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EP1238108A2 - Verfahren zur detektion und evaluierung einer potentiell aberrant methylierten dns-region am x-chromosom oder der klonalität - Google Patents

Verfahren zur detektion und evaluierung einer potentiell aberrant methylierten dns-region am x-chromosom oder der klonalität

Info

Publication number
EP1238108A2
EP1238108A2 EP00984601A EP00984601A EP1238108A2 EP 1238108 A2 EP1238108 A2 EP 1238108A2 EP 00984601 A EP00984601 A EP 00984601A EP 00984601 A EP00984601 A EP 00984601A EP 1238108 A2 EP1238108 A2 EP 1238108A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna region
methylated
methylation
region
potentially
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00984601A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar A. Haas
Andreas Wienhäusel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungsinstitut fur Krebskranke Kinder
Original Assignee
Forschungsinstitut fur Krebskranke Kinder
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungsinstitut fur Krebskranke Kinder filed Critical Forschungsinstitut fur Krebskranke Kinder
Publication of EP1238108A2 publication Critical patent/EP1238108A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • a method for the detection and evaluation of a potentially aberrantly methylated DNA region on the X chromosome or the clonality is made available, the use of such a method and a kit for carrying out the method.
  • the DNA, carrier of the genetic information is densely packed in structural units, the chromosomes, in the cell nucleus of the eukaryotes. Changes in the number or structure of the chromosomes as well as changes in the DNA itself, without these microscopic changes in the chromosomes causing, usually result in serious clinical pictures in humans. Diseases can also be caused by epigenetic changes such as aberrant DNA methylation.
  • the methylation of the DNA takes place through covalent binding of methyl groups to the nucleotides and represents an important regulatory mechanism: In the case of the mammalian genome, active genes or their regulatory units are often under-methylated, while inactive DNA sections are often characterized by strong methylation.
  • methyl cytosine is preferably found in methylated DNA as mCpG in the CpG islands of DNA. Most of these are found in regulatory DNA units and are not methylated.
  • imprinted genes - depending on the parental origin of the respective gene or chromosome, usually unmethylated active DNA - and methylated inactive DNA sections. Thus "imprinted genes” are expressed by only one of the two homologous chromosomes.
  • methylation of DNA e.g. by cutting with methylation-sensitive enzymes, by mC-specific antibodies, by genomic sequencing of bisulfite-deactivated DNA, selective hydrazine cleavage of non-methylated DNA, etc.
  • a DNA section shows defective (aberrant) methylation (i.e. hypermethylation of physiologically unmethylated DNA or hypomethylation of pyhsiologically methylated DNA), this usually leads to a deregulation of the physiological function of this DNA section and can result in a disease.
  • determining the phenotype is not enough to diagnose the particular disease.
  • an examination of the patient's genetic material is usually necessary, in particular the methylation of a specific DNA segment.
  • a number of diseases are caused by a change in the DNA on an X chromosome.
  • a DNA region on the X chromosome can be methylated so that this gene is is activated.
  • a change (mutation) of the DNA for example by expansion of a repeat region, can disrupt gene function and can also be methylated (FraX-A, FraX-E, FraX-F (see Carrel et al., American Journal of Medical Genetics 64: 27-30 (1996); Hirst et al., Hum. Molec. Genet. 2: 197-200, 1993; Parrish et al., Nature Genet.
  • diseases can be caused by changes in DNA sections or entire chromosomes (- areas) due to duplication, insertion, translocation. If such a change affects the X chromosome already in the early developmental stages of an individual, one has to speak in many cases of X chromosomal diseases. Even with sporadic diseases, as is the case for many If tumor diseases are true, X-chromosomal changes could be detected (Gale et al., Blood, Vol. 83 , No.
  • ISSN 0003-4800; Leal et al., Hum. Genet., 1994; 94 (4): 423-6; ISSN: 0340-6717; MacDonald et al., Hum. Mol Genet., 1994; 3 (8): 1365-71; ISSN: 0964-6906; and Martinez-Pasarell et al., Horm. Res., October 1999; 51 (5): 248-252; ISSN: 0301- 0163).
  • the affected gene or the affected locus is examined using cytogenetic, Southern blot, PCR, reverse transcription PCR (RT-PCR) or immunological analyzes. In these studies, the sequence, expression, extent of methylation, and the like are examined.
  • Fragile X syndrome (FX or FraX-A syndrome) is an example of an inherited disorder, particularly in men.
  • the clinical phenotype of FX syndrome shows a low to iQ
  • I'MR-1 alleles with a large number of repeat units can be reactivated in vitro by treatment with demethylating agents, such as 5-azadeoxycitidine.
  • demethylating agents such as 5-azadeoxycitidine.
  • FX syndrome Common methods for evaluating FX syndrome include cytogenetic, Southern blot, PCR, reverse transcription PCR (RT-PCR) and immunohistochemical analyzes. These studies usually analyze the size of the expanded repeat region, the Denovo methylation of these gene regions or the gene expression.
  • WO 92/14840 describes the detection of fragile X syndrome by means of restriction enzymes, these restriction enzymes, for example, only cutting the sites which have non-methylated cytosines. In contrast to unmethylated DNA, the methylated DNA is thus digested, the digestive products being detectable.
  • WO 91/09140 relates to an oligonucleotide with a specific sequence which binds to a specific location, M54, the region of the fragile gene. Patients with fragile X syndrome can be detected by in situ hybridization with the labeled oligonucleotide.
  • WO 92/20825 also relates to a method for diagnosing fragile X syndrome, the amount of mRNA being determined, for example, by RT-PCR or the amount of protein, for example, by means of immunological methods of the FMR-1 gene.
  • Another method of detecting fragile X syndrome is to determine the length of the repeat area. This is done, for example, by digestion of the FMR-1 gene with restriction enzymes or PCR methods with primers that are specific for the repeat region of the FMR-1 gene and subsequent gel electrophoresis.
  • the method according to US Pat. No. 5,658,764 for the detection of the fragile X syndrome also includes a size measurement of the GC-rich sequence with the aid of PCR methods.
  • a disadvantage of PCR is that it is not possible to differentiate between a full mutation and a premutation, especially if there is a borderline case full mutation / premutation, i.e. that the length of the repeat region is around 200 units and the sequence is partially methylated or not methylated. Furthermore, the distinction between a full mutation and a mosaic (e.g. a full mutation on one allele and a premutation or an expansion in the normal range on the other allele) is problematic or impossible. Furthermore, these known methods are very time-consuming, since several process steps are necessary. These methods also show a high "false negative" rate in women.
  • the Das et al. "Methylation analysis of the fragile X syndrome by PCR” (Genetic testing, Volume 1, Number 3, 1997/98) relates to a method for the detection of the fragile X syndrome by means of methylation-specific PCR (MS-PCR).
  • MS-PCR methylation-specific PCR
  • the unmethylated cytosine residues are converted into uracil by adding an agent, while the methylated cytosine residues are not being transformed.
  • the uracil in the modified DNA is replaced by thymidine.
  • primers are selected which result in different product lengths, it can be determined, depending on the PCR product, whether or not the particular site of the FMR-1 gene is methylated.
  • the normal and premium alleles are distinguished from the full mutation and mosaic sequences — amplification of the methylated sequence — by this MS-PCR.
  • Normal and award-winning sequences must then be differentiated using a conventional PCR (page 152, column 2, 2nd paragraph). In conventional PCR, only normal sequences (5-50 repeat units) but not pre-selected sequences (50-200 repeat units) are amplified (see FIG. 2B).
  • a GCC repeat expansion that is present next to a CpG island in the Xq28 includes over 200 GCC units, compared to 6-25 GCC units in normal people.
  • the CpG island is methylated in FraX-E positive individuals. These patients have mental retardations (see Knight et al., Am. J. Hum. Gent. 53: A79, 1993; Knight et al., Cell 74: 127-134, 1993).
  • a gene, FMR2 has been identified that is transcribed distal to the CpG island in FraX-E and is down-regulated by repeat expansion & methylation (Gu et al., Nature Gent. 13: 109-113).
  • the disadvantages of the known determination techniques are that several different procedural steps are often necessary to diagnose the diseases and the disease variant. In many cases, it is not possible to make a clear statement about the clinical picture, since the determination used only allows statements about a specific gene area.
  • the goal of the present! The invention is accordingly to provide a method for diagnosing a potentially aberrantly methylated DNA region on the X chromosome or the clonality, which can be carried out quickly and easily with as few procedural steps as possible, a distinction being made between the different variants, and that Procedures can be used in both male and female patients to differentiate between the different genotypes.
  • the extent of the methylation of the potentially aberrantly methylated DNA region and / or the extent of the methylation and, if appropriate, the sequence variant of a polymorphic DNA region of the X chromosome, which can be either physiologically or aberrantly methylated, is determined in a sample and subsequently the presence and, if appropriate, the variant and the extent of the potential aberration or the clonality is diagnosed from the comparison of the methylation determinations and, if appropriate, the sequence variant, or
  • Chromosome which can be either physiologically or aberrantly methylated, is determined and then the presence and optionally the variant and the extent of the potential aberration is diagnosed from the comparison of the methylation determinations and the sequence variant.
  • the extent of methylation in the context of the present invention is understood to mean the ratio of methylated and unmethylated allele in a chromosome, ie that the methylated and unmethylated DNA are determined simultaneously in one reaction. Through the simultaneous determination, an accurate and quantitative statement can be made regarding the ratio of methylation and non-methylation of a specific sequence. This makes it possible to diagnose the extent and variant of the particular disease.
  • a potentially aberrantly methylated DNA region is understood to mean a DNA region which is methylated or unmethylated. If this DNA region is affected by methylation, aberrant methylation can cause a disease.
  • a quantitative methylation analysis which is meaningful when determining the clonality (clone size), is suitable for the clarification of all X-chromosomal diseases and also those diseases which are based on a deviation from the normal number of X-chromosomes (Klinefelter, Turner, Multiple X syndrome), or also those diseases whose affected cell population (clone) has X aneuploidy. This is very common in various tumor diseases and haematological neoplasms. The detection and determination of the clone size / clonality of these neoplastic diseases is an important parameter for diagnosis and monitoring. In the case of autosomal diseases that affect imprinted genes, the situation is similar.
  • the extent of methylation in a safely physiologically methylated DNA region of the X chromosome can also be determined.
  • the certainly physiologically methylated DNA region affects only one allele of the X chromosome, while the other allele is not methylated.
  • this additional control serves as an internal standard.
  • a clinical picture is determined by evaluating the potentially aberrantly methylated DNA region and the polymorphic DNA region.
  • a polymorphic DNA region is understood to mean the variability of a DNA sequence, for example a DNA segment which has different alleles in a population, such as the length of a specific DNA segment in the case of microsatellite repeats or Nucleotide and amino acid polymorphisms.
  • the simultaneous determination of the extent of the methylation of the sequence variant together with the determination of the extent of the methylation of the potentially aberrantly methylated DNA region allows a very good statement regarding the variant or the clone size of the corresponding disease.
  • the extent of methylation can be determined by various methods, e.g. Methylation-specific restriction enzymes, oligonucleotides which specifically recognize and hybridize DNA segments which have been modified specifically for methylation, etc.
  • the sequence variant of the polymorphic DNA region can also be determined in various ways, for example by means of PCR or with the aid of restriction enzymes.
  • the extent of the methylation and, if appropriate, the sequence variant are determined by means of a methylation-specific PCR (MS-PCR), using primers with which a methylated or not methylated DNA region are amplified specifically for each methylation.
  • MS-PCR methylation-specific PCR
  • the technique of MS-PCR is a simple method to distinguish between methylated sequences and non-methylated sequences and, because methylation or non-methylation is often an indication of a genetic disease or causes it, for diagnosis used by patients.
  • the MS-PCR is based on the principle that primers are used that are specific for a methylated or non-methylated sequence, so that one or the other primer hybridizes with the sequence, depending on whether it is methylated or not methylated .
  • the PCR products then suggest methylation or non-methylation.
  • the primers can be selected such that the PCR product for the methylated sequence has a certain length and the PCR product for the unmethylated sequence has a different length. Because of their size, the PCR products conclusion about the methylation of the amplified DNA sections.
  • a common method for obtaining MS primers is to specifically change the methylated and / or the non-methylated sequence and to construct corresponding primers which are specific for the changed sequences.
  • One way to specifically change the DNA methylation is to treat the DNA with a deaminating agent, e.g. Sodium bisulfite. Sodium bisulfite converts the unmethylated cytosine to uracil, which is replaced by thymidine in the subsequent DNA amplification.
  • This method thus produces different DNA sequences based on originally homologous but differently methylated alleles.
  • the primers that hybridize with the unmethylated sequence have thymidine instead of cytosine.
  • the primers which are specific for the methylated sequence continue to have cytosine at the sites of the methylated Cs.
  • the primers are chosen such that the PCR product of the methylated sequence always has a different length than the PCR product of the non-repeat region, regardless of the length of the repeat region. methylated sequence.
  • the determination by means of MS-PCR therefore ensures a particularly time-saving and efficient method, since little DNA is used and less work is required.
  • the result of the PCRs is obtained at the same time. No further process steps are necessary, such as Southern blot, hybridization processes, etc.
  • the MS-PCR primer is or are carried out on an antisense strand or on antisense strands.
  • These temperature conditions are gentle on the reaction components and the DNA polymerase.
  • the MS-PCRs are preferably carried out in duplex reactions. This means that the PCRs for the amplification of a specific methylated sequence as well as the same specific non-methylated sequence are carried out in one reaction, for example the PCRs for the amplification of the polymorphic methylated and non-methylated DNA region. This ensures that the reaction products that are obtained can be clearly assigned in the subsequent analysis based on their size, and so the result can be clearly interpreted.
  • the MS-PCR for the determination of the potentially aberrantly methylated DNA region and the MS-PCR for the determination of the safely physiologically methylated DNA region are advantageously carried out in a common multiplex reaction. Since the MS-PCRs generally relate to two different genes and thus two different sequences, the MS-PCRs are not influenced by one another. The determination of the polymorphic DNA region would be carried out in a separate duplex reaction in order to be able to clearly determine the polymorphism, e.g. So that the size of variable PCR products does not overlap with other PCR products in the subsequent evaluation.
  • a method is particularly preferably provided in which the polymorphic DNA region is a DNA region with a repeat polymorphism, which is preferably related to the potentially aberrantly methylated DNA region, the length of the repeat region being determined as a sequence variant and then determining both the presence and the extent of the potential aberration.
