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EP1573053A2 - Verfahren zur bestimmung der homöostase behaarter haut - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der homöostase behaarter haut

Info

Publication number
EP1573053A2
EP1573053A2 EP03767789A EP03767789A EP1573053A2 EP 1573053 A2 EP1573053 A2 EP 1573053A2 EP 03767789 A EP03767789 A EP 03767789A EP 03767789 A EP03767789 A EP 03767789A EP 1573053 A2 EP1573053 A2 EP 1573053A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
skin
proteins
mrna molecules
hairy
fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03767789A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Petersohn
Kordula Schlotmann
Thomas Gassenmeier
Olaf HOLTKÖTTER
Marcus Conradt
Kay Hofmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1573053A2 publication Critical patent/EP1573053A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/148—Screening for cosmetic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the homeostasis of hairy skin in vitro, test kits and biochips for determining markers of hairy skin and the use of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules as markers of hairy skin; furthermore a test method for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances for the treatment of hairy skin as well as a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances for the treatment of hairy skin and a method for the production of a cosmetic or pharmaceutical preparation for the treatment of hairy skin.
  • Every living cell is able to react to signals from its environment.
  • the reactions of the cells are realized by an orderly regulation of the gene expression, so that the metabolism of cells is not static but very dynamic.
  • the human genome contains between 30,000 and 140,000 genes.
  • each cell uses only a small, specific part for the synthesis of proteins, which is reflected in the gene expression pattern.
  • Exogenous signals are received by cells and lead to changes in the gene expression pattern, partly via complex signal transduction cascades. In this way, every cell responds to signals from its environment by adapting its metabolism.
  • every living cell is subject to the aging phenomenon, a process that is associated with the slow change in gene expression.
  • Human skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ, which consists of a variety of different Cell types exist and form the body's interface with the environment. Most skin cells are found in the epidermis and dermis.
  • Skin appendages such as Hair follicles, sebaceous glands, sweat glands etc. are formed by a smaller proportion of specialized cells. For example, only less than 5% of the skin cells are involved in the hair follicle structure. This fact makes it clear that the cells of certain skin appendages are difficult to carry out biological analyzes, e.g. Gene expression analyzes can be subjected. In order to understand the reactions of the skin and especially its appendages to exogenous stimuli, the analysis of gene expression is of crucial importance.
  • the human skin has hair down to the lips, the palms of the hands and the soles of the feet.
  • the inconspicuous vellus hairs do not only differ macroscopically e.g. of the cosmetically relevant hair on the head.
  • the hair follicles but also the hair itself can be differentiated microscopically. Which biochemical and molecular biological mechanisms underlie these differences is largely unknown.
  • a relevant characteristic of hair and its follicles is that with age the cells lose their ability to maintain the organ's homeostasis. For example, the number of hair follicles per unit area decreases over time. The structure of the hair also changes, for example by reducing the hair diameter. With age, certain cells of the hair follicle often no longer produce hair pigments - the hair gray. Which molecular mechanisms underlie this development has so far been largely unclear.
  • Effective cosmetic or pharmaceutical hair products should have a positive effect on the broadest possible range of molecular processes in the hair follicle. So far, however, only a few molecular reaction mechanisms have been described in the hair follicle, which can thus serve as a target for cosmetic hair products.
  • the skin consists of several different cell types (e.g. fibroblasts, keratinocytes in different differentiation states, melanocytes, Merkel cells, Langerhans cells, a large number of different cells of the hair follicle or other skin appendages), so that the complexity of genes expressed in the skin is very great.
  • fibroblasts keratinocytes in different differentiation states
  • melanocytes Merkel cells
  • Langerhans cells a large number of different cells of the hair follicle or other skin appendages
  • mRNA molecules are present in the cell in concentrations between a few and several hundred copies.
  • the weakly expressed genes have not been available to previous analysis techniques or have been very difficult to access, but can certainly play a decisive role in the hair follicle.
  • the transcriptome i.e. the entirety of all transcribed genes of the human hair follicle, has not been described to date.
  • Transcriptome analyzes of the skin using various methods, including SAGE TM analysis, are state of the art. However, isolated keratinocytes (in vitro) or epidermal explants are used, which - as above explained - do not represent models representative of complex skin events.
  • DE-A-101 00 127.4-41 From DE-A-101 00 127.4-41 by the applicant it is known to subject skin cells to a SAGE TM analysis in order to characterize the total transcriptome of the skin.
  • DE-A-101 00 121.5-41 by the applicant discloses the determination of markers of stressed or aged skin on the basis of a comparative SAGE TM analysis between stressed or aged skin and undressed or young skin.
  • information on specific markers of hairy skin cannot be found in these publications.
  • the object of the present invention is to identify as large a part as possible of the genes which are important for the hair on the skin.
  • methods for determining the homeostasis of hairy skin are to be provided using the identified genes.
  • This first object is achieved according to the invention by a method (1) for
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • hairless is also to be understood as meaning the hair with the fine and barely visible vellus hair.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to understand the complex process of hair formation and the causal relationships between the changes in the hair. Only with this knowledge can new concepts for cosmetic hair products be developed that have an effect on the broad spectrum of gene expression in the hair follicle.
  • the SAGE TM analysis carried out in the context of the method according to the invention shows for the first time in a very comprehensive manner which genes are expressed in (with the main hair) hairy scalp and which genes are expressed there differently than in skin with vellus hair.
  • SAGE TM serial analysis of gene expression
  • the comparison of the transcriptome of hairy skin with the transcriptome of hairless skin makes it possible to distinguish between genes that are relevant and not relevant for the hair on the skin.
  • SAGE TM analysis Human skin from healthy female donors was used for SAGE TM analysis.
  • the SAGE TM analysis was carried out as described in EP-A-0 761 822 and in Velculescu, VE et al., 1995 Science 270, 484-487.
  • This technique also allows the identification and quantification of the genes expressed in hairy scalp.
  • the comparison of the transcriptome of hairy scalp with the transcriptome of facial skin allows the identification of relevant genes for hairy scalp. These can be genes that are particularly strongly expressed in hairy scalp or also genes that are characterized in that they are only expressed slightly compared to hairless facial skin.
  • the SAGE TM analysis is a technique with special sensitivity and surprisingly shows even interindividual differences in the gene expression profile.
  • the comparison to the transcriptome of hairless skin is therefore particularly effective when the analyzed tissue is from an individual come from a donor.
