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EP2265624A1 - Procede de preparation de nucleotides et analogues a façon par synthese sur support soluble et outils biologiques prepares - Google Patents

Procede de preparation de nucleotides et analogues a façon par synthese sur support soluble et outils biologiques prepares

Info

Publication number
EP2265624A1
EP2265624A1 EP09723437A EP09723437A EP2265624A1 EP 2265624 A1 EP2265624 A1 EP 2265624A1 EP 09723437 A EP09723437 A EP 09723437A EP 09723437 A EP09723437 A EP 09723437A EP 2265624 A1 EP2265624 A1 EP 2265624A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peg
nucleoside
och
nmr
mhz
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09723437A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Suzanne Peyrottes
Christian Perigaud
Céline CRAUSTE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2265624A1 publication Critical patent/EP2265624A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of nucleotide monomers or monomers of nucleotide analogues on a soluble support, more precisely a method for preparing nucleotides, that is to say mono-, di- and triphosphate nucleosides.
  • the chemical synthesis of nucleotides and oligonucleotides has been the subject of intense research since the early eighties.
  • a method for synthesizing oligonucleotides on a solid support was developed by McBride and Caruthers. This method, called “phosphoramidites”, uses a solid support to which a nucleoside is attached.
  • the solid supports used in this method are glass beads of controlled porosity.
  • the first nucleoside is attached to the solid support via the hydroxyl at the 3 'position and the synthesis progresses from the 3' end to the 5 'end of the nucleic acid chain. More specifically, by removing a labile acid protecting group at the 5 'position, a hydroxyl function is released.
  • the terminal nucleophilic group is then coupled to a 3'-O-phosphoramidite monomer protected at the 5 'position and optionally on the heterocycle, in the presence of an activator.
  • the 3 ', 5' phosphite triester bond is then oxidized to give a phosphotriester bond.
  • the solid support methods have certain disadvantages, for example a nonlinear behavior in terms of kinetics, an irregular distribution on the support or because of the support, problems of solvation, a rate of insufficient coupling or synthesis problems due to the heterogeneous nature of the reaction conditions, and more specifically of the reaction medium.
  • the solid supports are very expensive, which makes the large-scale synthesis very expensive.
  • the conventional solid phase synthesis efficiency is not always satisfactory, particularly in view of the difficulties of purification of the product and separation of the product from the truncated sequences.
  • the reaction monitoring can be difficult.
  • Other alternative methods have therefore been sought, which would implement more homogeneous reaction conditions and the use of soluble polymeric supports has been proposed.
  • cleavage methods were then used, such as those induced by labile acid or base linkages, labile thiol linkages and photolitic release of the peptides after synthesis.
  • a recent method for synthesizing oligopeptides, oligosaccharides and oligonucleotides using liquid phase synthesis is described in WO2006096963.
  • the ionic liquid used as a liquid carrier is an organic salt of onium type, for example a heterocyclic quaternary ammonium cation and an anion, for example CI “ , Br “ , BF 4 " , PF 6 “ , SbF 6 “ , CuCl 2 " and AICI 4 ".
  • cations also include substituted pyridines and imidazoles 1, 3-disubstituted.
  • Donga et al, J. Org. Chem. 71, 7907-7910 (2006) describes the synthesis of oligonucleotides on soluble support ionic liquid type (ILSS) with high yields and with such purity that no chromatography step is necessary for the purification of the intermediates before the cleavage of the support
  • the soluble ion carrier is synthesized from N
  • the 3'-succinylated 5'-DMT-thymidine derivative was coupled to the ionic liquid using dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and a catalytic amount of 4- (d) -methylimidazole and 2-bromoethanol, and then isolated by anion-exchange chromatography.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • Parang et al in Organic Letters Vol. 3, No. 2 discloses a supported reagent for producing carbohydrate monophosphates and a nucleoside using a polystyrene-divinylbenzene crosslinked copolymer functionalized with cyanoethyl-N, N-diisopropyl phosphoramidite as a phosphitylation agent.
  • This immobilized agent is coupled with alcohols in the presence of 1H-tetrazole to produce polymer-bound phosphite triesters which are then oxidized to the corresponding phosphotriesters.
  • the invention relates to a novel nucleotide process for preparing phosphorylated nucleosides or analogs (scheme below), these derivatives pr ⁇ " ⁇ " as an interest as potential therapeutic agents, tools
  • a nucleoside or a nucleoside analogue (below pyrimidine having an exocyclic amino function) is coupled via an arm (linker) to a soluble polyethylene glycol carrier.
  • R 2 to R 5 have the meanings given below.
  • the present invention relates to a method using a soluble support for producing nucleotides or nucleotide analogues.
  • the invention provides a process for preparing nucleotide monomers or nucleotide analogs with high yields.
  • the monomers obtained are nucleosides or analogs of mono-, di- and triphosphated nucleosides.
  • the purification steps are very simplified, which has a favorable influence on the yields.
  • the present invention also relates to nucleotide monomers and nucleotide analog monomers obtained by the method as biological tools.
  • the present invention relates to a process for the preparation of nucleotides or monomeric nucleotide analogues comprising the steps of: (1) coupling a soluble polyethylene glycol carrier provided with at least one diacid or ether-acid linker and a nucleoside or monomeric nucleoside analogue, via an exocyclic amino group or hydroxyl of the nucleoside, using a coupling agent; (2) at least one phosphorylation of said nucleoside or nucleoside analog coupled to the support with a phosphorylation agent.
  • the attachment arm is attached to the PEG-type soluble support, and then this support is coupled to a nucleoside or the like via the linking arm, and phosphorylated. then the coupled nucleoside, in one or more stages of phosphorylation.
  • the nucleotide can then be cleaved to recover it.
  • This method makes it possible to obtain biological tools or phosphorylated effectors (mono-, di- and triphosphate nucleosides), nucleotides or the like, whether natural or not, avoiding the usual long, tedious and expensive purification steps.
  • the synthesis takes place in solution, which allows a reaction monitoring and the characterization of the intermediates by usual techniques.
  • This supported technique has the advantages of facilitated purification of intermediate and final products, the more often ionic, and allows the elimination of the reagents used in excess.
  • the commercial AraCTP has a cost more than 13 times higher than the cost price (reagent and material) by the method proposed according to the invention. From the point of view of yields, the method of the invention is also superior to the usual methods.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating, on the one hand, the stowage (a) of various linking arms on soluble supports, as well as the supports once these arms are attached, and then the functionalization of a soluble support by coupling (b). with a nucleoside, via the exocyclic amine function of a heterocycle R 1 NH 2 .
  • FIG. 2 is a diagram showing, illustrated for the case (a-2), phosphorylation steps which can be carried out in particular starting from the grafted nucleosides of FIG. 1.
  • a direct (D) diphosphorylation and a monophosphorylation (e) can be followed, following an activation step, by a second monophosphorylation (g) leading to diphosphate nucleosides, or two successive monophosphorylations (g) or a diphosphorylation (f), leading to triphosphate nucleosides.
  • the first step according to the invention consists in coupling a nucleoside monomer on a soluble support having a linker.
  • a soluble carrier according to the invention, it is possible to use a polyethylene glycol carrier (PEG) having at least one acid, diacid or ether-acid junction arm. At least one arm means one or two. More specifically, the PEG provided with at least one linking arm may have the formula
  • p or n 'in formula (I) is less than 6 and preferably, p or n' in formula (I) is an integer ranging from 0 to 4 and in formula (II) m and m 'are preferably 1 or 2.
  • a preferred linker is of the succinate type.
  • the alkyl radical is preferably linear or branched, C 1 -C 12
  • the aryl radical is preferably selected from phenyl, tolyl and o-tolyl.
  • R is methyl or benzyl.
  • polyethylene glycol (PEG) is not limited to polyethylene glycol itself but includes any derived polyethylene glycol, for example having hydroxyl groups at both ends or a hydroxyl group at one end and a methoxy group at the other, polyethylene glycol monomethyl ether and poly (oxyethylene) glycol or the like.
  • soluble carrier means a polyethylene glycol carrier having a diacid arm or an ether-acid arm of junction or two such arms.
  • the soluble carrier of the present invention is a polyethylene glycol (PEG), polyethylene glycol monomethyl ether or a poly (oxyethylene) glycol having at least one diacid or ether-acid arm.
  • PEG polyethylene glycol
  • the molecular weight of said PEG according to the invention is preferably in the range of from about 3,000 to about 6,000.
  • the PEG has a molecular weight of about 4,000.
  • the diacid or ether-acid arm is attached to the PEG by various methods depending on the type of linker to be attached, the general method being illustrated in the examples.
  • the procedure comprises dissolving the PEG in a solvent, adding the corresponding acid anhydride, stirring at room temperature, and then concentrating of the reaction mixture under reduced pressure, and precipitation of the PEG comprising the diacid arm.
  • the promoter of the arm is succinic anhydride.
  • an oxalate arm it is oxalyl chloride which is used. More generally, a carboxylic acid derivative, anhydride or acid chloride, for example, may be used to functionalize PEG.
  • the ether-acid arm can for example be obtained by two synthesis routes involving the oxidation of the terminal alcohol of the support, as illustrated in the examples or by reaction of the PEG with an alkyl acrylate. If the arm is ethanoic acid, the process for forming the arm comprises, for example, the oxidation of PEG with chromium salts, the stirring of the mixture at room temperature and the precipitation of the modified PEG.
  • the process for forming the arm comprises, for example, the oxidation of PEG with chromium salts, the stirring of the mixture at room temperature and the precipitation of the modified PEG.
  • the phosphorylation reaction is carried out in the same way regardless of the nature of the arm.
  • the connecting arm can remain attached to the PEG support during the cleavage step.
  • the PEG can be bifunctional (HO-PEG-OH), where R is H and has two linking arms (a-2; a-4) or monofunctional (RO-PEG-OH) and carrying then a linking arm (a-1; a-3), R representing alkyl, benzyl or aryl.
  • the PEG-OH is functionalized with t-butyl acrylate, and after a deprotection step, the PEG functionalized PEG-PEG-O acid (CH 2 -
  • PEG-bis OCH 2 CH 2 -CO-nucleoside
  • a particular advantage of PEGs functionalized by an arm of 3-hydroxypropanoic acid lies in the simplification of the subsequent procedure.
  • the support is brought into contact with the nucleoside or the nucleoside analogue.
  • Coupling with the soluble support can take place via an exocyclic amino group, using a coupling agent and leading to the formation of an amide bond, this variant being illustrated in FIG. b) or via a hydroxyl group of the nucleoside analogue or nucleoside and leading to the formation of an ester linkage.
  • the coupling is carried out on the exocyclic amino function.
  • the coupling is carried out on the exocyclic nitrogen of the nucleoside base.
  • these are, for example, the exocyclic amino function of cytosine, among pyrimidine bases, and adenine or guanine, among the purine bases, illustrated in FIG. 1 (b and c).
  • the coupling method may vary depending on the nucleoside to be coupled and the support chosen.
  • the linker PEG is mixed with the nucleoside or nucleoside analog that is to be phosphorylated, and the coupling agent is added to the mixture.
  • the reaction mixture is stirred for a time sufficient to obtain the coupling, the solvents are evaporated and the final product precipitated, optionally recrystallized.
  • nucleoside is meant here various compounds comprising on the one hand a sugar and on the other hand a heterocycle. Natural nucleosides are substances whose hydrolysis gives a molecule of ribose or deoxyribose and a purine heterocycle (adenine, guanine) or pyrimidine (cytosine, uracil, thymine). The nucleoside monomers, nucleosides and nucleoside analogues of the invention may be natural or synthetic.
  • nucleoside analogue or “analogous nucleoside” is meant, according to the invention, any modified nucleoside, that is to say a compound having a structural analogy with a nucleoside.
  • nucleoside analog or “nucleotide analog” means, according to the invention, any modified nucleotide, that is to say having a structural analogy with a nucleotide.
  • the analogs may thus comprise one or more modifications on the osidic cycle and / or on the aglycone, the pyrimidine or purine bases for example being able to carry modifications of their heterocycle.
  • FIG. 1 illustrates some of these compounds, and R 1 to R 6 on the osidic ring representing the usual substituents of natural or non-natural saccharide residues.
  • R 1 to R 6 independently of one another, may represent H, OH, halo, an alkyl group, O-alkyl, alkenyl, C 1 -C 4 alkynyl, alkylamino, amino, hydroxylamino, azido, nitro, cyano, or any other substituent capable of forming a modified nucleoside.
  • the nucleoside to be coupled is noted as R 1 NH 2 . It is a sugar-base assembly with an exocyclic amine (NH 2 ), and R 'represents the sugar-base combination, without this exocyclic amine NH 2 of the base which will couple with the soluble support arm (b).
  • the base is pyrimidine and in the osidic ring, W can be CH 2 , CHX or CX 2 (X is halo here) to form a carbocycle, when Y and Z are also carbon atoms, but W can also represent O or S, Y and Z represent carbon atoms, or W and Z can represent O or S, Y represents CH 2 , or Y and W can represent O or S, Z representing CH 2 .
  • the base may carry a halogen, X 'preferably being H or F.
  • the base is purified, W may be CH or CF, and X' is then H , or represent N, and X 'can then represent F for example.
  • the sugar may be a ribose or a deoxyribose or any other analog of the arabinofuranose type, for example.
  • the definition of the analogous nucleosides of the invention is thus not limited to the compounds illustrated in FIG.
  • nucleosides or nucleoside analogs used as starting material in the process of the invention comprise an amino exocyclic group or a hydroxyl group which allows their coupling to the binding arm of the soluble support.
  • nucleosides containing bases are for example adenosine, guanosine, cytidine. They may also be the corresponding deoxynucleosides, deoxyadenosine, deoxyguanosine, or deoxycytidine.
  • nucleoside analogs can be modified on the basis of purine or pyrimidine, and / or on the carbohydrate (sugar) group.
  • nucleosides and nucleoside analogues more specifically used as starting materials are given below: 3'-O-acetyl-2'-deoxycytidine, allopurinol riboside, 2-amino-6-chloropurine riboside, 2'- deoxyuridine, cytidine, 2'-deoxycytidine, 5-aza-2'-deoxycytidine, 8-azaguanine, 8-bromoguanosine, 8-bromoguanosine, 2-chloroadenosine, 2-chloro-N 6 -cyclopentyladenosine, 5-chlorocytosine arabinoside, 2- chloro-2'-deoxyadenosine, 5-chloro-2'-deoxyuridine, 6-chloropurine riboside, 2'-deoxyaden
  • the coupling is carried out using at least one coupling agent which may be chosen from a carbodiimide, an aromatic oxime or onium-type coupling agents, that is to say, for example ammonium, phosphonium or uronium of a nucleophilic anion, or their analogues.
  • a carbodiimide mention may be made of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or diisopropylcarbodiimide (DIC).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • the aromatic oxime there may be mentioned 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) or 1-hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt) and the like.
  • phosphonium in particular phosphonium, mention may be made of (2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), hexafluorophosphate of (2- (1) 1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium (HATU) or benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), and the like.
  • Coupling agent is dimethylaminopyridine (DMAP).
  • the amounts used in the coupling reaction depend on the amounts of nucleosides or analogs involved. Generally, for 1 to 5 eq of nucleoside, 1 to 10 eq of coupling agent is used. It is also possible to use 1 to 2 eq of nucleoside and 1 to 4 eq of coupling agent Generally, one equivalent of the soluble support having one or two linkers is coupled to one or two equivalents of the nucleoside or the like.
  • nucleotide is meant here monomers consisting of a heterocycle and a sugar and at least one phosphorylated group.
  • Nucleotides produced by the method of the present application include mono-, di- or triphosphate nucleosides. The nucleotides can thus be natural or synthetic.
  • nucleotides and analogues of modified nucleotides on the sugar or the base, as were the nucleosides or the like are obtained according to the invention. starting nucleoside, and also nucleotides that can be modified on the phosphate or phosphates.
  • the base-modified nucleotide analogues may be: 2'-deoxyinosine 5'-triphosphate, 2-amino-2-deoxyadenosine 5'-triphosphate, 5-aminoallyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate, 5-fluorocytidine 5'-monophosphate, 2-fluoroadenosine 5'-monopohosphate, 5-iododeoxyuridine 5'-triphosphate, 5-trifluoromethylthymidine 5'-triphosphate, 5- (2-chloroethyl) deoxyuridine 5'-triphosphate, 5-ethyldeoxyuridine 5 ' -triphosphate, (E) -5- (2-bromovinyl) deoxyuridine 5'-triphosphate, 5-fluorodeoxyuridine 5'-triphosphate, 6-thlopurine riboside 5'-triphosphate, 2-chlorodeoxyadenosine 5'-triphosphate
  • nucleoside triphosphates modified on the sugar part are the following: 2 ', 3'-dideoxyadenosine 5'-triphosphate, 2', 3'- deoxycytidine 5'-triphosphate, 2'amino-2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate and the like.
  • modified nucleotide analogs on both the base and the osidic residue may be: arabinosyl-5-azacytosine 5'-triphosphate, 2-fluoroarabinofuranosyladenosine 5'-triphosphate, 1- (beta-L-ribofuranosyl) 2-Isopropylamino-5,6-dichlorobenzimidazole 5'-triphosphate, 7-deaza-2'-C-methyladenosine 5'-triphosphate, 2-amino-9-beta-D-arabinofuranosyl-6-methoxy-9H-purine '-triphosphate, 1- (beta-L-2-fluoro-2-desoxyarabinofuranosyl) -5-methyluracil 5'-triphosphate.
  • nucleosides modified on phosphate are the following: 2 ', 3'-dideoxyadenosine 5'-O- (1-thiotriphosphate), 2', 3'-dideoxycytidine-5'-O- (1-thiotriphosphate), 2 ', 3'-dideoxyguanosine-5'-O- (1-thiotriphosphate), 2'-deoxyadenosine-5'-O- (1-thiotriphosphate), 2'-deoxycytidine-5'-O- (1-thiotriphosphate), 2'-deoxyguanosine-5'-O- (1-thiotriphosphate), 2'-deoxythymidine-5'-O- (1-thiotriphosphate), adenosine-5'-O- (1-thiotriphosphate), cytidine-5'- O- (1-thiotriphosphate), guanosine-5'-O- (1-thiotriphosphate), adenosine 3 ', 5' cycl
  • nucleoside Starting with a nucleoside or the like attached to the soluble support, the nucleoside is mono-, di- or triphosphorylated in one or two or three stages of phosphorylation.
  • monophosphorylation (e) is carried out.
  • a diphosphorylation is carried out. This can be carried out directly in one step with a diphosphorylating agent (d), or in two successive monophosphorylation steps (e) then (g), the second monophosphorylation (g) can be activated.
  • triphosphorylation is carried out. This can be carried out by diphosphorylation (d) with a diphosphorylating agent, followed by monophosphorylation or by monophosphorylation (e), followed by diphosphorylation (f) or followed by two successive monophosphorylations (g).
  • the second phosphorylations are activated.
  • a phosphorylating agent is used. Depending on the nature and reactivity of this agent, prior activation may be necessary.
  • a phosphorus oxychloride phosphorylating agent is added for the monophosphorylation of the polymer-supported nucleoside and the supported nucleoside monophosphate is extracted and / or isolated by precipitation.
  • the supported nucleoside monophosphate is dissolved in a suitable solvent, activated and then brought into the presence of phosphorylating agent of the tributylammonium phosphate type and the expected compound is precipitated.
  • the nucleoside monophosphate on a polymer support in a suitable solvent is activated, then brought into contact with phosphorylating agent of the tributylammonium pyrophosphate type and the expected product precipitated.
  • W 1 and Z ' have the above meaning capable of mono- and diphosphoryl are less effective and may require activation of the nucleoside or r "" ' ⁇ ⁇ nucleoside eu.
  • phosphorylation agent mention may be made especially of phosphorus (III) derivatives or phosphorus (V) derivatives.
  • Phosphorus oxychloride phosphorylating agents are suitable for monophosphorylation, for example selected from phosphorus oxychloride, thiophosphate trichloride, 4-nitrophenyl dichlorophosphate, O- (2-chlorophenyl) dichlorothiophosphate, aminomethyl phosphonic acid, aminomethyl (methyl) phosphonic acid, 2-chloro-1,3,2-dioxaphospholane, 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane, 2-chloro 4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, barium 2-cyanoethylphosphate, diethylchlorothiophosphate, dimethylchlorothiophosphate, methylphosphorodichloridate, phenyl-dichlorophosphate, methyldichlorophosphite and diphenylphosphite and the like and also 2-chlorophenylphosphorodichloridate, 4-chlorophen
  • Preferred according to the invention are phosphorus oxychloride, thiophosphate trichloride, 4-nitrophenyl dichlorophosphate, tributylammonium phosphate and diphenylphosphite.
  • tributylammonium pyrophosphate diphosphorylation agents mention may be made of etidronic acid, the salts of imidodiphosphate, imino di (methylphosphonic acid), pyrophosphoryl tetrachloride, methylbis (dichlorophosphonate), and the like.
  • methylene bisphosphonic acid Tributylammonium pyrophosphate and methylenebisphosphonic acid are preferred according to the invention.
  • phosphorylation agents depend on their reactivity. In general, 10 to 30 equivalents of phosphorylating agents are used for 1 to 2 equivalents of the nucleoside coupled to the support, preferably 15 to 30 equivalents of phosphorylating agents.
  • activating agents include eg sesitylsulfonylnitrotriazole (MSNT), the capsidazole (STDs), ch 1 "- 11"? of mesitylsulfonyl (MSCI), tri-isopropylsulfonyl chloride (TPSCI), Tf 2 O / dimethylaminopyridine system (DMAP), 1,1-carbonyldiimidazole (CDI) and the like.
