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EP1960773A2 - Procede de caracterisation d'un element biochimique presentant une activite biologique, par analyse des signaux electromagnetiques de basses frequences - Google Patents

Procede de caracterisation d'un element biochimique presentant une activite biologique, par analyse des signaux electromagnetiques de basses frequences

Info

Publication number
EP1960773A2
EP1960773A2 EP06841939A EP06841939A EP1960773A2 EP 1960773 A2 EP1960773 A2 EP 1960773A2 EP 06841939 A EP06841939 A EP 06841939A EP 06841939 A EP06841939 A EP 06841939A EP 1960773 A2 EP1960773 A2 EP 1960773A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nanometers
porosity
analysis
characterizing
electromagnetic signals
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06841939A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Luc Montagnier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36754265&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EP1960773(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1960773A2 publication Critical patent/EP1960773A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • G01N37/005—Measurement methods not based on established scientific theories
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to the field of the characterization of biochemical material from microorganisms or their structural or molecular components, by the analysis of the electromagnetic signals generated after filtration, and preferably after dilution.
  • the European patent EP0701695 describes a method and a transmission device in the form of a signal characteristic of the manifestation of the biological activity or the specific biological behavior of a given substance. It also describes a treatment of such a signal, from a first carrier material having said biological activity to a second material physically separated from the first material and initially free from any physical presence of said determined substance, and a material obtained by such a method.
  • This method of the prior art comprises the amplification of the electrical or electromagnetic signal emitted by the first substance, and captured by a sensor, and the transmission to a transmitter, of a signal characteristic of the manifestation of the biological activity or the biological behavior presented by the first material, then the detection in the second material of a signal characteristic of the manifestation of the biological activity specific to said determined substance and transmitted to this second material via the high gain amplification means.
  • the object of the present invention is to make improvements to this technique in order to extend its scope and performance.
  • the invention relates, in its most general sense, to a method of characterizing a biochemical element exhibiting a biological activity, by analyzing the low frequency electromagnetic signals emitted by a solution prepared from a sample of the biological material to be analyzed, characterized in that it comprises a preliminary filtration step.
  • the sample is filtered through a filter having a porosity less than or equal to 150 nanometers prior to the analysis step, and in particular a porosity of between 20 nanometers and 100 nanometers.
  • the dilution step consists of a dilution of between 10 -2 and 10-20 and in particular of between 10 -2 and 10-9 .
  • the method comprises a strong stirring step and / or a centrifugation step.
  • an excitation of the solution is carried out by a white noise during the acquisition of the electromagnetic signals.
  • the invention relates in particular to the application of the characterization method for the analysis of microorganisms.
  • the invention also relates to a biological inhibition method of recording at least one signature obtained by the application of the characterization method to at least one known biochemical element, and to applying to a sample an inhibition signal according to said signature. .
  • an equipment for biological analysis comprising a sensor for the acquisition of electromagnetic signals emitted by a solution by the implementation implementation of the characterization method according to the invention, a circuit for processing said signals for calculating a signature of an analyzed sample and a comparison circuit of the signature thus calculated with a signature database previously recorded.
  • FIG. 1 represents a schematic view of the signal acquisition equipment
  • FIG. 2 represents a view of the electrical signals generated by the solenoid in the absence of emitting source (background noise);
  • FIGS. 3 and 4 represent views of the electrical signals generated by the solenoid in the presence of an emitting source (M. Pirum) after filtration of 0.02 micrometer and 0.1 micrometer, respectively;
  • M. Pirum emitting source
  • FIG. 5 represents a three-dimensional histogram of the distribution of the wavelengths detected by the solenoid in the absence of emitting source (background noise);
  • FIG. 6 represents a three-dimensional histogram of the wavelength distribution detected by the solenoid in the presence of an emitting source (M. Pirum) after filtration of 0.02 micrometer;
  • FIG. 7 represents the Fourier analysis of the same background noise (unfiltered electric power supply harmonics).
  • FIG. 8 represents the Fourier analysis of the signal generated by the solenoid in the presence of a transmitting source (M. Pirum);
  • FIG. 9 represents a schematic view of the amplification device for the application of a previously recorded signal.