  • interindividual differences in gene expression are negligible.
  • hairy tissues accumulate from a patient from the area above the ear and the area behind the ear.
  • skin tissue in front of the ear is removed that - at least in female donors - only vellus
  • the analysis of such tissue samples therefore allows the description of the transcriptome of hairy scalp and hairless (or only covered with vellus hair) facial skin with the exclusion of interindividual gene expression differences.
  • the hairy skin For hairy skin, an increased number of tags can be shown for genes that are expressed in the hair follicle or in hair appendages.
  • the hairy skin In addition to an increased level of keratin, which is typical of hair and hair follicles, the hairy skin also has, for example, more FGF7, a transcription factor involved in hair development.
  • Dermcidin and cystatin, both involved in the defense against bacterial and viral attacks in the hair shaft also show a significantly increased expression in the hairy skin.
  • the expression of differentiation-dependent genes of the interfollicular epidermis is in the hairless skin intensified, which is reflected in the results of the investigation.
  • keratin 10 At the top of the differentially expressed genes is keratin 10, a typical marker for the differentiation of stratified epithelia.
  • Keratin 1 the partner of Keratin 10, does not show these differences in expression.
  • the analysis of further differentiation-dependent expressed genes also confirms their increased expression in the hairless skin (Tab. 2).
  • another keratin, keratin 2e is mainly expressed in hairless skin, which is also observed in the analysis carried out.
  • the expression of keratins 5, 14 and 15 expressed in the basal layer of the epidermis and in the hair follicles is almost identical in both samples (Tab. 2).
  • Table 1 lists markers which, according to literature knowledge, are differentially in the hair follicle in the
  • Table 2 shows differentiation-dependent genes of the interfollicular epidermis.
  • HF hair follicle
  • ORS Outer Root Sheath (Outer Root Sheath)
  • IRS Inner Root Sheath (Inner Root Sheath)
  • Tables 3 to 12 contain a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention and differentially expressed in hairy and hairless skin, with indication
  • the quotient in column 3 indicates the strength of the differential expression, i.e. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in hairy scalp (scalp) than in hairless facial skin (face), or vice versa.
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in hairy scalp (scalp) than in hairless body skin (breast), or vice versa.
  • the respective genes or gene products are disclosed in the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under their UniGene Accession Number. This database is accessible on the Internet at the following address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. The genes or gene products are also available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ guide directly accessible.
  • Table 3 lists all genes that are at least 10-fold differentially expressed in hairy scalp compared to hairless facial skin with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1.3).
  • Table 4 lists all genes that are expressed differentially in hairy scalp (scalp) compared to hairless facial skin (face) with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3) at least 5-fold.
  • Table 5 lists all genes that are at least 3-fold differentially expressed in hairy scalp compared to hairless facial skin with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3).
  • Table 6 lists all genes that are expressed at least 1.9 times differentially in hairy scalp compared to hairless facial skin with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3) ,
  • Table 7 lists all genes that are expressed differentially in hairy scalp (scalp) compared to hairless facial skin (face) with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) and that in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (breast) with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3) at least 5-fold differentially expressed.
  • the comparison of the subsignificant scalp / face data with independent SAGE TM experiments (scalp / breast) confirms the differential gene expression and validates the markers of the hairy skin.
  • Table 8 lists all the genes that are expressed differentially in hairy scalp (scalp) compared to hairless facial skin (face) with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) and that in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (breast) with a p- Value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1.3) are expressed at least 5-fold differentially, the expression of which differs by less than a power of ten, ie the quotient (scalp / face) / (scalp / breast) is smaller than 10 or greater than 0.1.
  • the comparison of the subsignificant scalp / face data with independent SAGE TM experiments (scalp / breast) confirms the differential gene expression and validates the markers of the hairy skin.
  • Scalp Errr compared to hairless facial skin (Face) with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) at least 3 times differentially expressed and that in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (Breast) with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3) are expressed at least 3 times differentially.
  • the comparison of the subsignificant scalp / face data with independent SAGE TM experiments confirms the differential gene expression and validates the markers of the hairy skin.
  • Table 10 lists all genes that are at least 3-fold differentially expressed in hairy scalp compared to hairless facial skin with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) and that in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (breast) with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) at least 3-fold differentially expressed, the expression of which differs by less than a power of ten, that is, the quotient (scalp / face) / (scalp / breast) is less than 10 or greater than 0.1.
  • the comparison of the subsignificant scalp / face data with independent SAGE TM experiments (scalp / breast) confirms the differential gene expression and validates the markers of the hairy skin.
  • Table 11 lists all genes that are expressed differentially in hairy scalp (scalp) compared to hairless facial skin (face) with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1.3) at least 1.9-fold and which are expressed differentially in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (breast) with a p-value of p> 0.05 (Signif> 1, 3) at least 1.9-fold.
  • Comparison of subsignificant scalp / face data with independent SAGE TM experiments (scalp / breast) confirm the differential gene expression and validate the markers of the hairy skin.
  • Table 12 lists all genes that are expressed at least 1.9 times differentially in hairy scalp compared to hairless facial skin with a p-value of p ⁇ 0.05 (Signif ⁇ 1, 3) and in hairy scalp (scalp) compared to hairless body skin (Breast) with a p-VäT ⁇ e of p ⁇ 0.05 (signif ⁇ 1, 3) at least T, 9-fan-shaped red differentially "exf5rirniert whose expression is less as a power of ten, ie the quotient (Scalp / Face) / (Scalp / Breast) is less than 10 or greater than 0.1.
  • the comparison of the subsignificant Scalp / Face data with independent SAGE TM experiments (Scalp / Breast) confirms the differential gene expression and validates the markers of the hairy skin.
  • the second object on which YQ - Jjßg ---- d-aD invention is based is achieved according to the invention by a method (2) for determining the homeostasis of hairy skin in humans, in particular women, in vitro, which is characterized in that a ) a mixture of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from hairy human skin is obtained, b) the mixture obtained for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA -Molecules examined, which are identified by means of serial analysis of gene expression (SAGE) as differentially expressed in hairy and hairless skin, c) the test results from b) are compared with the expression patterns identified by means of serial analysis of gene expression (SAGE) and d) that in b ) investigated mixture of healthy or hairy skin in homeostasis if it predominantly contains proteins , mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are more strongly expressed in hair
  • the mixture in step a) of the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin can be obtained from whole skin samples, hairy skin equivalents, isolated hair follicles, hair follicle equivalents or cells of hairy skin.
