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EP2001843A2 - Inhibitoren der löslichen adenylatzyklase - Google Patents

Inhibitoren der löslichen adenylatzyklase

Info

Publication number
EP2001843A2
EP2001843A2 EP07723652A EP07723652A EP2001843A2 EP 2001843 A2 EP2001843 A2 EP 2001843A2 EP 07723652 A EP07723652 A EP 07723652A EP 07723652 A EP07723652 A EP 07723652A EP 2001843 A2 EP2001843 A2 EP 2001843A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alkyl
substituted
acyi
identically
differently
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07723652A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Buchmann
Dirk Kosemund
Bernd Menzenbach
Martin Fritsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Schering Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Schering Pharma AG filed Critical Bayer Schering Pharma AG
Publication of EP2001843A2 publication Critical patent/EP2001843A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/42—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals

Definitions

  • the present invention relates to inhibitors of the soluble adenylate cyclase, their preparation and their use for the preparation of a medicament for contraception.
  • the rat recombinant enzyme can be stimulated by bicarbonate. With the help of antibodies it could be proven that the catalytic domain of the enzyme is localized in testes, semen, kidneys and the choroid plexus. These disclosures are the subject of application WO01 / 85753, issued to the US (US6544768).
  • Assays test systems that can be used to identify substances that inhibit the activity of sAC. The ability to use these substances to reversibly reduce the number of mobile seed lines and their use as a male fertility control agent is disclosed.
  • WO 02/20745 claims test systems which can be used to identify substances which modulate the expression or the activity of the human sAC. For example, such compounds could selectively inhibit sAC activity, resulting in sperm cells losing the ability to fertilize an egg cell. These sAC inhibitors could therefore serve as drugs for non-hormonal contraception.
  • R 1 is hydrogen, halogen, CF 3 , C 3 -C 6 -Cycioaikyi, which is optionally poly-saturated and optionally polysubstituted, or the group Ci-C 6 alkyl, Ci-C 6 -aryl, C r C 6 acyl , Haio-C 1 -C 6 - alkyl, Ci-Ce-alkyl-d-Ce-alkyl, alkyl-dC dC 6 6 acyl, dC 6 acyl Ci-C 6 acyl, CrC 6 alkyl dC 6 aryl, C 6 aryl-Ci-C 6 alkyl, or CF 3, in which Ci-Ce-alkyl, dC 6 aryl, C 6 -acyl, halo-Ci-C 6 alkyl , 6 -alkyl-Ci-C 6 alkyl, Ci-C 6 alkyl-C 6 acyl, Ci-C 6 -acy
  • C 1 -C 6 -alkyl-C 1 -C 6 -aryl or C 1 -C 6 -aryl-C 1 -C 6 -alkyl optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, by oxygen, sulfur or nitrogen, or Group sulfonyl-dC 6 alkyl, sulfonamide, or cyano,
  • R 2 is halogen, CF 3 , C 3 -C 6 -cycloalkyl, which is optionally poly-saturated and optionally polysubstituted, or the group Ci-C 6 alkyl, Ci-C 6 -aryl, Ci-C 6 acyl, Halo -C-C 6 - alkyl, Ci-C 6 alkyl-C 6 alkyl, C r C 6 alkyl-C 6 acyl, C 1 -C 6 -ACyI- Ci-C 6 acyl , C 1 -C 6 -alkylCrCe-aryl, C 1 -C 6 -aryl-C 1 -C 6 -alkyl or
  • CF 3 in the 6 -alkyl, dC 6 aryl, C 6 acyl, halo-Ci-C 6 alkyl, dC 6 alkyl-C 6 alkyl, Ci-C 6 alkyl Ci-C 6 alkyl Ci-C 6 acyl, C iC 6 -Acy 1-C 6 - acyl, d-Ce-alkyl-d-Ce-aryl or C 6 aryl-Ci-C 6 alkyl optionally mono- or may be the same or different interrupted by oxygen, sulfur or nitrogen, or the group sulfonyl-dC 6 alkyl, sulfonamide, or cyano,
  • R 3 is C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, with C 6 alkyl or C 1 -C 6 -acyl, which is optionally substituted or may be substituted multiple times, or with C 1 -C 6 -alkoxy, hydroxy, cyano, CO 2 - (6 -alkyl), N- (C 1 -
  • C 5 -C 2 -heteroaryl which is optionally monosubstituted or polysubstituted, identically or differently with halogen, C 6 alkyl, C 1 -C 6 -acyl, C 1 - Ce alkoxy, hydroxy, cyano, CO 2 - (C -C 6 -alkyl), N- (C 1 -C 6 -alkyl) 2) CO-NR 4 R 5 or may be substituted by CF 3 or C 3 -C 6 -
  • Cycloalkyl which is optionally monosubstituted or polysubstituted, identically or differently with halogen, CF 3, hydroxy, cyano, CO 2 - (C 1 -C 6 - alkyl), dC 6 alkyl, C r C 6 acyl, N- ( C 1 -C 6 -alkyl) 2 , CO-NR 4 R 5 or C 1 -C 6 -alkoxy may be substituted,
  • R 4 is hydrogen, C 3 -C 6 -cycloalkyl which is optionally substituted singly or multiply, identically or differently with C 6 alkyl, Ci-C 6 acyl, C 1 - C 6 alkoxy or is substituted CF 3, C 6 Ci2-aryl, which is optionally monosubstituted or polysubstituted, identically or differently, with halogen, with C 6 alkyl, C r C 6 acyl, C 1 -C 6 -alkoxy, NdC 6 alkyl dC 6 - alkyl, CF 3 or cyano, or C 5 -C 12 - heteroaryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, Ci-C 6 alkyl, Ci-C 6 acyl, C 1 -C 6 - alkoxy, N-CrCe-alkyl-CrC ⁇ -alkyl, CF 3 or cyano, substituted, or d-Ce-alkyl
  • R 5 is hydrogen, C- ⁇ -C 6 alkyl-C 3 -C 6 -cycloalkyl which is optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, with CrC 6 alkyl, C 1 - Ce-acyl, C 1 -C 6 - AIkOXy or CF 3 is substituted, C 3 -C 6 -cycloalkyl, which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different with C- ⁇ -C 6 alkyl, C 1 -C 6 acyl, C 1 -C 6 -alkoxy or CF 3 is substituted,
  • C 6 -C 12 aryl which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, C r C 6 alkyl, C 1 -C 6 -acyl, C 6 - alkoxy, Nd-C ⁇ -alkyl-CRCE Alkyl, CF 3 or cyano, or C 5 -C 12 heteroaryl, which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different, with halogen, C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 6 -acyl, C 1 -C 4 -alkyl 6 -alkoxy, N-CrCe-alkyl-d-Ce-alkyl, CF 3 or cyano, substituted, or d-C ⁇ -alkyl, which may be arbitrarily substituted, and
  • R 4 and R 5 together form a 5-8 membered ring which may contain other heteroatoms
  • the compounds according to the invention inhibit the soluble adenylate cyclase and thus prevent the capacitation of the sperm and thus serve the purpose of male fertility control.
  • Alkyl is in each case a straight-chain or branched alkyl radical, such as, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, pentyl, isopentyl and hexyl, to understand.
  • alkyl radical such as, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, pentyl, isopentyl and hexyl, to understand.
  • Alkoxy is in each case a straight-chain or branched alkoxy radical, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, sec-butoxy, iso-butoxy, tert. Butyloxy, pentoxy, iso-pentoxy and hexoxy, to understand.
  • Acyl is in each case to be understood as meaning a straight-chain or branched radical such as, for example, formyl, acetyl, propionyl, butyroyl, isobutyryl, valeroyl and benzoyl.
  • cycloalkyl monocyclic alkyl rings such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl.
  • the cycloalkylyl radicals may contain one or more heteroatoms, such as oxygen, sulfur and / or nitrogen, instead of the carbon atoms. Preference is given to those heterocycloalkyls having 3 to 6 ring atoms.
  • cycloalkenyls such as cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclopentadienyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl to understand, where the attachment can be done both on the double bond as well as on the single bonds.
  • Halogen is in each case fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the aryl radical comprises in each case 6 to 12 carbon atoms and may, for example, be benzo-fused. Examples include: phenyl, tropyl, cyclooctadienyl, indenyl, naphthyl, biphenyl, florenyl, anthracenyl, etc.
  • the heteroaryl radical comprises in each case 5-16 ring atoms and may contain one or more, identical or different, heteroatoms, such as oxygen, sulfur or nitrogen in the ring instead of the carbon, and may be mono-, bi- or tricyclic and may additionally each be benzo-fused.
  • Oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl, etc. and benzo derivatives thereof e.g. Benzofuranyl, benzothienyl, benzooxazolyl, benzimidazolyl, indazolyl, indolyl, isoindolyl, etc .; or pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, etc. and benzo derivatives thereof such as e.g. Quinolyl, isoquinolyl, etc .; or azocinyl, indolizinyl, purinyl, etc.
  • quinolinyl isoquinolinyl, cinnolinyl, phthalazinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, naphthyridinyl, pteridinyl, carbazolyl, acridinyl, phenazinyl, phenothiazinyl, phenoxazinyl, xanthenyl, oxepinyl, etc.
  • the heteroaryl radical may each be benzo-fused.
  • Heteroatoms are oxygen, nitrogen or sulfur atoms.
  • suitable salts are the physiologically tolerated salts of organic and inorganic bases, such as, for example, the readily soluble alkali and alkaline earth salts and N-methyl-glucamine, dimethylglucamine, ethyl-glucamine, lysine, 1,6-hexadiamine , Ethanolamine, glucosamine, sarcosine, serinol, tris-hydroxy-methyl-amino-methane, aminopropanediol, Sovak base, 1-amino-2,3,4-butanetriol.
  • organic and inorganic bases such as, for example, the readily soluble alkali and alkaline earth salts and N-methyl-glucamine, dimethylglucamine, ethyl-glucamine, lysine, 1,6-hexadiamine , Ethanolamine, glucosamine, sarcosine, serinol, tris-hydroxy-methyl-amino-methane, amino
  • physiologically acceptable salts of organic and inorganic acids are suitable, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, citric acid, tartaric acid and the like.