  • Mycoplasma Mycoplasma pirum (M. pirum)
  • a culture of M.pirum in CEM cells is prepared in 1640 culture medium + 10% fetal calf serum. Cells in good condition, show the presence of typical aggregates related to the presence of M. pirum.
  • the suspension is centrifuged at low speed for eliminate the cells.
  • the supernatant is filtered through a Millipore PEVD filter (trade name) 0.45 ⁇ , and the filtrate is filtered again on Whatman Anotop (trade name) 0.02 ⁇ filter or Millipore (trade name) 0, 1 ⁇ .
  • FIG. 1 represents a schematic view.
  • the equipment comprises a solenoid reading cell (1) sensitive from 0 to 20000 hertz, placed on a table of insulating material.
  • the solutions to be read are distributed in Eppendorf conical plastic tubes (2) of 1.5 milliliters.
  • the volume of liquid is generally 1 milliliter, in some cases from 0.3 to 0.5 milliliter, without a difference in response being noted.
  • Each sample is read for 6 seconds, twice in succession, each reading being entered separately.
  • the electrical signals delivered by the solenoid are amplified by means of an audio card (4) to a computer (3) whose appropriate software gives a visual representation of the recordings:
  • FIGS. 2, 3 and 4 An overall gross amplitude representation is shown in FIGS. 2, 3 and 4.
  • a background noise (-) is observed (FIG. 2), converted into an average.
  • a positive signal is detected when the amplitude exceeds at least 1.5 times the background noise, defined as (+).
  • the amplitude detected is double the background noise (++), sometimes the triple: the detected signal will be called the electromagnetic signal SEM.
  • FIGS. 5 and 6 A histogram analysis in 3d respectively of the background noise and the signal in the presence of the sample is represented in FIGS. 5 and 6.
  • FIG. 2 is the gross overall representation in amplitude of the detected signal.
  • FIG. 3 is the overall gross amplitude representation of the detected signal: a clear difference is observed.
  • the solution from the suspension of mycoplasma is (++) up to the dilution 10 "7.
  • the uninfected CEM control is (-).
  • a complementary experiment, performed a few hours later starting from the dilution 10 " 6 allows to regain a positivity (++) up to the dilution 10 "14 and (+) to 10 " 15 .
  • Dilutions 10 "6 and 10 ⁇ 7 of the first experiment remain (++) after several hours at 20 ° C.
  • FIG. 4 is the gross overall representation in amplitude of the detected signal.
  • the filtrate M.pirum is (++) until dilution 10 ⁇ 7 .
  • the controls are all negative except for 1 reading of the dilution 10 " 2.
  • the 8 control tubes are close to the M.pirum tubes, placed in the same plastic rack The positivity of one of the tubes can be explained by the passing signals from one tube to another through their walls.
  • Centrifugation is carried out for 2 hours at 35,000 rpm for +4 ° C. The first 0.02 / J filtrate is kept overnight at + 4 ° C. It is checked that it is always positive just before centrifugation.
  • fractions 2 to 2. They are diluted to 10 -7 in RPMI + 16/40 calf serum concentration of 10%.
  • the negativity of the less diluted fractions can be explained by an auto-interference of the signals emitted by too many sources. This autoinhibition is verified by mixing 0.1 milliliter of undiluted with 0.4 ml of the dilution 10 ⁇ 4 : after vortex, there is actually a signal extinction which becomes negative.
  • the source of the electromagnetic signals behaves like a large polymer (but ⁇ 0.02 ⁇ ) and density between 1.16 and 1.26.
  • This experiment concerns a culture of HIV1 / IIIB infected CEM cells prepared in two culture times:
  • CPE cyto-pathogenic effect
  • the operating protocol comprises the following steps:
  • the supernatant of the 0.02 micron filtered positive culture is centrifuged at the 20-70% sucrose gradient density equilibrium at 35000 rpm in BECKMANN (trade name) rotor SW56 at 4 ° C.
  • a control supernatant of uninfected CEM cells is treated in the same way.
