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EP1216060A2 - Magnetische nanoteilchen mit biochemischer wirksamkeit und verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung - Google Patents

Magnetische nanoteilchen mit biochemischer wirksamkeit und verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung

Info

Publication number
EP1216060A2
EP1216060A2 EP00979466A EP00979466A EP1216060A2 EP 1216060 A2 EP1216060 A2 EP 1216060A2 EP 00979466 A EP00979466 A EP 00979466A EP 00979466 A EP00979466 A EP 00979466A EP 1216060 A2 EP1216060 A2 EP 1216060A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
derivatives
acids
magnetic nanoparticles
magnetic
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00979466A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael K. Bahr
Dimitri Berkov
Norbert Buske
Joachim Clement
Peter GÖRNERT
Klaus HÖFFKEN
Kay-Oliver Kliche
Thomas Kober
Matthias Schnabelrauch
Sebastian Vogt
Kerstin Wagner
Christian Gansau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomedical Apherese Systeme GmbH
Original Assignee
Biomedical Apherese Systeme GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomedical Apherese Systeme GmbH filed Critical Biomedical Apherese Systeme GmbH
Publication of EP1216060A2 publication Critical patent/EP1216060A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated
    • Y10T428/2998—Coated including synthetic resin or polymer

Definitions

  • the invention relates to magnetic nanotubes, their production and their
  • Cancer is one of the most common causes of death. More and more people are dying in particular from lung, breast and prostate cancer.
  • combating cancer is currently one of the primary goals of medicine.
  • chemotherapy with its known side-effect profile is one of the usual treatment methods for combating metastatic tumors, since the drugs also damage healthy cells due to their unspecific effect, and that in the sensitive areas of the entire body.
  • New therapeutic approaches use, among other things, immune reactions by activating the body's own defenses through messenger substances or cytokines and by destroying the tumor cells on the other hand by protein molecules and / or monoclonal antibodies.
  • New developments in the field of tumor cell separation already use particles with a magnetic core that have been modified with biologically active enveloping substances. So-called “drug targeting" with substances coupled to magnetic microspheres such as doxorubicin or other cytostatics are in development.
  • microbeads and "dynabeads”, which are also known, are already used for diagnostic procedures in that the magnetic microspheres are adsorbed onto the cell membrane of malignant cells as a result of biological interaction and then magnetically separated. Since the surface structure of the cell membrane is generally non-specific, the separation rates are less than 80%. As a result, there is a risk that many cancer cells have not been separated. These can continue to form metastases.
  • the separation for the purpose of diagnosis takes place exclusively extracorporeally, i.e. the liquid with the cells to be separated is treated in a suitable vessel outside the human body. After the separation, the now cleaned liquid can be returned to the human body.
  • DE 41 16 093 AI is a process for the production of magnetic carriers by controlled modification the surface of magnetic particles.
  • magnetic particles are described which are also capable of forming magnetic liquids, which are characterized in that they carry heteropoly anions and saturated or unsaturated surface-active agents.
  • This surface modification is intended to enable biologically active molecules, including antibodies, to be bound to the surface of the particles.
  • the biologically active molecules are bound to polythiols via thio bridges.
  • dicarboxylic acids and hydroxycarboxylic acids and dimercaptosuccinic acid are used as linker substances. These compounds are able to bind to the magnetic particle due to an iron complexing group.
  • DE 196 24 426 AI describes magnetic liquids for the transport of diagnostically or therapeutically active substances.
  • the magnetic core particles are encased with polymers that have reactive groups that are capable of covalent bonding or ion exchange. New or additional functional groups can be applied or activated to this absolutely biocompatible shell, which can consist, among other things, of dextran.
  • the drug bound to the magnetic particle in the manner described should be administrable intravenously and by means of a magnetic high gradient field in the area of a target area such.
  • the particle size of which is specified as 200-500 nm. Due to the size of the particles, penetration of the particles into intracellular spaces is also not possible here. A specific binding to intracellular biomacromolecules is also not possible with these particles.
  • the object of the invention is to provide nanotubes which can specifically bind to intracellular biomacromolecules in the intracellular area of cells, so that separation is possible by the action of an external magnetic field.
  • the magnetic nanoparticles according to the invention are advantageously able to penetrate through the cell membranes into intracellular spaces and there to interact with intracellular biomacromolecules.
  • the magnetic nanoparticles are made of ferromagnetic or ferromagnetic material and are biologically active and / or therapeutically effective cladding layers. They are able, on the one hand, to penetrate the cell membrane of the cells and, on the other hand, to dock in the intracellular area of malignant cells with high specificity on the target located there.
  • the size of the nanoparticles according to the invention is generally 2 to 100 nm.
  • the nanoparticles have excellent properties with regard to the ability to penetrate the cell membrane and their better tolerance to the body. Although they have a relatively low magnetic moment due to the small volume, the intracellular particle agglomeration leads to an increase in concentration due to the binding to the intracellular target biomacromolecules, with an increase in the magnetic moment of the malignant cells to be separated, which favors the magnetic separation.
  • Typical core materials of the nanoparticles according to the invention are ferrites of the general composition MeO x Fe 2 0 3 , where Me is a divalent metal, such as Co, Mn or Fe.
  • Other suitable materials are ⁇ -Fe 2 0 3 , pure metals Co, Fe, Ni and metal compounds, such as carbides and nitrides. Since the magnetic moment of cobalt and iron is up to four times higher than that of ferrite, these substances can be separated more effectively with the same particle size and the same magnetic fields. However, it should be borne in mind that the biocompatibility of these materials is lower. This can be an advantage if it causes additional damage to, for example, malignant cells. On the other hand, the exposure time and concentration of these substances in healthy cells must be limited. The interplay of biochemical, medical and physical properties requires the production of tailor-made magnetic core materials and cladding layers.
  • the magnetic nanoparticles enable penetration of the cell membranes and interaction of the magnetic nanoparticles with intracellular target biomacromolecules. For this it is necessary to distribute the magnetic nanoparticles homogeneously in body fluids, because aggregated nanoparticles are not able to penetrate the cell membrane. Among other things, this requires a sufficiently thick covering layer, which must be at least in the order of the radius of the cores, and a good biocompatibility of the components of the covering layer. Charge carriers in the shell material, that is, a higher zeta potential, can also have a favorable effect on the dispersibility in the body fluid.
  • a particularly favorable application form of the magnetic nanoparticles is a dispersion according to claim 9.
  • a homogeneous distribution of the magnetic nanoparticles according to the invention can be promoted by setting a low concentration of the nanoparticle dispersions.
  • higher concentrations occur in the interior of the cell if the nanoparticles are concentrated in the intracellular area of cells by specific adsorption on target biomacromolecules. Particle agglomeration inside the cell is advantageous.
  • the increase in concentration of magnetic nanoparticles increases the magnetic moment in the cell to be separated.
  • the formation of the magnetic core particles takes place in either the aqueous or organic phase via seed / crystal growth processes.
  • Manufacturing in the aqueous phase using chemical precipitation methods has several advantages. Firstly, the unmodified magnetic particles form in a first stage. These can be given both positive and negative charge signs via pH settings.
  • the shell molecules are only adsorbed in a second stage. The adsorption effectiveness depends on the charge sign on the surface of the magnetic core particles. The rule applies that shell molecules with negatively charged molecule particles preferentially adsorb onto core surfaces with a positive charge sign.
  • An ionic chemical reaction usually takes place, e.g. between carboxyl compounds and amino compounds. This has the advantage that the adsorbed enveloping molecules completely cover the core surface and are firmly anchored to it.
  • Ferromagnetic metal core particles are mainly produced by thermolysis of the metal carbonyls in the organic phase.
  • soluble surfactants or polymers are added, which serve for stabilization.
