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EP1434997A1 - Fixed support for immobilizing biomolecules - Google Patents

Fixed support for immobilizing biomolecules

Info

Publication number
EP1434997A1
EP1434997A1 EP02799374A EP02799374A EP1434997A1 EP 1434997 A1 EP1434997 A1 EP 1434997A1 EP 02799374 A EP02799374 A EP 02799374A EP 02799374 A EP02799374 A EP 02799374A EP 1434997 A1 EP1434997 A1 EP 1434997A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
biomolecules
solid support
hybridization
functionality
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02799374A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Claudia Preininger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AIT Austrian Institute of Technology GmbH
Tecnet Equity NO Technologiebeteiligungs Invest GmbH
Original Assignee
ARC Seibersdorf Research GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ARC Seibersdorf Research GmbH filed Critical ARC Seibersdorf Research GmbH
Publication of EP1434997A1 publication Critical patent/EP1434997A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D161/00—Coating compositions based on condensation polymers of aldehydes or ketones; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D161/04—Condensation polymers of aldehydes or ketones with phenols only
    • C09D161/06—Condensation polymers of aldehydes or ketones with phenols only of aldehydes with phenols

Definitions

  • the present application relates to a solid support for immobilizing biomolecules, which is at least partially coated with a polymer, as well as a method for producing this support and the use of an epoxy resin.
  • an array for biomolecules is disclosed in US Pat. No. 6,150,103, a layer of polyethyleneimine (PEI) being applied to a glass support via a coupling agent such as tri (0-Ci-Cs-alkyl) silane on the surface of the array.
  • PEI polyethyleneimine
  • WO 94/00600 describes solid supports for nucleic acid hybridization assays, the solid support being coated with a polymer, such as PEI.
  • primers are bound to amino-derivatized glass supports for carrying out a solid-phase PCR.
  • the binding takes place via, for example, S-MBS (m-maleinimidobenzoyl-n-hydroxysulfo-subtinimide ester).
  • US 5,962,136 describes a solid support on which a polymer is applied, this polymer including is made of polyacrylic, polyester, polyurethane, silicone, cellulose, epoxy, olefin, fluorine, etc. Proteins or fragments thereof are immobilized on this polymer layer.
  • epoxy polymers are applied to a carrier which have been produced, for example, from the following monomers: acrylics, acrylamide derivatives, vinyls, nylon, polyurethanes and polyethers and copolymers thereof. These are copolymers. preferably hydrophilic. The functionality is at least 1.
  • the object of the present invention is to provide a To provide layering for a solid support for the immobilization of biomolecules, which has low or negligibly small intrinsic fluorescence, a high immobilization capacity and a large signal-to-noise ratio after the hybridization. Furthermore, the material for the coating should be easy and inexpensive to produce, easy to apply to the solid support and suitable for a number of different biomolecules, both at the DNA and protein levels.
  • the object of the present invention is achieved by the solid support described at the outset, which is characterized in that the polymer is a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8. It has surprisingly been found that such a phenolic resin is excellently suitable as a coating for a solid support for the immobilization of biomolecules, has a low autofluorescence, a high immobilization capacity and a very large signal-to-noise ratio. Phenolic resins with such functionality are already known, but they have hitherto been used in the field of semiconductors and also as an additive to solids, plastics, adhesives and other materials which have to withstand high temperatures.
  • a phenolic resin with such a functionality is optimally suitable for immobilizing biomolecules both at the DNA and at the protein level.
  • the term "functionality" is used in the art to describe the reactivity of the molecules making up the polymer.
  • the functionality relates, for example, to the number of epoxy groups per molecule.
  • the high functionality of the polymer is extremely favorable because it increases the binding capacity of the polymer.
  • the functionality of the polymer according to the invention is not too high that it would have an adverse effect. If the functionality is too high, there is a risk, for example, that the reactive groups react with one another and thus adversely affect the structure of the polymer.
  • the above functionalities are optimal for the Coating of a solid support for the immobilization of biomolecules, in particular for subsequent analysis processes at high temperatures, for which such phenolic resins are particularly suitable, in particular since no additional ther ochemical or photoreactive groups are necessary to bind the polymer to the support surface.
  • the phenolic resin also has high storage stability, improved tear properties and extremely high temperature and shape stability.
  • the phenolic resin can also be provided with additives in order to improve or change certain properties.
  • solid support is understood to mean all solid supports of any shape, size and of any suitable material known to the person skilled in the art.
  • microtiter plates, microarrays, filters, columns, membranes, etc. come into question.
  • phenolic resins are extremely suitable as a polymer for coating solid substrates for immobilizing biomolecules. Phenolic resins also have a low tendency to creep and a low coefficient of thermal expansion. Solid supports with epoxy-phenolic resins with a functionality defined above have surprisingly been found to be optimal in terms of the inherent fluorescence and the signal-to-noise ratio after hybridization.
  • Novolaks are phenolic resins, the aromatic rings of which are linked via methylene bridges. After hardening agents, such as formaldehyde, have been added, they can be hardened at elevated temperature with crosslinking. Novolaks are acid-catalyzed polycondensation products made from formaldehyde and phenols and do not contain any methylol groups. Novolak coatings with the functionality defined above have surprisingly been found to be extremely favorable in terms of immobilization capacity.
  • the polymer is preferably composed of bisphenol A groups.
  • Bisphenol A is a 2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane (C15H16O2) with a melting temperature of 155-156 ° C.
  • C15H16O2 2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane
  • These are polymers Particularly stable in temperature and shape, which is advantageous, for example, for use in on-chip PCRs, since repeated heating and cooling has to be carried out. Furthermore, these polymers have a high chemical resistance, flow stability and short pressing cycles.
  • a polymer composed of bisphenol A groups with an epoxy functionality of 6 to 15 has all the necessary properties of a coating for solid supports for the immobilization of biomolecules:
  • the immobilization capacity after blocking the reactive groups is extremely high, for example it is at least 60%.
  • Epon Resin SU-8 from Shell (corresponds to Epikote 157 from Resolution).
  • Epikote 157 is a polymeric solid phenolic resin with an average epoxy group functionality average of 8 and is based on bisphenol A.
  • the viscosity at 130 ° C is 1 to 6 Pa.st.
  • the epoxy molar weight is 195 to 230 g / eq and the epoxy group content is 4348 to 5128 mmol / kg.
  • the melting point is around 82 ° C, the density at 1.2 kg / L. This substance has proven to be optimal as a coating for a solid support for immobilizing biomolecules.
  • SU-8 has a decomposition temperature of about 380 ° C.
  • SU-8 is particularly biocompatible and, in the event that it is cross-linked, it is difficult to bring it back into the liquid state and is insoluble in most chemicals. It has been shown that SU-8 is particularly stable in temperature and shape and is therefore ideal as a coating material.
  • the carrier is preferably a microtiter plate.
  • the coating is provided in each well, so that certain biomolecules can be immobilized per well.
  • the carrier is a microarray.
  • This microarray can have any shape or size; it can be provided, for example, in the form of a glass plate or a well.
  • the biomolecules are in a high Density is immobilized, so that such microarrays are highly suitable for detection and analysis processes.
  • Such microarrays are well known in the art and, depending on the biomolecule and the amount of samples to be detected, the person skilled in the art can select the microarray that is optimal for him.
  • the polymer is preferably coated in spots on the carrier. These spots are localized areas with a given diameter. This provides a solid support that can only immobilize biomolecules in the spots, so that an accurate and reproducible result is obtained in analysis methods with multiple samples. Furthermore, the necessary sample quantities are limited.