  • the 400 ml fractions are diluted in RPMI 16/40 medium plus calf serum. Successive dilutions are performed 10 to 10 from these fractions.
  • the density groups 1.23 - 1.24 and density 1.19-1.21 are very positive until the dilution 10 " 7.
  • the density group 1.15-1.16 gives positive signals. until dilution 10 '7.
  • the top group of the tube does not give any signal, regardless of the dilution.
  • Fractional groups at the bottom of the tube (density 1.25 to 1.28) give positive signals at only a few dilutions.
  • FIG. 9 represents a schematic view of the equipment, comprising a computer 3 equipped with a sound card (4) whose output is connected to an amplifier (10) with a maximum power of 60 watts, in the example described .
  • the amplified signal is applied to a flexible solenoid (11) into which the Eppendorf tube (12) is immersed.
  • the applied signal is measured with equipment (13).
  • Experiment 4 Plasma analysis of subjects with different infections (HIV, ureaplasma urolyticum urethritis, rheumatoid arthritis).
  • Microorganisms of different types such as retroviruses (HIV), bacteria without rigid walls close to Gram + (M.pirum), bacteria with rigid walls Gram - (E. coli) produce persistent nanostructures in solutions aqueous.
  • HIV retroviruses
  • M.pirum bacteria without rigid walls close to Gram +
  • E. coli bacteria with rigid walls Gram -
  • these nanostructures After the indispensable filtration step, which will eliminate the physical particles of micro-organisms, these nanostructures (smaller than 100 nanometers) emit complex electromagnetic signals of low frequencies that can be recorded and digitized.
  • nanostructures differ from the microorganisms that generated them by their broad density spectrum, and their susceptibility to freezing.
  • the signals they emit can be neutralized by auto-interference with signals previously recorded and inverted in phase, or by allo-interference with signals from other microorganisms.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de caractérisation d'un élément biochimique présentant une activité biologique, par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir d'un échantillon du matériel biologique à analyser caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable de filtration.

Description

PROCEDE DE CARACTÉRISATION D'UN ÉLÉMENT BIOCHIMIQUE
PRÉSENTANT UNE ACTIVITÉ BIOLOGIQUE, PAR ANALYSE DES SIGNAUX
ÉLECTROMAGNÉTIQUES DE BASSES FRÉQUENCES
La présente invention concerne le domaine de la caractérisation de matériel biochimique provenant de microorganismes ou de leurs composants structuraux ou moléculaires, par l'analyse des signaux électromagnétiques générés après filtration, et préférentiellement après dilution.
Il est connu d'après les travaux du Professeur Jacques BENVENISTE d'enregistrer et de numériser avec une carte-son d'ordinateur l'activité spécifique d'une molécule à activité biologique. Les molécules analysées dans l'art antérieur sont une substance naturelle (histamine, caféine, nicotine, adrénaline...) ou des médicaments.
On a proposé dans l'art antérieur de capter ce signal, et de le transmettre sous une forme analogique ou de préférence numérique.
Dans le cadre de ces travaux, le brevet européen EP0701695 décrit un procédé et un dispositif de transmission sous forme d'un signal caractéristique de la manifestation de l ' activité biologique ou du comportement biologique spécifique à une substance déterminée. Il décrit également un traitement d'un tel signal, à partir d'une première matière porteuse présentant ladite activité biologique à une deuxième matière physiquement séparée de la première matière et initialement exempte de toute présence physique de ladite substance déterminée, et d'une matière obtenue par un tel procédé . Ce procédé de l ' art antérieur comporte l'amplification du signal électrique ou électromagnétique émis par la première substance, et capté par un capteur, et la transmission à un émetteur, d'un signal caractéristique de la manifestation de l ' activité biologique ou du comportement biologique présentée par la première matière, puis la détection dans la seconde matière d'un signal caractéristique de la manifestation de l ' activité biologique spécifique à ladite substance déterminée et transmis à cette deuxième matière par l ' intermédiaire des moyens d'amplification à haut gain.
