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EP1194558A2 - Nouveau gene sgs3 de plante et son utilisation - Google Patents

Nouveau gene sgs3 de plante et son utilisation

Info

Publication number
EP1194558A2
EP1194558A2 EP00953244A EP00953244A EP1194558A2 EP 1194558 A2 EP1194558 A2 EP 1194558A2 EP 00953244 A EP00953244 A EP 00953244A EP 00953244 A EP00953244 A EP 00953244A EP 1194558 A2 EP1194558 A2 EP 1194558A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polynucleotide
sgs3
plants
plant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00953244A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Beclin
Taline Elmayan
Hervé Vaucheret
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Bayer CropScience SA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Aventis CropScience SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9909417A external-priority patent/FR2796394A1/fr
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Aventis CropScience SA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1194558A2 publication Critical patent/EP1194558A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a new plant gene SGS3 and its use for the preparation of genetically modified plants.
  • heterologous gene expression will depend on various factors, including the locus of integration of the heterologous gene in the genome of the transformed plant and so-called phenomena of "silencing". It is indeed known to the state of the art as the expression of a heterologous gene in a plant can be inhibited completely or partly in the progeny of the transformed plants regenerated, even said the gene s is expressed correctly in the regenerated plant coming directly from the transformed cell.
  • the introduced heterologous gene can sometimes undergo epigenetic inactivation (inactivation being accompanied by any change in sequence). When the genes have homologies with genes of the host organism, the inactivation can also affect the expression of these host genes and generate deleterious effects for the organism (co-inactivation). Two distinct mechanisms of inactivation have been identified in higher plants, translating to either a transcription blocking (transcriptional inactivation) or by RNA degradation (post-transcriptional inactivation).
  • GUSs under the control of the CamV 35S promoter showed inactivation of the transgene regardless of the number of copies of the transgene inserted at the locus.
  • the phenomenon takes place during the development of each generation indicating a meiotic reversibility.
  • Haploid plants from the anther culture of inactivated homozygous transformants carrying a single copy of the transgene showed gene reactivation followed by inactivation during development, suggesting that meiosis was necessary to initiate the reactivation process, but that initiation of inactivation during development did not require fertilization, and was not the result of interaction between different copies of the transgene.
  • run-on experiments have shown that the phenomenon occurs at the post-transcriptional level (Elmayan and Vaucheret, Plant J. 9: 787-797,1996).
  • SGS3 a new plant gene, called SGS3, involved in the phenomena of post-transcriptional inactivation in transgenic plants and in the resistance of plants to viral infections.
  • the inhibition of this gene leads to the inhibition of post-transcriptional inactivation phenomena in particular in transgenic plants comprising a heterologous gene coding for a particular peptide or protein, allowing a level of expression of said peptide or said protein at a particularly high level.
  • Another subject of the invention is the overexpression of the SGS3 gene for the preparation of plants more resistant to viral infections.
  • SEQ ID NO.l SGS3 gene from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO. 2 cDNA of the SGS3 gene to Arabidopsis thaliana
  • the present invention relates to SGS3 polynucleotides, in particular polynucleotides comprising a plant SGS3 gene.
  • the polynucleotides of the present invention comprise the coding sequence of a plant SGS3 gene.
  • the SGS3 gene can be isolated in dicotyledonous plants, such as Arabidopsis, tobacco, rapeseed, sunflower, soybean, cotton, clover, duckweed (lemnae) or in monocotyledonous plants such as rice, corn or wheat.
  • the SGS3 gene is isolated from dicotyledonous plants, in particular crucifers like Arabidopsis or rapeseed.
  • the polynucleotides of the invention comprise an SGS3 d! Arabidopsis thaliana.
  • SGS3 polynucleotides designates all of the polynucleotides of the present invention, preferably the polynucleotides of the genomic sequence of SGS3, the polynucleotides of the cDNA sequence of SGS3. as well as the polynucleotides encoding the SGS3 polypeptides of the present invention.
  • SGS3 polynucleotides also denotes recombinant polynucleotides comprising the said polynucleotides.
  • polynucleotide means a single-stranded nucleotide chain or its complement or a double-stranded nucleotide chain which may be of DNA or RNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular double stranded DNA.
  • polynucleotide also denotes modified oligonucleotides and polynucleotides.
  • polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polynucleotides of the present invention can be prepared by conventional techniques of molecular biology as described by Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Labratory Manual. 1989) or by chemical synthesis.
  • the invention includes polynucleotides of the genomic sequence of the SGS3 gene.
  • This genomic sequence includes 5 exons (positions 696-1658, 1732-2023, 2135-2379, 2482-2648, 2739-2949 of SEQ ID NO. 1), 4 introns (positions 1659-1731, 2024-2134, 2380- 2481, 2649-2738 of SEQ ID NO.l) and regulatory sequences in 5 'and 3'.
  • the polynucleotides of the genomic sequence of SGS3 comprise a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) the polynucleotide of SEQ ID NO.1, b) a polynucleotide comprising at least one exon of SEQ ID NO.1; c) a polynucleotide comprising a combination of exons of SEQ ID NO.1.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising a regulatory sequence 5 ′ or 3 ′ of the SGS3 gene.
  • the invention relates to a 5 'regulatory polynucleotide comprising the polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1.
  • the invention relates to a 3 'regulatory polynucleotide comprising the polynucleotide whose sequence is between position 2950 and position 3275 of SEQ ID NO. 1.
  • the invention also relates to a promoter of the SGS3 gene of Arabidopsis thaliana.
  • the promoter of the SGS3 gene comprises a polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1.
  • the promoter of the SGS3 gene comprises a fragment biologically active of a polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1.
  • biologically active fragment is meant above a polynucleotide having a promoter activity and preferably a promoter activity in plants.
  • the techniques making it possible to establish the promoter activity of a polynucleotide are well known to those skilled in the art. These techniques conventionally involve the use of an expression vector comprising, in the direction of transcription, the polynucleotide to be tested and a reporter gene (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual. 1989).
  • polynucleotides comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide homologous to a polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1, b) a polynucleotide capable of s '' selectively hybridize to a polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO 1.
  • these polynucleotides have promoter activity in plant cells and plants.
  • the invention also relates to a terminator sequence of the SGS3 gene of Arabidopsis thaliana.
  • the terminator sequence of the SGS3 gene comprises a polynucleotide whose sequence is between position 2950 and position 3275 of SEQ ID NO. 1.
  • the terminator sequence of the SGS3 gene comprises a biologically active fragment of a polynucleotide whose sequence is between position 2950 and position 3275 of SEQ ID NO. 1.
  • the invention also relates to polynucleotides of the SGS3 cDNA.
  • the polynucleotides of the coding sequence of a plant SGS3 gene comprise polynucleotides of SEQ ID NO. 2.
  • the invention also extends to polynucleotides comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide homologous to a polynucleotide according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2; b) a polynucleotide capable of hybridizing selectively to a polynucleotide according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2.
  • the polynucleotides which are homologous to a reference polynucleotide or which selectively hybridize to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the polynucleotides of the present invention preferably code for a polypeptide essential for post-transcriptional inactivation in plants.
  • the polynucleotides of the present invention restore a sgs3 mutant of Arabidopsis thaliana. These mutants and their method of production are described in Elmayan et al. (Plant Cell, 10: 1747-1757, 1998). Other methods for constructing Arabidopsis thaliana mutants in which the SGS3 gene is inactive are well known to those skilled in the art. The methods for obtaining mutants of Arabidopsis thaliana are widely described in the literature.
  • homologous a polynucleotide having one or more sequence modifications compared to the reference sequence. These modifications can be deletions, additions or substitutions of one or more nucleotides of the reference sequence.
  • the percentage of homology will be at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% by compared to the reference sequence.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art. One can use for example the PILEUP or BLAST programs (in particular Altschul et al., J.
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising polynucleotides having at least 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with the polynucleotides SGS3, the polynucleotides of SEQ ED NO.l or the polynucleotides of SEQ ID NO . 2.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleotides having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with the polynucleotides SGS3, the polynucleotides of SEQ ID NO.l or the polynucleotides of SEQ ID NO. 2.
  • these homologs retain the function of the reference sequence.
  • sequence capable of selective hybridization is meant according to the invention the sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise.
  • the stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art. In general, the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C. lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C for a polynucleotide of more than 50 nucleotides.