  • core particles that are in the organic phase are homogeneously distributed.
  • the core particles are transferred into an aqueous carrier liquid. If the coating contains modified amino acids, the core particles are transferred after the organic solvent has been largely removed by adding an alkaline aqueous carrier liquid. The coating layer is converted into the water-soluble salt of the amino acid, which causes the magnetic core particles to be dispersed.
  • the magnetic nanoparticles can then be produced via further reactions.
  • the magnetic nanoparticles contain a compound of the general formula M - S - L - Z (I), the linking sites between S and L and L and Z having covalently bonded functional groups, and
  • M is the magnetic core particle
  • S is a biocompatible substrate attached to M
  • L is a linker group
  • the magnetic core particles consist of magnetite, maghemite, ferrites of the general formula MeO x Fe 2 0 3 , where Me is a divalent metal, such as cobalt, manganese, iron, or cobalt, iron, nickel, iron carbide or iron nitride.
  • Me is a divalent metal, such as cobalt, manganese, iron, or cobalt, iron, nickel, iron carbide or iron nitride.
  • the size of the core particles is 2-100 nm.
  • the substrate S is in one embodiment of the invention by the compounds such as poly- or oligosaccharides or their derivatives such as dextran, carboxymethyl dextran, starch, dialdehyde starch, chitin, alginates, cellulose, carboxymethyl cellulose, proteins or their derivatives such as albumins , Peptides, synthetic polymers such as polyethylene glycols, polyvinylpyrrolidone, polyethyleneimine, polymethacrylates, bifunctional carboxylic acids and their derivatives such as mercapto-succinic acid or hydroxycarboxylic acids.
  • the compounds such as poly- or oligosaccharides or their derivatives such as dextran, carboxymethyl dextran, starch, dialdehyde starch, chitin, alginates, cellulose, carboxymethyl cellulose, proteins or their derivatives such as albumins , Peptides, synthetic polymers such as polyethylene glycols, polyvinylpyrrolidone, polyethyleneimine,
  • the linker group L is converted by reacting a compound such as poly- and dicarboxylic acids, polyhydroxycarboxylic acids, diamines, amino acids, peptides, proteins, lipids, lipoproteins, glycoproteins, lectins, oligosaccharides, polysaccharides, oligonucleotides and their alkylated derivatives and Nucleic acids (DNA, RNA, PNA) and their alkylated derivatives, either single-stranded or double-stranded, which contain at least two identical or different functional groups, are formed.
  • a compound such as poly- and dicarboxylic acids, polyhydroxycarboxylic acids, diamines, amino acids, peptides, proteins, lipids, lipoproteins, glycoproteins, lectins, oligosaccharides, polysaccharides, oligonucleotides and their alkylated derivatives and Nucleic acids (DNA, RNA, PNA) and their alkylated derivatives
  • the functional groups are provided by way of example, which can be used according to the invention as linking groups for the substrate S, for the linker grouping L and the grouping Z. It is essential that the compound (I) is characterized by covalent bonds.
  • the biochemically active compound of the general formula S - L - Z (II) is excellently suitable for producing the magnetic nanoparticles according to the invention.
  • the magnetic nanoparticles are produced in stages.
  • the magnetic core particles are produced in a manner known per se and, in a preferred variant, are reacted directly with the biochemically active compound (II).
  • the magnetic core particles according to the invention are produced by the following method: a. Production of the magnetic core particles in a manner known per se, b. Implementation of the magnetic core particles with the biocompatible substrate S and c. Reacting the resulting compound M - S with a compound L - Z, whereby for the production of L - Z a compound such as poly- and dicarboxylic acids, polyhydroxycarboxylic acids, diamines, amino acids, peptides, proteins, lipids, lipoproteins, glycoproteins, lectins, oligosaccharides, poly - Saccharide, oligonucleotides and their alkylated derivatives and nucleic acids (DNA, RNA, PNA) and their alkylated derivatives, either single-stranded or double-stranded, which contains at least two identical or different functional groups, with nucleic acids, peptides and / or proteins or their derivatives which have at least one functional group and which contain at least
  • the procedure is such that only the compound L - Z is produced and then L - Z is reacted with the substrate S.
  • the nanoparticles according to the invention can be used for separating cells, for separating malignant cells and for separating intracellular biomacromolecules.
  • the fusion regions of chromosomes serve as molecular markers as points of attack for an interaction with intracellular biomacromolecules. That can e.g. B. Molecular markers typical of the disease.
  • these fusion regions can lead to fusion genes which produce fusion messenger ribonucleic acids (fusion mRNA) and fusion proteins.
  • fusion mRNA fusion messenger ribonucleic acids
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • a chromosomal reorganization t (9; 22) (q34; qll) occurs, the so-called Philadelphia chromosome, which leads to the BCR / ABL gene product.
  • Philadelphia chromosome the so-called Philadelphia chromosome
  • This gene is rewritten into messenger ribonucleic acid (mRNA) and leads to the synthesis of the BCR / ABL protein.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • the BCR / ABL mRNA and the BCR / ABL protein only occur in the tumor cells.
  • BCR / ABL mRNA can be considered as the binding domain for the magnetic nanoparticles.
  • the Z grouping of the magnetic nanoparticles according to the invention is intended to interact with the complementary sequence on the mRNA by means of nucleic acid-nucleic acid interaction, the BCR / ABL fusion site having to be contained in this sequence.
  • the individual-specific sequence around the fusion site has previously been determined by laboratory methods. The interaction is said to take place in the cytoplasm of the tumor cells.
  • ALL Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) t (9; 22) (q34; qll) (BCR / ABL) t (1; 19) (q23; pl3) (E2A / PBX) t (8; 14) (q24; q32) t (2; 8) (pll; q24) t (8; 22) (q24; qll) (MYC, IGH,
  • AML Acute Myeloid Leukemia
  • AML t (8; 21) (q22; q22) (AML / ETO) t (15; 17) (q21; qll) (PML / RARA) invl6 (pl3q22) t (16, -16) ( pl3; q22)
  • Non-Hodgkin lymphomas t (14, -18) (q32, q21) (BCL2 / IGH) t (8, -14) (q24, -q32) t (2, 8) (pll; q24) t (8, - 22) (q24; qll)
  • the invention has several advantages. First of all, it has been shown that the magnetic nanoparticles according to the invention have high biocompatibility in corresponding cell culture studies. This enables a safe application, and a purely extracorporeal use of the particles is also conceivable in the context of the applications according to the invention.
  • the magnetic nanoparticles according to the invention offer decisive advantages. With them it is possible to penetrate into the interior of the cells, the so-called cytoplasm, and specifically to bind biomacromolecules with corresponding structures such as binding domains of nucleic acids.
  • Proteins produced after appropriate translation are also envisaged as target biomacromolecules for specific binding to the group Z of the general formula (I).
  • group Z of the general formula (I) Proteins produced after appropriate translation are also envisaged as target biomacromolecules for specific binding to the group Z of the general formula (I).
  • all malignant diseases have a changed genome in the cell as the basis. This molecular basis has already been defined for a number of diseases.
  • the fusion of existing genes into so-called fusion genes leads to an individual-specific change in the base sequence, which has both specificity with regard to the underlying disease and to the respective patient.
  • the modified genomic structure (binding domain) is first used as a specific binding partner of the group Z in (I) by means of molecular diagnostics. Are defined.
  • the group Z is synthesized as a specific binding partner of the binding domain and then used clinically.
  • healthy cells also have defined base sequences which are of interest as a binding domain.
  • An example of this may be embryonic cells that are present in every healthy organism and that, as a prototype for a cell type-specific gene expression, have a base sequence that is different from that of adult cells.