On connaît également le brevet français FR2811591 décrivant un procédé pour produire des signaux, notamment des signaux électriques, caractéristiques de l'activité biologique et/ou chimique d'une substance étudiée, pour traiter une substance réceptrice ne présentant initialement aucune activité biologique particulière, notamment de l'eau, de telle sorte qu'elle présente après traitement une activité biologique. La substance réceptrice après traitement est appelée ci-après la "Substance Traitée" (ou encore Matière Informée). Quand la substance réceptrice est de l'eau, la Substance Traitée est appelée de l'Εau Traitée" (ou encore de l'Eau Informée). La substance ayant une activité biologique peut également se présenter sous la forme de préparation ou de granules homéopathiques.
La demande de brevet internationale WOOOO1412 décrit un procédé pour activer une solution inactive et à très faible concentration d'une substance déterminée biologique et/ou chimique dans un solvant, consistant à placer ladite solution dans un champ d'excitation mécanique et à soumettre ladite solution à une agitation pour créer ledit champ d'excitation mécanique. La concentration de ladite substance déterminée dans ladite solution est inférieure à 10"6 moles par litre.
Le but de la présente invention est d'apporter des améliorations à cette technique afin d'en étendre le champ d'application et les performances.
À cet effet, l'invention concerne selon son acception la plus générale un procédé de caractérisation d'un élément biochimique présentant une activité biologique, par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir d'un échantillon du matériel biologique à analyser caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable de filtration.
De préférence, l'échantillon est filtré à travers un filtre présentant une porosité inférieure ou égale à 150 nanomètres préalablement à l'étape d'analyse, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres .
Avantageusement, l'étape de dilution consiste en une dilution comprise entre 10"2 et 10"20 et en particulier compris entre 10"2 et 10~9.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comporte une étape d'agitation forte et/ou une étape de centrifugation.
On procède selon un mode de réalisation préféré à une excitation de la solution par un bruit blanc pendant l'acquisition des signaux électromagnétiques.
L'invention concerne notamment l'application du procédé de caractérisation pour l'analyse de microorganismes .
Elle concerne également l'analyse biologique consistant à enregistrer les signatures obtenues par l'application du procédé de caractérisation à des éléments biochimiques connus, et à comparer la signature obtenue à celle d'un élément biochimique à caractériser avec les signatures préalablement enregistrées .
L'invention concerne également un procédé d'inhibition biologique consistant à enregistrer au moins une signature obtenue par l'application du procédé de caractérisation à au moins un élément biochimique connu, et à appliquer à un échantillon un signal d'inhibition fonction de ladite signature.
Elle concerne encore un équipement pour l'analyse biologique comportant un capteur pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par une solution par la mise en oeuvre du procédé de caractérisation selon l'invention, un circuit de traitement desdits signaux pour le calcul d'une signature d'un échantillon analysé et un circuit de comparaison de la signature ainsi calculée avec une base de signatures enregistrées préalablement.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, se référant aux dessins annexés correspondant à des exemples non limitatifs de réalisation, où : la figure 1 représente une vue schématique de l'équipement d'acquisition des signaux ; la figure 2 représente une vue des signaux électriques générés par le solénoïde en l'absence de source émettrice (bruit de fond) ;
- les figures 3 et 4 représentent des vues des signaux électriques générés par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) après filtration respectivement de 0,02 micromètre et de 0,1 micromètre ;
- la figure 5 représente un histogramme en trois dimension de la distribution des longueurs d'onde détectées par le solénoïde en l'absence de source émettrice (bruit de fond) ;
- la figure 6 représente un histogramme en trois dimension de la distribution des longueurs d'onde détectées par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) après filtration de 0,02 micromètre ;
- la figure 7 représente l'analyse de Fourier du même bruit de fond (les harmoniques du courant électrique d'alimentation non filtrées) ;
- la figure 8 représente l'analyse de Fourier du signal généré par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) ; la figure 9 représente une vue schématique du dispositif d'amplification pour l'application d'un signal précédemment enregistré. Dans ce qui suit, on conviendra :
* Que les organismes vivants sont en suspension dans le milieu de culture in vitro ou in vivo dans les prélèvements sanguins, en particulier un plasma prélevé sous anti-coagulant de préférence héparine.