  • repeat polymorphism is understood to mean an area which has a repeated repetition of a repeat unit, ie a certain sequence of several nucleotides.
  • the number of repetitions, the so-called “repeat units”, differs depending on the gene or disease, the extent of the disease generally being related to the length of the repeat region.
  • a repeat region that has a particularly unnatural length is usually methylated at the same time, if this DNA region is normally not methylated. In most cases this is also the case For example, the adjacent or potentially aberrantly methylated region is correspondingly strongly methylated, so that the determination of the potentially aberrantly methylated DNA region and the determination of the polymorphic DNA region yield additional results and can therefore be seen as additional controls.
  • the polymorphic DNA region of the CGG trinucleotide repeat region of the FMR-1 gene is particularly preferred.
  • the determination in this area gives a repeatable and unambiguous result. If the determination is carried out, for example, with the aid of MS-PCR, both the length of the repeat region and the extent of the methylation can be determined in a single method step if the primers are selected such that they include the entire repeat region .
  • the CGG trinucleotide repeat region of the FMR-1 gene is a sequence region which provides information about diseases, in particular about the fragile X syndrome, since the length of the repeat region is characteristic for the variant of the disease.
  • polymorphic DNA region is in the first untranslated exon of the FMR-1 gene. This is a region which is advantageous for the determination and leads to an error-free result.
  • the potentially aberrantly methylated DNA region is the FMR-1 gene or a part thereof. This ensures a simplified procedure since only the FMR-1 gene region is necessary for at least part of the analysis. This could be used for the analysis isolated from the rest of the DNA, and the analysis could also be carried out on isolated X chromosomes.
  • the potentially aberrantly methylated DNA region is the 5 'untranslated region of the FMR-1 gene, ie the FMR-1 promoter, or a part thereof.
  • the potentially aberrantly methylated DNA region is close to the CGG repeat region, since this is in the first untranslated exon. In this way, the entire gene, which could possibly disintegrate in the course of the deamination, does not have to be used for the analysis. If the potentially aberrantly methylated DNA region is in the FMR-1 promoter, a shorter DNA section can be used for the determination.
  • the safely physiologically methylated DNA region is a DNA region that is securely methylated on the active X chromosome. Its methylation pattern is therefore opposite to that of the FMR-1 gene, which is methylated on the inactive X chromosome.
  • the ratio of the methylated to the non-methylated DNA region of the one gene is compared with the ratio of the reciprocal methylated DNA region (methylated: non-methylated) and also with the ratio of the methylated repeat Polymorphism compared to unmethylated repeat polymorphism (preferably of the FMR-1 gene).
  • the safely physiologically methylated DNA region is a region that comprises the XIST gene or parts thereof.
  • the XIST gene is methylated on the active chromosome X, so that it has a reciprocal methylation pattern to the FMR-1 gene.
  • the determination using the XIST gene as an internal standard provides a reliable, unambiguous and simple method for the detection and evaluation of a potentially aberrantly methylated DNA region on the X chromosome, especially in women.
  • the DNA region which is certainly physiologically methylated is a region in the XIST gene promoter. It has been found that the methylation of the promoter of the XIST gene is easy to determine and leads to reliable results.
  • the potentially aberrantly methylated DNA region and the polymorphic DNA region are two non-overlapping sequences. This ensures that even if both DNA regions are on the FMR-1 gene, two separate, independent DNA regions are examined, so that the results of the examination - 17 - the two areas complement each other, so that possible confusion errors can be recognized early.
  • two or more potentially aberrantly methylated DNA regions on the X chromosome are detected and evaluated at the same time.
  • the clinical pictures with regard to FraX-A, FraX-E and FraX-F can be determined at the same time, whereby an exact and reliable result is obtained for each individual clinical picture without the results of the different clinical pictures influencing one another.
  • Another aspect of the present invention is the use of a method according to the invention described above for the detection and evaluation of X-chromosomal diseases.
  • These diseases have already been described above, which are diseases which are caused by aberrant methylation in at least one place in the X chromosome.
  • a specific, potentially aberrantly methylated DNA region and possibly a physiologically methylated DNA region of the X chromosome and / or a specific polymorphic DNA region of the X chromosome is analyzed.
  • the FMR-1 promoter is determined as a potentially aberrantly methylated DNA region and / or the XIST gene or a part thereof is determined as a safely physiologically methylated DNA region and / or the CGG trinucleotide region of the FMR-1 gene is determined as the polymorphic DNA region.
  • the CpG island in Sq28 is advantageously a potentially aberrantly methylated DNA region and / or the GCC trinucleotide region is a polymorphic DNA region and / or the XIST gene or a part thereof is safely physiologically methylated DNS range determined.
  • the (GCCGTC) n (GCC) m region is advantageously used as the polymorphic DNA region and / or the adjacent CpG island as the potentially aberrantly methylated DNA region and / or the XIST gene or part of it is determined to be a safely physiologically methylated DNA region.
  • the CGG nucleotide repeat region of the FMRI gene is preferably determined as the polymorphic DNA region.
  • the analysis according to the invention enables a clear and rapid distinction to be made between the different genotypes of fragile X syndrome, even in female patients in which the methylation analysis does not provide a clear result, since - in the case of the repeat region - this is competed in the PCR, in particular with a length of more than 200 units, by a repeat of normal length.
  • the sample can be clearly assigned to a specific genotype, since in normal and premutation this DNA region is not methylated, but is methylated in the case of the full mutation.
  • the potentially aberrantly methylated DNA region in addition to the determination of the potentially aberrantly methylated DNA region, also a certainly physiologically methylated one DNS range is analyzed, it can be used as an internal standard. If the potentially aberrantly methylated DNA region cannot be detected due to deletions, the securely methylated DNA region (eg the XIST gene) is detected in any case. This ensures that the method has worked and that the potentially aberrantly methylated DNA region is at least partially missing, ie deleted (eg FMR-1 gene).
  • the number of normal or premutation repeat units can simply be calculated from the length of the MS-PCR products. In this way, a method is made available in which the degree of methylation and the length of the repeat regions are determined simultaneously.
  • the degree of fragile X syndrome is thus determined in a single procedural step (either a single MS-PCR reaction or several MS-PCR reactions side by side).
  • MS-PCR is a fast and reliable procedure that is inexpensive and can be carried out in any laboratory. Furthermore, only a small amount of DNA is necessary for this analysis. Furthermore, no additional, often time-consuming and costly procedures need to be carried out, such as immunological or Southern blot procedures.
  • non-methylated repeat region as a polymorphic DNA region
  • FMR-1 DNA region eg the promoter (as a potentially aberrant methylated DNA region).
  • Mosaic full mutation / premutation the repeat region of the allele with the full mutation is not amplified, the unmethylated repeat region of the premutation allele is amplified, having (48-) 54 to 200 units.
  • the methylated FMR-1 promoter region is amplified.
  • the ratio of the non-methylated to the methylated FMR-1 DNA region and from the non-methylated to the methylated XIST gene is 1: 1. Since both homologs have identical repeat region lengths, only one non-methylated and one methylated FMR-1 repeat region are visible.
  • Women with a premutation have a similar pattern to heterozygous women, with the difference that a methylated and a non-methylated FMR-1 repeat region of an allele are (48-) 54 to 200 units in length.
  • methylation ratio of the FMR-1 DNA region promoter region is 3: 1 (methylation: non-methylation), while the methylation ratio of the XIST gene continues to be 1: 1.
  • Women with a full nutation and either skewed X inactivation or mosaic have the same pattern as affected women with random X inactivation. Skewed X inactivation and mosaics can be identified by quantitative assessment of the methylation ratio of the FMR-1 promoter region with that of the XIST gene and the FMR-1 repeat region.
  • the methylation ratio of the XIST gene remains 1: 1 in all cases, since each cell still contains an active and an inactive chromosome.
  • the methylation ratio of the portion of the further gene (XIST) is a standard.
  • the methylation ratio of the FMR-1 promoter region and that of the repeat region shifts towards non-methylation or methylation, depending on whether the normal chromosome or which has a skewed X inactivation with the expanded allele.
  • a similar pattern can be seen in mosaic women with a normal cell population and one with a full mutation.
  • the present invention relates to a kit of the type mentioned at the outset, wherein it contains primer sets for the specific amplification of the methylated and unmethylated DNA variant in each case of a potentially aberrantly methylated DNA region and / or a safely physiologically methylated DNA region.
  • Region of the X chromosome and / or a polymorphic DNA region of the X chromosome which can be either physiologically or aberrantly methylated.
  • This kit preferably comprises, in addition to the primer sets, further substances necessary for carrying out an MS-PCR: a substance for converting the methylated or non-methylated sequence (for example sodium bisulfite for converting the non-methylated cytosine residues), the necessary enzymes, Buffers, etc.
  • a substance for converting the methylated or non-methylated sequence for example sodium bisulfite for converting the non-methylated cytosine residues
  • the necessary enzymes for example sodium bisulfite for converting the non-methylated cytosine residues
  • Buffers etc.
  • This Ki can be particularly advantageous; for the detection and evaluation of X-chromosomal diseases using primer sets for the methylation-specific amplification of a DNA re- gion with a repeat polymorphism for the determination of the polymorphic DNA region. The extent of methylation and the length of the repeat polymorphism are determined with these primer sets in order to test the degree of the disease and the clonality thereof.
  • chromosomal diseases are, for example: FraX-A, FraX-E, FraX-F, X-chromosomal retardation, clonality, etc.
  • the kit preferably comprises primer sets for amplifying a polymorphic DNA region of the CGG nucleotide repeat region in the first exon of the FMR-1 gene. Since the repeat range of the FMR-1 gene, as already described above, ensures a reliable and clear statement about the degree of disease of the fragile X syndrome or the clone size, a quick and safe analysis procedure can be provided with the help of this kit.
  • the kit comprises primer sets for the amplification of the XIST gene or parts thereof for the determination of the safely physiologically methylated DNA region.
  • the XIST gene has a methylation pattern that is reciprocal to that of the FMR-1 gene. The methylation pattern in the result allows an exact interpretation regarding the variant of the fragile X syndrome.
  • the kit comprises primer sets for amplifying the FMR-1 gene or a part thereof for determining the potentially aberrantly methylated DNA region.
  • the kit advantageously comprises primer sets for amplifying the FMR-1 gene promoter or a part thereof. The preferred analysis method described above can thus be carried out.
  • primer sets are each provided as duplex sets, spatially separated from one another. This ensures, as described above, that clear and easily interpretable results are obtained.
  • the primer sets for the amplification of the safely physiologically methylated DNA region and the potentially aberrantly methylated DNA region are provided together in a multiplex set or 4-plex set.
  • the methylation-specific PCR reactions become two DNA regions are carried out simultaneously in a reaction mixture, which makes the process time-saving. This is possible because the two genes (FMR-1 and XIST) have different sequences, so that the two PCR reactions do not influence each other.
  • EDTA anticoagulated, peripheral blood samples from healthy and fragile X syndrome patients were stored in 500 ⁇ l aliquots at -20 ° C until DNA extraction.
  • DNA was extracted from 80 ⁇ l blood with DNAzol TM (Vienna Lab, Vienna, Austria) and resuspended in 30 ⁇ l sterile water.
  • 0.5 ⁇ g DNA was according to the protocols of Zeschnigk et al. "A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.” Eur. J. Hum. Genet. 5, 94-8 (1997); "Imprinted segments in the human geno e: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi / Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.” Hum. Mol. Genet. 6, 387-95 (1997), the deamination at 55 ° C. for two hours Add 8 ⁇ l of polyacrylic carrier, which shortens the DNA precipitation to 10 min at -20 ° C. The deaminated DNA was dissolved in 20 ul sterile water.
  • a multiplex PCR reaction mixture two forward primers (PUF, PMF), which are specific for unmethylated and methylated DNA, and a common reverse primer (PR), which are specific for the deaminated, unmethylated and methylated FMR- 1 promoter, and two forward primers (XUF, XMF) and two backward primers (XUR, XMR), which are specific for the deaminated, unmethylated and methylated XIST promoter, were added.
  • the duplex PCR mix comprises two forward primers (RUF, RMF) and two reverse primers (RUR, RMR), which are specific for the deaminated, unmethylated and methylated triplet repeat region.
  • An additional primer pair detects a further methylated sequence in the FMR-1 promoter (FMF, FMR), but cannot be combined with the other primers.
  • the PCR was carried out in a reaction volume of 25 ⁇ l under oil, 1 ⁇ l of the 20 ⁇ l deaminated DNA from patients and normal controls being used in each case.
  • the amplification buffer F-511 (10 mM Tris, pH 8, 8, 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton-X-100; Finnzymes Oy, Espoo, Finland) ( DYN) used; Optimized buffer EXT (50 mM Tris, 15 mM NH4CI, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton-X-100, pH 9.0) was used for the duplex reaction with 4% DMSO and 60 mM TMAC and used for FMP amplification without amplifier (DMSO, TMAC).
  • the dNTPs concentrations were 200 ⁇ M of each nucleotide. Table 1 lists the optimal primer concentrations.
  • the amplifications were carried out on a Biometra TrioBlock (Biometra, Goettingen, Germany) and started with a Dynazyme 501L unit (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), with a first denaturation step at 95 ° C. for 5 min.
  • the multiplex PCR profiles were 33 cycles 95 ° C / 30 s [program 1], 60 ° C / 20 s, 72 ° C / 40 s [program 2].
  • Duplex and FMP profiles were 35 cycles at 95 ° C / 45 s, 63 ° C / 1 min and 72 ° C / 1 min.
  • PCR products (5 ul) were separated in 0.5x TBE buffer (90mM Tris, 90mM borate, 2mM EDTA, pH 8.0) on NOVEX-TBE gels (Novex, San Diego, California, USA ). The bands were detected by staining with ethidium bromide (EtBr). Densitometric analyzes were performed with KODAK-1D TM 2.0.2 software package (Kodak, New Haven, CT, USA).
  • the number of repeat units for normal individuals and premutation carriers could be calculated from the length of the PCR products.
  • Table 2 lists the results to be expected, where "-" means no PCR product, "+” means a PCR product and "2+” means two products with different lengths.
  • the results to be expected are shown schematically in FIG. 2, the same numbering as in Table 2 being used.
  • the ratio of unmethylated to methylated FMR-1 promoter and that of the XIST gene promoter is about 1: 1. Since both homologs have identical repeat region lengths, only one unmethylated and one methylated FMR-1 repeat region are visible in each case.