  • malignant cells these cells can serve as target objects for magnetic separation of intracellular biomacromolecules by inducing a specific binding of the Z group to intracellular nucleic acids. This makes it clear that the separation of malignant cells is only one example of many. In addition to the separation from blood, the use of all other body fluids such as cerebrospinal fluid, lymph, urine, saliva, sperm and dissociated tissue can of course also be considered.
  • chronic myeloid leukemia It has long been known that chronic myeloid leukemia is based on a specific translocation between chromosome 9 and 22, which is referred to as a generic term as the Philadelphia chromosome.
  • molecular analyzes in recent years have shown that even in the case of a disease, there are a large number of possible breakpoints - that is, different fusion genes - which must be defined individually for each patient. It is therefore not possible to develop a universal strategy for every patient with chronic offer myeloid leukemia, rather the exact location of the break point (binding domain) must first be defined in the sense described above.
  • the breakpoints are advantageously to be specifically addressed with the magnetic nanoparticles according to the invention after appropriate characterization. Then cells of the malignant clone can first be marked and later separated in the desired manner. In principle, this procedure is possible for all other diseases. Even solid tumors such as breast cancer or colon cancer are increasingly understood in their molecular basis. Hereditary forms of breast and colon cancer can be distinguished from sporadic forms, which still make up the vast majority of cases. On the basis of the expression of certain gene patterns, the malignant cells can in turn be labeled and isolated in the desired form. In principle, extraction from liquids as well as from tissue is conceivable. At this point it must be emphasized again that such a specific procedure has not yet been possible with any other magnetic nanoparticle and represents a completely new application of the binding of magnetic particles to biomacromolecules.
  • the residue is taken up again in HCl (3-10 N) and the whole process is repeated until an electrical conductivity of 20-500 ⁇ S / cm is reached at a pH of 4-5 or the residue is counteracted with HCl (3rd -10 N) dialyzed until these values are also reached.
  • the saturation polarization of the stable magnetite / maghemite sol formed is a maximum of 6 mT.
  • Magnetite and / or maghemite sols are added 6 g CM- Dextran (DS 0.4-2) dissolved in 20 ml of water and heated the mixture with stirring to 40-80 ° C, primarily 50-60 ° C, for 30 min.
  • the stable sol formed in the process consisting of magnetite / maghemite particles coated with CM-dextran, is then purified by dialysis against water.
  • the saturation polarization of the CM-dextran coated nanoparticles is a maximum of 6 mT.
  • Example 5 2 g of dimercaptosuccinic acid dissolved in 20 ml of water are added to 100 ml of the magnetite and / or maghemite sol described in Examples 1 and 2 and the mixture is heated to 70 ° C. with stirring for 30 min.
  • the stable sol formed in the process consisting of magnetite / maghemite particles coated with dimercaptosuccinic acid, is then purified by dialysis against water.
  • the saturation polarization is 1-8 mT, primarily 3-6 mT.
  • Example 7 100 ml of the dispersion prepared according to Example 1 or 2 are mixed in an alkaline solution which contains 7 g of N-oleoylsarcosine (Korantin SH from BASF) and stirred for 30 minutes at 50-80 ° C., primarily at 65 ° C. The particles agglomerate after mixing, but stabilize again when the pH in alkaline is maintained, primarily between 8 and 9. The particles precipitate out in acid but redisperse again in alkaline.
  • Korantin SH N-oleoylsarcosine
  • 1 ml of the magnetite and / or maghemite sol described in Examples 1 and 2 is diluted with water in a ratio of 1:10 and adjusted to pH 7 by adding dilute NaOH. Then 60 mg of the albumin functionalized according to 9, dissolved in 10 ml of phosphate buffer (pH 7.0), are added and the mixture is heated to 40 ° C. with stirring for about 30 min. The magnetic liquid obtained is then centrifuged and the solution is purified by dialysis against water.
  • 1 ml of the magnetic liquid prepared according to Example 3 or 4 is diluted with water in a ratio of 1:10, mixed with 20 mg of a water-soluble carbodiimide (N-ethyl-N - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and for about Stirred at 5-10 ° C for 30 min. Then 10 mg of a peptide (H-Ala-Ala-Ala-Ala-OH) are added and the mixture is kept at 5-10 ° C. for 24 h. To separate the by-products and unreacted starting materials, dialysis is carried out against water.
  • a water-soluble carbodiimide N-ethyl-N - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf magnetische Nanoteilchen, ihre Herstellung sowie auf ihre Verwendung. Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Nanoteilchen, die spezifisch auch im intrazellulären Bereich von Zellen Bindungen an intrazelluläre Biomakromoleküle eingehen können, so dass durch Einwirkung eines äusseren Magnetfeldes eine Separation möglich wird. Die Lösung erfolgt durch magnetische Nanoteilchen mit biochemischer Wirksamkeit, bestehend aus einem magnetischen Kernteilchen und einer am Kernteilchen fixierten Hüllschicht, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel M - S - L - Z (I), wobei die Verknüpfungsstellen zwischen S und L und L und Z kovalent gebundene funktionelle Gruppen aufweisen und wobei M das magnetische Kernteilchen, S ein an M fixiertes, biokompatibles Substrat, L eine Linker-Gruppierung ist und Z eine Gruppierung, bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden oder Proteinen oder deren Derivate, die mindestens eine Struktur aufweist, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, ist.

Description

Magnetische Nanoteüchen mit biochemischer Wirksamkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
Besehreibu g
Die Erfindung bezieht sich auf magnetische Nanoteüchen, ihre Herstellung sowie auf ihre
Verwendung gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1, 9, 13, 17, 18, 19, 21 und 23 bis 25.
Krebserkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen. Immer mehr Menschen sterben insbesondere an Lungen-, Brust- und Prostatakrebs. Die Bekämpfung von Krebserkrankungen gehört darum gegenwärtig zu den vorrangigen Zielen der Medizin. Zu den üblichen Behandlungsmethoden der Bekämpfung von metastasierenden Tumoren gehört neben der operativen Entfernung befallener Organe die Chemotherapie mit ihrem bekannten Nebenwirkungsprofil, da die Medikamente infolge ihrer unspezifischen Wirkung auch gesunde Zellen schädigen und zwar an den dafür empfänglichen Stellen des gesamten Körpers.
Neue Therapieansätze nutzen u. a. Immunreaktionen, indem einmal die körpereigenen Abwehrkräfte durch Botenstoffe oder Zytokine aktiviert werden und zum anderen Eiweißmoleküle und/oder monoklonale Antikörper die Tumorzellen vernichten. Neuentwicklungen auf dem Gebiet der Tumorzellseparation benutzen bereits Teilchen mit magnetischem Kern, die mit biologisch aktiven Hüllsubstanzen modifiziert sind. Sogenanntes "drug targeting" mit an magnetische Mikrosphären gekoppelten Substanzen wie Doxorubicin oder anderen Zytostatika befinden sich in der Entwicklung.
Die auch bekannten "Microbeads" und "Dynabeads" werden schon für diagnostische Verfahren genutzt, indem die magnetischen Mikrosphären infolge biologischer Wechselwirkung an die Zellmembran maligner Zellen adsorbiert und anschließend magnetisch separiert werden. Da die Oberflächenstruktur der Zellmembran im allgemeinen unspezifisch ist, liegen die Separationsraten allerdings bei weniger als 80%. Das hat zur Folge, daß die Gefahr besteht, daß viele Krebszellen nicht separiert worden sind. Diese können weiterhin Metastasen bilden. Die Separation zum Zwecke der Diagnose erfolgt dabei ausschließlich extrakorporal, d.h. die Flüssigkeit mit den zu separierenden Zellen wird in einem geeigneten Gefäß außerhalb des menschlichen Körpers behandelt . Nach der Separation kann die nun gereinigte Flüssigkeit wieder dem menschlichen Körper zugeführt werden.