  • R 1 is hydrogen, halogen, CF 3, C 3 -C 6 cycloalkyl, or the group C 1 - C 6 alkyl, d-Ce-aryl, -C 6 acyl, halo-CrC 6 alkyl, dC 6 alkyl -d-
  • R 2 is halogen, CF 3 , C 3 -C 6 -cycloalkyl, or the group dC 6 -alkyl, C 1 -
  • C 6 -acyl, C 6 acyl-C 6 acyl, Ci-C 6 alkyl-C 6 aryl or C 6 - aryl-Ci-C 6 alkyl optionally mono- or may be the same or different interrupted by oxygen, sulfur or nitrogen, or the group sulfonyl-C 1 -C 6 -alkyl, sulfonamide, or cyano,
  • R 3 is C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, Ci-C 6 -alkyl, C 3 acyl, C 1 -C 3 - alkoxy, cyano, hydroxy, N - (CH 3 J 2 , CO 2 - (C 1 -C 3 -alkyl), CO-NR 4 R 5 or CF 3 may be substituted,
  • C 5 -C 2 -Heteroaryl which is optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, with chlorine and / or fluorine, with C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy, cyano, hydroxy , N (CH 3 J 2, CO 2 - (C 3 - alkyl), CO-NR 4 R 5 may be substituted by CF 3, or C 3 -C 6 -cycloalkyl which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different with chlorine and / or fluorine, CF 3 , cyano, C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, hydroxy, N- (CH 3 J 2 , CO 2 - (C r C 3 -alkyl) , CO-NR 4 R 5 or C 1 -C 3 -alkoxy may be substituted,
  • R 4 is hydrogen, C 3 -C 6 -cycloalkyl which is optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, by C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy or CF 3 ,
  • C 6 -C 2 -aryl which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different, with halogen, C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy, N-C 1 -C 3 -alkylCrC 3- alkyl, CF 3 or cyano, or C 5 -C 2 -heteroaryl, which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different, with halogen, C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy , N-C 1 -C 3 -alkyl-C r C 3 -alkyl, CF 3 or cyano, or C 1 -C 6 -alkyl, which may be arbitrarily substituted,
  • R 5 is hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl-C 3 -C 6 -cycloalkyl, which is optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, with C 1 -C 6 -alkyl, C r C ⁇ -acyl, Ci-C ⁇ -alkoxy or CF 3 is substituted, C 3 -C 6 -cycloalkyl, which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different with Ci-C 3 -AiKyI, Ci-C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy or CF 3 being substituted, C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, Ci-C3 alkyl, Ci-C3-acyl, Ci-C 3 -
  • C 5 -C 2 -Heteroaryl which may be mono- or polysubstituted, identically or differently, with halogen, C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, Cr
  • Ci-C 6 -alkyl which may be arbitrarily substituted
  • R 1 is hydrogen
  • R 2 is C 3 -C 6 cycloalkyl, Ci-C 6 alkyl, CF 3, cyano, bromine, or the group
  • R 3 is C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, d-C ⁇ -alkyl, Ci-C3-acyl, CrC 3 - alkoxy, cyano, hydroxy, N- (CH 3 J 2 , CO 2 - (C r C 3 alkyl), CO-NR 4 R 5 or CF 3 may be substituted, C 5 -C 2 -heteroaryl, which may be mono- or polysubstituted, identical or different, with chlorine and / or fluorine, with C 1 -C 6 -alkyl,
  • Ca-C ⁇ cycloalkyl which is optionally monosubstituted or polysubstituted, identically or differently with chlorine and / or fluorine, CF 3, cyano, Ci-C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, hydroxy, N- (CH 3 ) 2 , CO 2 - (C 1 -C 3 -alkyl), CO-NR 4 R 5 or C 1 -C 3 -alkoxy may be substituted,
  • R 4 is hydrogen
  • R 5 is hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl-C 3 -C 6 -cycloalkyl, which may be mono- or polysubstituted, identically or differently, with C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 6 -acyl, C 1 -C 6 -alkoxy or CF 3 being substituted, C 3 -C 6 cycloalkyl, which is optionally monosubstituted or polysubstituted, identically or differently with Ci-C 3 alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -alkoxy or CF 3 is substituted,
  • C 6 -C 12 aryl which is optionally substituted one or more times, identically or differently with halogen, Ci-C 3 alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 -C 3 -
  • C 5 -C 12 -heteroaryl which is optionally substituted one or more times, identically or differently, with halogen, CrC 3 alkyl, C 1 -C 3 -acyl, C 1 - C 3 alkoxy, Nd-Cs-alkyl-CRCS Alkyl, CF 3 or cyano, or
  • Ci-C ⁇ -alkyl which may be arbitrarily substituted
  • R 1 is hydrogen
  • R 2 is C 3 -C 6 cycloalkyl, C r C 6 alkyl, CF 3, cyano, bromine, or the group
  • R 3 is C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted once or twice, identically or differently with halogen, Ci-C3 alkyl, acetyl, methoxy, ethoxy, cyano, hydroxy, N- (CH 3) 2, CO 2 - (C 1 -C 3 -alkyl), CO-NHR 5 or CF 3 may be substituted,
  • C 5 -C 2 -Heteroaryl which may be mono- or di-lower, identical or different, with chlorine and / or fluorine, with C 1 -C 3 -alkyl, acetyl, methoxy, ethoxy, cyano, hydroxy, N- (CH 3 ) 2 , CO 2 - (C 1 -C 3 -alkyl), CO-NHR 5 or may be substituted by CF 3 , C 3 -C 6 -cycloalkyl,
  • R 4 is hydrogen
  • R 5 is hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl-C 3 -C 6 -cycloalkyl which is optionally mono- or polysubstituted, identically or differently, with C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -
  • C 6 acyl, C 1 -C 6 alkoxy or CF 3 is substituted, C 3 -C 6 cycloalkyl, which is optionally mono- or polysubstituted, identical or different, with C 1 -C 3 -alkyl, C 1 -C 3 -acyl, Ci-C 3 alkoxy or CF 3 being substituted, C 6 -C 2 aryl, which is optionally substituted one or more times, identically or differently, with halogen, CrC 3 -alkyl, C 3 acyl, C 1 -C 3 -
  • Ci-C 6 -alkyl which may be arbitrarily substituted
  • R 4 is hydrogen
  • R s is hydrogen or the group - (CH 2 ) mN- (CH 3 ) 2, - (CH 2 ) 2 -CH 3 , - (CHz) 2 -NH-COCH 3 , - (CH 2 ) -CHCH 3 -OH , - (CH 2 ) 2 -O-CH 3) - (CH 2 ) 2 -OH, -CHCH 3 -CH 2 -OH, where m is 1-3.
  • R 1 is hydrogen
  • R A is hydrogen
  • R 5 is hydrogen or the group, - (CH 2 ) -CHCH 3 -OH, - (CH 2 ) 2 -O-CH 3 , -CHCH 3 -CH 2 -OH,
  • the invention relates to a process for the preparation of the compounds of general formula I according to the invention, which is characterized in that a compound of formula II,
  • R 1 , R 2 and R 3 have the meanings given above, and R 6 may be a hydrogen or a C 1 -C 6 -alkyl radical, preference is given to hydrogen, the methyl or ethyl radical, with an amine of the general formula III
  • the reaction can be carried out first by activation of the acid function, in this case, for example, first the carboxylic acid of the general formula II in the presence of a tertiary amine, such as triethylamine, with isobutyl chloroformate in the mixed anhydride.
  • a tertiary amine such as triethylamine
  • isobutyl chloroformate in the mixed anhydride.
  • the reaction of the mixed anhydride with the Aikaiisaiz of the corresponding amine is carried out in an inert solvent or solvent mixture, such as tetrahydrofuran, dimethoxyethane, dimethylformamide, hexamethylphosphoric acid triamide, at temperatures between -30 0 C and + 60 0 C, preferably at 0 0 C to 30 ° C.
  • Another possibility is to activate the carboxylic acid of general formula II by reagents such as HOBt or HATU.
  • the reaction of the acid takes place for example with HATU in an inert solvent such as DMF in the presence of the corresponding amine of the general formula IM and a tertiary amine such as ethyldiisopropylamine at temperatures between -50 and + 60 0 C, preferably at 0 0 C to 30 0 C.
  • R 6 is C 1 -C 6 -alkyl
  • a direct amidolysis of the ester with the corresponding amine may also be carried out with the aid of aluminum trialkyl reagents, preferably aluminum trimethyl.
  • the compounds of the general formula II which serve as starting materials can be prepared, for example, by dissolving the known bromine-indol esters IV in a manner known per se
  • R 6 is a C 1 -C 6 -alkyl radical, preferably a methyl or ethyl radical, first with chlorosulfuric acid to the compounds of general formula V
  • esters of the general formula VII are then reacted in a Pd-catalyzed reaction with boronic acid derivatives of the general formula VIII
  • R3 (VIII), wherein R 3 has the abovementioned meaning, optionally after cleavage of required protecting groups, optionally followed by saponification, for example, with sodium hydroxide solution in the compounds of general formula II transferred
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 6 have the meanings given above.
  • the compounds according to the invention inhibit the soluble adenylate cyclase, and their effect is also due, for example, to male fertility control.
  • Adenylate cyclases are the effector molecules for one of the most widely used signal transduction pathways. They synthesize the second messenger molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP) from adenosine triphosphate (ATP) with elimination of pyrophosphate (PP). cAMP mediates numerous cellular responses to a variety of neurotransmitters and hormones.
  • the soluble, sperm-specific adenylate cyclase (sAC, human mRNA sequence (GenBank) NM_018417, human gene ADCY X) is one of ten described adenylate cyclases in the human genome. sAC shows some specific properties that distinguish it from the other adenylate cyclases.
  • sAC is stimulated by the concentration of bicarbonate in the surrounding medium and not by G proteins.
  • sAC has no transmembrane regions in its amino acid sequence, is not inhibitable by forskolin, is much more stimulable by manganese than magnesium, and shows little sequence homology to the other adenylate cyclases ( ⁇ 26% identity of the catalytic domains I and II of the sAC with other adenylate cyclases at the amino acid level).
  • sperm must be prepared for this functionality before they can penetrate the zona pellucida of the egg to subsequently fuse with the oolemma of the egg. This process, sperm capacitation, is quite well studied.
  • a capacitated sperm is characterized by an altered pattern of movement and the ability to undergo, through a suitable stimulus, the process of acrosomal reaction (release of lytic enzymes presumably acting on the passage of zona pellucida through the sperm).
  • Sperm capacitation occurs in vivo and in vitro, among other things, depending on an increased bicarbonate concentration in the medium (PE Visconti & GS Kopf (1998) Biol Reprod 59: 1ff; E de Lamirande et al 1997 Mol Hum Reprod 3 (3): 175ff).sperm capacitation may also be stimulated by the addition of suitable membrane-permeable cAMP analogs, eg, db-cAMP, and an inhibitor that inhibits their degradation (eg, IBMX). The suspected dependence of sperm function on sAC has recently been confirmed by a genetic deletion model, a so-called knock-out mouse (G Esposito et al., 2004 PNAS 101 (9): 2993ff).
  • mice lacking the sAC gene show normal spermatogenesis but are infertile.
  • the sperm have movement defects and are unable to fertilize an egg.
  • the animals showed no other defects or abnormal findings, which speaks against other hypothesized functions of the sAC (JH Zippin et al 2003 FASEB 17: 82ff).
  • the sAC has a unique sequence and little homology to other somatic adenylate cyclase. It is the only Adenyiatzykiase in the mammalian sperm and the activity is essential for sperm motility and capacitation. Specific inhibitors of sAC are therefore an important way to regulate male fertility.
  • Active substance suitable for enteral or parenteral administration Pharmaceutical, organic or inorganic inert carrier materials, such as water, gelatin, gum arabic, lactose, starch,
  • the pharmaceutical preparations may be in solid form, for example as tablets,
  • Dragees, suppositories, capsules or in liquid form for example as
  • Solutions, suspensions or emulsions are present. If appropriate, they also contain adjuvants, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers; Salts for changing the osmotic pressure or buffer. These pharmaceutical preparations are also the subject of the present invention
  • Injection solutions or suspensions in particular aqueous solutions of the active compounds in polyhydroxyethoxylated castor oil, are particularly suitable for parenteral use.
  • carrier systems are surface-active adjuvants such as salts of bile acids or animal or vegetable phospholipids, but also -
  • tablets, dragees or capsules with talc and / or hydrocarbon carriers or binders such as lactose, corn or potato starch
  • talc and / or hydrocarbon carriers or binders such as lactose, corn or potato starch
  • the application can also take place in liquid form, for example as juice, which may be accompanied by a sweetener.
  • enteral, parenteral, vaginal and oral applications are also the subject of the present invention.
  • the dosage of the active ingredients may vary depending on the route of administration, the age and weight of the patient, the nature and severity of the disease being treated, and similar factors.
  • the daily dose is 0.5-1000 mg, preferably 50-200 mg, which dose may be given as a single dose to be administered once or divided into 2 or more daily doses.
  • the compounds of general formula I according to the invention are, inter alia, excellent inhibitors of soluble adenylate cyclase.
  • Inhibitors of soluble adenylate cyclase lead to a lowering of the cAMP signal.
  • the cAMP level is crucial for the control of the processes that play an important role in cell proliferation, cell differentiation and apoptosis.
  • Diseases such as cancer in which the lowering of the cAMP level is critical, can be modulated by inhibitors of soluble adenylate cyclase. This modulation can have prophylactic and therapeutic effects for the patients suffering from such disease.
  • diseases that are associated with increased cell proliferation such as cancer, are treated by radiotherapy and chemotherapy, for example. These methods are nonspecific and have one -
  • the present invention relates to substances which modulate cAMP production by the inhibition of soluble adenylate cyclase. For example, abnormal cell proliferation can be decreased or inhibited by regulation or inhibition of cAMP production. By using the substances according to the invention, the soluble adenylate cyclase can be inhibited, which results in a reduction in cell proliferation.
  • the present invention relates to medicaments for the treatment of diseases which contain at least one compound according to the general formula I, as well as medicaments with suitable formulation and carrier substances. The diseases are characterized by the fact that they are caused by disorders of the metabolism of the second messenger cAMP.
  • Decreasing the cAMP concentration by inhibiting soluble adenylate cyclase may provide means for modulating sperm capacitance.
