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EP1576357A1 - Lecteur de puces de type biopuces, et procedes associes - Google Patents

Lecteur de puces de type biopuces, et procedes associes

Info

Publication number
EP1576357A1
EP1576357A1 EP03813936A EP03813936A EP1576357A1 EP 1576357 A1 EP1576357 A1 EP 1576357A1 EP 03813936 A EP03813936 A EP 03813936A EP 03813936 A EP03813936 A EP 03813936A EP 1576357 A1 EP1576357 A1 EP 1576357A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
temperature
chip
excitation
molecules
laser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03813936A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Françoise Soussaline
Elena Khomyakova
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Original Assignee
IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS filed Critical IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Publication of EP1576357A1 publication Critical patent/EP1576357A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
    • G01N2201/121—Correction signals
    • G01N2201/1211—Correction signals for temperature

Definitions

  • the present invention relates generally to the reading and interpretation of chips and more particularly to the detection of hybrids marked by signal generating molecules, such as fluorophores, and formed between the molecules constituting these chips and molecules or cells originating from 'biological or chemical samples.
  • signal generating molecules such as fluorophores
  • the invention thus relates according to a first aspect to a device for reading and analyzing chips (or chip reader), comprising:
  • the invention also provides a means of controlling the temperature of the chips, thus making it possible to develop applications involving changes in temperature of the chip.
  • the chip is a DNA or oligonucleotide chip, and the temperature control makes it possible to precisely define the hybridization temperature of oligonucleotide probes on said chip.
  • the invention also relates to methods of implementing such a reader, in particular for the detection of genetic mutations.
  • network micro-network, array, micro-array, puce, chip
  • terms which will be used interchangeably in the present text, one intends to define a network of cells or of biological or chemical molecules arranged on a solid support in locations individuals (for example forming a matrix).
  • the molecules or cells are typically fixed on respective locations of a solid support coated with a polymer and arranged so that each of the locations is in this way associated with a molecule / cell which has specificity with respect to the molecules / cells of the other locations.
  • the network includes biological molecules such as nucleic acids or peptides, we speak of a biochip.
  • the solid support is selected from glass solid supports, plastic, Nylon ®, Kevlar ®, silicone, silicon, or by polyoses or poly (hetero monosaccharides), such as cellulose. Preferably it is glass.
  • This support may be of any shape (flat blade, microbeads, etc.) but according to a preferred mode the support is a plane, and it is a flat glass blade.
  • markers typically dyes or fluorescent molecules - commonly known as
  • Fluorophores which make it possible to detect the presence of the components after contacting the sample with the chip. This detection requires in the case of fluorophores the excitation of the chip with a light of controlled wavelength
  • Microlecule here covers chemical molecules, and biological molecules.
  • biological molecules are preferably nucleic acids, more preferably single-stranded oligonucleotides.
  • they may be chemical ligands of biological molecules.
  • nucleic acid nucleic probe, nucleic sequence or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, oligonucleotide sequences
  • nucleic acid is intended to denote a precise sequence of nucleotides , modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid, comprising or not unnatural nucleotides, and being able to correspond as well to a double stranded DNA, a single stranded DNA, a PNA (for “Peptid Nucleic Acid ”) or LNA (for" Locked Nucleic Acid ”) as transcripts of said DNAs such as RNA.
  • PNA for “Peptid Nucleic Acid ”
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • oligonucleotide probe or oligonucleotide we will mean here designating Poligonucleotide functionalized or not which will be deposited (or “spotted”) and fixed by covalent bond directly or indirectly to the solid support via a spacer compound at a location.
  • the oligonucleotide thus deposited is capable of binding to a target nucleic acid of complementary sequences (that is to say a complementary oligonucleotide or polynucleotide) present in the sample, by one or more types of chemical bonds, usually through complementary base pairing by forming hydrogen bonds.
  • said probes are DNAs or single-stranded RNAs, preferably DNAs, the size of which is between 10 and 7,000 bases (b), preferably between 10 and 1,000 b, between 10 and 500 b, between 10 and 250 b, between 10 and 100 b, between 10 and 50 b, or between 10 and 35 b.
  • the deposited oligonucleotide probes can be chemically synthesized, purified from the biological sample or more generally produced by recombinant DNA technologies from natural and / or purified polynucleotides.
  • the probes can be produced by polymerase chain reaction (PCR), or by RT-PCR (reverse transcription reaction followed by PCR reaction).
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription reaction followed by PCR reaction
  • “Locations or spot” corresponds to the locations of the chip at which the molecules are linked.
  • the same molecule is preferably present in several copies at a location.
  • the locations are defined by their coordinates in x and y relative to a reference point on the chip.
  • a location or spot can, for example, correspond to a circle of diameter depending on the volume of a drop of solution deposited in a defined area of a plane, or to a well, or even to a block of parallelepipedal dimension of gel (called gel pad).
  • Sample corresponds to a solution of biological, biochemical or chemical molecules or to a cell group, whose properties one wishes to characterize.
  • the sample is a solution containing at least one polynucleotide obtained from a biological source.
  • the sample can come from a living or dead source from different tissues or cells.
  • biological samples include biological fluids, such as blood (including leukocytes), urine, saliva, semen, vaginal secretions, skin, and also cells such as root follicle cells hair, normal or pathological internal tissue cells, in particular from tumors, chorionic villus tissue cells, amniotic cells, placental cells, fetal cells, umbilical cord cells.
  • biological fluids such as blood (including leukocytes), urine, saliva, semen, vaginal secretions, skin, and also cells such as root follicle cells hair, normal or pathological internal tissue cells, in particular from tumors, chorionic villus tissue cells, amniotic cells, placental cells, fetal cells, umbilical cord cells.
  • marker or “signal generator marker” is intended to denote a marker which can be associated directly or indirectly with a biological, biochemical or chemical molecule of the sample, with a view to its subsequent detection by reading means such as than those of the readers according to the invention.
  • the signal generator marker is preferably selected from enzymes, dyes, haptens, ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin or luminescent agents.
  • the signal generator marker according to the invention is a luminescent agent, which depending on the excitation energy source, can be classified as radio luminescent, chemiluminescent, bioluminescent and photo-luminescent (including fluorescent and phosphorescent).
  • the signal generator marker according to the invention is a fluorescent agent.
  • fluorescent generally refers to the property of a substance such as a fluorophore to produce light when it is excited by a light source at a specific wavelength, called the excitation wavelength. and emit light in a higher wavelength called the emission wavelength, which could be detected using a photon sensor, supplying the signals, the assembly of which will make it possible to constitute an image of the hybridization signals of the chip.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • reaction designates a chemical or biological reaction (hybridization for example) taking place between a molecule associated with a location of the chip and a molecule of the sample.
  • Hybridization is a reaction which refers to the link between a deposited (or “spotted”) oligonucleotide and a target sequence from the biological sample by pairing of complementary bases.
  • the hybrid or duplex resulting from hybridization is called hybridization complex or hybridization duplex.
  • a hybridization complex can be either a complementary complex or a complex with mismatch.
  • a complementary complex is a hybridization complex in which there is no mismatch between the oligonucleotide deposited and between the target sequence or sequences of the sample.
  • a mismatch complex is a hybridization complex in which there is at least one mismatch between the deposited oligonucleotide and between the target sequence (s) of the sample.
  • a specific hybridization refers to the binding, the formation of duplexes, or the hybridization of a nucleic acid molecule, only on a particular nucleotide sequence under stringent conditions, and when the sequence is present in a complex medium DNA or RNA.
  • a “complementary oligonucleotide” is a probe whose sequence is perfectly complementary to a particular target sequence (the term “match” will be used in this text to designate this type of perfect pairing).
  • a probe exhibiting a mismatch refers to a probe or probes whose sequence is not perfectly complementary to a particular target sequence.
  • the mismatch can be located anywhere in the probe showing the mismatches, the terminal mismatches are less desired since the terminal mismatches will affect hybridization less on the target sequence.
  • duplex or “hybrid” corresponds to a double stranded DNA fragment. It will be seen that such duplexes are obtained by hybridization of oligonucleotides (molecules arranged at locations of the chip) with the single-stranded fragments of a sample which it is desired to characterize.
  • Reading generally designates the operation consisting in collecting, by one or more suitable sensors, the response of the molecules after reaction, with a view to detecting a marker.
  • This reading can in particular be an optical reading, but also alternatively a reading by collecting a signal such as radioactive radiation.
  • Chip readers of the type mentioned above are already known. Such readers make it possible to collect, after reaction of the molecules of a chip with the molecules of a sample, the response of said molecules to a given excitation.
  • the collection of this response makes it possible to identify markers reacting specifically to said excitation, which can in particular be an illumination (excitation by a light) centered on a determined wavelength.
  • the chip preferably flat, is placed on a table, which can be moved along the three logitudinal, transverse and vertical axes x, y, z so as to successively receive on the different locations (or subsets of spots) excitation radiation from the chip, and to present these different locations to the observation means.
  • the chip can be placed directly on the table or in a processing chamber (for example hybridization chamber) which is itself fixed on the table.
  • a processing chamber for example hybridization chamber
  • the table can be fixed (case of the excitation and observation means moving to scan the wells of the chip).
  • excitation means which generally take the form of a light source (of the order of a few hundred square microns to a few square millimeters) making it possible to illuminate the molecules or the cells of the chip with a spectrum of controlled wavelength, to cause the excitation of a signal generator marker, preferably fluorescent, which is sought in association with the molecule.
  • These means of illumination are generally in the form of a lamp (typically xenon or mercury), or one or more laser diodes.
  • Xenon lamps provide a continuous and regular spectrum, covering the excitation wavelengths of most commonly used markers.
  • a limitation of these lamps is that the energy level associated with the excitation lines of the different markers may be too low to achieve sufficient excitation of the desired lines.
  • Mercury lamps provide a spectrum with lines (maximum energy) for certain wavelengths. Such lamps thus make it possible to sufficiently excite the fluorescent markers excitable at the wavelengths corresponding to these lines.
  • the excitation lines of mercury lamps do not include in particular the wavelengths making it possible to excite the fluorophore (which may be of the Cy5, Cy7 or other fluorophore type which cannot be effectively excited by a wide-beam lamp spectrum), commonly used in the applications of these readers.
  • the “red” lasers which are very common and inexpensive thus constitute a practical and accessible solution to excite markers such as cyanine ⁇ or cyanine7. But in the case where it is desired to excite reactive markers at wavelengths situated in the blue zones or close to the ultra violet (for example to excite a marker of the FITC type, it is necessary to have recourse to a less common type of laser, which results in a significant drawback in terms of price.
  • An object of the invention is to allow these limitations concerning the means of illumination to be overcome.
  • Another object of the invention is to improve this arrangement.
  • an object of the invention is to allow reading of chips under the optimum temperature conditions for the observation of the desired parameters, automatically.
  • the invention proposes, according to a first aspect, a device for reading and analyzing chips, comprising:
  • Means for reading and analyzing molecules subjected to excitation characterized in that the device also comprises:
  • a temperature control unit of said table said control unit being connected to a module (111) comprising a plurality of heating / cooling elements of the type
  • Peltier arranged next to different locations on the table surface
  • the laser is a laser whose radiation is centered on a wavelength of the order of 635 nm,
  • the reader includes several lasers, • the lasers are centered on the same wavelength,
  • the excitation means comprise at least one laser associated with a module for scanning its beam to excite the molecules to be analyzed,
  • the reader comprises two lasers and the scanning modules of the two lasers control two respective scans of the molecules in two orthogonal directions,
  • the excitation means comprise at least one laser assembly comprising a laser whose radiation is guided by an optical fiber, the excitation means comprise two identical laser assemblies,
  • the excitation means comprise a fixed laser which directs its beam towards two successive sets of mirrors mounted in series and whose movement is controlled along two different directions,
  • the movement of the two sets of mirrors are controlled so as to produce a beam which can borrow any desired sequence on the chip,
  • the excitation means comprise a lamp and a laser, the radiation of which takes the same optical path thanks to a tilting mirror capable of pivoting about an axis between two positions to direct one of these two radiations towards the chip,
  • an optical chain is interposed between the lamp and the molecules to be excited, while the laser excitation is done by direct illumination of the molecules, • said optical chain comprises filters of excitation light with narrow bandwidth as well as filters with narrow bandwidth of light in emission and a beam splitter
  • the reader also includes an excitation control unit connected to each of the excitation means for controlling their operation,
  • said excitation control unit is capable of selectively controlling the simultaneous or successive illumination of the molecules with the lamp and at least one laser, or the separate excitation of the molecules with the lamp and at least one laser.
  • the invention also provides a device for reading and analyzing chips, comprising:
  • Means for reading molecules or cells subjected to excitation characterized in that the reader also includes a temperature control unit.
  • the table includes a temperature sensor connected to said temperature control unit.
  • the reader includes a heating / cooling module associated with the table and intended to control its temperature, said heating / cooling module being connected to the temperature control unit.
  • the reader also includes processing means comprising a microprocessor and connected to the temperature control unit as well as to the reading means. • the reader includes means for memorizing reference curves of the response of the match and mismatch of the molecules to the excitation means as a function of the temperature.
  • the storage means are connected to means making it possible to determine a melting temperature of the match and mismatch of the molecules from said reference curves.
  • the temperature control unit is capable of controlling the operation of the reader according to a "static" mode in which pre-established reference curves of the response of match and mismatch of molecules as a function of temperature are used to establish a set temperature able to be transmitted by said temperature control unit to control the temperature of said table.
  • the temperature control unit is able to control the operation of the reader in a "dynamic" mode in which the temperature control unit controls a given change in temperature at the table, and, during this change in temperature:
  • the reading means collect in real time the response of the molecules associated with the different locations of the chip to the excitation of the excitation means, and transmit said response to processing means,
  • memorization means memorize for each location of the chip the evolution of the response of the molecule as a function of the temperature.
  • the reader includes processing means capable of establishing for each molecule, at the end of the memorization of said response evolution, a diagnosis of the state of the molecule.
  • said state diagnosis is a match / mismatch diagnosis.
  • the invention also relates to a method of implementing such a device, for reading chips.
  • Such a method can in particular be a method for hybridizing the oligonucleotides of a chip, which can be implemented by a reader according to one of the above aspects, the method comprising the steps consisting in:
  • nucleic probes corresponding to a target nucleic acid into contact with a biological sample containing single-stranded DNA fragments, so as to selectively hybridize certain probes with said single-stranded DNA fragments from the sample, constituting duplexes,
  • the method being characterized in that the method comprises a step of automatic determination of: the melting temperature of each target nucleic acid in a “match” configuration, and
  • said determination is carried out in “static” mode using reference curves illustrating the evolution, as a function of temperature, of the signal received by means of reading duplexes corresponding respectively to matches and to mismatches, • the method includes temperature control so as to hybridize at a temperature corresponding to maximum discrimination between match and mismatch,
  • the method comprises the constitution of said reference curves during a step preceding the reading step, the method comprises the memorization of said reference curves, • said determination can be carried out in “dynamic” mode by controlling a given change in temperature of the samples, and, during this change in temperature, the procedure is carried out:
  • the method comprises for each duplex the establishment, at the end of the memorization of said response evolution, of a match / m ismatch diagnosis of the duplex.
  • Figure 1 is a block diagram of a reader according to the invention.