  • the activating agents are used in amounts of the order of 1 to 10 equivalents, preferably 3 to 6 equivalents.
  • the soluble support can be dissociated from the nucleotide or the analog of the nucleotide obtained, this being achieved using a cleavage agent.
  • Any base or nucleophile can be used as a cleavage agent.
  • ammonia sodium hydroxide, sodium methoxide, ammoniacal methanol or potassium cyanide and the like can be used.
  • nucleotides cleaved from their support as produced by the process of the present application can then be isolated by any method of the art.
  • Liquid chromatography (LC) or HPLC can be used, for example on a reverse phase column.
  • the dialysis can be carried out by any suitable method, for example on cellulose ester membrane.
  • the cleaved arm separates from the substrate and the support. This can make dialysis beneficial for purifying.
  • the compound derived from the hydrolysis of the arm can contaminate the substrate and dialysis can then be considered as a purification step.
  • dialysis may not be necessary for the ether-acid arms.
  • the cleavage of the arm makes it possible to directly obtain the expected nucleotide after elimination of the polymeric support, and this without having to perform dialysis.
  • the use of the functionalized PEG with an arm corresponding to 3-hydroxypropanoic acid (PEG-O (CH 2 ) 2 -COOH makes it possible to simplify the procedure, the dialysis step possibly being
  • the nucleotides and analogues obtained can be useful as effectors, biological tools for research, diagnosis or any therapeutic or pre-clinical application.
  • Example 1 Polyethylene Glycol-bis-Succinate, PEG 4 Ooo-bis-Succinate
  • PEG bis-succinate was precipitated by the addition of excess cold diethyl ether. The precipitate was filtered, washed with diethyl ether and dried under vacuum over KOH pellets to give PEG bis-succinate as a white solid (18.14 g, 86%).
  • Example 2 bis Poly (oxyethylene) 40 oo bis (2-hydroxypropanoic acid)
  • PEG-bis (O- (CH 2 ) 2 -COO 3) was dissolved in dichloromethane (20 ml) and an equal volume of TFA (trifluoroacetic acid) was added and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • N, N-dimethylformamide (30 ml) is added to a solution of PEG comprising two linking arms (0.95 mmol, 1 eq), for example PEG bis-succcinate, in dichloromethane (70 ml).
  • N, N-dicyclohexylcarbodiimide (3.79 mmol, 4 eq) and N-hydroxylbenzotriazole (1.89 mmol, 2 eq) are added and the resulting mixture is stirred at 60 ° C. for 7 h.
  • the solvents are evaporated under reduced pressure and the resulting residue dissolved in a minimum of dichloromethane and allowed to stand at 4 ° C overnight.
  • the precipitated dicyclohexylurea is separated by filtration.
  • Example 8a Poly (oxyethylene) 4 ooo bis [6-N- (1- (2'-deoxy-3 ', 5'-O- ((tetraisopropyl) disiloxane-1, 3-diyl) - ⁇ -D- ribofuranosyl) -adenosyl) succinate
  • Example 8b Poly (oxyethylene) 40 oo bis [6-N- (1- (2'-deoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -adenosyl) succinate
  • Example 9a Poly (oxyethylene) 40 oo bis [4-N- (1- ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) -cytosyl) -3-hydroxypropanamide]
  • Example 9b Poly (oxyethylene) 40 oo bis [4-N- (1- (2'-deoxy- ⁇ -D- ribofuranosyl) -cytosyl) -3-hydroxy-propanamide]
  • Example 11 bis Poly (oxyethylene) 40 oo bis [4-N- (1- ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) -cytosyl-5'-monophosphate) -3-hydroxypropanamide] triethylammonium salts
  • Example 6 The monophosphorylation of 0.50 g of PEG-O-bis (succ-C) (0.11 mmol) of Example 6 was carried out using Method B of Example 10, with 30 eq. phosphorus (0.29 g, 3.30 ml). The compound was obtained as a white solid (4.80 g, 89%).
  • Example 7 The monophosphorylation of 0.04 g of PEG-O-bis (succinyl-ddC) (0.09 mmol) of Example 7 was carried out by Method B of Example 10, using 30 eq. phosphorus (0.24 ml, 2.70 mmol), in the presence of activated molecular sieve (3). The expected compound was obtained as a white solid (0.41 g, 96%).
  • Example 19 Method D: Triphosphorylation; diphosphorylation of the nucleoside monophosphate on polymer support
  • the reaction mixture is stirred for 2h at room temperature and treated with anhydrous methanol (0.10ml). After 15 min, a solution of tributylammonium pyrophosphate in anhydrous N, N-dimethylformamide (1 M, 1.49 mmol, 15 eq) was added. The suspension is stirred for 24 hours at room temperature. The mixture was treated with an equal volume of methanol and then concentrated under reduced pressure. The residue precipitates in cold diethyl ether (50 ml). The precipitate is filtered and washed with diethyl ether. RP18 reverse phase column chromatography of the crude product is carried out with an acetonitrile gradient: 0 to 70% in water.
  • Triphosphorylation of 0.50 g of PEG-O-bis (succ-araCMP) (0.09 mmol) was carried out using Method D of Example 19 and provided the compound as a white solid ( 0.43 g, 69%) after lyophilization.
  • Example 20a Poly (oxyethylene) 4 ooo bis [4-N- (1- ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) - cytosyl-5'-triphosphate) -3-hydroxy-propanamide] tri-butylammonium salts
  • PEG-bis OCH 2 CH 2 -CO-AraCMP (0.70 g, 0.15 mmol) was carried out using method D and PEG-bis (OCH 2 CH 2 -CO-AraCTP) was obtained as a white solid (0.41 g, 55%) after lyophilization.
  • CH 2b 6Hz, 2H, CH 2 A), 1.51 (m, 18H); , (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2) s NH), 1.26 (m, 18H, (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2) s NH), 0.94 (t, 27H, (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 ) S NH).
  • Triphosphorylation of 0.30 g of PEG-O-bis (succ-dCMP) (0.06 mmol) was carried out using method D of Example 19 and provided the compound as a white solid (0). 27 g, 73%) after lyophilization.
  • Example 23 Poly (Ethylene Glycol) 4,000 Bis [4- ⁇ / - (1- ( ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosyl-5'-triphosphate) succinate] salts of f / v-ethylammonium and carbonyldiimidazolium
  • Example 26 Method E: Cleaving the Nucleotide from its Support The supported nucleotide (0.05 mmol, 1eq) is dissolved in concentrated ammonia (2 ml). The solution is stirred at ambient temperature for 1 h and then evaporated under reduced pressure. The purification is carried out by RP18 reverse phase column chromatography (isocratic water) followed by dialysis on cellulose ester membranes.
  • a supported nucleotide (0.05 mmol, 1 eq.) was dissolved in concentrated ammonia (2 ml). The solution was stirred at ambient temperature for 1 h and then evaporated under reduced pressure. Purification was performed by RP18 reverse phase chromatography (isocratic water) followed by lyophilization.
  • Example 26 the dialysis step is not performed.
  • Example 27 1- ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) -cytosine-5'-monophosphate, ammonium salt
  • Example 26 was applied to 0.15 g of PEG-O-bis (succinyl-araCMP) (0.02 mmol). Purification by column chromatography of the crude product gave a mixture of araCMP and succinamide in a ratio of 93/7 (15 mg). Succinamide was removed by dialysis in water (2 ml) overnight and araCMP (13 mg, 68%) was obtained as a white solid after lyophilization. Rf (iPrOH / H 2 O / NH 4 OH, 6/2/2, v / v / v): 0.2.
  • the E bis method was applied to PEG-bis (OCH 2 CH 2 -CO-AraCMP) (0.15 g, 0.02 mmol). Chromatographic column purification of the crude product afforded araCMP as a white solid (0.51 g, 70%) after lyophilization.
  • Example 28 1 - ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) -cytosine-5'-diphosphate, ammonium salts
  • Example 26 was applied to 0.34 g of PEG-O-bis (succinyl-araCDP) (0.05 mmol). Purification of the crude product on a chromatography column gave a mixture of araCDP and 88/12 succinamide (55 mg). A 10 mg sample of the mixture was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. AraCDP (8.5 mg, 96%) was obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 26 Method E of Example 26 was applied to 0.43 g of PEG-O-bis (succinyl-araCTP) (0.07 mmol). Purification on a chromatography column gave a mixture of araCTP and succinamide in the ratio 95/5 (68 mg). A sample of the mixture (8.5 mg) was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. AraCTP (8 mg, 92%) was obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 30 1- (2'-Deoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosine-5'-monophosphate ammonium salt
  • Example 26 was applied to 0.14 g of PEG-O-bis (succinyl-dCMP) (0.03 mmol). Purification on a chromatography column gave a mixture of dCMP and succinamide in the ratio 86/14 (17 mg). A sample of the mixture (10 mg) was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. The dCMP
  • Example 26 was applied to 0.21 g of PEG-O-bis (succinyl-dCDP) (0.03 mmol). Purification on a chromatography column gave a mixture of dCDP and succinamide in the ratio 90/10 (27 mg). A sample of the mixture (10 mg) was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. 9 mg of dCDP (86%) were obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 32 1- (2'-Deoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosine-5'-triphosphate, ammonium salts
  • Example 26 was applied to 0.25 g of PEG-O-bis (succinyl-dCTP) (0.04 mmol). Purification on a chromatography column gave a mixture of dCTP and succinamide in the ratio 94/6 (30 mg). A 10 mg sample of the mixture was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. 9 mg dCTP (70%) were obtained in the form of a white solid after lyophilization.
  • Example 33 1- ( ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosine-5'-monophosphate, ammonium salt
  • Example 26 was applied to 0.13 g of PEG-O-bis (succinyl-CMP) (0.02 mmol). Purification on a chromatography column gave 17 mg of a mixture of CMP and succinamide in the ratio 80/20. A 10 mg sample of the mixture was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. CMP (7 mg, 82%) was obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 34 1- ( ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosine-5'-diphosphate, ammonium salts
  • CDP 9 mg were obtained in the form of a white solid after lyophilization, contaminated with 7% of a by-product identified as cyclic cytidine 5'-diphosphate-2,3'-monophosphate analogue.
  • Example 35 1- ( ⁇ -D-Ribofuranosyl) -cytosine-5'-triphosphate, ammonium salts
  • Example 26 was applied to PEG-O-bis (succinylddCTP) (0.20 g, 0.03 mmol). Chromatographic column purification led to a mixture of the expected compound ddCTP and succinamide in a ratio of 92/8 (30 mg). A 10.5 mg sample of the mixture was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. ddCTP (9.50 mg, 67%) is obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 37 1- (2 ', 3'-dideoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosyl-5'-monophosphate), ammonium salt
  • Example 26 was applied to PEG-O-succinyl-ddCMP (0.16 g, 0.03 mmol). Purification on a chromatographic column led to a mixture of the expected compound ddCMP and succinamide in a ratio 86/14 (17 mg). Succinamide is removed by dialysis overnight in water (2 ml). ddCMP (14 mg, 79%) is obtained as a white solid after lyophilization.
  • Example 38 1- (2 ', 3'-dideoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosyl-5'-diphosphate), ammonium salts
  • Example 26 was applied to PEG-O-succinyl-ddCDP (0.18 g, 0.03 mmol). ). Chromatographic column purification led to a mixture of the expected compound ddCDP and succinamide in a ratio of 92/8 (17 mg). A 16 mg sample of the mixture was dissolved in water (2 ml) and purified by dialysis overnight. ddCDP (14.8 mg, 66%) is obtained in the form of a white solid after lyophilization.
  • Example 40 1- ( ⁇ -D-arabinofuranosyl) -cytosine-5'-monophosphate, sodium salt - - - - - - - -
  • Example 41 1- ( ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosine-5'-monophosphate, triethylammonium salt
  • araCMP in the form of its mono (triethylammonium) salt (0.10 g, 0.23 mmol) in water (1.80 ml) is added tributylamine (0.46 mmol, 2 eq. ). The mixture was stirred for 30 min at room temperature. The solvents were evaporated under reduced pressure. After co-evaporation with ethanol and then with anhydrous pyridine, the monophosphate is dried overnight under vacuum over P 2 O 5 . Was added 0.23 g (1 41 mmol) of 1, 1-carbonyldiimidazole to a suspension of this monophosphate in 5 ml of N 1 N- dimethylformamide.
  • the reaction mixture is stirred for 2 h at room temperature and treated with anhydrous methanol (0.10ml, 2.50mmol) to decompose the excess of 1'-carbonyldiimidazole. After 15 minutes, a solution (1 M, 1, 41 ml, 1, 41 mmol) of tributylammonium phosphate in N, N-dimethylformamide is added. The suspension is stirred for 24 hours at ambient temperature and then filtered. The filtrate is treated with an equal volume of methanol and concentrated under reduced pressure. After purification on a DEAE-Sephadex column (TEAB linear gradient, 0-1 M), the residual phosphate salts are then removed by RP18 reverse phase chromatography (isocratic / water). AraCDP (45mg, 42%) was obtained as a white solid after ion exchange on DOWEX Na + and lyophilization.
  • GI "one pot" method To a suspension of the desired nucleoside (1 eq) in triethylphosphate (2 ml) at 0 ° C was added phosphorus oxychloride (1.64 mmol, 2 eq). The mixture was stirred at 0 ° C. for 4 h. A solution of tributylammonium pyrophosphate in anhydrous N, N-dimethylformamide (1 M, 4.11 mmol, 5eq) was added as well as tributylamine (0.90 mmol, 1.1 eq). The mixture was vigorously stirred for 5 min and a solution of triethylammonium bicarbonate buffer (1M, 30 mL) was slowly added.
  • the filtrate was treated with an equal volume of methanol and then concentrated under reduced pressure.
  • the purification was carried out by DEAE-Sephadex column chromatography, eluting with a linear gradient of triethylammonium bicarbonate buffer (0-1M). Residual phosphate salts were removed by RP18 reverse phase chromatography (isocratic / water).
  • araCTP (0.015 mg, 11%) was obtained in the form of a white solid after ion exchange on Dowex and lyophilization.
  • the precipitate is filtered and washed with diethyl ether.
  • the final product was recrystallized from absolute ethyl alcohol (5 mL) and dried under vacuum over KOH pellets.
  • PEG-ddC (0.25 g, 0.05 mmol) was treated according to method B ⁇ of Example 48, and the supported ddC H-phosphonate 5'-monoester was obtained as a white solid (0.23 g, 0.05 mmol). g, 86%).
  • PEG-3TC (0.30 g, 0.06 mmol) was treated according to Method B of Example 48, and the supported 3TC H-phosphonate 5'-monoester was obtained as a white solid (0.28 g). , 87%).
  • Example 51 Method B ' 2 : Monophosphate synthesis by oxidation of the nucleoside H-phosphonate Poly (ethylene glycol) 4,000 Bis [4- ⁇ - (1- (2 ', 3'-dideoxy-5'-O-monophosphoryl- ⁇ -D-ribofuranosyl) -cytosyl) succinate], triethylammonium salts
  • the mixture was cooled to 0 ° C., and the oxidation was carried out by adding a solution of tert-butyl peroxide in decane (0.36 mL, 5-6 M, 2.00 mmol) at room temperature.
  • the mixture was stirred for 3 h, treated with excess MeOH-NEt 3 (0.50 mL, 5/5, v / v) and stirring was continued for 1 h.
  • the solvents were evaporated under reduced pressure and the residue dissolved in dichloromethane (10 mL).
  • the organic phase was washed with 5% aqueous sodium bicarbonate solution (7 mL) and the aqueous phase was extracted several times with dichloromethane (10 mL). The organic phases were combined and evaporated under reduced pressure.
  • nucleoside 5'-monophosphate was precipitated from the dichloromethane solution by addition of excess volume of cold diethyl ether (100 mL). The precipitate was filtered and washed with diethyl ether. Monophosphate, slightly contaminated with a small amount of starting material (84% / 16%) was obtained as a white solid (0.09 g, 89%).
  • Example 52 Oxidation of the nucleoside 5'H-phosphonate monoester alternative to the method B ' 2
  • the precipitate was filtered and washed with diethyl ether.
  • the final product was recrystallized from absolute ethyl alcohol (5 mL) and dried under vacuum over KOH pellets.
  • the PEG-3TCMP monophosphate was obtained in the form of a yellow solid (0.15 g, 103%), contaminated with an iodine residue.
  • PEG-3TCMP Diphosphorylation of PEG-3TCMP (0.25 g, 0.05 mmol) was carried out according to method C. After ion exchange on DOWEX HNEt 3 + and column purification (reverse phase) RP18, the diphosphate was obtained. PEG-3TCDP as a yellow solid (0.17 g, 62%) after lyophilization.
  • PEG-3TCMP (0.25 g, 0.05 mmol) was carried out according to method D. After ion exchange on DOWEX HNEt 3 + and purification on column (reverse phase) RP18, PEG-3TCTP triphosphate was obtained in the form of of a yellow solid (0.16 g, 54%) after lyophilization.
  • EXAMPLE 55 Obtaining the mono-, di- and triphosphate derivatives of the nucleoside 3TC after the cleavage step according to the E 1- (2 ', 3'-dideoxy-3'-thia- ⁇ -L-ribofuranosyl) -cytosine method -5 > -monophosphate, ammonium salt
  • Method E was applied to PEG-3TCMP (0.14 g, 0.03 mmol). Purification on RP18 column by chromatography followed by a dialysis step gave 3TCMP (10.40 mg, 64%) as a white solid after lyophilization.
  • Example 58 Fixation of purine nucleosides via the use of a protective group
  • the protection of the nucleoside was carried out with a TIPS (tetraisopropylsilyl ethers) as a protecting group, according to Eur. J. Org. Chem. 2005, pp. 5171-83.
  • TIPS tetraisopropylsilyl ethers
  • the nucleoside is co-evaporated with pyridine (x 3) and dried under vacuum on KOH pellets.
  • Tetra-isopropylsilyl chloride (3.79 mmol, 1.02 eq.) Is added to a solution of the nucleoside (3.71 mmol, 1 eq.) In pyridine (10 ml) and the resulting mixture is stirred at room temperature for 1 h 30 min.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation de nucléotides ou analogue de nucléotides monomères comportant les étapes de : (1) couplage d'un support polyéthylèneglycol soluble pourvu d'au moins un bras de liaison diacide ou éther-acide et d'un nucléoside ou analogue de nucléoside monomère, sur un groupe aminé ou hydroxyle du nucléoside à l'aide d'un agent de couplage; (2) au moins une étape de phosphorylation dudit nucléoside ou analogue de nucléoside couplé audit support avec un agent de phosphorylation; (3) clivage dudit support et récupération d'au moins un nucléotide ou analogue de nucléotide monomère. Les nucléotides préparés sont des outils biologiques.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE NUCLEOTIDES ET ANALOGUES A
FAÇON PAR SYNTHESE SUR SUPPORT SOLUBLE ET OUTILS
BIOLOGIQUES PREPARES
La présente invention concerne un procédé de préparation de monomères nucléotidiques ou de monomères d'analogues nucléotidiques sur support soluble, plus précisément une méthode de préparation de nucléotides, c'est-à-dire des nucléosides mono-, di- et triphosphatés. La synthèse chimique de nucléotides et oligonucléotides a fait l'objet de recherches intenses depuis le début des années quatre-vingt. Ainsi, en 1983, un procédé de synthèse d'oligonucléotides sur support solide a été mis au point par McBride et Caruthers. Cette méthode, dite « aux phosphoramidites », utilise un support solide auquel est attaché un nucléoside. Les supports solides utilisés dans cette méthode sont des billes de verre de porosité contrôlée. Le premier nucléoside est attaché au support solide via l'hydroxyle en position 3' et la synthèse progresse de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' de la chaîne d'acide nucléique. Plus précisément, en enlevant un groupe protecteur acide labile en position 5', on libère une fonction hydroxyle. Le groupe nucléophile terminal est alors couplé à un monomère 3'-O-phosphoramidite protégé en position 5' et éventuellement sur l'hétérocycle, en présence d'un activateur. La liaison 3', 5' phosphite triester est alors oxydée pour donner un lien phosphotriester. Dans cette méthode de synthèse, on réalise successivement les étapes de déprotection, couplage, « capping » et oxydation, et elles sont répétées jusqu'à ce qu'un oligomère de la longueur désirée soit obtenu. Depuis lors, d'autres méthodes synthétiques ont utilisé des supports solides. Ainsi, ces méthodes sont décrites par Gallop et al J.Med. Chem. 37, 1233 (1994), GoId et al, Annu Rev. Biochem. 64,763 (1995) et Thompson et al Chem Rev, 96 555 (1996). Bien que l'on obtienne des résultats satisfaisants, les méthodes sur support solide présentent certains désavantages, par exemple un comportement non linéaire en termes de cinétique, une distribution irrégulière sur le support ou du fait du support, des problèmes de solvatation, un taux de couplage insuffisant ou des problèmes de synthèse dus à la nature hétérogène des conditions réactionnelles, et plus précisément du milieu réactionnel. De plus, les supports solides sont très coûteux, ce qui rend la synthèse à grande échelle très onéreuse. En outre, le rendement de synthèse en phase solide conventionnelle n'est pas toujours satisfaisant, compte tenu notamment de difficultés de purification du produit et de séparation du produit d'avec les séquences tronquées. Enfin, avec les méthodes sur support solide, le suivi réactionnel peut être difficile. D'autres méthodes alternatives ont donc été recherchées, qui mettraient en œuvre des conditions réactionnelles plus homogènes et l'utilisation de supports polymères solubles a été proposée. Cette méthodologie est appelée « synthèse en phase liquide » (« liquid phase synthesis ») et résout certains problèmes rencontrés avec les supports solides. Ces méthodes utilisent du polyéthylène glycol (PEG) comme support soluble, comme cela apparaît dans Mutter et al Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10, 811 (1971) et Bayer et al Nature (London) 237, 512 (1972). A part le PEG, d'autres supports sont connus dans la technique, notamment les PEG greffés sur polystyrène réticulé (Bayer, E. Angew. Chem. Int. Ed. Eng/30,113 (1991). On connaît aussi la synthèse de peptide sur polyéthylèneimine, le support ayant un poids moléculaire compris entre 30.000 et 40.000 (Pfaender et al In Peptides; Proc. Eight Eur. Pep. Symp; Ann Arbor Science; North Holland p. 137 (1967) et Blecher et al Liebigs. A"n rhem, 1263 (1973)). Des copolymères polyvinyl-alcool (Bayer et al Liebigs An. Chem., 1671 (1974)) et des copolymères polyvinyl alcool- poly(1-vinyl-2-pyrrolidone) (Geckeler et al Makromol. Chem, 175, 1995 (1974)) ont également été utilisés comme support soluble pour la synthèse de peptides. Un des désavantages majeurs de ces premières synthèses peptidiques sur support soluble réside dans les rendements d'obtention du peptide attendu, qui sont bas, du fait d'un clivage incomplet et/ou de réactions annexes prédominantes. On a alors utilisé d'autres méthodes de clivage, tels que celles qui sont induites par des liaisons acide ou base labiles, des liaisons thiol labiles et le relargage photolitique des peptides après la synthèse. Une méthode récente pour synthétiser des oligopeptides, des oligosaccharides et des oligonucléotides utilisant la synthèse en phase liquide, est décrite dans WO2006096963. Le liquide ionique utilisé comme support liquide est un sel organique de type onium, par exemple un cation ammonium quaternaire hétérocyclique et un anion, par exemple CI", Br", BF4 ", PF6 ", SbF6 ", CuCI2 " et AICI4 ". Des exemples de cations comprennent également des pyridines substituées et des imidazoles 1 ,3-disubstitués. Donga et al, J. Org. Chem. 71 , 7907-7910 (2006) décrit la synthèse d'oligonucléotides sur support soluble du type liquide ionique (ILSS) avec de hauts rendements et avec une telle pureté qu'aucune étape de chromatographie n'est nécessaire pour la purification des intermédiaires avant le clivage du support. Dans cette méthode, le support ionique soluble est synthétisé à partir de N-méthylimidazole et 2-bromoéthanol puis isolé par chromatographie échangeuse d'anions. Le dérivé 3'-succinylé 5'-DMT- thymidine a été couplé au liquide ionique en utilisant de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et une quantité catalytique de 4- (diméthylamino)pyridine (DMAP) dans l'acétonitrile, pour donner le nucléoside greffé au liquide ionique. Ce dernier est isolé et purifié par précipitation d'une solution éthyléther/acétate d'éthyle, traité dans le chloroforme et lavé à l'eau. Divers oligonucléotides ont été obtenus à partir du nucléoside greffé correspondant selon cette méthode. Le brevet américain US 6,001 ,966 décrit pour sa part une méthode de synthèse séquentielle en solution d'oligonucléotides, par réaction d'unités monomères.