Aufgrund der unvollständigen Abtrennung der malignen Zellen ist zu erwarten, daß dieses Verfahren nach einiger Zeit wiederholt werden muß. Da aber das Verfahren ohnehin kranke Personen sehr stark belastet, ist eine wiederholte Behandlung nur sehr begrenzt möglich.
In der DE 41 16 093 AI ist ein Verfahren zur Gewinnung magnetischer Träger durch kontrollierte Modifizierung der Oberfläche von magnetischen Teilchen beschrieben. Nach diesem Verfahren werden magnetische Teilchen beschrieben, die auch magnetische Flüssigkeiten zu bilden in der Lage sind, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Heteropolyanionen und gesättigte oder ungesättigte oberflächenaktive Mittel tragen. Diese Oberflächenmodifizierung soll ermöglichen, daß biologisch aktive Moleküle, unter anderem Antikörper, an die Oberfläche der Teilchen gebunden werden können. Die biologisch aktiven Moleküle werden hier über Thio- Brücken an Polythiole gebunden. Unter anderem werden hier als Linker-Substanzen Dicarbonsäuren und Hydroxy- carbonsäuren sowie Dimerkaptobersteinsäure eingesetzt. Diese Verbindungen sind in der Lage, aufgrund einer Eisen-komplexierenden Gruppe an das magnetische Teilchen zu binden.
Es hat sich gezeigt, daß diese magnetischen Teilchen, die auf der Oberfläche biologisch aktive Moleküle enthalten, nicht geeignet sind, in intrazelluläre Räume einzudringen und dort mit Biomakromolekülen zu koppeln, da sie keine ausreichende Biokompatibiltät besitzen.
In der DE 196 24 426 AI sind magnetische Flüssigkeiten für den Transport von diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Substanzen beschrieben. Die magnetischen Kernteilchen werden mit Polymeren umhüllt, die reaktive Gruppen aufweisen, die zur kovalenten Bindung oder zum Ionenaustausch befähigt sind. An diese durchaus biokompatible Hülle, die unter anderem aus Dextran bestehen kann, können neue oder zusätzliche funktioneile Gruppen aufgebracht oder aktiviert werden, z. B. Bersteinsäureanhydrid oder Chloressigsäure, an die dann die diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Substanzen entweder über eine heteropolare oder eine kovalente Bindung fixiert werden. Das an das Magnetteilchen auf die beschriebene Weise gebundene Pharmakon soll intravenös verabreichbar sein und mittels eines magnetischen Hochgradientenfeldes im Bereich eines Zielgebietes wie z. B. eines Tumores oder einer entzündlichen Gewebsregion fixiert werden und dort seine diagnostischen und therapeutischen Wirkungen entfalten. Um diesen Transport im Magnetfeld zu ermöglichen, ist hier eine hohe intravasale Verfügbarkeit der Magnetteilchen erforderlich, deren Partikelgröße mit 200-500 nm angegeben werden. Schon aufgrund der Größe der Teilchen ist auch hier ein Eindringen der Teilchen in intrazelluläre Räume nicht möglich. Auch eine spezifische Bindung an intrazelluläre Biomakromoleküle ist mit diesen Teilchen nicht durchführbar .
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Nanoteüchen, die spezifisch auch im intrazellulären Bereich von Zellen Bindungen an intrazelluläre Biomakromoleküle eingehen können, so daß durch Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes eine Separation möglich wird.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß mit den kennzeichnenden Teilen der Ansprüche 1, 9, 13, 17, 18, 19, 21 und 23 bis 25.
Die erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen sind vorteilhafterweise in der Lage durch die Zellmembranen in intrazelluläre Räume einzudringen und dort mit intrazellulären Biomakromolekülen zu interagieren.
Die magnetischen Nanoteilchen bestehen aus ferri- oder ferromagnetischem Material und weisen biologisch aktive und/oder therapeutisch wirksame Hüllschichten auf. Sie sind in der Lage, zum einen die Zellmembran der Zellen zu durchdringen und zum anderen im intrazellulären Bereich von malignen Zellen mit hoher Spezifität an dem dort befindlichen Targets anzudocken.
Die Größe der erfindungsgemäßen Nanoteilchen beträgt in der Regel 2 bis 100 nm. Die Nanoteilchen haben hinsichtlich des Vermögens der Durchdringung der Zellmembran und ihrer besseren Körperverträglichkeit hervorragende Eigenschaften. Obwohl sie wegen des kleinen Volumens ein relativ geringes magnetisches Moment besitzen, führt die intrazelluläre Teilchenagglomeration aufgrund der Bindung an die intrazellulären Zielbiomakromoleküle zu einer Konzentrationssteigerung mit Erhöhung des magnetischen Momentes der abzutrennenden malignen Zellen, was die magnetische Separation begünstigt.
Typische Kernmaterialien der erfindungsgemäßen Nanoteilchen sind Ferrite der allgemeinen Zusammensetzung MeOxFe203, wobei Me ein zweiwertiges Metall, wie Co, Mn oder Fe ist. Weitere geeignete Materialien sind γ-Fe203, Reinmetalle Co, Fe, Ni und MetallVerbindungen, wie Carbide und Nitride. Da das magnetische Moment von Cobalt und Eisen bis zu vierfach höher als das der Ferrite ist, sind diese Stoffe bei gleicher Teilchengröße und gleichen Magnetfeldern effektiver abzutrennen. Allerdings ist zu berücksichtigen, daß die biologische Verträglichkeit dieser Materialien geringer ist. Das kann ein Vorteil sein, wenn dadurch eine zusätzliche Schädigung von beispielsweise malignen Zellen erfolgt. Andererseits ist die Expositionszeit und Konzentration dieser Stoffe in gesunden Zellen zu begrenzen. Das Zusammenspiel von biochemischen, medizinischen und physikalischen Eigenschaften erfordert die Herstellung von maßgeschneiderten magnetischen Kernmaterialien und Hüllschichten .
Erfindungsgemäß ermöglichen die magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 ein Durchdringen der Zellmembranen und das Interagieren der magnetischen Nanoteilchen mit intrazellulären Zielbiomakromolekülen. Dazu ist es erforderlich, die magnetischen Nanoteilchen homogen in Kδrperflüssigkeiten zu verteilen, denn aggregierte Nanoteilchen sind nicht in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen. Das setzt unter anderem eine genügend dicke Hüllschicht, die wenigstens in der Größenordnung des Radius der Kerne sein muß, und eine gute Biokompatibilität der Bestandteile der Hüllschicht voraus. Ladungsträger im Hüllmaterial, also ein höheres Zetapotential, können die Dispergierfähigkeit in der Kδrperflüssigkeit zusätzlich günstig beeinflussen. Eine besonders günstige Applikationsform der magnetischen Nanoteilchen ist eine Dispersion gemäß Anspruch 9.
Eine homogene Verteilung der erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen kann durch Einstellung einer geringen Konzentration der Nanoteilchen-Dispersionen begünstigt werden. Höhere Konzentrationen entstehen dann allerdings im Innenraum der Zelle, wenn die Nanoteilchen durch spezifische Adsorption an Zielbiomakromoleküle im intrazellulären Bereich von Zellen konzentriert werden. Im Inneren der Zelle ist eine Teilchenagglomeration von Vorteil. Die Konzentrationssteigerung an magnetischen Nanoteilchen erhöht das magnetische Moment in der zu separierenden Zelle.