  • the hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA.
  • the washes are for example carried out successively at low stringency in a 2X SSC buffer, 0.1% SDS, at medium stringency in a 0.5X SSC buffer, 01% SDS and at high stringency in a 0.1X SSC buffer, 0.1 % SDS.
  • the hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising a polynucleotide capable of hybridizing selectively with the polynucleotide of SEQ ID NO.l or the polynucleotide of SEQ ID NO. 2.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleotides capable of hybridizing selectively with the polynucleotide of SEQ ID NO.l or the polynucleotide of SEQ ID NO. 2.
  • these polynucleotides which hybridize selectively to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the present invention also relates to antisense polynucleotides allowing the inhibition of the expression of a plant SGS3 gene.
  • the antisense polynucleotides hybridize specifically to the mRNA of a plant SGS3 gene thus interfering with the expression of this gene.
  • Techniques for inhibiting the expression of a protein by an antisense polynucleotide are well known to those skilled in the art and widely described in the literature, in particular by Judelson et al. (Gene, 133: 63-69, 1993) as well as by Prokish et al. (Mol.Gen.Genet. 256: 104-114, 1997).
  • the antisense polynucleotides of the present invention hybridize to the mRNA of a plant SGS3 gene over its entire length or only to part of the mRNA of a plant SGS3 gene.
  • the antisense polynucleotides of the present invention can be perfectly complementary to the mRNA of a plant SGS3 gene or sufficiently homologous to allow pairing and inhibition of the expression of a plant SGS3 gene.
  • the present invention therefore also relates to polynucleotides comprising an antisense polynucleotide of a plant SGS3 gene and preferably an antisense polynucleotide of the coding sequence of the SGS3 gene of SEQ ID NO. 2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention are derived from a polynucleotide of SEQ ID NO. 2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention comprise the polynucleotide of SEQ ID No.2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention comprise a fragment of at least 100 nucleotides, preferably of at least 500 nucleotides and preferably of at least 1000 nucleotides of SEQ ID NO.2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention comprise a polynucleotide having at least 85%, 90%), 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with a polynucleotide of SEQ ID NO. 2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention comprise a polynucleotide having at least 85%, 90%, 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% of homology with a fragment d '' at least 100 nucleotides, preferably at least 500 nucleotides and preferably at least 1000 nucleotides of SEQ ID NO.2.
  • the antisense polynucleotides of the present invention specifically inhibit the expression of an SGS3 gene in plants.
  • the antisense polynucleotide of the present invention are expressed in plant cells or plants from an expression cassette.
  • the present invention relates to the use of a polynucleotide or of a fragment of a polynucleotide of SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 according to the invention for the identification of the SGS3 gene in other plants.
  • Cloning is carried out, for example, by screening cDNA libraries or genomic DNA libraries with a polynucleotide or a fragment of a polynucleotide of SEQ ID NO.l and SEQ ID NO.2. These libraries can also be screened by PCR using specific or degenerate oligonucleotides derived from SEQ ID NO.l or SEQ ID NO.2.
  • Plant SGS3 genes can also be identified in databases by nucleotide or protein BLAST using SEQ ID NOs. 1-3. Preferably, it is verified that the cloned genes perform the same function as the gene
  • a subject of the invention is also polynucleotides comprising a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention.
  • the present invention also relates to SGS3 polypeptides.
  • SGS3 polypeptides designates all of the polypeptides of the present invention as well as the polypeptides for which the polynucleotides of the present invention encode.
  • SGS3 polypeptides also refers to fusion proteins, recombinant proteins or chimeric proteins comprising these polypeptides.
  • polypeptide also denotes proteins and peptides as well as modified polypeptides.
  • the polypeptides of the invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polypeptides can be prepared by various methods. These methods include purification from natural sources such as cells naturally expressing these polypeptides, production of recombinant polypeptides by appropriate host cells and their subsequent purification, production by chemical synthesis or, finally, a combination of these different approaches. . These various production methods are well known to those skilled in the art.
  • the SGS3 polypeptides of the present invention can be isolated from plants expressing SGS3 polypeptides.
  • the SGS3 polypeptides of the present invention are isolated from recombinant host organisms expressing a heterologous SGS3 polypeptide or expressing a natural SGS3 polypeptide under the control of a heterologous promoter.
  • These organizations are preferably chosen from bacteria, yeasts, fungi, animal cells, plant cells or plants.
  • the subject of the present invention is a polypeptide of sequence SEQ ID NO.3 as well as a polypeptide comprising a polypeptide of sequence SEQ ID NO. 3.
  • the invention also comprises polypeptides comprising a fragment or a homolog of a SGS3 polypeptide and more particularly of the polypeptide of SEQ ID NO. 3.
  • fragment of a polypeptide refers to a polypeptide comprising part but not all of the polypeptide from which it is derived.
  • the invention relates to a polypeptide comprising a fragment of at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 amino acids of a polypeptide of SEQ ID NO.3.
  • these fragments retain at least one biological activity of the polypeptide from which they are derived.
  • this activity relates to post-transcriptional inactivation in plants.
  • the polypeptides of the present invention restore a sgs3 mutant of Arabidopsis thaliana.
  • homologous denotes a polypeptide according to the invention denotes a polypeptide which may have a deletion, an addition or a substitution of at least one amino acid.
  • the subject of the invention is a polypeptide having at least 75%, 80%, 85%, 90% or 95%), 98%> and preferably 99% "of identical amino acids with a polypeptide of SEQ ID NO. 3.
  • these homologous polypeptides retain the same biological activity.
  • this activity relates to post-transcriptional inactivation in plants.
  • the polypeptides of the present invention restore a sgs3 mutant of Arabidopsis thaliana.
  • the SGS3 gene can be expressed or over-expressed in different host organisms such as plants.
  • the present invention relates in particular to the overexpression of the SGS3 gene in plants or plant cells to improve their resistance to viruses.
  • the SGS3 gene can be expressed in a host organism under the control of the SGS3 promoter of the present invention or under the control of a heterologous promoter and preferably under the control of a promoter functional in plants.
  • a polynucleotide encoding an SGS3 polypeptide is inserted into an expression cassette using cloning techniques well known to those skilled in the art. This expression cassette includes the elements necessary for transcription and translation of the sequences coding for the SGS3 polypeptide.
  • this expression cassette comprises both elements making it possible to have an SGS 3 polypeptide produced by a host cell and elements necessary for the regulation of this expression.
  • the expression cassettes according to the invention comprise, in the direction of transcription, a functional promoter in a host organism, a plant SGS3 gene or the coding sequence of a plant SGS3 gene and a terminator sequence in said host organism.
  • the expression cassettes according to the invention comprise, in the sense of transcription, a functional promoter in a host organism, a polynucleotide encoding an SGS3 polypeptide and a terminator sequence in said host organism.
  • the expression cassette comprises, in the direction of transcription, a promoter functional in a host organism, a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotides encoding a polypeptide SGS3 of SEQ ID NO. 3, for a homolog or for a fragment of a polypeptide of SEQ ID NO.3; b) a polynucleotide of SEQ ID NO. 1; c) a polynucleotide of SEQ ID NO.
  • the expression cassettes of the present invention allow the expression of an antisense polynucleotide for the inhibition of expression of the SGS3 gene in a plant.
  • the expression cassettes according to the invention comprise, in the direction of transcription, a promoter functional in a host organism, an antisense polynucleotide of the coding sequence of a SGS3 gene. of a plant and a functional terminator sequence in said host organism.
  • the expression cassettes according to the invention comprise, in the direction of transcription, a promoter functional in a host organism, an antisense polynucleotide of the coding sequence of the SGS3 gene of SEQ ID NO. 2 and a functional terminator sequence in said host organism.
  • the antisense polynucleotides of the present invention are expressed under the control of an inducible promoter.
  • the subject of the invention is an expression cassette comprising, in the direction of transcription: a) a promoter functional in a host organism; and b) an SGS3 polynucleotide according to the invention in antisense orientation; and c) a terminator sequence in said host organism.
  • the SGS3 promoter can be used to express a heterologous gene in a host organism and in particular in plant cells or in plants.
  • the invention therefore also relates to expression cassettes comprising the promoter of a plant SGS3 gene operatively associated with a sequence coding for a heterologous protein, allowing the expression of said protein in plant cells or plants.