  • Figures 3a to 3d are diagrams illustrating four alternative embodiments of all or part of the excitation light means of such a reader, Figure 3a further comprising an illustration of the scanning of a chip by light sources means of excitation,
  • Figures 4a and 4b are graphs relating to an application of the invention to molecular hybridization:> Figure 4a is a reference curve illustrating the evolution as a function of the temperature of the signal at all points of a chip , received by reading means, for the same DNA sequence in perfect match configuration (“match”) and in mismatch configuration (“mismatch”),
  • FIG. 4b illustrating a so-called “dynamic” mode of implementation of the invention in which curves of the type of those of FIG. 4a are constructed, for several DNA sequences
  • FIG. 5 is a diagram of an immobilization reaction of probes on a slide having an aldehyde function (Super Aldehyde slide of
  • FIG. 6 illustrates images of the Cy3 fluorescence of the hybridization of a mixture of wild oligonucleotides Q493X-Cy3 and mutated Q493X-Cy5 on a biochip comprising the corresponding probes deposited at different concentrations (50, 100 and 200 ⁇ M) then immobilized with different conditions (low and high humidity).
  • Hybridization is carried out in SSC 6X, DSD 0.2%, BSA 0.2 mg / ml at room temperature for 12 hours.
  • the concentration of oligonucleotides is 0.5 ⁇ M.
  • the washing of the biochip after hybridization is carried out in SSC 6X, SDS 0.2% for 5 minutes at room temperature followed in SSC 2X for 2 minutes at room temperature, •
  • Figure 7 shows intensities of fluorescence signals and noise / signal ratios correspond to the hybridization of a solution of oligonucleotides wtQ493X-Cy3 and mutQ493X-Cy5 for chips comprising probes corresponding to different concentrations (50, 100 and 200 ⁇ M) and immobilized under different conditions (low humidity and high),
  • FIG. 8 represents fluorescence images corresponding to the hybridization of ⁇ F-508 wild type oligonucleotides labeled with Cy3, and of mutated oligonucleotides Q493X labeled with Cy5.
  • FIG. 1 there is shown schematically a reader 10 according to the invention.
  • the reader 10 includes: • A table 11 for receiving a chip 12,
  • Means 14 for reading ie observation of the molecules of the chip, in particular in response to an excitation emitted by the means 13
  • Command and control means •
  • Table 11 is detailed in the upper part of FIG. 2. This table conventionally comprises means 110 for holding a chip 12.
  • These means can include a chamber - for example a hybridization chamber.
  • the table 11 is associated with a heating / cooling module 111 capable of controlling the temperature of the table.
  • the module 111 comprises a plurality of heating / cooling elements by Peltier effect. These Peltier elements are integrated into the thickness of the table 11.
  • Each of these Peltier elements is situated opposite a location on the surface of the table 11 - and therefore of the chip 12 which is carried by the table. Said locations are adjacent to each other, and their meeting covers the entire surface of the chip.
  • the module 111 is also connected to a temperature control unit 15 which prepares a temperature setpoint and transmits it to the module 111 so that the latter adapts the temperature of the table accordingly, with a speed of variation of temperature depending on the physicochemical phenomenon observed.
  • control unit prepares an individual temperature setpoint for each Peltier element of the module 111.
  • Peltier elements have great qualities of precision - they typically provide a set temperature with an accuracy of the order of 0.01 ° C.
  • the module 111 formed by the combination of these Peltier elements is associated with a heat exchange module, to allow heating / cooling of the table 11.
  • This heat exchange module can operate by air circulation, or fluid.
  • Peltier elements are very reactive to changes in temperature setpoint (upwards or downwards).
  • At least one correspondence table is stored in a memory of the device accessible by the central unit 15 (for example a memory of the computer 17 which will be described). It should be noted that the speed depends not only on the type of reaction envisaged, but also on the type of probe used, and on the sample which it is desired to characterize.
  • the correspondence table or tables also take these parameters into account.
  • the user of the device can thus enter a suitable interface (keyboard or other) and connected to the central unit 15 and / or to the computer 17 the parameters (in particular type of reaction, probe, sample) according to which one, program associated with the correspondence table (s) will automatically select the temperature change to be transmitted as a setpoint to the module 111.
  • a temperature sensor 112 is also integrated into the table, to collect its effective temperature and transmit it to the temperature control center 15 to which this sensor is also connected.
  • the temperature of the locations of the chip is controlled by the temperature control unit 15, and this temperature of the chip locations is also known in real time by the temperature control unit.
  • the sensor (s) 112 is (are) integrated in table 11.
  • this (these) temperature sensor (s) makes it possible to record the temperature parameters associated with the operation of the device, and also to regulate this operation.
  • the excitation means 13 comprise two types of light sources:
  • a broad spectrum lamp 131 - preferably a mercury lamp
  • This laser emits at a wavelength which makes it possible to excite the markers usually used, and whose excitation spectrum does not correspond to the emission spectrum of the lamp 131.
  • the laser is a conventional red laser emitting around a line centered on 635 nm or other lasers allowing the excitation of the Cy5 molecule.
  • the excitation means 13 also comprise a respective electrical power source 1310, 1320 for each type of light source.
  • the means 13 further comprise an optical chain 1311 interposed between the lamp 131 and the table (therefore between the lamp and the molecules of the chip).
  • this optical chain comprises an excitation filter 13111, and a beam splitter 13112 making it possible to: • Direct the radiation coming from the lamp and the filter 13111 towards the chip, • And direct towards the means of reading 14 the signal from the chip in response to the excitation received from the lamp (or from the laser (s) of the excitation means).
  • said optical chain may also include filters of excitation light with narrow passband as well as filters with narrow passband of light in emission (at least 2 and up to 8) and a beam splitter.
  • the excitation means 13 also include means for changing the interference filter 1312 (shown in FIG. 1), which are connected to the filter 13111 and to means 16 for filter control.
  • the excitation of the molecules of the chip by the radiation coming from the laser is done in a direct way, no element being interposed between the laser and the chip.
  • the excitation means comprise two lasers 1321 and 1322. These two lasers are identical. Each laser is associated with a module (not shown) for scanning the biochips.
  • this laser is also associated with a module fulfilling this function, in a beam of configurable geometry.
  • the two scanners control two respective scans of the molecules in two orthogonal directions.
  • the two strips 13210 and 13220 represent the respective beams of the two lasers 1321 and 1322. These two beams have an elongated section, the directions of elongation of the two beams being orthogonal.
  • Each of these directions can be aligned on one of the two alignment directions of the locations of the chip, these locations generally forming a rectangular matrix.
  • Each beam is moved by the scanning module of its associated laser over the field of view 120, in a direction orthogonal to the direction of extension of the beam.
  • FIG. 3b represents a second alternative embodiment of the lasers of the excitation means 13. These lasers are intended to be used in place of the lasers 1321 and 1322.
  • the excitation of the lasers is directed towards the chip 12 by two identical assemblies 1321 'and 1322' which produce two respective beams 13210 'and 13220'
  • This assembly includes a laser 13211 'associated with an output lens 13212' which directs the flux coming from the laser to an optical fiber 13213 '.
  • This fiber itself transmits the radiation to another lens, noted 13214 ', which is mounted fixed relative to the chip and directs the beam 13210' towards it.
  • FIG. 3a The lower part of FIG. 3a represents the impact of the two beams 13210 'and 13220' on the chip and the field of illumination 1320 thus defined.
  • FIG. 3c represents a third variant of the laser system (s) in which at least one fixed laser 132 "directs its beam towards two successive sets of mirrors mounted in series, denoted 1321" and 1322 ".
  • Each of these mirror assemblies comprises a mirror whose orientation is controlled by a respective piezoelectric actuator 13210 ", 13220".
  • each mirror is thus moved along a respective axis, which corresponds to one of the transverse X, Y axes of the chip 12.
  • the beam 1320 "from the two mirrors is thus described on the chip a path 13201" which can take any desired sequence in X, Y.
  • this laser system can replace the lasers 1321, 1322 of FIG. 3a.
  • FIG. 3d finally illustrates another alternative embodiment of the excitation means 13, which corresponds to an alternative to the means shown in FIG. 3a.
  • This 3d figure represents a mercury lamp 131, and a laser 132.
  • the laser and the lamp are each associated with a respective output lens.
  • the respective rays from the laser and the lamp take the same optical path, thanks to a mirror. tilting 130 able to pivot around an axis 1300 between two positions to direct one of these two rays towards a series of lenses 1301 and a deflection mirror 1302 making it possible to direct the radiation towards the optics 134 and the chip 12.
  • the means mirror tilt control 130 can control any sequence to illuminate the chip with the two types of radiation (laser and lamp), for example by pivoting between its two positions with a desired frequency.
  • the excitation means can comprise a laser, or several identical lasers.
  • the reading means 14 comprise an optical chain 141 for acquiring the image of the field 120 of the chip 12, this chip also being able to be moved relative to the rest of the reader by a controlled movement of the table 11.
  • the reading means also comprise register means for coordinating the movements of the table 11.
  • the optical chain 141 thus comprises a first acquisition optic 1411, and a filter 1412 interposed between this first optic and a CCD camera 142.
  • the optical chain 141 also includes filter change means 14120 (shown in FIG. 1), which are connected to the filter 1412 and to the filter control means 16.
  • the reader control and command means comprise, in addition to the temperature control unit 15 and the filter control means 16 already mentioned, a computer 17 which manages the operation of all the components of the reader.
  • the computer is connected to the following elements so as to transmit operating instructions to them and / or to receive information therefrom:
  • the computer fulfills the function of an excitation control unit in this regard. It is specified that the computer can selectively control:
  • the reader control and command means thus also include:
  • Reader operation The structure of the reader according to the invention has been described in detail above. We also discussed certain aspects of its operation, in particular with regard to the excitation of the molecules of the chip. We will now detail the operation of this reader, with regard to temperature control.
  • the reader according to the invention can be implemented for other applications - for example for carrying out enzymatic reactions (in particular of the ligase type, PCR, extension of simple oligonucleotide, etc.), of screening ligands.
  • enzymatic reactions in particular of the ligase type, PCR, extension of simple oligonucleotide, etc.
  • the hybridization application we study a biological sample - for example from a patient - to detect certain genetic characteristics.
  • the characteristic sought may, for example, be the possible presence of mutations in a particular nucleic acid sequence, such as for example the CFTR gene.
  • the method begins in a conventional manner with the preparation of a chip, by constituting at the various locations of the chip nucleic probes constituted from nucleotides corresponding to a target nucleic acid.
  • probes are intended to be hybridized with the sample containing fragments. single strand of DNA.
  • the single-stranded DNA fragments are obtained, moreover, in a known manner, in particular by PCR amplification. They are associated with a marker so as to allow their detection by the reader reading means, after hybridization of these fragments with the probes of the chip. Said probes are then brought into contact with the sample so as to effect selective hybridization of certain probes with said single-stranded fragments of DNA from the sample, so as to constitute duplexes.
  • each nucleic probe will preferentially hybridize with its target nucleic acid.
  • probes thus correspond to a nucleic acid without mutation, while others correspond to a nucleic acid comprising a given mutation.
  • duplexes are formed, for the probes which are effectively hybridized.
  • a probe hybridizes correctly means that the sample contains single-stranded fragments of DNA corresponding to the target nucleic acid of said probe.
  • a probe hybridizing in this way thus corresponds to a “match” type duplex after the hybridization step.
  • a probe which does not hybridize - or which hybridizes poorly - with the single-stranded fragments of DNA of the sample corresponds after the hybridization step to a duplex of “mismatch” type or even to a single strand not hybrid.
  • the temperature is an important parameter of this hybridization step.
  • the melting point corresponds to the temperature at which the two strands of half the duplexes separate.
  • Tm1 is less than Tm2, as illustrated in FIG. 4a. And it is desirable to carry out, for a given target nucleic acid, the hybridization step at a temperature corresponding to maximum discrimination between match and mismatch.
  • This desired temperature is between Tm1 and Tm2.
  • this application of the invention can be implemented according to two modes: a so-called “static” mode and a so-called “dynamic” mode.
  • This mode is well suited to the case of a chip whose probes correspond to the same target nucleic acid or to target nucleic acids having similar melting temperatures.
  • said determination of melting temperatures is carried out beforehand, so that these temperatures are known before carrying out the characterization. These temperatures can be known to the operator who carries out this characterization and who consequently enters a set value temperature in the device (using an interface connected to the computer 17, or directly to the control unit 15).
  • temperatures can also be stored in a memory of the reader which is connected to said central unit 15.
  • the temperature of the chip is thus controlled so as to hybridize at a temperature corresponding to maximum discrimination between match and mismatch.
  • the melting temperatures can also be determined by the reader (see dynamic mode below), and stored for the implementation of the static mode.
  • the reference curves can thus be formed during a step preceding the reading step.
  • the reader is used to collect the response of the probes to single-stranded fragments of known type (fragments corresponding to a target nucleic acid without mutation, and with mutation), when the temperature varies continuously under the effect control panel 15. And these curves can be stored, for example in the computer 17.
  • This mode is particularly well suited to the case of a chip whose probes correspond to target nucleic acids whose “match” configurations have very different melting temperatures.
  • a change in temperature of the chip is controlled (for example constant increase or constant decrease), so as to pass through the melting temperatures of the different target nucleic acids of the different probes.
  • This change is obtained by sending a suitable instruction from the central 15 to the Peltier elements of the module 111 associated with the table.
  • the reading means 14 collect in real time the response of the duplexes associated with the different locations of the chip to the excitation of the excitation means 13, and transmit said response to the computer 18,
  • the evolution of the response of the duplex as a function of the temperature is stored in a memory of the computer 18.
  • the sensor (s) 112 allow (s) true temperature regulation, beyond a simple “blind” command which would be content to transmit a temperature setpoint to a heating element.
  • the Peltier elements being very reactive and allowing rapid temperature changes, applications of the PCR type are also possible.
  • the combination of discrete heating / cooling elements of the Peltier type with at least one temperature sensor thus makes it possible:. to finely control the temperature distribution in all the locations of the table (and therefore of the chip),. and to carry out a real regulation going beyond a simple command.
  • the computer thus constructs for each location of the chip a curve illustrating the evolution of response of the probe as a function of temperature, as shown in FIG.
  • FIG. 4b which illustrates the very simple case of a chip with four locations (curves 1 , 2, 3 and 4).
  • the probes are distributed in pairs, one probe of the pair corresponding to a target nucleic acid without mutation, the other probe corresponding to the same target nucleic acid with a mutation.
  • the computer includes for this purpose a program capable of establishing for each location of the chip, after storing said response evolution, a diagnosis of the state of the probe associated with this location.
  • the chip reader according to the invention makes it possible to read DNA chips. It is therefore also an object of the present invention to provide a DNA chip composed of numerous oligonucleotides (or probes) corresponding to or comprising fragments of wild or mutated gene, in particular of the human CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Such a chip is particularly useful for the detection of mutations in the human CFTR gene and the diagnosis of cystic fibrosis.
  • Cystic fibrosis is one of the most common autosomal recessive illnesses in the Caucasian population, affecting approximately 1 in 2,000 people born in North America (Boat and al., The metabolic basis of inherited disease, 6th Ed. pp2649-1680, McGraw Hill, New York, 1989).
  • Cystic fibrosis has been associated with mutations in the CFTR gene, which spans 250 kb and includes 27 exons. Since the characterization of the gene in 1989, numerous genetic analyzes have been carried out to define the spectrum of mutations in this gene. These are of a wide variety, and more than 850 mutations have been characterized. However, a mutation is found alone present in 50% of patients, it is the Delta F508 mutation. The majority of other mutations are present with a low incidence in patients (1-5%).