  • the present invention is the use of the substances according to the invention for the reduction and / or inhibition of male germ cell fertility, mediated by the reduction or inhibition of the soluble adenylate cyclase activity and thereby resulting sperm capacitation.
  • the isomer mixtures can be separated into the enantiomers or E / Z isomers by customary methods such as, for example, crystallization, chromatography or salt formation.
  • the preparation of the salts is carried out in a customary manner by adding a solution of the compound of formula I with the equivalent amount or an excess of a base or acid, optionally in solution, and separating the precipitate or working up the solution in a conventional manner.
  • Example 1 5- (4-tert-butylphenylsulfamoyl) -3-phenyl-1H-indole-2-carboxylic acid (tetrahydro-pyran-4-yl) -amide
  • Example 1 In analogy to Example 1 is obtained from 70 mg of the acid from Example 1d) and 12.4 ⁇ l 2-amino-1-propanol 29.2mg of the title compound.
  • the soluble, sperm-specific adenylate cyclase catalyses the conversion of adenosine triphosphate (ATP) to cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and pyrophosphate.
  • Free cAMP generated in this way is subsequently used in a competitive detection method in which the binding of an europium cryptate (Eu [K]) -labeled anti-cAMP antibody (anti-CAMP-Eu [K] -AK) to a cAMP molecule labeled, modified allophycocyanin-1 molecule (cAMP XL665) is prevented.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the enzyme reaction is started by adding 5 .mu.l of the ATP substrate solution (200 .mu.M ATP in H 2 O) and after incubation (25 min. At room temperature) by the addition of 5 .mu.l of the stop solution (200 .mu.M EDTA in PBS) ended. Finally, the entire reaction is adjusted to a total volume of 91.5 ⁇ l by the addition of 70 ⁇ l PBS.
  • detection solution 1 8 ⁇ l are placed in a well of the 384-well measuring plate (measuring plate: polystyrene; 384, SV - black; detection solution 1: 50 ⁇ l cAMP-XL665; 950 ⁇ l reconstitution buffer; 2200 ⁇ l PBS; cAMP-XL. 665: Preparation by adding 5 ml of H 2 O to the lyophilisate _ _
  • Human sperm are purified from the ejaculate by a two-layered gradient system based on colloidal silica particles (trade name: Percoll or ISolate).
  • the sperm pellets resuspended in about 200 ⁇ l each are transferred to a 15 ml plastic tube containing 12 ml mHTF medium (4 mM NaHCO 3 , 0.01% BSA, 37 ° C.) and the sperm are seeded at 1000 ⁇ g for 20 Min sedimented.
  • the medium is aspirated until just above the pellet and adjusted to 1000 ⁇ l with mHTF medium medium (4 mM NaHCO 3 , 0.01% BSA, 37 ° C.).
  • the number of sperm cells is determined in a Neubauer counting chamber and for the following capacitation optionally with mHTF medium (4 mM NaHCO3; 37 0 C; 0.01% BSA) is set to 4x106 ul sperm / 150th 2.2. capacitation
  • sperm must be preincubated with the test substances. This preincubation (15 min in the oven at 37 0 C) is necessary to allow the penetration of the test substances in the sperm before the beginning of capacitation, ie to achieve a presaturation of the binding sites in the sperm, especially for substances that pass poorly through the membrane , It is also necessary because the increase in the BSA concentration in the capacitance due to the high lipid binding of the BSA could lead to a decrease in the effective test substance concentration.
  • test substances are dissolved in DMSO and diluted with mHTF medium (4 mM NaHCO3; 0.01% BSA; 37 0 C) diluted so that the final capacitation of 400 .mu.l the DMSO concentration 0.5% by weight.
  • mHTF medium 4 mM NaHCO3; 0.01% BSA; 37 0 C
  • Per 150 .mu.l of the temperature-controlled above test substance solution are pipetted to in each case 150 .mu.l sperm suspension and preincubated for 15 min at 37.degree.
  • Sperm capacitance is started by adding 100 ⁇ l of mHTF medium (88 mM NaHCO 3 , 4% BSA, 37 ° C).
  • the sperm concentration is 10x106 / ml
  • the bicarbonate concentration is 4 mM
  • the BSA concentration is 1%.
  • Capacitance is carried out at 37 ° C for 3 hours in a warming cabinet.
  • the batches (400 ⁇ l each) are transferred completely into each of a 15 ml sample tube with 1.5 ml mHTF (4 mM NaHCO 3 , 37 ° C.), centrifuged at 1000 ⁇ g for 5 minutes and the supernatant is removed. This step removes both the high amount of protein and the test substances.
  • sperm acrosomal reaction is triggered by the binding of sperm to the zona pellucida (ZP).
  • ZP zona pellucida
  • enzymes are released from the acrosome that enable the sperm to penetrate through the ZP to the oocyte.
  • OAM outer acrosomal membrane
  • the sperm head is limited in the end only by the inner akrosomaie membrane (IAM). Only at the iAM is the CD46 antigen detectable.
  • the acrosome reaction can be induced.
  • the FITC-labeled anti-CD46 antibody Pieringen
  • the acrosome-reacted sperm can be differentiated from the acrosome-intact sperm, in which the IAM is not exposed, in the flow cytometer.
  • EhD Ethidium Homodimer
  • the solutions can not be prepared prior to the start of the experiment, but must be prepared during the work-up of the capacitation approaches.
  • the sperm pellets are resuspended in the residual supernatant and diluted in the water bath (37 ° C) with 450 ⁇ l mHTF (4 mM NaHCO 3 , 0.01% BSA, 37 ° C). 100 ⁇ l aliquots of the sperm suspensions are pipetted into prepared sample FACS flow tubes (in a water bath). To the sperm 150 ⁇ l of a solution with ionophore and F ITC-labeled anti-CD46 antibody are pipetted. The final concentration of 80OnM ionophore and a 1: 125 dilution of the anti-CD46 antibody in mHTF (4 mM NaHCO3; 0.01% BSA; 37 ° C).
  • the sperm are incubated for 30 minutes protected from light in a water bath at 37 ° C. Incubation is stopped by adding 3.5 ml of PBS [0.1% BSA] / batch, followed by centrifugation for 5 min at 700 xg (room temperature) and subsequent aspiration of the supernatants. After - -
  • the sperm pellets are each treated with 500 ⁇ l of freshly prepared EhD solution (150 mM EhD in PBS [w / o BSA], 37 ° C.). The samples can then be measured on the Flow Cytometer (BD Facs Calibur). The measurement takes place at an excitation wavelength of the laser of 488nm, it is recorded 10,000 sperm per measurement. Acrosome-reacted sperm are measured via CD46-FITC in filter FL-1 at 530nm. Dead sperm are measured by EhD DNA staining in filter FL-2 at 634nm. The measuring channels are previously compensated accordingly.
  • the sperm are considered to be very uniform cell population in a FSC-H
  • IAR [%] the percentage induced acrosomalous sperm
  • mHTF modif. Human tubularly fluid (Fa. Irvine Scientific), Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (Fa. Gibco) (with Ca 2+, Mg 2+, 1 g / L D-glucose, 36 mg / L Na-Pyruvate, w / o phenol red, w / o NaHCO 3 ); Bovine serum albumin, fraction V (from Fluka); Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous (Merck); Sodium bicarbonate 7.5% sol.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • Merck Sodium bicarbonate 7.5% sol.
  • the compounds according to the invention have an approximately 10-fold higher activity in terms of the inhibition of the soluble adenylate cyclase expressed by the IC 50 value than the already known catechol estrogens (OH estradiols).
  • the catechol estrogens are toxic, therefore, the compounds of the invention are far superior to the known compounds.
  • the compounds of the invention are also about 10-fold more potent than the compounds presented by Zippin.

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Abstract

Zusammenfassung Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie deren Herstellung und Verwendung als Medikament.

Description

Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren der iöslichen Adenylatzyklase, deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Kontrazeption.
Derzeitig stehen Frauen eine Vielzahl moderner Methoden zur Kontrazeption zur Verfügung, für die männliche Fertilitätskontrolle hingegen stehen nur sehr wenige Methoden zur Verfügung (Kondom und Sterilisation). Die Entwicklung von neuen zuverlässigen Mitteln für die männliche Fertilitätskontrolle ist zwingend notwendig. Hierbei sollte die durch eine „männliche Pille" hervorgerufene Infertilität vollständig reversibel sein und genauso wirksam wie die existierenden Methoden, die der Frau zur Verfügung stehen. Die Unfruchtbarkeit sollte relativ schnell einsetzen und möglichst lang anhaltend sein. Eine derartige Verhütungsmethode sollte keine Nebenwirkungen haben, es kann sich hierbei neben hormonellen Ansätzen auch um nicht-hormonelle Ansätze handeln. Ein möglicher Ansatzpunkt ist die Regulation der Aktivität eines Enzyms, das eine wichtige Rolle bei der Befruchtung der Eizelle spielt, die lösliche Adenylatzyklase (sAC). Dieses Enzym wird hauptsächlich in den testikulären Stammzellen exprimiert und ist in reifem Sperma vorhanden.
1999 gelang es den Autoren Levin und Bück (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (1): 79-84) eine Isoform der sAC aus den Testes der Ratte zu reinigen und zu klonieren.
Das rekombinante Enzym der Ratte kann durch Bicarbonat stimuliert werden. Mit Hilfe von Antikörpern konnte nachgewiesen werden, dass die katalytische Domäne des Enzyms in Testes, Sperma, Nieren und dem Choroid Plexus lokalisiert ist. Diese Offenbarungen sind Gegenstand der Anmeldung WO01/85753, die in den US zur Erteilung gekommen ist (US6544768).
In der WO01/21829 (Conti er al.) werden isolierte Polynukleotidesequenzen, die für die humane Isoform der sAC kodieren, isolierte sAC Polypeptide und _
Testsysteme beansprucht, mit deren Hilfe Substanzen identifiziert werden können, die die Aktivität der sAC inhibieren. Die Möglichkeit, diese Substanzen zu benutzen um die Anzahi der beweglichen Samenzeilen reversibel zu reduzieren, sowie deren Verwendung als Mittel zur männlichen Fertilitätskontrolle, wird offenbart.
Die Gruppe von John Herr zeigte die Isolation und Charakterisierung der humanen Isoform der sAC aus Sperma. In der WO 02/20745 werden neben Nukleinsäuren, die für die sAC kodieren, auch Testsysteme beansprucht, mit deren Hilfe Substanzen identifiziert werden können, die die Expression oder die Aktivität der humanen sAC modulieren. Derartige Verbindungen könnten beispielsweise selektiv die Aktivität der sAC inhibieren, dies hätte zur Folge, dass die Samenzellen die Fähigkeit eine Eizelle zu befruchten verlieren. Diese Inhibitoren der sAC könnten daher als Arzneimittel für die nicht hormonelle Kontrazeption dienen.