Die Bildung der magnetischen Kernteilchen findet entweder in der wäßrigen oder organischen Phase über Keimbüdungs-/Kristallwachstumsprozesse statt. Die Herstellung in der wäßrigen Phase über chemische Fällungsmethoden hat mehrere Vorteile, zum einen bilden sich in einer ersten Stufe die unmodifizierten magnetischen Teilchen, diese können über pH- Einstellungen sowohl positive als auch negative Ladungsvorzeichen erhalten. Erst in einer zweiten Stufe werden die Hüllmoleküle adsorbiert . Die Adsorptionseffektivität richtet sich nach dem Ladungsvorzeichen an der Oberfläche der magnetischen Kernteüchen. Es gilt die Regel, daß Hüllmoleküle mit negativ geladenen Molekülteilchen bevorzugt an Kernoberflächen mit positivem Ladungsvorzeichen adsorbieren. Dabei erfolgt meist eine ionische chemische Reaktion, wie z.B. zwischen CarboxylVerbindungen und Aminoverbindungen . Diese hat den Vorteil, daß die adsorbierten Hüllmoleküle einmal vollständig die Kernoberfläche bedecken und zum anderen fest auf dieser verankert sind.
Oft reicht eine koordinative Bindung des biokompatiblen Substrates S für eine feste Verankerung aus, wie das für Polysaccharide bekannt ist .
Die Herstellung von ferromagnetischen Metallkern- teilchen erfolgt überwiegend durch Thermolyse der Metallcarbonyle in der organischen Phase. Dabei werden in der organischen Phase lösliche Tenside oder Polymere zugesetzt, die zur Stabilisierung dienen. In der ersten Reaktionsstufe werden dadurch Kernteilchen, die in der organischen Phase homogen verteilt sind, gebildet. In einem zweiten Reaktionsschritt erfolgt die Überführung der Kernteilchen in eine wäßrige Trägerflüssigkeit. Enthält die Hüllschicht modifizierte Aminosäuren, so erfolgt die Überführung der Kernteilchen nach weitgehender Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Zusatz von alkalischer wäßriger Trägerflüssigkeit. Die Hüllschicht wird in das wasserlösliche Salz der Aminosäure überführt, die die Dispergierung der magnetischen Kernteilchen bewirkt. Anschließend können über weitere Reaktionen die magnetischen Nanoteilchen hergestellt werden.
Erfindungsgemäß enthalten die magnetischen Nanoteilchen eine Verbindung der allgemeinen Formel M - S - L - Z (I) , wobei die Verknüpfungsstellen zwischen S und L und L und Z kovalent gebundene funktionelle Gruppen aufweisen und wobei
M das magnetisches Kernteüchen, S ein an M fixiertes, biokompatibles Substrat, L eine Linker-Gruppierung ist und
Z eine Gruppierung, bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden oder Proteinen oder deren Derivate, die mindestens eine Struktur aufweist, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakro- moleküls zur Bindung befähigt ist, ist.
Die magnetischen Kernteüchen bestehen aus Magnetit, Maghemit, Ferriten der allgemeinen Formel MeOxFe203, wobei Me ein zweiwertiges Metall, wie Cobalt, Mangan, Eisen ist, oder aus Cobalt, Eisen, Nickel, Eisencarbid oder Eisennitrid. Die Größe der Kernteilchen beträgt in einer Weiterbildung der Erfindung 2-100 nm. Das Substrat S wird in einer Ausführung der Erfindung durch die Verbindungen wie Poly- bzw. Oligosaccharide oder deren Derivate wie Dextran, Carboxymethyl-Dextran, Stärke, Dialdehyd-Stärke, Chitin, Alginate, Zellulose, Carboxymethyl-Zellulose, Proteine oder deren Derivate wie Albumine, Peptide, synthetische Polymere wie Polyethylenglykole, Polyvinylpyrrolidon, Poly- ethylenimin, Polymethacrylate, bifunktionelle Carbonsäuren und deren Derivate wie die Merkapto- bernsteinsäure oder Hydroxycarbonsäuren gebildet .
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird die Linker-Gruppierung L durch Umsetzung einer Verbindung wie Poly- und Dicarbonsäuren, Polyhydroxycarbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Polysaccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, gebildet .
In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung sind beispielhaft die funktioneilen Gruppen vorgesehen, die als Verknüpfungsgruppierungen für das Substrat S, für die Linker-Gruppierung L und die Gruppierung Z erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Wesentlich ist, daß die Verbindung (I) durch kovalente Bindungen gekennzeichnet ist .
Die biochemisch wirksame Verbindung der allgemeinen Formel S - L - Z (II) eignet sich hervorragend zur Herstellung der erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen. Die Herstellung der magnetischen Nanoteilchen erfolgt stufenweise. Die magnetischen Kernteüchen werden auf an sich bekannte Weise hergestellt und in einer bevorzugten Variante unmittelbar mit der biochemisch wirksamen Verbindung (II) umgesetzt.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden die erfindungsgemäßen magnetischen Kernteilchen nach folgendem Verfahren hergestellt: a. Herstellung der magnetischen Kernteüchen auf an sich bekannte Weise, b. Umsetzen der magnetischen Kernteüchen mit dem biokompatiblen Substrat S und c. Umsetzen der entstandenen Verbindung M - S mit einer Verbindung L - Z, wobei zur Herstellung von L - Z eine Verbindung wie Poly- und Dicarbonsäuren, Polyhydroxycarbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Poly- saccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, mit Nukleinsäuren, Peptiden und/oder Proteinen bzw. deren Derivate, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen und die mindestens eine Struktur enthalten, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, umgesetzt werden.
Zur Herstellung der biochemisch wirksamen Verbindung (II) wird so verfahren, daß erst die Verbindung L - Z hergestellt wird und anschließend L - Z mit dem Substrat S umgesetzt wird.
Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen lassen sich zur Separation von Zellen, zur Separation von malignen Zellen und zur Separation von intrazellulären Biomakromolekülen verwenden. Als Angriffspunkte für eine Interaktion mit intrazellulären Biomakromolekülen sollen insbesondere auch die Fusionsregionen von Chromosomen als molekulare Marker dienen. Das können z. B. erkrankungstypische molekulare Marker sein. Weiterhin können diese Fusionsregionen zu Fusionsgenen führen, die Fusions-Boten-Ribonukleinsäuren (Fusions- mRNA) und Fusionsproteine hervorbringen. Beispielgebend soll die Chronisch-Myeloische Leukäme (CML) genannt werden. Bei der CML tritt ein Chromosomenrearrangement t (9;22) (q34;qll) auf, das sog. Philadelphia-Chromosom, das zum BCR/ABL-Genprodukt führt. Das heißt, in den Zellen mit dieser Chromosomenveränderung liegt ein Gen vor, das in keiner anderen Körperzelle vorkommt. Dieses Gen wird in Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) umgeschrieben und führt zur Synthese des BCR/ABL-Proteins . Die BCR/ABL-mRNA und das BCR/ABL-Protein kommen nur in den Tumorzellen vor. Als Bindungsdomäne für die magnetischen Nanoteilchen kommt die BCR/ABL-mRNA in Betracht. Die Z-Gruppierung der erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen soll mittels Nukleinsäure- Nukleinsäure-Wechselwirkung mit der komplementären Sequenz auf der mRNA interagieren, wobei die BCR/ABL- Fusionstelle in dieser Sequenz enthalten sein muß. Die individualspezifische Sequenz um die Fusionsstelle ist vorher durch Labormethoden bestimmt worden. Die Interaktion soll im Zytoplasma der Tumorzellen stattfinden. Nach dem Andocken der magnetischen Nanoteilchen über die Z-Gruppierung an die komplementäre Sequenz auf der BCR/ABL-mRNA ist die Tumorzelle markiert .