  • a diagnostic test thus allows the detection of approximately 30 distinct mutations by implementing tube ligation reactions (OLA; Perkin Elmer).
  • OLA tube ligation reactions
  • Other approaches involving microarray technologies have been developed for the identification of mutations in the human CFTR gene. It is thus appropriate to cite the patents US 6,027,880, US 5,837,832, US 5,972,618, US 5,981, 178).
  • no test allows the detection of the most frequent mutations of the CFTR gene in a simple, rapid, efficient and reliable manner. This is the problem which the present invention also proposes to solve by developing a DNA chip for the detection of mutations in the human CFTR gene capable of being used with the reader according to the invention.
  • the present invention therefore provides a network of oligonucleotides or DNA chip (CFTR chip), for the detection of mutations in the human CFTR gene.
  • This network includes a solid support on which a plurality different oligonucleotides (the probes) are attached in such a way that said oligonucleotides hybridize effectively with complementary oligonucleotides or polynucleotides (i.e.
  • oligonucleotides having different nucleotide sequences are linked to said solid support at separate locations so that oligonucleotides having a specific nucleic sequence hybridize effectively with target oligonucleotides or complementary polynucleotides at a particular location on said solid support.
  • Said network is characterized in that it comprises at least one pair, at least two pairs, at least three pairs, at least four pairs, at least five pairs of oligonucleotides, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15 pairs of oligonucleotides, each pair of oligonucleotides consisting of a corresponding oligonucleotide or comprising an oligonucleotide fragment of the wild-type CFTR gene (wt) and an oligonucleotide corresponding or comprising an oligonucleotide fragment of the gene Mutated CFTR (mut) and a negative control oligonucleotide (cont) which forms a “mismatch” duplex with both the mutated and wild-type CFTR gene.
  • wt wild-type CFTR gene
  • mut Mutated CFTR
  • cont negative control oligonucleotide
  • Two sets of probes of length approximately 20 nt (depending on the basic composition) and 15 nt are formed.
  • said set (wild / mutated / control) is selected from the group consisting of:
  • N ° 1 (this set has no control probe) TAGGAAACACCAAAGATGATATTT (SEQ ID N ° 1) 24 mer CATAGGAAACACCAATGATATTTT (SEQ ID N ° 2) 24 sea set N ° 2:
  • TTCTTGCTCGTTGACCT (SEQ ID N ° 9) / 17 sea TTCTTGCTCATTGACCT (SEQ ID N ° 10) 17 sea TTCTTGCTCCTTGACCT (SEQ ID N ° 11) 17 sea
  • Pair N ° 1 allows the detection of the most frequent mutation of the CFTR gene which is the delta F508 mutation located in exon 10. This mutation corresponds to a deletion of 3 base pairs (codon AGA) which results in the deletion amino acid 508 of the CFTR protein.
  • the set N ° 2 allows the detection of the Q493X mutation of the exon
  • the sets N ° 3 and 6 allow the detection of the G542X mutation of exon 11 of the CFTR gene. This mutation corresponds to a substitution C -> A in position 542 which results in the appearance of a nonsense mutation.
  • Sets No. 4 and 7 allow the detection of the R553X mutation of exon 11 of the CFTR gene. This mutation corresponds to a substitution G -> A in position 553 which results in the appearance of a nonsense mutation.
  • the sets N ° 5 and 8 allows the detection of the G551 D mutation of exon 11 of the CFTR gene. This mutation corresponds to a substitution C -> T at position 551 which results in the substitution of a glycine at position 551 with an aspartic acid.
  • the present CFTR chip comprises at least all of the five pairs of preceding oligonucleotides.
  • the CFTR chip according to the invention is characterized in that the oligonucleotides which compose it, when in double strand form, have temperatures of similar melting (Tm) and preferably between approximately 55 and 85 ° C, approximately 65 and 75 ° C, preferably close to approximately 70 ° C (in 1 M NaCl).
  • Tm melting
  • the CFTR chip according to the invention further comprises negative control oligonucleotides, that is to say probes forming hybrids with mismatches with all the targets studied.
  • the choice of the sequences of the oligonucleotides immobilized on the solid surface is of great importance in obtaining a good distinction between the hybrids with mismatch and without mismatch.
  • one of the important parameters resides in the design of the probes so as to avoid the probability of formation of secondary intramolecular structures as well as the probability of formation of intermolecular complexes by the immobilized probes, since these structures significantly reduce the efficiency of hybridization of the target on the probe, as well as the distinction between hybrids with or without mismatch.
  • the requirements relating to the characteristics of the oligonucleotides are achieved by the choice of the nucleic sequence of the oligonucleotides, in particular its length and its base composition, and / or by the addition of additional nucleotides to modify the Tm or the possibility of the formation of intramolecular structures and intermolecular complexes. These requirements, which are difficult to satisfy, justify the inventive step of the present invention.
  • the CFTR chip according to the invention coated with pairs of oligonucleotide probes is characterized in that said oligonucleotide probes are deposited in the form of locations or spots whose average diameter is between 20 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 200 ⁇ m.
  • each location preferably has at least 1, at least 2, or frequently at least 16, of the same oligonucleotide.
  • the number of locations on the chip according to the invention is variable and depends on the number of pairs of oligonucleotides deposited on the solid surface. Preferably, it is a medium density network, that is to say with a limited number of locations.
  • the number of said locations is at least 2 per cm 2 , at least 4 per cm 2 , at least 6 per cm 2 , at least 8 per cm 2 , at least 10 per cm 2 , at least 50 per cm 2 , at least 100 per cm 2 , at least 500 per cm 2 , at least 1000 per cm 2 , at least 10,000 per cm 2 , of at least 50,000 per cm 2 , at least 100,000 per cm 2 .
  • the solid support of the CFTR chip according to the invention is selected from glass solid supports, plastic, Nylon ®, Kevlar ®, silicone, silicon or polyoses.
  • the solid support is a glass slide, more preferably a microscope glass slide.
  • the chip according to the invention is preferably chosen from the 2D microarray or 3D-micro-array type. According to a first embodiment, it is a 2D chip, the probes of which are preferably fixed by amino- and aldehyde chemistry according to the methods known to those skilled in the art. Unmodified DNA and amino-modified DNA can thus respectively hybridize on these substrates by covalent bond.
  • Figures 6 and 7 illustrate the effect of modifying the protocol, so as to achieve a coupling of the DNA with a SuperAldehyde surface under high humidity (humidity in a closed plastic box with a volume of approximately 700 cm 3 filled with half a volume of water). This modification increases the immobilization efficiency and the signal / noise ratio.
  • a 3D hydrogel-based chip such as 3D-link activated slides TM (Motorola) which have the advantage (i) of greater probes immobilization efficiency. , and thus a better intensity of the hybridization signal; (ii) a better distinction between hybrids with and without mismatches (Livshits and Mirzabekov, 1996, Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides. Biophys. J. Nov.; 71 (5) 2795-2801 ).
  • 3D hydrogel-based chip such as 3D-link activated slides TM (Motorola) which have the advantage (i) of greater probes immobilization efficiency. , and thus a better intensity of the hybridization signal; (ii) a better distinction between hybrids with and without mismatches (Livshits and Mirzabekov, 1996, Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucle
  • the oligonucleotides of the CFTR chip described above are deposited and linked to the solid surface in the form of single-stranded DNA by one of the ends of the oligonucleotides. Preferably it is the 3 'end.
  • mutated oligonucleotides (“mutated” or “mut”), labeled with a Cy5 fluorophore has been hybridized on a chip:
  • AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-Cy3 ( ⁇ F508-wt)
  • AAAATATCATTGGTGTTTCCTATG-Cy5 ( ⁇ F508-mut)
  • FIG. 8 shows the hybridization images corresponding to the hybridization of the oligonucleotides ⁇ F508-wt, ⁇ F508-mut, Q493-wt and Q493X-mut on the chip. There is match / mismatch discrimination for all mutations. Materials and methods: hybridization conditions
  • the oligonucleotides labeled at the 3 'end of the company Metabion were used.
  • the quality of the oligonucleotides was checked in a 20% polyacrylamide gel, under denaturation conditions.
  • the hybridization of the oligonucleotides labeled by fluorophore on the chip was carried out in a 2xSSC type solution, 0.2% SDS, 0.2 mg / ml BSA at room temperature, for 12 hours.
  • the volume of the hybridization chamber was 180 ⁇ l, the concentration of each oligonucleotide was 0.1 ⁇ M.
  • the post hybridization washing of the chip was then carried out in a 2xSSC, 0.2% SDS solution for one minute at room temperature.
  • this application of the invention comprises the use of a CFTR chip according to the invention for the detection of the possible presence of mutation in the sequence of the CFTR gene of a patient, preferably by implementing the reader according to the invention.
  • the essential steps of this process are as follows: • Preparation of the target oligonucleotide or polynucleotides:
  • Genomic DNA, or messenger RNAs, or their fragments are extracted from the biological sample according to the methods commonly used by those skilled in the art. Using recombinant DNA technologies, the RNAs are eventually transformed into cDNA (complementary DNA). The DNA thus isolated is then fragmented and or subjected to amplification by PCR to generate oligonucleotide fragments. These are marked, before, simultaneously or after with signal generator markers according to conventional methods. According to a preferred embodiment, the DNA thus isolated is amplified by PCR using a primer specific for the region of the CFTR gene tested using nucleotides marked or modified. The DNAs, cDNAs, or RNAs thus labeled are then denatured to obtain single-stranded molecules.
  • the DNAs, cDNAs or RNAs thus labeled and denatured are then deposited on the chip and, if necessary, bind by specific hybridization under hybridization conditions of defined stringency with the oligonucleotide probes. After washing to remove the excess of DNAs, cDNAs, or non-specifically labeled and / or hybridized RNAs, the duplexes formed are detected by using the reader according to the invention.
  • the analysis of mutations in the CFTR gene can be carried out according to a first method which consists in comparing the intensities of the hybridization signals of the target oligonucleotides wild (wt) and / or mutated on the CFTR chip, using a single type of oligonucleotide target marked with a fluorophore.
  • a second approach uses the hybridization on the CFTR chip of at least two different target oligonucleotides labeled with distinct signal generator markers, one of the oligonucleotides coming from the test sample, the other corresponding to a reference ologonucleotide (in general, the oligonucleotide corresponding to the wild-type sequence). hybridization
  • Hybridization of probes on said target oligonucleotides is carried out at a temperature of approximately 20 ° C. in the hybridization buffer defined below and not comprising formamide. Those skilled in the art will have to adapt these hybridization conditions if the hydridation medium used contains formamide.
  • the hybridization medium of said CFTR chip according to the invention comprises at least SSC 6X (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), sodium dodecyl sulfate 0 , 2%, and optionally 0.2 mg / ml bovine serum albumin.
  • SSC 6X (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), sodium dodecyl sulfate 0 , 2%, and optionally 0.2 mg / ml bovine serum albumin.
  • SSPE buffer 5X SSPE consists of 750 M NaCl, 50 mM Na phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4
  • these are preferably conditions of high stringency in particular as defined below.
  • "Stringent” conditions are conditions in which a probe will hybridize on its target sequence, but not on the other sequences. The stringency conditions are dependent on the sequence, and are different depending on the circumstances. A variety of factors can influence the stringency of hybridization. Among these, mention should be made of the base composition, the size of the complementary strands, the presence of organic solvents and the length of the base layers. For a discussion of the general factors which influence hybridization, reference may be made, for example, to WO 93/02216 or Ausubel et al.
  • stringency conditions are selected so that the temperature is 5 ° C lower than the melting point temperature (Tm), for a sequence specific to an ionic strength and a defined pH.
  • Tm is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration conditions) at which 50% of the probes complementary to a target sequence hybridize to the target sequence at equilibrium.
  • stringency conditions include a salt concentration of at least about 0.01 M up to 1M concentration of sodium or other salts, at a pH of 7.0 to 8.3 and a temperature of at least about 30 ° C for small probes (10 to 50 nucleotides).
  • Stringency conditions can also be obtained with the addition of destabilizing agents such as formamide or tetra-alkyl-ammonium salts.
  • destabilizing agents such as formamide or tetra-alkyl-ammonium salts.
  • 5X SSPE 750 M NaCl, 50 mM Na phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4
  • a temperature of 25 ° -30 ° C are conditions usually used for the hybridization of probes specific for alleles.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA or RNA / DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the hybridization conditions described above are advantageously as follows: DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages : (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC, 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) hybridization proper for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes
  • the last wash is carried out in 0.1 x SSC + 0.1 % SDS for 30 minutes at 60 ° C for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
  • hybridization can be carried out in a more or less humid atmosphere.
  • Hybridization conditions in low humidity or in high humidity can make it possible to optimize the specificity of hybridization.
  • Stringency can be determined empirically by gradually increasing the conditions of stringency, for example by increasing the salt concentration, or by increasing the temperature until the desired level of specificity is obtained. The present invention thus makes it possible to increase the stringency conditions by precisely controlling an increase in temperature.
  • the invention also provides a cystic fibrosis diagnostic kit comprising an oligonucleotide network or CFTR chip according to the invention.
  • the kit or kit necessary for the detection of mutations or the genotyping of the human CFTR gene in a sample is characterized in that it comprises a CFTR chip according to the invention and optionally the reagents necessary for labeling the target oligonucleotides or polynucleotides. It is therefore also an object of the present invention to use the network of oligonucleotides according to the invnetion, or CFTR chip for the diagnosis of cystic fibrosis in an individual.
  • the present invention also relates to a method for the detection of mutations of the CFTR gene from a sample, characterized in that it comprises the following steps: a) depositing the sample containing target oligonucleotides or polynucleotides , derived from the human CFTR gene in which it is sought to detect the possible presence of mutations, on a chip coated with oligonucleotide probes according to the invention, under conditions allowing specific hybridization of these oligonucleotides or of the target polynucleotides with said oligonucleotide probes; b) if necessary, rinsing the chip obtained in step a) under the appropriate conditions in order to remove the nucleic acids from the sample not captured by hybridization; and c) the detection, optionally using the reader according to the invention, of the nucleic acids captured on the chip by hybridization.
  • said fragments are marked in step (b) directly or indirectly with a signal generator marker according to the invention; preferably it is a fluorescent marker chosen from the group consisting of Cy3, Cy5, FITC,
  • a single target nucleic acid labeled with a signal generator marker is hybridized on the said CFTR chip.
  • at least one, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least minus 9, at least 10 target nucleic acids labeled with a signal generator marker is / have hybridized on the said CFTR chip.
  • the reader according to the invention makes it possible to detect simultaneously or in a time-delayed manner hybrids or duplexes marked with different markers.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif de lecture et analyse de puces, comprenant : une table (11) pour recevoir une puce (12) destinée à caractériser au moins un échantillon, des moyens d'excitation des molécules ou des cellules de la puce, après réaction avec d'autres molécules, des moyens de lecture et d'analyse (14) des molécules soumises à excitation, caractérisé en ce que le dispositif comprend également : une centrale de commande de température (15) de ladite table, ladite centrale de commande étant reliée à un module (111) comportant une pluralité d'éléments de chauffage/refroidissement de type Peltier disposés en regard de différents emplacements de la surface de la table, et au moins un capteur de température de la table (112) également relié à ladite centrale de commande. L'invention concerne également des procédés associés.

Description

LECTEUR DE PUCES DE TYPE BIOPUCES, ET PROCEDES ASSOCIES
Contexte général
La présente invention concerne de manière générale la lecture et l'interprétation de puces et plus particulièrement la détection d'hybrides marqués par des molécules génératrices de signal, telles les fluorophores, et formés entre les molécules constituant ces puces et des molécules ou cellules provenant d'échantillons biologiques ou chimiques.