Die bereits bekannten Inhibitoren der sAC zeigen jedoch spezifische Probleme: Catecholöstrogene (T. Braun, Proc Soc Exp Biol Med 1990, 194(1): 58ff) und Gossypol (KL Olgiati, Arch Biochem Biophys 1984, 231(2): 411 ff) sind inhärent toxisch, während Adenosinanaloga nur mit sehr schwacher Wirkung inhibieren (MA Brown und ER Casillas, J Androl 1984, 5:361 ff). Etwas potenter sind die Inhibitoren (IC5O < 10 μM) der rekombinanten humanen sAC, die von Zippin et al. beschrieben werden (JH Zippin et al. J Cell Biol 2004, 164(4): 527ff). Um ein Mittel für die männliche Fertilitätskontrolle zur Verfügung stellen zu können, besteht ein zunehmender Bedarf an Substanzen, die reversibel, schnell und mit gutem Erfolg zur Infertilität führen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I1
(I) wobei
R1 Wasserstoff, Halogen, CF3, C3-C6-Cycioaikyi, welches gegebenenfalls mehrfach gesättigt und gegebenenfalls mehrfach substituiert ist, oder die Gruppe Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Aryl, CrC6-Acyl, HaIo-C1-C6- Alkyl, Ci-Ce-Alkyl-d-Ce-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Acyl, d-C6-Acyl- Ci-C6-Acyl, CrC6-Alkyl-d-C6-Aryl, Ci-C6-Aryl-Ci-C6-Alkyl oder CF3, in der Ci-Ce-Alkyl, d-C6-Aryl, Ci-C6-ACyI, Halo-Ci-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Acyl, Ci-C6-ACyI-Ci-C6-
Acyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Aryl oder Ci-C6-Aryl-Ci-C6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-d-C6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano ,
R2 Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls mehrfach gesättigt und gegebenenfalls mehrfach substituiert ist, oder die Gruppe Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Aryl, Ci-C6-Acyl, HaIo-Ci-C6- Alkyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Alkyl, CrC6-Alkyl-Ci-C6-Acyl, C1-C6-ACyI- Ci-C6-Acyl, CrCe-Alkyl-CrCe-Aryl, d-C6-Aryl-d-C6-Alkyl oder
CF3, in der d-C6-Alkyl, d-C6-Aryl, Ci-C6-Acyl, Halo-Ci-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Acyl, C i-C6-Acy 1-Ci-C6- Acyl, d-Ce-Alkyl-d-Ce-Aryl oder Ci-C6-Aryl-Ci-C6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-d-C6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, mit d-C6-Alkyl oder C1-C6-ACyI, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann, oder mit C1-C6-AIkOXy, Hydroxy, Cyano, Cθ2-(d-C6-Alkyl), N-(C1-
C6-Alkyl)2, CO-NR4R5 _ _
oder mit CF3 substituiert sein kann,
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-C6-Alkyl, C1-C6-ACyI, C1- Ce-Alkoxy, Hydroxy, Cyano, CO2-(Ci-C6-Alkyl), N-(Ci-C6-Alkyl)2) CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann oder C3-C6-
Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CF3, Hydroxy, Cyano, CO2-(C1-C6- Alkyl), d-C6-Alkyl, CrC6-Acyl, N-(CrC6-Alkyl)2, CO-NR4R5 oder Ci-C6-Alkoxy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit d-C6-Alkyl, Ci-C6-Acyl, C1- C6-Alkoxy oder CF3 substituiert ist, C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, mit Ci-C6-Alkyl, CrC6-Acyl, C1-C6-AIkOXy, N-d-C6-Alkyl- d-C6-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder C5-C12- Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Acyl, C1-C6- Alkoxy, N-CrCe-Alkyl-CrCβ-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder d-Ce-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
R5 Wasserstoff, C-ι-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit CrC6-Alkyl, C1- Ce-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit C-ι-C6-Alkyl, C1-C6-ACyI, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-C12-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC6-Alkyl, C1-C6-ACyI, Ci-C6- Alkoxy, N-d-Cε-Alkyl-CrCe-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-Cβ-Alky!, d- C6-Acyl, C1-C6-AIkOXy, N-CrCe-Alkyl-d-Ce-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder d-Cβ-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann, und
R4 und R5 gemeinsam einen 5-8 gliedrigen Ring bilden, der weitere Heteroatome enthalten kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze, die die bekannten Nachteile überwinden und verbesserte Eigenschaften aufweisen, d.h. eine gute Wirksamkeit, gute Löslichkeit und Stabilität aufweisen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren die lösliche Adenylatzyklase und verhindern so die Kapazitation des Spermiums und dienen somit der männlichen Fertilitätskontrolle.
Unter Alkyl ist jeweils ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl und Hexyl, zu verstehen.
Unter Alkoxy ist jeweils ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxyrest, wie beispielsweise Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, iso-Propoxy-, n-Butoxy-, sec- Butoxy-, iso-Butoxy-, tert. Butyloxy-, Pentoxy-, iso-Pentoxy- und Hexoxy-, zu verstehen.
Unter Acyl ist jeweils ein geradkettiger oder verzweigter Rest, wie beispielsweise Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyroyl, iso-Butyroyl, Valeroyl und Benzoyl zu verstehen.
Unter Cycloalkyl sind monocyclische Alkylringe wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl zu verstehen.
Die Cycloalklyreste können anstelle der Kohlenstoffatome ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Schwefel und/oder Stickstoff enthalten. Bevorzugt sind solche Heterocycloalkyle mit 3 bis 6 Ringatomen. Unter den Ringsystemen, bei denen gegebenenfalls ein- oder mehrere mögliche Doppelbindungen im Ring enthalten sein können, sind zum Beispiel Cycloalkenyle wie Cyclopropenyl, Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclopentadienyl, Cyclohexenyl, Cycloheptenyl zu verstehen, wobei die Anknüpfung sowohl an der Doppelbindung wie auch an den Einfachbindungen erfolgen kann.
Unter Halogen ist jeweils Fluor, Chlor, Brom oder Jod zu verstehen.
Der Arylrest umfasst jeweils 6 - 12 Kohlenstoffatome und kann beispielsweise benzokondensiert sein. Beispielsweise genannt seien: Phenyl, Tropyl, Cyclooctadienyl, Indenyl, Naphthyl, Biphenyl, Florenyl, Anthracenyl etc.
Der Heteroarylrest umfasst jeweils 5-16 Ringatome und kann anstelle des Kohlenstoffs ein- oder mehrere, gleiche oder verschiedene Heteroatome, wie Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff im Ring enthalten, und kann mono-, bi- oder tricyclisch sein und kann zusätzlich jeweils benzokondensiert sein.
Beispielsweise seien genannt:
Thienyl, Furanyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl,
Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl, etc. und Benzoderivate davon, wie z.B. Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzooxazolyl, Benzimdazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isoindolyl, etc; oder Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Triazinyl, etc. und Benzoderivate davon wie z.B. Chinolyl, Isochinolyl, etc; oder Azocinyl, Indolizinyl, Purinyl, etc. und Benzoderivate davon; oder Chinolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Naphthyridinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, Xanthenyl, Oxepinyl, etc.
Der Heteroarylrest kann jeweils benzokondensiert sein. Beispielsweise seien als 5-Ringheteroaromaten genannt: Thiophen, Furan, Oxazol, Thiazol, Imidazol, Pyrazol und Benzoderivate davon und als 6-Ring-Heteroaromaten Pyridin, Pyrimidin, Triazin, Chinolin, Isochinolin und Benzoderivate. Unter Heteroatomen sind Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-Atome zu verstehen.
Ist eine saure Funktion enthalten, sind als Salze die physiologisch verträglichen Salze organischer und anorganischer Basen geeignet, wie beispielsweise die gut löslichen Alkali- und Erdalkalisalze sowie N-Methyl-glukamin, Dimethyl- glukamin, Ethyl-glukamin, Lysin, 1 ,6-Hexadiamin, Ethanolamin, Glukosamin, Sarkosin, Serinol, Tris-hydroxy-methyl-amino-methan, Aminopropandiol, Sovak- Base, 1-Amino-2,3,4-butantriol.
Ist eine basische Funktion enthalten, sind die physiologisch verträglichen Salze organischer und anorganischer Säuren geeignet wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Weinsäure u.a.
Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei
R1 Wasserstoff, Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, oder die Gruppe C1- C6-Alkyl, d-Ce-Aryl, CrC6-Acyl, Halo-CrC6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-
C6-Alkyl, CrCe-Alkyl-d-Ce-Acyl, CrC6-ACyI-C1-C6-ACyI, C1-C6-
Alkyl-CrCβ-Aryl, d-Ce-Aryl-d-Ce-Alkyl oder CF3, in der C1-C6-
Alkyl, d-Cβ-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-CrC6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-
Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Acyl, Ci-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, d-C6-Alkyl- d-C6-Aryl oder C !-C6-AIyI-C1 -C6-Al ky I gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-
CrC6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R2 Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, oder die Gruppe d-C6-Alkyl, C1-
C6-Aryl, Ci-C6-Acyl, Halo-d-C6-Alkyl, Ci-Ce-Alkyl-d-Ce-Alkyl, C1- C6-Alky I-C ! -C6-Acy I , C -\ -C6-Acy I-C , -C6-Acy I , C 1 -C6-Alky I-C ! -C6-Ary I , d-Ce-Aryl-CrCe-Alkyl oder CF3, in der Ci-C6-Alkyl, CrC6-Aryl, C1- C6-ACyI, Halo-d-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d- _
C6-ACyI, Ci-C6-Acyl-Ci-C6-Acyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Aryl oder Ci-C6- Aryl-Ci-C6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-Ci-C6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C6-Alkyl, Ci-C3-Acyl, C1-C3- Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3J2, CO2-(Ci-C3-Alkyl), CO-NR4R5 oder CF3 substituiert sein kann,
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und / oder Fluor, mit Ci-C6-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Ci-C3-Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3J2, CO2-(Ci-C3- Alkyl), CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und / oder Fluor, CF3, Cyano, Ci-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Hydroxy, N-(CH3J2, CO2-(CrC3-Alkyl), CO- NR4R5 oder Ci-C3-Alkoxy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit CrC3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Cr C3-Alkoxy oder CF3 substituiert ist,
C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, d-C3-Acyl, Ci-C3- Alkoxy, N-Ci-C3-Alkyl-CrC3-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC3-Alkyl, Cr C3-Acyl, Ci-C3-Alkoxy, N-Ci-C3-Alkyl-CrC3-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder Ci-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
R5 Wasserstoff, d-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, Cr Cβ-Acyl, Ci-Cβ-Alkoxy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C3-AiKyI, Ci-C3-Acyl, C1-C3-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Ci-C3-
Alkoxy, N-Ci-Cs-Alkyl-d-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Cr
C3-Alkoxy, N-d-Cs-Alkyl-Ci-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
Ci-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel I1 wobei
R1 Wasserstoff,
R2 C3-C6-Cycloalkyl, Ci-C6-Alkyl, CF3, Cyano, Brom, oder die Gruppe
-OCF3, -SO2-CH3 bedeutet,
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-Cβ-Alkyl, Ci-C3-Acyl, CrC3- Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3J2, CO2-(CrC3-Alkyl), CO-NR4R5 oder CF3 substituiert sein kann, C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und / oder Fluor, mit C-ι-C6-Alkyl,
CrC3-ACyI, Ci-C3-Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(CrC3- Alkyl), CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann, _ _
Ca-Cβ-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und / oder Fluor, CF3, Cyano, Ci-C3-Aikyi, C1-C3-ACyI, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(C1-C3-AIKyI), CO- NR4R5 oder C1-C3-AIkOXy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff,
R5 Wasserstoff, C-ι-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-Cβ-Alkyl, C1- Cβ-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-C12-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3-
Alkoxy, N-Ci-C3-Alkyl-Ci-C3-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1- C3-Alkoxy, N-d-Cs-Alkyl-CrCs-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
Ci-Cβ-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei
R1 Wasserstoff,
R2 C3-C6-Cycloalkyl, CrC6-Alkyl, CF3, Cyano, Brom, oder die Gruppe
-OCF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht, _ _
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, Acetyl, Methoxy, Ethoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(Ci-C3-Alkyl), CO-NHR5 oder CF3 substituiert sein kann,
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit Chlor und / oder Fluor, mit Ci-C3-Alkyl, Acetyl, Methoxy, Ethoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(C1-C3- Alkyl), CO-NHR5 oder mit CF3 substituiert sein kann, C3-C6-Cycloalkyl,
R4 Wasserstoff,
R5 Wasserstoff, C-ι-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, C1-
C6-Acyl, Ci-C6-Alkoxy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, Ci-C3-Alkoxy oder CF3 substituiert ist, C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, C1-C3-
Alkoxy, N-d-Cs-Alkyl-Ci-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, C1-
C3-Alkoxy, N-d-Cs-Alkyl-Ci-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
Ci-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei R1 Wasserstoff,
R' tertiär Butyi, iso-Propyl, iso-Butyi, sek. Butyi, Cyano, Brom, oder die Gruppe -0-CF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht,
RJ die Gruppe
R4 Wasserstoff,
Rs Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)m-N-(CH3)2, -(CH2)2-CH3, - (CHz)2-NH-COCH3, -(CH2)-CHCH3-OH, -(CH2)2-O-CH3) -(CHz)2-OH, -CHCH3-CH2-OH, wobei m 1-3 ist,
bedeutet, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei
R1 Wasserstoff,
R' tertiär Butyl, iso-Propyl, iso-Butyl, sek. Butyl, Cyano, Brom, oder die Gruppe -0-CF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht,
R' die Gruppe
RA Wasserstoff,
R5 Wasserstoff oder die Gruppe, -(CH2)-CHCH3-OH, -(CH2) 2-O-CH3, -CHCH3-CH2-OH,
bedeutet, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
Die folgenden Verbindungen entsprechend der vorliegenden Erfindung sind ganz besonders bevorzugt:
1. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid
2. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure(2- morpholin-4-yl-ethyl)-amid 3. (±)-5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure-(2- hydroxy-1 -methyl-ethyl)-amid
4. (±)-5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure-(2- hydroxy-propyl)-amid 5. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-fluor-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid
6. 5-(4-tert.-Buty!-phenyisuifamoy!)-3-(3-fiuor-phenyi)-l H-indoi-2- carbonsäure(2-morpholin-4-yl-ethyl)-amid 7. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-methoxy-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid
8. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-methoxy-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(2-morpholin-4-yl-ethyl)-amid
9. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure(pyridin-4- yl)-amid
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der Formel II,
worin R1, R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen haben, und R6 ein Wasserstoff oder ein Ci-C6-Akylrest sein kann, bevorzugt ist Wasserstoff, der Methyl- oder Ethyl-Rest, mit einem Amin der allgemeinen Formel III
R5 HN
R4 (III) worin R4 und R5 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, nach dem Fachmann bekannten Methoden umsetzt und gegebenenfalls benötigte Schutzgruppen anschließend gespalten werden.