En ce qui concerne l'obtention de monomères phosphatés, Parang et al in Organic Letters Vol. 3, No. 2 (2001 ) décrit un réactif supporté pour produire des monophosphates de carbohydrates et d'un nucléoside en utilisant un copolymère réticulé polystyrène-divinylbenzène fonctionnalisé par le cyanoéthyl-N,N-diisopropyl phosphoramidite comme agent de phosphitylation. Cet agent immobilisé est couplé avec des alcools en présence de 1 H-tétrazole pour produire des phosphite-triesters liés au polymère qui sont ensuite oxydés en phosphotriesters correspondants. Le dérivé phosphaté immobilisé est alors déprotégé et clivé du support solide. Ainsi, bien que différentes méthodes soient connues pour synthétiser des nucléotides, il reste encore des problèmes tant avec les synthèses en phase solide qu'avec les synthèses en solution, notamment des problèmes de rendements faibles et des procédures de purification longues. Pour la synthèse des nucléosides triphosphates, il y a un réel besoin pour une méthode générale qui produise des nucléosides triphosphates avec de hauts rendements et qui puisse être appliquée à de nombreux substrats (Burgess and Cook, Synthesis of Nucléoside Triphosphates, Chem Rev. 100(6) 2047-2060 (2000). On a donc besoin d'une méthode de production de monomères nucléotides ou d'analogues de nucléotide en grande quantité, à des prix de revient bas et sans étapes de purification laborieuses.
Un objet de la présente demande est de résoudre ces problèmes de l'art antérieur concernant la synthèse de monomères nucléotidiques. L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de nucléotides ou analogues de nucléosides phosphorylés (schéma ci-dessous), ces dérivés prΛ"β"tant un intérêt en tant qu'agents thérapeutiques potentiels, outils biologiques... Au cours de ce procédé, un nucléoside ou un analogue de nucléoside (ci-dessous pyrimidine présentant une fonction aminé exocyclique) est couplé via l'intermédiaire d'un bras (linker) à un support polyéthylèneglycol soluble. Une fois l'(es) étape(s) de phosphorylation réalisée(s), le bras est clivé, et les dérivés mono-, di-, ou triphosphorylés peuvent être purifiés et isolés.
où R2 à R5 ont les significations données plus loin.
Cette approche permet de bénéficier à la fois des avantages de la synthèse sur support (élimination des excès de réactifs, purification facilitée) et de ceux de la synthèse en solution (suivi réactionnel et caractérisation). En conséquence, les rendements de synthèse sont améliorés et l'isolation des composés en est très largement facilitée en comparaison de la méthodologie classique (synthèse en solution), ce qui engendre une diminution importante des coûts de production.
La présente invention concerne une méthode utilisant un support soluble pour produire des nucléotides ou analogues de nucléotides. L'invention procure un procédé de préparation de monomères nucléotides ou d'analogues de nucléotides avec de hauts rendements.
Selon l'invention, les monomères obtenus sont des nucléosides ou analogues de nucléosides mono-, di- et triphosphatés. Dans le procédé de préparation de monomères nucléotidiques de l'invention les étapes de purification sont très simplifiées, ce qui influe favorablement sur les rendements.
La présente invention concerne également des monomères nucléotidiques et des monomères d'analogues nucléotidiques obtenus par le procédé, comme outils biologiques.
Ces outils biologiques peuvent être utilisés en enzymologie, en pharmacologie ainsi que comme produit de départ pour la synthèse de molécules d'intérêt, notamment des antiviraux et/ou des anticancéreux. La présente invention concerne un procédé de préparation de nucléotides ou analogue de nucléotides monomères comportant les étapes suivantes : (1) couplage d'un support polyéthylèneglycol soluble pourvu d'au moins un bras de liaison diacide ou éther-acide et d'un nucléoside ou analogue de nucléoside monomère, via un groupe aminé exocyclique ou hydroxyle du nucléoside, à l'aide d'un agent de couplage; (2) au moins une phosphorylation dudit nucléoside ou analogue de nucléoside couplé au support avec un agent de phosphorylation. Le clivage du bras entre le support et le monomère peut alors avoir lieu, et permet alors la récupération du nucléotide ou analogue de nucléotide monomère. Ainsi, de façon générale, selon l'invention, on procède à l'accrochage du bras de liaison sur le support soluble de type PEG, puis on couple ce support à un nucléoside ou analogue par l'intermédiaire du bras de liaison, on phosphoryle alors le nucléoside couplé, en une ou plusieurs étapes de phosphorylation. On peut ensuite cliver le nucléotide afin de le récupérer. Ce procédé permet d'obtenir à façon des outils biologiques ou effecteurs phosphorylés (nucléosides mono-, di- et triphosphatés), nucléotides ou analogues, naturels ou non, en évitant les étapes usuelles longues, fastidieuses et onéreuses de purification. La synthèse a lieu en solution, ce qui permet un suivi réactionnel et la caractérisation des intermédiaires par des techniques usuelles. Cette technique sur support présente les avantages de purification facilitée des produits intermédiaires et finaux, le plus souvent ioniques, et permet l'élimination des réactifs utilisés en excès. A titre d'exemple, l'AraCTP commercial a un coût plus de 13 fois supérieur au prix de revient (réactif et matériel) par le procédé proposé selon l'invention. Du point de vue des rendements, le procédé de l'invention s'avère également supérieur aux procédés usuels.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description et des modes préférés de réalisation ainsi que des exemples qui suivent, et sur les figures annexées. La figure 1 est un schéma illustrant d'une part l'arrimage (a) de bras de liaison divers sur des supports solubles, ainsi que les supports une fois ces bras attachés, puis la fonctionnalisation d'un support soluble par couplage (b) avec un nucléoside, via la fonction aminé exocyclique d'un hétérocycle R1NH2. Sur cette figure, sont également représentés (c) divers hétérocycles aminés susceptibles d'être couplés au support, dans le procédé de l'invention : un nucléoside à base purique (c-1), un nucléoside à base pyrimidique (c-2), un analogue structural à base pyrimidique modifié sur le sucre et la base (c-3), illustrant les analogues de nucléosides par modification du sucre, ainsi qu'un analogue de nucléoside à base purique (c-4) illustrant les analogues de nucléosides par modification sur la base. La figure 2 est un schéma où apparaissent, illustrées pour le cas (a-2), des étapes de phosphorylation que l'on peut mener notamment à partir des nucléosides greffés de la figure 1. Sont illustrées une diphosphorylation (d) directe et une monophosphorylation (e) pouvant être suivie, à la suite d'une étape d'activation, par une seconde monophosphorylation (g) menant à des nucléosides diphosphatés, ou encore deux monophosphorylations successives (g) ou une diphosphorylation (f), menant à des nucléosides triphosphatés.
Par « monomère », il est ici considéré que le nucléoside ou le nucléotide comporte une base, un sucre et dans le cas des nucléotides, un ou plusieurs groupe(s) phosphate(s). Sont ainsi donc exclus les oligomères. La première étape selon l'invention consiste à coupler un monomère nucléosidique sur un support soluble possédant un bras de liaison. A titre de support soluble, selon l'invention, on peut utiliser un support polyéthylèneglycol (PEG) ayant au moins un bras acide, diacide ou éther- acide de jonction. Par au moins un bras, on entend un ou deux. Plus précisément, le PEG pourvu d'au moins un bras de liaison peut avoir pour formule
(I) RO-C2H4-O-PEG-O-C2H4-O-C(O)-(CH2)P-COOH dans laquelle R est un groupe alkyle ou benzyle ou aryle ou -C(O)-(CH2)n- COOH et p et n', indépendamment l'un de l'autre, représentent O ou un entier de 1 à 10, ou
(II) RO-C2H4-O-PEG-O-C2H4-O-(CH2)m-COOH dans laquelle R est un groupe alkyle ou benzyle ou aryle ou -(CH2)m-COOH et m et m', indépendamment l'un de l'autre, représentent O ou un entier de 1 à 3.
De préférence selon l'invention, p ou n' dans la formule (I) est inférieur à 6 et de préférence, p ou n' dans la formule (I) est un entier allant de O à 4 et dans la formule (II), m et m' sont de préférence 1 ou 2. Comme cela apparaîtra dans la description détaillée, un bras de liaison préféré est de type succinate.
Dans les formules ci-dessus, le radical alkyle est de préférence linéaire ou ramifié, en Ci à Ci2, et le radical aryle est de préférence choisi parmi phényle, tolyle et o-tolyle. De préférence, R signifie méthyle ou benzyle. Le terme « polyéthylèneglycol » (PEG) n'est pas limité au seul polyéthylèneglycol proprement dit mais inclut tout polyéthylèneglycol dérivé, ayant par exemple des groupes hydroxyles à ses deux extrémités ou un groupe hydroxyle à l'une de ses extrémités et un groupe méthoxy à l'autre, le polyéthylèneglycol monométhyléther et le poly(oxyéthylène) glycol ou analogues. Plus généralement, tel qu'utilisé ici, « support soluble » signifie un support Hu tvpe polyéthylèneglycol ayant un bras diacide ou un bras éther-acide de jonction ou deux tels bras. De préférence, le support soluble de la présente invention est un polyéthylèneglycol (PEG), polyéthyleneglycol monométhyléther ou un poly(oxyéthylene)glycol comportant au moins un bras diacide ou éther-acide. Le poids moléculaire dudit PEG selon l'invention est de préférence dans la fourchette allant d'environ 3.000 à environ 6.000. De préférence, le PEG a un poids moléculaire d'environ 4.000.
Le bras diacide ou éther-acide est attaché au PEG par diverses méthodes dépendant du type de bras de liaison à fixer, la méthode générale étant illustrée dans les exemples.
Par exemple, si le bras, du type succinate, doit être associé au PEG, la procédure comprend la dissolution du PEG dans un solvant, l'addition de l'anhydride d'acide correspondant, l'agitation à température ambiante, puis la concentration du mélange réactionnel sous pression réduite, et la précipitation du PEG comportant le bras diacide. Dans le cas précis du bras succinate, le promoteur du bras est l'anhydride succinique. Dans le cas d'un bras oxalate, c'est le chlorure d'oxalyle qui est utilisé. De façon plus générale, un dérivé d'acide carboxylique, anhydride ou chlorure d'acide, par exemple, peut être utilisé pour fonctionnaliser le PEG. Le bras éther- acide peut par exemple être obtenu par deux voies de synthèse impliquant l'oxydation de l'alcool terminal du support, tel qu'illustré dans les exemples ou encore par réaction du PEG avec un acrylate d'alkyle. Si le bras est l'acide éthanoïque, le procédé pour former le bras comporte par exemple l'oxydation du PEG par des sels de chrome, l'agitation du mélange à température ambiante et la précipitation du PEG modifié. On peut utiliser par exemple
un support fonctionnalisé avec un bras succinyle, ou un support fonctionnalisé de type PEG-acide
n dépendant dans les deux formules ci-dessus et le schéma ci-dessous du poids moléculaire du PEG.
La réaction de phosphorylation s'effectue de la même façon quelle que soit la nature du bras. Selon cette variante le bras de liaison peut rester solidaire du support PEG lors de l'étape de clivage. Parmi les supports
PEG-acide, de préférence, on utilise ceux pour lesquels m"=1.
Le bras de liaison est ci-dessus qualifié bras « acide » pour m"=0.
L'homme du métier saura adapter la méthode d'accrochage du bras au support soluble choisi et au bras requis. Comme cela apparaît à la figure 1 , le PEG peut être bifonctionnel (HO-PEG-OH), R représentant H et porter deux bras de liaison (a-2 ; a-4) ou monofonctionnel (RO-PEG-OH) et porter alors un bras de liaison (a-1 ; a-3), R représentant alkyle, benzyle ou aryle.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le PEG-OH est fonctionnalisé avec l'acrylate de t-butyle, et après une étape de déprotection, on obtient le PEG fonctionnalisé PEG-acide PEG-O(CH2^-
COOH selon le schéma suivant : Ainsi, selon l'invention, selon un mode de réalisation particulier, on utilise le
PEG-O-bis(succinyl-nucléoside).
Dans un autre mode de réalisation particulier, on utilise le PEG- bis(OCH2CH2-CO-nucléoside).
Un avantage particulier des PEG fonctionnalisé par un bras de l'acide 3- hydroxypropanoïque réside dans la simplification de la procédure ultérieure. Une fois réalisé l'accrochage du bras de liaison sur le support soluble, le support est mis en présence du nucléoside ou de l'analogue de nucléoside. Le couplage avec le support soluble peut avoir lieu par l'intermédiaire d'un groupe aminé exocyclique, à l'aide d'un agent de couplage et conduisant à la formation d'une liaison amide, cette variante étant illustrée à la figure 1 (b) ou via un groupe hydroxyle de l'analogue nucléosidique ou du nucléoside et conduisant à la formation d'une liaison ester. De préférence, selon l'invention, le couplage est réalisé sur la fonction aminé exocyclique. Ainsi, de préférence, le couplage est réalisé sur l'azote exocyclique de la base du nucléoside. Il s'agit par exemple de la fonction aminé exocyclique de la cytosine, parmi les bases pyrimidiques, et de l'adénine ou la guanine, parmi les bases puriques, illustrées à la figure 1 (b et c). Le procédé de couplage peut varier selon le nucléoside à coupler et le support choisi. Généralement, le PEG à bras de liaison est mélangé avec le nucléoside ou nucléoside analogue que l'on cherche à phosphoryler, et l'agent de couplage est ajouté au mélange. Le mélange réactionnel est agité pendant une durée suffisante pour obtenir le couplage, les solvents sont évaporés et le produit final précipité, éventuellement recristallisé. Par « nucléoside », on entend ici divers composés comportant d'une part un sucre et d'autre part un hétérocycle. Les nucléosides naturels sont des substances dont l'hydrolyse donne une molécule de ribose ou de déoxyribose et un hétérocycle purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (cytosine, uracile, thymine). Les monomères nucléosidiques, nucléosides et analogues de nucléosides de l'invention peuvent être naturels ou synthétiques.
Par « analogue de nucléoside » ou « nucléoside analogue », on entend, selon l'invention, tout nucléoside modifié, c'est-à-dire un composé possédant une analogie structurale avec un nucléoside. De même, par « nucléotide analogue » ou « analogue de nucléotide », on entend, selon l'invention, tout nucléotide modifié, c'est-à-dire possédant une analogie structurale avec un nucléotide.
Les analogues peuvent ainsi comporter une ou plusieurs modifications sur le cycle osidique et/ou sur l'aglycone, les bases pyrimidique ou purique par exemple pouvant porter des modifications de leur hétérocycle. La figure 1 illustre certains de ces composés, et Ri à R6 sur le cycle osidique représentant les substituants usuels des résidus osidiques naturels ou non. Ainsi, Ri à R6, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, OH, halo, un groupement alkyle, O-alkyle, alcènyle, alcynyle en C1 à C4, alkylamino, aminé, hydroxylamino, azido, nitro, cyano, ou tout autre substituant susceptible de former un nucléoside modifié. A la figure 1 , le nucléoside à coupler est noté R1NH2. C'est un ensemble sucre-base à aminé exocyclique (NH2), et R' représente l'ensemble sucre- base, sans cette aminé exocyclique NH2 de la base qui va se coupler avec le bras du support soluble (b).
Dans le composé analogue modifié sur le sucre de la figure 1 (c-3), la base est pyrimidique et, dans le cycle osidique, W peut représenter CH2, CHX ou CX2 (X représentant ici halo) pour former un carbocycle, quand Y et Z sont aussi des atomes de carbone, mais W peut aussi représenter O ou S, Y et Z représentant des atomes de carbone, ou encore W et Z peuvent représenter O ou S, Y représentant CH2, ou encore Y et W peuvent représenter O ou S, Z représentant CH2. La base peut porter un halogène, X' représentant de préférence H ou F. Dans le composé analogue modifié de la figure 1 (c-4), la base est purique modifiée, W pouvant représenter CH ou CF, et X' représentant alors H, ou représenter N, et X' peut alors représenter F par exemple. Le sucre peut-être un ribose ou un déoxyribose ou encore tout autre analogue du type arabinofuranose, par exemple. La figure 1 suite illustre plus particulièrement le cas éther-acide (m"=1 ) c'ΩO+-à-dire un cas particulier de la figure 1 (a-3), (a-4) et (b). La définition des nucléosides analogues de l'invention n'est donc pas limitée aux seuls composés illustrés à la figure 1 ou par les définitions de X, X', W, W, Y, Z et R1 à R6 données ci-dessus à titre illustratif non limitatif. Les nucléosides ou analogues de nucléosides utilisés comme produit de départ dans le procédé de l'invention comportent un groupe exocyclique amino ou un groupe hydroxyle qui permet leur couplage au bras de liaison du support soluble.
Des exemples de nucléosides comportant des bases sont par exemple l'adénosine, la guanosine, la cytidine. Ils peuvent être également les déoxynucléosides correspondants, de la déoxyadénosine, déoxyguanosine, ou déoxycytidine.