  • An advantageous carrier is further characterized in that biomolecules are immobilized on the polymer.
  • biomolecules are immobilized on the polymer.
  • a carrier with immobilized biomolecules is already made available, as a result of which additional preparatory steps for preparing the carrier are not necessary and thereby simplify an analysis method to be carried out.
  • the biomolecules can be immobilized directly on the polymer surfaces or via crosslinkers known per se.
  • biomolecules can be immobilized on the polymer surface via an additional derivatization.
  • the biomolecules are preferably immobilized in spots on the polymer.
  • spots are understood to mean localized areas with a certain diameter, with the same or identical biomolecules being advantageously immobilized per spot. In this way, a number of different biomolecules can be analyzed or detected simultaneously on a solid support, which can also be coated with polymer over its entire surface.
  • the biomolecules are particularly preferably selected from the group consisting of oligonucleotides, proteins, peptides, antigens and antibodies.
  • Oligonucleotides are understood to mean both DNA and RNA molecules of any size, in particular a size between 5 and 70 nucleotides, with or without artificial modifications.
  • the biomolecules react with the epoxy groups, immobilizing them on the polymer.
  • Such solid supports can thus be used, for example, for solid-phase PCRs, hybridization reactions, the detection of antigens or antibodies, enzymatic reactions, etc.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, as a coating on a solid support for immobilizing biomolecules.
  • a phenolic resin with such functionality has not previously been used as a coating agent for a solid support for immobilizing biomolecules.
  • a phenolic resin with a functionality of 6 to 15 is particularly well suited for this and delivers optimal results, in particular with regard to the binding capacity, the signal-to-noise ratio and the autofluorescence.
  • the phenolic resin can be made available in solid form, for example dissolved in methyl ethyl ketone, or as a finished solution, for example in ⁇ -butyrolactone.
  • the polymer is particularly preferably a novolak and particularly preferably a polymer which is based on bisphenol A groups.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing a carrier according to the invention as described above, wherein a layer of phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, is applied to the carrier.
  • a layer of phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8 is applied to the carrier.
  • This can be carried out by any known method which is also known to the person skilled in the art in the field of biochemistry.
  • Various supports can also be used here, such as chips, microtiter plates, biosensors, etc..
  • FIG. 1 shows the reaction mechanism of the carrier according to the invention
  • 2 shows the hybridization genetics on the carrier according to the invention
  • 3 shows the immobilization capacity of biomolecules on commercial and inventive carriers
  • 4 shows the signal-to-noise ratio of different carriers
  • a comparison of a hybridization with and without Ethanolamine blocking is shown
  • Figure 6 the compatibility with two different spotters is shown
  • the spot diameters of different polymers are compared with one another in FIG. 7 and the optimal sample concentration is shown in FIG. 8.
  • the glass slides are coated by immersion in 2% epoxy resin (functionality 8) (Shell Chemicals) / toluene solution under N2 or 2% epoxy resin / methyl ethyl ketone (hereinafter referred to as "SU-8 slides").
  • epoxy resin functionality 8
  • SU-8 slides 2% epoxy resin / methyl ethyl ketone
  • SU-8 slides contain epoxy functions that are linked to nucleophilic groups, e.g. Amino groups react with ring opening to secondary amines.
  • the reaction mechanism is shown in Fig.l.
  • the SU-8 slides are placed on a damp paper towel in a plastic petri dish, sealed with parafilm and placed in the drying cabinet at 50 ° C. overnight.
  • the spots swell in the wet atmosphere, can react with the reactive surface and be covalently bound to the surface.
  • the slides can lie down for a few days before the blocking and hybridization is started.
  • the slides are shaken with a solution of 50 mM ethanolamine, 0.1 M ris, pH 9 and 0.1% SDS for 15 min at 50 ° C, and again twice in H 2 0 washed, and finally blown dry with compressed air. It is beneficial to use at least 10 ml of solution per slide and the slides when changing the washing solution do not dry.
  • the sample labeled with Cy5 or Cy3 is placed in 20mM Tris, pH 7.4; 0.9 M NaCl, 0.01% SDS and formamide were taken up, denatured at 95 ° C. (5 min) and then immediately placed on ice. 20 ⁇ l are dropped onto the array on the slide, covered with a 1.5 x 1.5 cm cover plate and hybridized at 50 ° C.
  • the hybridization times were varied from 1 to 7 hours. 2 shows the fluorescence (fl) of the hybridization signal as a function of time. A hybridization time of 2 hours is sufficient for a clear hybridization result. The fluorescence intensities after 2 and 4 hours of hybridization are within the standard deviation.
  • the hybridization efficiency was the same for 0.35 and 1 nl spots.
  • the fluorescence intensities did not change.
  • FIG. 4 shows a comparison of the signal-to-noise ratio (HG, background) in%, amino-silanized (a), nitrocellulose (N), aldehyde (A) being known Epoxy slides (E) and SU-8 slides were compared.
  • the SU-8 slides showed a very good signal-to-noise ratio compared to the known slides.
  • the fluorescence background was calculated as a percentage of the hybridization signal, the mean fluorescence background measured on 15 hybridized samples on SU8 9.3%, on 3D-Link TM 29.9% and on EasySpot (hydrophilic epoxy polymer) 30.1 % scam.
  • Hybridization was measured after blocking the supports with 0, 20 and 50 mM ethanolamine, and it can be seen from FIG. 5 that hybridization without ethanolamine blocking gave a similar fluorescence background compared to hybridization with ethanolamine blocking.
  • the result of this is that the method with SU8 can also be carried out without a blocking step, which considerably simplifies and shortens the method compared to conventional carriers in which the blocking step is essential.
  • the average spot diameter of biomolecular probes was measured on different, reactive chip surfaces.
  • the concentration of an amino-modified oligonucleotide (18 to 50mer) spotted on a SU8 support was varied between 0.02 ⁇ m and 100 ⁇ m, and the hybridization signals were measured. No difference in hybridization fluorescence could be detected at the higher concentrations (above 20 ⁇ M). The lowest sample concentration that resulted in a significant hybridization signal was 2uM. 8a shows the hybridization fluorescence of 20, 2, 0.2 and 0.02 ⁇ M-spotted oligonucleotides.
  • single-stranded DNA (1500 base pairs) was spotted on an SU8 support, a detectable signal being seen even at 50ng / ⁇ l single-stranded DNA.
  • 8b shows the result of the fluorescence scan, 10, 50, 100, 150 and 200ng / ⁇ l single-strand DNA with 2ng / ⁇ l fluorescent labeling being spotted on the support.

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Abstract

The invention concerns a fixed support for immobilizing biomolecules, said support being covered, at least in some parts, with a polymer. The invention is characterized in that the polymer is an epoxy resin with functionality ranging between 4 and 15. The invention also concerns a method for making such a support.

Description

Fester Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen Solid support for immobilizing biomolecules
Die vorliegende Anmeldung betrifft einen festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen, der zumindest bereichsweise mit einem Polymer beschichtet ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Trägers und eine Verwendung eines Epoxyharzes.The present application relates to a solid support for immobilizing biomolecules, which is at least partially coated with a polymer, as well as a method for producing this support and the use of an epoxy resin.