Für den Fall, dass R6 gleich Wasserstoff ist, kann die Umsetzung zunächst durch Aktivierung der Säurefunktion erfolgen, hierbei wird beispielsweise zunächst die Carbonsäure der allgemeinen Formel Il in Gegenwart eines tertiären Amins, wie beispielsweise Triethylamin, mit Chlorameisensäure- isobutylester in das gemischte Anhydrid überführt. Die Umsetzung des gemischten Anhydrids mit dem Aikaiisaiz des entsprechenden Amins erfolgt in einem inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan, Dimethylformamid, Hexamethylphosphor- säuretriamid, bei Temperaturen zwischen -300C und +600C, vorzugsweise bei O0C bis 30°C.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Carbonsäure der allgemeinen Formel Il durch Reagenzien wie beispielsweise HOBt oder HATU zu aktivieren. Die Umsetzung der Säure erfolgt z.B. mit HATU in einem inerten Lösungsmittel wie beispielsweise DMF in Gegenwart des entsprechenden Amins der allgemeinen Formel IM und einem tertiären Amin wie beispielsweise Ethyldiisopropylamin bei Temperaturen zwischen -50 und +600C, vorzugsweise bei 00C bis 300C.
Für den Fall, dass R6 gleich Ci-C6-Alkyl ist, kann beispielsweise auch eine direkte Amidolyse des Esters mit dem entsprechenden Amin eventuell unter zu Hilfenahme von Aluminiumtrialkyl-Reagenzien, vorzugsweise Aluminium- trimethyl, durchgeführt werden.
Die als Ausgangsmaterialien dienenden Verbindungen der allgemeinen Formel Il können beispielsweise hergestellt werden, in dem man in an sich bekannter Weise die bekannten Brom-Indolester IV
worin R6 ein Ci-C6-Alkylrest, vorzugsweise ein Methyl- oder Ethylrest, ist, zunächst mit Chlorschwefelsäure zu den Verbindungen der allgemeinen Formel V
und diese dann anschließend mit einem Amin der allgemeinen Formel (VI)
worin R1 und R2 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, zu den Verbindungen der allgemeinen Formel VII umsetzt
Die Ester der allgemeinen Formel VII werden dann in einer Pd-katalysierten Reaktion mit Boronsäurederivaten der allgemeinen Formel VIII
^B(OH)2
R3 (VIII), worin R3 die oben angegebene Bedeutung aufweist, gegebenenfalls nach Abspaltung benötigter Schutzgruppen, gegebenenfalls gefolgt von einer Verseifung beispielsweise mit Natronlauge in die Verbindungen der allgemeinen Formel Il überführt
worin R1, R2, R3 und R6 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren die lösliche Adenylatzyklase, worauf auch deren Wirkung zum Beispiel bei der männlichen Fertilitätskontrolle beruht.
Adenylatzyklasen sind die Effektormoleküle für einen der am meist genutzten Signaltransduktionswege, sie synthetisieren das second messenger Molekül zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) aus Adenosintriphosphat (ATP) unter Abspaltung von Pyrophosphat (PP). cAMP vermittelt zahlreiche zelluläre Antworten für eine Vielzahl von Neurotransmittern und Hormonen. Die lösliche, spermienspezifische Adenylatzyklase (sAC, humane mRNA- Sequenz (GenBank) NM_018417, humanes Gen ADCY X) ist eine von zehn beschriebenen Adenylatzyklasen im menschlichen Genom. sAC zeigt dabei einige spezifische Eigenschaften, die sie von den anderen Adenylatzyklasen unterscheidet. sAC wird, im Gegensatz zu allen anderen Adenylatzyklasen, durch die Konzentration an Bicarbonat im sie umgebenden Medium stimuliert und nicht durch G-Proteine. sAC besitzt keine Transmembranregionen in ihrer Aminosäuresequenz, sie ist nicht durch Forskolin inhibierbar, ist durch Mangan viel stärker stimulierbar als durch Magnesium, und zeigt nur geringe Sequenzhomologien zu den anderen Adenylatzyklasen (< 26% Identität der katalytischen Domänen I und Il der sAC mit anderen Adenylatzyklasen auf Aminosäureebene).
Spezifische, Mangan-abhängige Aktivität von sAC wurde zuerst von T. Braun et al. (1975, PNAS 73:1097ff) in Rattentestis und Spermien beschrieben. N. Okamura et al. (1985, J. Biol. Chem 260(17):9699ff) zeigten, dass es sich bei der Substanz, die die Aktivität der sAC in Eberseminalflüssigkeit stimuliert, um Bicarbonat handelt. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass nur in Rattentestis und Spermien, aber nicht in anderen Geweben, Bicarbonat -stimulierbare AC- Aktivität nachgewiesen werden kann. sAC wurde von der Gruppe Bück und Levin aus Rattentestis gereinigt und erstmalig sequenziert (J. Bück et al. 1999 PNAS 96:79ff, WO 01/85753). Die zu erwartenden Eigenschaften (z.B. Bikarbonat- und Magnesiumstimulierbarkeit) wurden am rekombinant exprimierten Protein bestätigt (Y. Chen et al. 2000 Science 289:625ff). _ _
Daten zur Verteilung der sAC mRNA und zu Bicarbonat -stimulierbarer sAC Aktivität lassen auf eine Testis- und Spermienspezifische Expression des Enzyms schließen (ML Sinclair et al. 2000 Mol Reprod Develop 56:6ff; N Okamura et al. 1985 J. Biol. Chem 260(17):9699ff; J. Bück et al. 1999 PNAS 96:79ff). Im Hoden wird sAC mRNA dabei nur in späteren Stadien der sich zu Spermien entwickelnden Keimzellen exprimiert, nicht aber in somatischen Zellen (ML Sinclair et al. 2000 Mol Reprod Develop 56:6ff).
Zur Funktion der sAC in Spermien in Säugetieren gibt es eine Reihe pharmakologischer Untersuchungen. Spermien müssen, bevor sie die Zona Pellucida des Eies durchdringen können um anschließend mit dem Oolemma des Eies zu verschmelzen, für diese Funktionalität vorbereitet sein. Dieser Prozess, die Spermienkapazitation, ist recht gut untersucht. Ein kapazitiertes Spermium zeichnet sich durch ein verändertes Bewegungsmuster aus und durch die Fähigkeit, durch einen geeigneten Stimulus den Prozess der akrosomalen Reaktion (einer Ausschüttung lytischer Enzyme die vermutlich dem Durchdringen der Zona Pellucida durch das Spermium dienen) zu durchlaufen. Die Spermienkapazitation erfolgt in vivo und in vitro u.a. abhängig von einer erhöhten Bikarbonatkonzentration im Medium (PE Visconti & GS Kopf (1998) Biol Reprod 59:1ff; E de Lamirande et al. 1997 Mol Hum Reprod 3(3):175ff). Die Spermienkapazitation kann auch stimuliert werden durch die Zugabe geeigneter membrangängiger cAMP-Analoga, z.B. db-cAMP, und einem Inhibitor, der deren Abbau hemmt (z.B. IBMX). Die vermutete Abhängigkeit der Spermienfunktion von sAC wurde erst kürzlich durch ein genetisches Deletionsmodell, eine sog. Knock-out Maus, bestätigt (G Esposito et al. 2004 PNAS 101(9):2993ff). Männliche Mäuse, denen das Gen für sAC fehlt, zeigen eine normal verlaufende Spermatogenese, sind aber infertil. Die Spermien haben Bewegungsdefekte und sind nicht in der Lage ein Ei zu befruchten. Die Tiere zeigten keine sonstigen Defekte oder abnorme Befunde, was gegen andere hypothetisierte Funktionen der sAC spricht (JH Zippin et al 2003 FASEB 17:82ff). Die sAC hat eine einzigartige Sequenz und nur eine geringe Homologie zu anderen somatischen Adenylatzyklaseπ. Sie ist die einzige Adenyiatzykiase im Säugetiersperma und die Aktivität ist für die Beweglichkeit der Spermien und die Kapazitation essentiell. Spezifische Inhibitoren der sAC stellen demnach eine wichtige Möglichkeit dar, die männliche Fertilität zu regulieren.
Arzneimittel, die mindestens eine der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 - 7 enthalten, sind daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 - 7.
Zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Arzneimittel werden diese in die Form eines pharmazeutischen Präparats gebracht, das neben dem
Wirkstoff für die enterale oder parenterale Applikation geeignete pharmazeutische, organische oder anorganische inerte Trägermaterialien, wie zum Beispiel Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke,
Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Polyalkylenglykole usw. enthält. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, zum Beispiel als Tabletten,
Dragees, Suppositorien, Kapseln oder in flüssiger Form, zum Beispiel als
Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls enthalten sie darüber hinaus Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgatoren; Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer. Diese pharmazeutischen Präparate sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
Für die parenterale Anwendung sind insbesondere Injektionslösungen oder Suspensionen, insbesondere wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in polyhydroxyethoxyliertem Rizinusöl, geeignet.
Als Trägersysteme können auch grenzflächenaktive Hilfsstoffe wie Salze der Gallensäuren oder tierische oder pflanzliche Phospholipide, aber auch -
Mischungen davon sowie Liposomen oder deren Bestandteile verwendet werden.
Für die orale Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talkum und/oder Kohlenwasserstoffträger oder -binder, wie zum Beispiel Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke, geeignet. Die Anwendung kann auch in flüssiger Form erfolgen, wie zum Beispiel als Saft, dem gegebenenfalls ein Süßstoff beigefügt ist.
Für die vaginale Applikation sind z. B. Zäpfchen geeignet und üblich.
Die enteralen, parenteralen, vaginalen und oralen Applikationen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Dosierung der Wirkstoffe kann je nach Verabfolgungsweg, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die tägliche Dosis beträgt 0,5-1000 mg, vorzugsweise 50-200 mg, wobei die Dosis als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in 2 oder mehreren Tagesdosen gegeben werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind unter anderem hervorragende Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase. Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase führen zu einer Erniedrigung des cAMP Signals. Der cAMP-Spiegel ist entscheidend für die Kontrolle der Prozesse, die bei der Zeilproliferation, der Zelldifferenzierung und der Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Erkrankungen, wie z.B. Krebs, bei denen die Erniedrigung des cAMP- Spiegels entscheidend sind, können durch Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase moduliert werden. Diese Modulation kann prophylaktische und therapeutische Effekte haben für die Patienten, die an einer derartigen Erkrankung leiden. Im Moment werden Erkrankungen, die wie Krebs mit einer erhöhten Zeilproliferation einhergehen, z.B. durch Strahlentherapie und Chemotherapie behandelt. Diese Verfahren sind unspezifisch und haben ein -
hohes Nebenwirkungspotential. Die Bereitstellung von neuen Substanzen, die direkt an bestimmten Zielorten eingreifen, sind deshalb vorteilhaft. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Substanzen, die die cAMP-Produktion durch die Inhibition der löslichen Adenylatzyklase modulieren. So kann beispielsweise die anomale Zeilproliferation erniedrigt oder gehemmt werden durch eine Regulation oder Inhibition der cAMP Produktion. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Substanzen kann die lösliche Adenylatzyklase inhibiert werden, dies hat eine Erniedrigung der Zeilproliferation zur Folge. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, die mindestens eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I enthalten, sowie Arzneimittel mit geeigneten Formulierungs- und Trägerstoffen. Die Erkrankungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie verursacht werden durch Störungen des Stoffwechsels des second messengers cAMP.