* Que les nanostructures émettrices de signaux sont isolées à partir des milieux de culture ou du plasma filtrés pour éliminer tout organisme vivant (0,45 micromètre puis 0,1 micromètre ou 0,02 micromètre pour les bactéries, 0,45 micromètre puis 0,02 micromètre pour les virus.
* Que les signaux électromagnétiques sont enregistrés sur ordinateur et donnent lieu à diverses représentations :
- Globales, mesurées sur 6 secondes deux fois de suite, le signal étant considéré comme positif lorsque son amplitude atteint au moins 1,5 fois celui du bruit de fond
- en analyse sous forme d'histogramme en trois dimensions
- en analyse par transformation de Fourier.
La présente description expose la mise en œuvre d'un exemple de procédé selon l'invention, pour la caractérisation de trois exemples de micro-organismes, par l'analyse des signaux émis :
- Le mycoplasme Mycoplasma pirum (M. pirum)
- Le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), souche IUB (LAI)
- La bactérie Escherichia CoIi K12 (E. coli)
- Le plasma de patients infectés par le VIH. Expérience 1 : Application à une culture de M.pirum en cellules CEM.
Une culture de M.pirum en cellules CEM est préparée dans un milieu de culture rpmi 1640+10% de sérum de veau fœtal. Les cellules en bon état, montrent la présence d'agrégats typiques liés à la présence de M. pirum.
La suspension est centrifugée en basse vitesse pour éliminer les cellules. Le surnageant est filtré sur filtre Millipore PEVD (nom commercial) 0,45μ, puis le filtrat est filtré à nouveau sur filtre Whatman Anotop (nom commercial) 0,02μ ou Millipore (nom commercial) 0,lμ.
On compare avec un surnageant de cellules CEM non infectées , filtré dans les mêmes conditions. Les solutions sont diluées de 10 en 10 en rpmi complet sous hotte à flux laminaire jusqu'à 10-7. On traite au Vortex (puissance maximale) pendant 15 secondes chaque solution avant la dilution suivante.
La détection des signaux est réalisée avec un équipement dont la figure 1 représente une vue schématique. L'équipement comprend une cellule solénoïde de lecture (1) sensible de 0 à 20000 hertz, placée sur une table en matière isolante. Les solutions à lire sont distribuées dans des tubes en plastique (2) coniques Eppendorf (nom commercial) de 1,5 millilitre. Le volume de liquide est en général de 1 millilitre, dans quelques cas de 0,3 à 0,5 millilitre, sans qu'une différence de réponse soit notée. Chaque échantillon est lu pendant 6 secondes, deux fois de suite, chaque lecture étant saisie séparément.
Les signaux électriques délivrés par le solénoxde sont amplifiés grâce à une carte audio (4) jusqu'à un ordinateur (3) dont des logiciels appropriés donnent une représentation visuelle des enregistrements :
Une représentation globale brute en amplitude est montrée en figure 2, 3 et 4. Un bruit de fond (-) est observé (figure 2), transformé en moyenne. Un signal positif est détecté lorsque l'amplitude dépasse au moins 1,5 fois le bruit de fond, défini comme (+). En général l'amplitude détectée est le double du bruit de fond (++), parfois le triple : le signal détecté sera appelé signal électromagnétique SEM.
- Une analyse par histogramme en 3d respectivement du bruit de fond et du signal en présence de l'échantillon est représentée figure 5 et 6.
- Une décomposition en fréquences individuelles par transformation de Fourier respectivement du bruit de fond et du signal en présence de l'échantillon est représentée en figure 7 et 8.
Résultats :
1°) Émission des SEM
Suspension non filtrée : on note un bruit de fond (-) dans le témoin non infecté et dans la suspension infectée. La figure 2 est la représentation globale brute en amplitude du signal détecté.