  • step b) of the method for determining the homeostasis of hairy skin it may be sufficient to examine the mixture obtained for the presence of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which can be determined by means of serial analysis of the gene expression ( SAGE) can be identified as differentially expressed in hairy and hairless skin if they are expressed exclusively in hairy or hairless skin only. In all other cases, the amount of differentially expressed molecules must also be examined in step b). that is, expression must be quantified.
  • SAGE serial analysis of the gene expression
  • step d) of the method for determining the homeostasis of hairy skin the mixture examined in b) of healthy hairy skin is assigned if it is predominantly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or Contains mRNA molecules that are more strongly expressed in hairy skin than in hairless skin, ie that the mixture contains either more different compounds typically expressed in hairy skin than those that are typically expressed in hairless skin (qualitative differentiation), or more Contains copies of compounds typically expressed in hairy skin than are typically present in hairless skin (quantitative differentiation).
  • the assignment to diseased or " 1rr ⁇ e ⁇ oTteT ⁇ Hömeö ⁇ stäase hairy skin is followed in a complementary manner.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules , which are defined in Tables 11 and 12 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) compares the test results from b) with the expression quotients given in Tables 11 and 12 in column 3 and column 5 and in step d) the mixture examined in b) is assigned to healthy hairy skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed in healthy hairy skin at least 1.9 times as strongly as in hairless skin , or assigns the mixture examined in b) to diseased or hairy skin in disturbed homeostasis, if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 1.9 times as strongly in hairless skin as in hairy skin.
  • step b) Determination of the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 9 and 10 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the test results from b) with those in Tables 9 and 10 in column 3 and column 5 given expression quotient and in step d) assigns the mixture of healthy hairy skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are at least 3 times in healthy hairy skin barren "the ih ⁇ b) l tersücl ⁇ fe mixture diseased or disturbed homeostasis in-hairy skin allocates when it contains mainly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that fold in hairless skin at least 3 so highly expressed become like in hairy skin.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Tables 7 and 8 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) compares the test results from b) with the expression quotients given in Tables 7 and 8 in column 3 and column 5 and in Step d) assigns the mixture of healthy hairy skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 5 times as strongly in healthy hairy skin as in hairless skin, or assigns the mixture examined in b) to diseased or hairy skin in disturbed homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 5 times as strongly in hairless skin as in hairy skin.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Table 6 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the ⁇ Ontersucl ⁇ üTrgsel ⁇ e ⁇ ⁇ is ⁇ eä ⁇ sb) ⁇ rnit with " deh " in table 6 ⁇ in " S ' column 3 and column 5 expressed expression quotient and in step d) assigns the mixture of healthy hairy skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are at least 1.9 times as good in healthy hairy skin are strongly expressed as in hairless skin, or the mixture examined in b) of sick or hairy in disturbed homeostasis contains proteins or mRNA molecules that are expressed at
  • the method for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are shown in Table 5 defined in column 7 by their UniGene accession number, in step c) comparing the test results from b) with the expression quotients given in table 5 in column 3 and column 5 and in step d) the mixture of healthy hairy skin examined in b) assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 3 times as strongly in healthy hairy skin as in hairless skin, or which was examined in b)
  • a further particularly preferred embodiment of the method for determining the homeostasis of the scalp is characterized in that in step b) the mixture obtained in the presence and optionally iie _ M "ertge ⁇ ⁇ n _ min" de "ste ⁇ s ⁇ a _ of the proteins ; mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Table 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the test results from b) with those in Table 4 in column 3 and column 5 indicated expression quotient and in step d) assigns the mixture of healthy hairy skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 5 times as strongly in healthy hairy skin as in hairless skin, or the mixture examined in b) of diseased or hairy skin in disturbed homeostasis arranges if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 5 times as strongly in hair
  • a method for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are shown in Table 3 defined in column 7 by their UniGene accession number, in step c) comparing the test results from b) with the expression quotients given in table 3 in column 3 and column 5 and in step d) the mixture of healthy hairy skin examined in b) assigned if it contains predominantly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are at least 10- in healthy hairy skin are expressed as strongly as in hairless skin, or assigns the mixture examined in b) to diseased or hairy skin in disturbed homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are in hairless skin expressed at least 10 times as strongly as in hairy skin.
  • condition of the skin can also be described by quantifying a number of markers (expression products of the genes which are important for hairy skin), which must then be active in a characteristic ratio to one another in order to represent healthy (inostasis) hairy skin, or must be active in a characteristic ratio different from this in order to represent diseased skin (which is in disturbed homeostasis).
  • markers expression products of the genes which are important for hairy skin
  • Another object of the present invention is therefore a method j3) for determining the homeostasis of hairy skin in humans, in particular women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from hairy human skin, b) quantified in the mixture obtained at least two of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are identified by method (1) as being important for hairy skin, c) the Expression ratios of the at least two proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules to one another are determined and the expression quotient is formed, d) comparing the expression ratios from c) with the expression ratios which are typically hairy or in for the molecules quantified in b) hairless skin, especially with the expression ratios, d ie from tables 3 to 12, columns 3 and 5, respectively, and e) assigns the mixture obtained in a) to healthy (in homeostasis) hairy skin if the expression ratios of
  • the mixture is preferably obtained from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
  • a skin sample in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
  • the ⁇ Völlh ütprbbe " Cimfussihdere TM opens up possibilities for comparison ⁇ with the SAGE libraries, which are also obtained from whole skin.
  • the epidermis sample on the other hand, is easier to obtain, for example by applying an adhesive tape to the skin and tearing it off, as described in WO 00/10579 , to which reference is hereby made in full.
  • the mixture is obtained in step a) by means of microdialysis.
  • microdialysis The technique of microdialysis is described, for example, in “Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; and in “Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies ", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
  • microdialysis When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions have subsided after the puncture, the microdialysis provides proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a full skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins or protein fragments; or in method (3) the quantification of at least two proteins or protein fragments is carried out by means of a method which is selected from ii. Affinity Chromatography iii. Protein-protein complexation in solution iv. Mass spectrometry, especially matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) and especially v. Use of protein chips, or by means of suitable combinations of these methods.