Eine Erniedrigung der cAMP-Konzentration durch Inhibition der löslichen Adenylatzyklase kann Mittel zur Verfügung stellen zur Modulation der Spermienkapazitation. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen zur Erniedrigung und/oder zur Hemmung der männlichen Keimzell-Fertilität, vermittelt durch die Reduktion oder Inhibition der löslichen Adenylatzyklase Aktivität und dadurch resultierend der Spermienkapazitation.
Durch die Administration einer wirksamen Menge einer Substanz, die zur Inhibition der cAMP-Produktion führt, kann die Befruchtung des Ovums verhindert werden. Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels für die nicht hormonelle Kontrazeption.
Soweit die Herstellung der Ausgangsverbindungen nicht beschrieben wird, sind diese bekannt oder analog zu bekannten Verbindungen oder hier beschriebenen Verfahren herstellbar. Es ist ebenfalls möglich, alle hier beschriebenen Umsetzungen in Parallel-Reaktoren oder mittels kombinatorischer Arbeitstechniken durchzuführen. -
Die Isomerengemische können nach üblichen Methoden wie beispielsweise Kristallisation, Chromatographie oder Salzbildung in die Enantiomeren bzw. E/Z- Isorneren aufgetrennt werden.
Die Herstellung der Salze erfolgt in üblicher Weise, indem man eine Lösung der Verbindung der Formel I mit der äquivalenten Menge oder einem Überschuss einer Base oder Säure, die gegebenenfalls in Lösung ist, versetzt und den Niederschlag abtrennt oder in üblicher Weise die Lösung aufarbeitet.
-
Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), ohne den Umfang der beanspruchten Verbindungen auf diese Beispiele zu beschränken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) lassen sich wie nachstehend beschrieben herstellen.
Beispiel 1 : 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure (tetrahydro-pyran-4-yl)-amid
Zu einer Lösung von 70mg der in Beispiel 1d) hergestellten Säure in 1.2ml Dimethylformamid gibt man 64.7mg N-[(Dimethylamino)-1H-1 ,2,3-triazolo[4,5- b]pyridin-1-ylmethylen]-Λ/-Methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N-oxid (HATU) und 15.8mg 4-Aminotetrahydropyran. Bei 00C werden dann 29.6μl Ethyldiisopropylamin zugetropft und 20 Stunden bei 25°C gerührt. Anschließend gibt man 20ml Wasser zu, und extrahiert dreimal mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen wäscht man einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung, trocknet über Natriumsulfat und engt nach Filtration im Vakuum ein. Der so erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel mit Hexan / 0-80% Ethylacetat gereinigt. Man erhält auf diese Weise 67.1 mg der Titelverbindung.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.13 (s, 9H), 1.26 (2H), 1.65 (2H), 3.32 (2H), 3.68 (2H), 3.90 (1 H), 6.93 (2H), 7.18 (2H), 7.32-7.50 (5H), 7.53 (1 H), 7.58 (1 H), 7.86 (1 H), 7.91 (1 H), 9.91 (H), 12.21 (1 H). -
Das Ausgangsmaterial für die obige Titelverbindung wird wie folgt hergestellt:
1 a) 3-Brom-5-ch!orsυ!fony!-1 H-indol-carbonsäure-ethyiester
Zu 2.48ml Chlorsulfonsäure gibt man bei -100C 2.0g 3-Brom-1 H-indol-2- carbonsäure-ethylester und rührt anschließend bei 250C für drei Stunden. Dann verdünnt man mit 200ml Ethylacetat und wäscht je einmal mit 30ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Filtration wird im Vakuum eingeengt. Man erhält auf diese Weise 1.93g der Titelverbindung, die ohne weitere Reinigung weiter umgesetzt wird.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.33 (3H), 4.34 (2H), 7.38 (1 H), 7.57 (1 H), 7.76 (1 H), 12.25 (1 H).
1 b) 3-Brom-5-(4-tert.-butyl-phenylsulfamoyl)-1 H-indol-2-carbonsäure-ethylester
Zu einer Lösung von 1.93g des in Beispiel 1a) hergestellten Sulfonsäurechlorids in 51 ml DMF gibt man bei 25°C 1.38ml Ethyldiisopropylamin und 0.84ml 4-tert.- Butyl-phenylamin und rührt 20 Stunden bei dieser Temperatur. Nach Zugabe von etwas Toluol wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel mit Hexan / 0-50% Ethylacetat gereinigt. Man erhält auf diese Weise 1.7g der Titelverbindung.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.13 (9H), 1.32 (3H), 4.35 (2H)1 6.96 (2H), 7.18 (2H), 7.57 (1 H), 7.67 (1 H), 7.91 (1 H), 10.09 (1 H). -
1 c) 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure- ethylester
Zu einer Lösung von 1.7g des in Beispiel 1b) hergestellten Bromids in einem Gemisch aus 67ml Ethanol und 67ml Toluol gibt man 627mg Phenylboronsäure und 8.9ml einer 1 M-wässrigen-Natriumcarbonatlösung sowie 421mg Lithiumchlorid. Nach Zugabe von 328mg Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium wird die Reaktionsmischung 20 Stunden refluxiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit 250ml Ethylacetat verdünnt, über Celite abgesaugt und mit Ethylacetat nachgewaschen. Die so erhaltene organische Phase wird mit je 30ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat- und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wird im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/0-60% Ethylacetat gereinigt. Eine weitere Aufreinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Hexan/Ethylacetat. Man erhält auf diese Weise 1.03g der Titelverbindung.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.13 (3H), 1.14 (9H), 4.19 (2H), 6.93 (2H), 7.18 (2H), 7.31-7.48 (5H), 7.58 (1 H), 7.65 (1 H), 7.81 (1 H), 9.93 (1 H), 12.36 (1 H).
1 d) 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure
Zu einer Mischung von 976mg des in Beispiel 1c) hergestellten Esters in 24ml Ethanol und 12ml Wasser gibt man 1.51g Natriumhydroxid und rührt 18
Stunden bei 25°C. Anschließend wird mit 30ml Wasser verdünnt und mit 5%
Schwefelsäure angesäuert. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält auf diese Weise 910mg der Titelverbindung die ohne weitere Reinigung weiter umgesetzt wird.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.14 (12H)1 6.93 (2H), 7.18 (2H), 7.31-7.46 (5H), 7.55 (1 H), 7.62 (1 H), 7.79 (1 H), 9.92 (1 H), 12.27 (1 H), 13.14 (1 H).
Beispiel 2: 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure (2-morpholin-4-yl-ethyl)-amid
In Analogie zu Beispiel 1 erhält man aus 70mg der Säure aus Beispiel 1d) und 20.5μl 2-(Morpholin-4-yl)-ethylamin 61.9mg der Titelverbindung. NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.14 (9H), 2.18 (4H), 2.25 (2H), 3.26 (2H), 3.37 (4H), 6.92 (2H), 7.10 (1 H), 7.18 (2H), 7.35 (2H), 7.42 (1 H), 7.47-7.55 (3H), 7.58 (1 H), 7.76 (1 H), 9.90 (1H), 12.21 (1 H).
Beispiel 3: (±)-5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2- carbonsäure-(2-hydroxy-1-methyl-ethyl)-amid
In Analogie zu Beispiel 1 erhält man aus 70mg der Säure aus Beispiel 1d) und 12.4μl 2-Amino-1-propanol 29.2mg der Titelverbindung.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 0.94 (3H), 1.14 (9H), 3.17 (1 H), 3.34 (1 H), 3.90 (1 H), 4.62 (1 H), 6.93 (2H), 7.15 (1 H), 7.17 (2H), 7.33-7.50 (5H), 7.53 (1 H), 7.58 (1 H), 7.83 (1 H), 9.90 (1 H), 12.19 (1 H). Beispiel 4: (±)-5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2- carbonsäure-(2-hydroxy-propyl)-amid
In Analogie zu Beispiel 1 erhält man aus 70mg der Säure aus Beispiel 1d) und 12.1 μl 1-Amino-2-propanol 56.7mg der Titelverbindung.
NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 0.91 (3H)11.14 (9H), 3.09 (2H), 3.58 (1H)14.59 (1H), 6.93 (2H), 7.18 (2H)17.29 (1H), 7.32-7.51 (5H), 7.53 (1H), 7.58 (1H), 7.79 (1H), 9.90(1H), 12.18(1H).
Biologische Beispiele:
Beispiel 1 : sAC-Assay
In einem geeigneten Puffersystem katalysiert die lösliche, spermienspezifische Adenylatzyklase die Umsetzung von Adenosintriphosphat (ATP) zu zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und Pyrophosphat. Auf diese Weise generiertes, freies cAMP wird anschließend in einem kompetitiven Nachweisverfahren eingesetzt, bei dem die Bindung eines mit Europiumkryptate (Eu[K]) markierten anti-cAMP Antikörpers (anti CAMP-Eu[K]-AK) an ein mit cAMP-Molekülen markiertes, modifiziertes Allophycocyanin-1 Molekül (cAMP- XL665) verhindert wird. In Abwesenheit von exogenem cAMP kommt es nach Anregung bei 335 nm zu einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) zwischen dem anti CAMP-Eu[K]-AK (FRET-Donor) und dem cAMP- XL665 Molekül (FRET-Akzeptor). Dieser Prozess wird zeitlich versetzt (time- resolved) anhand der Emission des FRET-Akzeptors XL665 (665nm und 620nm) quantifiziert. Ein Signal-Abfall (gemessen als Well-Ratio; Berechnungsformel: [(E665nm/E620nm) X 10000] ) lässt sich auf das Vorhandensein von cAMP und somit auf die Aktivität der sAC zurückführen. Pro Vertiefung einer 384-Loch Testplatte (Polystyrol; 384, NV) werden zunächst 1 ,5 μl der Testsubstanz (in 30% DMSO) vorgelegt, bei den Lösemittelkontrollen lediglich 30% DMSO. Anschließend werden 10 μl einer verdünnten sAC Enzymiösung ausgebracht (Enzym-Stocklösung in 300 mM NaCI, 10 % Glycerin; pH 7,6; Enzym-Zwischen- und Endverdünnung a) 1 :10 und b) 1 :2000 jeweils in: 1.0 mM MnCI2; 0.2 % BSA; 50 mM Tris pH 7,5 in H2O). Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 5 μl der ATP-Substrat-Lösung (200 μM ATP in H2O) gestartet und nach einer Inkubation (25 Min. bei Raumtemperatur) durch die Zugabe von 5 μl der Stop-Lösung (200 μM EDTA in PBS) beendet. Zum Schluss wird die ganze Reaktion durch die Zugabe von 70 μl PBS auf ein Gesamtvolumen von 91 ,5 μl eingestellt. Anschließend werden 8 μl der Detektionslösung 1 in eine Vertiefung der 384- Loch Mess-Platte vorgelegt (Messplatte: Polystyrol; 384, SV - black; Detektionslösung 1 : 50 μl cAMP-XL665; 950 μl Rekonsititutionspuffer; 2200 μl PBS; cAMP-XL.665: Herstellung durch Zugabe von 5 ml H2O zum lyophyliserten _ _
Produkt gemäß Vorschrift Cis bio Kit: #62AMPPEC; Lagerung: aliquotiert bei - 800C). Anschließend werden 3μl aus den 91 ,5 μl der entsprechenden Vertiefung der Testplatte zugegeben. Zum Schluss erfolgt die Zugabe von 8 μl der Detektionslösung2 (Detektionslösung 2: 50 μl anti CAMP-Eu[K]-AK; 950 μl Rekonsititutionspuffer; 2200 μl PBS; anti CAMP-Eu[K]-AK: Herstellung gemäß Vorschrift Cis bio Kit: #62AMPPEC; Lagerung: aliquotiert bei -800C). Nach einer weiteren Inkubation von 90 Min. bei Raumtemperatur wird das HTRF-Ergebnis entweder am Packard Discovery oder mit dem RubiStar HTRF- Messgerät gemessen (Delay: 50 μs; Integration time: 400 μs).