Weitere beispielhafte Krebserkrankungen sind nachfolgend genannt :
Hämatologische Erkrankung Chromsomenrearrangement (Fusionsgenprodukt)
Akute Lymphatische Leukämie (ALL) t (9;22) (q34;qll) (BCR/ABL) t (1;19) (q23;pl3) (E2A/PBX) t(8;14) (q24;q32) t (2; 8) (pll;q24) t (8;22) (q24;qll) (MYC, IGH,
IGK, IGL) t (4;11) (q21;q23) ( LL/AF2) t(l;14) (p32;qll)del(lp32)
(TAL1, TCRA)
Akute Myeloische Leukämie (AML) t(8;21) (q22;q22) (AML/ETO) t(15;17) (q21;qll) (PML/RARA) invl6 (pl3q22) t (16,-16) (pl3;q22)
(MYHll/CBFb) t (6;9) (p23;q34) (DEK/CAN)
Non-Hodgkin Lymphome t (14,-18) (q32;q21) (BCL2/IGH) t (8,-14) (q24,-q32) t(2;8) (pll;q24) t (8,-22) (q24;qll)
(MYC, IGH, IGK, IGL) t (11;14) (ql3;q32) (BCLl/lGH) t (3;14) (q27;q32) (BCL6/IGH)
Ewing Sarkom t (11;22) (q24;ql2) (FLIl/E S)
Für diese Erkrankungen, die wiederum nur eine Auswahl der denkbaren zu therapierenden Krankheiten darstellen, kommt sinngemäß o.g. Vorgehen zur Anwendung. Es existiert jeweils eine krankheitstypische Basensequenz, die durch die folgenden Chromosomenlokalisationen eindeutig beschrieben ist. Entsprechend soll auch bei diesen Erkrankungen die Z-Gruppierung der magnetischen Nanoteilchen mittels Nukleinsäure-Nukleinsäure- Wechselwirkung mit der komplementären Sequenz (Bindungsdomäne) auf der mRNA interagieren. Die Menge aller exakten Basensequenzen für wiederum alle denkbaren Erkrankungen ist unendlich groß, allein für die CML sind derzeit mehr als 10 Bruchregionen beschrieben, hierzu werden ständig neue beschrieben.
Die Erfindung weist verschiedene Vorteile auf. Zunächst hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen in entsprechenden Zellkultur- Untersuchungen eine hohe Bioverträglichkeit aufweisen. Hierdurch ist eine gefahrlose Applikation möglich, wobei ebenso eine rein extrakorporale Verwendung der Partikel im Rahmen der erfindungsgemäßen Anwendungen denkbar ist. Im Unterschied zu den existierenden Separationsverfahren mittels Durchflusszytometrie (FACS) sowie MagnetSeparation (MACS) bieten die erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen entscheidende Vorteile. Mit ihnen ist es möglich, in das Innere der Zellen, das sogenannte Zytoplasma, vorzudringen und hier spezifisch eine Bindung von Biomakromolekülen mit entsprechenden Strukturen wie Bindungsdomänen von Nukleinsäuren herbeizuführen. Auch nach entsprechender Translation entstehende Proteine sind als Zielbiomakromoleküle für die spezifische Bindung an die Gruppierung Z der allgemeinen Formel (I) ins Auge gefasst . Nach heutigem Kenntnisstand weisen alle bösartigen Erkrankungen ein verändertes Genom in der Zelle als Grundlage auf. Bei einer Reihe von Krankheiten ist diese molekulare Grundlage bereits definiert. Die Fusion von existierenden Genen zu sogenannten Fusionsgenen führt zu einer individualspezifischen Veränderung der Basensequenz, die sowohl Spezifität im Hinblick auf die zugrunde liegende Erkrankung als auch auf den jeweiligen Patienten besitzt. Im Rahmen dieses Vorgehens wird erfindungsgemäß zunächst mittels molekularer Diagnostik die veränderte genomische Struktur (Bindungsdomäne) als spezifischen Bindungspartner der Gruppierung Z in (I) definiert. Im Gefolge hiervon wird die Gruppierung Z als spezifischer Bindungspartner der Bindungsdomäne synthetisiert und anschließend klinisch eingesetzt . Weiterhin ist auszuführen, dass auch gesunde Zellen definierte Basensequenzen besitzen, die als Bindungsdomäne von Interesse sind. Als Beispiel hierzu mögen embryonale Zellen dienen, die in jedem gesunden Organismus vorhanden sind und als Prototyp einer Zelltyp-spezifischen Genexpression eine gegenüber adulten Zellen geänderte Basensequenz besitzen. Diese Zellen können - ebenso wie maligne Zellen - als Zielobjekte für eine Magnet-Separation intrazellulärer Biomakromoleküle dienen, indem eine spezifische Bindung der Gruppierung Z an intrazelluläre Nukleinsäuren herbeigeführt wird. Somit wird klar, dass die Separation maligner Zellen nur ein Beispiel von vielen sein dürfte. Neben der Separation aus Blut kommt selbstverständlich auch der Einsatz aller anderen Körperflüssigkeiten wie Liquor, Lymphe, Urin, Speichel, Sperma sowie dissoziierter Gewebe in Betracht.
Die erfindungsgemäße Verwendung der magnetischen Nanoteilchen soll am Beispiel der chronisch-myeloischen Leukämie nochmals ausführlicher dargelegt werden. Seit langem ist bekannt, dass der chronisch-myeloischen Leukämie eine spezifische Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 zugrunde liegt, welche als Oberbegriff als Philadelphia-Chromosom bezeichnet werden. Molekulare Analysen der letzten Jahre haben jedoch ergeben, dass selbst bei einer Krankheit eine Vielzahl von möglichen Bruchpunkten - sprich verschiedenen Fusionsgenen - existiert, die beim jeweiligen Patienten individuell definiert werden müssen. Es ist somit nicht möglich, eine Universalstrategie für jeden Patienten mit chronisch- myeloischer Leukämie anzubieten, vielmehr muss im oben beschriebenen Sinne zunächst die exakte Lokalisation des Bruchpunktes (Bindungsdomäne) definiert werden. Die Bruchpunkte sind vorteilhafterweise nach entsprechender Charakterisierung spezifisch mit den erfindungsgemäßen magnetischen Nanoteilchen anzugehen. Es können dann gezielt Zellen des malignen Klons zunächst markiert und später in gewünschter Weise separiert werden. Dieses Vorgehen ist prinzipiell für sämtliche anderen Erkrankungen möglich. Auch solide Tumoren wie das Mammakarzinom oder das Dickdarmkarzinom werden zunehmend in ihren molekularen Grundlagen verstanden. Hierbei können hereditäre Formen von Brust- und Darmkrebs gegenüber sporadischen Formen, die nach wie vor die weit überwiegende Mehrzahl der Krankheitsfälle ausmachen, abgegrenzt werden. Anhand der Expression bestimmter Genmuster können hier die malignen Zellen wiederum markiert werden und in gewünschter Form isoliert werden. Hierbei ist prinzipiell sowohl die Extraktion aus Flüssigkeiten wie auch aus Gewebe denkbar. An dieser Stelle muss nochmal betont werden, dass ein solch spezifisches Vorgehen bisher mit keinem anderen magnetischen Nanoteilchen realisierbar ist und eine völlig neuartige Anwendung der Bindung von Magnetpartikeln an Biomakromoleküle darstellt .
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Ausführungs- beispiele näher erläutert.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1
0,5 Mol FeCl2 x 4 H20 und 1 Mol FeCl3 x 6 H20 werden in 100 ml Wasser vollständig gelöst und unter Rühren mit konzentriertem Ammoniumhydroxid versetzt bis ein pH- Wert von 9 erreicht wird. Die schwarzen Teilchen in der Dispersion werden magnetisch abgetrennt und die überstehende Lösung abdekantiert . Danach wird die Dispersion mit halbkonzentrierter HCl auf pH 1-4 gebracht, wobei die Teilchen umgeladen werden. Der Prozeß wird wiederholt bis die Teilchen beginnen zu redispergieren. Danach wird zentrifugiert (5000-10000 g) und die überstehende partikelarme Lösung abdekantiert. Der Rückstand wird wieder in HCl (3-10 N) aufgenommen und der ganze Prozeß solange wiederholt bis eine elektrische Leitfähigkeit von 20-500 μS/cm bei einem pH-Wert von 4-5 erreicht wird oder aber der Rückstand wird gegen HCl (3-10 N) dialysiert bis ebenfalls diese Werte erreicht werden. Die Sättigungspolarisation des gebildeten, stabilen Magnetit/Maghemit-Sol beträgt maximal 6 mT.