Eine Reihe verschiedener fester Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen ist bereits bekannt, wobei im Stand der Technik die verschiedensten Formen und Zusammensetzungen -beschrieben sind. Damit ein Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen geeignet ist, muss dieser entweder aus einem geeigneten Material hergestellt werden, oder - wie immer häufiger der Fall ist - ein fester Träger wird aus einem beliebigen Material hergestellt und dessen Oberfläche mit einem spezifisch ausgewählten, geeigneten Stoff beschichtet. Es sind eine Vielzahl von Stoffen zur Beschichtung von festen Trägern im Stand der Technik beschrieben:A number of different solid supports for the immobilization of biomolecules are already known, the most varied forms and compositions being described in the prior art. For a carrier to be suitable for immobilizing biomolecules, it must either be made of a suitable material or - as is more and more often the case - a solid carrier is made of any material and its surface is coated with a specifically selected, suitable substance. A large number of substances for coating solid supports are described in the prior art:
Beispielsweise ist in der US 6 150 103 ein Array für Biomoleküle offenbart, wobei auf der Oberfläche des Arrays eine Schicht Polyethylenimin (PEI) über ein Kup lungsagens wie Tri (0- Ci-Cs-Alkyl) Silan auf einem Glasträger aufgebracht ist.For example, an array for biomolecules is disclosed in US Pat. No. 6,150,103, a layer of polyethyleneimine (PEI) being applied to a glass support via a coupling agent such as tri (0-Ci-Cs-alkyl) silane on the surface of the array.
In der WO 94/00600 sind feste Träger für Nukleinsäuren-Hy- bridisierungs -Assays beschrieben, wobei der feste Träger mit einem Polymer, wie beispielsweise PEI, beschichtet ist.WO 94/00600 describes solid supports for nucleic acid hybridization assays, the solid support being coated with a polymer, such as PEI.
In der Veröffentlichung von Adessi et al. (Nucleic Acid Research, 2000, vol. 28, no. 20, e87) werden Primer zur Durchführung einer Festphasen PCR an aminoderivatisierte Glasträger gebunden. Die Bindung erfolgt über beispielsweise S-MBS (m-Mal- einimidobenzoyl-n-hydroxysulfo-subtinimidester) .In the Adessi et al. (Nucleic Acid Research, 2000, vol. 28, no. 20, e87), primers are bound to amino-derivatized glass supports for carrying out a solid-phase PCR. The binding takes place via, for example, S-MBS (m-maleinimidobenzoyl-n-hydroxysulfo-subtinimide ester).
In der US 5 962 136 wird ein fester Träger beschrieben, auf dem ein Polymer aufgebracht ist, wobei dieses Polymer u.a. aus Polyacryl, Polyester, Polyurethan, Silikon, Cellulose, Epoxy, Olefin, Fluorin, etc. aufgebaut ist. Auf dieser Polymerschicht werden Proteine oder Fragmente davon immobilisiert.US 5,962,136 describes a solid support on which a polymer is applied, this polymer including is made of polyacrylic, polyester, polyurethane, silicone, cellulose, epoxy, olefin, fluorine, etc. Proteins or fragments thereof are immobilized on this polymer layer.
Gemäß der WO 01/67129 A2 werden Epoxipolymere auf einen Träger aufgebracht, die beispielsweise aus den folgenden Monomeren hergestellt wurden: Acryle, Acrylamidderivate, Vinyle, Nylon, Polyurethane und Polyäther sowie Copolymere davon. Dabei sind diese Copolymere . vorzugsweise hydrophil. Die Funktionalität beträgt zumindest 1.According to WO 01/67129 A2, epoxy polymers are applied to a carrier which have been produced, for example, from the following monomers: acrylics, acrylamide derivatives, vinyls, nylon, polyurethanes and polyethers and copolymers thereof. These are copolymers. preferably hydrophilic. The functionality is at least 1.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Be- Schichtung für einen festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen, die geringe oder vernachlässigbar kleine Eigenfluoreszenz, eine hohe Immobilisierungs- kapazität und ein großes Signal-Rausch Verhältnis nach der Hybridisierung aufweist. Weiters soll das Material für die Beschichtung leicht und kostengünstig herstellbar sein, auf einfache Weise auf den festen Träger aufbringbar sein und sich für eine Reihe von verschiedenen Biomolekülen, sowohl auf DNA- als auch auch Protein-Ebene, eignen.The object of the present invention is to provide a To provide layering for a solid support for the immobilization of biomolecules, which has low or negligibly small intrinsic fluorescence, a high immobilization capacity and a large signal-to-noise ratio after the hybridization. Furthermore, the material for the coating should be easy and inexpensive to produce, easy to apply to the solid support and suitable for a number of different biomolecules, both at the DNA and protein levels.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch den eingangs beschriebenen festen Träger gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polymer ein Phenolharz mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, ist. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass sich ein solches Phenolharz ausgezeichnet als Beschichtung für einen festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen eignet, eine geringe Autofluoreszenz, eine hohe Immobilisierungskapazität sowie ein sehr großes Signal-Rausch Verhältnis aufweist. Phenolharze mit einer solchen Funktionalität sind bereits bekannt, jedoch wurden sie bisher auf dem Gebiet der Halbleiter sowie auch als Zusatz zu Feststoffen, Kunststoffen, Klebstoffen und weiteren Materialien, die hohe Temperaturen aushalten müssen, eingesetzt.The object of the present invention is achieved by the solid support described at the outset, which is characterized in that the polymer is a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8. It has surprisingly been found that such a phenolic resin is excellently suitable as a coating for a solid support for the immobilization of biomolecules, has a low autofluorescence, a high immobilization capacity and a very large signal-to-noise ratio. Phenolic resins with such functionality are already known, but they have hitherto been used in the field of semiconductors and also as an additive to solids, plastics, adhesives and other materials which have to withstand high temperatures.
Es hat sich nun überraschenderweise herausgestellt, dass sich ein Phenolharz mit einer solchen Funktionalität optimal zur Immobilisierung von Biomolekülen sowohl auf DNA- als auch auf Protein-Ebene eignet. Der Ausdruck "Funktionalität" wird in der Fachwelt für die Beschreibung der Reaktivität der das Polymer aufbauenden Moleküle verwendet. Im vorliegenden Fall betrifft die Funktionalität beispielsweise die Anzahl der Epoxygruppen pro Molekül . Dabei ist auf der einen Seite die hohe Funktionalität des Polymers ausgesprochen günstig, da dadurch die Bindungskapazität des Polymers erhöht wird. Auf der anderen Seite ist bei dem erfindungsgemäßen Polymer die Funktionalität nicht zu hoch, dass sie störend wirken würde. Im Falle einer zu hohen Funktionalität besteht beispielsweise die Gefahr, dass die reaktiven Gruppen miteinander reagieren und somit die Struktur des Polymers nachteilig beeinflusst wird. Dadurch würde sich die Konsistenz des Polymers bei einer zu hohen Funktionalität nachteilig verändern. Aus diesem Grund sind die obigen Funktionalitäten optimal für die Beschichtung eines festen Trägers zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere für anschließende Analyseverfahren mit hohen Temperaturen, für die sich derartige Phenolharze bestens eignen, insbesondere da keine zusätzlichen ther ochemischen oder photoreaktiven Gruppen notwendig sind, um das Polymer an die Trägeroberfläche zu binden. Das Phenolharz weist weiters eine hohe Lagerstabilität, verbesserte Reißeigenschaften sowie eine ausgesprochen hohe Temperatur- und Formstabilität auf. Das Phenolharz kann auch mit Zusätzen versehen sein, um bestimmte Eigenschaften zu verbessern oder zu verändern.It has now surprisingly turned out that a phenolic resin with such a functionality is optimally suitable for immobilizing biomolecules both at the DNA and at the protein level. The term "functionality" is used in the art to describe the reactivity of the molecules making up the polymer. In the present case, the functionality relates, for example, to the number of epoxy groups per molecule. On the one hand, the high functionality of the polymer is extremely favorable because it increases the binding capacity of the polymer. On the other hand, the functionality of the polymer according to the invention is not too high that it would have an adverse effect. If the functionality is too high, there is a risk, for example, that the reactive groups react with one another and thus adversely affect the structure of the polymer. This would disadvantageously change the consistency of the polymer if the functionality was too high. For this reason, the above functionalities are optimal for the Coating of a solid support for the immobilization of biomolecules, in particular for subsequent analysis processes at high temperatures, for which such phenolic resins are particularly suitable, in particular since no additional ther ochemical or photoreactive groups are necessary to bind the polymer to the support surface. The phenolic resin also has high storage stability, improved tear properties and extremely high temperature and shape stability. The phenolic resin can also be provided with additives in order to improve or change certain properties.