  • Women with a premutation have a similar pattern to heterozygous women, with the difference that a methylated and a non-methylated FMR-1 repeat region have a length between (48-) 54 to 200 units.
  • Skewed X inactivation and mosaic can be identified by semi-quantitative comparison of the methylation ratio of the FMR-1 promoter and the FMR-1 repeat region with that of the gene portion of the XIST gene.
  • the methylation ratio of the XIST gene remains 1: 1 in all cases, since each cell continues to carry 1 active and 1 inactive chromosome.
  • the methylation ratio of the FMR-1 promoter and that of the repeat region shifts towards non-methylation or methylation, depending on whether the normal chromosome or the one with the expanded allele has skewed X inactivation.
  • a similar pattern can be seen in mosaic women with a normal cell population and one with a full mutation.
  • FIG. 3a and 3b show gel electrophoresis of the MS-PCR products, with FIG. 3a the products of the multiplex reaction (FMR-1 promoter, XIST promoter) and FIG. 3b the products of the duplex reaction ( FMRI repeat expansion) shows, using the same numbering as in Table 2, and n means the number of repeat units.
  • negative control nodenta DNA that was not deaminated before amplification
  • Table 3 shows the results of a densitometric analysis of the multiplex PCR products from female patients.
  • the ratio of unmethylated and methylated XIST products, specific for the inactive or active X chromosome, remained stable within all female samples (mean (XM / XU) 1.033 ⁇ 0.21).
  • hum-A (um): SEQ. ID.Nr. 18
  • hum-B2 (m): SEQ. ID. r. 19
  • hum-C (com) SEQ. ID.Nr. 20
  • hum-A hybridizes with the unmethylated sequence
  • hum-B2 hybridizes with the methylated sequence
  • hum-C hybridizes in both cases.
  • 25 ul hum-A [20 pmol / ul] 37.5 ul hum-B2 [20 pmol / ul]
  • 50 ul hum-C [20 pmol / ul] 672 ul AD
  • 100 ul DYN and 100 are used per batch ul dNTP's [2 M] used.
  • the PCR profiles were 33 cycles 95 ° C / 20 ⁇ , 54 ° C / 40 s, 72 ° C / 40 s [program 3].
  • Table 4 shows the results of a densitometric analysis of the multiplex PCR products, the results being shown in the gel shown in FIG. 4.
  • the numbering of the Bands in the gel of Fig. 4 correspond to the numbering of the columns in Table 4.
  • the net intensities are calculated from the ratios of unmethylated and methylated products, the mean (A + A ') / 2 being all the more 0.5 deviates (ie 50% of the total cell population), the more skewed. Patients 15, 16 and 19 are heavily skewed.
  • Multiplex-MS-PCRs are performed on patients in order to detect and evaluate the occurrence and extent of any aberrant methylation of the promoter region of FraX-A, FraX-E and FraX-F in a single reaction.
  • Table 5 shows the primers used [20 pmol / ⁇ l], the amounts of the substances used for the MS-PCRs and the expected product sizes, the concentration of the d TPs being 2 mM. 5 shows the result (in the form of an image of the gel) of these multiplex MS-PCRs [program 1], where A is the size standard, B normal women, C normal men, D male patients with FraX -E disease and E native non-deaminated DNA. It can be seen that compared to normal men, the diseased male patients show a band of the order of 248 bp, but no FraX-F bands (191 bp) occur. All patients show control (unmethylated promoter, PU).
  • the net intensity of the bands in the gel is measured, the strength of the individual bands from one another indicating the extent of the disease. If, for example, one of the bands specific to the methylated promoter (PM, FraX-E AB, FraX-F AB) is amplified in a ratio of 3: 2 compared to the other band, this is an indication of a disease. In the present gel in FIG. 5, all women have a ratio of 2: 2, from which it can be seen that these women are healthy (neither FraX-A, FraX-E nor FraX-F ill).
  • Example 5 Combination of a duplex PCR with a potentially methylated DNA region
  • a PCR [program 2] is used to amplify the polymorphic gene region (in the present case the FX repeat (RU, RM)) together with the potentially aberrantly methylated gene region (in the example the methylated FMR-1 promoter (FX-JK) ) carried out.
  • the band pattern and the band intensities as shown in Table 6, a disease can be concluded and, if necessary, the extent of the disease can be determined.
  • Table 7 shows the primers used and the PCR products to be expected.
  • FX-K 5 '-GGAAGTGAAATCGAAACGGAGTTGAGC-3' (SEQ ID NO 21)
  • FX-J 5 '-AACGTTCTAACCCTCGCGAAACAATACG-3' (SEQ ID NO 22)
  • Figure 6 shows the separation of the PCR products, where S is the standard, 21 a normal man, 22 a male patient with premutation, 23 a male patient with full mutation, 24 a normal woman (homozygous repeat), 25 a normal woman (heterozygous repeat), 26 a female patient with premutation, 27 a female patient with full mutation, 28 as negative control native undeamined DNA.
  • the unmethylated repeat In a normal man, only the unmethylated repeat is amplified. In a male patient with a premutation, the unmethylated expanded repeat is also amplified. In a male patient with a full mutation, the methylated promoter is amplified and, if appropriate, the methylated repeat (as already mentioned, the repeat is not amplified if it exceeds a certain size).
  • Normal women have an intensity ratio of 2: 2: 2 (methylated promoter: methylated repeat: unmethylated repeat), whereby homozygous women have two identical alleles (same repeat number), heterozygous women have different repeat lengths, so that two different alleles with different repeat lengths (2 x 1) can be seen.
  • Women with a premutation have a ratio of 2: 1: 1 (the expanded repeat cannot be amplified from a certain size or if it is amplified, the normal and the expanded repeat can be seen).
  • this embodiment of the method according to the invention ensures an accurate evaluation of the clinical picture, both in male and in female patients.

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Abstract

Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom oder der Klonalität, wobei in einer Probe das Ausmass der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und gegebenenfalls das Ausmass der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms und/oder das Ausmass der Methylierung sowie gegebenenfalls die Sequenzvariante einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, bestimmt wird und anschliessend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen und gegebenenfalls der Sequenzvariante das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmass der potentiellen Aberration oder der Klonalität diagnostiziert wird.

Description

Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom oder der Klonalität
Es wird ein Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom oder der Klonalität zur Verfügung gestellt, die Verwendung eines solchen Verfahrens sowie ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.
Die DNS, Träger der genetischen Information, liegt im Zellkern der Eukaryonten in strukturellen Einheiten, den Chromosomen, dicht verpackt vor. Änderungen der Zahl oder aber der Struktur der Chromosomen sowie Veränderungen der DNS selbst, ohne dasε diese mikroskopische Veränderungen an den Chromosomen herbeiführen, haben bei Menschen meist schwerwiegende Krankheitsbilder zur Folge. Krankheiten können auch infolge epigenetischer Veränderungen, wie etwa durch aberrante DNA-Methylierung hervorgerufen werden. Die Methylierung der DNA erfolgt durch kovalente Bindung von Methylgruppen an die Nukleotide und stellt einen wichtigen Regu- lationsmechanismus dar: Im Fall des Säugergenoms sind aktive Gene oder deren regulatorische Einheiten häufig untermethyliert , während inaktive DNA-Abschnitte sich häufig durch eine starke Methylierung auszeichnen. Dabei werden primär die Cytosin-Reste in CpG-Dinukleotiden in 5 '-Position methyliert. Dementsprechend ist in methylierter DNA Methyl-Cytosin (mC) präferentiell als mCpG in den CpG-lnseln der DNA vorzufinden. Diese sind zumeist in regulatorischen DNA-Einheiten zu finden und ursächlich nicht methyliert. Physiologisch findet man im diploiden Säugergenom mCpG in geprägten Genen, "imprinted genes", - in Abhängigkeit vom elterlichen Ursprung des jeweiligen Gens bzw. Chromosoms, in der Regel unmethylierte aktive DNA -, und methylierte inaktive DNA-Abschnitte. Somit werden "geprägte Gene" von nur einem der beiden homologen Chromosomen exprimiert. Ein ähnliches Verhältnis findet sich in Zellen weiblicher Individuen zur Dosiskompensation von Genen, welche am X-Chromosom lokalisiert sind: da weibliche Zellen (XX) im Gegensatz zu den männlichen Zellen (XY) 2 X-Chromosomen tragen, wird eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert. Da¬ bei ist dieses inaktive X-Chromosom, bzw. dessen DNA (in der Form mCpG) bis auf wenige Bereiche (XIC... X-Inaktivierungs-Zentrum, pseudoautosomale Bereiche) methyliert. Diese X-Inaktivierung erfolgt im Laufe der Entwicklung eines Individuums zufällig (Ran- dom-X-Inaktivierung) , wonach die Gesamtheit der Zellen aus einer Population von Zellen mit inaktivem väterlichen und aktivem mütterlichen X-Chromosom, sowie einer gleich großen Population von Zellen mit aktivem väterlichen und inaktivem mütterlichen X-Chromosom besteht. So kommt es zu einem Verhältnis von aktiven zu inaktiven (Xa/Xi) Allelen bezüglich ihres elterlichen Ursprungs von Xa/Xi = 50/50. In vielen Fällen kann es bei weiblichen Individuen aber auch zu einer Abweichung von diesem 50/50-Verhältnis kommen, so dass zwar das Verhältnis von methylierten zu unmethylierten bzw. aktiven zu inaktiven X-Chromosomen (pro Zelle und auch pro Gesamtpopulation) von 1:1 aufrecht erhalten wird, aber die Größe der Zellpopulation mit dem aktiven/inaktiven X-Chromosom in Bezug auf dessen elterlichen Ursprung nicht gleich 50/50 ist. D.h. es ist die Zellpopulation (Klon) mit dem aktiven X-Chromosom des einen Elter (El) größer und die mit dem aktiven X-Chromosom des anderen Elter (E2) kleiner, bzw. der Klon mit dem inaktiven X-Chromosom von El kleiner und jener mit dem inaktiven X-Chromosom von E2 größer. Dieses Phänomen der "verschobenen" Klongröße bzw. Klonalität wird durch den Begriff "skewed-X-inactivation" beschrieben, welches auch bei normalen Frauen mit zunehmendem Alter beobachtet werden kann.
Experimentell kann man die Methylierung von DNA, z.B. durch das Schneiden mit methylierungssensitiven Enzymen, durch mC spezifische Antikörper, durch genomisches Sequenzieren Bisulfit dea i- nierter DNA, selektive Hydrazin-Spaltung nicht-methylierter DNA, etc. nachweisen.
Weist ein DNA-Abschnitt eine fehlerhafte (aberrante) Methylierung auf (d.h. Hypermethylierung von physiologisch unmethylierter DNA oder aber Hypomethylierung pyhsiologisch methylierter DNA) , führt dies zumeist zu einer Deregulation der physiologischen Funktion dieses DNA-Abschnittes und kann in einer Krankheit resultieren. Häufig genügt die Feststellung des Phänotyps nicht, um die spezielle Krankheit zu diagnostizieren. Um die Krankheit mit Sicherheit feststellen zu können und auch die Variante bzw. die Krankheit zu diagnostizieren, ist in der Regel eine Untersuchung der Erbsubstanz des Patienten notwendig, insbesondere die Methylierung eines bestimmten DNA-Abschnitts.
Eine Reihe an Krankheiten wird durch eine Veränderung der DNA an einem X-Chromosom hervorgerufen. Beispielsweise kann ein DNA-Bereich am X-Chromosom methyliert werden, so dass dieses Gen in- aktiviert wird. Zusätzlich kann z.B. durch eine Veränderung (Mutation) der DNA, etwa durch Expansion einer Repeatregion, die Genfunktion gestört und zudem methyliert werden (FraX-A, FraX-E, FraX-F (s. Carrel et al . , American Journal of Medical Genetics 64:27-30 (1996); Hirst et al . , Hum. Molec. Genet. 2: 197-200, 1993; Parrish et al . , Nature Genet. 8: 229-235, 1994; Ritchie et al., Hum. Molec. Genet. 3: 2115-2121, 1994; Sutherland et al . , Hum. Molec. Gent. 1: 111-113, 1992). In anderen Fällen können Krankheiten durch Veränderungen von DNA-Abschnitten bzw. ganzer Chromosomen (-bereiche) durch Duplikation, Insertion, Transloka- tion bedingt sein. Betrifft eine solche Veränderung das X-Chromosom bereits in den frühen Entwicklungsstadien eines Individuums, muss man in vielen Fällen von X-chromosomalen Erkrankungen sprechen. Auch bei sporadischen Erkrankungen, wie dies für viele Tumor-Erkrankungen gilt, konnten X-chromosomale Veränderungen nachgewiesen werden (Gale et al . , Blood, Vol. 83, No. 10 (1994), 2899-2905). Demzufolge liegen unterschiedliche Varianten des X- Chromosoms nebeneinander oder aber auch unterschiedliche Zellpopulationen (Klone) neben dem normalen gesunden Klon vor. Diese Populationen (Klone) können sich einerseits im Allelmuster als auch im Methylierungsmuster der Allele bzw. des veränderten genetischen Materials unterscheiden (siehe Cammarata et al . , Am. j. Med. Genet., 1999; 85(1): 86-7; ISSN: 0148-7299; Dierla m et al . , Br. J. Haematol., 1995; 91 (4) : 885-91; ISSN: 0007-1048; James et al., Ann. Hum. Genet., 1997; 61(6): 485-90; ISSN: 0003-4800; Leal et al., Hum. Genet., 1994; 94(4): 423-6; ISSN: 0340-6717; MacDonald et al . , Hum. Mol. Genet., 1994; 3(8): 1365-71; ISSN: 0964-6906; und Martinez-Pasarell et al . , Horm. Res . , Oktober 1999; 51(5): 248-252; ISSN: 0301-0163).
Bei genetischen Untersuchungen wird das betroffene Gen bzw. der betroffene Genlokus mittels zytogenetischen, Southern blot-, PCR-, reverse Transkription PCR (RT-PCR)- bzw. immunologischen Analysen untersucht. In diesen Untersuchungen wird die Sequenz, die Expression, das Ausmaß der Methylierung, und ähnliches untersucht .