Solution filtrée 0,02 micromètre. La figure 3 est la représentation globale brute en amplitude du signal détecté: on observe une différence nette. La solution provenant de la suspension de mycoplasmes est (++) jusqu'à la dilution 10"7. Le témoin CEM non infecté est (-). Une expérience complémentaire, effectuée quelques heures plus tard à parti de la dilution 10"6 permet de retrouver une positivité (++) jusqu'à la dilution 10"14 et ( + ) à 10"15. Les dilutions 10"6 et 10~7 de la première expérience restent (++) après plusieurs heures à 20°C.
Solution filtrée à O.lμ. La figure 4 est la représentation globale brute en amplitude du signal détecté. Le filtrat M.pirum est (++) jusqu'à la dilution 10~7. les témoins sont tous négatifs sauf 1 lecture de la dilution 10" 2. À noter que les 8 tubes témoins sont proches des tubes M.pirum, placés dans le même portoir plastique. La positivité d'un des tubes peut s'expliquer par le passage des signaux d'un tube à l'autre à travers leurs parois.
L'analyse de Fourier des fréquences positives a montré divers pics à par ordre d'intensité décroissante : 1000, 2000, 3000, 1999, 999, 2999, 500, 399, 300, 900, pour 10"6 et 10"7 (tout ceci au filtrat 0,02).
L'analyse en 3D (figure 6), montre un déplacement vers les plus hautes fréquences chez les positifs (+) Expérience 2 ; Comportement de la source de SEM en centrifugation à l'équilibre de densité en gradient de saccharose 20-70% en PBS sans Ca++ ni Mg++.
On procède à une centrifugation pendant 2h à 35000 tours par minutes à +40C. On part du premier filtrat 0.02/J conservé pendant une nuit à +4°C. On vérifie qu'il est toujours positif juste avant la centrifugation.
Après cette centrifugation, on collecte 12 fractions à partir du fond du tube. La mesure des indices de réfraction permet de déterminer le gradient de densité.
On regroupe ensuite les fractions 2 à 2. On les dilue jusqu'à 10~7 en milieu RPMI 16/40 + sérum de veau à concentration de 10%.
Pool 1-2 densité 1,26- Pool 3-4 densité 1,25-1,26
1,28
(-) à toutes dilutions Non dilué (-)
10"1 (-)
102 (+)
10-3 (-)
10"4 (++)
ÎO"5 (++)
10"6 (++) lu"7 (-)
La négativité des fractions les moins diluées peut s'expliquer par une auto-interférence des signaux émis par des sources trop nombreuses. On vérifie cette autoinhibition en mélangeant 0,1 millilitre du non dilué à 0,4 ml de la dilution 10~4 : après vortex, on observe effectivement une extinction du signal qui devient négatif.
Pool 5-6 Pool 7-8 densité 1,2 1-1,225 densité 1,165- 1,194
Non dilué (-) Non dilué (-) lu"1 (-) ÎO"1 (-) lu"2 (-) io-2 (-)
On constate que la source des signaux électromagnétiques se comporte comme un polymère de grande taille (mais <0,02μ) et de densité située entre 1,16 et 1,26.
Il existe par ailleurs un effet de zone qui n'avait pas été vu avec la préparation brute non centrifugée. Il y a auto-interférence pour les dilutions jusqu'à 10~4 au pic d'activité (5-6 et 7-8).
Expérience 3 : Application à une culture de cellules CEM infectées VIH1/IIIB
Cette expérience porte sur une culture de cellules CEM infectées par le VIH1/IIIB, préparé en deux temps de culture :
- 4 jours : début de l'effet cyto-pathogène (CPE)
- 6 jours : effet CPE ++
Elle est comparée avec une culture témoin de CEM non infectée .
Le protocole opératoire comporte les étapes suivantes :
- filtration du surnageant à 0,45 micromètre - puis filtration à 0,02 micromètre
- dilution du filtrat de 10 en 10 jusqu'à 10"7 en milieu RPMI + sérum de veau
- agitation forte au vortex 15 secondes à chaque étape de dilution.