  • the expression cassette according to the invention comprises, in the direction of transcription, the SGS3 promoter from Arabidopsis thaliana. the coding sequence for the heterologous protein and a functional terminator sequence in the plant cells and plants.
  • the expression cassette according to the invention comprises, in the direction of transcription, a polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1 or a biologically active fragment of the polynucleotide whose sequence is between position 1 and position 695 of SEQ ID NO. 1, the sequence coding for a heterologous polypeptide and a terminator sequence functional in plant cells and plants.
  • the expression cassettes according to the present invention can also include any other sequence necessary for the expression of the gene of interest, such as for example regulatory elements or signal sequences allowing the addressing of the polypeptide of interest.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising an expression cassette according to the invention and in particular a vector comprising an expression cassette according to the invention.
  • the expression cassettes according to the present invention are inserted into a vector for their replication or for the transformation of a host organism.
  • Certain elements of the expression cassettes according to the invention are illustrated below without implied limitation. Promoters
  • any type of promoter sequence can be used in the expression cassettes according to the invention.
  • the choice of promoter will depend in particular on the host organism chosen for the expression of the gene of interest.
  • the present invention relates more particularly to the transformation of plants.
  • the choice of promoter used in the expression cassette determines the temporal and spatial expression of the gene of interest. Certain promoters allow specific expression in certain tissues of the plant (roots, leaves or seeds for example) or in certain cells of the plant. Some promoters allow constitutive expression while other promoters are on the contrary inducible.
  • promoter regulatory sequence in plants any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants can be used, in particular a promoter expressing in particular in the leaves of plants, such as for example so-called promoters of original origin.
  • bacterial, viral or vegetable or also so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit of a plant or any suitable known promoter which can be used.
  • RuBisCO small ribulose-biscarboxylase / oxygenase
  • any suitable known promoter which can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • the promoters of a plant virus gene there may be mentioned that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the circovirus promoter (AU 689 311).
  • a promoter regulatory sequence specific to specific regions or tissues of plants and more particularly specific promoters of seeds (Datla et al., Biotechnology Ann. Rev. 3: 269-296, 1997). It is also possible to use an inducible promoter advantageously chosen from the promoters of phenylalanine ammonia lyase (PAL), of HMG-CoA reductase (HMG). of chitinases. glucanases.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • HMG HMG-CoA reductase
  • chitinases glucanases.
  • PI proteinase
  • PR1 family genes nopaline synthase (nos) or the vspB gene (US 5,670,349)
  • HMG2 promoter US 5,670,349
  • beta promoter apple galactosidase ABS 5,670,349
  • ACC synthase ACC synthase
  • any regulatory sequence can be used which makes it possible to increase the level of expression of the coding sequence inserted in said expression cassette.
  • transcription activators e.g., transcription activators
  • leader sequences derived from viruses mention will be made, for example, of the activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or the activator of the tobacco etch virus (TEV).
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco etch virus
  • Different sequences derived from plant introns can also be used to increase the level of expression of the gene of interest, especially in monocotyledonous plants.
  • Terminator Sequences A wide variety of terminator sequences can be used in the expression cassettes according to the invention. These sequences allow the termination of transcription and polyadenylation of the mRNA. Any terminator sequence functional in the selected host organism can be used. For expression in plants, it is possible in particular to use the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or alternatively terminator sequences of plant origin, such as for example the histone terminator (see EP 0 633 317), the terminator CaMV 35 S and the tml terminator. These terminator sequences are usable in monocotyledonous and dicotyledonous plants.
  • the terminator sequence of the SGS3 gene from Arabidopsis thaliana is another example of a terminator sequence which can be used in the expression cassettes according to the invention.
  • any gene of interest can be expressed in a host organism under the control of an SGS3 promoter.
  • the SGS3 promoter is used for the expression of a heterologous gene in plant cells or in a plant.
  • the genes of interest which may be expressed in plants under the control of an SGS3 promoter are more broadly illustrated below.
  • the present invention also relates to transformation or expression vectors comprising at least one SGS3 polynucleotide or an expression cassette according to the present invention.
  • the vectors of the present invention are used in particular for transforming a host organism and for expressing an SGS3 polypeptide or an SGS3 polynucleotide in said host organism.
  • the host organism is for example a bacterium, a yeast, a fungus, a plant cell or a plant.
  • This vector can in particular consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus into which is inserted a polynucleotide SGS3 or an expression cassette according to the invention.
  • any vector capable of maintaining, of self-replicating or of propagating in a host cell in order to induce the expression of a polynucleotide or of a polypeptide can be used.
  • the vectors according to the invention comprise at least one origin of replication.
  • the vectors of the invention also comprise at least one selection marker and preferably a selection marker usable in plant cells or in plants.
  • selection markers there may be mentioned antibiotic resistance genes such as the npt11 gene for resistance to kanamycin (Bevan et al. Nature 304: 184-187, 1983) and the hph gene for resistance to 'hygromycin (Gritz et al. Gene 25: 179-188, 1983).
  • herbicide tolerance genes such as the bar gene (White et al., NAR 18: 1062, 1990) for bialaphos tolerance, the EPSPS gene (US 5,188,642) for glyophosate tolerance or the HPPD gene. (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. It will also be possible to use the genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS or genes coding for pigments and enzymes regulating the production of pigments in the transformed cells. Such selection marker genes are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • these vectors are used for the transformation of a host organism.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate transformation vectors in particular as a function of the host organism to be transformed and as a function of the transformation technique used.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • vectors have been developed for the transformation of plants with Agrobacterium tumefaciens. Other vectors are used for transformation techniques not based on the use of Agrobacterium. These vectors are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the subject of the invention is also a method of transforming host organisms, in particular plant cells with an SGS3 polynucleotide, an expression cassette or a transformation or expression vector according to the invention.
  • the transformation of the host organism can be obtained by any suitable known means, the techniques of transformation and in particular of transformation of plants are amply described in the specialized literature.
  • the following patents and patent applications may be cited: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672,752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204.25 EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071, WO 95/06128 and WO 99/19497.
  • Agrobacterium in particular for the transformation of dicotyledons.
  • a series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods include bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Other methods can also be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
  • the present invention also relates to a host organism transformed with a polynucleotide SGS3, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • host organism is meant in particular according to the invention any mono or multicellular organism, lower or higher, in particular chosen from bacteria, yeasts, fungi or plant cells and plants.
  • the bacteria are chosen from Escherichia coli
  • the yeasts are chosen from Pichia postons and Saccharomyces cerevisae
  • the fungi are chosen from Aspergillus niger.
  • the host organism is a plant cell or a plant.
  • Plant cell is understood according to the invention any cell derived from a plant and capable of constituting undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat. barley, sorghum, rapeseed, soybeans, rice. sugar cane, beet, tobacco, cotton, clover, duckweed (lemnae) etc.
  • the host organism comprises at least one other heterologous gene coding for a peptide. a polypeptide or protein of interest.
  • the polynucleotide comprising a SGS3 polynucleotide according to the invention and the other heterologous gene (s) may have been introduced into the host organism simultaneously by means of the same vector comprising them, or by means of several vectors, or sequentially by means of several vectors, or by crossing several host organisms, each comprising a heterologous gene.
  • heterologous gene is meant according to the invention any gene introduced artificially into the host organism, and more particularly artificially integrated into its genome, the methods allowing this introduction or integration possibly being those described above, the content of the references cited being incorporated herein by reference.
  • the heterologous gene other than SGS3 polynucleotides according to the invention may be a gene comprising a coding sequence and regulatory elements at the 5 'and 3' to said coding sequence not modified with respect to the natural gene, reintroduced artificially in the genome of a host organism which may be of the same species as that from which the gene was isolated, or of a different species.
  • the heterologous gene may also be a chimeric gene or an expression cassette comprising a coding sequence original, plant, bacterial, fungal, viral or animal, under the control of regulatory elements functional in the host organism, other than those naturally functionally linked to the coding sequence.
  • the present invention also relates to plants containing transformed cells as defined above, in particular plants regenerated from transformed cells and leu r offspring Regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to genetically modified plants in the genome of which an SGS3 polynucleotide or an expression cassette according to the invention are integrated in a stable and transmissible manner by sexual reproduction.