Das fragile X-Syndrom (FX- oder FraX-A-Syndrom) ist ein Beispiel für eine Erbkrankheit, wobei sie insbesondere Männer betrifft. Der klinische Phänotyp des FX-Syndroms zeigt eine geringe bis iQ
H- o
P K φ w
^
3
1
_->
1
Q
Φ
P w
3
Φ rt p'
*
H-
Φ ti rr s:
Φ
&
Φ
P
Nichtsdestotrotz können I'MR-1-Allele mit sehr vielen Repeat-Ein- heiten (300-800) in vitro durch Behandlung mit demethylierenden Agentien, wie 5-Azadeoxycitidin, reaktiviert werden. Weiters wurden Männer gefunden, die obwohl sie eine Repeatzahl über 200 (Vollmutation) aufweisen, diese jedoch unmethyliert ist, eine normale Intelligenz und fast normale FMR-1-Proteinkonzentrationen aufweisen. Daraus kann geschlossen werden, dass eher die Denovo- Methylierung des FMR-1-Promotors als die Länge des expandierten Repeat-Bereiches die Genfunktion stört. Unterschiedliche Grade der Methylierung können unterschiedliche Grade der Krankheit zur Folge haben.
Gängige Verfahren zur Evaluierung des FX-Syndroms umfassen zyto- genetische, Southern blot-, PCR-, reverse Transkription PCR (RT- PCR)- und immunohistochemische Analysen. Bei diesen Untersuchungen wird in der Regel die Größe des expandierten Repeat-Bereichs, die Denovo-Methylierung dieser Genregionen oder die Genexpression analysiert.
In der WO 92/14840 wird die Detektion von fragilem X-Syndrom mittels Restriktionsenzymen beschrieben, wobei diese Restriktions- enzyme beispielsweise nur die Stellen schneiden, die nicht methy- lierte Cytosine aufweisen. Die methylierte DNA wird somit im Gegensatz zur nicht-methylierten DNA verdaut, wobei die Verdauungs- produkte nachweisbar sind.
Die WO 91/09140 betrifft ein Oligonukleotid mit einer bestimmten Sequenz, welches an eine bestimmte Stelle, M54, der Region des fragilen Gens, bindet. Durch eine in situ-Hybridisierung mit dem markierten Oligonukleotid können Patienten mit fragilem X-Syndrom detektiert werden.
Die WO 92/20825 betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Diagnose des fragilen X-Syndroms, wobei einerseits die Menge an mRNA etwa durch RT-PCR oder die Menge des Proteins etwa mittels immunologischer Verfahren des FMR-1-Gens bestimmt wird. Eine weitere Methode zur Detektion des fragilen X-Syndroms besteht darin, die Re- peat-Bereich-Länge zu bestimmen. Dies geschieht z.B. durch Verdauung des FMR-1-Gens mit Restriktionsenzymen bzw. PCR-Verfahren mit Primern, die für den Repeat-Bereich des FMR-1-Gens spezifisch sind, und anschließender Gelelektrophorese.
Auch das Verfahren gemäß der US 5 658 764 zur Detektion des fragilen X-Syndroms umfasst eine Größenmessung der GC-reichen Sequenz mit Hilfe von PCR-Verfahren.
Die Nachteile dieser beschriebenen Verfahren bestehen darin, dass die Bestimmung lediglich einer Genregion keine eindeutige Aussage bezüglich der Variante der Krankheit zulässt. Eine herkömmliche PCR eines einzigen Gen-Bereiches ergibt z.B. keine ausreichenden Ergebnisse, da im Falle des fragilen X-Syndroms beispielsweise Vollmutationen aufgrund ihres hohen CG-Gehalts und ihrer repeti- tiven Natur mittels PCR nicht amplifiziert werden können. Da negative Ergebnisse somit auch auf eine Vollmutation schließen lassen können, müsste anschließend immer eine Southern blot-Analyse durchgeführt werden. Diese Southern blot-Analysen bringen Informationen bezüglich der Repeat-Bereich-Länge sowie der Methylierung. Die Nachteile des Southern blots liegen darin, dass er zeitaufwendig ist, dass relativ große Mengen an DNA notwendig sind, was insbesondere bei pränatalen Analysen Schwierigkeiten darstellt, und auch die dabei übliche Verwendung von Radioisotopen ist für das Laborpersonal nachteilig. Ein Nachteil der PCR besteht darin, dass nicht zwischen einer Vollmutation und einer Prämutation unterschieden werden kann, insbesondere wenn ein Grenzfall Vollmutation/Prämutation vorliegt, d.h. dass die Länge des Repeat-Bereichs um 200 Einheiten liegt und die Sequenz teilweise methyliert bzw. nicht methyliert ist. Weiters ist die Unterscheidung zwischen einer Vollmutation und einem Mosaik (d.h. z.B. eine Vollmutation auf einem Allel und eine Prämutation oder eine Expansion im Normalbereich auf dem anderen Allel) problematisch bzw. unmöglich. Weiters sind diese bekannten Verfahren sehr zeitaufwendig, da mehrere Verfahrensschritte notwendig sind. Auch zeigen diese Methoden eine hohe "Falsch-Negativ" -Rate bei Frauen.
Die Schrift von Das et al . "Methylation analysis of the fragile X Syndrome by PCR" (Genetic testing, Volume 1, Number 3, 1997/98) betrifft ein Verfahren zur Detektion des fragilen X-Syndroms mittels Methylierungs-spezifischer PCR (MS-PCR) . Hierbei werden die nicht-methylierten Cytosinreste durch Zusetzen eines Agens in Urazil umgewandelt, während die methylierten Cytosinreste nicht umgewandelt werden. Bei der DNA-Replikation wird in der modifizierten DNA das Urazil durch Thymidin ersetzt. Durch die Konstruktion von spezifischen Primern, die entweder mit der modifizierten DNA-Sequenz hybridisieren, wird entweder die methylierte Sequenz oder die nicht-methylierte Sequenz amplifiziert . Werden Primer ausgewählt, die unterschiedliche Produktlängen ergeben, kann je nach PCR-Produkt bestimmt werden, ob die bestimmte Stelle des FMR-1-Gens methyliert ist oder nicht. Durch diese MS-PCR werden infolge der PCR-Amplifikation der nicht-methylierten Sequenz die normalen und prämutierten Allele von den Vollmutation und Mo- saiksequenzen, - Amplifikation der methylierten Sequenz -, unterschieden. Normale und prämutierte Sequenzen müssen anschließend durch eine konventionelle PCR unterschieden werden (Seite 152, Spalte 2, 2. Absatz). In der konventionellen PCR werden nur normale Sequenzen (5-50 Repeat-Einheiten) nicht aber prämutierte Sequenzen (50-200 Repeat-Einheiten) amplifiziert (s. Fig. 2B) . Weiters kann gemäß dieser MS-PCR nicht zwischen Personen mit Vollmutationen und solchen mit einem Mosaik aus Vollmutation/Prämutation unterschieden werden. Für diese Bestimmung muss anschließend eine Southern blot-Analyse durchgeführt werden (s. Seite 153, 2. Spalte unten, bis Seite 154, 1. Spalte oben). Weiters ist es auch nicht möglich, mit Hilfe dieser MS-PCR das Krankheitsbild von Frauen zu testen, da das inaktive X-Chromosom immer methyliert ist und somit immer ein Produkt erhalten wird. Betroffene weibliche Patienten können demnach nur mit Hilfe der konventionellen Southern blot-Analyse richtig diagnostiziert werden (s. Seite 155, vorletzter Absatz).
Selbst bei Durchführung der obgenannten Methoden in Kombination, ist im Falle eines Mosaiks eine Bestimmung der Klongröße, d.h. der Klonalität, nicht möglich, da hier lediglich die Methylierung bzw. Nicht-Methylierung qualitativ bestimmt wird. Diese kann nur durch Analyse eines zusätzlichen informativen (d.h. 2 voneinander unterscheidbare Allele) Genabschnittes erfolgen, wobei das Ausmaß einer "skewed X-Inaktivierung" durch Methylierungsanalyse eines solchen informativen Bereiches am X-Chromosom durchgeführt werden muß. Zudem ist dieser Bereich so zu wählen, dass das physiologische Methylierungsmuster von vornherein bekannt ist. Ein dazu oftmals herangezogener Genlokus ist das HUMARA (human androgen receptor) Gen (s. Pardini et al . , The New England Journal of Me- dicine, Vol. 338, Nr. 5 (1998), 291-295; Kubota et al . , Hum. Gent. (1999) 104: 49-55) .
Diese Problematik ergibt sich bei der Diagnostik aller X-chromo- somaler Erkrankungen, deren zugehörige Genbereiche durch X-Inak- tivierung unterschiedlich methyliert werden, insbesondere bei der Ermittlung der Variante der Erkrankung (Normal-/Prä-/Vollmutati- on) und Klonalität bzw. Klongröße. Als Beispiele seien hier nur FraX-A, FraX-E, FraX-F, und diverse X-chromosomale Erkrankungen angeführt :
Wie schon für das fragile X-Syndrom (FraX-A) dargestellt, sind die Verhältnisse im Fall von FraX-E und FraX-F ähnlich, wobei ebenfalls Repeat-Expansion und einhergehende Methylierung zur Ausprägung der Erkrankung führen.
Bei FraXE-positiven Personen umfasst eine GCC-Repeat-Expansion, die neben einer CpG-Insel im Xq28 vorhanden ist, über 200 GCC- Einheiten, im Vergleich zu 6-25 GCC-Einheiten bei normalen Personen. Überdies ist bei FraX-E-positiven Personen die CpG-Insel methyliert. Diese Patienten weisen mentale Retardationen auf (s. Knight et al . , Am. J. Hum. Gent. 53:A79, 1993; Knight et al . , Cell 74: 127-134, 1993). Es wurde ein Gen, FMR2 , identifiziert, das distal der CpG-Insel beim FraX-E transkribiert wird und durch Repeat-Expansion & Methylierung down-reguliert wird (Gu et al . , Nature Gent. 13: 109-113).
Bei FraX-F-positiven Patienten ist eine Expansion einer Sequenz (GCCGTC ) n (GCC) m zu finden, wobei m mehr als 900 betragen kann und die daneben liegende CpG-Insel methyliert ist. In normalen Personen beträgt m 12 bis 26 und n 3 (Ritchie et al . , Hum. Molec. Gent. 3: 2115-2121, 1994).
Die Nachteile der bekannten Bestimmungstechniken liegen darin, dass zur Diagnose der Krankheiten und der KrankheitsVariante oft mehrere unterschiedliche Verfahrensschritte notwendig sind. In vielen Fällen ist eine eindeutige Aussage über das Krankheitsbild nicht möglich, da die angewandten Bestimmung nur Aussagen über einen spezifischen Gen-Bereich zulassen. Das Ziel der vorliegender! Erfindung ist es demnach, ein Verfahren zur Diagnose einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom oder der Klonalität zur Verfügung zu stellen, das rasch und einfach mit möglichst wenigen Verfahrensschritten durchgeführt werden kann, wobei zwischen den verschiedenen Varianten unterschieden wird, und das Verfahren sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Patienten zur Unterscheidung der verschiedenen Genotypen herangezogen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass
a) entweder in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder das Ausmaß der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration diagnostiziert wird, oder
b) in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder das Ausmaß der Methylierung sowie gegebenenfalls die Sequenzvariante einer polymor- phen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen und gegebenenfalls der Sequenzvariante das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration oder der Klonalität diagnostiziert wird, oder
c) in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region, das Ausmaß der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms, und das Ausmaß der Methylierung sowie die Sequenzvariante einer poly orphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen und der Sequenzvariante das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration diagnostiziert wird. Unter dem Ausmaß der Methylierung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Verhältnis von methyliertem und nicht-methyliertem Allel in einem Chromosom verstanden, d.h., dass in einer Reaktion gleichzeitig die methylierte und nicht-methylierte DNS bestimmt wird. Durch die gleichzeitige Bestimmung kann eine genaue und quantitative Aussage bezüglich des Verhältnisses von Methylierung und Nicht-Methylierung einer spezifischen Sequenz getroffen werden. Dadurch ist es möglich, das Ausmaß und die Variante der bestimmten Krankheit zu diagnostizieren.
Unter einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine DNS-Region verstanden, die methyliert oder nicht-methyliert ist. Wird diese DNS-Region durch Methylierung beeinflusst, kann durch aberrante Methylierung eine Krankheit hervorgerufen werden.
Es konnte gezeigt werden, dass eine quantitative Methylierungs- bestimmung der beiden Allele eines methylierten DNS-Bereichs und/ oder die Bestimmung der Klongröße über die Methylierungsbestim- mung einer polymorphen DNS-Region eine eindeutige und klare Auflösung des Methylierungsmusters und damit des Krankheitsbildes ergeben. Somit können die unterschiedlichen Genotypen sowohl von männlichen als auch von weiblichen Patienten voneinander unterschieden werden, da je nach Genotyp das Ergebnis ein spezifisches Muster aufweist.
Eine quantitative Methylierungsanalyse, welche bei Bestimmung der Klonalität (Klongröße) aussagekräftig ist, eignet sich zur Abklärung aller X-chromosomalen Erkrankungen, und auch jener Erkrankungen, welchen eine Abweichung von der normalen Anzahl an X- Chromosomen zugrunde liegt (Klinefelter- , Turner-, Multiples X- Syndrom) , oder auch jener Krankheiten, deren betroffene Zellpopulation (Klon) X-Aneuploidie aufweist. Dies findet man sehr häufig bei verschiedenen Tumorerkrankungen und hämatologischen Neopla- sien. Der Nachweis und eine Bestimmung der Klongröße/Klonalitäc dieser neoplastischen Erkrankungen ist für Diagnose und ein Monitoring ein wichtiger Parameter. Im Falle autosomaler Erkrankungen, welche geprägte Gene betreffen, liegen die Verhältnisse ähnlich. Dabei kann auch das Ausmaß der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms bestimmt werden. Der sicher physiologisch methylierte DNS-Bereich betrifft dabei lediglich ein Allel des X-Chromosoms, während das andere Allel nicht methyliert ist.
Ist dieses Ausmaß des sicher physiologisch methylierten DNS-Bereiches bekannt, so dient diese zusätzliche Kontrolle als interner Standard.
Einen diagnostischen Wert hat diese zusätzliche Analyse dann, wenn die potentiell aberrant methylierte DNS-Region Deletionen aufweist, so dass diese auch nicht nachgewiesen werden kann, unabhängig davon, ob sie Methylierungen aufweist oder nicht. Im Ergebnis würde dann der Nachweis der potentiell aberrant methylierten DNS-Region fehlen, jedoch würde der sicher physiologisch methylierte DNS-Bereich nachgewiesen werden. Somit kann auf eine Deletion geschlossen werden. Ohne diese zusätzliche Kontrolle wäre es nicht möglich zu sagen, ob die DNS-Region Deletionen aufweist, und somit nicht detektiert worden ist, oder ob der Nachweis nicht funktioniert hat.