Résultats :
1) avec la culture de 4 jours, on n'observe aucun signal au-dessus du bruit de fond. Il n'y a pas de différence avec le témoin CEM non infecté jusqu'à dilution io-7
2 ) avec la culture infectée de 6 jours :
10"1 à 10"5 (-) 10"6 (++) 10"7 (++)
10"8 (++) 10-9 10-is (-)
On refait une expérience d'auto-interférence :
0,1 ml de la solution 10"1 (négative) + 0,4 ml de la solution 10~7 (positive) : cette dernière devient négative. Il y a donc bien auto-interférence aux faibles dilutions.
3 ) Analyse en gradient de densité
Le surnageant de la culture positive filtré à 0,02 micromètre est centrifugé à l'équilibre de densité en gradient de saccharose 20-70% à 35000 tours par minute en rotor BECKMANN (nom commercial) SW56 à 4° C.
Un surnageant témoin de cellules CEM non infectées est traité de la même façon.
Après centrifugation, 13 fractions sont collectées et regroupées 2 à 2. Les indices de réfraction de certaines fractions sont déterminées avec un réfractomètre ABBE (nom commercial) pour déterminer le gradient de densité.
Les fractions de 400 ml sont diluées en milieu RPMI 16/40 plus sérum de veau. Des dilutions successives sont effectuées de 10 en 10 à partir de ces fractions.
On constate que les groupes de densité 1,23 — 1,24 et densité 1,19-1,21 sont très positifs jusqu'à la dilution 10" 7. Le groupe de densité 1,15-1,16 donne des signaux positifs jusqu'à la dilution 10'7. Le groupe du haut du tube ne donne pas de signaux, quelle que soit la dilution.
Les groupes de fraction du bas du tube (densité 1,25 à 1,28) donnent de signaux positifs à seulement quelques dilutions .
Contrairement à M. pirum, il y a auto-interférence pour le filtrat de départ et pas d'auto-interférence à partir des fractions du gradient.
La majorité des signaux dans ce cas se concentre, comme chez M. pirum, dans les fractions de densité de 1,19 à 1,26, avec cependant une épaule vers les fractions plus légères de 1,16.
Expérience 5 : Essai d'inactivation de la source de SEM de M. Pirum
On place dans un tube Eppendorf un millilitre d'un filtrat 0,02 micromètre de M. Pirum à la dilution 10"1 Ce tube est placé dans un solénoïde alimenté pendant 10 minutes par le signal électrique brut enregistré précédemment sur une préparation de M. Pirum à la même dilution, après amplification.
La figure 9 représente une vue schématique de l'équipement, comportant un ordinateur 3 muni d'une carte son (4) dont la sortie est reliée à un amplificateur (10) d'une puissance maximale de 60 watts, dans l'exemple décrit. Le signal amplifié est appliqué à un solénoïde flexible (11) dans lequel est plongé le tube Eppendorf (12). Le signal appliqué est mesuré avec un équipement (13).
Différents types de signaux amplifiés sont appliqués pendant 10 minutes à la suspension de M. Pirum qui donnait un signal positif. a) Ce même signal, mais amplifié : le signal de départ reste positif. Par contre, un tube témoin contenant le filtrat 0,02 micromètre des cellules CEM non infectées qui était négatif, devient positif. Ceci suggère que l'on peut transmettre les signaux électromagnétiques dans un milieu non activé, sous réserve que le spectre initial n'ait pas été modifié. b) Si l'on choisit dans le spectre des signaux électromagnétiques émis par les nanostructures de M. Pirum les fréquences de plus grande intensité (179, 374, 624, 1000, 2000 Hertz), le signal reste également positif, après application de ces fréquences amplifiées. c) Par contre, si l'on applique ces mêmes signaux, mais en inversion de phase, la positivité SEM disparaît.
Ceci est également le cas lorsqu'on utilise la totalité des SEM émis par M. Pirum en inversion de phase . d) II est également possible de neutraliser les signaux par allo-interférence, c'est-à-dire par des signaux provenant d'un autre micro-organisme (colibacille) .
Expérience 4 : analyse du plasma de sujets atteints par différentes infections (VIH, urétrite à Uréaplasma urolyticum, polyarthrite rhumatoïde).