Les analogues de nucléosides peuvent être modifiés sur la base, purine ou pyrimidine, et/ou sur le groupe carbohydrate (sucre). Des exemples de nucléosides et d'analogues de nucléosides plus précisément employés comme produits de départ sont donnés ci-après : 3'- O-acétyl-2'-désoxycytidine, allopurinol riboside, 2-amino-6-chloropurine riboside, 2'-désoxyuridine, cytidine, 2'-désoxycytidine, 5-aza-2'- désoxycytidine, 8-azaguanine, 8-bromoguanosine, 8-bromoguanosine, 2- chloroadénosine, 2-chloro-N6-cyclopentyladénosine, 5-chlorocytosine arabinoside, 2-chloro-2'-désoxyadénosine, 5-chloro-2'-désoxyuridine, 6- chloropurine riboside, 2'-désoxyadénosine monohydrate, 2'-désoxycytidine, 2'-désoxyguanosine monohydrate, 3'-désoxyguanosine, 2'-désoxyuridine, 2,6-diaminopurine 2'-désoxyriboside, 2',3'-didésoxyadénosine, 2',3'- didésoxycytidine, 5,6-dihydrodésoxyuridine, 6-(γ,γ- diméthylallylamino)purine riboside, 1 ,N6-éthèno-2'-désoxyadénosine, 5- hydroxyméthyl-2'-désoxyuridine, 5-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-6- thioguanosine, S-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-6-thioinosine, 5-iodo-2'- désoxycytidine, N4-isobutyryl-2'-désoxycytidine, isocytosine, 2',3'-O- isopropylidèneguanosine, 8-mercaptoguanosine, 5-méthoxyuridine, 2'-O- méthyladénosine, 5-méthylcytidine, 2'-O-méthylcytidine, 3-méthylcytidine rrr^^ulfate, N6-méthyl-2'-désoxyadénosine, 7-méthylguanosine, N2- méthylguanosine, 6-méthylmercaptopurine riboside, 3'-O-méthyluridine, acide orotique, 2-thio-6-azauridine, 4-thiouridine, thymine 1 -/8-D- arabinofuranoside, uracil 1-β-D-arabinofuranoside, zeatine-riboside, 2', 3'- didésoxy-3'-thia-/M_-cytidine, 2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-5-fluorocytidine, 9[2- (phosphonylméthoxy) propyl] adénine, 9[2-(phosphonylméthoxy) éthyl] adénine, 1-(/3-D-ribofuranosyl)-1 H-1 ,2,4-triazole-3-carboxamide, /3-D-2'-C- méthyl cytidine, β-D-2'-C-méthyl 5-fluorocytidine, /3-D-2'-désoxy-2'-fluoro-2'- C-méthyl cytidine, β-D-2'-désoxy-2',2'-difluoro cytidine, 7-déaza-jβ-D-2'-C- méthyl adénosine, 7-déaza-7-fluoro-β-D-2'-C-méthyl adénosine, 2'-désoxy- jβ-L-thymidine, 2'-désoxy-β-L-cytidine, 1-(2'-fluoro-/3-L-ribofuranosyl)- uracile, 9-(β-D-arabinofuranosyl)-2-fluoro- adénine, 9-(β-D- arabinofuranosyl)-adénine, 1-(j8-D-arabinofuranosyl)-cytosine et analogues. Le couplage est réalisé à l'aide d'au moins un agent de couplage qui peut être choisi parmi un carbodiimide, une oxime aromatique ou les agents de couplage du type onium, c'est-à-dire par exemple ammonium, phosphonium ou uronium d'un anion nucléophile, ou leurs analogues. A titre d'exemple de carbodiimide, on peut citer le dicyclohéxylcarbodiimide (DCC) ou le diisopropylcarbodiimide (DIC). Comme oxime aromatique, on peut citer le 1- hydroxybenzotriazole (HOBt) ou le 1- hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt) et analogues.
Comme onium, en particulier phosphonium, on peut citer l'hexafluorophosphate de (2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1 , 1 ,3,3- tétraméthyluronium (HBTU), l'hexafluorophosphate de (2-(7-aza-1 H- benzotriazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium (HATU) ou l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris- pyrrolidinophosphonium (PyBOP), et analogues. Un autre agent de couplage est la diméthylaminopyridine (DMAP).
Les quantités utilisées dans la réaction de couplage dépendent des quantités de nucléosides ou analogues mises en jeu. Généralement, pour 1 à 5 éq de nucléoside, on utilise 1 à 10 éq d'agent de couplage. On peut aussi utiliser 1 à 2 éq de nucléoside, et 1 à 4 éq d'agent de couplage Généralement, un équivalent du support soluble comportant un ou deux bras de liaison est couplé à un ou deux équivalents du nucléoside ou analogue.
Par « nucléotide », on entend ici des monomères constitués d'un hétérocycle et d'un sucre et d'au moins un groupe phosphorylé. Les nucléotides produits selon le procédé de la présente demande incluent des nucléosides mono-, di- ou triphosphates. Les nucléotides peuvent ainsi être naturels ou bien synthétiques. A l'issue de l'étape ou des étapes de phosphorylation décrites plus bas, et après le clivage, on obtient selon l'invention des nucléotides et analogues de nucléotides modifiés sur le sucre ou la base, comme l'étaient les nucléosides ou analogues de nucléoside de départ, et aussi des nucléotides pouvant être modifiés sur le ou les phosphates. Par exemple, les analogues de nucléotides modifiés sur la base peuvent être les suivants : 2'-désoxyinosine 5'-triphosphate, 2-amino-2- désoxyadénosine 5'-triphosphate, 5-aminoallyl-2'-désoxycytidine 5'- triphosphate, 5-fluorocytidine 5'-monophosphate, 2-fluoroadénosine 5'- monopohosphate, 5-iododésoxyuridine 5'-triphosphate, 5- trifluorométhylthymidine 5'-triphosphate, 5-(2-chloroéthyl) désoxyuridine 5'- triphosphate, 5-éthyldésoxyuridine 5'-triphosphate, (E)-5-(2-bromovinyl) désoxyuridine 5'-triphosphate, 5-fluorodésoxyuridine 5'-triphosphate, 6- thlopurine riboside 5'-triphosphate, 2-chlorodésoxyadénosine 5'- triphosphate, 5-azacytidine 5'-triphosphate, 3-déazauridine 5'-triphosphate, thiazofurine 5'-triphosphate, ribavirine 5'-triphosphate, allopurinol riboside 5'-triphosphate, Formycine B 5'-triphosphate, 8-bromoguanosine 5'- triphosphate, 8-mercaptoguanosine 5'-triphosphate, 7-méthyl-8- oxoguanosine 5'-triphosphate, 7-thia-8-oxoguanosine 5'-triphosphate, et analogues. Des exemples de nucléosides triphosphates modifiés sur la partie sucre sont les suivants : 2',3'-didésoxyadénosine 5'-triphosphate, 2',3'- désoxycytidine 5'-triphosphate, 2'amino-2'-désoxyadénosine 5'- triphosphate et analogues.
Par exemple, des analogues de nucléotides modifiés à la fois sur la base et le résidu osidique peuvent être les suivants : arabinosyl-5-azacytosine 5'- triphosphate, 2-fluoroarabinofuranosyladénosine 5'-triphosphate, 1-(beta-L- ribofuranosyl)-2-isopropylamino-5,6-dichlorobenzimidazole 5'-triphosphate, 7-déaza-2'-C-méthyladénosine 5'-triphosphate, 2-amino-9-beta-D- arabinofuranosyl-6-méthoxy-9H-purine 5'-triphosphate, 1 -(beta-L-2-fluoro- 2-desoxyarabinofuranosyl)-5-méthyluracile 5'-triphosphate. Des exemples de nucléosides modifiés sur le phosphate sont les suivants : 2',3'-didésoxyadénosine 5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2',3'-didésoxycytidine-5'- O-(1 -thiotriphosphate), 2',3'-didésoxyguanosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'-désoxyadénosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'-désoxycytidine-5'-O-(1- thiotriphosphate), 2'-désoxyguanosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'- désoxythymidine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), adénosine-5'-O-(1- thiotriphosphate), cytidine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), guanosine-5'-O-(1 - thiotriphosphate), adénosine 3', 5' cyclique monophosphate et analogues. La synthèse des monophosphates et diphosphates correspondants est aussi possible selon l'invention, comme cela apparaîtra par la suite, et dans les exemples.
Partant d'un nucléoside ou analogue fixé au support soluble, le nucléoside est mono-, di- ou triphosphorylé en une ou deux ou trois étapes de phosphorylation.
Comme cela apparaît à la figure 2, pour parvenir à un monophosphate, on procède à une monophosphorylation (e).
Pour parvenir à un monomère diphosphaté, on procède à une diphosphorylation. Celle-ci peut être menée directement en une étape avec un agent diphosphorylant (d), ou en deux étapes de monophosphorylation successives (e) puis (g), la seconde monophosphorylation (g) pouvant être activée. Pour parvenir à un monomère triphosphaté, on procède à une triphosphorylation. Celle-ci peut être menée par diphosphorylation (d) avec un agent diphosphorylant, puis monophosphorylation ou encore par monophosphorylation (e), suivie par une diphosphorylation (f) ou suivie par deux monophophorylations successives (g).
De préférence les secondes phosphorylations sont activées. Pour réaliser la phosphorylation, on utilise un agent de phosphorylation. Selon la nature et la réactivité de cet agent, une activation préalable peut être nécessaire. Pour la monophosphorylation du nucléoside sur support polymère, à une solution du nucléoside sur support polymère dans un solvant approprié, on ajoute un agent de phosphorylation du type oxychlorure de phosphore et on extrait et/ou on isole par précipitation le nucléoside monophosphate supporté. Pour la phosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère, du nucléoside monophosphate supporté est dissous dans un solvant approprié, activé puis mis en présence d'agent phosphorylant du type phosphate de tributylammonium et le composé attendu est précipité. Pour la diphosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère, le nucléoside monophosphate sur support polymère dans un solvant approprié est activé, puis mis en présence d'agent phosphorylant du type pyrophosphate de tributylammonium et le produit attendu précipité. Les agents de phosphorylation peuvent être choisis parmi les composés de type Z'=PX1 3, où Z' est O, S ou Se, pour une monophosphorylation, ou pour une diphosphorylation, W1[(P=Z')X1]2 où W1 est O, NH, CH2, CHOH, CHNH2, CHCH3, CHX2 ou CX2 2 et Z' est O, S ou Se, et X1 et X2 représentant halo, ou analogues appropriés.
D'autres agents de phosphorylation Z=P(O )3 et W1[(P=O)(O")2]2 où W1 et Z' ont la signification ci-dessus capables de mono- et diphosphoryler sont moins efficaces et peuvent nécessiter une activation du nucléoside ou de l'r""'Λ^ue de nucléoside. Comme exemple d'agent de phosphorylation, on peut citer particulièrement les dérivés du phosphore (III) ou les dérivés du phosphore (V). Sont appropriés les agents de phosphorylation du type de l'oxychlorure de phosphore, pour une monophosphorylation, par exemple choisi parmi l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le O-(2-chlorophényl) dichlorothiophosphate, l'aminométhyl phosphonique acide, l'aminométhyl (méthyl) phosphonique acide, la 2-chloro-1 ,3,2-dioxaphospholane, la 2-chloro-2-oxo-1 ,3,2- dioxaphospholane, la 2-chloro-4H-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, le baryum 2-cyoanoéthylphosphate, le diéthylchlorothiophosphate, le diméthylchlorothiophosphate, le méthyl-phosphorodichloridate, le phényl- dichlorophosphate, le méthyldichlorophosphite et le diphénylphosphite et analogues et aussi le 2-chlorophénylphosphorodichloridate, le 4- chlorophényl-phosphorodichloridate, le diphényl-chlorophosphate et le dibenzyl-N,N-diisopropylphosphoramidite. Sont préférés selon l'invention, l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le phosphate de tributylammonium et le diphénylphosphite. Parmi les agents de diphosphorylation du type pyrophosphate de tributylammonium, on peut citer l'acide étidronique, les sels de l'imidodiphosphate, l'imino di(méthyl phosphonique acide), le tétrachlorure de pyrophosphoryle, le méthyl bis(dichlorophosphonate), l'acide méthylène bisphosphonique. Sont préférés selon l'invention, le pyrophosphate de tributylammonium et l'acide méthylène bisphosphonique. Les quantités d'agents de phosphorylation utilisées dépendent de leur réactivité. De façon générale, 10 à 30 équivalents d'agents phosphorylants sont utilisés pour 1 à 2 équivalents du nucléoside couplé au support, de préférence, 15 à 30 équivalents d'agents phosphorylants. Comme agents d'activation, on peut citer par exemple le mésitylsulfonylnitrotriazole (MSNT), le mésitylsulfonyltriazole (MST), le ch1"-11"? de mésitylsulfonyle (MSCI), le chlorure de tri-isopropylsulfonyle (TPSCI), le système Tf2O/diméthylaminopyridine (DMAP), le 1 ,1- carbonyldiimidazole (CDI) et similaires. Les agents d'activation sont utilisés dans des quantités de l'ordre de 1 à 10 équivalents, de préférence 3 à 6 équivalents. Dans une étape ultérieure à la phosphorylation, le support soluble peut être dissocié du nucléotide ou de l'analogue du nucléotide obtenu, ceci étant réalisé en utilisant un agent de clivage.
Toute base ou tout nucléophile peut-être utilisé comme agent de clivage. Par exemple, on peut utiliser de l'ammoniaque, de l'hydroxyde de sodium, du méthylate de sodium, du méthanol ammoniacal ou du cyanure de potassium et analogues.
Selon l'invention, de façon générale, on utilise un excès de base. Les nucléotides clivés de leur support tels que produits par le procédé de la présente demande peuvent ensuite être isolés selon toute méthode de l'art. On peut utiliser la chromatographie liquide (LC) ou HPLC, par exemple sur colonne en phase inverse.
Ils peuvent être également purifiés par dialyse, notamment lorsque le résidu issu du clivage n'a pas été éliminé précédemment. La dialyse peut être réalisée par toute méthode convenable, par exemple sur membrane d'ester de cellulose.
De façon générale, pour les bras bifonctionnels, de type succinate, le bras clivé se sépare d'avec le substrat et du support. Ceci peut rendre une dialyse avantageuse pour purifier. Ainsi, le composé issu de l'hydrolyse du bras peut contaminer le substrat et une dialyse peut alors être envisagée comme étape de purification. En revanche, pour les bras du type ether- acide, le bras restant sur le support PEG, la dialyse peut ne pas être nécessaire.
Après l'étape (ou les étapes) de mono(di ou tri)phosphorylation(s), notamment dans le cas du PEG-O(CH2)2-COOH, le clivage du bras permet d'obtenir directement le nucléotide attendu après élimination du support polvmérique, et ceci sans avoir à réaliser de dialyse. Ainsi, comme cela apparaîtra dans les exemples, l'utilisation du PEG fonctionnalisé par un bras correspondant à l'acide-3-hydroxypropanoïque (PEG-O(CH2)2-COOH permet de simplifier la procédure, l'étape de dialyse pouvant être supprimée. Comme indiqué ci-dessus, les nucléotides et analogues obtenus peuvent être utiles à titre d'effecteurs, d'outils biologiques pour la recherche, le diagnostic ou encore toute application thérapeutique ou pré-clinique. Bien que l'invention soit ici décrite dans ses modalités préférées, le spécialiste appréciera les équivalents, modifications, substitutions, omissions ou variantes possibles sans sortir pour autant du champ de l'invention. Exemple 1 : Polyéthylèneglycol-bis-succinate, PEG4ooo-bis-succinate
20g (4,76 mmol) de PEG40Oo ont été co-évaporés avec de la pyridine anhydre et dissous dans 160 ml de pyridine. 5 g (49,90 mmol) d'anhydride succinique et 0,30 g (2,49 mmol) de diméthylaminopyridine ont été ajoutés et le mélange agité pendant deux jours à température ambiante. La solution a été concentrée sous pression réduite, co-évaporée avec du toluène et dissous dans un minimum de dichlorométhane. Le précipité brun formé a été éliminé par filtration. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et dissous dans un mélange dichlorométhane / N,N-diméthylformamide (3/7, v/v). Le PEG bis-succinate a été précipité par addition d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur pastilles de KOH pour donner du PEG bis-succinate sous forme d'un solide blanc (18,14 g, 86 %).
RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) δ 4.18 (m, 2H, (OCH2α)p£G),
3.40-3.75 (m, (OCH2)PR3), 2.57 (s, 4H, CH2succ).
RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 173.9, 172.2 (s, C=OSUcc), 70.5
(s, (OCH2)pEG), 68.9 (s, (OCH2β)pEG), 64.2 (s, (OCH2α)P£G), 29.3, 28.9 (s, CH2sUcc). Exemple 2 : Poly(oxyéthylène)40oo bis (2-hydroxyacétique acide)
1 g de PEG40OO (0,25 mmol) est dissous dans 10 ml d'acétone et 0,85 ml de réactif de Jones ("I mmol de CrO3) est ajouté. A la fin de l'addition, les sels de chrome bleu-vert précipitent dans le milieu réactionnel. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 16h. La réaction a été stoppée par ajout de 0,15 ml d'isopropanol et 0,10 g de charbon actif, et l'agitation a été poursuivie pendant 3h. Le charbon actif a alors été éliminé par filtration sur un entonnoir de Buckner et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans un minimum de dichlorométhane et précipité par ajout d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther, puis séché sous vide sur pastilles de KOH pour donner le produit attendu sous forme d'un solide blanc (3,26 g, 81 %).
IR 1643 cm"1(ÇOOH), 3418 cm"1 (OH).
RN 13C (CDCI3, 75 MHz) δ 171.6 (s, C=O), 70.8 (s, (OCH2a)pEβ), 70.4 (s, (OCH2)PEG), 68.5 (s, (OÇH2COOH)PEG).
Exemple 2 bis: Poly(oxyéthylène)40oo bis (2-hydroxypropanoïque acide)
Une solution de 1 g de PEG4000 (2,5 mmol, 1 eq.) et de tert-butoxide de potassium (0,25 mmol, 0,1 eq.) dans le toluène (25 mL) a été agitée à 40°C pendant 20 minutes, et du tert-butylacrylate (15 mmol, 6 eq.) a été ajouté Le mélange a été agité à 400C pendant 6h. Le solvant a été éliminé par ??
évaporation sous pression réduite. Le résidu obtenu a été dissous dans du dichlorométhane (100ml) et cette solution a été lentement ajoutée à un excès de diéthyléther froid (1 L). Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther plusieurs fois, puis séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit.
Le PEG-bis (O-(CH2)2-COOfl3u) a été dissous dans du dichlorométhane (20ml) et un volume égal de TFA (acide trifluoroacétique) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante toute la nuit.
Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et l'huile résultante dissoute dans le dichlorométhane (100ml), et cette solution a été lentement ajoutée à un excès de diéthyléther froid (1 L). Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther plusieurs fois, puis séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit. Le produit final PEG-bis (OCH2CH2-COOH) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (8.63g, 83%).
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 3.87-3.42 (m, (OCH2)PEG), 2.60 (t, 2H, CH2a).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) δ 173.0 (s, C=O), 70.5 (s, (OCH2)PEG), 66.9 (s,CH2b), 34.7 (s, CH2a).
Exemple 3 : Méthode A: Couplage du PEG bifonctionnalisé et du nucléoside
Une solution du nucléoside ou de l'analogue de nucléoside (2eq.) dans du
N,N-diméthylformamide (30 ml) est ajoutée à une solution de PEG comportant deux bras de liaison (0,95 mmol, 1 eq), par exemple le PEG bis-succcinate, dans du dichlorométhane (70 ml). On ajoute du N, N- dicyclohexylcarbodiimide (3,79 mmol, 4 eq) et du N-hydroxylbenzotriazole (1 ,89 mmol, 2 eq) et le mélange résultant est agité à 60°C pendant 7h. Les solvants sont évaporés sous pression réduite et le résidu obtenu dissous dans un minimum de dichlorométhane et laissé à reposer à 4°C toute une nuit. La dicyclohexylurée précipitée est séparée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite et dissous dans du N1N- diméthylformamide (40 ml). La solution résultante est éliminée lentement à du diéthyléther froid en excès en volume. Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Le produit final est recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (40 ml) et séché sous vide sur pastilles de KOH .
Exemple 4 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl) succinate]
Le couplage entre du PEG-bis-succinate (4 g, 0,95 mmol) et le nucléoside araC (0,46 g, 1 ,89 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (3,65 g, 83 %).
(CH2CI2 / MeOH, 7/3, v/v) : 0.7.
RMN 1H (D2O, 200 MHz) δ 8.16 (d, J6 5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.26 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.10 (d, J1 -2- = 4.6 Hz, 1 H, H1 ), 4.34 (t, J2 -1. = J2 -3- = 4.6 Hz, 1 H, H2), 4.16 (m, 2H, (OCH2α)p£G), 4.02-3.92 (m, 2H, H3. H4), 3.73 (m, 2H, 2H5), 3.70-3.33 (m, (OCH2)PeG), 2.76-2.62 (m, 4H, CH2succ).
RMN 1 1J3C, (D2O, 75 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUCc), 162.5 (s, C4), 156.7 (s, C2), 146.7 (s, C6), 97.3 (s, C5), 87.1 (s, C1 ), 84.0 (s, C4), 75.4 (s, C2), 75.2 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)pEG), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.1 (s, (OCH2α)PEG), 60.7 (s, C5-), 31.5, 28.5 (2s, CH2succ).
Exemple 5 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]
Le couplage entre du PEG-bis-succinate (4,84 g, 1 ,15 mmol) et la 2'- désoxycytidine (0,52 g, 2,30 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (4,60 g, 87 %).
(CH2CI2 / MeOH, 6/4, v/v) : 0.9.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.25 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.27 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.13 (t, Jr.?a = Jv-2 b = 6.2 Hz, 1 H, H1 ), 4.30 (m, 1 H, H3), 4.19 (m, 2H, (OCH2α)pEG), 4.04 (m, 1 H, H4), 3.85-3.50 (m, 2H5- (OCH2)PR3), 2.80-2.65 (m, 4H, CH2succ), 2.43 (m, 1 H, H2 a), 2.23 (m, 1 H, H2 b).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=OSUcc), 162.4 (s, C4), 156.7 (s, C2), 145.5 (s, C6), 97.7 (s, C5), 87.4 (s, Cr), 87.3 (s, C4), 70.2 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.1 (s, (OCH2α)p£G), 61.0 (s, C5), 40.1 (s, C2), 31.5, 28.4 (2s, CH2succ).
Exemple 6 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]
Le couplage entre le PEG-bis-succinate (5 g, 1 ,20 mmol) et la cytidine (0,58 g, 2,4 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3 et le composé obtenu sous forme d'un solide blanc (4.80 g, 87 %).
(CH2CI2 / MeOH, 6/4, v/v) : 0.9.