Gemäß Punkt b) ist es aber auch möglich, als eventuelle zusätzliche Bestimmung das Ausmaß der Methylierung sowie gegebenenfalls die Sequenzvariante einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms zu bestimmen. Beispielsweise wird ein Krankheitsbild durch Evaluierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und der polymorphen DNS-Region bestimmt.
Unter einer polymorphen DNS-Region wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Variabilität einer DNS-Sequenz verstanden, beispielsweise ein DNS-Abschnitt , der in einer Population verschiedene Allele aufweist, wie etwa die Länge eines bestimmten DNS-Abschnittes im Fall von Mikrosatelliten-Repeats oder Nukleotid- und Aminosäure-Polymorphismen. Die gleichzeitige Bestimmung des Ausmaßes der Methylierung der Sequenzvariante zusammen mit der Bestimmung des Ausmaßes der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region erlaubt eine sehr gute Aussage bezüglich der Variante oder auch der Klongröße der entsprechenden Krankheit . Gemäß Punkt c) können diese drei verschiedenen Bestimmungen auch gleichzeitig durchgeführt werden, was eine maximale Aufklärung des Krankheitsbildes ergibt, da eine genaue Zuordnung der Variante der aberrant methylierten DNS-Region gewährleistet ist. Das Verfahren kann schnell durchgeführt werden und das Ergebnis ist fehlerfrei und leicht zu interpretieren. Mit diesem Verfahren können im Gegensatz zu den herkömmlichen Analyseverfahren sowohl männliche als auch weibliche Patienten untersucht werden. Diese Analyse gibt selbst in Grenzfällen eindeutige Ergebnisse.
Das Ausmaß der Methylierung kann dabei durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, z.B. Methylierungs-spezifische Restriktionsenzyme, Oligonukleotide, die Methylierungs-spezifisch veränderte DNS-Abschnitte spezifisch erkennen und hybridisieren, etc. Auch die Sequenzvariante der polymorphen DNS-Region kann auf unterschiedliche Arten bestimmt werden, etwa mittels PCR oder mit Hilfe von Restriktionsenzymen.
Für eine rasche Analyse ist es besonders vorteilhaft, wenn die Bestimmung des Ausmaßes der Methylierung sowie gegebenenfalls die Bestimmung der Sequenzvariante mittels einer Methylierungs-spezi- fischen PCR (MS-PCR) durchgeführt wird, wobei Primer verwendet werden, mit welchen eine methylierte bzw. nicht-methylierte DNS- Region jeweils Methylierungs-spezifisch amplifiziert werden. Die Technik der MS-PCR ist eine einfache Methode, um zwischen methylierten Sequenzen und nicht-methylierten Sequenzen zu unterscheiden und wird, da die Methylierung bzw. Nicht-Methylierung häufig ein Indiz für eine genetisch bedingte Krankheit ist bzw. diese hervorruft, für die Diagnostik von Patienten herangezogen.
Die MS-PCR basiert auf dem Prinzip, dass Primer verwendet werden, die spezifisch für eine methylierte bzw. nicht-methylierte Sequenz sind, so dass jeweils die einen oder anderen Primer mit der Sequenz hybridisieren, je nachdem, ob diese methyliert oder nicht methyliert ist. Die PCR-Produkte lassen anschließend auf die Methylierung bzw. Nicht-Methylierung schließen. Beispielsweise können die Primer so gewählt werden, dass das PCR-Produkt für die methylierte Sequenz eine bestimmte Länge aufweist und das PCR- Produkt für die nicht-methylierte Sequenz eine andere Länge aufweist. Die PCR-Produkte geben somit aufgrund ihrer Größe Auf- schluss über die Methylierung der amplifizierten DNA-Abschnitte .
Eine gängige Methode, MS-Primer zu erhalten besteht darin, die methylierte und/oder die nicht-methylierte Sequenz spezifisch zu verändern und entsprechende Primer, die spezifisch für die geänderten Sequenzen sind, zu konstruieren. Eine Möglichkeit, die DNA Methylierungs-spezifisch zu verändern, besteht darin, die DNA mit einem deaminierenden Agens zu behandeln, z.B. Natriumbisulfit . Natriumbisulfit wandelt das nicht-methylierte Cytosin in Urazil um, das bei der anschließenden DNA-Amplifikation durch Thymidin ersetzt wird. Dieses Verfahren stellt somit unterschiedliche DNA- Sequenzen ausgehend von ursprünglich homologen aber unterschiedlich methylierten Allelen her. Die Primer, die mit der nicht-me- thylierten Sequenz hybridisieren, weisen Thymidin anstelle von Cytosin auf. Die Primer, die für die methylierte Sequenz spezifisch sind, weisen hingegen an den Stellen der methylierten Cs weiterhin Cytosin auf.
In dem vorliegenden Fall ist es für ein eindeutiges Ergebnis vorteilhaft, wenn die Primer so gewählt werden, dass das PCR-Produkt der methylierten Sequenz immer - unabhängig von der Länge des Repeat-Bereichs - eine andere Länge aufweist als das PCR-Produkt der nicht-methylierten Sequenz.
Die Bestimmung mittels MS-PCR gewährleistet demnach ein besonders zeitsparendes und effizientes Verfahren, da wenig DNA gebraucht wird und weniger Arbeitsaufwand notwendig ist. Das Ergebnis der PCRs wird gleichzeitig erhalten. Es sind auch keine weiteren Verfahrensschritte notwendig, wie Southern blot, Hybridisierungsver- fahren, etc.
Besonders günstig ist es, z.B. im Falle des CGG-Repeats des FMR- 1-Gens, wenn die MS-PCR-Primer an einem antisense-Strang bzw. an antisense-Strängen durchgeführt wird bzw. werden. Dadurch wird die Schmelztemperatur von 95°C auf eine Schmelztemperatur von 75°C reduziert, was die Durchführung der PCR bei moderater Annea- lingtemperatur ermöglicht und den Ablauf des Verfahrens verbessert. Diese Temperaturbedingungen sind für die Reaktionskomponenten und die DNA-Polymerase schonend. Vorzugsweise werden die MS-PCRs in Duplex-Reaktionen durchgeführt. D.h., dass die PCRs zur Amplifikation einer bestimmten methylierten Sequenz als auch derselben bestimmten nicht-methylier- ten Sequenz in einer Reaktion durchgeführt werden, z.B. die PCRs zur Amplifikation der polymorphen methylierten und nicht-methy- lierten DNS-Region. Auf diese Weise wird gewährleistet, dass die Reaktionsprodukte, welche erhalten werden, bei der anschließenden Analyse aufgrund ihrer Größe eindeutig zugeordnet werden können, und so das Ergebnis klar zu interpretieren ist.
Vorteilhafterweise werden die MS-PCR für die Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und die MS-PCR für die Bestimmung des sicher physiologisch methylierten DNS-Bereichs in einer gemeinsamen Multiplex-Reaktion durchgeführt. Da die MS-PCRs in der Regel zwei verschiedene Gene betreffen und somit zwei verschiedene Sequenzen, werden die MS-PCRs nicht von einander beein- flusst. Die Bestimmung der polymorphen DNS-Region würde in einer separaten Duplex-Reaktion durchgeführt werden, um den Polymor- phismus eindeutig bestimmen zu können, z.B. damit diese in der Größe variabler PCR-Produkte mit anderen PCR-Produkten bei der anschließenden Auswertung nicht überlagern.
Besonders bevorzugt wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, wobei die polymorphe DNS-Region eine DNS-Region mit einem Repeat- Polymorphismus ist, die vorzugsweise mit der potentiell aberrant methylierten DNS-Region in Zusammenhang steht, wobei als Sequenzvariante die Länge des Repeat-Bereiches bestimmt wird, und anschließend sowohl das Vorhandensein als auch das Ausmaß der potentiellen Aberration bestimmt wird.
Unter Repeat-Polymorphismus wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Bereich verstanden, der eine mehrmalige Wiederholung einer Repeat-Einheit , d.h. einer bestimmten Abfolge von mehreren Nukleotiden, aufweist. Die Anzahl der Wiederholungen, der sogenannten "Repeat-Einheiten", ist dabei je nach Gen bzw. Krankheit unterschiedlich, wobei das Ausmaß der Krankheit in der Regel mit der Länge des Repeat-Bereichs zusammenhängt. Meist ist ein Repeat-Bereich, der eine besonders unnatürliche Länge aufweist, auch gleichzeitig methyliert, wenn dieser DNS-Bereich normalerweise nicht methyliert ist. Meist ist in diesem Fall auch der z.B. angrenzende bzw. potentiell aberrant methylierte Bereich entsprechend stark methyliert, so dass die Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und die Bestimmung der polymorphen DNS-Region ergänzende Ergebnisse erbringen und damit als zusätzliche Kontrollen gesehen werden können.
Besonders bevorzugt ist die polymorphe DNS-Region der CGG-Trinu- kleotid-Repeat-Bereich des FMR-1-Gens. Die Bestimmung in diesem Bereich ergibt ein wiederholbares und eindeutiges Ergebnis. Wird die Bestimmung etwa mit Hilfe einer MS-PCR durchgeführt, kann in einem einzigen Verfahrensschritt sowohl die Länge des Repeat-Be- reiches als auch das Ausmaß der Methylierung bestimmt werden, wenn die Primer so gewählt werden, dass sie den gesamten Repeat- Bereich einschließen. Der CGG-Trinukleotid-Repeat-Bereich des FMR-1-Gens ist, wie bereits in der Beschreibungseinleitung angeführt ist, ein Sequenzbereich, der Auskunft über Krankheiten, insbesondere über das fragile X-Syndrom, gibt, da die Länge des Repeat-Bereichs charakteristisch für die Variante der Krankheit ist .
Dabei ist es besonders günstig, wenn die polymorphe DNS-Region im ersten untranslatierten Exon des FMR-1-Gens ist. Dies ist eine für die Bestimmung vorteilhafte Region, die zu einem fehlerfreien Ergebnis führt.
Vorzugsweise ist die potentiell aberrant methylierte DNS-Region das FMR-1-Gen oder ein Teil davon. Dies gewährleistet ein vereinfachtes Verfahren, da für zumindest einen Teil der Analyse lediglich der FMR-1-Genbereich notwendig ist. Dieser könnte aus der übrigen DNA isoliert für die Analyse verwendet werden, auch könnte die Analyse an isolierten X-Chromosomen durchgeführt werden.
Vorzugsweise ist die potentiell aberrant methylierte DNS-Region der 5 ' -untranslatierte Bereich des FMR-1 Gens, d.h. der FMR-1- Promotor, oder ein Teil davon. Dies liefert einerseits zuverlässige Ergebnisse und andererseits liegt die potentiell aberrant methylierte DNS-Region damit in der Nähe des CGG-Repeat-Bereichs , da dieser im ersten untranslatierten Exon liegt. Auf diese Weise muss nicht das gesamte Gen für die Analyse herangezogen werden, das im Laufe der Deaminierung möglicherweise zerfallen könnte. Liegt die potentiell aberrant methylierte DNS-Region im FMR-1- Promotor, kann für die Bestimmung ein kürzerer DNS-Abschnitt für die Untersuchung herangezogen werden.
Dabei ist es vorteilhaft, wenn die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine DNS-Region ist, die am aktiven X-Chromosom sicher methyliert ist. Damit ist dessen Methylierungsmuster gegenteilig zu dem des FMR-1-Gens, welches am inaktiven X-Chromosom methyliert ist. Diese zusätzliche Bestimmung stellt damit ein neues und erfinderisches Verfahren zur Verfügung, das erlaubt, auf besonders einfache und eindeutige Art und Weise auch den Grad der entsprechenden Krankheit von Frauen zu bestimmen. Dazu wird das Verhältnis der methylierten zur nicht-methylierten DNS-Region des einen Gens (vorzugsweise des FMR-1-Gens) mit dem Verhältnis der reziprok-methylierten DNS-Region (methyliert: nicht-methyliert) sowie auch mit dem Verhältnis des methylierten Repeat-Po- lymorphismus zum nicht-methylierten Repeat-Polymorphismus (vorzugsweise des FMR-1-Gens) verglichen.
Vorzugsweise ist die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine Region, die das XIST-Gen oder Teile davon umfaßt. Das XIST- Gen ist am aktiven Chromosom X methyliert, so dass es ein reziprokes Methylierungs-Muster zum FMR-1-Gen aufweist. Die Bestimmung mit Hilfe des XIST-Gens als interner Standard stellt ein zuverlässiges, eindeutiges und einfaches Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom, insbesondere bei Frauen, zur Verfügung.
Besonders günstig ist es, wenn die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine Region im XIST-Gen-Promotor ist. Es hat sich herausgestellt, dass die Methylierung des Promotors des XIST-Gens einfach zu bestimmen ist, und zu zuverlässigen Ergebnissen führt.
Für ein besonders vorteilhaftes Verfahren ist es vorgesehen, dass die potentiell aberrant methylierte DNS-Region und die polymorphe DNS-Region zwei einander nicht überlappende Sequenzen sind. Somit ist sichergestellt, dass, selbst wenn beide DNS-Regionen auf dem FMR-1-Gen sind, zwei separate, voneinander unabhängige DNS-Regionen untersucht werden, so dass die Ergebnisse der Untersuchung - 17 - beider Bereiche sich gegenseitig ergänzen, und dadurch mögliche Verwechslungsfehler vorzeitig erkannt werden können.
Vorzugsweise werden gleichzeitig zwei oder mehr potentiell aberrant methylierte DNS-Regionen am X-Chromosom detektiert und eva- luiert. Beispielsweise können in einer Reaktion gleichzeitig die Krankheitsbilder hinsichtlich des FraX-A, FraX-E und FraX-F bestimmt werden, wobei für jedes einzelne Krankheitsbild ein genaues und zuverlässiges Resultat erhalten wird, ohne dass sich die Resultate der verschiedenen Krankheitsbilder beeinflussen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen, oben beschriebenen Verfahrens zur Detektion und Evaluierung von X-chromosomalen Erkrankungen. Diese Erkrankungen wurden bereits oben beschrieben, wobei es sich um Erkrankungen handelt, die durch aberrante Methylierung an zumindest einer Stelle im X-Chromosom hervorgerufen werden. Je nach der zu detektierenden und zu evaluierenden Erkrankung wird eine spezifische, potentiell aberrant methylierte DNS-Region und gegebenenfalls ein sicher physiologisch methylierter DNS-Bereich des X- Chromosoms und/oder eine spezifische polymorphe DNS-Region des X- Chromosoms analysiert.