L'invention concerne ainsi selon un premier aspect un dispositif de lecture et analyse de puces (ou lecteur de puces), comprenant :
• Une table pour recevoir une puce destinée à caractériser au moins un échantillon,
• Des moyens d'excitation des molécules ou des cellules de la puce, après réaction avec d'autres molécules, • Des moyens de lecture et d'analyse des molécules soumises à excitation. Plus particulièrement, l'invention fournit en outre un moyen de contrôle de la température des puces, permettant ainsi de développer des applications impliquant des changements de température de la puce. Dans une application particulière, la puce est une puce à ADN ou d'oligonucléotides, et le contrôle de la température permet de définir avec précision la température d'hybridation de sondes oligonucleotidiques sur ladite puce.
L'invention concerne également des procédés de mise en œuvre d'un tel lecteur, notamment pour la détection de mutations génétiques.
Définitions
Avant de présenter les buts et caractéristiques de l'invention, on va dans un premier temps définir certains termes qui seront employés dans ce texte. Par « réseau, micro-réseau, array, micro-array, puce, chip», termes qui seront employés indifféremment dans le présent texte, on entend définir un réseau de cellules ou de molécules biologiques ou chimiques disposées sur un support solide en des emplacements particuliers (formant par exemple une matrice).
Les molécules ou cellules sont typiquement fixées sur des emplacements respectifs d'un support solide revêtu d'un polymère et disposées de sorte que chacun des emplacements soit de la sorte associé à une molécule/cellule qui présente une spécificité par rapport aux molécules/cellules des autres emplacements.
Lorsque le réseau comprend des molécules biologiques telles que des acides nucléiques ou des peptides, on parle de bio-puce.
Plus précisément, lorsque le réseau est constitué de désoxyribonucléotides, on parle de puce à ADN ou de puce à oligonucléotides.
Le support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon®, en Kevlar®, en silicone, en silicium, ou encore en polyoses ou poly(hétéro-oses), tel que la cellulose. De préférence il s'agit du verre. Ce support pourra être de forme quelconque (lame plane, microbilles, ...) mais selon un mode préféré le support est un plan, et il s'agit d'une lame plane en verre.
Lorsque la puce est mise en contact avec un échantillon dans des conditions appropriées, certains composants de l'échantillon peuvent réagir sélectivement avec (et en particulier se lier à) une ou plusieurs molécules/cellules de la puce.
Et ces composants contiennent des marqueurs (typiquement des teintures ou molécules fluorescentes - que l'on nomme généralement
« fluorophores ») qui permettent de détecter la présence des composants après mise en contact de l'échantillon avec la puce. Cette détection nécessite dans le cas de fluorophores l'excitation de la puce avec une lumière de longueur d'onde contrôlée
« Molécule » recouvre ici les molécules chimiques, et les molécules biologiques.
Pour les applications biologiques, les « molécules biologiques » sont de préférence des acides nucléiques, de manière plus préférée des oligonucléotides simple brin.
Pour des applications chimiques, il peut s'agir de ligands chimiques de molécules biologiques.
Par « acide nucléique, sonde nucléique, séquence nucléique ou séquence d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, séquences oligonucleotidiques », termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucleotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucleotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin, un PNA (pour « Peptid Nucleic Acid ») ou LNA ( pour « Locked Nucleic Acid ») que des produits de transcription desdits ADNs tels que l'ARN.
Par « sonde, sonde oligonucléotidique ou oligonucléotide », on entendra désigner ici Poligonucléotide fonctionnalisé ou non qui sera déposé (ou « spotté ») et fixé par liaison covalente directement ou indirectement au support solide via un composé espaceur au niveau d'un emplacement.
L'oligonucléotide ainsi déposé est capable de se lier à un acide nucléique cible de séquences complémentaires (c'est-à-dire un oligonucléotide ou polynucléotide complémentaire) présent dans l'échantillon, par un ou plusieurs types de liaisons chimiques, habituellement à travers un appariement de base complémentaire en formant des liaisons hydrogène.
De préférence, lesdites sondes sont des ADNs ou ARNs monobrins, de préférence des ADNs, dont la taille est comprise entre 10 et 7 000 bases (b), de préférence entre 10 et 1 000 b, entre 10 et 500 b, entre 10 et 250 b, entre 10 et 100 b, entre 10 et 50 b, ou entre 10 et 35 b.
Les sondes oligonucleotidiques déposées peuvent être synthétisées chimiquement, purifiées à partir de l'échantillon biologique ou plus généralement produites par les technologies de l'ADN recombinant à partir de polynucléotides naturels et/ou purifiés.
Des exemples, les sondes peuvent être produites par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ou par RT-PCR (réaction de transcription inverse suivie d'une réaction PCR).
« Emplacements ou spot» correspond aux endroits de la puce au niveau duquel sont liées les molécules.
Une même molécule est de préférence présente en plusieurs copies au niveau d'un emplacement.
Les emplacements sont définis par leurs coordonnées en x et y par rapport à un point de référence sur la puce.
Un emplacement ou spot peut, par exemple, correspondre à une cercle de diamètre dépendant du volume d'une goutte de solution déposée dans une zone définie d'un plan, ou à un puit, ou encore à un pavé de dimension parallélépipédique de gel (appelé gel pad).
« Echantillon» correspond à une solution de molécules biologiques, biochimiques ou chimiques ou à un groupe cellulaire, dont on désire caractériser certaines propriétés.
Dans une application préférée de l'invention, l'échantillon est une solution contenant au moins un polynucléotide obtenu à partir d'une source biologique. L'échantillon peut provenir d'une source vivante ou morte à partir de différents tissus ou cellules.
Des exemples d'échantillons biologiques comprennent les fluides biologiques, tels que le sang (notamment les leucocytes), l'urine, la salive, le sperme, les sécrétions vaginales, la peau, et également les cellules telles les cellules des follicules de la racine des cheveux, les cellules des tissus internes normaux ou pathologiques, en particulier provenant de tumeurs, les cellules des tissus de la villosité choriale, les cellules amniotiques, les cellules placentaires, les cellules fétales, les cellules du cordon ombilical.
Par « Marqueur» ou « marqueur générateur de signal » on entend désigner un marqueur que l'on peut associer directement ou indirectement à une molécule biologique, biochimique ou chimique de l'échantillon, en vue de sa détection ultérieure par des moyens de lecture tels que ceux des lecteurs selon l'invention.
Le marqueur générateur de signal est de préférence sélectionné parmi les enzymes, les colorants, les haptènes, les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine ou les agents luminescents. De préférence, le marqueur générateur de signal selon l'invention est un agent luminescent, qui selon la source d'énergie d'excitation, peut être classé en radio luminescent, chémiluminescent, bioluminescent et photo-luminescent (incluant fluorescent et phosphorescent).
De préférence, le marqueur générateur de signal selon l'invention est un agent fluorescent.
Le terme "fluorescent" se réfère en général à la propriété d'une substance telle un fluorophore de produire de la lumière lorsqu'elle est excitée par une source de lumière dans une longueur d'onde déterminée, appelée longueur d'onde d'excitation et d'émettre une lumière dans une longueur d'onde supérieure appelée longueur d'onde d'émisssion, qui pourra être détectée à l 'aide d'un capteur de photons, fournissant les signaux dont l'ensemble permettra de constituer une image des signaux d'hybridation de la puce.
Parmi les fluorophores mis en œuvre dans l'invention, on peut citer de manière non exhaustive :
• l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) [longueur d'onde maximale d'absorption : 494 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 517 nm] ;
• le Rouge Texas (TR pour Texas Red) [longueur d'onde maximale d'absorption : 593 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 613 nm] ; • la cyanine 3 (Cy3) [longueur d'onde maximale d'absorption :554 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 568 nm] ;
• la cyanine 5 (Cy5) [longueur d'onde maximale d'absorption :652 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 670 nm] ;
• la cyanine 5,5 (Cy5,5) [longueur d'onde maximale d'absorption :675 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 694 nm] ;
• la cyanine 7 (Cy7) [longueur d'onde maximale d'absorption: 743 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 767 nm] ;
• le Bopidy 630/650 [longueur d'onde maximale d'absorption :632 nm / longueur d'onde maximale d'émission : 658 nm]. • L'Alexa 488 (495/519)
• L'Alexa 350 (347/422)
• La Rhodamine Red dye (570/590)
« Réaction » désigne une réaction chimique ou biologique (hybridation par exemple) ayant lieu entre une molécule associée à un emplacement de la puce et une molécule de l'échantillon.
L' « hybridation » est une réaction qui se réfère à la liaison entre une oligonucléotide déposé (ou « spotté ») et une séquence cible provenant de l'échantillon biologique par appariement des bases complémentaires. L'hybride ou duplex résultant de l'hybridation est appelé complexe d'hybridation ou duplex d'hybridation.
Un complexe d'hybridation peut être soit un complexe complémentaire ou un complexe avec mésappariement. Ainsi, un complexe complémentaire est un complexe d'hybridation dans lequel il n'y a pas de mésappariement entre l'oligonucléotide déposé et entre la ou les séquences cible de l'échantillon.
Un complexe avec mésappariement est un complexe d'hybridation dans lequel il existe au moins un mésappariement entre l'oligonucléotide déposé et entre la ou les séquences cible de l'échantillon.
Une hybridation spécifique se réfère à la liaison, à la formation de duplex, ou à l'hybridation d'une molécule d'acide nucléique, seulement sur une séquence nucléotidique particulière dans des conditions stringeantes, et lorsque la séquence est présente dans un milieu complexe d'ADN ou d'ARN.
Un « oligonucléotide complémentaire » est une sonde dont la séquence est parfaitement complémentaire à une séquence cible particulière (on utilisera dans ce texte le terme de « match » pour désigner ce type d'appariement parfait).
Une sonde présentant un mésappariement (« mismatch ») se réfère à une sonde ou des sondes dont la séquence n'est pas parfaitement complémentaire à une séquence particulière cible.
Bien que le mismatch puisse être localisé n'importe où dans la sonde présentant les mesappanements, les mesappanements terminaux sont moins désirés car les mésappariements terminaux affecteront moins l'hybridation sur la séquence cible.
Ainsi, les sondes ont fréquemment un mésappariement situé au centre ou à côté du centre de la sonde, de telle sorte que le mésappariement a davantage de chance de déstabiliser le duplex avec la séquence cible dans des conditions d'hybridation. « Duplex » ou « hybride » correspond à un fragment d'ADN double brin. On verra que de tels duplexes sont obtenus par hybridation d'oligonucléotides (molécules disposées en des emplacements de la puce) avec les fragments simple brin d'un échantillon que l'on désire caractériser.
« Lecture » désigne de manière générale l'opération consistant à recueillir par un ou plusieurs capteurs adaptés la réponse des molécules après réaction, en vue de détecter un marqueur. Cette lecture peut en particulier être une lecture optique, mais également en alternative une lecture par recueil d'un signal tel qu'un rayonnement radioactif.
On remarquera que dans ce texte la définition du « lecteur » de puces va au-delà de cette simple opération de lecture, puisqu'elle comprend également l'analyse des signaux « lus ».
Problèmes à résoudre et résumé de l'invention
Aspect « source de lumière »
On connaît déjà des lecteurs de puces du type mentionné ci- dessus. De tels lecteurs permettent de recueillir, après réaction des molécules d'une puce avec les molécules d'un échantillon, la réponse desdites molécules à une excitation donnée.
Le recueil de cette réponse permet d'identifier des marqueurs réagissant spécifiquement à ladite excitation, qui peut être en particulier une illumination (excitation par une lumière) centrée sur une longueur d'onde déterminée. La puce, de préférence de forme plane, est placée sur une table, qui peut être déplacée selon les trois axes logitudinal, transversal et vertical x, y, z de manière à successivement recevoir sur les différents emplacements (ou sous-ensembles de spots) de la puce le rayonnement d'excitation, et à présenter aux moyens d'observation ces différents emplacements.
La puce peut être placée directement sur la table ou encore dans une chambre de traitement (par exemple chambre d'hybridation) qui est elle-même fixée sur la table. En alternative, la table peut être fixe (cas des moyens d'excitation et d'observation se déplaçant pour balayer les puits de la puce).
Ces lecteurs comprennent des moyens d'excitation qui se présentent généralement sous la forme d'une source de lumière (de l'ordre de quelques centaines de microns carrés à quelques millimètres carrés) permettant d'illuminer les molécules ou les cellules de la puce avec un spectre de longueur d'onde contrôlée, pour provoquer l'excitation d'un marqueur générateur de signal, de préférence fluorescent, que l'on recherche en association avec la molécule.
Ces moyens d'illumination se présentent généralement sous la forme d'une lampe (typiquement à xénon ou à mercure), ou d'une ou plusieurs diodes laser(s).
Les lampes à xénon fournissent un spectre continu et régulier, recouvrant les longueurs d'onde d'excitation de la plupart des marqueurs habituellement utilisés. Cependant, une limitation de ces lampes est que le niveau d'énergie associé aux raies d'excitation des différents marqueurs peut être trop bas pour réaliser une excitation suffisante des raies désirées.
Les lampes à mercure fournissent, quant à elles, un spectre présentant des raies (maxima d'énergie) pour certaines longueurs d'onde. De telles lampes permettent ainsi d'exciter suffisamment les marqueurs fluorescents excitables aux longueurs d'onde correspondant à ces raies.
Cependant, les raies d'excitation des lampes à mercure ne comprennent pas en particulier les longueurs d'onde permettant d'exciter le fluorophore (qui peut être du type Cy5, Cy7 ou un autre fluorophore ne pouvant être efficacement excités par une lampe à large spectre), couramment employé dans les applications de ces lecteurs. Ceci constitue une limitation importante des lampes à mercure. En alternative aux lampes, il est connu de réaliser les moyens d'illumination du lecteur sous la forme d'un ou plusieurs laser(s) de longueur(s) d'onde donnée(s).
Les lasers « rouges » qui sont très courants et peu onéreux constituent ainsi une solution pratique et accessible pour exciter des marqueurs tels que la cyanineδ ou la cyanine7. Mais dans le cas où l'on désire exciter des marqueurs réactifs à des longueurs d'onde situées dans les zones du bleu ou proches de l'ultra violet (par exemple pour exciter un marqueur du type FITC, il est nécessaire d'avoir recours à un laser de type moins courant, ce qui se traduit par un inconvénient important en terme de prix.
Il apparaît ainsi que les solutions connues pour réaliser des moyens d'illumination des lecteurs comportent des limitations.
Un but de l'invention est de permettre de s'affranchir de ces limitations concernant les moyens d'illumination.
Aspect « contrôle de température »
Par ailleurs, pour de nombreuses applications, telles par exemple les réactions d'hybridation d'oligonucléotides ou les réactions enzymatiques sur la puce, il serait avantageux de suivre avec le lecteur les paramètres de ces réactions en fonction de la température de la puce.
Il est ainsi connu de prévoir que la table du lecteur soit contrôlée en température. On trouvera un exemple d'un tel lecteur dans le document US 6 329 661.
Le fait d'ainsi associer à un lecteur de puces une table contrôlée en température peut permettre de commander la température de la table par l'envoi d'une consigne déterminée.
Un autre but de l'invention est de perfectionner cette disposition. En particulier, un but de l'invention est de permettre la lecture de puces dans les conditions de température optimales pour l'observation des paramètres désirés, de manière automatique.