  • the present invention also relates to plants obtained by crossing the regenerated plants above with other plants. It also relates to the seeds of transformed plants. Sss3 mutants
  • the invention also relates to sgs3 mutants in which the SGS3 gene is inactivated. Inactivation of this gene leads to the inhibition of post-transcriptional inactivation phenomena in these mutants.
  • Inactivation of the SGS3 gene in plants can be achieved by different mutagenesis techniques, site-directed mutagenesis, "machine gene” or by homologous recombination techniques (Kempin, SA et al., Targeted disruption in Arabidopsis, Nature 389: 802-803, 1997). These techniques are well known to those skilled in the art. Among the mutagenesis techniques, mention will be made of chemical mutagenesis techniques. Mention will also be made of the mutagenesis techniques using transposable elements allowing the inactivation of genes by insertion. When the mutagenesis techniques used do not specifically make it possible to inactivate the SGS3 gene, the mutants obtained are screened to identify the mutants affected in the SGS3 gene.
  • This screening can be a phenotypic screening or a screening based on the amplification and sequencing of the SGS3 gene in the mutants according to techniques described in the literature.
  • chimeraplasty US 6,010,907
  • mutants are obtained according to the method described by Elmayan et al. (Plant Cell, 10: 1747-1757, 1998) by treating seeds with 0.4% EMS (ethyl methanesulfonate) solution. The mutants are then analyzed to identify the mutants affected in the SGS3 gene. This screening can for example be carried out by PCR.
  • the present invention also relates to the use of SGS3 mutants for the identification of SGS3 genes in other plant species such as, for example, tobacco, rapeseed, sunflower, soybeans, cotton, rice, corn, sorghum, barley or wheat.
  • SGS3 mutants for the identification of SGS3 genes in other plant species such as, for example, tobacco, rapeseed, sunflower, soybeans, cotton, rice, corn, sorghum, barley or wheat.
  • the functional counterparts of SGS3 in other species are identified by complementing the sgs3 mutants according to the invention.
  • a polynucleotide that restores the wild type of post-transcriptional inactivation is cloned.
  • the sequence of this polynucleotide is then determined in order to identify the constituent elements of the cloned gene.
  • the development of genetic transfer techniques has made it possible to express genes in plants, in particular with a view to improving their agronomic properties or for the production of proteins of interest.
  • post-transcriptional inactivation phenomena constitute an important obstacle to the stability of the expression of transgenes in plants. These phenomena of suppression of the expression of the transgene are particularly frequent in the context of strongly expressed transgenes.
  • the present invention relates to a new plant gene SGS3. Inhibition or inactivation of this SGS3 gene in plants causes inhibition of the post-transcriptional inactivation phenomenon and therefore makes it possible to obtain plants in which the expression of heterologous genes is more stable as well as plants in which the level of expression of heterologous genes is higher.
  • the invention relates to a method for expressing a heterologous gene in a plant characterized in that it comprises the transformation of the plant with the heterologous gene and the inhibition of expression of the SGS3 gene in said plant.
  • the invention relates to a method for expressing a heterologous gene in a plant characterized in that it comprises the following stages: a) transforming said plant with said heterologous gene; and b) inhibiting the expression of an SGS3 polynucleotide according to the invention in said plant.
  • inhibiting the expression of the SGS3 gene comprises transforming the plant with a polynucleotide comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) an antisense polynucleotide of the coding sequence of a plant SGS3 gene; b) an antisense polynucleotide of the coding sequence of the SGS3 gene of SEQ ID NO.2; c) an expression cassette comprising, in the direction of transcription, a promoter functional in a host orgasm, a polynucleotide as defined in a) or b) and a terminator sequence functional in said host organism.
  • the invention in another embodiment relates to a method for expressing a heterologous gene in a plant characterized in that it comprises the transformation of the plant with the heterologous gene and the inactivation of the expression of the SGS3 gene in said plant .
  • the invention also relates to a method for expressing a heterologous gene in a plant comprising the following steps: a) transforming said plant with said heterologous gene; b) the expression of an SGS3 polynucleotide according to the invention is inactivated in said plant.
  • step of inactivation or inhibition of the plant SGS3 gene and the step of transformation of the plant with a heterologous gene can be carried out simultaneously on the same plant or sequentially or by crossing several plants.
  • the methods according to the invention can therefore also include stages of plant regeneration, asexual multiplication or crossing of plants.
  • heterologous genes of interest can be expressed in plants in which the expression of the SGS3 gene is inhibited or inactivated.
  • the heterologous gene codes for peptides, proteins or enzymes. These can be reporter proteins, selection markers or peptides or proteins of interest giving the host organism new properties, especially new agronomic properties to the transformed plants.
  • genes conferring new agronomic properties on transformed plants there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring resistance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases, etc. Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • a gene coding for an FfPPD conferring tolerance to herbicides targeting ⁇ HPPD such as isoxazoles, in particular isoxafutole (FR 95 06800. FR 95 13570).
  • diketonitriles EP 496 630, EP 496 631
  • triketones in particular sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195).
  • Such genes coding for HPPD conferring tolerance to herbicides targeting HPPD are described in patent application WO 96/38567.
  • proteins of interest imparting novel insect resistance properties are more particularly Bt proteins widely described in the literature and well known to the skilled person. Mention will also be made of proteins extracted from bacteria such as Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
  • chitinases and glucanases oxalate oxidase, all these proteins and their coding sequences being widely described in the literature, or else antibacterial and / or antifungal peptides, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly the lytic peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between the cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, deposited on August 18, 1998) or drosomicin (PCT / FR98 / 01462, filed July 8, 1998).
  • the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al., 1993; Panab restaurants & al., 1995).
  • proteins enriched in sulfur amino acids will also have the function of trapping and storing excess cysteine and / or methionine, making it possible to avoid the possible problems of toxicity linked to an overproduction of these sulfur amino acids by trapping them.
  • Mention may also be made of genes coding for peptides rich in sulfur amino acids and more particularly in cysteines. said peptides also having antibacterial and / or antifungal activity.
  • Mention will more particularly be made of plant defensins, as well as lytic peptides of any origin, and more particularly the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814. Deposited on August 18, 1998) or drosomicin (PCT / FR98 / 01462, filed July 8, 1998).
  • the host organisms of the present invention can also be used for the production of proteins of interest in plants or "molecular farming". Indeed, the invention relates in particular to transformed plants making it possible to obtain higher levels of expression of heterologous genes.
  • proteins of interest mention will in particular be made of peptides and mammalian proteins.
  • immunoglobulins US 5,990,385; US 5,639,947, 5,959,177
  • interferon US 4,956,282
  • FIGURE 1 sgs3 Mutants
  • Example 1 Isolation and Identification of the SGS3 Gene from Arabidopsis
  • the mutant SGS3 (affected in the SGS3 gene) was obtained using the same experimental protocol as that which allowed the isolation of the mutants sgsl and sgs2 (Elmayan et al. Plant Cell 10: 1747-1757, 1998).
  • the starting line was the Ll line.
  • Ll is a transgenic line obtained by transformation of plants of the Columbia ecotype by construction 23b (Elmayan and Vaucheret, Plant J. 9: 787-797, 1996).
  • the L1 line has only one transgenic locus.
  • the glucuronidase activity in the L1 line is 4000 nmol of 4-methylumbelliferone per minute and per microgram of total proteins in the first days of development.
  • the GUS activity in these 6 mutant lines, 1 month after germination, is between 2500 and 3500 nmol of 4-methylumbelliferone per minute and per microgram of total proteins. .
  • the GUS activity in these mutant lines, 1 month after germination, is between 2,500 and 3,500 nmol of 4-methylumbelliferone per minute and per microgram of total proteins.
  • the GUS activity, the mRNA accumulation and the transcription rate were measured by fluorimetric tests, by blot analysis. mRNA and through "run-on" experiences.
  • the GUS activity is multiplied by a factor of 300 in the sgs2 mutants compared to the L1 line while the accumulation of mRNA is multiplied by a factor of 250.
  • the transcription rate is only multiplied by a factor 2.6 compared to the Ll line.
  • Line 2a3 is a transgenic line of Arabidopsis thaliana resulting from the transformation of a plant of the Columbia ecotype by construct 2a (Elmayan et al., Plant Cell 10: 1747-1757, 1998) containing the transcribed part of the gene NIA2 from Arabidopsis encoding nitrate reductase under the control of the 35S promoter and the hygromycin hpt resistance gene. All the plants of the 2a3 line homozygous for the 2a construction have a post-transcriptional inactivation of the Nia2 genes (transgenic and endogenous) leading to chlorosis of the plant and then to its death.