Dabei ist es besonders günstig, wenn das Verfahren insbesondere zur Detektion und Evaluierung des FraX-A-, FraX-E-, FraX-F-Syn- droms , der Klonalität und X-Aneuploidien verwendet wird.
Im Fall des fragilen X-Syndroms ist es besonders günstig, wenn der FMR-1-Promotor als potentiell aberrant methylierte DNS-Region bestimmt wird und/oder das XIST-Gen oder ein Teil davon als sicher physiologisch methylierter DNS-Bereich bestimmt wird und/ oder der CGG-Trinukleotid-Bereich des FMR-1-Gens als polymorphe DNS-Region bestimmt wird.
Im Fall des FraXE wird vorteilhafterweise die CpG-Insel im Sq28 als potentiell aberrant methylierte DNS-Region und/oder der GCC- Trinukleotid-Bereich als polymorphe DNS-R»_gion und/oder das XIST- Gen oder ein Teil davon als sicher physiologisch methylierter DNS-Bereich bestimmt. Im Fall des FraX-F wird vorteilhafterweise die (GCCGTC) n (GCC)m-Re- gion als polymorphe DNS-Region und/oder die daneben liegende CpG- Insel als potentiell aberrant methylierte DNS-Region und/ oder das XIST-Gen oder ein Teil davon als sicher physiologisch methylierter DNS-Bereich bestimmt.
Im Fall der Klongröße wird vorzugsweise der CGG-Nukleotid-Repeat- Bereich des FMRl-Gens als polymorphe DNS-Region bestimmt.
Wie bereits in der Beschreibungseinleitung angeführt ist, weisen im Fall der FraX-A normale Sequenzen einen Repeat-Bereich von 5- (48-) 54 CGG-Einheiten, prämutierte Sequenzen (48-) 54-200 CGG-Ein- heiten und Vollmutationen über 200 CGG-Einheiten auf.
Zur vollständigen Erfassung des Krankheitsbildes im Falle des fragilen X-Syndroms (aber auch z.B. bei FraX-E und FraX-F) kann durch die erfindungsgemäße Analyse eindeutig und schnell zwischen den verschiedenen Genotypen des fragilen X-Syndroms unterschieden werden, selbst bei weiblichen Patienten, bei denen die Methylierungsanalyse kein eindeutiges Ergebnis liefert, da - im Fall des Repeat-Bereichs - dieser in der PCR insbesonders bei einer Länge von mehr als 200 Einheiten durch einen Repeat mit normaler Länge kompetitiert wird. Durch die Bestimmung des Ausmaßes der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region kann die Probe einem bestimmten Genotyp eindeutig zugeordnet werden, da im Normal- und Prämutationsfall diese DNS-Region nicht methyliert, bei der Vollmutation hingegen methyliert ist. In männlichen Prä-/ Vollmutations-Mosaiken liegen die Verhältnisse ähnlich wie soeben für weibliche Patienten dargestellt. Mittels einer herkömmlichen Analyse, bei der lediglich der Repeat-Bereich bestimmt wird, kann insbesonders bei Grenzfällen ohne zusätzliche Verfahrensschritte, z.B. Southern-blot , keine eindeutige Diagnose erfolgen. Selbst bei Durchführung eines Southern-blots können Mosaike aufgrund der limitierten Sensitivität nur begrenzt nachgewiesen werden. Demgegenüber kann mittels der genannten PCR-Verfahren höhere Sensitivität bei geringerem Bedarf an Patienten-DNA eine verbesserte Beurteilung des Krankheitsbildes erfolgen.
Wenn weiters neben der Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region auch ein sicher physiologisch methylierter DNS-Bereich analysiert wird, so kann dieser als interner Standard herangezogen werden. Falls die potentiell aberrant methylierte DNS-Region aufgrund von Deletionen nicht nachgewiesen werden kann, wird in jedem Fall der sicher methylierte DNS-Bereich (z.B. das XIST-Gen) nachgewiesen. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass das Verfahren funktioniert hat, und gegebenenfalls die potentiell aberrant methylierte DNS-Region zumindest teilweise fehlt, d.h. deletiert ist (z.B. FMR-1-Gen) .
Im Fall, dass der FMR-1-Repeat-Bereich bestimmt wird, und zwar mittels MS-PCR, kann die Anzahl der normalen bzw. Prämutations- Repeat-Einheiten einfach aus der Länge der MS-PCR-Produkte errechnet werden. Auf diese Weise wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, bei dem gleichzeitig der Grad der Methylierung und die Länge der Repeat-Bereiche bestimmt werden. In einem einzigen Ver- fahrensschritt (entweder eine einzige MS-PCR-Reaktion oder mehrere MS-PCR-Reaktionen nebeneinander) wird somit der Grad des fragilen-X-Syndroms bestimmt. Die MS-PCR ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren, das kostengünstig ist und in jedem Labor durchgeführt werden kann. Weiters ist lediglich eine kleine Menge an DNA für diese Analyse notwendig. Weiters müssen keine zusätzlichen, oft zeitaufwendigen und kostspieligen Verfahren durchgeführt werden, wie etwa immunologische oder Southern blot-Verfahren. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung des fragilen X-Syndroms, die meist PCR und zusätzlich einen Southern blot beinhalten, werden keine radioaktiven Substanzen eingesetzt, was insbesondere für das Laborpersonal vorteilhaft ist. Weiters wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, das aufwendige Arbeitsschritte einspart und sich besonders für Routine- diagnosen und Screening-Studien eignet. Weiters eignet sich diese Analyse für DNA, die aus Guthrie-Karten extrahiert wurde, und für Studien von kleinen Gewebsproben, die mit feinen Nadeln aus dem Körper entnommen wurden.
Wird eine 3-fach MS-PCR-Analyse für die Detektion und Evaluierung des fragilen X-Syndroms durchgeführt, kommt es zu folgendem Ergebnis :
Normale männliche Individuen zeigen einen nicht-methylierten Repeat-Bereich (als polymorphe DNS-Region) von bis zu (48-) 54 Einheiten sowie eine nicht-methylierte FMR-1-DNS-Region, z.B. der Promotor (als potentiell aberrant methylierte DNS-Region) .
Männliche Patienten mit einer Prämutation zeigen dasselbe Muster, aber mit etwa (48-) 54 bis 200 Repeat-Einheiten.
Männliche Patienten mit einer Vollmutation weisen einen methylierten Repeat-Bereich mit über 200 Einheiten (wird in der Regel nicht amplifiziert) sowie eine methylierte FMR-1-Promotor-Region (als potentiell aberrant methylierte DNS-Region) auf. Bei Grenzfällen Vollmutation/Prämutation ist es ausschlaggebend, ob die methylierte oder nicht-methylierte FMR-1-Promotor-Region ampli- fiziert ist. Selbst wenn nun der methylierte Repeat-Bereich einer Vollmutation so lange ist, dass dieser nicht amplifiziert werden würde, kann die Vollmutation aufgrund der Amplifizierung der methylierten FMR-1-Promotor-Region detektiert werden.
Mosaik Vollmutation/Prämutation: der Repeat-Bereich des Allels mit der Vollmutation wird nicht amplifiziert , der nicht-methylierte Repeat-Bereich des Prämutationsallels wird amplifiziert , wobei es (48-) 54 bis 200 Einheiten aufweist. Die methylierte FMR-1-Promotor-Region wird amplifiziert .
- Aufgrund der zufälligen (random) X-Inaktivierung in normalen homozygoten Frauen beträgt das Verhältnis der nicht-methylierten zur methylierten FMR-1-DNS-Region sowie vom nicht-methylierten zum methylierten XIST-Gen 1:1. Da beide Homologe idente Repeat- Bereich-Längen aufweisen, ist lediglich jeweils ein nicht-methy- lierter und ein methylierter FMR-1-Repeat-Bereich sichtbar.
Bei heterozygoten Frauen, die unterschiedliche Repeat-Bereich- Längen aufweisen, ist dasselbe Muster wie oben beschrieben zu sehen, lediglich sind zwei nicht-methylierte und zwei methylierte FMR-1-Repeat-Bereiche mit unterschiedlichen Längen zu sehen.
Frauen mit einer Prämutation weisen ein ähnliches Muster auf wie heterozygote Frauen, mit dem Unterschied, dass ein methylierter und ein nicht-methylierter FMR-1-Repeat-Bereich eines Allels eine Länge von (48-) 54 bis 200 Einheiten aufweist.
Frauen mit einer Vollmutation weisen immer eine methylierte FMR-1-Promotor-Region am expandierten Allel auf, unabhängig davon, ob diese am aktiven oder inaktiven Chromosom liegt. Im Fall einer random X-Inaktivierung beträgt das Methylierungsverhältnis der FMR-1-DNS-Region Promotor-Region 3:1 (Methylierung: Nicht- Methylierung) , während das Methylierungsverhältnis des XIST-Gens weiterhin 1:1 beträgt. Frauen mit einer Vollnutation und entweder einer skewed X-Inaktivierung oder Mosaik weisen dasselbe Muster auf wie betroffene Frauen mit random X-Inaktivierung. Eine skewed X-Inaktivierung und Mosaike können durch quantitative Bewertung des Methylie- rungsverhältnisses der FMR-1-Promotor-Region mit dem des XIST- Gens und des FMR-1-Repeat-Bereichs identifiziert werden. Das Methylierungsverhältnis des XIST-Gens bleibt in allen Fällen 1:1, da jede Zelle weiterhin ein aktives und ein inaktives Chromosom enthält. Somit stellt das Methylierungsverhältnis des Abschnitts des weiteren Gens (XIST) einen Standard dar. Im Gegensatz dazu verschiebt sich das Methylierungsverhältnis der FMR-1-Promotor- Region und das des Repeat-Bereichs in Richtung Nicht-Methylierung bzw. Methylierung, je nachdem, ob das normale Chromosom oder das mit dem expandierten Allel eine skewed X-Inaktivierung aufweist. Ein ähnliches Muster kann bei Mosaik-Frauen mit einer normalen Zellpopulation und einer mit einer Vollmutation gesehen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der eingangs angeführten Art, wobei er Primer-Sets zur spezifischen Amplifizierung jeweils der methylierten und nicht- methylierten DNA-Variante einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder eines sicher physiologisch methylierten DNS- Bereichs des X-Chromosoms und/oder einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, umfasst. Mit diesem Kit kann das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden.
Vorzugsweise umfasst dieser Kit zusätzlich zu den Primer-Sets weitere notwendige Stoffe zur Durchführung einer MS-PCR: einen Stoff zur Umwandlung der methylierten bzw. nicht-methylierten Sequenz (z.B. Natriumbisulfit zur Umwandlung der nicht-methylierten Cytosin-Reste) , die notwendigen Enzyme, Puffer, etc. Auf diese Weise wird ein Kit zur Verfügung gestellt, so dass für die Durchführung des Verfahrens lediglich die zu testende DNA noch zugefügt werden muss . Mit Hilfe dieses Kits können in jedem Labor routinemäßige Diagnosen durchgeführt werden.
Besonders vorteilhaft läßt sich dieser Ki; zur Detektion und Evaluierung X-chromosomaler Erkrankungen einsetzen, wobei er Primer- Sets zur methylierungsspezifischen Amplifizierung einer DNS-Re- gion mit einem Repeat-Polymorphismus für die Bestimmung der polymorphen DNS-Region umfasst. Mit diesen Primer-Sets wird das Ausmaß der Methylierung und die Länge des Repeat-Polymorphismus bestimmt, um den Grad der Erkrankung und die Klonalität dieser zu testen. Diese chromosomalen Erkrankungen sind z.B.: FraX-A, FraX- E, FraX-F, X-chromosomale Retardierungen, Klonalität, etc.
Vorzugsweise umfasst der Kit Primer-Sets zur Amplifizierung einer polymorphen DNS-Region des CGG-Nukleotid-Repeat-Bereiches im ersten Exon des FMR-1-Gens. Da der Repeat-Bereich des FMR-1-Gens wie oben bereits beschrieben eine sichere und klare Aussage über den Krankheitsgrad des fragilen X-Syndroms bzw. die Klongröße gewährleistet, kann mit Hilfe dieses Kits ein rasches und sicheres Analyseverfahren zur Verfügung gestellt werden.
Weiters ist es günstig, wenn der Kit Primer-Sets zur Amplifizie- rung des XIST-Gens oder Teilen davon für die Bestimmung der sicher physiologisch methylierten DNS-Region umfasst. Wie oben bereits beschrieben, weist das XIST-Gen ein Methylierungsmuster auf, das reziprok zu dem des FMR-1-Gens ist. Das Methylierungsmuster im Ergebnis lässt eine genaue Interpretation bezüglich der Variante des fragilen X-Syndroms zu.
Weiters ist es von Vorteil, wenn der Kit Primer-Sets zur Amplifi- zierung des FMR-1-Gens oder eines Teils davon für die Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region umfasst. Günsti- gerweise umfasst der Kit Primer-Sets zur Amplifizierung des FMR- 1-Gen-Promotors oder eines Teiles davon. Damit kann das oben beschriebene bevorzugte Analyseverfahren durchgeführt werden.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Primer-Sets jeweils als Duplex-Sets, räumlich voneinander getrennt, vorgesehen sind. Auf diese Weise wird, wie oben beschrieben, sichergestellt, dass klare und leicht interpretierbare Ergebnisse erhalten werden.
Dabei ist es besonders günstig, wenn die Primer-Sets für die Am- plifizierung des sicher physiologisch methylierten DNS-Bereichs und der potentiell aberrant methylierten DNS-Region zusammen in einem Multiplex-Set oder 4-plex-Set vorgesehen sind. Auf diese Weise werden die Methylierungs-spezifischen PCR-Reaktionen zweier DNS-Regionen in einem Reaktionsgemisch gleichzeitig durchgeführt, wodurch das Verfahren zeitsparender wird. Dies ist möglich, da die beiden Gene (FMR-1 und XIST) unterschiedliche Sequenzen aufweisen, so dass sich die beiden PCR-Reaktionen nicht beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen sowie von Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, weiter erläutert, wobei
in Fig. 1 die Stellung der Primer für das FMR-1-Gen,
in Fig. 2 die jeweiligen Methylierungsmuster des FMR-1- und XIST- Gens sowie die Größe und Methylierung des Repeat-Bereichs sche- matisch,
in Fig. 3a und 3b Gelelektrophoresen zur Auftrennung der MS-PCR- Produkte,
in Fig. 4 die Ergebnisse einer Multiplex-PCR am HUMARA-Locus
in Fig. 5 und 6 die Ergebnisse von MS-PCR' s dargestellt sind.