Afin d'atteindre les buts exposés ci-dessus, l'invention propose selon un premier aspect un dispositif de lecture et analyse de puces, comprenant :
• Une table pour recevoir une puce destinée à caractériser au moins un échantillon,
• Des moyens d'excitation des molécules ou des cellules de la puce, après réaction avec d'autres molécules,
• Des moyens de lecture et d'analyse des molécules soumises à excitation, caractérisé en ce que le dispositif comprend également :
• une centrale de commande de température de ladite table, ladite centrale de commande étant reliée à un module (111) comportant une pluralité d'éléments de chauffage / refroidissement de type
Peltier disposés en regard de différents emplacements de la surface de la table,
• et au moins un capteur de température de la table (112) également relié à ladite centrale de commande Des aspects préférés, mais non limitatifs, de ce dispositif sont les suivants : • la lampe est une lampe à mercure,
• le laser est un laser dont le rayonnement est centré sur une longueur d'onde de l'ordre de 635 nm,
• le lecteur comprend plusieurs lasers, • les lasers sont centrés sur la même longueur d'onde,
• les moyens d'excitation comprennent au moins un laser associé à un module de balayage de son faisceau pour exciter les molécules à analyser,
• le lecteur comprend deux lasers et les modules de balayage des deux lasers commandent deux balayages respectifs des molécules dans deux directions orthogonales,
• les moyens d'excitation comprennent au moins un ensemble de laser comprenant un laser dont le rayonnement est guidé par une fibre optique, • les moyens d'excitation comprennent deux ensembles de laser identiques,
• les moyens d'excitation comprennent un laser fixe qui dirige son faisceau vers deux ensembles de miroir successifs montés en série et dont le déplacement est commandé le long de deux directions différentes,
• le déplacement des deux ensembles de miroir sont commandés de manière à produire un faisceau qui peut emprunter toute séquence désirée sur la puce,
• les moyens d'excitation comprennent une lampe et un laser dont les rayonnements empruntent un même chemin optique grâce à un miroir basculant apte à pivoter autour d'un axe entre deux positions pour diriger un de ces deux rayonnements vers la puce,
• une chaîne optique est interposée entre la lampe et les molécules à exciter, tandis que l'excitation par laser se fait par illumination directe des molécules, • ladite chaîne optique comprend des filtres de la lumière d'excitation à bande passante étroite ainsi que des filtres à bande passante étroite de la lumière en émission et un séparateur de faisceau
• le lecteur comprend également une centrale de commande d'excitation reliée à chacun des moyens d'excitation pour la commande de leur fonctionnement,
• ladite centrale de commande d'excitation est apte à sélectivement commander l'illumination simultanée ou successive des molécules avec la lampe et au moins un laser, ou l'excitation séparée des molécules avec la lampe et au moins un laser.
L'invention propose également un dispositif de lecture et d'analyse de puces, comprenant :
• Une table pour recevoir une puce destinée à caractériser au moins un échantillon,
• Des moyens d'excitation des cellules ou molécules de la puce, après réaction avec d'autres molécules ou cellules,
• Des moyens de lecture des molécules ou cellules soumises à excitation, caractérisé en ce que le lecteur comprend également une centrale de commande de la température.
Des aspects préférés, mais non limitatifs de ce dispositif sont les suivants :
• la table comprend un capteur de température relié à ladite centrale de commande de température. • le lecteur comprend un module de chauffage/refroidissement associé à la table et destiné à contrôler sa température, ledit module de chauffage/refroidissement étant relié à la centrale de commande de température.
• le lecteur comprend également des moyens de traitement comprenant un microprocesseur et reliés à la centrale de commande de température ainsi qu'aux moyens de lecture. • le lecteur comprend des moyens de mémorisation de courbes de référence de la réponse des match et mismatch des molécules aux moyens d'excitation en fonction de la température.
• les moyens de mémorisation sont reliés à des moyens permettant de déterminer une température de fusion des match et mismatch des molécules à partir desdites courbes de référence.
• la centrale de commande de température est apte à commander le fonctionnement du lecteur selon un mode « statique » dans lequel des courbes de référence préétablies de la réponse des match et mismatch des molécules en fonction de la température sont utilisées pour établir une température de consigne apte à être transmise par ladite centrale de commande de température pour commander la température de ladite table.
• la centrale de commande de température est apte à commander le fonctionnement du lecteur selon un mode « dynamique » dans lequel la centrale de commande de température commande une évolution donnée de température au niveau de la table, et, pendant cette évolution de température :
> les moyens de lecture recueillent en temps réel la réponse des molécules associées aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation, et transmettent ladite réponse à des moyens de traitement,
> des moyens de mémorisation mémorisent pour chaque emplacement de la puce l'évolution de la réponse de la molécule en fonction de la température.
• le lecteur comprend des moyens de traitement aptes à établir pour chaque molécule, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, un diagnostic d'état de la molécule.
• ledit diagnostic d'état est un diagnostic de match/mismatch. Et l'invention concerne également un procédé de mise en œuvre d'un tel dispositif, pour la lecture de puces.
Un tel procédé peut en particulier être un procédé d'hybridation des oligonucléotides d'une puce, pouvant être mis en œuvre par un lecteur selon un des aspects ci-dessus, le procédé comprenant les étapes consistant à :
> Mettre en contact des sondes nucléiques correspondant à un acide nucléique cible avec un échantillon biologique contenant des fragments simple brin d'ADN, de manière à réaliser une hybridation sélective de certaines sondes avec lesdits fragments simple brin d'ADN de l'échantillon, en constituant des duplexes,
> Effectuer une lecture des duplexes ainsi constitués, le procédé étant caractérisé en ce que le procédé comprend une étape de détermination automatique de : la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « match », et
> la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « mismatch ».
Des aspects préférés, mais non limitatifs d'un tel procédé sont les suivants :
• ladite détermination est réalisée en mode « statique » en utilisant des courbes de référence illustrant l'évolution, en fonction de la température, du signal reçu par des moyens de lecture de duplexes correspondant respectivement à des match et à des mismatch, • le procédé comprend le contrôle de la température de manière à réaliser l'hybridation à une température correspondant à une discrimination maximale entre match et mismatch,
• le procédé comprend la constitution desdites courbes de référence lors d'une étape précédant l'étape de lecture, • le procédé comprend la mémorisation desdites courbes de référence, • ladite détermination peut être réalisée en mode « dynamique » par la commande d'une évolution donnée de température des échantillons, et, pendant cette évolution de température, on procède :
> au recueil en temps réel de la réponse des duplexes associés aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation,
> à la mémorisation pour chaque duplex de l'évolution de la réponse en fonction de la température,
• le procédé comprend pour chaque duplex l'établissement, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, d'un diagnostic de match/m ismatch du duplex.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent à la lecture de la description suivante avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après :
• La figure 1 est un schéma de principe d'un lecteur selon l'invention.
• La figure 2 comprend :
> Dans sa partie haute, un schéma de principe de la table d'un lecteur selon l'invention, détaillant les moyens de contrôle de température, > Dans sa partie basse, un graphe représentatif d'une évolution de température possible (et faisant notamment apparaître que des évolutions rapides de température - de l'ordre de 2,3 °C/s - sont possibles avec le dispositif selon l'invention),
• les figures 3a à 3d sont des schémas illustrant quatre variantes de réalisation de tout ou partie des moyens de lumière d'excitation d'un tel lecteur, la figure 3a comprenant en outre une illustration du balayage d'une puce par les sources de lumière des moyens d'excitation,
• Les figures 4a et 4b sont des graphes relatifs à une application de l'invention à l'hybridation moléculaire : > La figure 4a est une courbe de référence illustrant l'évolution en fonction de la température du signal en tous points d'une puce, reçu par les moyens de lecture, pour une même séquence d'ADN en configuration d'appariement parfait (« match ») et en configuration de mésappariement (« mismatch »),
> La figure 4b illustrant un mode dit « dynamique » de mise en œuvre de l'invention dans lequel on construit des courbes du type de celles de la figure 4a, pour plusieurs séquences d'ADN,
• La figure 5 est un schéma d'une réaction d'immobilisation de sondes sur lame présentant une fonction aldéhyde (lame Super Aldéhyde de
TéléChem). Des groupes aldéhyde sont attachés de manière covalente au support en verre de la biopuce (rectangle). La fonction NH2 de la molécule d'ADN attaque la groupe aldéhyde pour former une liaison covalente (figure centrale). La liaison est stabilisée par une réaction de déshydratation (séchage dans une atmosphère faiblement humide) qui conduit à la formation d'une base de Schiff, • La figure 6 illustre des images de la fluorescence Cy3 de l'hybridation d'un mélange d'oligonucléotides sauvage Q493X-Cy3 et muté Q493X- Cy5 sur une biopuce comprenant les sondes correspondantes déposées à différentes concentrations (50, 100 et 200 uM) puis immobilisées avec différentes conditions (faible te forte humidité). L'hybridation est réalisée dans du SSC 6X, DSD 0,2% , BSA 0,2 mg/ml à température ambiante pendant 12 heures. La concentration des oligonucléotides est de 0,5 uM. Le lavagede la biopuce après l'hybridation est réalisée dans du SSC 6X, SDS 0,2% pendant 5 minutes à température ambiante suivi dans du SSC 2X pendant 2 minutes à température ambiante, • la figure 7 montre des intensités de signaux de fluorescence et des ratios bruit/signal correspondent à l'hybridation d'une solution d'oligonucléotides wtQ493X-Cy3 et mutQ493X-Cy5 pour des puces comportant des sondes correspondant à différentes concentrations (50, 100 and 200 μM) et immobilisées sous différentes conditions (humidité basse et haute), • la figure 8 représente des images de fluorescence correspondent à l'hybridation d'oligonucléotides ΔF-508 wild type marqués au Cy3, et d'oligonucléotides Q493X mutés marqués au Cy5.
Description détaillée de l'invention
En référence à la figure 1 , on a représenté de manière schématique un lecteur 10 selon l'invention.
Le lecteur 10 comprend : • Une table 11 pour recevoir une puce 12,
• Des moyens 13 d'excitation,
• Des moyens 14 de lecture (c'est à dire d'observation des molécules de la puce, en particulier en réponse à une excitation émise par les moyens 13), • Des moyens de commande et de contrôle.
Table 11
La table 11 est détaillée dans la partie haute de la figure 2. Cette table comporte de manière classique des moyens 110 pour tenir une puce 12.
Ces moyens peuvent comprendre une chambre - par exemple une chambre d'hybridation.
La table 11 est associée à un module 111 de chauffage/refroidissement apte à contrôler la température de la table.
Plus précisément, le module 111 comporte une pluralité d'éléments de chauffage / refroidissement par effet Peltier. Ces éléments Peltier sont intégrés dans l'épaisseur de la table 11.
Chacun de ces éléments Peltier est situé en regard d'un emplacement de la surface de la table 11 - et donc de la puce 12 qui est portée par la table. Lesdits emplacements sont adjacents les uns aux autres, et leur réunion couvre la totalité de la surface de la puce.
Il peut être avantageux de prévoir que ces emplacements correspondent aux emplacements de la puce qui recevront les sondes (voir plus loin dans le texte).
Le module 111 est par ailleurs relié à une centrale de commande de température 15 qui élabore une consigne de température et la transmet au module 111 afin que celui-ci adapte la température de la table en conséquence, avec une vitesse de variation de température dépendant du phénomène physicochimique observé.
Plus précisément, la centrale de commande élabore une consigne individuelle de température à destination de chaque élément Peltier du module 111.
Ces éléments Peltier présentent des grandes qualités de précision - ils assurent typiquement une température de consigne avec une précision de l'ordre de 0,01 °C.
Le module 111 formé par la réunion de ces éléments Peltier est associé à un module d'échange de chaleur, pour permettre le chauffage / refroidissement de la table 11. Ce module d'échange de chaleur peut fonctionner par circulation d'air, ou de fluide.
Il est ainsi possible de commander finement la température en tout emplacement de la table.
On peut en particulier de la sorte assurer que la température est strictement la même en tous les emplacements de la table 11.
Ceci est encore favorisé par le fait que les éléments Peltier sont très réactifs à des changements de consigne de température (à la hausse ou à la baisse).
Ces éléments peuvent donc assurer avec précision des changements de température rapides (typiquement, avec une précision de l'ordre de 0,01 °C, et avec une vitesse de changement de quelques degrés par seconde).
Il est ainsi possible que l'on souhaite mettre en œuvre une évolution de température « rapide » - évolution de l'ordre de quelques degrés par seconde, mise en œuvre par exemple dans des réactions de type PCR (acronyme de Polymerase Chain Reaction).
Il est également possible que l'on souhaite mettre en œuvre une évolution « lente » (évolution de l'ordre de quelques degrés par minute - mise en œuvre par exemple dans des réactions de type fusion de brins d'ADN en vue de leur dissociation).
Pour pouvoir mettre en œuvre ces différents types d'évolutions, au moins une table de correspondance est mémorisée dans une mémoire du dispositif accessible par la centrale 15 (par exemple une mémoire de l'ordinateur 17 qui va être décrit). On notera que la vitesse dépend non seulement du type de réaction envisagé, mais également du type de sonde utilisé, et de l'échantillon que l'on souhaite caractériser.
A cet égard, la ou les table(s) de correspondance prennent également en compte ces paramètres. Et l'utilisateur du dispositif peut ainsi entrer dans une interface adaptée (clavier ou autre) et reliée à la centrale 15 et/ou à l'ordinateur 17 les paramètres (en particulier type de réaction, sonde, échantillon) en fonction desquels un, programme associé à la ou aux table(s) de correspondance sélectionnera automatiquement l'évolution de température à transmettre en consigne au module 111.
Un capteur 112 de température est par ailleurs intégré dans la table, pour recueillir sa température effective et la transmettre à centrale de commande de température 15 à laquelle ce capteur est également relié.
De la sorte, la température des emplacements de la puce est contrôlée par la centrale de commande de température 15, et cette température des emplacements de la puce est en outre connue en temps réel par la centrale de commande de température.
Il est par ailleurs possible de prévoir plusieurs capteurs de température 112, en regard de groupes d'emplacements ou même de chacun des emplacements individuels de la puce.
Le(s) capteur(s) 112 est (sont) intégré(s) dans la table 11.
Et comme on le verra plus en détail plus loin dans ce texte
(notamment à propos du mode dynamique), ce(s) capteur(s) de température permet(tent) d'enregistrer les paramètres de température associés au fonctionnement du dispositif, et également de réguler ce fonctionnement.
Moyens d'excitation 13
Les moyens d'excitation 13 comprennent deux types de sources de lumière :
• Une lampe 131 à spectre large - de préférence une lampe à mercure,
• Au moins un laser 132.
Ce laser émet selon une longueur d'onde qui permet d'exciter les marqueurs habituellement utilisés, et dont le spectre d'excitation ne correspond pas au spectre d'émission de la lampe 131.
Dans le mode de réalisation préféré dans lequel la lampe est une lampe à mercure - qui ne permet pas d'exciter le marqueur Cy5 - le laser est un laser rouge classique émettant autour d'une raie centrée sur 635 nm ou d'autres lasers permettant l'excitation de la molécule de Cy5.
De la sorte, l'ensemble des marqueurs luminescents habituellement utilisés peuvent être excités par les moyens d'excitation 13.
Et le recours à un laser n'augmente pas ici de manière significative le prix de revient du lecteur, ce type de laser étant extrêmement courant et bon marché. Les moyens d'excitation 13 comprennent également une source d'alimentation électrique respective 1310, 1320 pour chaque type de source de lumière.