  • MALDI matrix assisted laser desorption ionization
  • 2D gel electrophoresis is described, for example, in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System or in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; both in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; or in 2-D electrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (order no. 80-6429-60).
  • the mass spectrometric characterization of the proteins or protein fragments is carried out in a manner known to those skilled in the art, for example as described in the following references: Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: AJ Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. In particular: Courchesne, PL and Patterson, SD; Pp. 487-512.
  • Determination of the homeostasis of hairy skin is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the mRNA molecules or mRNA molecule fragments; or in method (3) the quantification of at least two mRNA molecules or mRNA molecule fragments is carried out by means of a method which is selected from Northern blnts.
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • RNase protection experiments iv. Dot blots
  • v. cDNA sequencing vi. Clone hybridization
  • vii. Differential display viii. Subtractive hybridization
  • TOGA Total Gene Expression Analysis
  • SAGE Serial analysis of gene expression
  • MPSS ® Massively Parallel Signature Sequencing
  • step b) the presence and optionally the amount of 1 to about 5000, preferably 1 to about 1000, in particular about 10 to about 500, preferably about 10 to about 250, particularly preferably about 10 to about 100 and very particularly preferably about 10 to about 50 of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules investigated by their in Tables 3 to 12 in column 7 UniGene Accession Number can be defined.
  • the present invention further provides a test kit for determining the homeostasis of hairy skin in humans in vitro, comprising means for carrying out the method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin.
  • Another object of the present invention is a biochip for determining the homeostasis of hairy skin in humans in vitro, comprising i. a solid, ie rigid or flexible support and ii. on this immobilized probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in Tables 3 to 12 in column 7 by their UniGene Accession Number.
  • a biochip which is particularly preferred according to the invention comprises probes which are selected from those which specifically bind to at least one
  • Molecules are capable, which are defined in Tables 3 to 6 in column 1 by the following serial number: 2, 4, 9, 12, 14, 16, 22, 25, 29, 31, 35, 36, 38, 39, 40 , 42, 43, 44, 46, 59, 62, 63, 65, 67, 68, 69, 74.
  • a BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
  • BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
  • the base surfaces can also be formed, for example, by walls of one or more capillaries or by channels.
  • the DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings.
  • This technical principle known as hybridization, has been used in Southern blot and Northern blot analysis for years. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel.
  • a DNA chip essentially consists of a carrier material (e.g. glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot). The technique of probe application and the chemistry of probe immobilization are considered problematic.
  • E. M. Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the preparation of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface, which was derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
  • DNA molecules already present can also be bound to surfaces of support material.
  • the DNA probes can be applied to a carrier using a so-called “pin spotter”.
  • a pin spotter thin metal needles, for example with a diameter of 250 ⁇ m, are immersed in probe solutions and then transfer the attached sample material with defined volumes to the carrier material of the DNA Crisps.
  • the probe is preferably applied by means of a piezocontrolled nanodispenser, which, like an inkjet printer, applies probe solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material without contact.
  • the probes are immobilized, for example, as described in EP-A-0 965 647:
  • the generation of DNA probes is carried out by means of PCR using a sequence-specific pair of primers, a primer at the 5 'end being modified and a linker with a free one Amino group carries. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface which has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4-phenyldiisothiocyanate.
  • the Gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences.
  • mRNA from two to NeT EiseneTTäeTrZellpopulä ⁇ mRN ⁇ s are converted into cDNA by means of " reverse transcription using, for example, fluorescence-labeled nucleotides.
  • the samples to be compared are labeled with, for example, red or green fluorescent nucleotides.
  • the cDNAs are labeled then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and subsequently quantified the bound fluorescence.
  • the analysis chips mentioned in DE-A-100 28 257.1-52 and in DE-A-101 02 063.5-52 are particularly preferred for the production of small (up to about 500 probes) biochips.
  • These analysis chips have an electrically addressable structure which allows the samples to be electrofocused. This advantageously makes it possible to focus and immobilize samples regardless of their viscosity with the aid of electrodes at defined points on a grid of points (arrays). Due to the focusing ability, the local concentration of the samples is increased and thus a higher specificity.
  • the biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes.
  • the probes which differ from one another, can each be present in duplicate on the chip.
  • the biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
  • the nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
  • biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 3 to 12 in column 7 by their UniGene accession number, as markers of hairy skin in humans ,
  • CDT6 whose role as a hair cycle marker is particularly surprising since it would have been more likely that VEGF or angiopoietin could be used as a marker.
  • the DPPIV family and the DNA helicases are particularly noticeable.
  • a role in the hair cycle was also not foreseeable by the expert.
  • Another object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin in vitro, characterized in that a) the skin status of hairy skin by an inventive method for determining the homeostasis of hairy skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin, or by means of a biochips according to the invention determines "&) a drug counter --i!
  • test method according to the invention can be carried out with whole skin samples, hairy skin equivalents, isolated hair follicles, hair follicle equivalents or cells with hairy skin.
  • Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 3 to 12 in column 7 by their UniGene Accession Number, for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin.
  • Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin in vitro, which is characterized in that a) the skin status of hairy skin by an inventive method for determining the homeostasis hairy skin, or by a ⁇ rfindungsdorfen- -estrKits-for-determination _ _ der ⁇ omeostase behaarte ⁇ "skin, or determined by means of a biochip according to the invention, b) a potential drug for diseases or disturbances of homeostasis the scalp once or more is applied to the skin, c) the skin status of hairy skin is determined by a method according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the homeostasis of hairy skin, or by means of a biochip according to the invention, and d) effective active ingredient ffe determined by comparing the results from a) and
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 3 to 12 in column 7 by their UniGene Accession Number, for the identification of cosmetic or pharmaceutical Active substances against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin.
  • Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against diseases or impairments of the homeostasis of hairy skin, characterized in that a) active ingredients using the screening method according to the invention, or the use for the identification of cosmetic or active pharmaceutical ingredients against diseases or
  • Impairments in the homeostasis of hairy skin are determined and active ingredients found to be effective are mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung von Markern behaarter Haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker behaarter Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung behaarter Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung behaarter Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung behaarter Haut.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung von Markern behaarter Haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker behaarter Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung behaarter Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung behaarter Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung behaarter Haut.
Jede lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren. Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regulation der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht statisch sondern sehr dynamisch ist. Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen zwischen 30 000 und 140.000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt. Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum Teil über komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung mit der Anpassung ihres Metabolismus.