B e i s p i e l 1 : DNA-Präparation
EDTA antikoagulierte, periphere Blutproben aus gesunden sowie an fragilem X-Syndrom erkrankten Patienten wurden bis zur DNA-Extraktion in 500 μl Aliquoten bei -20°C gelagert. Für die DNA-De- aminierung und anschließender MS-PCR-Analyse wurde DNA aus 80 μl Blut mit DNAzol™ (Vienna Lab, Vienna, Austria) extrahiert und in 30 μl sterilem Wasser resuspendiert.
0,5 μg DNA wurde gemäß den Protokollen von Zeschnigk et al . "A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader- Willi syndrom based on allelic methylation differences at the SNRPN locus." Eur. J. Hum. Genet. 5, 94-8 (1997); "Imprinted segments in the human geno e : different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. " Hum. Mol. Genet. 6, 387-95 (1997) deaminiert, wobei die Deaminierung bei 55°C zwei Stunden lang mit Zusatz von 8 μl Polyacrylträger, der die DNA-Präzipitation auf 10 min bei -20°C verkürzt, durchgeführt wird. Die deaminierte DNA wurde in 20 μl sterilem Wasser gelöst.
B e i s p i e l 2: Methylierungs-spezifische PCR
13 Primer wurden (s. SEQ. ID. r. 1-13) entsprechend der deami- nierten DNA-Sequenz der jeweiligen nicht-methylierten bzw. methylierten Genregionen synthethisiert (s. Tabelle 1 und Fig. 1).
Tabelle 1
Multiplex-PCR
t
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Multiplex-PCR
t
CTi
In einer Multiplex-PCR-Reaktionsmischung wurden zwei Vorwärts- Primer (PUF, PMF) , die spezifisch für unmethylierte und methylierte DNS sind, und ein gemeinsamer Rückwärts-Primer (P-R) , der spezifisch für den deaminierten, nicht-methylierten und methylierten FMR-1-Promotor ist, sowie zwei Vorwärts-Primer (XUF, XMF) und zwei Rückwärts-Primer (XUR, XMR) , die spezifisch für den deaminierten, nicht-methylierten und methylierten XIST-Promotor sind, zugesetzt. Der Duplex-PCR-Mix umfasst zwei Vorwärts-Primer (RUF, RMF) und zwei Rückwärts-Primer (RUR, RMR) , die spezifisch für den deaminierten, nicht-methylierten und methylierten Trip- let-Repeat-Bereich sind.
Ein zusätzliches Primer-Paar detektiert einen weiteren methylierten Se uenzabschnitt im FMR-1-Promotor (FMF, FMR) , kann jedoch nicht mit den anderen Primern kombiniert werden.
Für das Design dieser Primer wurde als zu amplifizierende Ziel- Sequenz die des antisense-Stranges des FMR-1-Genbereiches (Acc. Nr. L29074, L38501, U80460) verwendet, um die Schmelztemperatur von Tm=95°C auf Tm=75°C zu reduzieren.
Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 25 μl unter Öl durchgeführt, wobei jeweils 1 μl der 20 μl deaminierten DNA aus Patienten und Normalkontrollen verwendet wurde. Für die Multiplex-PCR wurde der Amplifikationspuffer F-511 (10 mM Tris, pH 8 , 8 , 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton-X-100 ; Finnzymes Oy, Espoo, Finnland) (DYN) verwendet; optimierter Puffer EXT (50 mM Tris, 15 mM NH4CI, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton-X-100 , pH 9,0) wurde für die Du- plex-Re-aktion mit 4% DMSO und 60 mM TMAC und für die FMP-Ampli- fikation ohne Verstärker (DMSO, TMAC) verwendet. Die dNTPs-Kon- zentrationen betrugen 200 μM jedes Nukleotids . In Tabelle 1 sind die optimalen Primer-Konzentrationen aufgelistet. Die Amplifika- tionen wurden auf einem Biometra TrioBlock (Biometra, Goettingen, Deutschland) durchgeführt und mit einer Einheit Dynazyme 501L (Finnzymes Oy, Espoo, Finnland) gestartet, mit einem ersten Dena- turierungsschritt bei 95 °C für 5 min. Die Multiplex-PCR-Profile waren 33 Zyklen 95°C/30 s [Programm 1], 60°C/20 s, 72°C/40 s [Programm 2]. Duplex und FMP-Profile betrugen 35 Zyklen bei 95°C/45 s, 63°C/1 min und 72°C/1 min. Abschließend wurde in allen Fällen bei 72 °C 7 min lang inkubiert. PCR-Produkte (5 μl) wurden auf in 0,5x TBE-Puffer (90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH 8,0) auf NOVEX-TBE-Gelen getrennt (Novex, San Diego, California, USA) . Die Banden wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr) detektiert. Densitometrische Analysen wurden mit KODAK-1D™2.0.2 Software package (Kodak, New Haven, CT, USA) durchgeführt.
Repeat-Einheiten im normalen und Prämutations-Bereich, aber keine Vollmutationen, konnten amplifiziert werden. Die Anzahl der Repeat-Einheiten konnte bei normalen Individuen und Prämutationsträgern aus der Länge der PCR-Produkte errechnet werden.
In Tabelle 2 sind die zu erwartenden Ergebnisse aufgelistet, wobei "-" kein PCR Produkt, "+" ein PCR Produkt und "2+" zwei Produkte mit unterschiedlichen Längen bedeuten. In Fig. 2 sind die zu erwartenden Ergebnisse schematisch dargestellt, wobei dieselbe Nummerierung wie in Tabelle 2 verwendet wird.
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Tabel l e 2
Ziel -Gen-SeQ enz Multiplex PCR Duplex PCR PCR-Produkt FMR1 XIST FMR1
Promotor Promotor Repeat
PU PM XU XM RU RM normale Männer
Männer mit Prämutation
Männer mit Vollmutation
Mosaik-Männer mit Vollmutation
Männer mit Deletion
Normale Frauen mit gleichen Re1:1 1:1 peat-Längen an beiden Allelen
normale Frauen mit ungleichen 1:1 1:1 2+ 2+ Repeat-Längen an beiden Allelen
Frauen mit Prämutation 1:1 1:1 2+ 2+
Frauen mit Vollmutation 1:3 1:1
Frauen mit Vollmutation und ei(>)1:3 1:1 V ner erhöhten Menge an Zellen mit aktiven normalen Allelen
Frauen mit Vollmutation und ei(<)1:3 1:1 ner erhöhten Menge an Zellen mit aktiven betroffenen Allelen
Mosaik-Frauen mit Prämutation (>)1:3 Δ V oder 1:1 oder
(<)1:3 V Δ Δ V
Mosaik-Frauen mit Vollmutation (>)1:3 oder oder 1:1
(<)1:3 V Δ (1) Normale männliche Individuen zeigen einen nicht-methylierten Repeat-Bereich von bis zu (48-) 54 Triplets sowie einen nicht-methylierten FMR-1-Promotor .
(2) Männliche Patienten mit einer Prämutation zeigen dasselbe Muster, aber mit etwa (48-) 54 bis 200 Repeat-Einheiten.
(3) Männliche Patienten mit einer Vollmutation weisen im Ergebnis einen methylierten Repeat-Bereich mit über 200 Triplets
(wird in der MS-PCR meist nicht amplifiziert ) sowie einen methylierten FMR-1-Promotor auf.
(4) Männliche Patienten mit Mosaik Vollmutation/Prämutation zeigen einen methylierten Repeat-Bereich mit über 200 Einheiten wird nicht amplifiziert) sowie einen nicht-methylierten Repeat-Bereich von (48-) 54 bis 200 Einheiten, zudem einen nicht-methylierten und einen methylierten FMR-1-Promotor . Anhand des Nachweises des spezifischen Produktes des XIST- Gens, kann in allen Fällen zwischen weiblichen und männlichen Patienten eindeutig unterschieden werden.
(5) Bei Deletionen im zu amplifizierenden Bereich des FMR-1-Gens ist lediglich das methylierte PCR-Produkt des XIST-Gen-Pro- motors sichtbar.
(6) Bei normalen homozygoten Frauen ist das Verhältnis von nicht- methyliertem zu methyliertem FMR-1-Promotor und jenes des XIST-Gen-Promotors etwa 1:1. Da beide Homologe idente Repeat- Bereich-Längen aufweisen, ist lediglich jeweils ein nicht-me- thylierter und ein methylierter FMR-1-Repeat-Bereich sichtbar.
(7) Bei heterozygoten Frauen, die unterschiedliche Repeat-Be- reich-Längen aufweisen, ist dasselbe Muster wie oben beschrieben zu sehen, lediglich sind zwei nicht-methylierte und zwei methylierte FMR-1-Repeat-Bereiche mit unterschiedlichen Längen zu sehen.
(8) Frauen mit einer Prämutation weisen ein ähnliches Muster auf wie heterozygote Frauen, mit dem Unterschied, dass ein methylierter und ein nicht-methylierter FMR-1-Repeat-Bereich eine Länge zwischen (48-) 54 bis 200 Einheiten aufweist.
(9) Frauen mit einer Vollmutation weisen immer einen methylierten FMR-1-Promotor am expandierten Allel auf, unabhängig davon, ob dieser am aktiven oder inaktiven Chromosom liegt. Im Fall einer random-X-Inaktivierung beträgt das Methylierungsverhältnis des FMR-1-Promotors 1:3 (Nicht-Methylierung :Methylie- rung) , während das Methylierungsverhältnis des XIST-Gen-Pro- motors weiterhin 1:1 beträgt. (10) -(13) Frauen mit einer Vollmutation und entweder einer skewed X-Inaktivierung oder Mosaik weisen dasselbe Muster auf wie betroffene Frauen mit random-X-lnaktivierung, wobei jedoch das Methylierungsverhältnis im FMR-1-Gen in die eine oder andere Richtung verschoben ist. Eine skewed X-Inaktivierung und Mosaik können durch semi-quantitativen Vergleich des Methylierungsverhältnisses des FMR-1-Promotors und des FMR-1-Repeat-Bereichs mit dem des Gen-Abschnitts des XIST- Gens identifiziert werden. Das Methylierungsverhältnis des XIST-Gens bleibt 1:1 in allen Fällen, da jede Zelle weiterhin 1 aktives und 1 inaktives Chromosom trägt. Im Gegensatz dazu verschiebt sich das Methylierungsverhältnis des FMR-1- Promotors und das des Repeat-Bereichs in Richtung Nicht- Methylierung bzw. Methylierung, je nachdem ob das normale Chromosom oder das mit dem expandierten Allel eine skewed X-Inaktivierung aufweist. Ein ähnliches Muster kann bei Mosaik-Frauen mit einer normalen Zellpopulation und einer mit einer Vollmutation gesehen werden.
Somit können alle möglichen Varianten zur Diagnostik des fragi- len-X-Syndroms und ähnlicher Erkrankungen wie FraX-E, FraX-F, und andere X-chromosomale Erkrankungen aber auch Klonalität und X- Aneuploidien festgestellt werden.
In Fig. 3a und 3b sind Gelelektrophoresen der MS-PCR-Produkte dargestellt, wobei Fig. 3a die Produkte der Multiplex-Reaktion (FMR-1-Promotor, XIST-Promotor) und Fig. 3b die Produkte der Du- plex-Reaktion (FMRl-Repeat-Expansion) zeigt, wobei dieselbe Num- merierung wie in Tabelle 2 verwendet wird, und n die Anzahl der Repeat-Einheiten bedeutet.
(1) Normaler männlicher Patient (n = 34);
(2) Männlicher Patient mit Prämutation (n = 130);
(3) Männlicher Patient mit Vollmutation (n > 200);
(4) Männlicher Patient mit Mosaik-Vollmutation (n > 200 und n = 100) ;
(5) Männlicher Patient mit einer Deletion im FMRl-Gen-Promotor sowie im Repeat-Bereich; (6) Normale homozygote Frau (n = 33);
(7) Normale heterozygote Frau (n = 23+30);
(8) Frau mit Prämutation (n = 33+66);
(9) Frau mit Vollmutation (n > 200 + n = 23);
(10) Frau mit einer Vollmutatation und einer erhöhten Anzahl von Zellen mit einem normalen Allel auf Grund einer skewed X-Inaktivierung (n > 200 und n = 30) ; erhöhte Menge des RU-Produktes) ;
(11) Frau mit erhöhter Menge von Zellen mit einer Vollmutation auf Grund einer skewed X-Inaktivierung (n > 200 und n = 46; erhöhte Menge des RM-Produktes) ;
(12) Negativkontrolle (native Plazenta-DNA, die vor der Ampli- fikation nicht deaminiert wurde) ;
(s) Größenstandard.
Tabelle 3 stellt die Ergebnisse einer densitometrischen Analyse der Multiplex-PCR-Produkte von weiblichen Patienten dar. Es werden die Netto-Intensitäten, die berechneten Verhältnisse von nicht-methylierten und methylierten Produkten sowie das standardisierte Verhältnis, basierend auf dem intergenen XIST-Standard- verhältnis (XM pro XU) gezeigt, wobei die Spalten gemäß Fig. 1 und 3 nummeriert sind. Das Verhältnis von nicht-methylierten und methylierten XIST-Produkten, spezifisch für das inaktive bzw. aktive X-Chromosom, blieb innerhalb aller weiblichen Proben stabil (Mittelwert (XM/XU) = 1,033 ± 0,21). In betroffenen Frauen (9 und 11) waren die Verhältnisse der FMRl-Methylierung basierend auf dem XIST-Standardverhältnis außerhalb des 95 %-Vertrauensberei- ches (Verhältnis (PU/PM) / (XM/XU) = 0,32 ± 0,06). Im Fall einer skewed X-Inaktivierung, die das Vollmutations-Allel bevorzugt (Spalte 10) verbleibt das Verhältnis im normalen Bereich und es wurde auf Grund der verschiedenen Banden-Intensitäten der RU- und RM-Produkte, spezifisch für betroffene Frauen, diagnostiziert, dass der Patient am fragilen X-Syndrom erkrankt war (Spalte 10, s. auch Fig. 3, unten) .