Beispiel 2
0 , 5 Mol FeCl2 x 4 H20 und 1 Mol FeCl3 x 6 H20 werden in
100 ml Wasser vollständig gelöst und unter Rühren mit konzentriertem Ammoniumhydroxid versetzt bis ein pH- Wert von 9 erreicht wird. Die schwarzen Teilchen in der Dispersion werden magnetisch abgetrennt und die überstehende Lösung abdekantiert. Anschließend gibt man unter Rühren einige Milliliter Wasserstoffperoxid (30%ig) zu, wobei die Teilchen zu Maghemit oxidiert werden. Danach werden die Teilchen durch Zugabe von halbkonzentrierter HCl wie unter Beispiel 1 beschrieben behandelt . Die Sättigungspolarisation des gebildeten, stabilen Maghemit-Sol beträgt maximal 6 mT .
Beispiel 3
Zu 100 ml des unter Beispiel 1 und 2 beschriebenen
Magnetit- und/oder Maghemit-Sols gibt man 6 g CM- Dextran (DS 0,4-2) gelöst in 20 ml Wasser und erwärmt die Mischung unter Rühren auf 40-80°C, vorrangig auf 50-60°C, für 30 min. Das dabei gebildete stabile Sol, bestehend aus mit CM-Dextran beschichteten Magnetit/Maghemit-Teilchen, wird anschließend durch Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Beispiel 4
Zu einer Lösung aus 0,6 g CM-Dextran (DS 0,4-2) in 25 ml Wasser werden unter Rühren bei 70°C 13,1 ml einer 1 M Fe (III) -Chlorid-Lösung, in der 2,04 g FeCL2 x 4 H20 gelöst sind, langsam zugetropft. Danach wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von verdünnter NaOH (2N) auf pH 9-10 gebracht, anschließend mit verdünnter HCl (2N) neutralisiert und für 2 h bei 70°C gerührt, wobei der pH-Wert der Lösung durch weitere Zugabe von verdünnter NaOH oder HCl auf einem Wert von etwa 6,5- 7,5 gehalten wird. Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches wird der unlösliche Anteil durch Zentrifugation entfernt und die erhaltene magnetische Flüssigkeit durch Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Die Sättigungspolarisation der CM-Dextran beschichteten Nanoteilchen beträgt maximal 6 mT.
Beispiel 5 Zu 100 ml des unter Beispiel 1 und 2 beschriebenen Magnetit- und/oder Maghemit-Sols gibt man 2 g Dimerkaptobernsteinsäure gelöst in 20 ml Wasser und erwärmt die Mischung unter Rühren auf 70°C für 30 min. Das dabei gebildete stabile Sol, bestehend aus mit Dimerkaptobernsteinsäure beschichteten Magnetit/Maghemit-Teilchen, wird anschließend durch Dialyse gegen Wasser gereinigt . Die Sättigungspolarisation beträgt 1-8 mT, vorrangig 3-6 mT . Beispiel 6
Zu 100 ml des unter Beispiel 1 und 2 beschriebenen Magnetit- und/oder Maghemit-Sols gibt man 6 g bovines Albumin gelöst in 100 ml Wasser und erwärmt die Mischung unter Rühren auf 70°C, für 30 min. Das dabei gebildete stabile Sol, bestehend aus mit Albumin beschichteten Magnetit/Maghemit-Teilchen, wird anschließend durch Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Beispiel 7 100 ml der nach Beispiel 1 oder 2 hergestellten Dispersion werden in einer alkalischen Lösung, die 7g N-Oleoylsarkosin (Korantin SH von BASF) enthält, vermischt und 30 Minuten bei 50-80°C, vorrangig bei 65°C, gerührt. Die Teilchen agglomerieren nach dem Vermischen, stabilisieren sich aber wieder, wenn der pH-Wert im Alkalischen, vorrangig zwischen 8 und 9, gehalten wird. Die Teilchen fallen im Sauren aus, redispergieren aber wieder im Alkalischen.
Beispiel 8
Zu 1 mg Bernsteinsäure gelöst in 10 ml Wasser gibt man unter Rühren die aquimolare Menge eines wasserlöslichen Carbodiimids (N-Ethyl-N* - (3-dimethylaminopropyl) carbo- diimid-hydrochlorid) und läßt für 30 min bei 5-10°C rühren. Anschließend werden 10 μg eines amino- funktionalisierten Oligonukleotids (5'-H2N- ACTGGCCGCTGAAGGGCTTCTGCGTCTCCA-OH-31) gelöst in 50 μl Phosphat-Puffer (pH 7,0) zugegeben und das Gemisch für 24 h bei 5-10°C gehalten. Zur Abtrennung der Nebenprodukte und nicht umgesetzter Ausgangstoffe wird gegen Wasser dialysiert und das Reaktionsprodukt lyophilisiert . Beispiel 9
Zu 10 μg des nach Beispiel 8 funktionalisierten Oligonukleotids, gelöst in 100 μl Phosphat-Puffer (pH 7,0), gibt man unter Rühren 20 μg eines wasserlöslichen Carbodiimids (N-Ethyl-Nv- (3-dimethylaminopropyl) carbo- diimid-hydrochlorid) und hält für 30 min bei 5-10°C. Diese Lösung wird anschließend zu 200 mg Albumin, gelöst in 20 ml Phosphat-Puffer, gegeben und das Gemisch für 24 h bei 5-10°C gehalten. Zur Abtrennung der Nebenprodukte und nicht umgesetzter Ausgangstoffe wird gegen Wasser dialysiert und das erhaltene Reaktionsprodukt lyophilisiert .
Beispiel 10
1 ml des unter Beispiel 1 und 2 beschriebenen Magnetit- und/oder Maghemit-Sols wird mit Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnt und durch Zugabe von verdünnter NaOH auf pH 7 eingestellt. Anschließend gibt man 60 mg des nach 9 funktionalisierten Albumins, gelöst in 10 ml Phosphat-Puffer (pH 7,0), zu und erwärmt unter Rühren für etwa 30 min auf 40°C. Die dabei erhaltene magnetische Flüssigkeit wird anschließend zentrifugiert und die Lösung durch Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Beispiel 11
Zu 10 μg des nach Beispiel 8 funktionalisierten Oligonukleotids, gelöst in 100 μl Phosphat-Puffer (pH 7,0), gibt man unter Rühren 20 μg eines wasserlöslichen Carbodiimids (N-Ethyl-N*- (3-dimethylaminopropyl) carbo- diimid-hydrochlorid) und hält für 30 min bei 5-10°C. Diese Lösung wird anschließend zu 10 ml der nach Beispiel 6 hergestellten und im Verhältnis 1:10 mit Wasser verdünnten magnetischen Flüssigkeit gegeben, für 24 h bei 5-10°C gehalten und danach durch Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Beispiel 12
1 ml der nach Beispiel 3 bzw. 4 hergestellten magnetischen Flüssigkeit wird mit Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnt, mit 20 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids (N-Ethyl-N - (3-dimethylaminopropyl) carbo- diimid-hydrochlorid) versetzt und für etwa 30 min bei 5-10°C gerührt. Danach werden 10 mg eines Peptids (H- Ala-Ala-Ala-Ala-OH) zugegeben und das Gemisch für 24 h bei 5-10°C gehalten. Zur Abtrennung der Nebenprodukte und nicht umgesetzter Ausgangstoffe wird gegen Wasser dialysiert .