Unter dem Begriff "fester Träger" sind im Rahmen der vorliegenden Anmeldung alle dem Fachmann bekannten, festen Träger jeglicher Form, Größe und aus jeglichem geeigneten Material zu verstehen. So kommen beispielsweise Mikrotiterplatten, Mikroar- rays, Filter, Säulen, Membranen etc. in Frage. Dabei ist es möglich, das Phenolharz mittels Strahlung, etwa UV-Strahlung zu strukturieren, um sog. "patterned surfaces" herzustellen.In the context of the present application, the term “solid support” is understood to mean all solid supports of any shape, size and of any suitable material known to the person skilled in the art. For example, microtiter plates, microarrays, filters, columns, membranes, etc. come into question. It is possible to structure the phenolic resin by means of radiation, for example UV radiation, in order to produce so-called "patterned surfaces".
Aufgrund der hohen Festigkeit, Steifheit,- Zähigkeit, Wärmebeständigkeit und Härte eignen sich Phenolharze ausgesprochen gut als Polymer zur Beschichtung von festen Trägern zu Immobilisierung von Biomolekülen. Weiters weisen Phenolharze eine geringe Kriechneigung und einen niedrigen Wärmeausdehnungskoeffizienten auf. Feste Träger mit Epoxy-Phenolharzen mit einer oben definierten Funktionalität haben sich überraschenderweise als optimal im Hinblick auf die Eigenfluoreszenz und das Signal-Rausch-Verhältnis nach der Hybridisierung herausgestellt.Because of their high strength, stiffness, toughness, heat resistance and hardness, phenolic resins are extremely suitable as a polymer for coating solid substrates for immobilizing biomolecules. Phenolic resins also have a low tendency to creep and a low coefficient of thermal expansion. Solid supports with epoxy-phenolic resins with a functionality defined above have surprisingly been found to be optimal in terms of the inherent fluorescence and the signal-to-noise ratio after hybridization.
Ein weiterer günstiger fester Träger ist dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Novolak ist. Novolake sind Phenolharze, deren aromatische Ringe über Methylenbrücken verknüpft sind. Sie können nach Zusatz von Härtungsmitteln, etwa Formaldehyd bei erhöhter Temperatur unter Vernetzung gehärtet werden. Novolake sind säurekatalytisch hergestellte Polykondensations- produkte aus Formaldehyden und Phenolen und enthalten keine Me~ thylol-Gruppen. Novolak-Beschichtungen mit der oben definierten Funktionalität haben sich überraschenderweise als ausgesprochen günstig im Hinblick auf die Immobilisierungskapazität herausgestellt.Another cheap solid support is characterized in that the polymer is a novolak. Novolaks are phenolic resins, the aromatic rings of which are linked via methylene bridges. After hardening agents, such as formaldehyde, have been added, they can be hardened at elevated temperature with crosslinking. Novolaks are acid-catalyzed polycondensation products made from formaldehyde and phenols and do not contain any methylol groups. Novolak coatings with the functionality defined above have surprisingly been found to be extremely favorable in terms of immobilization capacity.
Vorzugsweise ist das Polymer aus Bisphenol A Gruppen aufgebaut. Bisphenol A ist ein 2, 2-Bis (4-hydroxyphenyl) Propan (C15H16O2) mit einer Schmelztemperatur von 155-156 °C. Diese Polymere sind besonders temperatur- und formstabil, was beispielsweise für die Verwendung in On-Chip-PCR's günstig ist, da wiederholt aufgeheizt und abgekühlt werden muss . Weiters weisen diese Polymere eine hohe chemische Resistenz, Fließstabilität und kurze Presszyklen auf. Ein Polymer aufgebaut aus Bisphenol A Gruppen mit einer Epoxy-Funktionalität von 6 bis 15 weist alle notwendigen Eigenschaften einer Beschichtung für feste Träger zur Immobiliserung von Biomolekülen auf:The polymer is preferably composed of bisphenol A groups. Bisphenol A is a 2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane (C15H16O2) with a melting temperature of 155-156 ° C. These are polymers Particularly stable in temperature and shape, which is advantageous, for example, for use in on-chip PCRs, since repeated heating and cooling has to be carried out. Furthermore, these polymers have a high chemical resistance, flow stability and short pressing cycles. A polymer composed of bisphenol A groups with an epoxy functionality of 6 to 15 has all the necessary properties of a coating for solid supports for the immobilization of biomolecules:
- geringe oder vernachlässigbar kleine Eigenfluoreszenz, wodurch die Eigenfluoreszenz der des leeren Trägers entspricht, so dass die Wahl der Qualität des festen Trägers die Autofluoreszenz des Trägers bestimmt.- Low or negligibly small self-fluorescence, whereby the self-fluorescence corresponds to that of the empty support, so that the choice of the quality of the solid support determines the auto-fluorescence of the support.
- Weiters ist die Immobilisierungskapazität nach Blockierung der reaktiven Gruppen ausgesprochen hoch, beispielsweise liegt sie bei mindestens 60%.- Furthermore, the immobilization capacity after blocking the reactive groups is extremely high, for example it is at least 60%.
- Weiters ist das Signal-Rausch Verhältnis nach der Hybridisierung sehr groß.- Furthermore, the signal-to-noise ratio after hybridization is very large.