  • the transgenic locus 2a3 When the transgenic locus 2a3 is in the heterozygous state, only part of the plants undergo post-transcriptional inactivation. The stage at which this inactivation takes place varies from one plant to another. In some plants inactivation is late enough to allow the production of pollen and seeds.
  • the hybrid plants resulting from the cross between the mutant sgs3-2 and the line 2a3 were cultivated in the greenhouse and the seeds for self-fertilization were harvested. These were sown in the greenhouse and the plants obtained without chlorosis were kept to harvest their seeds for self-fertilization. We then sowed the different lots of seeds on an agar medium containing 20 mg / l of hygromycin.
  • sgs3-1 mutants were inoculated with the cucumber mosaic virus (CMV) strain II 7F.
  • CMV cucumber mosaic virus
  • infection with this viral strain leads to plants whose development is slower and altered: smaller rosette leaves, long but very flexible flower stalk, reduced but not zero fertility.
  • infection with this viral strain leads to an increased alteration of development: the plants have a particularly bushy habit, the leaves of the rosette are small and twisted, the flower stalk reaches a size at the end of development of the order of 5 cm, the plants are completely sterile.
  • F2-1 lines 120 homozygous F2 lines for the sgs3- ⁇ mutation
  • F2-2 lines 90 homozygous F2 lines for the sgs3-2 mutation
  • the polymorphism corresponding to the molecular marker 13H2L was revealed by hybridization (of the Southern blot type) of the total DNA of Arabidopsis plants, digested with the restriction enzyme HindIII, by a fragment of radioactive DNA corresponding to l left end of the artificial yeast chromosome (YAC) 13H2 (probe 13H2L).
  • the polymorphism corresponding to the molecular marker 3B3D was revealed by hybridization (of the type
  • the resulting plasmids were introduced into E. coli and then into the Agrobacterium tumefaciens C58pMP90 strain.
  • the resulting bacterial strains were used to transform plants of the sgs3-2 2a3 lines.
  • Strain Bacterial 356 made it possible to obtain 20 transgenic lines. Among these 20 lines. 19 showed signs of chlorosis identical to those observed on line 2a3. On 3 of these plants we were able to show by northem type hybridization using as probe NIA2 gene from Arabidopsis thaliana.
  • the DNA sequence inserted at the BamHI site of the plasmid pBin + and which led to the isolation of the bacterial strain 356 was determined. Subclones of clone 356 were made in the vector pBin + and the same sgs3-2 2a3 line was transformed by these subclones in order to determine those capable of restoring the function of the SGS3 gene. The smallest subclone capable of restoring this function constitutes the SGS3 gene as described in this patent. By computer analysis the ORS of SGS3 could be predicted. The sequence of the cDNA containing the ORF of the SGS3 gene and therefore the position of the promoter, terminator and intronic sequences of SGS3 were verified after having isolated and cloned this sequence.
  • PCR was carried out on the genomic DNA of these 5 mutants using the primers p356AD 'and P356Y' (see example 1). This reaction allows the amplification of the entire SGS3 gene. The fragment amplified by this PCR reaction was sequenced.
  • the nucleotide sequence thus obtained is then treated with the enzyme “klenow” to generate “blunt” ends at the ends of the amplified sequence.
  • the sequence is then cloned between the 35S promoter and the cauliflower mosaic virus terminator at the Smal site of the vector pRTl 00.
  • the clones are selected such that the sequence corresponding to p356AD 'is located near the 35S promoter.
  • clones are selected such that the sequence corresponding to p356Y 'is located near the 35S promoter.
  • This Assgs3 construction allows the expression of an anti-sense mRNA of the SGS3 mRNA.
  • Example 4 Transformation of Plants The expression cassettes constructed as described above are then introduced into a binary vector to allow their introduction via Agrobacterium tumefaciens into plants.
  • the binary vector used is the plasmid pBIN + (Van Engelen et al., Transgenic Research 4, 288-290, 1995). This is done by digesting the constructions obtained above with the enzyme SphI (which releases the expression cassettes) and by ligating the product of this digestion with the plasmid pBIN + digested with the enzyme SphI.
  • Example 5 Inhibition of Expression of the SGS3 Gene by Antisense
  • the complete cDNA of the SGS3 gene was cloned in antisense orientation (aSGS3) between the 35S promoter (p35S) and the 35S terminator (t35S).
  • the chimeric gene p35S-aSGS3-t35S was re-cloned into the binary vector pBiB-Hyg then transferred into Agrobacterium tumefaciens.
  • Plants of the L1 line p35S-GUS-tRbcS gene subjected to PTGS
  • the transformed plants were selected on medium supplemented with hygromycin.
  • the GUS activity of the p35S-GUS-tRbcS transgene was measured in the untransformed L1 plants, in 28 hygromycin-resistant transformants, as well as in the sgs3 mutants obtained by EMS mutagenesis of the L1 line.
  • the GUS activity in untransformed L1 plants is between 0 and 10 nmol MU / min / ug of protein while the GUS activity in sgs3 mutants is between 3000 and 5500 nmol MU / min / ug of proteins.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comprenant le gène <i>SGS3</i> de plante impliqué dans les phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle dans les plantes transgéniques et dans la résistance des plantes aux infections virales, et son utilisation pour la préparation de plantes génétiquement modifiées.

Description

Nouveau gène SGS3 de plante et son utilisation
La présente invention concerne un nouveau gène SGS3 de plante et son utilisation pour la préparation de plantes génétiquement modifiées. On connaît de l'état de la technique des méthodes permettant d'intégrer des gènes hétérologues dans le génome des plantes de différentes espèces. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459.355. US 4,536,475. US 5.464.763, US 5.177.010, US 5,187,073, EP 267.159, EP 604 662, EP 672 752, US 4.945.050. US 5.036.006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744. US 5,179,022. US 5.565.346, US 5.484.956, US 5,508,468, US 5.538.877, US 5,554,798, US 5.489,520. US 5,510.318, US 5.204.253, US 5,405,765, EP 442 174. EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
Le niveau d'expression du gène hétérologue dépendra de différents facteurs, dont le locus d'intégration du gène hétérologue dans le génome de la plante transformée et les phénomènes dits de " silencing ". Il est en effet connu de l'état de la technique que l'expression d'un gène hétérologue dans une plante peut être inhibée totalement ou en partie dans la descendance des plantes transformées régénérées, quand bien même le dit gène s'exprime correctement dans la plante régénérée directement issue de la cellule transformée. Les gènes hétérologues introduits peuvent parfois subir une inactivation épigénétique (inactivation ne s'accompagnant d'aucune modification de séquence). Lorsque les gènes présentent des homologies avec des gènes de l'organisme hôte, l'inactivation peut affecter également l'expression de ces gènes hôtes et engendrer des effets délétères pour l'organisme (co-inactivation). Deux mécanismes distincts d' inactivation ont été mis en évidence chez les végétaux supérieurs, se traduisant soit par un blocage de la transcription (inactivation transcriptionnelle) soit par une dégradation des ARN (inactivation post-transcriptionnelle).
Ces phénomènes d'inactivation. révélés accidentellement par la transgenèse, reflètent certainement des processus fondamentaux du contrôle épigénétique de l'expression des gènes, et leur étude constitue donc un moyen original d'accès à la compréhension des mécanismes de régulation mis enjeu au cours du développement des plantes. La mise en évidence de ces phénomènes soulève par ailleurs de nombreuses questions quant à l'utilisation de plantes transgéniques tant pour des programmes d'amélioration variétale que pour des études de physiologie moléculaire. Ainsi, des plantes homozygotes monolocus obtenues avec un gène codant la protéine
GUS sous le contrôle du promoteur CamV 35S (35S-UidA) ont présenté une inactivation du transgène quel que soit le nombre de copies du transgène insérées au locus. Le phénomène se met en place au cours du développement de chaque génération indiquant une réversibilité méiotique. Des plantes haploïdes issues de la culture d'anthères de transformants homozygotes inactivés portant une seule copie du transgène ont montré une réactivation du gène suivie d'une inactivation au cours du développement, suggérant que la méiose était nécessaire au déclenchement du processus de réactivation, mais que le déclenchement de l'inactivation au cours du développement ne nécessitait pas de fertilisation, et ne résultait pas de l'interaction entre différentes copies du transgène. Enfin. des expériences de run-on ont montré que le phénomène survenait au niveau post- transcriptionnel (Elmayan et Vaucheret, Plant J. 9:787-797,1996).