RMN 1H (D2O, 200 MHz) δ 8.26 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.26 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H1 H5), 5.79 (d, Jv-2' = 2.7 Hz, 1 H, H1 ), 4.19-4.14 (m, 2H, (OCH2α)PEG), 4.06 (d, J2 -1- = 2.7 Hz, 1 H, H2), 3.98-3.25 (m, H3- H4' 2H5. (OCH2)PEG), 2.64-2.76 (m, 4H, CH2succ).
RMN (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUcc), 13C 162.6 (s, C4), 156.9 (s, C2), 145.6 (s, C6), 97.8 (s, C5), 91.3 (s, Cr), 83.8 (s, C4), 74.5 (s, C3), 69.5 (s, (OCH2)PEG), 68.6 (s, C2), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.1 (s, (OCH2Q)PEG), 60.1 (s, C5), 31.5, 28.4 (2s,
Exemple 7 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)cytosyl) succinate]
Le couplage entre 0,25 g de PEG-bis-succinate (0,06 mmol) et 0,025 g de 2',3'-didésoxycytidine (0,12 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,23 g, 87 %).
R, (CH2CI2 / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.33 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.26 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.97 (dd, J1 -23= 6.6 Hz, Jr-2 b = 2.0 Hz, 1 H, Hr), 4.20 (m, 3H, (OCH2CI)PEG H4), 3.86-3.81 (m, 2H, 2H5), 3.73-3.62 (m, OCH2)PEG), 2.79-2.65 (m, 4H, CH2SUCc), 2.45 (m, 1 H, H2 a), 2.05 (m, 1 H, H2 b), 1.97 (m, 1 H1 H33), 1 -65 (m, 1 H, H3b). RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUcc), 162.4 (s, C4), 156.9 (s, C2), 145.7 (s, C6), 97.4 (s, C5), 88.3 (s, C1 ), 83.3 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2)P£G), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.1 (s, (OCH2α)P£G), 62.3 (s, C5), 32.5 (s, C2), 31.5, 28.5 (2s, CH2SUCc), 24.1 (s, C3 ).
Exemple 8 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]
Le couplage entre 1 g de PEG-bis-succinate (0,23 mmol) et 0,10 g de 3TC (0,47 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.88 g, 80 %).
(CH2CI2 / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.42 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.25 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.24 (dd, Jr-2.a = 2.7 Hz, J1 -2.b = 5.4 Hz, 1 H, H1 ), 5.31 (t, J4 -5' = 3.6 Hz, 1 H, H4), 4.20-4.17 (m, (OCH2α)P£G), 3.99 (dd, J5 >a-4- = 3 Hz, J53 -5 b = 12.9 Hz, 1 H, H53), 3.90-3.34 (m, OCH2)P£G H5.b H23), 3.22 (dd, J2 b-r = 2.4 Hz, Jzb-2 a = 12.6 Hz, 1 H, H2 b), 2.79-2.65 (m, 4H, CH2succ).
RMN lύC (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUcc), 162.6 (s, C4), 156.6 (s, C2), 146.1 (s, C6), 97.3 (s, C5), 88.0 (s, C1 ), 87.9 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2)PR3), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.1 (s, (OCH2α)P£G), 61.5 (s, C5), 38.0 (s, C2), 31.5, 28.5 (2s, CH2succ).
Exemple 8 bis: PoIy (oxyéthylène)4ooo bis[6-N-(1-(2'-désoxy-3',5'-O- ((tétraisopropyl)disiloxane-1 ,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)-adenosyl) succinate
Le couplage entre du PEG bis-succinate (1 g, 0.24 mmol) et de la 2'- désoxyadenosine (0.24 g, 0.48 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et on a obtenu le PEG-O-bis(succinyl-3',5'-TIPS,2'dA) sous forme d'un solide blanc (0.95 g, 78 %).
Rf (dichlorométhane/méthanol 98/2) : 0.57
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 8.74 (s, 1 H1 NH), 8.58 (s, 1 H, H8), 8.13 (s, 1 H, H2), 6.25 (m, 1 H, H1), 4.90 (m, 1 H, H3), 4.20 (m, 2H, (OCH2CX)PEG), 4.12 (m, 3H, H4- 2H5), 3.85-3.32 (m, (OCH2)PEG), 3.19 (m, 2H, CH2su∞ ), 2.72 (m, 2H, CH2succ ), 2.61 (m, 2H, H2), 0.962 (m, 28H, ((CH3J2CH)4).
Exemple 8 ter: PoIy (oxyéthylène)40oo bis[6-N-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-adénosyl) succinate
Le Peg-O-bis(succinyl-3',5'-TIPS,21dA) (0,21 mmol, 1 eq.) a été dissous dans du tétrahydrofurane (10 ml), et on a ajouté à cette solution 1 ,06 ml de de TBAF fluorure tétrabutylammonium (solution 1 M TBAF dans le tétrahydrofurane 5 éq.) Le mélange résultant a été agité pendant 1h, à température ambiante. Le mélange réactionnel a été dilué dans du dichlorométhane (3 ml) et la phase organique a été lavée à l'eau et à la saumure. Après évaporation sous pression réduite, le résidu a été dissous dans du déchlorométhane (2ml) pour être lentement ajouté à un excès en volume de diéthyl éther froid (20 ml). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyl éther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (2 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH. Le produit Peg-O- bis(succinyl-2'dA) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.82g, 90 %).
Rf (dichloromethane/methanol 98/2) : 0.43
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 9.15 (s, 1 H, HH), 8.63 (s, 1 H, H8), 8.19 (s, 1 H, H2), 6.41 (m, 1 H, H1), 4.73 (m, 1 H, H3), 4.22 (m, 4H, 2H5- (OCH2Q)PEG), 3.98 (m, 1 H1 H4), 3.86-3.39 (m, (OCH2)PEG), 3.22 (m, 2H, CH25UCc ), 2.96 (m, 1 H, 1 H2), 2.80 (m, 2H, CH2^ ), 2.61 (m, 2H, CH23UCc ), 2.37 (m, 1 H, 1 H2),
Exemple 9 : Poly(oxyéthylène)4000 Bis[4-N-(1-β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl) 2-hydroxyacétamide]
Le couplage entre 0,5 g de PEG-bis(OCH2-COOH) (0,12mmol) et 0,06 g d'araC (0,24 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,46 g, 82 %).
Rf (CH2CI2 / MeOH, 6.5/3.5, v/v) : 0.9 RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.22 (d, J6-5 = 7.0 Hz, 1 H, H6), 7.32 (d,
J5-6 = 7.0 Hz, 1 H, H5), 6.14 (s, 1 H, H1 ), 4.38 (m, 1 H, H2),
4.22 (m, 2H, (OCH2COOH)P£G), 4.05 (m, 3H, H3'
(OCH2Q)PEG), 4.05-3.20 (m, H4 2H5 (OCH2)pEG).
(D2O, 100 MHz) δ 172.3 (s, C=O), 162.1 (s, C4), 156.5 (s,
C2), 147.0 (s, C6), 97.3 (s, C5), 87.2 (s, Cr), 84.3 (s, C4),
75.5 (s, C2), 75.2 (s, C3), 70.6 (s, (OCH2 a)PEG), 70.0 (s,
(OCH2)PEG), 60.5 (s, OÇ_H2COOH)PEG), 60.4 (s, C5).
Exemple 9 bis: PoIy (oxyéthylène)40oo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl)-3-hydroxy propanamide]
Le couplage entre le PEG-bis (OCH2CH2-COOH) (3 g, 0.72 mmol) et araC (0.35 g, 1.44 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (2.40 g, 72 %).
R^ (CH2CI2 / MeOH, 85/15, v/v) : 0.7
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 8.30 (d, J6 5 = 7.2 Hz, 1 H, H6), 7.16 (d, J5-6 = 7.2 Hz, 1 H, H5), 6.09 (t, Jv.ZBi = Jv-Zb= 5.4 Hz, 1 H1 H1), 4.46 (m, 1 H, H2), 4.32 (m, 1 H, H3), 4.14 (m, 1 H, H4), 3.97-3.40 (m, 2H5(OCH2)PEG), 2.69 (m, 2H, CHJD).
Exemple 9 ter: PoIy (oxyéthylène)40oo bis[4-N-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl)-3-hydroxy propanamide]
Le couplage entre PEG-bis (OCH2CH2-COOH) (3 g, 0.72 mmol) et la 2'- désoxycytidine (0.33 g, 1.44 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et il a été obtenu le composé sous forme d'un solide blanc (2.75 g, 83 %).
Rf (CH2CI2 / MeOH, 85/15, v/v) : 0.8
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 8.42 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.38 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.16 (t, Jr-2 a = Jr-2 b = 6.2 Hz, 1 H, H1), 4.50 (m, 1 H, H3), 4.11 (m, 1 H, H4), 3.85-3.50 (m, 2H5- (OCH2)PEG), 3.39 (t, JCH23-CH25 = 4.5 Hz, 2H, CH^), 2.54 (m, 1 H, H2a), 2.32 (m, 1 H1 H26).
Exemple 10 : Méthode B : Monophosphorylation du nucléoside sur support polvmère A une solution du PEG-O-bis(succinyl-nucléoside) ou PEG-bis(OCH2CH2- CO-nucléoside), en fait le nucléoside sur support polymère (1 eq), dans du triéthylphosphate (6 ml) chauffé à 40°C ou dans de l'acétonitrile à 5°C, de l'oxychlorure de phosphore en excès est ajouté et le mélange est agité pendant 1 h. L'excès d'oxychlorure de phosphore est hydrolyse par addition d'une solution tampon de bicarbonate de triéthylammonium aqueux (1 M, pH= 7) (25 ml) et le mélange est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissous dans le dichlorométhane (180 ml) et la phase organique lavée à l'eau. La phase aqueuse subit plusieurs extractions au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées et évaporées sous pression réduite. Le monophosphate supporté est précipité à partir d'une solution de dichlorométhane, par addition d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité est filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur KOH.
Exemple 11 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri-éthylammonium
La monophosphorylation de 3 g (0,64 mnol) de PEG-O-bis(succinyl-araC) de l'exemple 4 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10 et a donné le composé sous forme d'un solide blanc (2,99 g, 92 %).
HPLC traraCMP '• 18-9 min tX monophosphorylation : 97 %. RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.34 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H1 H6), 7.10 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.18 (d, J1 -2. = 5.0 Hz, 1 H, H1 ), 4.42 (m, 1 H, H2), 4.19 (m, 2H, (OCH2α)pEG), 4.10-4.15 (m, 4H, H3. H4- 2H5), 3.30-3.90 (m, (OCH2)PR3), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH3CJHg)3NH), 2.62-2.85 (m, 4H, CH2succ), 1.18 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (ÇJH3CH2)3NH).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.7, 174.4 (s, C=OSucc), 159.0 (s, C4), 148.1 (s, C2), 145.2 (s, C6), 96.9 (s, C5), 87.0 (s, Cr), 82.3 (d, Jc4-P = 8.0 Hz, C4), 75.8 (s, C2), 74.1 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.1 (s, OCH2α)p£G), 63.6 (s, C5-), 46.6 (s, (CH3QHa)3NH), 31.6, 28.3 (s, CH2SUCc), 8.2 (s, (CHaCHz)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0,26 (s).
Exemple 11 bis: PoIy (oxyéthyïène)40oo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate)-3-hydroxy propanamide] sels de triéthylammonium
La monophosphorylation du PEG-bis(OCH2CH2-CO-AraC) (1.1 g, 0.24 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode B et le PEG-bis(OCH2CH2- CO-AraCMP) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.95 g, 84 %).
RMN 1H (D2O1 200 MHz) δ 8.29 (d, J6-5 = 7.2 Hz, 1 H1 H6), 7.27 (d, J5-6 = 7.2 Hz, 1 H, H5), 6.17 (m, 1 H, H1), 4.42 (m, 1 H, H2), 4.09 (m, 4H, H3 H4 ZH5), 3.96-3.25 (m, (OCH2)PEG), 3.10 (q, J = 7 Hz, 6H, (CH3CH2)3NH), 2.62 (t, JCH2a-CH2b = 6 Hz, 2H, CH^a), 1.18 (t, J = 7 Hz, 9H, (CH3CH2J3NH).
RMN 3 d1lP (D2O, 81 MHz) δ 0.22 (s).
Exemple 12 : Poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de triéthylammonium
La monophosphorylation de 1 g (0,21 mmol) de PEG-O-bis(succinyl-dC) de l'exemple 5 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10 avec 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,59 ml, 6,49 mmol). Le composé a été obtenu sous forme de solide blanc (0,93 g, 86 %).
HPLC tracMP : 13.07 min txmθnophosphoryiation : 80 %. RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.38 (d, J6 5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.16 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.17 (t, Jr-2 a = Jr-?b = 6.1 Hz, 1 H, Hr), 4.45 (m, 1 H, H3), 4.19 (m, 2H, (OCH2α)P£G), 4.11- 3.95 (m, 3H, H4.2H5), 3.95-3.35 (m, (OCH2) PEG), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3CH2J3NH), 2.82-2.62 (m, 4H, CH2succ), 2.48 (m, 1 H, H2 a), 2.25 (m, 1 H1 H2 b), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (DZbCH2)3NH).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.7, 174.5 (2s, C=OSUcc), 161.5 (s, C4), 155.2 (s, C2), 146.5 (s, C6), 97.5 (s, C5), 87.5 (s, Cr), 86.3 (d, JC4.p = 8.0 Hz, C4), 70.4 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.2 (s, (OCH2α)PEG), 64.1 (d, J05 -P = 8.0 Hz, C5), 46.6 (s, (CH3CHg)3NH), 40.1 (s, C2), 31.6, 28.4 (2s, CH2succ), 8.2 (s, (CH3CHz)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.19 (s).
Exemple 13 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri-éthylammonium
La monophosphorylation de 0,50 g de PEG-O-bis(succ-C) (0,11 mmol) de l'exemple 6 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10, avec 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,29 g, 3,30 ml). Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (4,80 g, 89 %).
HPLC trcMP : 14.17 min tx monophosphorylation : 96 %.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.59 (d, J6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H6), 7.10 (d,
J5-6 = 7.5 Hz, 1 H1 H5),
5.97 (s, 1 H, H1 ), 4.91-4.12 (m, 7H, H2. H3- H4- 2H5. (OCH2α)pEG), 3.94-3.47 (m, (OCH2)pEG), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3QHg)3NH)1 2.95-2.75 (m, 4H, CH2succ), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (CHgCH2)SNH).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.7, 174.4 (2s, C=OSUcc), 161.1 (s, C4), 154.0 (s, C2), 147.3 (s, C6), 97.3 (s, C5), 91.1 (s, C1 ), 86.4 (d, Jc4'-p = 8.0 Hz, C4), 74.3 (s, C2), 69.6 (s, C3' (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PR3), 64.1 (s, (OCH2α)PEG), 64.0 (s, C5), 46.6 (s, (CH3CH2J3NH), 31.6, 28.2 (2s, CH2SUCC), 8.2 (s, (ÇJH3CH2)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.12 (s).
Exemple 14 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri- éthylammonium
La monophosphorylation de 0,04 g de PEG-O-bis(succinyl-ddC) (0,09 mmol) de l'exemple 7 a été réalisée par la méthode B de l'exemple 10, en utilisant 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,24 ml, 2,70 mmol), en présence de tamis moléculaire activé (3Â). Le composé attendu a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,41 g, 96 %).
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.49 (d, J6 5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.13 (d, J5-6 = 7.3 Hz, 1 H1 H5), 5.98 (d, J1 -2 = 5.1 Hz, 1 H, H1 ), 4.35 (m, 1 H, H4'), 4.18-3.92 (m, 4H, (OCH2α)P£G 2H5), 3.85- 3.36 (m, OCH2)PEG), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3CiH2J3NH), 2.79-2.68 (m, 4H1 CH2succ), 2.46 (m, 1 H, H2 a), 2.08 (m, 1 H, H2 b), 1.97 (m, 1 H, H33), 1.83 (m, 1 H, H3 b), 1.18 (t, J= 7.2 Hz, 9H, (QH3CH2)SNH).
RMN ά 31Ψ 1 (D2O, 121 MHz) δ 0.37 (s). Exemple 15 : Méthode C: Diphosphorylation : phosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère
Une suspension de PEG-O-bis(succinyl-nucléoside monophosphate) (1 eq) dans de la tributylamine (2,50 ml) est agitée pendant 10 min à température ambiante. On ajoute du diéthyléther froid (50 ml) et le précipité est filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit. Le nucléoside monophosphate sur support polymère est dissous dans du N.N-diméthylformamide anhydre (3,75 ml) et on ajoute du 1 ,1 '- carbonyldiimidazole (0,59 mmol, 6 eq). Le mélange réactionnel est agité pendant 2h à température ambiante, et traité avec du méthanol anhydre (0,10 ml). Après 15 minutes d'agitation, une solution de phosphate de tributylammonium dans du N,N-diméthylformamide anhydre (1 M, 1 ,49 mmol, 15 eq) est ajoutée et la suspension agitée pendant 24h à température ambiante. Le mélange est traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. Le résidu est précipité au diéthyléther froid (50 ml). Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Une chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 du produit brut est effectuée (gradient acétonitrile : 0 à 70 %, dans l'eau).
Exemple 16 : Poly(éthylèneglycol)4000 Bis[4-Λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-diphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
La diphosphorylation de 0,5 g (0,09 mmol) de PEG-O-bis(succ-CMP) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15 et a conduit au composé sous forme d'un solide blanc (0,36 g, 66 %) après lyophilisation. RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.24 (d, J6-S = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.27 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.17 (d, Jv-z = 5.1 Hz, 1 H, H1 ), 4.42 (t, Jz-v = Jz-s = 5.1 Hz, 1 H, H2), 4.28-4.05 (m, 6H, H3- H4' 2H5. (OCH2α)p£G), 3.89-3.35 (m, (OCH2)PeG)1 2.92 (t, J = 7.7 Hz, 12H, (CHsCHsCHsDZyaNH), 2.80-2.68 (m, 4H, CH2SUCc), 1.54 (m, 12H, (CH3CH2CiH2CH2)SNH), 1.29 (m, 12H, (CH3CiH2CH2CH2)SNH), 0.81 (t, J = 7.2 Hz, 18H, (CiH3CH2CH2CH2)SNH).
RMN 1 1J3C, (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, 162.5 (s, C4), 156.8 (s, C2), 146.8 (s, C6), 97.6 (s, C5), 86.6 (s, Cr), 82.0 (d, Jc4-P = 9.0 Hz, C4), 75.1 (s, C2), 74.3 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)p£G), 64.1 (s, (OCH2α)PeG), 64.1 (s, C5), 52.6 (s, (CH3CH2CH2CH2)SNH), 31.6, 28.4 (2s, CH2succ), 25.2 (s, (CH3CH2QH2CHz)3NH), 19.2 (s, CH3CH2CH2CH2)SNH), 12.8 (s,
(ÇϋsCH2CH2CH2)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.44 (m, P3), -11.03 (m, P0).
Exemple 17 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-diphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
La diphosphorylation de 0,30 g du PEG-O-bis(succ-dCMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15 et a conduit au composé sous forme d'un solide blanc (0,28 g. 81 %) après lyophilisation.
C4), 70.4 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.9 (d, Jc5 -P = 6.0 Hz, C5), 64.1 (s, (OCH2α)PEG), 52.7 (s, (CH3CH2CH2CHg)3NH), 39.9 (s, C2), 31.6, 28.5 (2s, CH2succ), 25.8 (s, (CHaC^ÇHgCH^NH), 19.2 (s, (CH3Ç_H£CH2CH2)3NH), 12.7 (s, (CH2CH2CH2CH2)SNH).
RMN J 311P 1 (D2O, 121 MHz) δ -10.69 (d, Jβ-α = 19.3 Hz, Pβ), -11.26 (d, Jα-β = 17.3 Hz, Pα).
Exemple 18
La diphosphorylation de 0,55g du PEG-O-succ-CMP (0,11 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15. Un mélange (comprenant le dérivé 2', 3' carbonate correspondant) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,34 g, 60 %) après lyophilisation.
Poly(éthylène glycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- diphosphate) succinate], sels de fri-butylammonium
RMN 1H
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.79 (m, Pβ), -11.85 (m, P0).
Poly(éthylène glycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'-carbonyl-β-D-ribof uranosyl)- cytosyl-5'-diphosphate) succinate], sels de f/7-butylammonium
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.12 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.24 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.98 (s, 1 H, H1 ), 5.53, 5.46 (dd, J2S = Js-2- = 7.5 Hz, J2-V = J3 >-4' = 1.8 Hz, 2H, H2' H3.), 4.84 (m, 1 H, H4) 4.07-4.30 (m, 4H, 2H5 a (OCH2α)PEG), 3.88-3.33 (m, (OCH2)PEG), 3.09 (m, 12H, ((CH3CH2CH2CHg)3NH), 2.84-2.62 (m, 4H, CH2succ), 1.54 (m, 12H, (CHaC^ÇJHgCH^NH), 1.30-1.15 (m, 12H, (CH3Ç_H£CH2CH2)3NH), 0.68-0.92 (m, 18H, (Ç_H3CH2CH2CH2)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.79 (m, P3), -11.85 (m, Pα).