Als Beispiel eines solchen Polymers ist Epon Resin SU-8 der Firma Shell (entspricht dem Epikote 157 der Firma Resolution) zu nennen. Epikote 157 ist ein polymerisches festes Phenolharz mit einem durchschnittlichen Epoxidgruppen-Funktionalitätsmittelwert von 8 und basiert auf Bisphenol A. Die Viskosität beträgt bei 130 °C 1 bis 6 Pa.st. Das Epoxy-Molargewicht beträgt 195 bis 230 g/eq und der Epoxygruppengehalt beträgt 4348 bis 5128 mmol/kg. Der Schmelzpunkt liegt um 82 °C, die Dichte bei 1,2 kg/L. Dieser Stoff hat sich als optimal als Beschichtung eines festen Trägers zur Immobilisierung von Biomolekülen erwiesen. Beispielsweise hat SU-8 eine Zersetzungstemperatur von etwa 380°C. Gleichzeitig ist SU-8 besonders biokompatibel und im Fall, dass es quervernetzt ist, ist es nur schwer wieder in den flüssigen Zustand zu bringen und ist unlöslich in den meisten Chemikalien. Es hat sich gezeigt, dass SU-8 besonders temperatur- und formstabil ist und sich dadurch optimal als Beschichtungsmaterial eignet.An example of such a polymer is Epon Resin SU-8 from Shell (corresponds to Epikote 157 from Resolution). Epikote 157 is a polymeric solid phenolic resin with an average epoxy group functionality average of 8 and is based on bisphenol A. The viscosity at 130 ° C is 1 to 6 Pa.st. The epoxy molar weight is 195 to 230 g / eq and the epoxy group content is 4348 to 5128 mmol / kg. The melting point is around 82 ° C, the density at 1.2 kg / L. This substance has proven to be optimal as a coating for a solid support for immobilizing biomolecules. For example, SU-8 has a decomposition temperature of about 380 ° C. At the same time, SU-8 is particularly biocompatible and, in the event that it is cross-linked, it is difficult to bring it back into the liquid state and is insoluble in most chemicals. It has been shown that SU-8 is particularly stable in temperature and shape and is therefore ideal as a coating material.
Vorzugsweise ist der Träger eine Mikrotiterplatte. In diesem Fall wird die Beschichtung in jedem Well vorgesehen, so dass pro Well bestimmte Biomoleküle immobilisiert werden können.The carrier is preferably a microtiter plate. In this case, the coating is provided in each well, so that certain biomolecules can be immobilized per well.
Günstig ist es weiters, wenn der Träger ein Mikroarray ist. Dieser Mikroarray kann jegliche Form oder Größe aufweisen, er kann beispielsweise in Form einer Glasplatte oder eines Wells vorgesehen sein. Hierbei werden die Biomoleküle in einer hohen Dichte immobilisiert, so dass sich solche Mikroarrays für Detek- tions- und Analyseverfahren im hohen Ausmaße eignen. Solche Mikroarrays sind im Stand der Technik wohl bekannt und der Fachmann kann je nach Biomolekül und Menge der zu detektierenden Proben den für ihn optimalen Mikroarray selektieren.It is also advantageous if the carrier is a microarray. This microarray can have any shape or size; it can be provided, for example, in the form of a glass plate or a well. Here the biomolecules are in a high Density is immobilized, so that such microarrays are highly suitable for detection and analysis processes. Such microarrays are well known in the art and, depending on the biomolecule and the amount of samples to be detected, the person skilled in the art can select the microarray that is optimal for him.
Vorzugsweise ist das Polymer in Spots auf dem Träger beschichtet. Diese Spots sind lokalisierte Bereiche mit gegebenem Durchmesser. Dadurch wird ein fester Träger zur Verfügung gestellt, der nur in den Spots Biomoleküle immobilisieren kann, so dass ein genaues und reproduzierbares Ergebnis bei Analyseverfahren mit mehreren Proben erhalten wird. Weiters sind die notwendigen Probenmengen begrenzt.The polymer is preferably coated in spots on the carrier. These spots are localized areas with a given diameter. This provides a solid support that can only immobilize biomolecules in the spots, so that an accurate and reproducible result is obtained in analysis methods with multiple samples. Furthermore, the necessary sample quantities are limited.
Ein vorteilhafter Träger ist weiters dadurch gekennzeichnet, dass Biomoleküle am Polymer immobilisiert sind. Dadurch wird bereits ein Träger mit immobilisierten Biomolekülen zur Verfügung gestellt, wodurch zusätzliche Vorbereitungsschritte zur Aufbereitung des Trägers nicht notwendig sind und dadurch ein durchzuführendes Analyseverfahren vereinfachen. Dabei können die Biomoleküle direkt auf den Polymer-Oberflächen immobilisiert sein oder aber auch über an sich bekannte Crosslinker. Weiters können Biomoleküle über eine zusätzliche Derivatisierung auf der Polymer-Oberfläche immobilisiert sein.An advantageous carrier is further characterized in that biomolecules are immobilized on the polymer. As a result, a carrier with immobilized biomolecules is already made available, as a result of which additional preparatory steps for preparing the carrier are not necessary and thereby simplify an analysis method to be carried out. The biomolecules can be immobilized directly on the polymer surfaces or via crosslinkers known per se. Furthermore, biomolecules can be immobilized on the polymer surface via an additional derivatization.
Vorzugsweise sind die Biomoleküle in Spots am Polymer immobilisiert. Auch hier werden unter "Spots" wiederum lokalisierte Bereiche mit einem bestimmten Durchmesser verstanden, wobei günstigerweise pro Spot gleichartige bzw. identische Biomoleküle immobilisiert werden. Auf diese Weise kann eine Reihe von verschiedenen Biomolekülen auf einem festen Träger, der auch auf seiner gesamten Oberfläche mit Polymer beschichtet sein kann, gleichzeitig analysiert oder detektiert werden.The biomolecules are preferably immobilized in spots on the polymer. Here, too, "spots" are understood to mean localized areas with a certain diameter, with the same or identical biomolecules being advantageously immobilized per spot. In this way, a number of different biomolecules can be analyzed or detected simultaneously on a solid support, which can also be coated with polymer over its entire surface.
Besonders bevorzugt sind die Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden, Proteinen, Peptiden, Antigenen und Antikörpern. Unter "Oligonukleotiden" werden dabei sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle jeglicher Größe, insbesondere einer Größe zwischen 5 und 70 Nukleotiden, verstanden mit oder ohne künstliche Modifizierungen. Die Biomoleküle reagieren mit den Epoxygruppen, wodurch sie am Polymer immobilisiert werden. Somit können solche festen Träger beispielsweise für Festphasen- PCRs, Hybridisierungsreaktionen, die Detektion von Antigenen bzw. Antikörpern, enzymatische Reaktion usw. verwendet werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Phenolharzes mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, als Beschichtung auf einem festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen. Auch hier gelten wiederum die oben angegebenen Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen. Ein Phenolharz mit einer solchen Funktionalität wurde bislang noch nicht als Beschichtungs- mittel für einen festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen verwendet. Es hat sich nun herausgestellt, dass ein Phenolharz mit einer Funktionalität von 6 bis 15 sich dafür aber besonders gut eignet und insbesondere im Hinblick auf die Bindungskapazität, das Signal-Rausch-Verhältnis und die Autofluoreszenz optimale Ergebnisse liefert. Dabei kann das Phenolharz in fester Form, das beispielsweise in Methylethylketon gelöst wird, oder bereits als fertige Lösung, z.B. in γ-Butyrolacton, zur Verfügung gestellt werden.The biomolecules are particularly preferably selected from the group consisting of oligonucleotides, proteins, peptides, antigens and antibodies. “Oligonucleotides” are understood to mean both DNA and RNA molecules of any size, in particular a size between 5 and 70 nucleotides, with or without artificial modifications. The biomolecules react with the epoxy groups, immobilizing them on the polymer. Such solid supports can thus be used, for example, for solid-phase PCRs, hybridization reactions, the detection of antigens or antibodies, enzymatic reactions, etc. Another aspect of the present invention relates to the use of a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, as a coating on a solid support for immobilizing biomolecules. Again, the definitions and preferred embodiments given above apply. A phenolic resin with such functionality has not previously been used as a coating agent for a solid support for immobilizing biomolecules. It has now been found that a phenolic resin with a functionality of 6 to 15 is particularly well suited for this and delivers optimal results, in particular with regard to the binding capacity, the signal-to-noise ratio and the autofluorescence. The phenolic resin can be made available in solid form, for example dissolved in methyl ethyl ketone, or as a finished solution, for example in γ-butyrolactone.