En induisant une mutation des plantes transformées, il est possible, non seulement d'éliminer ces phénomènes d'inhibition, mais encore d'augmenter le niveau d'expression des gènes hétérologues dans cette plante mutée (Elmayan et al., 1998, Plant Cell 10:1747- 1757, 1998).
On conçoit donc qu'il est aujourd'hui indispensable d'identifier les gènes impliqués dans l'inactivation post-transcriptionnelle afin d'améliorer d'une part la stabilité de l'expression des transgènes dans les plantes et d'autre part la production de protéines recombinantes dans les plantes. L'identification de ces gènes présente également un grand intérêt en raison de leur rôle dans la résistance des plantes aux infections virales.
On a maintenant isolé un nouveau gène de plante, dénommé SGS3, impliqué dans les phénomènes d' inactivation post-transcriptionnelle dans les plantes transgéniques et dans la résistance des plantes aux infections virales. L'inhibition de ce gène conduit à l'inhibition des phénomènes d'inactivation post- transcriptionnelle en particulier dans les plantes transgéniques comprenant un gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine particuliers, permettant un niveau d'expression dudit peptide ou de ladite protéine à un niveau particulièrement élevé. L'invention a également pour objet la surexpression du gène SGS3 pour la préparation de plantes plus résistantes aux infections virales.
Description de la liste de séquences
SEQ ID NO.l : Gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 2: ADNc du gène SGS3 à'Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 3: Polypeptide SGS3 d'Arabidopsis thaliana
Description de l'invention
Polynucléotides SGS3
La présente invention concerne des polynucléotides SGS3, en particulier des polynucléotides comprenant un gène SGS3 de plante. Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention comprennent la séquence codante d'un gène SGS3 de plante. Le gène SGS3 peut être isolé chez les plantes dicotylédones, comme Arabidopsis, le tabac, le colza, le tournesol, le soja, le coton, le trèfle, la lentille d'eau (lemnae) ou chez les plantes monocotylédones comme le riz, le maïs ou le blé. De manière avantageuse, le gène SGS3 est isolé chez les plantes dicotylédones, en particulier les crucifères comme Arabidopsis ou le colza. De préférence, les polynucléotides de l'invention comprennent un gène SGS3 d! Arabidopsis thaliana.
Le terme "polynucléotides SGS3" désigne l'ensemble des polynucléotides de la présente invention, de préférence, les polynucléotides de la séquence génomique de SGS3, les polynucléotides de la séquence de l'ADNc de SGS3. ainsi que les polynucléotides codant pour les polypeptides SGS3 de la présente invention. Le terme "polynucléotides SGS3" désigne également des polynucléotides recombinants comprenant les dits polynucléotides.
Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés.
Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. ( Molecular Cloning : A Labratory Manual. 1989) ou par synthèse chimique.
L'invention comprend des polynucléotides de la séquence génomique du gène SGS3. Cette séquence génomique comprend 5 exons (positions 696-1658, 1732-2023, 2135-2379, 2482-2648, 2739-2949 de la SEQ ID NO. 1), 4 introns (positions 1659-1731, 2024-2134, 2380-2481, 2649-2738 de la SEQ ID NO.l) et des séquences régulatrices en 5' et en 3'. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les polynucléotides de la séquence génomique de SGS3 comprennent un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO.1 , b) un polynucléotide comprenant au moins un exon de la SEQ ID NO.1 ; c) un polynucléotide comprenant une combinaison d'exons de la SEQ ID NO.1. La présente invention concerne également un polynucléotide comprenant une séquence régulatrice en 5' ou en 3' du gène SGS3. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide de régulation en 5' comprenant le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1. Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide de régulation en 3' comprenant le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1.
L'invention a également pour objet un promoteur du gène SGS3 dArabidopsis thaliana. De préférence, le promoteur du gène SGS3 comprend un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le promoteur du gène SGS3 comprend un fragment biologiquement actif d'un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1.
Par "fragment biologiquement actif on entend ci-dessus un polynucléotide ayant une activité promotrice et de préférence une activité promotrice dans les plantes. Les techniques permettant d'établir l'activité promotrice d'un polynucléotide sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques impliquent classiquement l'utilisation d'un vecteur d'expression comprenant dans le sens de la transcription le polynucléotide à tester et un gène rapporteur (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual. 1989). L'invention s'étend également aux polynucléotides comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide homologue à un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1, b) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1. De préférence, ces polynucléotides ont une activité promotrice dans les cellules végétales et les plantes.
L'invention concerne aussi une séquence terminatrice du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana. De préférence, la séquence terminatrice du gène SGS3 comprend un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence terminatrice du gène SGS3 comprend un fragment biologiquement actif d'un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1.
L'invention concerne aussi des polynucléotides de l'ADNc de SGS3. De manière préférée, les polynucléotides de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante comprennent des polynucléotides de la SEQ ID NO. 2.
L'invention s'étend également aux polynucléotides comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide homologue à un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2; b) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2.
De préférence, les polynucléotides homologues à un polynucléotide de référence ou s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Les polynucléotides de la présente invention codent de préférence pour un polypeptide essentiel pour l'inactivation post-transcriptionnelle dans les plantes. Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention restaurent un mutant sgs3 d'Arabidopsis thaliana. Ces mutants et leur méthode d'obtention sont décrits dans Elmayan et al. (Plant Cell, 10:1747-1757, 1998). D'autres méthodes permettant de construire des mutants d'Arabidopsis thaliana dans lesquels le gène SGS3 est inactivé sont bien connues de l'homme du métier. Les méthodes d'obtention de mutants d'Arabidopsis thaliana sont largement décrites dans la littérature.
Par " homologue " on entend selon l'invention un polynucléotide présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence de référence. Ces modifications peuvent être des délétions, des additions ou des substitutions d'un ou plusieurs nucléotides de la séquence de référence. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence d'au moins 98% et plus préférentiellement d'au moins 99% par rapport à la séquence de référence. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., J.Mol.Evol., 36:290-300, 1993; Altschul et al., J.Mol.Biol., 215 :403-10, 1990). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant des polynucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec les polynucléotides SGS3, les polynucléotides de la SEQ ED NO.l ou les polynucléotides de la SEQ ID NO. 2. De préférence l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec les polynucléotides SGS3, les polynucléotides de la SEQ ID NO.l ou les polynucléotides de la SEQ ID NO. 2. De préférence, ces homologues conservent la fonction de la séquence de référence.
Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1%SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%SDS et à forte stringence dans un tampon 0.1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucléotide de la SEQ ID NO.l ou le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. De préférence, l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucléotides capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucléotide de la SEQ ID NO.l ou le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. Préférentiellement, ces polynucléotides s'hy bridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.
La présente invention a également pour objet des polynucléotides antisens permettant l'inhibition de l'expression d'un gène SGS3 de plante. Les polynucléotides antisens s'hybrident spécifiquement à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante interférant ainsi avec l'expression de ce gène. Les techniques d'inhibition de l'expression d'une protéine par un polynucléotide antisens sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature notamment par Judelson et al. (Gène, 133:63-69,1993) ainsi que par Prokish et al. (Mol.Gen.Genet. 256:104-114, 1997).
Les polynucléotides antisens de la présente invention s'hybrident à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante sur toute sa longueur ou seulement à une partie de l'ARNm d'un gène SGS3 de plante. Les polynucléotides antisens de la présente invention peuvent être parfaitement complémentaires à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante ou suffisamment homologues pour permettre l'appariement et l'inhibition de l'expression d'un gène SGS3 de plante.
La présente invention a donc également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide antisens d'un gène SGS3 de plante et préférentiellement un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO. 2. Préférentiellement, les polynucléotides antisens de la présente invention sont dérivés d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. Selon un premier mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent le polynucléotide de la SEQ ID No.2. Selon un deuxième mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un fragment d'au moins 100 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et préférentiellement d'au moins 1000 nucléotides de la SEQ ID NO.2. Selon un troisième mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un polynucléotide présentant au moins 85%, 90%), 95% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. Selon un autre mode de réalisation les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un polynucléotide présentant au moins 85%, 90%, 95% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un fragment d'au moins 100 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et préférentiellement d'au moins 1000 nucléotides de la SEQ ID NO.2.