Beispiel 2. Isolierung von humanen Spermien aus Ejakulaten und Kapazitation
2.1. Isolierung der Spermien
Humane Spermien werden aus dem Ejakulat durch ein zweischichtiges Gradientensystem auf Basis von colloidalen Silica-Partikeln gereinigt (Handelsname: Percoll oder ISolate).
Pro Ejakulat werden in einem15 ml Zentrifugenröhrchen (konisch, Kunststoff) je 2,5 ml vorgewärmte untere Schicht („90% ISolate lower layer", Fa. Irvine) vorgelegt und vorsichtig mit 2,5 ml vorgewärmter oberer Schicht („50% ISolate upper layer", Fa. Irvine) überschichtet und im Wasserbad bei 37°C für < 1h vorgehalten. Der Gradient wird vorsichtig mit maximal 3 ml normalen (in Bezug auf Spermienanzahl, Motilität und Verflüssigung) Ejakulates überschichtet. Die Sedimentation der Spermien erfolgt bei 1000 x g für 25 Min bei Raumtemperatur. Mittels einer Glaskapillare werden beide Schichten bis kurz oberhalb der Spermienpellets abgesaugt. Zum Auswaschen des ISolate- Gradienten werden die in je ca. 200 μl resuspendierten Spermienpellets in ein 15 ml Kunststoffröhrchen mit 12ml mHTF Medium (4mM NaHCO3; 0,01% BSA; 37°C) überführt und die Spermien werden bei 1000 x g für 20 Min sedimentiert. Das Medium wird bis kurz über dem Pellet abgesaugt und mit mHTF Medium Medium (4mM NaHCO3; 0,01 % BSA; 37°C) auf 1000 μl eingestellt. Die Anzahl der Spermien wird in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und für die folgende Kapazitation gegebenenfalls mit mHTF-Medium (4mM NaHCO3; 0,01 % BSA; 370C) auf 4x106 Spermien/150 μl eingestellt. 2.2. Kapazitation
Falls der Einfluss von Testsubstanzen auf die akrosomale Reaktion getestet werden soii, müssen die Spermien mit den Testsubstanzen vorinkubiert werden. Diese Vorinkubation (15 min im Wärmeschrank bei 370C) ist notwendig, um das Eindringen der Testsubstanzen in die Spermien vor Beginn der Kapazitation zu ermöglichen, d.h. eine Präsättigung der Bindungsstellen im Spermium zu erreichen, insbesondere bei Substanzen, die schlecht durch die Membran gehen. Sie ist außerdem notwendig, da die Erhöhung der BSA-Konzentration bei der Kapazitation durch die hohe Lipidbindung des BSA zur Abnahme der effektiven Testsubstanzkonzentration im Ansatz führen könnte.
Die Testsubstanzen werden in DMSO gelöst und mit mHTF-Medium (4mM NaHCO3; 0,01% BSA; 370C) verdünnt, so dass im finalen Kapazitationsansatz von 400 μl die DMSO-Konzentration 0.5% beträgt. Je 150 μl der temperierten obigen Testsubstanzlösung werden zu jeweils 150 μl Spermiensuspension pipettiert und für 15 min bei 37°C vorinkubiert. Die Kapazitation der Spermien wird gestartet durch Zugabe von 100 μl mHTF-Medium (88mM NaHCO3; 4% BSA; 37°C). In dem finalen 400 μl Kapazitationsansatz beträgt die Spermien- konzentration 10x106/ml, die Bicarbonatkonzentration 4 mM und die BSA- Konzentration 1%. Die Kapazitation erfolgt bei 37°C für 3 Stunden im Wärmeschrank.
Zum Beenden der Kapazitation werden die Ansätze (je 400 μl) komplett in jeweils ein 15 ml Probenröhren mit 1 ,5 ml mHTF (4mM NaHCO3; 37°C) überführt, 5 min bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Mit diesem Schritt werden sowohl die hohe Proteinmenge als auch die Test- Substanzen entfernt.
Beispiel 3. Flow cytometrische Bestimmung der akrosomalen Reaktion
3.1. Einleitung der akrosomalen Reaktion durch lonophorbehandlung und gleichzeitige CD46-FITC-Färbunq Die akrosomale Reaktion (AR) des Spermiums wird durch die Bindung des Spermiums an die Zona pellucida (ZP) ausgelöst. Dabei werden aus dem Akrosom Enzyme freigesetzt, die es dem Spermium ermöglichen, durch die ZP bis zur Eizelle vorzudringen. Bei der AR kommt es beim Spermium zu einer teilweisen Verschmelzung der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran (OAM). Der Spermienkopf wird am Ende nur noch durch die innere akrosomaie Membran (IAM) begrenzt. Nur an der iAM ist das CD46-Antigen nachweisbar. In vitro lässt sich mit einer geeigneten Konzentration des Calcium-Ionophors A23187 an kapazitierten, aber nicht an unkapazitierten bzw. an durch Testsubstanzen an der Kapazitation gehemmten Spermien die akrosomaie Reaktion induzieren. Mit Hilfe des FITC markierten Anti-CD46 Antikörpers (Fa. Pharmingen) gegen die IAM können die Akrosom -reagierten Spermien von den Akrosom -intakten Spermien, bei denen die IAM nicht exponiert ist, im Flow Cytometer unterschieden werden. Durch die gleichzeitige Färbung der Spermien mit dem DNA-Farbstoff Ethidium Homodimer (EhD), der nur die DNA membran-defekter, also toter Zellen färbt, können die toten von den lebenden Spermien unterschieden werden. Weil die lonophorverdünnungen zum Auslösen der AR sehr instabil zu sein scheinen und für die gleichzeitige Färbung mit der CD46-FITC Lösung gemischt werden müssen, können die Lösungen nicht vor Versuchsbeginn angesetzt werden, sondern müssen während der Aufarbeitung der Kapazitationsansätze hergestellt werden.
Die Spermienpellets werden im Restüberstand resuspendiert und im Wasserbad (37°C) mit 450 μl mHTF (4mM NaHCO3; 0,01% BSA; 37°C) verdünnt. 100 μl Aliquots der Spermiensuspensionen werden in vorbereitete Proben-FACS-Flow-Röhrchen pipettiert (im Wasserbad). Zu den Spermien werden 150 μl einer Lösung mit lonophor und F ITC-markiertem Anti-CD46 Antikörper pipettiert. Die Endkonzentration beträgt 80OnM lonophor und eine 1 :125 Verdünnung des Anti-CD46-Antikörpers in mHTF (4mM NaHCO3; 0,01% BSA; 37°C). Die Spermien werden darin für 30 min lichtgeschützt im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wird durch Zugabe von 3,5 ml PBS [0,1 % BSA] / Ansatz gestoppt, gefolgt von einer Zentrifugation für 5 min bei 700 x g (Raumtemperatur) und anschließendem Absaugen der Überstände. Nach der - -
Zentrifugation werden die Proben bis zur Messung auf der Wärmeplatte warmgehalten.
3.2. EhD-Färbung (zur Differenzierung der toten/lebenden akrosomal reagierten Spermien)
Die Spermienpellets werden nach dem Absaugen mit je 500 μl frisch angesetzter EhD-Lösung (150 nM EhD in PBS [w/o BSA]; 37°C) versetzt. Die Proben können anschließend am Flow Cytometer (BD Facs Calibur) vermessen werden. Die Messung erfolgt bei einer Anregungswellenlänge des Lasers von 488nm, es werden 10000 Spermien pro Messung erfasst. Akrosom reagierte Spermien werden über CD46-FITC im Filter FL-1 bei 530nm gemessen. Tote Spermien werden mittels der EhD - DNA-Färbung im Filter FL-2 bei 634nm gemessen. Die Messkanäle werden zuvor entsprechend gegeneinander kompensiert.
3.3 Auswertung
Die Spermien werden als sehr einheitliche Zellpopulation in einem FSC-H
(forward scatter) gegen SSC-H (sideward scatter) Dotblot ausgewählt. Da eine
Zweifarbenfluoreszenzfärbung genutzt wird, erfolgt die Auswertung mit Hilfe der
Quadrantenanalyse in einem FL-1 (EhD, X-Achse) vs. FL-2 (FITC-CD46, Y-
Achse) Dotblot mit der ausgewählten Spermienpopulation aus dem FSC vs SSC
Dotblot:
Zur Berechnung der % induziert akrosomal reagierter Spermien (= ,,IAR[%]") werden nur die lebenden Spermien aus Q3 und Q4 herangezogen und ihre Gesamtzahl gleich 100% gesetzt. IAR berechnet sich dann wie folgt: Ein Teii der Spermien reagiert bereits ohne ionophor∑ugabe spontan akrosoma! (= ,,SAR[%]"). Daher erfolgt immer auch eine Kontrollmessung gleichbehandelter Spermien ohne lonophorzugabe. Die SAR berechnet analog zur IAR. Die wirklich durch das lonophor ausgelöste akrosomale Reaktion ( = ,,ARIC[%]") berechnet sich als Differenz: ARIC = IAR - SAR. Für die folgende Analyse des Einflusses unserer Inhibitoren auf die sAC vermittelte Kapazitation (gemessen als Fähigkeit des Spermiums zur lonophor- induzierten akrosomalen Reaktion) wird der Prozentsatz akrosomal reagierter Spermien in der positiven Kapazitationskontrolle (= Inkubation mit mHTF- Medium mit 25mM NaHCO3; 1% BSA ohne Prüfsubstanzen) = 100% gesetzt. Die Fähigkeit der mit den Prüfsubstanzen versetzten Spermien zur akrosomalen Reaktion wird relativ zu dieser maximalen akrosomalen Reaktion angegeben.
Verwendete Materialien mHTF = modif. Human tubulär fluid (Fa. Irvine Scientific), Dulbeccos's Phosphate-Buffered-Saline (Fa. Gibco) (mit Ca2+, Mg2+, 1 g/L D-Glucose, 36 mg/L Na-Pyruvate, w/o Phenolrot, w/o NaHCO3); Rinderserumalbumin, Fraktion V (Fa. Fluka); Dimethylsulfoxid (DMSO), wasserfrei (Fa. Merck); Sodium Bicarbonate 7,5%ige Lsg.(893mM) (Fa. Irvine Scientific); Isolate- Gradient (Fa. Irvine Scientific); Ionophor-A23187 free acid, (Fa. Calbiochem); Ethidium Homodimer (EhD) (Fa. Molecular Probe), Mouse Anti Human CD46:FITC (Fa. Pharmingen).
Literaturzitat:
J. W. Carver-Ward, Human Reproduction Vol. 11 , No. 9, pp: 1923 ff, 1996 High fertilization prediction by flow cytometric analysis of the CD46 antigen on the inner acrosomal membrane of spermatozoa O. J. D'Cruz, G. G. Haas, Fertility and Sterility Vol. 65, No. 4, pp: 843 ff, 1996 Fluorescence-Iabeled fucolectins are superior markers for flow cytometric quantitation of the sperm acrosome reaction E. Nieschlag, H. M. Behre, Andrologie, Springer Verlag 1996 - -
Beispiele:
Aus der Tabelle ist zu erkennen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in Bezug auf die Inhibition der löslichen Adenylatzyklase, ausgedrückt durch den ICso-Wert, eine etwa 10-fach höhere Aktivität aufweisen als die bereits bekannten Catecholöstrogene (OH-Östradiole). Die Catecholöstrogene sind toxisch, daher sind die erfindungsgemäßen Verbindungen den bekannten Verbindungen weit überlegen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch etwa 10-fach potenter als die von Zippin vorgestellten Verbindungen.