Exemple 19 : Méthode D : Triphosphorylation ; diphosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère
Une suspension de PEG-O-bis(succinyl-nucléoside monophosphate) ou du PEG-bis(OCH2CH2-CO-nucléoside monophosphate) (1 eq) dans la tributylamine (2,50 ml) est agitée pendant 10 min à température ambiante. On ajoute du diéthyléther froid (50 ml) et le précipité est filtré, lavé et séché sous vide sur des pastilles de KOH toute une nuit. Le nucléoside monophosphate sur support polymère est dissous dans du N,N-diméthylformamide anhydre (3,75 ml) et on ajoute du 1 ,1 - carbonyldiimidazole (0,59 mmol, 6 eq). Le mélange réactionnel est agité durant 2h à température ambiante et traité avec du méthanol anhydre (0,10 ml). Après 15 min, on ajoute une solution de tributylamonium pyrophosphate dans du N,N-diméthylformamide (1 M, 1 ,49 mmol, 15 eq) anhydre. La suspension est agitée pendant 24h à température ambiante. Le mélange a été traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. Le résidu précipite dans du diéthyléther froid (50 ml). Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Une chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 du produit brut est effectuée avec un gradient acétonitrile : 0 à 70 % dans l'eau.
Exemple 20 : Poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de frv-butylammonium
La triphosphorylation de 0,50 g du PEG-O-bis(succ-araCMP) (0,09 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19 et a fourni le composé sous forme d'un solide blanc (0,43 g, 69 %) après lyophilisation.
RMN 1H
RMN 31P 121 MHz) δ -10.94 (d, Jγ-β = 19.43 Hz, Pγ), - 11.32 (d, JQ-β = 19.43 Hz, Pα), -23.28 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 19.43 Hz, Pβ).
Exemple 20 bis: PoIy (oxyéthylène)4ooo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate)-3-hydroxy propanamide] sels de tri-butylammonium
La triphosphorylation du PEG-bis(OCH2CH2-CO-AraCMP) (0,70 g, 0,15 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D et le PEG-bis(OCH2CH2-CO- AraCTP) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,41 g, 55 %) après lyophilisation.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.29 (d, J6-5 = 7.2 Hz, 1 H, H6), 7.27 (d, J5-6 = 7.2 Hz, 1 H, H5), 6.17 (m, 1 H, H1), 4.42 (m, 1 H, H2), 4.09 (m, 4H, H3 H4'2H5), 3.94-3.30 (m, (OCH2)PEG), 3.06 (t, J = 7.9 Hz, 18H, (CH3CH2CH2CH2)SNH), 2.62 (t, JCH2a-CH2b = 6 Hz, 2H, CH2A), 1.51 (m, 18H, (CH3CH2CH2CH2)SNH), 1.26 (m, 18H, (CH3CH2CH2CH2)SNH), 0.94 (t, 27H, (CH3CH2CH2CH2)SNH) .
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.80 (d, Jγ-β = 21.17 Hz, Pγ), -11.84 (d, Jα-β = 21.17 Hz, P0), -23.31 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 21.17 Hz, Pβ).
Exemple 21 : Poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
La triphosphorylation de 0,30g du PEG-O-bis(succ-dCMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19 et a fourni le composé sous forme d'un solide blanc (0,27 g, 73 %) après lyophilisation.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.35 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.17 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.17 (t, J1 -23 = Jr-2 b = 6.3 Hz, 1 H, Hr), 4.51 (m, 1 H, H3-), 4.21-4.13 (m, 5H1 H4- 2H5' (OCH2α)p£G), 3.89-3.31 (m, (OCH2)PEG), 3.17-2.95 (m, 18H, (CH3CH2CH2QHg)3NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH2succ), 2.47 (m, 1 H, H23), 2.26 (m, 1 H, H2 b), 1.59-1.45 (m, 18H, (CH3CH2CiH2CH2)SNH), 1.40-1.25 (m, 18H, (CHaÇH^CHsCH^aNH), 0.90-0.75 (m, 27H, (CHgCH2CH2CH2)SNH).
RMN 1JC (D2O, 100 MHz) δ 174.8, 174.6 (2s, C=OSUCc), 161.8 (s, C4), 155.4 (s, C2), 146.3 (s, C6), 98.0 (s, C5), 87.4 (s, Cr), 86.2 (s, C4), 70.3 (s, C3), 69.6 (s, (OCH2)pEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 65.2 (s, C5), 64.1 (s, (OCH2α)P£G), 52.6 (s, (CH3CH2CH2CH2J3NI-I), 40.0 (s, C2), 31.6, 28.4 (2s, CH2succ), 25.2 (s, (CH3CH2QH2CHz)3NH), 19.1 (s, (CHaÇJHgCH^H^NH), 12.8 (s, (Ç_H3CH2CH2CH2)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.73 (d, Jγ-β = 20.6 Hz, Pγ), -11.34 (d, Jα-β = 19.4 Hz, P0), -22.81 (m, Pβ).
Exemple 22 : Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
La triphosphorylation de 0,30 g du PEG-O-bis(succ-CMP) (0,11 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19. Un mélange (1/1) du composé attendu et du dérivé 2',3' carbonate correspondant, a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0, 26 g, 70 %) après lyophilisation.
Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(β-D-ribof uranosyl)-cytosyl-5'- triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
RMN 1H
RMN 31P (D2O, 81 MHz) δ -10.65 (m, Pγ), -12.10 (m, P0), -22.94
(m, Pβ). Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-carbonyl-β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.12 (d, J6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 7.21 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H5), 5.97 (s, 1 H, Hr), 5.50 (m, 2H, H2. H3), 4.86 (m, 1 H, H4-), 4.25-4.14 (m, 4H, 2H5- (OCH2α)p£G), 3.97-3.25 (m, (OCH2)P£G), 3.14-2.98 (m, 18H, (CH3CH2CH2ÇH2)3NH), 2.74-2.60 (m, 4H, CH2succ), 1.63-1.48 (m, 18H, (CHaCHpCH2CHp)3NH), 1.35-1.13 (m, 18H, (CH3QH2CH2CH2)SNH), 0.86-0.78 (m, 27H, (CH3CH2CH2CH2)SNH).
RMN 31P (D2O, 81 MHz) δ -10.65 (m, Pγ), -12.10 (m, P0), -
22.94 (m, Pβ).
Exemple 23 : Poly(éthyïèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de f/v-éthylammonium et carbonyldiimidazolium
La triphosphorylation de 0,32 g du PEG-O-bis(succ-CMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19. L'activation a été réalisée avec du carbonyldiimidazole (3 eq) durant 30 min seulement. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,17 g, 42 %) après lyophilisation.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.60 (s, 2H, N=CH-N), 8.31 (d, J6 5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.38 (s, 4H, N=CH=CH), 7.23 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.89 (d, Jy-? = 2.8 Hz, 1 H, H1-), 4.28- 4.19 (m, 7H, H2- H3. H4' 2H5. (OCH2α)P£G), 3.86-3.34 (m, (OCH2)p£G), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CHsCHp)3NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH2sUcc), 1.18 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (QHaCHaJaNH).
RMN J 311 P 1 (D2O, 121 MHz) δ -10.75 (d, Jγ-β = 19.4 Hz, Pγ), -11.37 (d, Jα-β = 19.4 Hz, Pα), -23.08 (t, Jβ-Y = Jβ-a = 19.4 Hz, Pp). Exemple 24 : Poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(2\3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'- triphosphate) succinate] sels de tri- butylammonium
La triphosphorylation de 0,36 g du PEG-O-bis(succ-ddCMP) (0,07 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode de l'exemple 19. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,27 g, 60 %) après lyophilisation. RMN 1H
RMN 1JC (D2O, 100 MHz) : 174.8, 174.5 (2s, C=OSUCc), 161.0 (s, C4), 155.0 (s, C2), 144.8 (s, C6), 97.3 (s, C5), 88.6 (s, Cr), 81.8 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)pEG), 66.0 (s, C5), 64.1 (s, (OCH2Q)PEG), 52.6 (s, (C H3C H2C H2CJi)3N H), 32.5 (s, C2), 31.6, 28.4 (2s, CH2succ), 25.2 (s, (CH3CH2ÇH2CH2)3NH), 23.8 (s, C3), 19.2 (s, (CH3Çϋ>CH2CH2)3NH), 12.8 (s, (DZbCH2CH2CH2)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -11.00 (m, Pv Pα), -22.85 (m, P3).
Exemple 25 : poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-disphosphate)succinate], sels de tri- butylammonium
La diphosphorylation du PEG-O-bis(succ-ddCMP) (0.20 g, 0.04 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.18 g, 80 %) après lyophilisation.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.35 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.21 (d, J5-6 = 7.3 Hz, 1 H, H5), 5.94 (d, J1 -2- = 5.6 Hz, 1 H, H1-), 4.31 (m, 1 H, H4'), 4.16 (m, 3H, (OCH2α)PEG H5 a), 4.03-3.93 (m, 1 H, H5 b), 3.80-3.33 (m, OCH2)P£G), 3.00 (m, 12H, (CH3CH2CHzQHg)3NH), 2.74-2.62 (m, 4H, CH2sUcc), 2.37 (m, 1 H, H23), 2.00 (m, 2H, H2 b H3 a), 1.77 (m, 1 H, H3*), 1.55 (m, 12H, (CH3CH2Ç_H£CH2)3NH), 1.23 (m, 12H,
(CH3CH2CH2CH2)SNH), 0.80 (m, 18H, (Ç_H3CH2CH2CH2)3NH).
RMN 13C
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.29 (m, Pβ), -10.97 (m, P0).
Exemple 26 : Méthode E : Clivage du nucléotide de son support Le nucléotide supporté (0,05 mmol, 1eq) est dissous dans l'ammoniaque concentré (2 ml). La solution est agitée à température ambiante pendant 1 h, puis évaporée sous pression réduite. On réalise la purification par chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique eau) puis une dialyse sur membranes d'ester de cellulose.
Exemple 26 bis Méthode E bis: Clivage des nucléotides sur support
Un nucléotide sur support (0.05 mmol, 1 eq.) a été dissous dans l'ammoniac concentré (2 ml_). La solution a été agitée à température ambiante pendant 1h, puis évaporée sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique eau), suivie d'une lyophilisation.
A la différence de l'exemple 26, l'étape de dialyse n'est pas réalisée.
Exemple 27 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,15 g du PEG-O- bis(succinyl-araCMP) (0,02 mmol). La purification par chromatographie sur colonne du produit brut a donné un mélange d'araCMP et de succinamide dans un rapport 93/7 (15 mg). Le succinamide a été éliminé par dialyse dans l'eau (2 ml) toute une nuit et l'araCMP (13 mg, 68 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.2.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.88 (d, J6 5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.11 (d,
J1 -2- = 5.3 Hz, 1 H, H1 ), 6.02 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H1 H5), 4.34 (t, J2-r = J2'-3' = 5.3 Hz 1 H, H2), 4.11-3.96 (m, 4H, H3- H4' 2H5).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.45 (s).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 7100), λmin 247 nm (ε 4100).
LC/MS (M-NH4 +) m/z : 322 tr : 11.7 min purity : 97 %.
Exemple 27 bis:
La méthode E bis a été appliqué au PEG-bis(OCH2CH2-CO-AraCMP) (0.15 g, 0.02 mmol). La purification sur colonne chromatographique du produit brut a permis d'obtenir araCMP sous forme d'un solide blanc (0.51 g, 70 %) après lyophilisation.
Exemple 28 1 -(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,34 g du PEG-O- bis(succinyl-araCDP) (0,05 mmol). La purification du produit brut sur colonne de chromatographie a donné un mélange de araCDP et de succinamide dans le rapport 88/12 (55 mg). Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. L'araCDP (8,5 mg, 96 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
(iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.14 (d, J1 -2. = 5.4 Hz, 1 H, H1 ), 6.03 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H5), 4.35 (t, J2'-v = Jz* = 5.4 Hz, 1 H, H2), 4.20-4.10 (m, 3H1 H3. 2H5'), 4.00 (m, 1 H, H4).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.42 (d, Jβ-α = 20.6 Hz, Pp), - 11.10 (d, Jα-β = 20.6 Hz, P0).
UV (H2O) λmax 274 nm (ε 7900), λmm 246 nm (ε 3800). LC/MS (M+H-2NIV) : m/z : 402 tr : 13.36 min purity : 86.7 %.
Exemple 29 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate sels d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,43 g du PEG-O- bis(succinyl-araCTP) (0,07 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange d'araCTP et de succinamide dans le rapport 95/5 (68 mg). Un échantillon du mélange (8,5 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. AraCTP (8 mg, 92 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
(iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.2.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J6 5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.14 (d, J1 -2' = 5.4 Hz, 1 H, Hr), 6.04 (d, J5-e = 7.6 Hz, 1 H, H5), 4.35 (t, J2'-v = J2-S = 5.4 Hz, 1 H, H2), 4.20-4.12 (m, 3H, H3' 2H5), 4.01 (m, 1 H, H4).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.45 (d, Jγ-β = 18.2 Hz, Pγ), -11.20 (d, Jα-p = 19.4 Hz, Pα), -22.96 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 18.2 Hz,
Pβ)-
UV (H2O) λmax 273 nm (ε 8700), λmιn 246 nm (ε 4500). LC/MS (M+2H-3NH4 +) : m/z : 482 tr : 19.25 min purity : 83.3 %.
Exemple 29 bis:
La méthode E bis a été appliqué à PEG-bis(OCH2CH2-CO-AraCTP) (0.20 g, 0.04 mmol). Après purification par chromatographie en phase inverse RP18 et lyophilisation, on a obtenu l'AraCTP sous forme d'un solide blanc (14mg, 79 %).
Exemple 30 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate sel d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,14 g du PEG-O- bis(succinyl-dCMP) (0,03 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCMP et de succinamide dans le rapport 86/14 (17 mg). Un échantillon du mélange (10 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. Le dCMP
(8,6 mg, 73 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.5.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.07 (d, J6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H6), 6.19 (t, Jv-za = Jv-2-b = 6.5 Hz, 1 H, Hr), 6.09 (d, J5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H5), 4.45 (m, 1 H, H3), 4.12 (m, 1 H, H4), 4.04-3.90 (m, 2H, 2H5), 2.44-2.32 (ddd, J2 a -r = 6.2 Hz, J23 -Ï = 3.7 Hz, J23 -2' = 14.1 Hz, 1 H, H2 a ), 2.27-2.18 (m, 1 H, H2.b).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 161.8 (s, C4), 151.7 (s, C2), 143.3 (s, C6), 95.5 (s, C5), 86.4 (s, Cr), 86.0 (d, J04 -P = 8.0 Hz, C4), 70.7 (s, C3), 64.4 (d, J05 -P = 5.0 Hz, C5), 39.5 (s, C2).
RMN 31 P (D2O, 121 MHz) δ 0.23 (s).
UV (H2O) λmax 273 nm (ε 9100), λmin 246 nm (ε 4800).
LC/MS (M-NH4 +) : m/z : 306 tr : 11.23 min purity : 92.5 %. Exemple 31 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,21 g du PEG-O- bis(succinyl-dCDP) (0,03 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCDP et de succinamide dans le rapport 90/10 (27 mg). Un échantillon du mélange (10 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. 9 mg de dCDP (86 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
(iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.08 (d, J6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H6), 6.19 (t, J1-. 2a = Jv-zb = 6.6 Hz, 1 H, H1 ), 6.16 (d, J5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H5), 4.52 (m, 1 H, H3), 4.16-4.06 (m, 3H, H4' 2H5), 2.43-2.34 (ddd, J23 -V = 6.3 Hz, J2.a -3' = 3.6 Hz, J23 -2' = Hz, 1 H, H23 ), 2.27-2.18 (m, 1 H, H2 b).
RMN 1 l3d,C (D2O, 100 MHz) δ 160.5 (s, C4), 147.9 (s, C2), 143.9 (s, C6), 95.4 (s, C5), 86.5 (s, C1), 86.0 (s, C4), 70.6 (s, C3), 64.9 (s, C5), 39.5 (s, C2).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.68 (d, Jβ-α = 19.3 Hz, Pp), -11.25 (d,
UV (H2O) λmax 273 nm (ε 9100), λmin 246 nm (ε 4600). LC/MS (M+H-2NH4 +) : m/z : 386 tr : 13.89 min purity : 77.4 %.
Exemple 32 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate, sels d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,25 g du PEG-O- bis(succinyl-dCTP) (0,04 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCTP et de succinamide dans le rapport 94/6 (30 mg). Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. 9 mg dCTP (70 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
(iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6. a -
RMN 3 J111P (D2O, 121 MHz) δ -9.62 (m, Pγ), -11.07 (d, Jα-Y = 16.4 Hz, Pα), -21.93 (m, Pβ).
UV (H2O) λmax 273 nm (ε 10100), λmin 245 nm (ε 4300). LC/MS (M+2H-3NH4 +) : m/z : 466 tr : 18.81 purity : 84.5 %.
Exemple 33 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,13 g du PEG-O- bis(succinyl-CMP) (0,02 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné 17 mg d'un mélange de CMP et de succinamide dans le rapport 80/20. Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. Le CMP (7 mg, 82 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.3. RMN 1H (D2O, 400 MHz) δ 7.98 (d, J6 5 = 7.7 Hz, 1 H, H6), 6.08 (d,
J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.89 (d, J1 -2- = 2.6 Hz, 1 H, H1 ), 4.28- 4.18 (m, 3H1 H2- H3- H4), 4.17-3.94 (m, 2H, 2H5).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 163.6 (s, C4), 154.4 (s, C2), 142.3 (s, C6), 96.0 (s, C5), 89.4 (s, C1 ), 83.0 (d, JC-V-P = 9-0 Hz, C4), 74.3 (s, C2), 69.2 (s, C3), 63.7 (d, JC5--P = 5.0 Hz, C5).
RMN 31 P (D2O, 121 MHz) δ 0.29 (s).
LC/MS (M-NH4 +) : m/z : 322 tr : 10.20 min purity : 86 %.
Exemple 34 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium
0,5 ml de triéthylamine ont été ajoutés à une solution de 0,20 g du PEG-O- bis(succinyl-CDP) (0,03 mmol.) dans un mélange éthanol/eau (6 ml, 1/1 , v/v). Le mélange a été agité à température ambiante durant 3h et concentré sous pression réduite. Le résidu a été traité selon la méthode E de l'exemple 25. La chromatographie sur colonne du produit a donné un mélange de CDP et de succinamide dans le rapport 95/5 (30 mg). Un échantillon (10,5 mg) du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse sur membranes d'ester de cellulose toute une nuit. 9 mg de CDP (93 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation, contaminé par 7 % d'un sous-produit identifié comme l'analogue cytidine 5'-diphosphate-2,3'-monophosphate cyclique.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 5.98 (d,
J5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H5), 5.83 (d, J1 -2- = 3.9 Hz, 1 H, Hr), 4.24-4.00 (m, 5H, H2. H3. H4.2H5).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 163.1 (s, C4), 154.2 (s, C2), 140.5 (s, C6),
94.8 (s, C5), 87.8 (s, C1 ), 81.3 (d, J04-P = 9.1 Hz, C4), 72.7 (s, C2), 67.7 (s, C3), 62.9 (d, JC5-P = 5.4 Hz, C5). RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.21 (d, Jβ-α = 20.3 Hz, Pβ), -11.13 (d,
Jα-β = 20.3 Hz, P0).
UV (H2O) λmax 270 nm (ε 10500), λmin 241 nm (ε 6700).
LC/MS (M+H-2NH4 +) : m/z : 402 tr : 14.15 min purity : 71.8 %.
Exemple 35 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate, sels d'ammonium
0,5 ml de théthylamine ont été ajoutés à une solution de 0,19 g du PEG- O-bis(succinyl-CTP) (0,03 mmol) dans un mélange éthanol/eau (6 ml, 1/1 , v/v). Le mélange a été agité à température ambiante durant 3h et concentré sous pression réduite. Le résidu traité selon la méthode E de l'exemple 25, La chromatographie du produit sur colonne a donné 24 mg d'un mélange de CTP et de succinamide dans le rapport 80/20. Un échantillon (16 mg) du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse sur membranes d'ester de cellulose toute une nuit. 13 mg de CTP (81 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation, contaminé par 10 % d'un sous-produit identifié comme l'analogue cytidine-2',3' monophosphate cyclique-5'-triphosphate.
R/ (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.94 (d, J6-5 = 7.7 Hz, 1 H, H6), 6.10 (d,
J5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H5), 5.88 (d, Jr-2. = 4.2 Hz, 1 H, Hr), 4.31- 4.11 (m, 5H, H2. H3 H4 ^H5).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 162.2 (s, C4), 152.8 (s, C2), 142.9 (s, C6), 95.9 (s, C5), 89.2 (s, Cr), 83.1 (d, JC4'-p = 9-3 Hz, C4), 74.3 (s, C2), 69.1 (s, C3), 64.5 (d, JC5 -P = 5.0 Hz, C5).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -9.72 (d, Jγ-β = 19.1 Hz, Pγ), -11.22 (d, J0. p = 19.4 Hz, P0), -22.69 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 19.4 Hz, Pβ). UV (H2O) λmax 270 nm (ε 12500), λmin 228 nm (ε 5300).
LC/MS (M+2H-3NH4 +) : m/z : 482 tr : 17.74 purity : 75.9 %. Exemple 36 : 1-(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'-triphosphate)) sels d'ammonium
La méthode E de I exemple 26 a été appliquée au PEG-O-bis(succinyl- ddCTP) (0.20 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCTP et de succinamide dans un rapport 92/8 (30 mg). Un échantillon de 10.5 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. ddCTP (9.50 mg, 67 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.7
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.02 (d, J6-S = 7.5 Hz, 1 H, H6), 6.08 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1H, H5), 6.02 (dd, Jr-2>a = 6.6 Hz, Jr-2 b = 2.0 Hz, 1 H, H1 ), 4.34 (m, 1 H, H4'), 4.25 (m, 1 H, H5 a), 4.08 (m, 1 H, H5 b), 2.43-2.33 (m, 1 H, H2 a), 2.10-1.97 (m, 2H, H2 b H3 a), 1.95-1.96 (m, 1 H, H^b).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 164.9 (s, C4), 155.4 (s, C2), 145.0 (s, C6), 97.1 (s, C5), 89.2 (s, C1 ), 82.8 (d, Jc-V- p = 8.5 Hz, C4), 68.3 (d, J04'. P = 5.4 Hz, C5), 33.9 (s, C2), 26.1 (s, C3).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ - 9.76 (d, Jγ-β = 19.3 Hz, Pγ), -10.90 (d, Jα-β = 18.9 Hz, P0), -22.38 (t, Jβ-Y = Jβ-a = 18.9 Hz, Pβ).