De préférence, les polynucléotides antisens de la présente invention inhibent spécifiquement l'expression d'un gène SGS3 chez les plantes. Selon un mode de réalisation préféré, les polynucléotide antisens de la présente invention sont exprimés dans les cellules végétales ou les plantes à partir d'une cassette d'expression.
La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 et de la SEQ ID NO. 2 selon l'invention pour l'identification du gène SGS3 dans d'autres plantes. Le clonage s'effectue par exemple par criblage de banques d'ADNc ou de banques d'ADN génomique avec un polynucléotide ou un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO.l et de la SEQ ID NO.2. Ces banques peuvent également être criblés par PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou dégénérés dérivés de la SEQ ID NO.l ou de la SEQ ID NO.2. Les techniques de construction et de criblage de ces banques sont bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). Des gènes SGS3 de plante peuvent également être identifiés dans les bases de données par BLAST nucléotidique ou protéique à l'aide des SEQ ID NO. 1-3. De préférence, on vérifie que les gènes clones assurent la même fonction que le gène
SGS3 d'Arabidopsis thaliana par introduction des gènes identifiés dans des mutants SGS3 et par test de restauration de l'inactivation post-transcriptionnelle (voir ci-dessous). L'invention a également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention.
Polypeptides SGS3
La présente invention concerne également des polypeptides SGS3. Le terme "polypeptides SGS3" désigne l'ensemble des polypeptides de la présente invention ainsi que les polypeptides pour lesquels codent les polynucléotides de la présente invention. Le terme "polypeptides SGS3" désigne également des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant ces polypeptides. Dans la présente description le terme "polypeptide" désigne également des protéines et des peptides ainsi que des polypeptides modifiés.
Les polypeptides de l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, les polypeptides SGS3 de la présente invention peuvent être isolés à partir de plantes exprimant des polypeptides SGS3. De préférence les polypeptides SGS3 de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un polypeptide SGS3 hétérologue ou exprimant un polypeptide SGS3 naturel sous le contrôle d'un promoteur hétérologue. Ces organismes sont préférentiellement choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales , les cellules végétales ou les plantes.
La présente invention a pour objet un polypeptide de séquence SEQ ID NO.3 ainsi qu'un un polypeptide comprenant un polypeptide de séquence SEQ ID NO. 3. L'invention comprend également des polypeptides comprenant un fragment ou un homologue d'un polypeptide SGS3 et plus particulièrement du polypeptide de la SEQ ID NO. 3.
Le terme "fragment" d'un polypeptide désigne un polypeptide comprenant une partie mais pas la totalité du polypeptide dont il est dérivé. L'invention concerne un polypeptide comprenant un fragment d'au moins 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 acides aminés d'un polypeptide de la SEQ ID NO.3. De préférence, ces fragments conservent au moins une activité biologique du polypeptide dont ils sont dérivés. Préférentiellement, cette activité concerne l'inactivation post-transcriptionelle chez les plantes. De manière préférée, les polypeptides de la présente invention restaurent un mutant sgs3 d'Arabidopsis thaliana. Le terme "homologue" désigne un polypeptide selon l'invention désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. L'invention a pour objet un polypeptide présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%o, 95%), 98%> et préférentiellement 99%» d'acides aminés identiques avec un polypeptide de la SEQ ID NO. 3. De préférence, ces polypeptides homologues conservent la même activité biologique. Préférentiellement, cette activité concerne l'inactivation post- transcriptionelle chez les plantes. De manière préférée, les polypeptides de la présente invention restaurent un mutant sgs3 d'Arabidopsis thaliana.
Cassettes d'expression
Le gène SGS3 peut être exprimé ou sur-exprimé dans différents organismes hôtes tels que les plantes. La présente invention concerne notamment la sur-expression du gène SGS3 dans les plantes ou les cellules végétales pour améliorer leur résistance aux virus. Le gène SGS3 peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle du promoteur SGS3 de la présente invention ou sous le contrôle d'un promoteur hétérologue et de préférence sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes. Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide SGS3 est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour le polypeptide SGS3. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide SGS 3 par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Dans un premier mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un gène SGS3 de plante ou la séquence codante d'un gène SGS3 de plante et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte. Dans un autre mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un polypeptide SGS3 et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte. Préférentiellement, la cassette d'expression comprend, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotides codant pour un polypeptide SGS3 de la SEQ ID NO. 3, pour un homologue ou pour un fragment d'un polypeptide de la SEQ ID NO.3; b) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 ; c) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2; d) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en b) ou c); e) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière spécifique à un polynucléotide tel que défini en b) ou c); f) un polynucléotide comprenant un fragment d'un polynucléotide tel que défini en b), c), d) et e). et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
Dans un autre mode de réalisation, les cassettes d'expression de la présente invention permettent l'expression d'un polynucléotide antisens pour l'inhibition de l'expression du gène SGS3 dans une plante. Pour l'expression d'un polynucléotide antisens dans une plante les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide antisens de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte. De préférence, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO. 2 et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte. Préférentiellement, les polynucléotides antisens de la présente invention sont exprimés sous le contrôle d'un promoteur inductible.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription: a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; et b) un polynucléotide SGS3 selon l'invention en orientation antisens ; et c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
Le promoteur SGS3 peut être utilisé pour exprimer un gène hétérologue dans un organisme hôte et notamment dans les cellules végétales ou dans les plantes. L'invention a donc également pour objet des cassettes d'expression comprenant le promoteur d'un gène SGS3 de plante associé de manière fonctionnelle à une séquence codant pour une protéine hétérologue, permettant l'expression de ladite protéine dans les cellules végétales ou les plantes. Dans un mode de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention comprend, dans le sens de la transcription, le promoteur SGS3 d'Arabidopsis thaliana. la séquence codante pour la protéine hétérologue et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes. De préférence, la cassette d'expression selon l'invention comprend, dans le sens de la transcription, un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1 ou un fragment biologiquement actif du polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1 , la séquence codant pour un polypeptide hétérologue et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes.
Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression du gène d'intérêt, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant l'adressage du polypeptide d'intérêt.
Les techniques de construction de ces cassettes d'expression sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).
La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention et notamment un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention.
Avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur pour leur réplication ou pour la transformation d'un organisme hôte. Certains éléments des cassettes d'expression selon l'invention sont illustrés ci- dessous à titre non limitatif. Promoteurs
Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. La présente invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Le choix du promoteur utilisé dans la cassette d'expression détermine l'expression temporelle et spatiale du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression spécifique dans certains tissus de la plante (racines, feuilles ou graines par exemple) ou dans certaines cellules de la plante. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311). On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ( Datla et al., Biotechnology Ann. Rev. 3:269-296, 1997). On peut également employer un promoteur inductible avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG). de chitinases. de glucanases. d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445). On pourra également utiliser le promoteur du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana.
Séquences de régulation de l'expression
Dans les cassettes d'expression de la présente invention on peut utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans ladite cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Parmi les séquences leader dérivées de virus on citera par exemple l'activateur du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou l'activateur du virus etch du tabac (TEV). Différentes séquences dérivées d'introns de plantes peuvent également être utilisées pour augmenter le niveau d'expression du gène d'intérêt notamment chez les plantes monocotylédones. On citera par exemple l'intron I du gène de mais AdhI (Callis et al.. Gènes Develop., 1 : 1183- 1200, 1987). Séquences terminatrices Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention. Ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes on peut notamment utiliser le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore des séquences terminatrices d'origine végétale, comme par exemple le terminateur d'histone (voir EP 0 633 317), le terminateur CaMV 35 S et le terminateur tml. Ces séquences terminatrices sont utilisables dans les plantes monocotylédones et dicotylédones.
La séquence terminatrice du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana est un autre exemple de séquence terminatrice utilisable dans les cassettes d'expression selon l'invention.
Gènes hétérologues
Tout gène d'intérêt peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle d'un promoteur SGS3. De préférence, le promoteur SGS3 est utilisé pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cellule de plante ou dans une plante. Les gènes d'intérêt pouvant être exprimés dans les plantes sous le contrôle d'un promoteur SGS3 sont plus largement illustrés ci-dessous.