Neben dieser verhältnismäßig kurzfristigen Veränderung der Genexpression, unterliegt jede lebende Zelle dem Alterungsphänomen, ein Prozess, der mit der langsamer Veränderung der Genexpression einhergeht.
Die menschliche Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Die meisten Zellen der Haut finden sich in der Epidermis und der Dermis.
Hautanhangsgebilde wie z.B. Haarfollikel, Talgdrüsen, Schweissdrüsen etc. werden durch einen geringeren Anteil spezialisierter Zellen gebildet. So sind z.B. nur weniger als 5% der Hautzellen an der Haarfollikelstruktur beteiligt. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen bestimmter Hautanhangsgebilde nur schwer biologischen Analysen, wie z.B. Genexpressionsanalysen unterzogen werden können. Für das Verständnis von Reaktionen der Haut und insbesondere ihrer Anhangsgebilde auf exogene Stimuli ist jedoch die Analyse der Genexpression von entscheidender Bedeutung.
Eine Isolation der Hautanhangsgebilde ist technisch schwer zu realisieren und sehr zeitintesiv. Desweiteren ist es für eine realistische Darstellung biochemischer Abläufe in der Haut oder ihrer Anhangsgebilde unerlässlich, die Zellen in ihrer natürlichen, zellulären Umgebung zu untersuchen. Jede Manipulation am Gewebe (z.B. zur Isolation oder Anreicherung bestimmter Strukturen) wird von den Zellen bemerkt und führt zu einer angepassten Genexpression. Dieser Zustand ist nicht mehr nativ und somit auch nicht mehr als repräsentativ zu betrachten.
Die menschliche Haut trägt bis auf die Lippen, die Handinnenflächen und die Fußsohlen Haare. Die unscheinbaren Vellushaare unterscheiden sich dabei nicht nur makroskopisch z.B. von den kosmetisch relevanten Haupthaaren am Kopf. Mikroskopisch sind ebenso die Haarfollikel aber auch die Haare selbst differenzierbar. Welche biochemischen und molekularbiolgischen Mechanismen diesen Unterschieden zu Grunde liegen ist jedoch weitgehend unbekannt.
Ein relevantes Merkmal der Haare und ihrer Follikel ist, dass mit zunehmendem Alter die Zellen ihre Fähigkeit, verlieren die Homöostase des Organs aufrecht zu erhalten. So nimmt z.B. im Verlauf der Zeit die Anzahl der Haarfollikel pro Flächeneinheit ab. Ebenso verändert sich die Struktur der Haare, indem z.B der Haardurchmesser geringer wird. Oftmals produzieren bestimmte Zellen der Haarfollikel mit zunehmendem Alter keine Haarpigmente mehr - die Haare ergrauen. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar.
Effektive kosmetische oder pharmazeutische Haarprodukte sollten ihre positive Wirkung auf ein möglichst breites Spektrum molekularer Abläufe im Haarfollikel zeigen. Bisher sind jedoch nur wenige molekulare Reaktionsmechanismen im Haarfollikel beschrieben worden, die somit als Target kosmetischer Haarprodukte dienen können.
Jeder Zelltyp der Haut und ihrer Anhangsgebilde exprimiert ca. 15.000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon in Haarfollikeln eine Rolle spielen ist bisher jedoch weitgehend unklar.
Die Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (z. B. aus Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Merkelzellen, Langerhanszellen, einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen des Haarfollikels oder anderer Hautanhangsgebilde), sodass die Komplexität in der Haut exprimierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht möglich gewesen, aus dieser Komplexität die Gene zu identifizieren, die mit dem Haarfollikel in Zusammenhang stehen und als molekulare Marker der Haarbiologie dienen können. Erschwerend kommt hinzu, dass in der Zelle mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vorkommen. Die schwach exprimierten Gene sind bisherigen Analysetechniken nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewesen, können aber durchaus eine entscheidende Rolle im Haarfollikel spielen.
Bis heute ist das Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene des humanen Haarfollikels, nicht beschrieben worden.
Transkriptom-Analysen der Haut mittels verschiedener Verfahren, einschließlich der SAGE™-Analyse, sind Stand der Technik. Allerdings werden hierbei isolierte Keratinozyten (in vitro) oder Epidermis-Explantate verwendet, die - wie oben erläutert - keine für das komplexe Geschehen in der Haut repräsentativen Modelle darstellen.
Aus der DE-A-101 00 127.4-41 der Anmelderin ist bekannt, Hautzellen einer SAGE™-Analyse zu unterwerfen, um das Gesamttranskriptom der Haut zu charakterisieren. Die DE-A-101 00 121.5-41 der Anmelderin offenbart die Ermittlung von Markern gestreßter bzw. gealterter Haut auf der Basis einer vergleichenden SAGE™-Analyse zwischen gestreßter bzw. gealterter Haut und ungestreßter bzw. junger Haut. Informationen über spezifische Marker behaarter Haut sind diesen Schriften aber nicht zu entnehmen.
Aus J Invest Dermatol 2002 Jul;119(1 ):3-13; „A serial analysis of gene expression in sun-damaged human skin"; Urschitz J. et al.; ist bekannt, Marker sonnengeschädigter Haut mittels einer vergleichenden SAGE™-Analyse von Vollhautexplantanten zu bestimmen, die vor der Ohrmuschel (sonnengeschädigt) bzw. hinter der Ohrmuschel (geschützt vor Sonnenstrahlung) entnommen wurden. Aus dieser Publikation lassen sich gleichfalls keinerlei Kenntnisse über spezifische Marker behaarter Haut gewinnen.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für die Behaarung der Haut wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für die Behaarung der Haut bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1 ) zur
Identifizierung der für die Behaarung der Haut bedeutsamen Gene bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in behaarter menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in unbehaarter menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus unbehaarter menschlicher Haut, vorzugsweise aus unbehaarter Gesichtshaut, gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in behaarter und unbehaarter Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter „unbehaart" auch die Behaarung mit den feinen und kaum sichtbaren Vellushaaren. zu verstehen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es vorteilhafterweise möglich, den komplexen Prozess der Haarentstehung und die kausalen Zusammenhänge der Veränderungen am Haar zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum der Genexpression im Haarfollikel ausüben. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte SAGE™-Analyse zeigt erstmals in einer sehr umfassenden Weise, welche Gene in (mit Haupthaar) behaarter Kopfhaut exprimiert werden, und welche Gene dort anders exprimiert werden als in Haut mit Vellushaar.