UV (H2O) λmax 279 nm (ε 11277), λmin 242 nm (ε 2283).
LC/MS (M+2H-3NH4 +) : m/z : 450 tr : 16.7 purity : 76 %
Exemple 37 : 1 -(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- monophosphate), sel d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée au PEG-O-succinyl-ddCMP (0.16 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCMP et de succinamide dans un rapport 86/14 (17 mg). Le succinamide est éliminé par dialyse d'une nuit réalisée dans l'eau (2 ml). ddCMP (14 mg, 79 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. R, (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.06 (d, J6-S = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.02 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H5), 5.93 (dd, J1 -23 = 6.6 Hz, Jr-2 b = 2.7 Hz, 1 H, H1 ), 4.27 (m, 1 H, H4), 4.07 (m, 1 H, H5 a), 3.88 (m, 1 H, H5-b), 2.37-2.32 (m, 1 H, H2 a), 2.07-1.83 (m, 3H, H2 b H3 a H3b).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 162.3 (s, C4), 151.6 (s, C2), 143.3 (s, C6), 94.8 (s, C5), 87.3 (s, C1 ), 81.2 (d, J04'- p = 8.4 Hz, C4), 65.2 (d, JC5 - p = 5.0 Hz, C5), 32.0 (s, C2), 24.0 (s, C3).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.42 (s).
UV (H2O) λmax 279 nm (ε 12276), λmin 245 nm (ε 2408).
LC/MS (M-NH4 +) : m/z : 290 tr : 10.75 purity : 93 %
Exemple 38 : 1-(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- diphosphate), sels d'ammonium
La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée au PEG-O-succinyl-ddCDP (0.18 g, 0.03 mmol). ). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCDP et de succinamide dans un rapport 92/8 (17 mg). Un échantillon de 16 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. ddCDP (14.8 mg, 66 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.5 RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.10 (d, J6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.09 (d, J5 6 = 7.6 Hz, 1 H, H5), 5.95 (dd, J1 -23 = 6.6 Hz, Jv-2 b = 2.7 Hz, 1 H, Hv), 4.30 (m, 1 H, H4), 4.18 (m, 1 H, H5 a), 3.99 (m, 1 H, H5 b), 2.45-2.30 (m, 1 H, H2 a), 2.10-1.80 (m, 3H, H2 b H3 a H3-b).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 161.7 (s, C4), 151.8 (s, C2), 143.6 (s, C6), 94.8 (s, C5), 87.4 (s, Cr), 81.2 (d, Jc4-. p = 8.3 Hz, C4), 66.1 (s, C5), 32.0 (s, C2), 24.1 (s, C3).
RMN 31P (D2O, 81 MHz) δ - 10.72 (m, Pβ), -11.03 (m, P0). UV (H2O) λmax 275 nm (ε 9803) , λmin 245 nm (ε 3514) .
LC/MS (M+H-2NH4 +) : m/z : 370 tr : 14.6 purity : 72 %
Exemple 39 : comparatif : Méthode F: Monophosphorylation d'un nucléoside ou analogue de nucléoside en solution: A une suspension de nucléoside (1 éq) dans le théthylphosphate (2 ml) à 0°C, on a ajouté de l'oxychlorure de phosphore (2 eq). Le mélange a été agité à 0°C pendant 4h, puis 3h à température ambiante. L'excès d'oxychlorure de phosphore a été hydrolyse par addition lente d'une solution aqueuse d'un tampon au bicarbonate de triéthylammonium (1 M, pH= 7) (5 ml). La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-cellulose, Sephadex avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium aqueux (0-1 M). Les sels de phosphate résiduels ont été supprimés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique eau).
Exemple 40 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de sodium - - - - - - -
La monophosphorylation de l'AraC (0,2 g, 0,82 mmol) a été réalisée selon la méthode F (exemple 36). L'araCMP a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,2 g, 70%) après échange d'ions sur Dowex Na+ et lyophylisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.2.
RMN 1H (D2O, 400 MHz) δ 8.01 (d, J6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H6), 6.13 (d, J1 -2' = 5.4 Hz, 1 H, Hv), 6.12 (d, J5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H5), 4.39 (t, J2 -1. = J2-. 3. = 5.4 Hz, 1 H, H2), 4.15-4.08-(m, 2H, H3- H5 a), 4.06-4.00 (m, 2H, H4- H5b).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 161.2 (s, C4), 151.0 (s, C2), 144.4 (s, C6), 94.7 (s, C5), 85.5 (s, C1 ), 81.5 (d, JC4-P = 9.0 Hz, C4), 75.3 (s, C2), 73.5 (s, C3), 63.1 (d, JC5-P = 4.0 Hz, C5).
RMN 31P (D2O 121 MHz) δ 0.80 (s).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 8100), λmιn 247 nm (ε 4900).
LC/MS (M-Na+) : m/z : 322 tr : 12.82 min purity : 97.7 %.
Exemple 41 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de triéthylammonium
La monophosphorylation de la cytidine (0,20 g, 0,82 mmol) a été réalisée par la méthode F. La purification sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a donné le CMP (0,13 g, 36 %), sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.3. RMN 1H (D2O, 400 MHz) δ 7.91 (d, J6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.02 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H5), 5.88 (d, J1 -2. = 3.5 Hz, 1 H, H1 ), 4.22-4.15 (m, 3H, H2- H3. H4), 4.04-4.11 (m, 1 H1 H5a), 3.94-4.01 (m, 1 H, H5 b), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH3CH2)SNH), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (DZbCH2)3NH). RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.46 (s).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 10238), λmin 247 nm (ε 6530).
LC/MS (M-HNEt3 +) : m/z : 322 tr : 10.7 min purity : 99 % .
Exempe 42 : 1-(2'-désoxy-/3-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de triéthylammonium
La monophosphorylation de la 2'-désoxycytidine (sous forme chlorhydrate) (0,20 g, 0,76 mmol) a été réalisée par la méthode F avec les modifications suivantes : le mélange a été agité à 15°C au lieu de 00C pendant 4h, puis 3h à température ambiante. La purification sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a donné le dCMP (0,15 g, 48 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation et une faible quantité de 5'3'dCMP (0.05 g, 11 %) a également été isolée sous forme de solide blanc.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.5 RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.96 (d, J6 5 = 7.7 Hz, 1 H, H6), 6.20 (t, Jv-23 = Jr-z-b = 6.6 Hz, 1 H, H1-), 6.06 (d, J5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H5), 4.45 (m, 1 H, H3), 4.11 (m, 1 H, H4), 4.03-3.90 (m, 2H, 2H5), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH3CHg)3NH), 2.40-2.31 (ddd, J2.a -r = 6.1 Hz, J2 a .3' = 3.7 Hz, J23 -2- = 14.1 Hz, 1 H, H2a ), 2.26-2.16 (m, 1 H, H2 b), 1.19 (t, J= 7.3 Hz, 9H, (QHaCHa)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.27 (s) UV (H2O) λmax 271 nm (ε 9700), λmin 247 nm (ε 6100).
LC/MS (M-HNEt3 +) : m/z : 306 tr : 11.9 min purity : 100 %. Exemple 43: 11 3-D arabinofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels de sodium
A une solution d'araCMP sous forme de son sel de mono(triéthylammonium) (0,10 g, 0,23 mmol) dans l'eau (1 ,80 ml) est ajoutée de la tributylamine (0,46 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité pendant 30 min à température ambiante. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Après une co-évaporation à l'éthanol puis à la pyridine anhydre, le monophosphate est séché toute la nuit sous vide sur P2O5. On ajoute 0,23g (1 ,41 mmol) de 1 ,1 '-carbonyldiimidazole à une suspension de ce monophosphate dans 5 ml de N1N- diméthylformamide. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à température ambiante et traité au méthanol anhydre (0,10ml, 2,50mmol) pour décomposer l'excès de 1 ,1 '-carbonyldiimidazole. Après 15 minutes, on ajoute une solution (1 M, 1 ,41 ml, 1 ,41 mmol) de tributylammonium phosphate dans le N,N-diméthylformamide. La suspension est agitée pendant 24h à température ambiante puis filtrée. Le filtrat est traité par un volume égal de méthanol et concentré sous pression réduite. Après purification sur colonne DEAE-Sephadex (gradient linéaire de TEAB, 0-1 M), les sels de phosphate résiduels sont alors éliminés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau). L'araCDP(45mg, 42%) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après échange d'ions sur DOWEX Na+ et lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.
RMN 1H (D2O, 400 MHz) δ 7.85 (d, J6-S = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.17 (d, J1 -2- = 5.6 Hz, 1 H, H1 ), 6.03 (d, J5-e = 7.6 Hz, 1 H, H5), 4.37 (t, J2-v = J2 -3- = 5.6 Hz, 1 H, H2), 4.22 (t, J3 -2' = 6.0 Hz, 1 H1 H3), 4.17 (m, 2H, 2H5), 4.01 (m, 1 H1 H4).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 166.1 (s, C4), 157.4 (s, C2), 142.7 (s, C6), 95.7 (s, C5), 85.1 (s, Cr), 81.1 (d, JCΛ--P = 9.0 Hz, C4), 75.3 (s, C2), 73.6 (s, C3), 63.6 (d, J05 -P = 5.0 Hz, C5).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -8.46 (m, Pβ), -10.84 (m, P0).
UV (H2O) λmax 271 nm (ε 9100), λmin 247 nm (ε 5700).
LC/MS (M+H-2Na+) : m/z : 402 tr : 15.8 min purity : 84.5 %
Exemple 44: Comparatif : Méthode G : Triphosphorylation de nucléosides en solution
G I : méthode « one pot » A une suspension du nucléoside désiré (1 eq) dans le triéthylphosphate (2 ml) à 0°C, on a ajouté de l'oxychlorure de phosphore (1 ,64 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité à 00C pendant 4h. Une solution de tributylammonium pyrophosphate dans du N,N-diméthyformamide anhydre (1 M, 4.11 mmol, 5eq) a été ajoutée, ainsi que de la tributylamine (0,90 mmol, 1 ,1 eq). Le mélange a été vigoureusement agité pendant 5 min et une solution d'un tampon de bicarbonate de triéthylammonium (1 M, 30 ml) a été ajoutée lentement. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-Sephadex, élution avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium (0-1 M). Les sels de pyrophosphate résiduels ont été éliminés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau). G2 : méthode avec activation au carbonyldiimidazole: A une solution du monophosphate requis sous forme de son sel mono(triethylammonium) (1eq) dans l'eau (1 ,80 ml) est ajoutée de la tributylamine (0,46 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité pendant 30mn à température ambiante. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Après co-évaporation à l'éthanol puis à la pyridine anhydre, le monophosphate a été séché toute une nuit sous vide sur P2O5. A une suspension de ce monophosphate dans le DMF (5ml) on a ajouté du 1 ,1 '-carbonyldiimidazole (1 ,41 mmol, 6eq). Le mélange réactionnel a été agité durant 2h à température ambiante et traité avec du méthanol anhydre (2,30 mmol, 10eq) pour décomposer l'excès de carbonyldiimidazole. Après 15min, on a ajouté une solution de tributylammonium pyrophosphate dans du N,N-diméthylformamide (1 M, 1 ,41 mmol, 6 eq) anhydre. La suspension a été agitée pendant 24h à température ambiante, puis filtrée. Le filtrat a été traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-Sephadex, élution avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium (0- 1 M). Les sels de phosphate résiduels ont été supprimés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau).
Exemple 45 : AraCTP
La triphosphorylation de l'araCMP (0,20 g. 0,82 mmol) a été réalisée selon la méthode G1 décrite ci-dessus. L'araCTP a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,045 mg, 10%) après échange d'ions sur DOWEX Na+ et lyophilisation.
La triphosphorylation de l'araC (0,10 g, 0,23 mmol) a également été réalisée selon la méthode G2 décrite ci-dessus. Après deux purifications sur colonne DEAE-Sephadex et sur une colonne en phase inverse RP18, l'araCTP (0.015 mg, 11 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après échange d'ions sur Dowex puis lyophilisation.
R, (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.2. RMN 1H (D2O, 400 MHz) δ 7.84 (d, J6 5 = 7.6 Hz, 1 H, H6), 6.17 (d, Jv-z = 5.4 Hz, 1 H1 Hr), 6.03 (d, J5-6 = 7.6 Hz, 1 H1 H5), 4.37 (t, J2 >-v = Jz- 3' = 5.4 Hz, 1 H, H2), 4.25-4.16 (m, 3H, H3- 2H5), 4.03 (m, 1 H, H4).
RMN 13C (D2O, 100 MHz) δ 166.0 (s, C4), 157.3 (s, C2), 142.8 (s, C6), 95.7 (s, C5), 85.3 (s, C1 ), 81.1 (d, JCΛ'-P = 9 0 Hz, C4), 75.4 (s, C2), 73.6 (s, C3), 64.0 (d, JC5 -P = 5.0 Hz, C5).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -9.55 (d, Jγ-β = 19.4 Hz, Pγ), -11.12 (d, J0- β = 19.4 Hz, P0), -22.69 (t, Jβ.γ = Jβ-a = 19.4 Hz, Pp).
UV (H2O) λmax 271 nm (ε 10800), λmin 245 nm (ε 6600).
LC/MS (M+2H-3Na+) : m/z : 482 tr : 18.5 min purity : 84.7 %
Exemple 46 : CTP
La triphosphorylation du CMP sous forme de son sel mono(triéthyïammonium) (0,10 g, 0,23 mmol) été réalisée selon la méthode G2. Une purification sur colonne DEAE-Sephadex puis en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a conduit au CTP (0,70 g, 37 %) obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.
RMN 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.97 (d, J6-5 = 7.7 Hz, 1 H, H6), 6.10 (d, J5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H5), 5.88 (d, Jv-? = 4.3 Hz, 1 H, H1 ) 4.30-4.12 (m, 5H, H? H3' H4. 2H5), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 18H, (CH3DZy3NH), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 27H, (DZbCH2)3NH).
RMN 13C (D2O, 75 MHz) δ 163.4 (s, C4), 154.1 (s, C2), 142.5 (s, C6), 96.1 (s, C5), 89.1 (s, C1 ), 83.0 (d, Jc-v-p = 12.0 Hz, C4), 74.3 (s, C2), 69.2 (s, C3), 64.5 (d, JC5-p = 7.0 Hz, C5), 46.62 (s, (CH3CHg)3NH), 8.18 (s, (QHaCHz)3NH).
RMN 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.78 (d, Jγ-β = 19.4 Hz, Pγ), -11.36 (d, Jα-β = 20.6 Hz, P0), -23.20 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 19.4 Hz, Pβ).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 12500), λmin 242 nm (ε 7200). LC/MS (M+2H-3HNEt3+) : m/z : 482 tr : 17.1 min purity : 97.1 % Exemple 47 : Couplage du nucléoside 3TC avec le support :
Poly(éthyleneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'- didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate] 6
Le couplage entre le PEG succinate (1 g, 0.23 mmol) et le 3TC (0.10 g, 0.47 mmol) a été realise selon la méthode A et on a obtenu le PEG-3TC sous forme d'un solide blanc (0.88 g, 80 %).
Rf (CH2CI2 / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.42 (d, J6 5 = 7.5 Hz1 1 H, H6), 7.25 (d, J5 6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.24 (dd, JV-2<a = 2.7 Hz, Jr-2b = 5.4 Hz, 1 H, H1 ), 5.31 (t, J4>-5'a = J4 -Sb 3.6 Hz, 1 H, H4), 4.20-4.17 (m, (OCH2 QPEG), 3.99 (dd, J53-4- = 3.0 Hz, J53-Sb = 12.9 Hz, 1 H, H53), 3.90-3.34 (m, (OCH2)P£G H5 b H23), 3.22 (dd, J2 b.r = 2.4 Hz, J2 b- sra≈ 12.6 Hz, 1 H, H2 b), 2.79-2.65 (m, 4H, CH2sUcc).
NMR 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUCc), 162.6 (s, C4), 156.6 (s, C2), 146.1 (s, C6), 97.3 (s, C5), 88.0 (s, C1 ), 87.9 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2)pEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.1 (s, (OCH2Q)PEG), 61.5 (s, C5), 38.0 (s, C2), 31.5, 28.5 (2s, CH2succ).
Exemple 48 : Monophosphorylation du nucléoside sur support polymère par oxydation du H-phosphonate Méthode B'i : synthèse du nucléoside H-phosphonate 5'-monoester
A une solution de PEG-nucléoside (nucléoside sur support polymère) (1 eq.) dans de la pyridine anhydre (3.75 ml_), on a ajouté du diphénylphosphite (1.60 mmol, 30 eq.). La solution a été agitée à température ambiante pendant 20 min, et une solution aqueuse de triéthylamine (1.25 mL, 1/1 , v/v) a été ajoutée 15 min plus tard, le mélange a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (30 mL) et la phase organique lavée avec une solution aqueuse à 5 % de NaHCθ3 (20 mL). La phase aqueuse a été extraite plusieurs fois avec du dichlorométhane (30 mL). Les phases organiques ont été combinées et soumises à évaporation sous pression réduite. Le nucléoside H-phosphonate supporté a été précipité à partir de la solution de dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther (25 mL) froid.
Le précipité est filtré, lavé au diéthyléther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (5 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH.
Exemple 49 : Application à la synthèse du monophosphate supporté du nucléoside ddC
Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-5'- hydrogénophosphonyl-β-D-ribo-furanosyl)-cytosyl) succinate] sels de tri- éthylammonium
Du PEG-ddC (0.25 g, 0.05 mmol) a été traité selon la méthode B\ de l'exemple 48, et on a obtenu le H-phosphonate 5'-monoester de la ddC supporté sous forme d'un solide blanc (0.23 g, 86 %).
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.34 (d, J6-S = 7.4 Hz, 1 H, H6), 7.26 (d, J5-6 = 7.4 Hz, 1 H, H5), 6.67 (d, JH-P = 637.2 Hz, 1 H, HHP), 5.99 (m, 1 H, Hr), 4.32 (m, 1 H, H4), 4.18-4.09 (m, 3H, (OCH2α)P£G H53), 3.94 (m, 1 H, H5 b), 3.83-3.36 (m, (OCH2)P£G), 3.09 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3CH^)3NH), 2.82-2.66 (m, 4H, CH2succ), 2.45 (m, 1 H, H2 a), 2.08-1.97 (m, 2H, H2 b H3a), 1.78 (m, 1 H, H3 b), 1.17 (t, J = 1.2
NMR 13C 162.3 (s, C4), 156.9 (s, C2), 146.8 (s, C6), 97.6 (s, C5), 88.2 (s, Cr), 86.6 (d, JC4-p = 7.6 Hz, C4), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.1 (s, (OCH2α)P£G), 63.9 (d, JC5--P = 3.9 Hz, C5), 46.6 (s, (CH3CJH2J3NH), 32.5 (s, C2), 31.5, 28.5 (2s, CH2sUcc), 24.1 (s, C3), 8.2 (s, (QHaCHz)3NH). NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ 6.53 (s).
Exemple 50 : Application à la synthèse du monophosphate supporté du nucléoside 3TC
Poly(éthylèneglycol)400o Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-5'- hydrogénophosphonyl-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate] sels de triéthylammonium
Du PEG-3TC (0.30 g, 0.06 mmol) a été traité selon la méthode B^ de l'exemple 48, et on a obtenu le H-phosphonate 5'-monoester du 3TC supporté sous forme d'un solide blanc (0.28 g, 87 %).
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.39 (d, J6-5 = 7.4 Hz, 1H, H6), 7.26 (d, J5-G = 7.4 Hz, 1 H, H5), 6.71 (d, JH-P = 641.9 Hz,1 H, HHP), 6.25 (s, 1 H, H1 ), 5.40 (s, 1 H, H4), 4.29-4.13 (m, 4H, (OCH2α)PEG H5 a H5 b ), 3.85-3.36 (m, OCH2)PEG HZa), 3.22 (m, 1 H, H2 b), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3CIy3NH), 2.79-2.65 (m, 4H, CH2succ), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (Ç_H3CH2)3NH).
NMR 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUCc), 162.6 (s, C4), 156.6 (s, C2), 146.1 (s, C6), 97.6 (s, C5), 88.0 (s, C1 ), 86.1 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.2 (s, (OCH2α)PEG), 63.5 (s, C5), 46.5 (s, (CH3CUs)3NH), 37.8 (s, C2), 31.6, 28.5 (2s, CH2succ), 8.1 (s, (QHaCHz)3NH).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ 6.35 (s).