Cette analyse indique que ces plasmas, une fois filtrés et dilués convenablement, sont émetteurs de signaux analogues à ceux émis par les mêmes micro-organismes in vitro, à l'exception de la polyarthrite où la cause infectieuse n'a pas encore été identifiée.
En particulier, dans le cas de sujets atteints de Sida et traités par trithérapie anti-rétrovirale, ces signaux sont émis par de hautes dilutions du plasma (jusqu'à 10"16), suggérant qu'ils existent en abondance après disparition de la charge virale plasmatique et pourraient contribuer à l'infection résiduelle persistant au traitement.
CONCLUSION GÉNÉRALE
Des micro-organismes de nature différente, tels que des rétrovirus (VIH), des bactéries sans parois rigides proches des Gram + (M.pirum), des bactéries avec parois rigides Gram — (E.coli) produisent des nanostructures persistant dans des solutions aqueuses.
Après l'étape indispensable de filtration, qui va éliminer les particules physiques des micro-organismes, ces nanostructures (de taille inférieure à 100 nanomètres) émettent des signaux électromagnétiques complexes de basses fréquences qui peuvent être enregistrés et numérisés.
Les mêmes résultats peuvent être obtenus à partir du plasma de sujets infectés par ces micro-organismes.
Ces nanostructures diffèrent des micro-organismes qui les ont générés par leur large spectre de densité, et leur sensibilité à la congélation. Les signaux qu'elles émettent peuvent être neutralisés par auto-interférence avec les signaux préalablement enregistrés et inversés en phase, ou par allo-interférence avec les signaux provenant d'autres micro-organismes .

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique présentant une activité biologique, par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir d'un échantillon du matériel biologique à analyser caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable de filtration.
2 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape d'analyse, l'échantillon est filtré à travers un filtre présentant une porosité inférieure à 150 nanomètres.
3 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 2, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape d'analyse, l'échantillon est filtré à travers un filtre présentant une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres.
4 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape de dilution consiste en une dilution comprise entre 10"2 et 10"20.
5 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le niveau de dilution est compris entre 10"2 et 10"9.
6 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'agitation forte.
7 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de centrifugation.
8 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on procède à une excitation de la solution par un bruit blanc pendant l'acquisition des signaux électromagnétiques.
9 — Application du procédé de caractérisation selon l'une au moins des revendications précédentes pour l'analyse de micro-organismes .
10 — Procédé de caractérisation d'un élément biochimique consistant à :
- enregistrer les signatures obtenues par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir des échantillons biologiques connus après une étape préalable de filtration, avec un filtre présentant une porosité inférieure ou égale à 150 nanomètres préalablement à l'étape d'analyse, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres ,
- enregistrer les signatures obtenues par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir des échantillons biologiques à caractériser après une étape préalable de filtration avec un filtre présentant une porosité inférieure ou égale à 150 nanomètres préalablement à l'étape d'analyse, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres .
- et à comparer la signature de l'élément à caractériser avec les signatures préalablement enregistrées. 11 — Application du procédé de caractérisation conforme à la revendication 1 pour l'inhibition biologique caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'enregistrement d'au moins une signature d'un élément biochimique présentant une activité biologique consistant à analyser les signaux électromagnétiques de basses fréquences émis par une solution préparée à partir d'un échantillon du matériel biologique connu après une étape préalable de filtration avec un filtre présentant un porosité inférieure ou égale à 150 nanomètres préalablement à l'étape d'analyse, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres et une étape d'application à un échantillon d'un signal d'inhibition fonction de ladite signature.
12 — Équipement pour la caractérisation d'un élément biochimique selon le procédé de la revendication 1, ledit équipement comportant un moyen pour la préparation d'une solution à partir d'un échantillon avec un filtre présentant un porosité inférieure ou égale à 150 nanomètres préalablement à l'étape d'analyse, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres, un capteur pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par une solution, un circuit de traitement desdits signaux pour le calcul d'une signature d'un échantillon analysé et un circuit de comparaison de la signature ainsi calculée avec une base de signatures enregistrées préalablement.
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