Les moyens 13 comprennent en outre une chaîne optique 1311 interposée entre la lampe 131 et la table (donc entre la lampe et les molécules de la puce).
Comme représenté sur la figure 3a, cette chaîne optique comprend un filtre d'excitation 13111 , et un séparateur de faisceau 13112 permettant de : • Diriger vers la puce le rayonnement issu de la lampe et du filtre 13111 , • Et diriger vers les moyens de lecture 14 le signal issu de la puce en réponse à l'excitation reçue de la lampe (ou du ou des laser(s) des moyens d'excitation).
On précise que ladite chaîne optique peut également comprendre des filtres de la lumière d'excitation à bande passante étroite ainsi que des filtres à bande passante étroite de la lumière en émission (au moins 2 et jusqu'à 8) et un séparateur de faisceau.
Les rayonnements dirigés vers la puce, et issus de cette puce, peuvent en outre traverser un objectif 134. Les moyens d'excitation 13 comprennent également des moyens de changement de filtre interférentiel 1312 (représentés sur la figure 1), qui sont reliés au filtre 13111 et à des moyens 16 de contrôle de filtres.
On comprend donc que l'excitation des molécules de la puce par le rayonnement issu de la lampe se fait par l'intermédiaire d'une chaîne optique.
L'excitation des molécules de la puce par le rayonnement issu du laser se fait quant à elle de manière directe, aucun élément n'étant interposé entre le laser et la puce.
Dans la variante qui est plus particulièrement illustrée sur la figure 3a, les moyens d'excitation comprennent deux lasers 1321 et 1322. Ces deux lasers sont identiques. Chaque laser est associé à un module (non représenté) de balayage des de la biopuce.
Dans le cas où le lecteur ne comporte qu'un laser, ce laser est lui aussi associé à un module remplissant cette fonction, dans un faisceau de géométrie paramétrable .
Pour couvrir de manière efficace un champ de vue correspondant aux emplacements de la puce que l'on souhaite caractériser, et illuminer par laser ce champ de vue de manière homogène, les deux modules de balayage commandent deux balayages respectifs des molécules dans deux directions orthogonales.
Ce type de balayage est illustré dans la partie inférieure de la figure 3a.
Les deux bandes 13210 et 13220 représentent les faisceaux respectifs des deux lasers 1321 et 1322. Ces deux faisceaux ont une section allongée, les directions d'allongement des deux faisceaux étant orthogonales.
Chacune de ces directions peut être alignée sur une des deux directions d'alignement des emplacements de la puce, ces emplacements formant généralement une matrice rectangulaire. Chaque faisceau est déplacé par le module de balayage de son laser associé sur le champ de vue 120, selon une direction orthogonale à la direction d'allongement du faisceau.
La figure 3b représente une deuxième variante de réalisation des lasers des moyens d'excitation 13. Ces lasers sont destinés à être mis en œuvre à la place des lasers 1321 et 1322.
D&ans cette variante, l'excitation des lasers est dirigée vers la puce 12 par deux ensembles identiques 1321' et 1322' qui produisent deux faisceaux respectifs 13210' et 13220'
Un de ces ensembles, référencé 1321', est représenté en partie supérieure de la figure 3b. Cet ensemble comprend un laser 13211' associé à une lentille de sortie 13212' qui dirige le flux issu du laser vers une fibre optique 13213'.
Cette fibre transmet elle-même le rayonnement jusqu'à une autre lentille, notée 13214', qui est montée fixe par rapport à la puce et dirige vers elle le faisceau 13210'.
La partie basse de la figure 3a représente l'impact des deux faisceaux 13210' et 13220' sur la puce et le champ d'illumination 1320 ainsi défini.
Les lasers peuvent ainsi être déportés. La figure 3c représente une troisième variante du système de laser(s) dans laquelle au moins un laser fixe 132" dirige son faisceau vers deux ensembles de miroir successifs montés en série, notés 1321" et 1322".
Chacun de ces ensembles de miroir comprend un miroir dont l'orientation est commandée par un actuateur piézoélectrique respectif 13210", 13220".
Plus précisément, chaque miroir est ainsi déplacé selon un axe respectif, qui correspond à un des axes X, Y transversaux de la puce 12.
Le faisceau 1320" issu des deux miroirs est décrit ainsi sur la puce un trajet 13201" qui peut emprunter toute séquence désirée en X, Y.
Ici encore, ce système de laser peut remplacer les lasers 1321 , 1322 de la figure 3a.
La figure 3d illustre enfin une autre variante de réalisation des moyens d'excitation 13, qui correspond à une alternative aux moyens représentés sur la figure 3a.
Cette figure 3d représente une lampe à mercure 131 , et un laser 132.
Le laser et la lampe sont associés chacun à une lentille de sortie respective. Dans cette variante, les rayonnements respectifs issus du laser et de la lampe empruntent le même chemin optique, grâce à un miroir basculant 130 apte à pivoter autour d'un axe 1300 entre deux positions pour diriger un de ces deux rayonnements vers une série de lentilles 1301 et un miroir de renvoi 1302 permettant de diriger le rayonnement vers l'optique 134 et la puce 12. Les moyens de commande de basculement du miroir 130 peuvent commander toute séquence permettant d'illuminer la puce avec les deux types de rayonnement (laser et lampe), par exemple en pivotant entre ses deux positions ave une fréquence désirée.
On précise que dans toutes les variantes présentées ci-dessus, les moyens d'excitation peuvent comprendre un laser, ou plusieurs lasers identiques.
Moyens de lecture 14
Les moyens de lecture 14 comprennent une chaîne optique 141 d'acquisition de l'image du champ 120 de la puce 12, cette puce pouvant par ailleurs être déplacée par rapport au reste du lecteur par un mouvement commandé de la table 11.
A cet effet, les moyens de lecture comprennent également des moyens de registre pour coordonner les déplacements de la table 11.
La chaîne optique 141 comprend ainsi une première optique d'acquisition 1411 , et un filtre 1412 interposé entre cette première optique et une caméra CCD 142.
La chaîne optique 141 comprend également des moyens de changement de filtre 14120 (représentés sur la figure 1), qui sont reliés au filtre 1412 et aux moyens 16 de contrôle de filtres.
Moyens de contrôle et de commande Les moyens de contrôle et de commande du lecteur comprennent, outre la centrale de commande de température 15 et les moyens 16 de contrôle de filtres déjà évoqués, un ordinateur 17 qui gère le fonctionnement de l'ensemble des composants du lecteur. L'ordinateur est relié aux éléments suivants de manière à leur transmettre des instructions de fonctionnement et/ou à en recevoir des informations :
> sources d'alimentation 1310 et 1320 - l'ordinateur remplit à cet égard la fonction d'une centrale de commande d'excitation. On précise que l'ordinateur peut sélectivement commander :
P l'illumination simultanée des molécules de la puce avec la lampe et au moins un laser, P ou l'excitation séparée des molécules avec la lampe et au moins un laser, > centrale de commande de température 15 ,
> moyens 16 de contrôle de filtres,
> ainsi que les autres éléments de contrôle et de commande qui suivent.
Les moyens de contrôle et de commande du lecteur comprennent ainsi également :
• un module 18 de commande de déplacement de la table 11 , relié à cette table et à l'ordinateur 17,
• un module 19 de commande de la caméra 142, et d'acquisition des images de cette caméra, selon des modalités variables qui incluent le mode temps réel pour le suivi d'un phénomène dynamique ou avec temps de pause pour l'augmentation du rapport signal-sur-bruit des images avec des spots (signaux d'hybridation) de très faible intensité.
Fonctionnement du lecteur On a ci-dessus décrit en détail la structure du lecteur selon l'invention. On a également abordé certains aspects de son fonctionnement, en particulier en ce qui concerne l'excitation des molécules de la puce. On va maintenant détailler le fonctionnement de ce lecteur, en ce qui concerne le contrôle de la température.
Plus précisément, on va décrire ce fonctionnement sur la base d'une application préférée de l'invention, qui est l'hybridation d'oligonucléotides d'une puce avec les fragments simple brin d'ADN issus d'un échantillon biologique.
On précise toutefois que le lecteur selon l'invention peut être mis en œuvre pour d'autres applications - par exemple pour réaliser des réactions enzymatiques (en particulier du type ligase, PCR, extension d'oligonucléotide simple, ...), de criblage de ligands. Revenant à l'application d'hybridation, on étudie un échantillon biologique - par exemple issu d'un patient - pour y détecter certaines caractéristiques génétiques. La caractéristique recherchée peut par exemple être la présence éventuelle de mutations dans une séquence d'acide nucléique particulière, telle par exemple le gène CFTR. Le procédé débute de manière classique avec la préparation d'une puce, en constituant aux différents emplacements de la puce des sondes nucléiques constituées à partir de nucleotides correspondant à un acide nucléique cible.
Ces sondes sont destinées à être hybridées avec l'échantillon contenant des fragments. simple brin d'ADN.
Les fragments simple brin d'ADN sont obtenus par ailleurs, de manière connue, en particulier par amplification PCR. Ils sont associés à un marqueur de manière à permettre leur détection par les moyens de lecture du lecteur, après hybridation de ces fragments avec les sondes de la puce. On met ensuite en contact lesdites sondes avec l'échantillon de manière à réaliser une hybridation sélective de certaines sondes avec lesdits fragments simple brin d'ADN de l'échantillon, de manière à constituer des duplexes.
On précise que toutes les sondes ne s'hybrident pas avec les brins d'ADN de l'échantillon. En effet, chaque sonde nucléique s'hybridera préférentiellement avec son acide nucléique cible.
Et certaines sondes correspondent ainsi à un acide nucléique sans mutation, alors que d'autres correspondent à un acide nucléique comprenant une mutation donnée. Lors de cette étape d'hybridation se constituent des duplexes, pour les sondes qui sont effectivement hybridées.
Le fait qu'une sonde s'hybride correctement signifie que l'échantillon contient des fragments simple brin d'ADN correspondant à l'acide nucléique cible de ladite sonde. Une sonde s'hybridant de la sorte correspond ainsi à un duplex de type « match » après l'étape d'hybridation.
Et une sonde ne s'hybridant pas - ou s'hybridant mal - avec les fragments simple brin d'ADN de l'échantillon correspond après l'étape d'hybridation à un duplex de type « mismatch » ou même à un simple brin non hybride.
La température est un paramètre important de cette étape d'hybridation.
En effet, pour chaque acide nucléique cible il existe :
• une température Tm1 de fusion d'un duplex en configuration « mismatch », et
• une température Tm2 de fusion d'un duplex en configuration « match ».
La température de fusion correspond à la température à laquelle les deux brins de la moitié des duplexes se séparent.
Tm1 est inférieure à Tm2, comme illustré sur la figure 4a. Et il est désirable de réaliser, pour un acide nucléique cible donné, l'étape d'hybridation à une température correspondant à une discrimination maximale entre match et mismatch.
On peut en effet ainsi visualiser sélectivement les duplex « match » et « mismatch », avec les moyens de lecture du lecteur de puce.
Cette température désirée est située entre Tm1 et Tm2.
Dans le cas des procédés d'hybridation connus, il est généralement nécessaire de répéter plusieurs hybridations afin d'aboutir à une température proche de cette température désirée. Dans le cas de l'invention, le contrôle de la température par l'intermédiaire de la centrale de commande de température 15 permet de s'affranchir de cet inconvénient.
Plus précisément, cette application de l'invention peut être mise en œuvre selon deux modes : un mode dit « statique » et un mode dit « dynamique ».
Dans ces deux modes, on va déterminer automatiquement :
• la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « match », et
• la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « mismatch ».
Mode statique
Ce mode est bien adapté au cas d'une puce dont les sondes correspondent au même acide nucléique cible ou à des acides nucléiques cibles ayant des températures de fusion voisines.
Dans ce mode, ladite détermination de températures de fusion est réalisée au préalable, de sorte que ces températures sont connues avant d'effectuer la caractérisation. Ces températures peuvent être connues de l'opérateur qui mène cette caractérisation et qui entre en conséquence une valeur de consigne de température dans le dispositif (à l'aide d'une interface reliée à l'ordinateur 17, ou directement à la centrale 15).
Ces températures peuvent également être mémorisées dans une mémoire du lecteur qui est reliée à ladite centrale 15. On contrôle ainsi la température de la puce de manière à réaliser l'hybridation à une température correspondant à une discrimination maximale entre match et mismatch.
On précise que les températures de fusion peuvent également être déterminées par le lecteur (voir mode dynamique ci-après), et mémorisées pour la mise en œuvre du mode statique.
Lors d'une telle détermination a priori des températures de fusion on élabore des courbes de référence équivalentes à celles de la figure 4a.
Les courbes de référence peuvent ainsi être constituées lors d'une étape précédant l'étape de lecture. Dans ce cas, le lecteur est mis en œuvre' pour recueillir la réponse des sondes à des fragments simple brins de type connus (fragments correspondant à un acide nucléique cible sans mutation, et avec mutation), lorsque la température varie continûment sous l'effet de la commande de la centrale 15. Et ces courbes peuvent être mémorisées, par exemple dans l'ordinateur 17.
Mode dynamique
Ce mode est particulièrement bien adapté au cas d'une puce dont les sondes correspondent à des acides nucléiques cibles dont les configurations « match » ont des températures de fusion très différentes.
Dans ce mode, on commande une évolution de température de la puce (par exemple augmentation constante ou diminution constante), de manière à passer par les températures de fusion des différents acides nucléiques cibles des différentes sondes. Cette évolution est obtenue par l'envoi d'une consigne adaptée de la centrale 15 aux éléments Peltier du module 111 associé à la table. Pendant de cette évolution de température :
• les moyens de lecture 14 recueillent en temps réel la réponse des duplexes associés aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation 13, et transmettent ladite réponse à l'ordinateur 18,
• pour chaque emplacement de la puce, l'évolution de la réponse du duplex en fonction de la température est mémorisée dans une mémoire de l'ordinateur 18.
De plus, la présence d'au moins un capteur de température 112 dans la table permet :
• d'enregistrer tout au long de l'évolution les valeurs successives de température (et ce aux différents endroits de la table - et donc de la puce - où différents capteurs 112 sont disposés). Ceci permet de caractériser l'évolution de la réponse du duplex en fonction de la température,
• de contrôler la température sur la surface de la table. A cet égard, le(s) capteur(s) 112 permet(tent) une véritable régulation de température, au- delà d'une simple commande « aveugle » qui se contenterait de transmettre à un élément de chauffage une consigne de température. On rappelle que les éléments Peltier étant très réactifs et permettant des changements de température rapides, des applications du type PCR sont en outre envisageables. Et la combinaison d'éléments discrets de chauffage/refroidissement du type Peltier avec au moins un capteur de température permet ainsi : . de contrôler finement la répartition de température en tous les emplacements de la table (et donc de la puce), . et d'effectuer une véritable régulation allant au-delà d'une simple commande. L'ordinateur construit ainsi pour chaque emplacement de la puce une courbe illustrant l'évolution de réponse de la sonde en fonction de la température, comme représenté sur la figure 4b qui illustre le cas très simple d'une puce à quatre emplacements (courbes 1, 2, 3 et 4). Les sondes sont réparties par couples, une sonde du couple correspondant à un acide nucléique cible sans mutation, l'autre sonde correspondant au même acide nucléique cible avec une mutation.
La réponse des deux sondes de chaque couple va donc correspondre à deux courbes similaires aux deux courbes de référence de la figure 4a.