Die am Markt befindlichen kosmetischen Haar-Produkte üben i.d.R. ihre Wirkungen auf den Haarschaft aus (z.B. Haar-Colorationen). Erst die hier beschriebenen Untersuchungen erlauben ein Verständnis der komplexen biologischen Prozesse im Haarfollikel. Die Identifikation geeigneter Marker des Haarfollikels gestattet somit die gezielte Suche nach Substanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Wirkspektrum auf die Genexpression im Haarfollikel. Produkte dieser Art konnten jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht entwickelt werden, da eine Vielzahl der Haarfollikelmarker noch nicht bekannt waren.
Zur Erfassung des Transkriptoms der behaarten Haut wurde die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in der behaarten Haut exprimierten Gene. Die Analyse der Genexpression ist zwar auch mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase- Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden. Theoretisch könnten die Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder Techniken, die auf Differential display beruhen, die SAGE™-Analyse ersetzen. Praktisch ist die SAGE™-Technik jedoch schneller und zuverlässiger als Alternativmethoden und somit zu bevorzugen.
Der Vergleich des Transkriptoms behaarter Haut, mit dem Transkriptom unbehaarter Haut lässt die Unterscheidung zwischen für die Behaarung der Haut relevanten und nicht relevanten Genen zu.
Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von gesunden weiblichen Spendern verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0 761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung der in behaarter Kopfhaut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms behaarter Kopfhaut, mit dem Transkriptom von Gesichtshaut erlaubt die Identifikation relevanter Gene für behaarte Kopfhaut. Dies können Gene sein, die in behaarter Kopfhaut besonders stark exprimiert werden oder auch Gene sein, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut nur gering exprimiert werden. Die SAGE™-Analyse ist eine Technik mit besonderer Sensitivität und zeigt überraschender weise sogar interindividuelle Unterschiede im Genexpressionsprofil auf. Zur Beschreibung des Transkriptoms behaarter Haut ist daher der Vergleich zum Transkriptom unbehaarter Haut insbesondere effektiv, wenn die analysierten Gewebe von einem Individuum also einem Spender stammen. Somit fallen interindividuelle Unterschiede bei der Genexpression nicht ins Gewicht. Im Rahmen von plastisch chirurgischen Operationen wie z.B. „Unteren Facelifts" fallen von einer Patientin behaarte Gewebe aus dem Bereich über dem Ohr und dem Bereich hinter dem Ohr an. Gleichzeitig wird Hautgewebe vor dem Ohr entfernt, dass - zumindest bei weiblichen Spendern - nur Vellus-Haar trägt. Die Analyse solcher Gewebeproben erlaubt daher die Beschreibung der Transkriptome behaarter Kopfhaut und unbehaarter (bzw nur mit Vellushaar besetzter) Gesichtshaut unter Ausschluß interindividueller Genexpressionsunterschiede.
Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von einer gesunden weiblichen Spenderin (65 Jahre alt) verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0 761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben. Analysiert wurden zwei SAGE™-Libraries aus verschieden lokalisierten Hautproben einer Patientin. Die erste Probe stammte von einer Entnahmestelle über dem Ohr und lieferte Haut mit Kopfhaar. Die zweite Probe stammte aus derselben Operation, wurde vor dem Ohr entnommen und lieferte Haut mit lediglich Vellushaar. Zur weiteren Analyse wurden beide SAGE™- Libraries auf die durchschnittliche Tag-Anzahl normiert. Die beiden Libraries wurden miteinander verglichen, um Gene mit einer haarspezifischen Regulation zu identifizieren. Wie für zwei Libraries desselben Gewebetyps erwartet, ist das Tag- Repertoire der beiden Haut- Libraries weitgehend ähnlich. Trotz der Ähnlichkeit der Gewebe und der relativ geringen Tag-Zahl zeigen 74 Tags eine signifikant differentielle Expression bei einem Signifikanz-Level von p>0,05.
Für die behaarte Haut lässt sich eine erhöhte Tag-Zahl für Gene zeigen, die im Haarfollikel oder in Haar-Anhangsgebilden exprimiert werden. Neben einem erhöhten Level der Haar- und Haarfollikel-typischen Keratine weist die behaarte Haut zum Beispiel auch mehr FGF7, einen an der Haarentwicklung beteiligten Transkriptionsfaktor, auf. Dermcidin und Cystatin, beide an der Abwehr bakterieller und viraler Angriffe im Haarschaft beteiligt, zeigen ebenfalls eine signifikant erhöhte Expression in der behaarten Haut. Die Expression Differenzierungs-abhängiger Gene der interfollikularen Epidermis ist in der unbehaarten Haut verstärkt, was sich in den Ergebnissen der Untersuchung widerspiegelt. An der Spitze der differentiell exprimierten Gene findet sich Keratin 10, ein typischer Marker für die Differenzierung stratifizierter Epithelien. Keratin 1 , der Partner von Keratin 10, zeigt diese Expressionsunterschiede nicht. Die Analyse weiterer Differenzierungs-abhängig exprimierter Gene bestätigt ebenfalls deren verstärkte Expression in der unbehaarten Haut (Tab. 2). Ein weiteres Keratin, Keratin 2e, wird laut Literatur vor allem in unbehaarter Haut exprimiert, was in der durchgeführten Analyse ebenfalls beobachtet wird. Die Expression der in der Basalschicht der Epidermis und in den Haarfollikeln exprimierten Keratine 5, 14 und 15 ist wie erwartet in beiden Proben nahezu identisch (Tab. 2).
Tabelle 1 listet Marker, die nach Literaturkenntnis differentiell im Haarfollikel im
Vergleich zum Rest der Haut (interfollikuläre Haut) exprimiert werden. Sie dienen als Positivkontrollen für das Experiment.