Beispiel 13
Zu 10 ml der nach Beispiel 12 beschriebenen Lösung gibt man 20 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids (N-Ethyl- N'- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid) , läßt für 30 min bei 5-10°C rühren und versetzt mit 10 μg eines aminofunktionalisierten Oligonukleotids (siehe Beispiel 7) gelöst in 50 μl Phosphat-Puffer (pH 7,0) . Das Gemisch wird dann für 24 h bei 5-10°C gehalten und anschließend gegen Wasser dialysiert.

Claims

Patentansprüche
1. Magnetische Nanoteilchen mit biochemischer Wirksamkeit, bestehend aus einem magnetischen Kernteilchen und einer am Kernteüchen fixierten
Hüllschicht, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Nanoteilchen eine Verbindung der allgemeinen
Formel
M - S - L (I)
enthalten, wobei die Verknüpfungsstellen zwischen S und L und L und
Z kovalent gebundene funktionelle Gruppen aufweisen und wobei
M das magnetische Kernteüchen, S ein an M fixiertes, biokompatibles Substrat,
L eine Linker-Gruppierung ist und Z eine Gruppierung, bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden und/oder Proteinen oder deren Derivate, die mindestens eine Struktur aufweist, die spezifisch mit einer
Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, ist .
Magnetische Nanoteilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kernteilchen aus Magnetit, Maghemit, Ferriten der allgemeinen Formel MeOxFe203 , wobei Me ein zweiwertiges Metall, wie Cobalt, Mangan oder Eisen ist, oder aus Cobalt, Eisen, Nickel, Eisencarbid oder Eisennitrid bestehen.
3. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Kernteüchen 2-100 nm beträgt.
4. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das biokompatible Substrat S eine Verbindung wie Poly- bzw. Oligosaccharide oder deren Derivate wie
Dextran, Carboxymethyl-Dextran, Stärke, Dialdehyd-
Stärke, Chitin, Alginate, Zellulose,
Carboxymethyl-Zellulose ,
Proteine oder deren Derivate wie Albumine, Peptide, synthetische Polymere wie Polyethylen- glykole, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenimin,
Polymethacrylate, bifunktionelle Carbonsäuren und deren Derivate wie die Merkaptobernsteinsäure oder
Hydroxycarbonsäuren ist.
5. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker-Gruppierung L durch Umsetzung einer
Verbindung wie Poly- und Dicarbonsäuren, Polyhydroxycarbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Poly- saccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte
Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, entstanden ist.
6. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen Gruppierungen wie -CHO,
-COOH, -NH2, -ΞH, -NCS, -NCO, -OH, -COOR wobei
R Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Reste sind und
sind.
7. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
S und M kovalent miteinander verbunden sind.
8. Magnetische Nanoteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen M und S eine elektrostatische Bindung ausgebildet ist. Dispersion, bestehend aus magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 und einer Trägerflüssigkeit .
10. Dispersion nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit polare und/oder nichtpolare Lösungsmittel enthält.
11. Dispersion nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit Wasser und/oder ein mit
Wasser mischbares Lösungsmittel enthält.
12. Dispersion nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß physiologische Zusätze enthalten sind.
13. Biochemisch wirksame Verbindung der allgemeinen Formel
S - L - Z (II) ,
wobei die Verknupfungssteilen zwischen S und L und L und
Z kovalent verbundene funktionelle Gruppen aufweisen und wobei
S ein an M fixiertes, biokompatibles Substrat, L eine biokompatible Linker-Gruppierung und Z eine Gruppierung, bestehend aus Nuklein- säuren, Peptiden und/oder Proteinen oder deren Derivate, die mindestens eine Struktur aufweist, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, ist .
14. Biochemisch wirksame Verbindung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das biokompatible Substrat S eine Verbindung wie Poly- bzw. Oligosaccharide oder deren Derivate wie
Dextran, Carboxymethyl-Dextran, Stärke, Dialdehyd- Stärke, Chitin, Alginate, Zellulose, Carboxymethyl-Zellulose ,
Proteine oder deren Derivate wie Albumine, Peptide, synthetische Polymere wie Polyethylen- glykole, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenimin, Polymethacrylate , bifunktionelle Carbonsäuren und deren Derivate wie die Merkaptobernsteinsäure oder Hydroxycarbonsäuren ist .
15. Biochemisch wirksame Verbindung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker-Gruppierung L durch Umsetzung einer
Verbindung wie Dicarbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipo- proteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Polysaccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA,
PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, entstanden ist.
16. Biochemisch wirksame Verbindung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen Gruppierungen wie -CHO,
-COOH, -NH2, -SH, -NCS, -NCO, -OH, -COOR und wobei R Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Reste sind und
CO.
- CO )"
sind.
17. Verfahren zur Herstellung von magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrens- schritte a. Herstellung der magnetischen Kernteüchen auf an sich bekannte Weise, b. Umsetzen der magnetischen Kernteüchen mit der Verbindung S - L - Z (II) zur Verbindung M - S - L - Z (I) .
18. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrens - schritte a. Herstellung der magnetischen Kernteüchen auf an sich bekannte Weise, b. Umsetzen der magnetischen Kernteüchen mit dem biokompatiblen Substrat S und c. Umsetzen der entstandenen Verbindung M - S mit einer Verbindung L - Z, wobei zur Herstellung von L - Z eine Verbindung wie Poly- und Dicarbonsäuren, Polyhydroxy- carbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide,
Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Polysaccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, mit Nukleinsäuren, Peptiden und/oder
Proteinen bzw. deren Derivate, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen und die mindestens eine Struktur enthalten, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, umgesetzt werden.
19. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrens- schritte a. Herstellung der magnetischen Kernteilchen auf an sich bekannte Weise, b. Umsetzen der magnetischen Kernteilchen mit dem biokompatiblen Substrat S, c. Umsetzen der entstandenen Verbindung M - S mit Verbindungen wie Poly- und Dicarbon- säuren, Polyhydroxycarbonsäuren, Diamine,
Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Polysaccharide,
Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, und d. Umsetzen der entstandenen Verbindung
M - S - L mit Nukleinsäuren, Peptiden und/oder Proteinen bzw. deren Derivate, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen und die mindestens eine Struktur enthalten, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist .
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen S, L und Z über funktionelle Gruppen wie -CHO, -COOH, -NH2, -SH, -NCS, -NCO, -
OH, -COOR und wobei R Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Reste sind und
verknüpft werden.
1. Verfahren zur Herstellung der biochemisch wirksamen Verbindung gemäß Anspruch 13, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrens- schritte a. Herstellung der Verbindung L - Z, b. Umsetzen von L - Z mit dem biokompatiblen Substrat S wobei zur Herstellung von L - Z eine Verbindung wie Poly- und Dicarbonsäuren, Polyhydroxy- carbonsäuren, Diamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Glyko- proteine, Lektine, Oligosaccharide, Poly- saccharide, Oligonukleotide und deren alkylierte Derivate und Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA) und deren alkylierte Derivate, entweder einzelsträngig oder doppelstrangig vorliegend, die mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, mit Nukleinsäuren, Peptiden und/oder Proteinen bzw. deren Derivate, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen und die mindestens eine Struktur enthalten, die spezifisch mit einer Bindungsdomäne eines intrazellulären Biomakromoleküls zur Bindung befähigt ist, umgesetzt werden.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen S, L und Z über funktionelle Gruppen wie -CHO, -COOH, -NH2, -SH, -NCS, -NCO, - OH, -COOR und wobei
R Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Reste sind und
CO. /
- )
verknüpft werden .
23. Verwendung der magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 zur Separation von Zellen.
24. Verwendung der magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 zur Separation von malignen Zellen.
25. Verwendung der magnetischen Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 zur Separation von intrazellulären Biomakromolekülen.
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