Besonders bevorzugt ist das Polymer ein Novolak und besonders bevorzugt ein Polymer, das auf Bisphenol A-Gruppen aufgebaut ist.The polymer is particularly preferably a novolak and particularly preferably a polymer which is based on bisphenol A groups.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers wie oben beschrieben, wobei eine Schicht Phenolharz mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, auf den Träger aufgebracht wird. Dies kann nach jedem bekannten Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann auch auf dem Gebiet der Biochemie bekannt sind. Auch hier können verschiedene Träger verwendet werden, etwa Chips, Mikrotiterplatten, Biosensoren, etc. .Another aspect of the present invention relates to a method for producing a carrier according to the invention as described above, wherein a layer of phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, is applied to the carrier. This can be carried out by any known method which is also known to the person skilled in the art in the field of biochemistry. Various supports can also be used here, such as chips, microtiter plates, biosensors, etc..
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und Figuren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, weiter erläutert, wobei in Fig.l der Reaktionsmechanismus des erfindungsgemäßen Trägers gezeigt ist; in Fig.2 die Hybridisierungsgenetik auf dem erfindungsgemäßen Träger dargestellt ist; in Fig.3 die Immobilisierungskapazität von Biomolekülen auf kommerziellen und auf erfinderischen Trägern dargestellt ist; in Fig.4 das Signal-Rausch-Verhältnis verschiedener Träger gezeigt ist; in Fig.5 ein Vergleich einer Hybridisierung mit und ohne Ethanolamin-Blockieren dargestellt ist; in Fig.6 die Kompatibilität mit zwei verschiedenen Spottern gezeigt ist; in Fig.7 die Spotdurchmesser verschiedener Polymere miteinander verglichen werden und in Fig. 8 die optimale Probenkonzentration dargestellt ist.The present invention is further illustrated by the following examples and figures, to which, however, it is not intended to be limited, the reaction mechanism of the carrier according to the invention being shown in FIG. 1; 2 shows the hybridization genetics on the carrier according to the invention; 3 shows the immobilization capacity of biomolecules on commercial and inventive carriers; 4 shows the signal-to-noise ratio of different carriers; a comparison of a hybridization with and without Ethanolamine blocking is shown; in Figure 6 the compatibility with two different spotters is shown; the spot diameters of different polymers are compared with one another in FIG. 7 and the optimal sample concentration is shown in FIG. 8.
Beispiel 1example 1
Herstellung von Epoxyharz-Slides für OligoarraysManufacture of epoxy resin slides for oligoarrays
Die Glasobjektträger werden durch Eintauchen in 2% Epoxyharz (Funktionalität 8) (Shell Chemicals)/ Toluollösung unter N2 oder 2% Epoxyharz/Methylethylketon beschichtet (in der Folge "SU-8 Slides" genannt) .The glass slides are coated by immersion in 2% epoxy resin (functionality 8) (Shell Chemicals) / toluene solution under N2 or 2% epoxy resin / methyl ethyl ketone (hereinafter referred to as "SU-8 slides").
SU-8 Slides enthalten Epoxyfunktionen, die mit nukleophilen Gruppen, wie z.B. Aminogruppen unter Ringöffnung zu sekundären Aminen reagieren. Der Reaktionsmechanismus ist in Fig.l angeführt .SU-8 slides contain epoxy functions that are linked to nucleophilic groups, e.g. Amino groups react with ring opening to secondary amines. The reaction mechanism is shown in Fig.l.
Beispiel 2Example 2
Hybridisierungsprotokollhybridization protocol
Nach dem Aufspotten von amino-modifizierten Oligonukleotiden werden die SU-8 Slides auf ein feuchtes Papiertuch in eine Plas- tikpetrischale gelegt, mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei 50 °C in den Trockenschrank gegeben. In der Feuchtatmosphäre quellen die Spots auf, können mit der reaktiven Oberfläche reagieren und kovalent an die Oberfläche gebunden werden. Nach Inkubation im Trockenschrank können die Slides ein paar Tage abliegen, bevor mit der Blockierung und Hybridisierung begonnen wird.After spotting amino-modified oligonucleotides, the SU-8 slides are placed on a damp paper towel in a plastic petri dish, sealed with parafilm and placed in the drying cabinet at 50 ° C. overnight. The spots swell in the wet atmosphere, can react with the reactive surface and be covalently bound to the surface. After incubation in the drying cabinet, the slides can lie down for a few days before the blocking and hybridization is started.
Um die reaktiven Epoxy-Gruppen am Slide zu blockieren, werden die Slides mit einer Lösung aus 50mM Ethanolamin, 0,1 M ris, pH 9 und 0,1% SDS 15 Min bei 50 °C geschüttelt, und wiederum zwei Mal in H20 gewaschen, und schließlich mit Pressluft trocken geblasen. Es ist günstig, wenn pro Slide mindestens 10 ml Lösung verwendet werden, und die Slides beim Wechsel der Waschlösung nicht antrocknen. Zur Hybridisierung am Chip wird die mit Cy5 oder Cy3 markierte Probe in 20mM Tris, pH 7,4; 0,9 M NaCl, 0,01% SDS und Formamid aufgenommen, bei 95 °C (5 Min) denaturiert und danach sofort auf Eis gestellt. 20 μl werden auf den Array am Slide getropft, mit einem 1,5 x 1,5 cm Deckplättchen bedeckt und bei 50 °C hybridisiert.In order to block the reactive epoxy groups on the slide, the slides are shaken with a solution of 50 mM ethanolamine, 0.1 M ris, pH 9 and 0.1% SDS for 15 min at 50 ° C, and again twice in H 2 0 washed, and finally blown dry with compressed air. It is beneficial to use at least 10 ml of solution per slide and the slides when changing the washing solution do not dry. For hybridization on the chip, the sample labeled with Cy5 or Cy3 is placed in 20mM Tris, pH 7.4; 0.9 M NaCl, 0.01% SDS and formamide were taken up, denatured at 95 ° C. (5 min) and then immediately placed on ice. 20 μl are dropped onto the array on the slide, covered with a 1.5 x 1.5 cm cover plate and hybridized at 50 ° C.
Abhängigkeit der Reaktivität von der PolymerkonzentrationDependence of the reactivity on the polymer concentration
Leere Glas-Slides wurden mit 2%, 5% und 10% SU-8 Lösungen in To- luol beschichtet, mit 20 pM/μl Alflb-C6-NH2 (5 ' CGTTCGYTCTGAGCCAG, 5' Amino) bespottet und nach dem Blockieren der reaktiven Gruppen mit Ethanolamin mit 2 ng/μl Cy5-Rhizobium Fredii hybridisiert. Es wurden keine Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz und im Signal-Rausch-Verhältnis gefunden.Empty glass slides were coated with 2%, 5% and 10% SU-8 solutions in toluene, spotted with 20 pM / μl Alflb-C6-NH2 (5 'CGTTCGYTCTGAGCCAG, 5' Amino) and after blocking the reactive ones Groups hybridized with ethanolamine with 2 ng / μl Cy5-Rhizobium Fredii. No differences in the hybridization efficiency and in the signal-to-noise ratio were found.