Et il sera possible, par analyse des courbes de chaque couple de sondes, de déterminer la sonde « match » et la sonde « mismatch ».
L'ordinateur comprend à cet effet un programme apte à établir pour chaque emplacement de la puce, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, un diagnostic d'état de la sonde associée à cet emplacement.
EXEMPLE DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION
Le lecteur de puce selon l'invention permet de lire des puces à ADN. C'est donc également un objet de la présente invention de fournir une puce à ADN composée de nombreux oligonucléotides (ou sondes) correspondant ou comprenant des fragments de gène sauvage ou muté, notamment du gène CFTR humain (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Une telle puce est particulièrement utile pour la détection de mutations du gène CFTR humain et le diagnostic de la mucoviscidose.
La mucoviscidose est l'une des maladies autosomiques récessives les plus fréquentes dans la population caucasienne puisqu'elle affecte environ une personne sur 2000 naissance en Amérique du Nord (Boat et al., The metabolic basis of inherited disease, 6th Ed. pp2649-1680, McGraw Hill, New York, 1989).
La mucoviscidose a été associée à des mutations dans le gène CFTR qui s'étend sur 250 kb et comprend 27 exons. Depuis la caractérisation du gène en 1989, de nombreuses analyses génétiques ont été menées pour définir le spectre des mutations de ce gène. Celles-ci sont d'une grande variété, et plus de 850 mutations ont ainsi été caractérisées. Cependant une mutation se retrouve à elle seule présente chez 50% des patients, il s'agit de la mutation Delta F508. La majorité des autres mutations est présente avec une faible incidence chez les patients (1-5 %).
Cette observation explique la complexité du développement des tests de diagnostic disponibles. Un test de diagnostic permet ainsi la détection d'environ 30 mutations distinctes en mettant en oeuvre des réactions de ligation en tube (OLA; Perkin Elmer). D'autres approches impliquant les technologies des puces à ADN ont été développées pour l'identification des mutations du gène humain CFTR. Il convient ainsi de citer les brevets US 6,027,880, US 5,837,832, US 5,972,618, US 5,981 ,178). Néanmoins, à ce jour aucun test ne permet la détection des mutations les plus fréquentes du gène CFTR de manière simple, rapide, efficace et fiable. C'est le problème que se propose également de résoudre la présente invention en développant une puce à ADN pour la détection de mutations du gène CFTR humain susceptible d'être utiliser avec le lecteur selon l'invention.
Caractéristiques de la puce CFTR
La présente invention fournit donc un réseau d'oligonucléotides ou puce à ADN (puce CFTR), pour la détection de mutations du gène CFTR humain. Ce réseau comprend un support solide sur lequel une pluralité d'oligonucléotides différents (les sondes) sont attachés de manière à ce que les dits oligonucléotides s'hybrident de manière efficace avec des oligonucléotides ou polynucléotides complémentaires (c'est-à-dire avec des oligonucléotides ou polynucléotides cibles présent dans l'échantillon biologique à tester, ou bien dériver de celui-ci), et de manière à ce que les dits oligonucléotides ayant des séquences de nucleotides différentes soient liés au dit support solide à des emplacements séparés de sorte que des oligonucléotides ayant une séquence nucléique spécifique s'hybrident de manière efficace avec des oligonucléotides ou des polynucléotides complémentaires cibles à une localisation particulière sur le dit support solide.
Ledit réseau se caractérise en ce qu'il comprend au moins une paire, au moins deux paires, au moins trois paires, au moins quatre paires, au moins cinq paires d'oligonucléotides, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 15 paires d'oligonucléotides, chaque paire d'oligonucléotides étant constituée par un oligonucléotide correspondant ou comprenant un fragment oligonucléotidique du gène CFTR sauvage (wt) et un oligonucléotide correspondant ou comprenant un fragment oligonucléotidique du gène CFTR muté (mut) et un oligonucléotide de contrôle négatif (cont) qui forme un duplex « mismatch » tant avec le gène CFTR muté que sauvage.
Deux ensembles de sondes de longueur environ 20 nt (en fonction de la composition de base) et de 15 nt sont constitués.
De préférence, ledit ensemble (sauvage/muté/contrôle) est sélectionné dans le groupe composé de :
ensemble N°1 : (cet ensemble n'a pas de sonde de contrôle) TAGGAAACACCAAAGATGATATTT (SEQ ID N°1) 24 mer CATAGGAAACACCAATGATATTTT (SEQ ID N°2) 24 mer ensemble N°2 :
AGGAAAACTGAGAACAGAATG (SEQ ID N°3) 21 mer AGGAAAACTAAGAACAGAATG (SEQ ID N°4) 21 mer AGGAAAACTTAGAACAGAATG (SEQ ID N° 5) 21 mer
ensemble N°3 :
ACCTTCTCCAAGAACTATATTG (SEQ ID N°6) / 22 mer ACCTTCTCAAAGAACTATATTG (SEQ ID N°7) 22 mer ACCTTCTCTAAGAACTATATTG (SEQ ID N° 8) 22 mer
ensemble N°4 :
TTCTTGCTCGTTGACCT (SEQ ID N° 9) / 17 mer TTCTTGCTCATTGACCT (SEQ ID N°10) 17 mer TTCTTGCTCCTTGACCT (SEQ ID N°11) 17 mer
ensemble N°5 :
TCGTTGACCTCCACTCA (SEQ ID N°12) / 17 mer TCGTTGATCTCCACTCA (SEQ ID N°13) 17 mer TCGTTGAACTCCACTCA (SEQ ID N°14) 17 mer
ensemble N°6
ACCTTCTCCAAGAAC (SEQ ID N°15) / 15 mer ACCTTCTCAAAGAAC (SEQ ID N°16) 15mer ACCTTCTCTAAGAAC (SEQ ID N° 17) 15mer
ensemble N°7 :
CTTGCTCGTTGACCT (SEQ ID N° 18) / 15 mer CTTGCTCATTGACCT (SEQ ID N°19) 15 mer CTTGCTCCTTGACCT (SEQ ID N°20) 15 mer ensemble N°8 :
TCGTTGACCTCCACT (SEQ ID N°21) / 15 mer TCGTTGATCTCCACT (SEQ ID N°22) 15 mer TCGTTGAACTCCACT (SEQ ID N°23) 15 mer
La paire N°1 permet la détection de la mutation la plus fréquente du gène CFTR qui est la mutation delta F508 situé dans l'exon 10. Cette mutation correspond à une délétion de 3 paires de bases (codon AGA) qui résulte dans la délétion de l'amino acide 508 de la protéine CFTR. L'ensemble N°2 permet la détection de la mutation Q493X de l'exon
10 du gène CFTR. Cette mutation correspond à une substitution G -> A en position 493 qui résulte dans l'apparition d'une mutation non-sens.
Les ensembles N°3 et 6 permet la détection de la mutation G542X de l'exon 11 du gène CFTR. Cette mutation correspond à une substitution C -> A en position 542 qui résulte dans l'apparition d'une mutation non-sens. Les ensembles N°4 et 7 permet la détection de la mutation R553X de l'exon 11 du gène CFTR. Cette mutation correspond à une substitution G -> A en position 553 qui résulte dans l'apparition d'une mutation non-sens. Les ensembles N°5 et 8 permet la détection de la mutation G551 D de l'exon 11 du gène CFTR. Cette mutation correspond à une substitution C -> T en position 551 qui résulte dans la substitution d'une glycine en position 551 par un acide aspartique.
De manière préférée, la présente puce CFTR comprend au moins l'ensemble des cinq paires d'oligonucléotides précédentes. La puce CFTR selon l'invention se caractérise en ce que les oligonucléotides qui la compose, ont lorsqu'ils sont sous forme double brin, des températures de fusion (Tm) similaires et de préférence comprises entre environ 55 et 85 °C, environ 65 et 75 °C, de préférence voisines de environ 70 °C (dans du 1 M NaCI). Ainsi, l'oligonucléotide de séquence :
De manière facultative, la puce CFTR selon l'invention comprend en outre des oligonucléotides contrôle négatifs, c'est-à-dire des sondes formant des hybrides avec mésappariements avec toutes les cibles étudiées.
Le choix des séquences des oligonucléotides immobilisés sur la surface solide est d'une grande importance à l'obtention d'une bonne distinction entre les hybrides avec mismatch et sans mismatch. Ainsi, un des paramètres importants réside dans la conception des sondes de manière à éviter la probabilité de formation de structures intramoléculaires secondaires ainsi que la probabilité de formation de complexes intermoléculaires par les sondes immobilisées, car ces structures diminuent de façon importante l'efficacité d'hybridation de la cible sur la sonde, ainsi que la distinction entre les hybrides avec ou sans mismatch. Ainsi, les exigences relatives aux caractéristiques de l'oligonucléotides sont atteintes par le choix de la séquence nucléique de l'oligonucléotides, notamment de sa longueur et de sa composition en base, et/ou par l'adjonction de nucleotides additionnels pour modifier le Tm ou la possibilité de formation de structures intramoléculaires et de complexes intermoléculaires. Ces exigences difficiles à satisfaire justifient l'activité inventive de la présente invention.
La puce CFTR selon l'invention revêtue de paires de sondes oligonucleotidiques, est caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucleotidiques sont déposées sous la forme d'emplacements ou de spots dont le diamètre moyen est compris entre 20 μm et 500 μm, de préférence entre 50 μm et 200 μm.
La distance moyenne entre le centre de chacun des emplacements de sondes oligonucleotidiques est variable et dépend de la puce, mais ils sont définis de sorte à ne pas affecter les réactions d'hybridation sur deux emplacements voisins. Néanmoins, de préférence cette distance est comprise entre 50 μm et 80 μm, entre 1 000 μm et 2 500 μm, ou entre 100 μm et 500 μm.Au niveau de chaque emplacement, de préférence de multiples copies d'un même oligonucléotide sont déposées. Ainsi, chaque emplacement comprend de préférence au moins 1 , au moins 2, ou de façon fréquente au moins 16, d'un même oligonucléotide.
Le nombre d'emplacements sur la puce selon l'invention est variable et dépend du nombre de paires d'oligonucléotides déposées sur la surface solide. De préférence, il s'agit d'un réseau moyenne densité, c'est-à-dire avec un nombre d'emplacements restreints. Ainsi, le nombre desdits emplacements est d'au moins 2 par cm2, d'au moins 4 par cm2, d'au moins 6 par cm2, d'au moins 8 par cm2, d'au moins 10 par cm2, d'au moins 50 par cm2, d'au moins 100 par cm2, d'au moins 500 par cm2, d'au moins 1000 par cm2, d'au moins 10 000 par cm2, d'au moins 50 000 par cm2, d'au moins 100 000 par cm2.
Le support solide de la puce CFTR selon l'invention est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon®, en Kevlar®, en silicone, en silicium ou en polyoses. De préférence, le support solide est une lame de verre, de manière plus préférée une lame de verre de microscope.
De préférence il s'agit d'une lame fonctionnalisée avec un aldéhyde. A titre d'exemple de lame de verre 2D disponibles dans le commerce La puce selon l'invention est de préférence choisie parmi le type 2D microréseau ou 3D-micro-réseau. Selon un premier mode de réalisation il s'agit de puce 2D dont les sondes sont fixées de préférence par une chimie amino- et aldéhyde selon les méthodes connues de l'homme de l'art. De l'ADN non modifié et de l'ADN amino-modifié peuvent ainsi respectivement hybrides sur ces substrats par liaison covalente.
On peut citer les lames de type substrat SuperAldehyde pour 'immobilisation d'ADN amino-modifiée ou de type substrat SuperAmine pour l'immobilisation d'ADN non modifié, (par exemple les lames TeleChem Array It - marque déposée).
Le principe général de l'immobilisation de l'ADN amino-modifié sur lame fonctionnalisée avec un aldéhyde du commerce est illustré sur la figure 5
Les figures 6 et 7 illustrent l'effet de modification du protocole, de manière à réaliser un couplage de l'AND avec une surface de SuperAldehyde sous haute humidité (humidité dans une boîte de plastique fermée d'un volume d'environ 700 cm3 remplie par un demi-volume d'eau). Cette modification permet une augmentation de l'efficacité d'immobilisation et du ratio signal/bruit.
Selon un second mode de réalisation il s'agit de puce 3D à base d'hydrogel, telles que les 3D-link activated slides™ (Motorola) qui présentent l'avantage (i) d'une plus grande efficacité d'immobilisation des sondes, et ainsi une meilleure intensité du signal d'hybridation ; (ii) d'une meilleure distinction entre les hybrides avec ou sans mismatches (Livshits et Mirzabekov, 1996, Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucléotides. Biophys. J. Nov. ; 71(5) 2795-2801). De préférence les oligonucléotides de la puce CFTR décrits ci- dessus sont déposés et liés à la surface solide sous la forme d'ADN monobrin par l'une des extrémités de l'oligonucléotides. De préférence il s'agit de l'extrémité 3'.
Mise en oeuvre de la puce CFTR Procédure
Matériels et méthodes : conditions d'hybridation
Hybridation d'olégonucléotides et puce
Un échantillon réalisé à partir d'un mélange de : • oligonucléotides non mutés (« wild type » ou « wt »), marqués avec un fluorophore Cy3, et
• oligonucléotides mutés (« mutated » ou « mut »), marqués avec un fluorophore Cy5 a été hybride sur une puce :
AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-Cy3 (ΔF508-wt) AAAATATCATTGGTGTTTCCTATG-Cy5 (ΔF508-mut)
CATTCTGTTCTCAGTTTTCCT-Cy3 (Q493X-wt) CATTCTGTTCTTAGTTTTCCT-Cy5 (Q493X-mut)
AATATACTTGGAGAAGGT-Cy3 (G542X -wt)
ACCTTCTCAAAGTATATT-Cy5 (G542X-mut)
AGGTCAACGAGCAAGAA-Cy3 (R552X -wt)
AGGTCAATGAGCAAGAA-Cy5 (R552X -mut)
TGAGTGGAGGTCAACGA-Cy3 (G551 D-wt)
TGAGTGGAGATCAACGA-Cy5 (G551 D-mut)
La figure 8 montre les images d'hybridation correspondent à l'hybridation des oligonucléotides ΔF508-wt, ΔF508-mut, Q493-wt et Q493X-mut sur la puce. On observe une discrimination match/mismatch pour toutes les mutations. Matériels et méthodes : conditions d'hybridation
les oligonucléotides marqués à l'extrémité 3' de la firme Metabion ont été utilisés. La qualité des oligonucléotides a été vérifiée dans un gel à 20% de polyacrylamide, dans des conditions de dénaturation.
L'hybridation des oligonucléotides marqués par fluorophore sur la puce a été réalisée dans une solution de type 2xSSC, 0.2% SDS, 0.2 mg/ml BSA à température ambiante, pendant 12 heures. Le volume de la chambre d'hybridation était de 180 μl, la concentration de chaque oligonucléotide était 0.1 μM.
Le lavage post hybridation de la puce a été ensuite réalisé dans une solution 2xSSC, 0.2% SDS pendant une minute à température ambiante.