+H = mit Haar (Hautquelle über dem Ohr)
-H = ohne Haar (Hautquelle vor dem Ohr)
Tabelle 2 zeigt Differenzierungs-abhängige Gene der interfollikularen Epidermis. HF = Haarfollikel
ORS = Outer Root Sheath (Äussere Wurzelscheide) IRS = Inner Root Sheath (Innere Wurzelscheide)
+H = mit Haar (Hautquelle über dem Ohr)
-H = ohne Haar (Hautquelle vor dem Ohr)
Zur Beschreibung und Sicherung sub-signifikanter Genexpressionsunterschiede (Tabellen 7 bis 12) wurden weitere SAGE™-Analysen humaner Haut berücksichtigt. So ist zu erwarten, dass ein haarspezifisches Gen nicht nur in unbehaarter Gesichtshaut, sondern auch in anderer unbehaarter Körperhaut gering exprimiert wird. Es wurden daher die sub-signifikanten Unterschiede aus dem Vergleich des Transkriptoms behaarter Kopfhaut mit dem Transkriptom unbehaarter Gesichtshaut mit dem Expressionsprofil unbehaarter Brusthaut verglichen. Für die SAGE™ -Analyse von Brusthaut wurde Brusthaut von einer gesunden weiblichen Spenderin (69 Jahre alt) verwendet. Hierdurch konnten subsignifikante Unterschiede in der Genexpression bestätigt werden.
Die Tabellen 3 bis 12 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimierten Gene unter Angabe
• einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 ,
• der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2,
• des Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in behaarter Kopfhaut (Scalp) und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in unbehaarter Gesichtshaut (Face) in Spalte 3,
• der Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
• des Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in behaarter Kopfhaut (Scalp) und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in unbehaarter Körperhaut (Breast) in Spalte 5,
• der Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6,
• der UniGene-Accession-Number in Spalte 7,
• einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8 und
• in den Tabellen 8, 10 und 12 des Quotienten (Scalp/Face) / (Scalp/Breast) in Spalte 9.
Der Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in behaarter Kopfhaut (Scalp) stärker exprimiert wird, als in unbehaarter Gesichtshaut (Face), oder umgekehrt.
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in behaarter Kopfhaut (Scalp) stärker exprimiert wird, als in unbehaarter Körperhaut (Breast), oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p>0,05 (Signif >1,3) mindestens 10-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p>0,05 (Signif >1 ,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p>0,05 (Signif >1 ,3) mindestens 3-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 6 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p>0,05 (Signif >1 , 3) mindestens 1 ,9-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 7 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p- Value von p>0,05 (Signif >1 ,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™- Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
In Tabelle 8 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p- Value von p<0,05 (Signif <1,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden, deren Expression sich um weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient (Scalp/Face) / (Scalp/Breast) ist kleiner als 10 oder größer als 0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™- Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
Kopfhaut (Scalp) Irrr Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens 3-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p- Value von p>0,05 (Signif >1 ,3) mindestens 3-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™- Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
In Tabelle 10 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1, 3) mindestens 3-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p- Value von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens 3-fach differentiell exprimiert werden, deren Expression sich um weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient (Scalp/Face) / (Scalp/Breast) ist kleiner als 10 oder größer als 0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™- Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
In Tabelle 11 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1,3) mindestens 1,9-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p-Value von p>0,05 (Signif >1, 3) mindestens 1,9-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™ -Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
In Tabelle 12 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem p-Value von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens 1 ,9-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut (Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem p-VäTϋe von p<0,05 (Signif <1 ,3) mindestens T,9-fäch differentiell"exf5rirniert werden, deren Expression sich um weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient (Scalp/Face) / (Scalp/Breast) ist ist kleiner als 10 oder größer als 0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGE™-Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten Haut.
Die zweite dar YQ--Jjßg ----d-aD Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in behaarter Haut stärker exprimiert werden als in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut stärker exprimiert werden als in behaarter Haut.
Erkrankungen bzw. Störungen der Homeostase behaarter Haut sind beispielsweise: Pili torti (Torsionshaare, gedrehte Haare), Monilethrix (Spindelhaar), Wollhaare (Kräuselhaar), Haarschaftveränderungen mit Brüchen [Trichorrhexis nodosa, Trichorrhexis invaginata, Trichoschisis, Trichoptilosis bei Stoffwechselstörungen, Pili recurväti, Rollhaare, Veränderungen der Haarfarbe [Heterochromie, Albinismus, Poliose (erworbene herdförmige Pigmentlosigkeit der Haare), Canitis (physiologisches Ergrauen)], Hypertrichosen, Hirsutismus, Alopezien (Irreversible Alopezie.: z.B. Androgenetische Alopezie des Mannes und der Frau); Reversible Alopezie.: z.B. Symptomatische diffuse Alopezien durch Infektionen, ehem. Noxen und Arzneimittel, hormoneile Störungen, Krankheiten, etc.) sowie Alopezia areata.
Die Gewinnung des Gemisches in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut kann aus Vollhautproben, behaarten Hautäquivalenten, isolierten Haafollikeln, Haarfollikeläquivalenten oder Zellen behaarter Haut vorgenommen werden.
Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in behaarter oder ausschließlich in unbehaarter Haut exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut wird das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zugeordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in behaarter Haut stärker exprimiert werden als in unbehaarter Haut, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in behaarter Haut exprimierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in unbehaarter Haut exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in behaarter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in unbehaarter Haut vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu kranker bzw. "1rr^e^oTteT~Hömeö~stäse befindlicher behaarter Haut wird in komplementärer Weise verfahren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 11 und 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 11 und 12 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 1,9- fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 1 ,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 9 und 10 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 9 und 10 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 3-fach öder "das ih~b)l tersüclτfe Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 3- fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 7 und 8 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 7 und 8 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 5- fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die~OntersuclτüTrgsel^eΕ^is^eäϊ s b)~rnit"deh" inTäbelle 6~in"S'pälte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 1 ,9- fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 1 ,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte
Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 3- fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls iie_M"ertge^σn_min"de"steπs~einem_der Proteine; mRNA-Moleküle Oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält die in gesunder behaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 5- fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 3 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 3 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 10- fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Man kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker -(Expressionprodukte der für behaarte Haut bedeutsamen Gene) quantifiziert- werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um gesunde (in Homeostase befindliche) behaarte Haut zu repräsentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um kranke (in gestörter Homeostase befindliche) Haut zu repräsentieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren j3) zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (1) als für behaarte Haut bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in behaarter bzw. in unbehaarter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 3 bis 12, Spalten 3 bzw. 5 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder (in Homeostase befindlicher) behaarter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in behaarter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker (in gestörter Homeostase befindlicher) Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen unbehaarter Haut entsprechen.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet dle~~Völlh ütprbbe "Cimfässehdere™ Vergleichsmöglichkeiten ~ mit den gleichfalls aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161:12 1735-8; sowie in „Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91, 231-244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
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Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blnts.