Abhängigkeit der Hybridisierungseffizienz von der Hybridisie- rungszeitDependency of the hybridization efficiency on the hybridization time
Die Hybridisierungszeiten wurden von 1 bis 7 h variiert. In Fig.2 ist die Fluoreszenz (fl) des HybridisierungsSignals als Funktion der Zeit dargestellt. Eine Hybridisierungszeit von 2 h ist für ein eindeutiges Hybridisierungsergebnis ausreichend. Die Fluoreszenzintensitäten nach 2- und 4-stündiger Hybridisierung liegen innerhalb der Standardabweichung.The hybridization times were varied from 1 to 7 hours. 2 shows the fluorescence (fl) of the hybridization signal as a function of time. A hybridization time of 2 hours is sufficient for a clear hybridization result. The fluorescence intensities after 2 and 4 hours of hybridization are within the standard deviation.
Abhängigkeit der Hybridisierungseffizienz vom SpotvolumenDependence of the hybridization efficiency on the spot volume
Die Hybridisierungseffizienz war für 0,35 und 1 nl Spots gleich. Die Fluoreszenzintensitäten änderten sich nicht.The hybridization efficiency was the same for 0.35 and 1 nl spots. The fluorescence intensities did not change.
Beispiel 3Example 3
Immobilisierungskapazitätimmobilization
Um die Immobilisierungskapazität K zu bestimmen, wurden mit Cy5 markierte 17-mer Oligonukleotide auf SU-8 Slides immobilisiert und die Fluoreszenzintensität I nach dem Spotten, Blockieren und Hybridisieren gemessen. Die Immobilisierungskapazität ist als •K-=1 U U lnach Blockierung bzw. Hybridisierung/ Inach Spotten ( )In order to determine the immobilization capacity K, 17-mer oligonucleotides labeled with Cy5 were immobilized on SU-8 slides and the fluorescence intensity I after spotting, blocking and hybridization was measured. The immobilization capacity is as • K- = 1 UU l after blocking or hybridization / inach spotting ()
definiert. In Fig.3 wird die Immobilisierungskapazität auf SU-8- Slides den auf aminosilanisierten (a) , Nitrocellulose- (N) , Aldehyd- (A) , bekannten Epoxy-Slides (E) und SU-8-Slides (SU) gegenübergestellt. Die SU-8-Slides zeigten die höchsten Immobilisierungskapazitäten, wobei hier jedoch zu beachten ist, dass lediglich bei- den bekannten Epoxy-Slides und die SU-8 Slides das gleiche Blockierungsreagens verwendet wurde.Are defined. In Figure 3, the immobilization capacity on SU-8 slides is compared to that on aminosilanized (a), nitrocellulose (N), aldehyde (A), known epoxy slides (E) and SU-8 slides (SU). The SU-8 slides showed the highest immobilization capacities, although it should be noted here that only the known epoxy slides and the SU-8 slides used the same blocking reagent.
Beispiel 4Example 4
Abhängigkeit der Immobilisierungskapazität und der Hybridisie- rungseffizienz vom SpotvolumenDependency of the immobilization capacity and the hybridization efficiency on the spot volume
0,35; 1, und 2 nl Cy5 markierte Oligonukleotide wurden auf SU-8 Slides gespottet. Der durchschnittliche Spotdurchmesser eines 350 pl Spots ist 100 μm. Der Spotdurchmesser nimmt mit dem Spotvolumen zu. Je größer der Spot ist, umso mehr Oligonukleotid kann immobilisiert werden. Die Fluoreszenzintensität ändert sich mit der Spotgröße nicht. Es wird angenommen, dass durch das Überei- nanderspotten von drei Tropfen für einen 1 nl Spot der Spot zwar etwas größer - nur etwas größer, da die SU-8 Oberfläche hydrophob ist - wird, aber nur ein Bruchteil der aufgebrachten Menge zur SU-8 Oberfläche gelangt und immobilisiert werden kann. Diese Annahme wird auch durch Hybridisierungen von 0,35 nl und 1 nl Alflb-Spots bestätigt: Die Hybridisierungseffizienz ist in beiden Fällen gleich. Abgesehen davon ist die Fluoreszenzintensität dem Lambert-Beer-Gesetz zur Folge von der Konzentration, nicht aber von der Menge abhängig.0.35; 1 and 2 nl of Cy5 labeled oligonucleotides were spotted on SU-8 slides. The average spot diameter of a 350 pl spot is 100 μm. The spot diameter increases with the spot volume. The larger the spot, the more oligonucleotide can be immobilized. The fluorescence intensity does not change with the spot size. It is assumed that by spotting three drops on top of each other for a 1 nl spot, the spot becomes a little larger - only a little larger because the SU-8 surface is hydrophobic - but only a fraction of the amount applied to the SU-8 Surface arrives and can be immobilized. This assumption is also confirmed by hybridizations of 0.35 nl and 1 nl Alflb spots: the hybridization efficiency is the same in both cases. Apart from this, the fluorescence intensity is dependent on the concentration, but not on the amount, according to the Lambert-Beer law.
Beispiel 5Example 5
Signal-Rausch-VerhältnisSignal-to-noise ratio
Der Fluoreszenzhintergrund (Background) auf SU-8 Slides beträgt durchschnittlich 5-10%. In Fig.4 ist ein Vergleich des Signal- Rausch-Verhältnisses (HG, Hintergrund) in % gezeigt, wobei ami- nosilanisierte (a) , Nitrocellulose- (N) , Aldehyd- (A) , bekannte Epoxy-Slides (E) und SU-8-Slides miteinander verglichen wurden. Die SU-8 Slides zeigten ein sehr gutes Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu den bekannten Slides .The fluorescence background on SU-8 slides averages 5-10%. FIG. 4 shows a comparison of the signal-to-noise ratio (HG, background) in%, amino-silanized (a), nitrocellulose (N), aldehyde (A) being known Epoxy slides (E) and SU-8 slides were compared. The SU-8 slides showed a very good signal-to-noise ratio compared to the known slides.
Durch diese Beispiele ist gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen besonders effizient im Vergleich mit bekannten Trägern sind und besonders gute Ergebnisse im Hinblick auf die Bindungskapazität, Eigenfluoreszenz und Hintergrundrauschen ergeben.These examples show that the supports according to the invention for immobilizing biomolecules are particularly efficient in comparison with known supports and give particularly good results with regard to the binding capacity, inherent fluorescence and background noise.
Beispiel 6Example 6
Fluoreszenz-Hintergrund nach HybridisierungFluorescence background after hybridization
Der Fluoreszenz-Hintergrund wurde als Prozent des Hybridisie- rungssignals berechnet, wobei der mittlere Fluoreszenz-Hintergrund gemessen an 15 hybridisierten Proben auf SU8 9,3%, auf 3D- Link™ 29,9% und auf EasySpot (hydrophiles Epoxypolymer) 30,1% betrug.The fluorescence background was calculated as a percentage of the hybridization signal, the mean fluorescence background measured on 15 hybridized samples on SU8 9.3%, on 3D-Link ™ 29.9% and on EasySpot (hydrophilic epoxy polymer) 30.1 % scam.