Claims

- - Ansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I1
wobei R1 Wasserstoff, Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls mehrfach gesättigt und gegebenenfalls mehrfach substituiert ist, oder die Gruppe Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Aryl, Ci-C6-Acyl, HaIo-Ci -C6-Alkyl, Ci-C6-Alkyl-Ci-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Acyl, d -C6-ACyI-C1 -C6- Acyl, Ci-Ce-Alkyl-d-Ce-Aryl, d-C6-Aryl-d-C6-Alkyl oder CF3, in der d-Ce-Alkyl, Ci-C6-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-d-C6-Alkyl, C1-C6- Alkyl-d-Ce-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Acyl, C1-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, CrCe-Alkyl-d-Ce-Aryl oder d-C6-Aryl-d-C6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-d-Cβ-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R^ Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls mehrfach gesättigt und gegebenenfalls mehrfach substituiert ist, oder die Gruppe CrC6-Alkyl, CrC6-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-d-C6-Alkyl, d-Ce-Alkyl-d-Ce-Alkyl, d-Ce-Alkyl-d-Ce-Acyl, C1-C6-ACyI-C1-C6- Acyl, CrCe-Alkyl-d-Ce-Aryl, d-Ce-Aryl-d-Ce-Alkyl oder CF3, in der d-C6-Alkyl, CrC6-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-d-C6-Alkyl, C1-C6- Alkyl-d-C6-Alkyl, C i -C6-Al ky 1-C1-C6-ACyI, C1-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, d-C6-Alkyl-Ci-C6-Aryl oder Ci-C6-Aryl-CrC6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-CrC6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
. .
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Haiogen, Ci-C6-Alkyl oder C1-Ce-ACyI, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann, oder mit Ci-C6-Alkoxy, Hydroxy, Cyano, CO2-(Ci -C6-Alkyl), N-(C1-
C6-Alkyl)2, CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann, C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-Cβ-Alkyl, Ci-C6-Acyl, Ci- C6-AIkOXy, Hydroxy, Cyano, CO2-(Ci-C6-Alkyl), N-(C1-C6-Alkyl)2, CO-NR4R5 oder CF3 substituiert sein kann, oder
C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CF3, Hydroxy, Cyano, CO2- (Ci-Cβ-Alkyl), Ci-Cβ-Alkyl, Ci-C6-Acyl, N-(C1-C6-AIkVl)2, CO-NR4R5 oder Ci-C6-Alkoxy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Acyl, Ci-
C6-Alkoxy oder CF3 substituiert ist,
C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC6-Alkyl, C1-C6-ACyI, C1-C6-
Alkoxy, N-CrCe-Alkyl-d-Ce-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C6-Alkyl, C1-C6-ACyI, C1- Ce-Alkoxy, N-Ci-C6-Alkyl-CrC6-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
CrCe-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
R5 Wasserstoff, Ci-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, C1-
C6-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder _ _
verschieden mit Ci-C6-Alkyl, Ci-C6-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-C12-APyI, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, C1-C6-AIKyI, C1-C6-ACyI, C1-C6- Alkoxy, N-CrCe-Alkyl-d-Ce-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC6-Alkyl, C1-C6-ACyI, C1- C6-AIkOXy, N-CrCe-Alkyl-d-Ce-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
C-ι-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann, und,
R4 und R5 gemeinsam einen 5-8 gliedrigen Ring bilden, der weitere
Heteroatome enthalten kann, bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
2. Verbindungen gemäß Anspruch 1 , wobei
R1 Wasserstoff, Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, oder die Gruppe C1-
C6-Alkyl, CrCe-Aryl, C1-C6-ACyI, HaIo-C1 -C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d- C6-Alkyl, d-Ce-Alkyl-CrCe-Acyl, C1-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, C1-C6- Alkyl-CrC6-Aryl, d-C6-Aryl-d-C6-Alkyl oder CF3, in der C1-C6- Alkyl, d-Ce-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-CrC6-Alkyl, d-C6-Alkyl-CrC6-
Alkyl, d-Ce-Alkyl-CrCe-Acyl, C1-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, d-C6-Alkyl- C1-C6-Ai^l oder C1-C6-AiYl-C1 -C6-Al ky I gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl- d-Ce-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R2 Halogen, CF3, C3-C6-Cycloalkyl, oder die Gruppe d-C6-Alkyl, C1-
C6-Aryl, C1-C6-ACyI, Halo-d-C6-Alkyl, d-C6-Alkyl-d-C6-Alkyl, C1- _ _
C6-Alkyl-d-C6-Acyl, Ci-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, d -C6-Al ky 1-C1-C6-Ar/!, CrCe-Aryl-Ci-Ce-Alkyl oder CF3, in der C1-C6-AIKyI, Ci-C6-Aryl, C1- Ce-Acyi, HaIo-C1 -C6-Aikyi, d-C6-Aikyi-d-C6-Aikyi, d-C6-Alkyl-d- C6-Acyl, C1-C6-ACyI-C1-C6-ACyI, d-C6-Alkyl-d-C6-Aryl oder C1-C6- Aryl-d-C6-Alkyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff unterbrochen sein kann, oder die Gruppe Sulfonyl-CrC6-Alkyl, Sulfonamid, oder Cyano,
R3 Ce-d2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-C6-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3- Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(d-C3-Alkyl), CO-NR4R5 oder CF3 substituiert sein kann, C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und/oder Fluor, mit d-Ce-Alkyl,
C1-C3-ACyI, C1-C3-AIkOXy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(C1-C3- Alkyl), CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und/oder Fluor, CF3, Cyano, d- C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(d-C3-Alkyl), CO-
NR4R5 oder C1-C3-AIkOXy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit d-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1- C3-Alkoxy oder CF3 substituiert ist,
C6-C12-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, Ci-C3- Alkoxy, N-d-C3-Alkyl-d-C3-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, C1-C3-AIkVl, C1-
C3-Acyl, C1-C3-AIkOXy, N-Ci-C3-Alkyl-CrC3-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder d-Ce-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann, _ .
R5 Wasserstoff, CrC6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, C1- C6-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C3-Alkyl, CrC3-Acyl, C1-C3-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3- Alkoxy, N-d-C3-Alkyl-CrC3-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, CrC3-Acyl, C1- C3-Alkoxy, N-Ci-C3-Alkyl-CrC3-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder
Ci-Cβ-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
3. Verbindungen gemäß Anspruch 1 - 2, wobei
R1 Wasserstoff,
R2 C3-C6-Cycloalkyl, d-C6-Alkyl, CF3, Cyano, Brom, oder die Gruppe
-OCF3, -SO2-CH3,
R3 C6-C12-AiYl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, CrC6-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3- Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(C1-C3-Alkyl), CO-NR4R5 oder CF3 substituiert sein kann,
C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und/oder Fluor, mit d-Cβ-Alkyl, C1-C3-ACyI, Ci-C3-Alkoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(C1-C3- Alkyl), CO-NR4R5 oder mit CF3 substituiert sein kann, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Chlor und/oder Fluor, CF3, Cyano, Ci- C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, Hydroxy, N-(CH3)2, CO2-(CrC3-Alkyl), CO- NR4R5 oder C1-C3-AIkOXy substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff,
R5 Wasserstoff, CrCβ-Alkyl-Cs-Ce-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Ci-C6-Alkyl, C1- C6-Acyl, C1-C6-AIkOXy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit C1-C3-A^yI, C1-C3-ACyI, C1-C3-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-C12-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3- Alkoxy, N-d-Cs-Alkyl-d-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, C^Cs-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1- C3-Alkoxy, N-CrCrAlkyl-d-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder Ci-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeuten, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
4. Verbindungen gemäß Anspruch 1 - 3, wobei
R1 Wasserstoff, _ -
R2 C3-C6-Cycloalkyl, CrC6-Alkyl, CF3, Cyano, Brom, oder die Gruppe
-OCF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht,
R3 C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, Acetyl, Methoxy,
Ethoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2) CO2-(Ci-C3-Alkyl), CO-NHR5 oder CF3 substituiert sein kann,
C5-Ci2-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit Chlor und/oder Fluor, mit CrC3-Alkyl, Acetyl, Methoxy, Ethoxy, Cyano, Hydroxy, N-(CH3)2) CO2-(C1-C3-
Alkyl), CO-NHR5 oder mit CF3 substituiert sein kann,
C3-C6-Cycloalkyl,
R4 Wasserstoff,
R5 Wasserstoff, Ci-C6-Alkyl-C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit d-C6-Alkyl, C1- C6-Acyl, Ci-C6-Alkoxy oder CF3 substituiert ist, C3-C6-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit d-C3-Alkyl, Ci-C3-Acyl, C1-C3-AIkOXy oder CF3 substituiert ist,
C6-Ci2-Aryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, d-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1-C3- Alkoxy, N-d-C3-Alkyl-d-C3-Alkyl, CF3 oder Cyano substituiert ist, oder
C5-C12-Heteroaryl, welches gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit Halogen, Ci-C3-Alkyl, C1-C3-ACyI, C1- C3-AIkOXy, N-d-Cs-Alkyl-d-Cs-Alkyl, CF3 oder Cyano, substituiert ist, oder Ci-C6-Alkyl, welches beliebig substituiert sein kann,
bedeutet, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze. - -
5. Verbindungen gemäß Anspruch 1 - 4, wobei
R1 Wasserstoff,
R^ tertiär Butyl, iso-Propyl, iso-Butyl, sek. Butyl, Cyano, Brom, oder die Gruppe -0-CF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht,
RJ die Gruppe
RA Wasserstoff, R5 Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)m-N-(CH3)2, -(CH2)2-CH3, - (CHa)2-NH-COCH3, -(CH2)-CHCH3-OH, -(CHz)2-O-CH3,
-(CHz)2-OH, -CHCH3-CH2-OH, wobei m = 1-3 ist,
bedeutet, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
6. Verbindungen gemäß Anspruch 1 - 5, wobei
R1 Wasserstoff,
R' tertiär Butyl, iso-Propyl, iso-Butyl, sek. Butyl, Cyano, Brom, oder die Gruppe -0-CF3, -SO2-CH3 bedeutet und in para-Stellung steht, RJ die Gruppe
R4 Wasserstoff
RS Wasserstoff oder die Gruppe, -(CH2)-CHCH3-OH, -(CH2) 2-O-CH3, -CHCH3-CH2-OH,
bedeutet, sowie deren Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze.
7. Verbindungen gemäß Anspruch 1-6, ausgewählt aus einer Gruppe, die folgende Verbindungen enthält:
1. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid 2. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure(2- morpholin-4-yl-ethyl)-amid 3. (±)-5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure-(2- hydroxy-1 -methyl-ethyl)-amid - -
4- . (±)-5-(4-tert.-Butyl-pheπylsulfamoyl)-3-phenyl-1 H-indol-2-carbonsäure-(2- hydroxy-propyl)-amid δ. δ-(4-iert.-Butyi-phenyisuifamoyi)-3-(3-fiuor-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid 6. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-fluor-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(2-morpholin-4-yl-ethyl)-amid
7. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-methoxy-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(tetrahydro-pyran-4-yl)-amid
8. 5-(4-tert.-Butyl-phenylsulfamoyl)-3-(3-methoxy-phenyl)-1 H-indol-2- carbonsäure(2-morpholin-4-yl-ethyl)-amid
9. S-^-tert.-Butyl-phenylsulfamoyO-S-phenyM H-indol^-carbonsäureCpyridin^- yl)-amid
8. Arzneimittel, die mindestens eine der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1-7 enthalten.
9. Arzneimittel gemäß Anspruch 8, in denen die Verbindung der allgemeinen Formel 1 in einer wirksamen Dosis enthalten ist.
10. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß den Ansprüchen 1-7 für die Herstellung von Arzneimittels.
11. Arzneimittel gemäß Anspruch 10 für die Behandlung von Erkrankungen.
12. Arzneimittel gemäß Anspruch 11 , wobei die Erkrankungen verursacht werden durch Störungen im cAMP Stoffwechsel.
13. Arzneimittel gemäß Anspruch 10 für die Kontrazeption.
14. Arzneimittel gemäß Anspruch 10 zur Inhibition der löslichen Adenylatzyklase. _ _
15. Arzneimittel gemäß Anspruch 10 -14 mit geeigneten Formulierungs- und Trägerstoffen.
16. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1-7 in Form eines pharmazeutischen Präparates für die enterale, parenterale, vaginale und orale Applikation.
17. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel II,
worin R1, R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen haben, und R6 ein Wasserstoff oder ein CrCβ-Akylrest sein kann, mit einem Amin der allgemeinen Formel III
R5
HN
R4 (III) nach Spaltung gegebenenfalls benötigter Schutzgruppen zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) umgesetzt wird.
18. Zwischenprodukte der allgemeinen Formel (II)
worin R1, R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen haben, und R6 ein Wasserstoff oder ein CrC6-Akylrest sein kann, - -
der allgemeinen Formel (V)
und der allgemeinen Formel (VII)
(VII).
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