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. cDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA), xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE), xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und insbesondere xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird. vollem umfang Bezug genommen wird.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.
Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugter Biochip umfaßt Sonden, die ausgewählt sind unter solchen, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines
Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 3 bis 6 in Spalte 1 durch folgende laufende Ordnungsnummer definiert werden: 2, 4, 9, 12, 14, 16, 22, 25, 29, 31, 35, 36, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 46, 59, 62, 63, 65, 67, 68, 69, 74.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21, Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher „DNA Microarrays: A Practical Approach" "(Editor: MäTfTSchena, "19997"OxföT OFπve7sity~ Pf ess)~u nd~M icröäTräy~Biöchip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen. Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden- Immobilisierung realisiert:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. NatI Acad Sei USA 91, 5022-5026).
Neben diesen auf der in s/fu-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.
P.O. Brown (DeRlsi et al7~(T997),~ Science 2787"6BO^686)"bes^lτreirJt~clie Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen. Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyl- diisothioeyanat behandelt wurde.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu NeTgleicheTTäeTrZellpopulä^ mRNÄs werden mittels" reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Für die Herstellung kleiner (bis etwa 500 Sonden umfassender) Biochips sind die in der DE-A-100 28 257.1-52 und in der DE-A-101 02 063.5-52 genannten Analysechips ganz besonders bevorzugt. Diese Analysechips weisen eine elektrisch adressierbare Struktur auf, die eine Elektrofokussierung der Proben gestattet. Hierduch wird es vorteilhafterweise ermöglicht, Proben unabhängig von ihrer Viskosität mit Hilfe von Elektroden an definierten Punkten eines Punktrasters (Arrays) zu fokussieren und zu immobilisieren. Durch die Fokussierfähigkeit erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung der lokalen Konzentration der Proben und so eine höhere Spezifität. Während der Analyse selbst besteht die Möglichkeit das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren. So kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen Sensitivität aufgespürt werden. Eine Kreuzkontamination durch benachbarte Spots ist nahezu ausgeschlossen.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein. Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
Hir-einer-weiteren— bevorzugten Fornrr umfasst- der- erfindungsgemäße— Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, als Marker behaarter Haut bei Menschen.
In diesem Zusammenhang sind einige der in den Tabellen 3 bis 12 aufgelisteten
Gene bzw. Genprodukte von besonderem Interesse, beispielsweise das Protein
CDT6, dessen Rolle als Haarzyklusmarker besonders überraschend ist, da eher zu erwarten gewesen wäre, daß VEGF oder Angiopoietin als Marker in Frage kämen.
Gleiches gilt für die Proteine der 14-3-3 Familie. Diese sind zwar ubiquitär exprimiert, aber es war nicht vorherzusehen, welche Isoformen ein Rolle im
Haarzyklus spielen, noch welches Expressionmuster diese Isoformen haben werden.
Bei den überrepräsentierten Gruppen fallen insbesondere die DPPIV-Familie und die DNA-Helikasen auf. Für beide Genfamilien war eine Rolle im Haarzyklus auch für den Fachmann nicht vorhersehbar.
Auch die Gene der Melanin-Biosynthese sind hier zu nennen. Dass die Gene der
Melanin-Biosynthese im katagenen Haarfollikel stärker exprimiert sind als im anagenen ist unerwartet und überraschend.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus behaarter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, "&) einen Wirkstoff gegen- --i!rlä ι θngeτr"^eT~ Beeinträchtigαrrgen^der Homeostase behaarter Haut einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus behaarter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
Das erfindungsgemäße Testverfahren kann mit Vollhautproben, behaarten Hautäquivalenten, isolierten Haarfollikeln, Haarfollikeläquivalenten oder Zellen behaarter Haut durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) den Hautstatus behaarter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines ^rfindungsgemäßen- -estrKits-zur-Bestimmung_derΗomeostase_behaarteτ" Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) den Hautstatus behaarter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder
Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut bestimmt und als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Tabellen:
Tabelle 1:
Tabelle 2:
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Tabelle 5:
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Tabelle 8:
Tabelle 9:
Tabelle 10:
Tabellen:
Tabelle 12:

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung der für die Behaarung der Haut bedeutsamen Gene bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in behaarter menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in unbehaarter menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus unbehaarter menschlicher Haut gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in behaarter und unbehaarter Haut unterschiedlich stark exprimiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die behaarte menschliche Haut behaarte Kopfhaut ist und die unbehaarte menschliche Haut unbehaarte Gesichtshaut ist.
3. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in behaarter Haut stärker exprimiert werden als in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut stärker exprimiert werden als in behaarter Haut.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 11 und 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 11 und 12 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 1 ,9-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 1,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 9 und 10 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 9 und 10 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 7 und 8 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 7 und 8 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 6 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 1 ,9-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 1,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
10.Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 3 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, b) in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 3 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und c) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
11. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels eines Verfahrens nach Anspruch 1 als für behaarte Haut bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in behaarter bzw. in unbehaarter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 3 bis 12, Spalten 3 bzw. 5 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder (in Homeostase befindlicher) behaarter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in behaarter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker (in gestörter Homeostase befindlicher) Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen unbehaarter Haut entsprechen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Northern Blots, ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), iii. RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE), xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und insbesondere xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA- Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots, Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), iii. RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und insbesondere xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.
17. Test-Kit zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16.
18. Biochip zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, insbesondere an solche, die in den Tabellen 3 bis 6 in Spalte 1 durch folgende laufende Ordnungsnummer definiert werden: 2, 4, 9, 12, 14, 16, 22, 25, 29, 31, 35, 36, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 46, 59, 62, 63, 65, 67, 68, 69, 74.
19. Biochip nach Anspruch 18, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.
20. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
21. Biochip nach Anspruch 20, umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.
22. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
23. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, als Marker behaarter Haut bei Menschen.
24. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus behaarter Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 22, bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus behaarter Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 22, bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
25. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut, umfassend Mittel zur Durchführung des Testverfahrens gemäß Anspruch 24.
26. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut.
27. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) den Hautstatus behaarter Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 22, bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) den Hautstatus behaarter Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 22, bestimmt, d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
28. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut.
29. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase behaarter Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Screening-Verfahrens nach Anspruch 27, oder der Verwendung nach Anspruch 28 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
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