tant que la concentration en faropénème reste inférieure à 32 mg/L. Ainsi, la sensibilité de détection en présence de 8 ou 16 mg/L de faropénème associé à 50 ou 100 mg/L de cloxacilline est supérieure en présence de PAbetaN. Pour 200 mg/L de cloxacilline et 8 ou 16 mg/L de faropénème, l'ajout de PAbetaN ne modifie pas la sensibilité de détection.
5. Conclusion
Ces résultats confirment le rôle inhibiteur de la cloxacilline sur les souches résistantes par imperméabilité, en présence d'un carbapénème. Ces résultats confirment également la meilleure inhibition des souches RI lorsque la cloxacilline est associée au PAbetaN. L'ajout de cloxacilline et de PAbetaN permet ainsi d'augmenter très fortement la spécificité du milieu.
L'ajout dans le milieu de cloxacilline (aux 3 concentrations testées) et de PAbetaN (25 mg/L) n'altère pas la détection des souches productrices de carbapénémases en présence de 8 ou 16 mg/L de faropénème. Il est confirmé que l'ajout de PAbetaN tend à améliorer leur détection à des concentrations de faropénème égales à 8 ou 16 mg/L, associées à la cloxacilline à 50 ou 100 mg/L.
En présence de faropénème, on confirme donc les résultats observés avec l'ertapénème (E-test), à savoir une meilleure inhibition des souches RI par l'ajout de cloxacilline et une amélioration de la détection des souches productrices de carbapénémases en présence de PAbetaN.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de détection de bactéries productrices de carbapénémases dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à :
o mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un carbapénème et de la cloxacilline,
o incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries productrices de carbapénémases, et
o détecter les souches correspondant aux bactéries productrices de carbapénémases.
2. Procédé de détection et/ou d'identification de bactéries productrices de carbapénémases dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à :
o mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un carbapénème, de la cloxacilline, et au moins un substrat chromogène,
o incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries productrices de carbapénémases, et
o détecter les souches correspondant aux bactéries productrices de carbapénémases.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le milieu réactionnel comprend également du phenylalanine-arginine beta-naphtylamide (PAbetaN).
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel les carbapénèmes sont choisis parmi : l'ertapénème, le méropénème, le doripénème, le faropénème.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la concentration en cloxacilline est comprise entre 25 et 300 mg/L.
6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, dans lequel la concentration en PAbetaN est comprise entre 1 et 50 mg/L.
7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, dans lequel le substrat chromogène détecte une activité choisie parmi : la glucuronidase, la glucosidase, la galactosidase, l'estérase, la sulfatase et la désaminase.
8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, dans lequel le substrat chromogène est choisi parmi : le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- beta-D-glucopyranoside (X-glucoside), le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl- beta-D-galactopyranoside (Magenta beta-Gal), le 6-Chloro-3-indoxyl- beta-D-glucuronide (Rose beta Gur), le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl- beta-D-glucopyranoside (Green A beta Glu), le L-Tryptophane
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le milieu réactionnel est un milieu de culture liquide ou solide.
10. Milieu de culture pour détecter et/ou identifier des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes, comprenant un milieu de culture de base, au moins un substrat chromogène, au moins un carbapénème et de la cloxacilline.
1 1 . Milieu de culture selon la revendication 10, comprenant en outre du phenylalanine-arginine beta-naphtylamide (PAbetaN).
12. Utilisation de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN pour détecter et/ou identifier spécifiquement des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.
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