Die Hybridisierung wurde nach Blockieren der Träger mit 0, 20 und 50 mM Ethanolamin gemessen, wobei aus Fig. 5 ersichtlich ist, dass eine Hybridisierung ohne Ethanolamin-Blockierung einen ähnlichen Fluoreszenz-Hintergrund ergab, verglichen mit Hybridisierung mit Ethanolamin-Blockieren. Daraus ergibt sich, dass das Verfahren mit SU8 auch ohne Blockierschritt durchgeführt werden kann, was das Verfahren erheblich erleichtert und verkürzt, im Vergleich zu herkömmlichen Trägern, bei denen der Blockierungsschritt unerlässlich ist.Hybridization was measured after blocking the supports with 0, 20 and 50 mM ethanolamine, and it can be seen from FIG. 5 that hybridization without ethanolamine blocking gave a similar fluorescence background compared to hybridization with ethanolamine blocking. The result of this is that the method with SU8 can also be carried out without a blocking step, which considerably simplifies and shortens the method compared to conventional carriers in which the blocking step is essential.
Beispiel 7Example 7
Spotter-KompatibilitätSpotter compatibility
SU8 wurde in einem diagnostischen Assay im Hinblick auf Spotter- Kompatibilität getestet. 0,35 nl Proben wurden auf einen Träger gespottet, wobei der piezoelektrische BioChip-Arrayer von Packard BioScience verwendet wurde, und 0,6 nl Proben wurden auf einen Träger mit Hilfe des OmniGrid von GeneMachines gespottet. In Fig. 6 sind die Hybridisierungssignale der gespotteten Proben gezeigt, wobei eine hervorragende Korrelation erhalten wird.SU8 was tested in a diagnostic assay for Spotter compatibility. 0.35 nl samples were spotted on a support using the Packard BioScience piezoelectric BioChip Arrayer, and 0.6 nl samples were spotted on a support using the OmniGrid from GeneMachines. 6 are the hybridization signals of the spotted samples shown, with an excellent correlation is obtained.
Beispiel 8Example 8
Spot-DichteSpot density
Es wurde der mittlere Spotdurchmeser von biomolekularen Sonden auf verschiedenen, reaktiven Chipoberflächen gemessen. Die Spots wurden einerseits mit OmniGrid und andererseits mit Packard BioScience aufgetragen, wobei aus Fig. 7 ersichtlich ist, dass die Spots auf SU-8 einen geringeren Durchmesser aufweisen als die Spots auf herkömmlichen Chipoberflächen (wobei FAST, = Nitrozellulose, Silane-Prep und Sigma-Screen = Amino-silanisiert, 3DLink = bekanntes Epoxypolymer und Cel = Aldehyd) . Aufgrund des vergleichsweise geringen Spotdurchmessers auf SU-8, eignet sich dieses Polymer besonders gut für Hochdurchsatzanwendungen, da mehr Spots pro Flächeneinheit in geringeren Abständen auf die Oberfläche aufgebracht werden können.The average spot diameter of biomolecular probes was measured on different, reactive chip surfaces. The spots were applied on the one hand with OmniGrid and on the other hand with Packard BioScience, whereby it can be seen from FIG. 7 that the spots on SU-8 have a smaller diameter than the spots on conventional chip surfaces (where FAST = nitrocellulose, silane prep and Sigma -Screen = amino-silanized, 3DLink = known epoxy polymer and Cel = aldehyde). Due to the comparatively small spot diameter on SU-8, this polymer is particularly suitable for high-throughput applications, since more spots per unit area can be applied to the surface at shorter intervals.
Beispiel 9Example 9
Optimale ProbenkonzentrationOptimal sample concentration
Die Konzentration eines auf einem SU8-Träger gespotteten Amino- modifizierten Oligonukleotids (18 bis 50mer) wurde zwischen 0,02μM und lOOμM variiert, und die Hybridisierungssignale wurden gemessen. Es konnte kein Unterschied in der Hybridisierungsfluo- reszenz bei den höheren Konzentrationen (über 20μM) detektiert werden. Die geringste Probenkonzentration, die zu einem signifikanten Hybridisierungssignal führt, betrug 2uM. Fig. 8a zeigt die Hybridierungsfluoreszenz von 20, 2, 0,2 und 0,02 μM-gespotteten Oligonukleotiden.The concentration of an amino-modified oligonucleotide (18 to 50mer) spotted on a SU8 support was varied between 0.02 μm and 100 μm, and the hybridization signals were measured. No difference in hybridization fluorescence could be detected at the higher concentrations (above 20μM). The lowest sample concentration that resulted in a significant hybridization signal was 2uM. 8a shows the hybridization fluorescence of 20, 2, 0.2 and 0.02 μM-spotted oligonucleotides.
Weiters wurden Einzelstrang-DNA (1500 Basenpaaren) auf einen SU8- Träger gespottet, wobei bereits bei 50ng/μl Einzelstrang-DNA ein detektierbares Signal zu sehen ist. In Fig. 8b ist das Ergebnis des Fluoreszenz-Scans zu sehen, wobei 10, 50, 100, 150 und 200ng/μl Einzelstrang-DNA mit 2ng/μl Fluoreszenzmarkierung auf den Träger gespottet wurden. Furthermore, single-stranded DNA (1500 base pairs) was spotted on an SU8 support, a detectable signal being seen even at 50ng / μl single-stranded DNA. 8b shows the result of the fluorescence scan, 10, 50, 100, 150 and 200ng / μl single-strand DNA with 2ng / μl fluorescent labeling being spotted on the support.

Claims

Patentansprüche : Claims:
1. Fester Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen, der zumindest bereichsweise mit einem Polymer beschichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Phenolharz mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, ist.1. Solid support for immobilizing biomolecules, which is coated at least in regions with a polymer, characterized in that the polymer is a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8.
2. Fester Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Novolak ist.2. Solid support according to claim 1, characterized in that the polymer is a novolak.
3. Fester Träger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer aus Bisphenol A-Gruppen aufgebaut ist.3. Solid support according to claim 2, characterized in that the polymer is composed of bisphenol A groups.
4. Fester Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Mikrotiterplatte ist.4. Solid support according to one of claims 1 to 3, characterized in that the support is a microtiter plate.
5. Fester Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Mikroarray ist.5. Solid support according to one of claims 1 to 3, characterized in that the support is a microarray.
6. Fester Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer in Spots auf dem Träger beschichtet ist.6. Solid support according to one of claims 1 to 5, characterized in that the polymer is coated in spots on the support.
7. Fester Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch, gekennzeichnet, dass Biomoleküle am Polymer immobilisiert sind.7. Solid support according to one of claims 1 to 6, characterized in that biomolecules are immobilized on the polymer.
8. Fester Träger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle in Spots am Polymer immobilisiert sind.8. Solid support according to claim 7, characterized in that the biomolecules are immobilized in spots on the polymer.
9. Fester Träger nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden, Proteinen, Peptiden, Antigenen und Antikörpern.9. Solid support according to claim 7 or 8, characterized in that the biomolecules are selected from the group consisting of oligonucleotides, proteins, peptides, antigens and antibodies.
10. Verwendung eines Phenolharzes mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, als Beschichtung auf einem festen Träger zur Immobilisierung von Biomolekülen. 10. Use of a phenolic resin with a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, as a coating on a solid support for immobilizing biomolecules.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Novolak ist.11. Use according to claim 10, characterized in that the polymer is a novolak.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer aus Bisphenol A-Gruppen aufgebaut ist.12. Use according to claim 11, characterized in that the polymer is composed of bisphenol A groups.
13. Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Schicht Phenolharz mit einer Funktionalität von 6 bis 15, vorzugsweise 7 bis 10, besonders bevorzugt 8, auf den Träger aufgebracht wird. 13. A method for producing a carrier according to one of claims 1 to 9, characterized in that a layer of phenolic resin having a functionality of 6 to 15, preferably 7 to 10, particularly preferably 8, is applied to the carrier.
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