B e i s p i e l 3 : Evaluierung der Klonalität am Humara-Gen-
Locuε
Zur Detektion einer skewed X-Inaktivierung wurde eine PCR zur Amplifikation einer Sequenz im Humara-Locus (Human Androgen Re- ceptor) durchgeführt. Es wurden drei Primer verwendet:
hum-A (um) : SEQ. ID.Nr. 18 hum-B2 (m) : SEQ. ID. r. 19 hum-C (com) SEQ. ID.Nr. 20,
wobei hum-A mit der nicht-methylierten Sequenz hybridisiert, hum- B2 mit der methylierten Sequenz und hum-C hybridisiert in beiden Fällen. Pro Ansatz werden 25 μl hum-A [20 pmol/μl], 37,5 μl hum-B2 [20 pmol/μl], 50 μl hum-C [20 pmol/μl], 672 μl AD, 100 μl DYN und 100 μl dNTP's [2 M] eingesetzt. Die PCR-Profile waren 33 Zyklen 95°C/20 ε, 54°C/40 s, 72°C/40 s [Programm 3].
Tabelle 4 stellt die Ergebnisse einer dens...tometrischen Analyse der Multiplex PCR-Produkte dar, wobei die Ergebnisse im Gel, dargestellt in Fig. 4, ersichtlich sind. Die Nummerierung der Banden im Gel von Fig. 4 entspricht der Nummerierung der Spalten in Tabelle 4. Die Netto-Intensitäten werden aus den Verhältnissen von nicht-methylierten und methylierten Produkten berechnet, wobei der Mittelwert (A + A')/2 umso mehr von 0,5 abweicht (d.h. 50% der Gesamtzellpopulation), je stärker geskewed ist. Patienten 15, 16 und 19 weisen ein starkes Skewing auf.
Somit ist ersichtlich, dass in einer Multiplex-Reaktion die Stärke des Skewings und somit das Ausmaß der Klonalität im Patienten mit Kilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens genau evaluiert werden kann.
B e i s p i e l 4 : Detektion von FraX-A, FraX-E und FraX-F-
Patienten in einer MS-PCR-Reaktion
Es werden Multiplex-MS-PCR' s an Patienten durchgeführt, um in einer einzigen Reaktion Vorkommen und Ausmaß einer eventuell aber- ranten Methylierung der Promotorregion von FraX-A, FraX-E und FraX-F zu detektieren und evaluieren. In Tabelle 5 sind die verwendeten Primer [20 pmol/μl], die Mengen der für die MS-PCR' s verwendeten Substanzen und die zu erwartenden Produktgrößen angegeben, wobei die Konzentration der d TPs 2 mM beträgt. In Fig. 5 ist das Ergebnis (in Form einer Abbildung des Gels) dieser Multiplex-MS-PCR' s [Programm 1] gezeigt, wobei A jeweils der Größen- Standard, B normale Frauen, C normale Männer, D männliche Patienten mit FraX-E-Erkrankung und E native nicht deaminierte DNA, ist. Es ist ersichtlich, dass im Vergleich zu normalen Männern die erkrankten männlichen Patienten eine Bande von der Größenordnung 248 bp zeigen, jedoch keine FraX-F-Banden (191 bp) auftreten. Alle Patienten zeigen die Kontrolle (nicht-methylierter Promotor, PU) .
Tabelle 5
Im Falle der Frauen wird die Netto-Intensität der Banden im Gel gemessen, wobei die Stärke der einzelnen Banden zueinander auf das Ausmaß der Erkrankung rückschließen lässt. Ist beispielsweise eine der für den methylierten Promotor spezifischen Banden (PM, FraX-E AB, FraX-F AB) gegenüber der anderen Bande im Verhältnis von 3:2 verstärkt, ist dies ein Anzeichen für eine Erkrankung. Im vorliegenden Gel in Fig. 5 weisen alle Frauen ein Verhältnis von 2:2 auf, woraus ersichtlich ist, dass diese Frauen gesund sind (weder an FraX-A, FraX-E noch FraX-F erkrankt) .
B e i s p i e l 5 : Kombination einer Duplex-PCR mit einem potentiell methylierten DNA-Bereich
Es wird eine PCR [Programm 2] zur Amplifikation der polymorphen Genregion (im vorliegenden Fall der FX-Repeat (RU, RM) ) zusammen mit der potentiell aberrant methylierten Gen-Region (im Beispiel der methylierte FMR-1 Promotor (FX-JK) ) durchgeführt. Durch Bewertung des Bandenmusters und der Bandenintensitäten kann, wie in Tabelle 6 dargestellt, auf eine Erkrankung geschlossen werden sowie gegebenenfalls das Ausmaß der Erkrankung bestimmt werden.
In Tabelle 6 sind die verschiedenen Konstellationen gezeigt, wobei "XY" männliche und "XX" weibliche Patienten darstellen.
Tabelle 6
PCR-Produkt normal XY Prämut . XY Vollmut. XY normale XX Prämut. XX Vollmut. XX methylierter Prαmotor:FX-JK - - 1 2 2 3 methylierter Repeat : RM - - -d) 2 oder 2x1 1 (2x1) 1 (2x1) unmethylierter Repeat: RU 1 1 - 2 oder 2x1 1 (2x1) 1
In Tabelle 7 sind die verwendeten Primer und die zu erwartenden PCR Produkte angegeben.
Tabelle 7: Primerkonzentrationen (20 pmol/μl)
FX-K: 5 ' -GGAAGTGAAATCGAAACGGAGTTGAGC-3 ' (SEQ ID NO 21) FX-J: 5 ' -AACGTTCTAACCCTCGCGAAACAATACG-3 ' (SEQ ID NO 22)
In Fig. 6 ist die Auftrennung der PCR Produkte gezeigt, wobei S der Standard ist, 21 ein normaler Mann, 22 ein männlicher Patient mit Prämutation, 23 ein männlicher Patient mit Vollmutation, 24 eine normale Frau (homozygoter Repeat) , 25 eine normale Frau (heterozygoter Repeat) , 26 eine weibliche Patientin mit Prämutation, 27 eine weibliche Patientin mit Vollmutation, 28 als negative Kontrolle native nicht deaminierte DNA.
Bei einem normalen Mann wird lediglich der nicht-methylierte Repeat amplifiziert . Bei einem männlichen Patienten mit einer Prämutation wird ebenfalls der nicht-methylierte expandierte Repeat amplifiziert . Bei einem männlichen Patienten mit Vollmutation wird der methylierte Promotor amplifiziert und gegebenenfalls der methylierte Repeat (wie bereits erwähnt, wird der Repeat nicht amplifiziert, wenn dieser eine bestimmte Größe überschreitet) .
Normale Frauen weisen ein Intensitäts-Verhältnis von 2 : 2 : 2 (methylierter Promotor : methylierter Repeat : unmethylierter Repeat) auf, wobei homozygote Frauen zwei gleiche Allele (gleiche Repeat-Zahl) , heterozygote Frauen jedoch unterschiedliche Repe- atlängen aufweisen, so dass zwei verschiedene Allele mit unterschiedlichen Repeatlängen (2 x 1) zu sehen sind.
Frauen mit Prämutation weisen ein Verhältnis von 2 : 1 : 1 auf (der expandierte Repeat kann ab einer bestimmten Größe nicht amplifiziert werden bzw. wenn dieser jedoch amplifiziert wird, so sind der normale und der expandierte Repeat zu sehen) .
Frauen mit Vollmutation weisen ein Verhältnis von 3 : 1 : 1 auf (Bislang konnte ein expandierter, methylierter Vollmutations-Re- peat nicht amplifiziert werden) .
Es ist ersichtlich, dass diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine genaue Evaluierung des Krankheitsbildes gewährleistet, sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Patienten.
SEQUENZPROTOKOLL
<110> St. Anna-Kinderspital
<120> Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom
<130> FMR1
<140> <141>
<160> 22
<170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 1 gtgtttgatt gaggttgaat ttttg 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 2 atttaatttc ccacrccact aaatacac 28
<210> 3 <211> 27
<212> DNA
<213 > Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 3 gttgcgggtg taaatattga aattacg 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 4 aattaaagta ggtattcgcg gtttcg 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 5 tttttcctta acccatcgaa atatcg 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer <400> 6 aaaagtggtt gttattttag atttgtt 27
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 7 ctacctccca atacaacaat cacac 25
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 8 tttgagaggt gggttgtggg tgtttgagg 29
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 9 aacaccacta ccaaaaaaca tacaacaaca caac 34
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 10 ccgcctctaa acgaacgacg aaccgacgac 30
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 11 tttcgagagg tgggttgcgg gcgttcgag 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 12 cgtcgtcggt tcgtcgttcg tttagaggc 29
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 13 ccgaccgatt cccaacaacg cgcatacg 28 <210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 14 ttcgtcgtcg ttgtcgtcgt c 21
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 15 aactaaaaat atccgaaccg catcgac 27
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 16 agttcgtagc gcggattttc g 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer <400> 17 aacgtaaacg cgactaacgc taacg 25
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Primer
<400> 18 aatttgtttt agagtgtgtg tg 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 19 gcgagcgtag tatttttcgg c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz . Primer
<400> 20 ctactaccta aaactaatct c 21
<210> 21 <211> 27 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 21 ggaagtgaaa tcgaaacgga gttgagc 27
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 22 aacgttctaa ccctcgcgaa acaatacg 28

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom oder der Klonalität, dadurch gekennzeichnet, dass a) entweder in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder das Ausmaß der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration diagnostiziert wird, oder b) in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder das Ausmaß der Methylierung sowie gegebenenfalls die Sequenzvariante einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen und gegebenenfalls der Sequenzvariante das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration oder der Klonalität diagnostiziert wird, oder c) in einer Probe das Ausmaß der Methylierung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region, das Ausmaß der Methylierung in einem sicher physiologisch methylierten DNS-Bereich des X-Chromosoms, und das Ausmaß der Methylierung sowie die Sequenzvariante einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, bestimmt wird und anschließend aus dem Vergleich der Methylierungsbestimmungen und der Sequenzvariante das Vorhandensein und gegebenenfalls die Variante und das Ausmaß der potentiellen Aberration diagnostiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Ausmaßes der Methylierung sowie gegebenenfalls die Bestimmung der Sequenzvariante mittels einer Methylierungs-spe- zifischen PCR (MS-PCR) durchgeführt wird, wobei Primer verwendet werden, mit welchen eine methylierte bzw. nicht-methylierte DNS- Region jeweils Methylierungs-spezifisch aπplifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die MS-PCRs an einem antisense-Strang bzw. an antisense-Strängen durchgeführt wird bzw. werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die MS-PCRs in Duplex-Reaktionen durchgeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die MS-PCR für die Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region und die MS-PCR für die Bestimmung des sicher physiologisch methylierten DNS-Bereichs in einer gemeinsamen Multiplex-Reaktion durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die polymorphe DNS-Region eine DNS-Region mit einem Repeat-Polymorphismus ist, die vorzugsweise mit der potentiell aberrant methylierten DNS-Region in Zusammenhang steht, wobei als Sequenzvariante die Länge des Repeat-Bereiches bestimmt wird, und anschließend sowohl das Vorhandensein als auch das Ausmaß der potentiellen Aberration bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die polymorphe DNS-Region der CGG-Trinukleotid- Repeat-Bereich des FMR-1-Gens ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die polymorphe DNS-Region im ersten untranslatierten Exon des FMR-1- Gens ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiell aberrant methylierte DNS-Region das FMR-1-Gen oder ein Teil davon ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiell aberrant methylierte DNS-Region der 5 ' -untranslatierte Bereich des FMRl-Gens, d.h. der FMR-1-Promo- tor, oder ein Teil davon ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine DNS-Region ist, die am aktiven X-Chromosom sicher methyliert ist .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine Region ist, die das XIST-Gen oder Teile davon umfasst.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass die sicher physiologisch methylierte DNS-Region eine Region im XIST-Gen-Promotor ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiell aberrant methylierte DNS-Region und die polymorphe DNS-Region zwei einander nicht überlappende Sequenzen sind.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig zwei oder mehr potentiell aberrant methylierte DNS-Regionen am X-Chromosom detektiert und evaluiert werden.
16. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Detektion und Evaluierung von X-chromosomalen Erkrankungen.
17. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es insbesondere zur Detektion und Evaluierung des FraX-A-, FraX-E-, Fr X-F-Syndroms, der Klonalität und X-Aneu- ploidien verwendet wird.
18. Kit zur Detektion und Evaluierung einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region am X-Chromosom gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer-Sets zur spezifischen Amplifizierung jeweils der methylierten und nicht-methylierten DNA-Variante einer potentiell aberrant methylierten DNS-Region und/oder eines sicher physiologisch methylierten DNS-Bereichs des X-Chromosoms und/oder einer polymorphen DNS-Region des X-Chromosoms, die entweder physiologisch oder aberrant methyliert sein kann, umfasst.
19. Kit nach Anspruch 18 zur Detektion und Evaluierung X-chro- mosomaler Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer- Sets zur Methylierungs-spezifischen Amplifizierung einer DNS-Region mit einem Repeat-Polymorphismus für die Bestimmung der polymorphen DNS-Region umfasst.
20. Kit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer-Sets zur Amplifizierung einer polymorphen DNS-Region des CGG-Nukleotid-Repeat-Bereichs im ersten Exon des FMR-1-Gens umfasst .
21. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer-Sets zur Amplifizierung des XIST-Gens oder von Teilen davon für die Bestimmung der sicher physiologisch methylierten DNS-Region umfasst.
22. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer-Sets zur Amplifizierung des FMR-1-Gens oder eines Teils davon für die Bestimmung der potentiell aberrant methylierten DNS-Region umfasst.
23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass er Primer- Sets zur Amplifizierung des FMR-1-Gen-Promotors oder eines Teils davon umfasst.
24. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer-Sets jeweils als Duplex-Sets räumlich voneinander getrennt vorgesehen sind.
25. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer-Sets für die Amplifizierung des sicher physiologisch methylierten DNS-Bereichs und der potentiell aberrant methylierten DNS-Region zusammen in einem Multiplex-Set oder 4- plex-Set vorgesehen sind.
EP00984601A 1999-12-03 2000-12-04 Verfahren zur detektion und evaluierung einer potentiell aberrant methylierten dns-region am x-chromosom oder der klonalität Withdrawn EP1238108A2 (de)

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CN108715869A (zh) * 2018-06-01 2018-10-30 华南农业大学 一种基于获取特定供体细胞提高哺乳动物克隆效率的方法

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