La puce a ensuite été séchée par centrifugation pendant une minute à 500 x g en accord avec le protocole TeleChem, puis lue. De manière générale, cette application de l'invention comprend l'utilisation d'une puce CFTR selon l'invention pour la détection de la présence éventuelle de mutation dans la séquence du gène CFTR d'un patient, de préférence en mettant en oeuvre le lecteur selon l'invention. Les étapes essentielles de ce procédé sont les suivantes : • Préparation de l'oligonucléotide ou du polynucléotides cibles :
L'ADN génomique, ou les ARN messagers, ou leurs fragments, sont extraits de l'échantillon biologique selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. En utilisant les technologies de l'ADN recombinant, les ARN sont éventuellement transformés en ADNc (ADN complémentaires). L'ADN ainsi isolé est ensuite fragmenté et ou soumis à une amplification par PCR pour générer des fragments oligonucleotidiques. Ceux-ci sont marqués, avant, simultanément ou après avec des marqueurs générateur de signal selon les méthodes conventionnelles. Selon un mode préféré de réalisation, l'ADN ainsi isolé est amplifié par PCR à l'aide d'amorce spécifique de la région du gène CFTR testé en utilisant des nucleotides marqués ou modifiés. Les ADNs, ADNc, ou ARNs ainsi marqués sont ensuite dénaturés pour obtenir des molécules simple brin.
• Marquage fluorescent du produit ssPCR Un produit ssPCR exon 10 (longueur d'environ 400 nt) a été marqué
3'-end avec des marqueurs fluorescents Cy3 ou Cy5, comme suit : - 100 pmol de produit ssPCR été dissous dans 25 μl d'une solution : (1x TdT tampon, 400 pmol de Cy3-UTP (ou Cy5-UTP) dans de l'eau), - 10 unités de TdT ont été ajoutées. La réaction a été réalisée à 37 °C pendant 1 heure. Les marqueurs non liés ont été supprimés avec des colonnes de QIAGEN® DyeEx™ Spin Kit selon le protocole de QIAGEN .
• Hybridation des ADN cibles avec les oligonucléotides de la puce :
Les ADNs, ADNc, ou ARNs ainsi marqués et dénaturés sont ensuite déposés sur la puce et, le cas échéant, se lient par hybridation spécifique dans des conditions d'hybridation de stringence définie avec les sondes oligonucleotidiques. Après un lavage pour éliminer l'excès d'ADNs, ADNc, ou ARNs marqués et/ou hybrides de manière non spécifique, les duplexes formés sont détectés en mettant en oeuvre le lecteur selon l'invention.
L'analyse des mutations du gène CFTR peut se faire selon une première méthode qui consiste à comparer les intensités des signaux d'hybridation des oligonucléotides cibles sauvage (wt) et/ou muté sur la bipuce CFTR, en utilisant une seul type d'oligonucléotide cible marqué avec un fluorophore. Un seconde approche utilise l'hybridation sur la puce CFTR d'au moins deux oligonucléotides cibles différents marqués avec des marqueurs générateur de signal distincts, l'un des oligonucléotides provenant de l'échantillon à tester, l'autre correspondant à un ologonucléotide de référence (en général, l'oligonucléotide correspondant à la séquence sauvage). hybridation
L'hybridation de sondes sur les dits oligonucléotides cibles est réalisée à une température d'environ 20°C dans le tampon d'hybridation défini ci-après et ne comprenant pas de formamide. L'homme du métier devra adapter ces conditions d'hybridations si le milieu d'hydridation utilisé contient de la formamide.
De manière préférée, le milieu d'hybridation de la dite puce CFTR selon l'invention comprend au moins du SSC 6X (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), du sodium dodécyl sulfate 0,2 %, et optionellement 0,2 mg/ml de sérum albumine bovine. L'homme du métier pourra éventuellement modifier ces conditions avec des composés ayant une fonction analogue dans le tampon d'hybridation. Ainsi, il pourrait être envisager de remplacer la sérum albumine bovine par de la gélatine ou le tampon SSC par du tampon SSPE (5X SSPE se compose de 750 M NaCI, 50 mM Na phosphate, 5 mM EDTA, pH 7,4).
Par conditions permettant l'hybridation spécifique d'acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucleotidiques, il s'agit de préférence de conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après. Les conditions « stringentes » sont des conditions dans lesquelles une sonde va hybrider sur sa séquence cible, mais pas sur les autres séquences. Les conditions de stringences sont dépendantes de la séquence, et sont différentes en fonction des circonstances. Une variété de facteur peut influencer la stringeance d'hybridation. Parmi ceux-ci, il convient de citer la composition en base, la taille des brins complémentaires, la présence de solvants organiques et la longueur des mesappanements de bases. Pour une discussion sur les facteurs généraux qui influencent l'hybridation, on peut se référer par exemple au WO 93/02216 ou Ausubel et al. (Current Protocol in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Inc and John Willey and Sons, Inc). En général, les conditions de stringence sont sélectionnées de sorte que la température est de 5°C inférieure à la température du point de fusion (melting point, Tm), pour une séquence spécifique à une force ionique et un pH défini. Le Tm est la température (sous des conditions de force ionique, de pH, et de concentration en acide nucléique définies) à laquelle 50% des sondes complémentaires à une séquence cible s'hybrident à la séquence cible à l'équilibre. De manière classique, des conditions de stringence incluent une concentration en sel d'au moins environ 0,01 M jusqu'à 1M de concentration de sodium ou d'autres sels, à un pH de 7,0 jusqu'à 8,3 et une température d'au moins environ 30°C pour les petites sondes (10 à 50 nucleotides). Des conditions de stringence peuvent également être obtenues avec l'addition d'agents déstabilisants tels que la formamide ou les sels de tétra-alkyl-ammonium. Par exemple, les conditions de stringence de 5X SSPE (750 M NaCI, 50 mM Na phosphate, 5 mM EDTA, pH 7,4) et une température de 25°-30°C sont des conditions habituellement utilisées pour l'hybridation de sondes spécifiques d'allèles.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN ou d'ARN/ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les conditions d'hybridations décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : l'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC, 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucleotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucleotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci- dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
Enfin, l'hybridation peut être réalisée dans un atmophère plus ou moins humide. Des conditions d'hybridation en faible humidité ou en forte humidité pourront permettre d'optimiser la spécificité d'hybridation. La stringence peut être déterminée de manière empirique en augmentant de manière graduelle les conditions de la stringence, par exemple en augmentant la concentration en sel, ou en augmentant la température jusqu'à ce que l'on obtienne le niveau désiré de spécificités. La présente invention permet ainsi d'augmenter les conditions de stringence en contrôlant avec précision une augmentation de la température.
L'invention fournit également un kit de diagnostic de la mucoviscidose comprenant un réseau d'oligonucléotides ou puce CFTR selon l'invention. Le kit ou nécessaire pour la détection de mutations ou le génotypage du gène CFTR humain dans un échantillon, est caractérisé en ce qu'il comprend une puce CFTR selon l'invention et optionnellement les réactifs nécessaires au marquage des oligonucléotides ou polynucléotides cibles. C'est donc également un objet de la présente invention d'utiliser le réseau d'oligonucléotides selon l'invnetion, ou puce CFTR pour le diagnostic de la mucoviscidose chez un individu. La présente invention a également pour objet un procédé pour la détection de mutations du gène CFTR à partir d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le dépôt de l'échantillon contenant des oligonucléotides ou des polynucléotides cibles, dérivés du gène CFTR humain dans lequel on cherche à détecter la présence éventuelle de mutations, sur une puce revêtue de sondes oligonucleotidiques selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de ces oligonucléotides ou des polynucléotides cibles avec lesdites sondes oligonucleotidiques; b) le cas échéant, le rinçage de la puce obtenue à l'étape a) dans les conditions appropriées afin d'éliminer les acides nucléiques de l'échantillon non capturés par hybridation ; et c) la détection, facultativement à l'aide du lecteur selon l'invention, des acides nucléiques capturés sur la puce par hybridation.
C'est également un des objets de la présente invention de fournir un procédé in vitro de diagnostic de la mucoviscidose chez un individu comprenant les étapes suivantes:
(a) obtention d'au moins un fragment d'ADN dérivé du gène CFTR d'un individu;
(b) marquage dudit fragment avec un marqueur générateur de signal; optionellement dénaturation dudit fragment pour obtenir un fragment simple brin.
(c) hybridation du dit fragment marqué avec un réseau d'oligonucléotides selon l'invention.
(d) détection du fragment d'ADN s'hybridant spécifiquement avec un ou plusieurs oligonucléotides du dit réseau ; (e) optionellement détermination de la présence d'une muatation du gène CFTR chez le dit individu.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les dits fragments sont marqués à l'étape (b) directement ou indirectement par un marqueur générateur de signal selon l'invention ; de préférence il s'agit d'un marqueur fluorescent choisi dans le groupe composé de de Cy3, Cy5, FITC,
TexasRed (Rhodamine) ,Bodipy630/650, l'Alexa 488, Alexa 350...
Selon un premier mode de réalisation, une acide nucléique cible unique marqué avec un marqueur générateur de signal est hybride sur la dite puce CFTR. Selon un second mode de réalisation, au moins un, au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10 acides nucléiques cibles marqués avec un marqueur générateur de signal est/ont hybridé(s) sur la dite puce CFTR..
Le lecteur selon l'invention permet en effet de détecter simultanément ou de manière décalé dans le temps des hybrides ou duplexes marqués avec des marqueurs différents.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de lecture et analyse de puces, comprenant :
• Une table pour recevoir une puce destinée à caractériser au moins un échantillon,
• Des moyens d'excitation des molécules ou des cellules de la puce, après réaction avec d'autres molécules, • Des moyens de lecture et d'analyse des molécules soumises à excitation, caractérisé en ce que le dispositif comprend également :
• une centrale de commande de température de ladite table, ladite centrale de commande étant reliée à un module (111) comportant une pluralité d'éléments de chauffage / refroidissement de type
Peltier disposés en regard de différents emplacements de la surface de la table,
• et au moins un capteur de température de la table (112) également relié à ladite centrale de commande.
2. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent une lampe à spectre large et au moins un laser.
3. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le laser est un laser dont le rayonnement est centré sur une longueur d'onde de l'ordre de 635 nm.
4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le lecteur comprend plusieurs lasers.
5. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les lasers sont centrés sur la même longueur d'onde.
6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent au moins un laser associé à un module de balayage de son faisceau pour exciter les molécules à analyser.
7. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le lecteur comprend deux lasers et les modules de balayage des deux lasers commandent deux balayages respectifs des molécules dans deux directions orthogonales.
8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent au moins un ensemble de laser comprenant un laser dont le rayonnement est guidé par une fibre optique.
9. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent deux ensembles de laser identiques.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent un laser fixe (132") qui dirige son faisceau vers deux ensembles de miroir successifs montés en série et dont le déplacement est commandé le long de deux directions différentes.
11. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le déplacement des deux ensembles de miroir sont commandés de manière à produire un faisceau qui peut emprunter toute séquence désirée sur la puce.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les moyens d'excitation comprennent une lampe et un laser dont les rayonnements empruntent un même chemin optique grâce à un miroir basculant (130) apte à pivoter autour d'un axe (1300) entre deux positions pour diriger un de ces deux rayonnements vers la puce.
13. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que une chaîne optique est interposée entre la lampe et les molécules à exciter, tandis que l'excitation par laser se fait par illumination directe des molécules.
14. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite chaîne optique comprend des filtres de la lumière d'excitation à bande passante étroite ainsi que des filtres à bande passante étroite de la lumière en émission et un séparateur de faisceau.
15. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le lecteur comprend également une centrale de commande d'excitation reliée à chacun des moyens d'excitation pour la commande de leur fonctionnement.
16. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite centrale de commande d'excitation est apte à sélectivement commander l'illumination simultanée ou successive des molécules avec la lampe et au moins un laser, ou l'excitation séparée des molécules avec la lampe et au moins un laser.
17. Dispositif de lecture et d'analyse de puces, comprenant : • Une table pour recevoir une puce destinée à caractériser au moins un échantillon, • Des moyens d'excitation des cellules ou molécules de la puce, après réaction avec d'autres molécules ou cellules,
• Des moyens de lecture des molécules ou cellules soumises à excitation, caractérisé en ce que le lecteur comprend également une centrale de commande de la température.
18. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la table comprend un capteur de température relié à ladite centrale de commande de température.
19. Dispositif selon l'une des deux revendications précédentes, caractérisé en ce que le lecteur comprend un module de chauffage/refroidissement associé à la table et destiné à contrôler sa température, ledit module de chauffage/refroidissement étant relié à la centrale de commande de température.
20. Dispositif selon l'une des trois revendications précédentes, caractérisé en ce que le lecteur comprend également des moyens de traitement comprenant un microprocesseur et reliés à la centrale de commande de température ainsi qu'aux moyens de lecture.
21. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le lecteur comprend des moyens de mémorisation de courbes de référence de la réponse des match et mismatch des molécules aux moyens d'excitation en fonction de la température.
22. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens de mémorisation sont reliés à des moyens permettant de déterminer une température de fusion des match et mismatch des molécules à partir desdites courbes de référence.
23. Dispositif selon l'une des six revendications précédentes, caractérisé en ce que la centrale de commande de température est apte à commander le fonctionnement du lecteur selon un mode « statique » dans lequel des courbes de référence préétablies de la réponse des match et mismatch des molécules en fonction de la température sont utilisées pour établir une température de consigne apte à être transmise par ladite centrale de commande de température pour commander la température de ladite table.
24. Dispositif selon l'une des sept revendications précédentes, caractérisé en ce que la centrale de commande de température est apte à commander le fonctionnement du lecteur selon un mode « dynamique » dans lequel la centrale de commande de température commande une évolution donnée de température au niveau de la table, et, pendant cette évolution de température :
• les moyens de lecture recueillent en temps réel la réponse des molécules associées aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation, et transmettent ladite réponse à des moyens de traitement (18),
• des moyens de mémorisation mémorisent pour chaque emplacement de la puce l'évolution de la réponse de la molécule en fonction de la température.
25. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le lecteur comprend des moyens de traitement aptes à établir pour chaque molécule, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, un diagnostic d'état de la molécule.
26. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit diagnostic d'état est un diagnostic de match/mismatch.
27. Procédé d'hybridation des oligonucléotides d'une puce, pouvant être mis en œuvre par un lecteur selon une des revendications précédentes, le procédé comprenant les étapes consistant à : • Mettre en contact des sondes nucléiques correspondant à un acide nucléique cible avec un échantillon biologique contenant des fragments simple brin d'ADN, de manière à réaliser une hybridation sélective de certaines sondes avec lesdits fragments simple brin d'ADN de l'échantillon, en constituant des duplexes, • Effectuer une lecture des duplexes ainsi constitués, caractérisé en ce que le procédé comprend une étape de détermination automatique de : • la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « match », et • la température de fusion de chaque acide nucléique cible dans une configuration de « mismatch ».
28. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite détermination est réalisée en mode « statique » en utilisant des courbes de référence illustrant l'évolution, en fonction de la température, du signal reçu par des moyens de lecture de duplexes correspondant respectivement à des match et à des mismatch.
29. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le procédé comprend le contrôle de la température de manière à réaliser l'hybridation à une température correspondant à une discrimination maximale entre match et mismatch.
30. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le procédé comprend la constitution desdites courbes de référence lors d'une étape précédant l'étape de lecture.
31. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le procédé comprend la mémorisation desdites courbes de référence.
32. Procédé selon l'une des cinq revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite détermination peut être réalisée en mode « dynamique » par la commande d'une évolution donnée de température des échantillons, et, pendant cette évolution de température, on procède :
• au recueil en temps réel de la réponse des duplexes associés aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation,
• à la mémorisation pour chaque duplex de l'évolution de la réponse en fonction de la température.
33. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le procédé comprend pour chaque duplex l'établissement, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, d'un diagnostic de match/mismatch du duplex.
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