Exemple 51 : Méthode B'2 : synthèse du monophosphate par oxydation du nucléoside H-phosphonate Poly(éthylèneglycol)4ooo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-O-monophosphoryl-β- D-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium
On a ajouté 0.20 ml_ (0.81 mmol) de Λ/,O-bis(trimethylsilyl)acétamide à une solution de PEG-ddC-H-phosphonate monoester (0.10 g, 0.02 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (1.50 ml_) puis de la triéthylamine anhydre (0.06 ml_, 0.40 mmol). La solution a été agitée à 500C pendant 4 h pour donner l'intermédiaire phosphite silylé correspondant. Le mélange a été refroidi à 00C, et l'oxydation est menée par addition d'une solution de peroxide de tert-butyle dans le décane (0.36 mL, 5-6 M, 2.00 mmol) à température ambiante. Le mélange a été agité pendant 3h, traité avec un excès de MeOH-NEt3 (0.50 mL, 5/5, v/v) et l'agitation a été poursuivie pendant 1 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et le résidu dissous dans du dichlorométhane (10 mL). La phase organique a été lavée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 % (7 mL) et la phase aqueuse a subi plusieurs extractions au dichlorométhane (10 mL). Les phases organiques ont été combinées et évaporées sous pression réduite. Le nucléoside 5'-monophosphate sur support a été précipité à partir de la solution dans le dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther froid (100 mL). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyléther. Le monophosphate, légèrement contaminé par une petite quantité de produit de départ (84 % / 16 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.09 g, 89 %). NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.49 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.13 (d, J5-6 = 7.3 Hz, 1 H, H5), 5.98 (d, Jy-? = 5.1 Hz, 1 H, H1 ), 4.35 (m, 1 H, H4'), 4.19 (m, 3H, (OCH2α)pEG H5 a), 3.98-3.92 (m, 1 H, H5 b), 3.85-3.36 (m, (OCH2)PEG), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CHsÇH^NH), 2.79-2.68 (m, 4H, CH2Succ), 2.46 (m, 1 H, H2 a), 2.08 (m, 1 H, H2 b), 1.97 (m, 1 H, H3 a), 1 -83 (m, 1 H, H3 b), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (Ç_H3CH2)3NH).
NMR 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.5, 174.5 (2s, C=OSUcc), 161.9 (s, C4), 156.0 (s, C2), 146.3 (s, C6), 97.4 (s, C5), 88.3 (s, Cr), 81.8 (d, Jc4'-p = 9.0 Hz, C4), 69.5 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 65.2 (s, C5), 64.1 (s, (OCH2α)PEG), 46.6 (s, (CH3CH2J3NH), 32.6 (s, C2), 31.5, 28.4 (s, CH2succ), 23.8 (s, C3), 8.2 (s,
(CJH3CH-O3NH). NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.37 (s).
Exemple 52 : Oxydation du nucléoside 5'H-phosphonate monoester alternative à la méthode B'2
Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-O-monophosphoryl-3'- thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium
On a ajouté 0.30 ml_ (1.21 mmol) de Λ/,O-bis(triméthylsilyl)acétamide à une solution de PEG-3TC-H-phosphonate monoester (0.15 g, 0.03 mmol) dans la pyridine anhydre (2.50 ml_). La solution a été agitée à 500C pendant 4 h pour donner l'intermédiaire phosphite silylé correspondant. L'oxydation est menée par addition d'une solution d'iode 200 mM (75 mg, 0.30 mmol) dans un mélange pyridine-eau (1.50 mL, 56/44, v/v) à température ambiante. Le mélange a été agité pendant 1h, traité avec un excès de MeOH-NEt3 (1.50 mL, 50/50, v/v) et l'agitation a été poursuivie pendant 1 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et le résidu dissous dans du dichlorométhane (15 mL). La phase organique a été lavée avec une solution aqueuse de thiosulfate de sodium à 5 % (10 mL) et la phase aqueuse a subi plusieurs extractions au dichlorométhane (15 ml_). Les phases organiques ont été combinées et évaporées sous pression réduite. Le nucléoside 5'-monophosphate sur support a été précipité à partir de la solution dans le dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther froid (150 mL). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyléther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (5 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH. Le monophosphate PEG-3TCMP a été obtenu sous forme d'un solide jaune (0.15 g, 103 %), contaminé par un résidu d'iode.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.44 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.26 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 6.25 (s, 1 H, Hr), 5.40 (s, 1 H, H4), 4.42-4.07 (m, 4H, (OCH2α)PeG Hs-a H5 b ), 3.84-3.36 (m, (OCH2)PEG H2 a), 3.20 (m, 1 H, H2.b), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH3CJHg)3NH), 2.82-2.67 (m, 4H, CH2succ), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (ÇhbCH2)3NH).
NMR 13C (D2O, 75 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=OSUcc), 162.6 (s, C4), 156.6 (s, C2), 146.3 (s, C6), 97.6 (s, C5), 88.1 (s, C1 ), 86.2 (d, J04-P = 8.4 Hz, C4), 69.6 (s, (OCH2)PEG), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.8 (s, C5), 64.1 (s, (OCH2α)p£G), (s, (CH3CHg)3NH), 37.9 (s, C2), 31.6, 28.5 (s, CH2succ), (s, (DZbCH2)3NH).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.72 (s).
Exemple 53: Synthèse du dérivé diphosphate du 3TC par la méthode C Poly(éthylèneglycol)40oo Bis[4-Λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-0-diphosphoryl-3'- thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium
La diphosphorylation du PEG-3TCMP (0,25 g, 0,05 mmol) a été réalisée selon la méthode C. Après échange d'ions sur DOWEX HNEt3 + et purification sur colonne (phase inverse) RP18 on a obtenu le diphosphate PEG-3TCDP sous forme d'un solide jaune (0.17 g, 62 %) après lyophilisation.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.40 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H1 H6), 7.20 (d, J5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H5), 6.24 (m, 1 H, Hv), 5.42 (m, 1 H, H4), 4.48-4.31 (m, 2H, H53 H5-b), 4.18 (m, 2H1 (OCH2α)pEG), 3.84-3.34 (m, (OCH2)PEG H23), 3.21 (dd, J2 b-1. = 2.7 Hz, J2^23 = 12.6 Hz, 1 H, H2 b), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 18H, (CHaÇH^NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH2SUCc), 1.17 (t, J= 7.2 Hz, 27H, (QHaCH2)3NH).
NMR 13C (D2O, 75 MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=OSUCc), 162.6 (s, C4), 156.6 (s, C2), 146.2 (s, C6), 97.7 (s, C5), 88.1 (s, Cv), 85.9 (d, JCA'-P = 8.6 Hz, C4), 69.6 (s, (OCH2)P£G), 68.4 (s, (OCH2β)PEG), 64.1 (s, (OCH2QPEG), 65.7 (s, C5), 46.6 (s, (CH3CJH2J3NH), 37.8 (s, C2), 31.6, 28.4 (2s, CH2suCc), 8.2 (s, (QHaCHz)3NH).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.37 (d, Jβ-α = 21 Hz, Pp)1 -11.36 (d, Jα-β = 20.2 Hz, P0).
Exemple 54 : Synthèse du dérivé triphosphate du 3TC par la méthode D Poly(éthylèneglycol)400o Bis[4-Λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-3'-thia-5'-0- triphosphoryl-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium
La triphosphorylation du PEG-3TCMP (0.25 g, 0.05 mmol) a été réalisée selon la méthode D. Après échange d'ions sur DOWEX HNEt3 + et purification sur colonne (phase inverse) RP18 on a obtenu le triphosphate PEG-3TCTP sous forme d'un solide jaune (0.16 g, 54 %) après lyophilisation.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.41 (d, J6 5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 7.20 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H1 H5), 6.24 (m, 1 H1 H1 ), 5.42 (m, 1 H, H4-), 4.45-4.22 (m, 2H, H53 H5-b), 4.17 (m, 2H, (OCH2α)pEG), 3.84-3.35 (m, (OCH2)PEG H23), 3.23-3.18 (m, 1 H, H2 b), 3.09 (q, J = 7.2 Hz, 18H, (CH3CiHg)3NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH2succ), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 27H, (QH3CH2)SNH). NMR 13C (D2O, 100 MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, C=OSUcc), 162.7 (s, C4), 156.4 (s, C2), 146.3 (s, C6), 97.6 (s, C5), 88.1 (s, C1 ), 86.2 (s, C4), 69.6 (s, (OCH2) PEG), 68.4 (s, (OCH2β)P£G), 64.1 (s, (OCH2α)P£G), 65.9 (s, C5), 46.6 (s, (CH3CJH^3NH), 37.8 (s, C2), 31.6, 28.5 (2s, CH2sUcc), 8.3 (s, (DZbCH2)3NH).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ -10.83 (d, Jγ-β = 18.9 Hz, Pγ), -11.59 (d, Jα-β = 20.5 Hz, P0), -23.17 (t, Jβ-Y = Jβ-a = 20.1 Hz, Pβ).
Exemple 55 : Obtention des dérivés mono-, di- et triphosphates du nucléoside 3TC après l'étape de clivage selon la méthode E 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5>-monophosphate, sel d'ammonium
La méthode E a été appliquée au PEG-3TCMP (0.14 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne RP18 par chromatographie suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCMP (10.40 mg, 64 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.
Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 7.97 (d, J6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H6), 6.22 (t, J1 -2. = 4.8 Hz, 1 H, H1 ), 5.96 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.35 (m, 1 H, H4), 4.16 (ddd, J5'a-4' = 3.3 Hz, J5.a-5 b = 11.7 Hz, J5 a-P = 5.6 Hz, 1 H, Hffa), 4.07-3.99 (m, 1 H1 H5 b), 3.45 (dd, J2.a-2'b = 12.3 Hz, J2<a-v = 5.4 Hz, 1 H, H23), 3.13 (dd, J2^23 = 12-3 Hz > Λrb-r = 4.2 Hz, 1 H, H2 b).
NMR 13C (D2O, 75 MHz) δ 165.8 (s, C4), 156.7 (s, C2), 142.0 (s, C6), 95.8 (s, C5), 87.4 (s, C1 ), 84.6 (d, J04: P = 8.6 Hz, C4-), 65.3 (d, J05.. P = 4.7 Hz, C5), 36.8 (s, C2).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ 0.83 (s).
UV (H2O) λmax 271 nm (ε 7771 ), λmin 248 nm (ε 5277).
LC/MS (M-NH4 +) : m/z : 308 rt : 10.80 min purity : 99 % Exemple 56 : 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5'- diphosphate, sel d'ammonium
La méthode E a été appliquée au PEG-3TCDP (0.25 g, 0.05 mmol). La purification par chromatographie sur colonne RP18 suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCDP (12 mg, 51 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.
NMR 1H (D2O, 200 MHz) δ 8.05 (d, J6-S = 7.7 Hz, 1 H, H6), 6.22 (t, J1 -2- = 4.8 Hz, 1 H, H1 ), 6.02 (d, J5-6 = 7.7 Hz, 1 H1 H5), 5.37 (m, 1 H, H4), 4.35-4.24 (m, 1 H, H5 a), 4.20-4.07 (m, 1 H, H5 b), 3.45 (dd, J2 a-2 b = 12.2 Hz, J23-1- = 5.2 Hz, 1 H, H2 a), 3.15 (dd, J2-b-2-a = 12.2 Hz, J2 b-
NMR 13C 75 MHz) δ 163.6 (s, C4), 153.9 (s, C2), 143.0 (s, C6), 95.4 (s, C5), 87.4 (s, C1 ), 84.8 (d, J04-. p = 8.5 Hz, C4-), 65.9 (d, J05'. p = 5.0 Hz, C5), 37.0 (s, C2).
NMR 31P (D2O, 81 MHz) δ -10.69 (d, Jβ-α = 20.5 Hz, Pβ), -11.53 (d, Jα-β = 20.5 Hz, P0).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 7769), λmin 248 nm (ε 5008).
LC/MS (M+H-2NH4 +) : m/z : 388 rt : 13.40 min purity : 79 %.
Exemple 57 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia -β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5'- triphosphate, sel d'ammonium
La méthode E a été appliquée au PEG-3TCTP (0.25 g, 0.05 mmol). La purification par chromatographie sur colonne RP18 suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCTP (9 mg, 35 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H2O/NH4OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6.
NMR 1H (D2O, 300 MHz) δ 8.10 (d, J6-5 = 7.8 Hz, 1 H1 H6), 6.22 (t, Jr-2'= 4.8 Hz1 1 H, H1 ), 6.07 (d, J5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H5), 5.38 (m, 1 H1 H4), 4.37-4.31 (m, 1 H1 H5 a), 4.22-4.14 (m, 1 H, H5 b), 3.47 (dd, J2<a-2'b = 12.3 Hz, J2 a-r = 5.4 Hz, 1 H, H23), 3.18 (dd, J2^a = 12-3 Hz' J?*>- r = 3.9 Hz, 1 H, H2 b).
NMR 13C (D2O, 75 MHz) δ 163.1 (s, C4), 150.8 (s, C2), 143.2 (s, C6), 95.3 (s, C5), 87.4 (s, Cr), 84.8 (d, Jc4 - p = 8.5 Hz, C4), 66.1 (d, JC5 - p = 5.5 Hz, C5), 37.0 (s, C2).
NMR 31P (D2O, 121 MHz) δ - 10.46 (d, Jγ-β = 19.1 Hz, Pγ), -11.39 (d, Jα-β = 18.9 Hz, P0), -22.77 (t, Jβ-Y = Jβ-α = 18.9 Hz, Pβ).
UV (H2O) λmax 272 nm (ε 7444), λmin 248 nm (ε 4451 ).
LC/MS (M+2H-3NH4 +) : m/z : 468 rt : 16.10 min purity : 87 %.
Exemple 58 : Fixation de nucléosides puriques via l'utilisation d'un groupement protecteur
La protection du nucléoside a été réalisée avec un TIPS (tétra-isopropylsilyl ethers) comme groupe protecteur, selon Eur. J. Org. Chem. 2005, pp 5171- 83.
Le nucléoside est co-évaporé avec de la pyridine (x 3) et séché sous vide sur pastilles de KOH.
On ajoute du chlorure de tétra-isopropylsilyle (3.79 mmol, 1.02 eq.) à une solution du nucléoside (3.71 mmol, 1 eq.) dans de la pyridine (10 ml) et le mélange résultant est agité à température ambiante pendant 1 h30.
Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu huileux est dissous dans du chlorométhane (20ml) et la phase organique est lavée deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCθ3, puis à la saumure. Après évaporation sous pression réduite, le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant dichlorométhane/méthanol 96/4). Exemple 59 : Synthèse du PEG-O-bis(succinyl-2'dA)
2'dA-TIPS
La synthèse a été réalisée comme décrit à l'exemple 58 à partir de la 21- désoxyadénosine (1 g, 3.71 mmol) et après purification, on a obtenu du 2'dA-TIPS sous forme d'un solide blanc (1.2Og, 65 %).
Rf (dichlorométhane/méthanol 96/4) : 0.45
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) δ 8.25 (s, 1 H, H8), 7.96 (s, 1 H, H2), 6.22 (t, Jv. 2a = Jv-2-b =2.4 Hz, 1 H, H1), 5.89 (s, 2H, NH2), 4.87 (m, 1 H, H3), 3.98 (m, 2H, 2H5), 3.82 (m, 1 H, H4), 2.60 (m, J?a-r = J∞-v =2.4 Hz, 2H, H2), 0.962 (m, 28H, ((CH3J2CH)4).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de nucléotides ou analogue de nucléotides monomères comportant les étapes suivantes : (1) couplage d'un support polyéthylèneglycol soluble, de poids moléculaire allant de 3000 à 6000, pourvu d'au moins un bras de liaison acide, diacide ou éther-acide et d'un nucléoside ou analogue de nucléoside monomère, sur un groupe aminé ou hydroxyle du nucléoside, à l'aide d'un agent de couplage; (2) au moins une étape de phosphorylation dudit nucléoside ou analogue de nucléoside couplé audit support avec un agent de phosphorylation.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit support polyéthylèneglycol pourvu d'au moins un bras de liaison diacide ou éther-acide a pour formule
(I) RO-C2H4-O-PEG-O-C2H4-O-C(O)-(CH2)P-COOH dans laquelle R est un groupe alkyle, benzyle ou aryle ou un groupe C(O)-(CH2)n-COOH et p et n', indépendamment l'un de l'autre, représentent 0 ou un entier de 1 à 10, ou
(ll) RO-C2H4-O-PEG-O-C2H4-O-(CH2)m-COOH dans laquelle R est un groupe alkyle, benzyle ou aryle ou un groupe (CH2)m-COOH et m et m', indépendamment l'un de l'autre, représentent un entier de 1 à 3.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit support polyéthylèneglycol est pourvu d'au moins un bras de liaison diacide de formule (I) et p dans la formule (I) est inférieur à 6.
4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que p ou n' dans la formule (I) est un entier de 0 à 4.
5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que R est un radical alkyle linéaire ou ramifié en Ci à Ci2 ou benzyle ou un radical aryle choisi parmi phényle, tolyle et o-tolyle.
6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que R est un radical méthyle ou benzyle.
7. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que PEG est fonctionnalisé par au moins un bras 3-hydroxypropanoïque PEG- O(CH2)2-COOH.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le nucléoside ou analogue de nucléoside possède une aminé exocyclique.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le couplage est réalisé entre une aminé exocyclique du nucléoside ou analogue de nucléoside et un PEG comportant un ou deux bras succinate ou 3-hydroxypropanoïque.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit support polyéthylèneglycol pourvu d'au moins un bras diacide a pour formule PEG-[O-C(O)-(CH2)2-COOH]2 ou PEG-O(CH2J2-COOH.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le couplage est réalisé à l'aide d'au moins un agent de couplage choisi parmi la diméthylaminopyridine, une carbodiimide, une oxime aromatique ou les agents de couplage du type onium, ammonium, phosphonium ou uronium.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que le couplage est réalisé à l'aide d'au moins un agent de couplage choisi parmi le dicyclohéxylcarbodiimide (DCC), le diisopropylcarbodiimide (DIC), et la diméthylaminopyridine (DMAP). le 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), le 1- hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt), l'hexafluorophosphate de (2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1 , 1 ,3,3- tétraméthyluronium (HBTU), l'hexafluorophosphate de (2-(7-aza-1 H- benzotriazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium (HATU) et l'hexafluorophosphate de benzotriazole-l-yl-oxy-tris- pyrrolidinophosphonium (PyBOP).
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le couplage est réalisé à l'aide de diméthylaminopyridine.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le support soluble est un PEG d'un poids moléculaire d'environ 4000.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le nucléoside ou analogue de nucléoside couplé au support est mono -, di- ou triphosphorylé en une, deux ou trois étapes de phosphorylation.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisée à l'aide d'un dérivé du phosphore (III) ou d'un dérivé du phosphore (V), en présence d'un agent d'activation ou en absence d'un agent d'activation.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisée à l'aide d'un agent de phosphorylation choisi parmi les oxychlorures de phosphore, les trialkylammonium pyrophosphates et les tétraalkylammonium phosphates.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisée à l'aide d'un agent de phosphorylation choisi parmi l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le phosphate de tributylammonium, le O-(2-chlorophényl) dichlorothiophosphate, l'aminométhyl phosphonique acide, l'aminométhyl (méthyl) phosphonique acide, la 2-chloro-1 ,3,2-dioxaphospholane, la 2-chloro- 2-oxo-i ,3,2-dioxaphospholane, la 2-chloro-4H-1 ,3,2- benzodioxaphosphorin-4-one, le 2-chlorophénylphosphorodichloridate, le 4-chlorophényl-phosphorodichloridate, le baryum 2- cyoanoéthylphosphate, le diéthylchlorothiophosphate, le diméthylchlorothiophosphate, le diphényl-chlorophosphate, le méthyl- phosphorodichloridate, le phényl- dichlorophosphate, le dibenzyl-N,N- diisopropylphosphoramidite, le méthyldichlorophosphite et le diphénylphosphite ou parmi le pyrophosphate de tributylammonium, l'acide étidronique, les sels de l'imidodiphosphate, l'imino di(méthyl phosphonique acide), le tétrachlorure de pyrophosphoryle, le méthyl bis(dichlorophosphonate) et l'acide méthylène bisphosphonique.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisée à l'aide d'un agent de phosphorylation choisi parmi l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le diphénylphosphite et le phosphate de tributylammonium.
20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisée à l'aide de pyrophosphate de tributylammonium ou l'acide méthylène bisphosphonique.
21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la phosphorylation est réalisé à l'aide d'oxychlorure de phosphore.
22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la phosphorylation est une monophosphorylation ou une diphosphorylation du nucléoside ou analogue de nucléoside à l'aide d'un dérivé du phosphore (V) en l'absence d'activateur.
23. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que le nucléoside ou analogue de nucléoside monophosphaté supporté obtenu après une étape de monophosphorylation subit une diphosphorylation ou une ou deux étapes de monophosphorylation, à l'aide d'un agent d'activation.
24. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 ou 23, caractérisé en ce que la phosphorylation est activée, l'agent d'activation étant choisi parmi le mésitylsulfonylnitrotriazole (MSNT), le mésitylsulfonyletriazole
(MST), le chlorure de mésitylsulfonyle (MSCI), le chlorure de tri- isopropylesulfonyle (TPSCI), le système Tf2O/ 4- diméthylaminopyridine (DMAP) et le 1 ,1-carbonyldiimidazole (CDI).
25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que le clivage du bras de liaison est réalisé après phosphorylation, en utilisant une base.
26. Procédé selon l'une des revendications 1 à 25, caractérisé en ce que le clivage du bras de liaison est réalisé en utilisant une base choisie parmi NH4OH, MeONa1 NH3MeOH.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que l'on récupère en outre le nucléotide ou analogue.
28. Nucléotides ou analogues de nucléotides obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 25, couplés avec un support polyéthylèneglycol de poids moléculaire allant de 3000 à 6000, en tant qu'outils biologiques.
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