Vecteurs La présente invention concerne également des vecteurs de transformation ou d'expression comprenant au moins un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon la présente invention. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte et pour exprimer un polypeptide SGS3 ou un polynucléotide SGS3 dans ledit organisme hôte. L'organisme hôte est par exemple une bactérie, une levure, un champignon, une cellule de plante ou une plante. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon l'invention. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte afin d'induire l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé.
Les techniques de construction de ces vecteurs et les techniques d'insertion d'une séquence appropriée dans ces vecteurs sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).
Avantageusement, les vecteurs selon l'invention comprennent au moins une origine de réplication. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection et de préférence un marqueur de sélection utilisable dans les cellules végétales ou dans les plantes. Parmi les marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que le gène nptll pour la résistance à la kanamycine (Bevan et al.. Nature 304:184-187, 1983) et le gène hph pour la résistance à l'hygromycine (Gritz et al.. Gène 25:179-188, 1983). On citera également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyophosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On pourra également utiliser les gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS ou des gènes codant pour des pigments et des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Avantageusement, ces vecteurs sont utilisés pour la transformation d'un organisme hôte. L'homme du métier choisira les vecteurs de transformation appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
De nombreux vecteurs ont été développés pour la transformation des plantes avec Agrobacterium tumefaciens. D'autres vecteurs sont utilisés pour les techniques de transformation ne reposant pas sur l'utilisation d'Agrobacterium. Ces vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Transformation
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales avec un polynucléotide SGS3, une cassette d'expression ou un vecteur de transformation ou d'expression selon l'invention.
Selon la présente invention la transformation de l'organisme hôte peut être obtenue par tout moyen connu approprié, les techniques de transformation et notamment de transformation des plantes sont amplement décrites dans la littérature spécialisée. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4.536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5.489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071, WO 95/06128 et WO 99/19497.
Certaines techniques utilisent Agrobacterium notamment pour la transformation des dicotylédones. Une série de méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes consistent à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. D'autres méthodes peuvent également être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
Organismes hôtes
La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucléotide SGS3, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les cellules végétales et les plantes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli, les levures sont choisies parmi Pichia postons et Saccharomyces cerevisae, les champignons sont choisis parmi Aspergillus niger. De manière préférentielle, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante. Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé. l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz. la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, le trèfle, la lentille d'eau (lemnae) etc.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide. un polypeptide ou une protéine d'intérêt. Le polynucléotide comprenant un polynucléotide SGS3 selon l'invention et le ou les autres gènes hétérologues peuvent avoir été introduits dans l'organisme hôte simultanément au moyen d'un même vecteur les comprenant, ou au moyen de plusieurs vecteurs, ou de manière séquentielle au moyen de plusieurs vecteurs, ou encore par croisement de plusieurs organismes hôtes, chacun comprenant un gène hétérologue.
Par gène hétérologue, on entend selon l'invention tout gène introduit de manière artificielle dans l'organisme hôte, et plus particulièrement intégré de manière artificielle dans son génome, les méthodes permettant cette introduction ou intégration pouvant être celles décrites précédemment, le contenu des références citées étant incorporé ici par référence.
Le gène hétérologue, autre que les polynucléotides SGS3 selon l'invention, peut être un gène comprenant une séquence codante et les éléments de régulation en 5" et 3' de ladite séquence codante non modifiés par rapport au gène naturel, réintroduit de manière artificielle dans le génome d'un organisme hôte pouvant être de la même espèce que celui d'où le gène a été isolé, ou d'une espèce différente. Le gène hétérologue peut également être un gène chimère ou une cassette d'expression comprenant une séquence codante d'origine, végétale, bactérienne, fongique, virale ou animale, sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels dans l'organisme hôte, différents de ceux naturellement liés fonctionnellement à la séquence codante. La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées et leur descendance. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. La présente invention concerne aussi les plantes génétiquement modifiées dans le génome desquelles un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon l'invention sont intégrés de manière stable et transmissible par reproduction sexuée.
La présente invention concerne également des plantes obtenues par croisement des plantes régénérées ci-dessus avec d'autres plantes. Elle concerne aussi les graines de plantes transformées. Mutants sss3
L'invention concerne également des mutants sgs3 dans lesquels le gène SGS3 est inactivé. L'inactivation de ce gène conduit à l'inhibition des phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle chez ces mutants.
L'inactivation du gène SGS3 dans les plantes peut être obtenue au moyen de différentes techniques de mutagenèse, de mutagenèse dirigée, de "gène machine" ou par des techniques de recombinaison homologue (Kempin, S.A.et al., Targeted disruption in Arabidopsis, Nature 389:802-803, 1997). Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Parmi les techniques de mutagenèse on citera les techniques de mutagenèse chimique. On citera également les techniques de mutagenèse utilisant des éléments transposables permettant l'inactivation de gènes par insertion. Lorsque les techniques de mutagenèse utilisées ne permettent pas de spécifiquement inactiver le gène SGS3, les mutants obtenus sont criblés pour identifier les mutants affectés dans le gène SGS3. Ce criblage peut être un criblage phénotypique ou un criblage basé sur l'amplification et le séquençage du gène SGS3 dans les mutants selon des techniques décrites dans la littérature. Parmi les techniques de mutagenèse dirigée on citera la chimeraplasty (US 6,010,907).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention des mutants sont obtenus selon le procédé décrit par Elmayan et al. (Plant Cell, 10:1747-1757, 1998) par traitement de graines avec une solution d'EMS (ethyl methanesulfonate) à 0,4%. Les mutants sont ensuite analysés pour identifier les mutants affectés dans le gène SGS3. Ce criblage peut par exemple s'effectuer par PCR.
La présente invention concerne également l'utilisation de mutants SGS3 pour l'identification de gènes SGS3 dans d'autres espèces végétales telles que par exemple le tabac, le colza, le tournesol, le soja, le coton, le riz, le maïs, le sorgho, l'orge ou le blé. Les homologues fonctionnels de SGS3 chez d'autres espèces sont identifiés par complémentation des mutants sgs3 selon l'invention. Un polynucléotide qui restaure le phénotype sauvage d'inactivation post-transcriptionnelle est clone. La séquence de ce polynucléotide est ensuite déterminée afin d'identifier les éléments constitutifs du gène clone.
Inhibition/Inactivation de SGS3 et expression de gènes hétérologues dans les plantes
Le développement des techniques de transferts génétiques a permis l'expression de gènes dans les plantes notamment en vue de l'amélioration de leur propriétés agronomiques ou pour la production de protéines d'intérêt. Cependant, les phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle constituent un obstacle important à la stabilité de l'expression des transgènes dans les plantes. Ces phénomènes de suppression de l'expression du transgène sont particulièrement fréquents dans le cadre de transgènes fortement exprimés. La présente invention concerne un nouveau gène de plante SGS3. L'inhibition ou l'inactivation de ce gène SGS3 dans les plantes provoquent une inhibition du phénomène d'inactivation post-transcriptionnelle et permet donc d'obtenir des plantes dans lesquelles l'expression des gènes hétérologues est plus stable ainsi que des plantes dans lesquelles le niveau d'expression des gènes hétérologues est plus élevé. Inactivation/inhibition du gène SGS3 dans les plantes Dans un premier mode de réalisation l'invention concerne un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de la plante avec le gène hétérologue et l'inhibition de l'expression du gène SGS3 dans ladite plante.
De préférence, l'invention concerne un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; et b) on inhibe l'expression d' un polynucléotide SGS3 selon l'invention dans ladite plante.
Préférentiellement. l'inhibition de l'expression du gène SGS3 comprend la transformation de la plante avec un polynucléotide comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide antisens de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante; b) un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO.2; c) une cassette d'expression comprenant, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un orgamsme hôte, un polynucléotide tel que défini en a) ou b) et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte.
Dans un autre mode de réalisation l'invention concerne un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de la plante avec le gène hétérologue et l'inactivation de l'expression du gène SGS3 dans ladite plante. L'invention a également pour objet un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante comprenant les étapes suivantes: a) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; b) on inactive l'expression d' un polynucléotide SGS3 selon l'invention dans ladite plante.
Dans le cadre de la présente invention il est bien entendu que l'étape d'inactivation ou d'inhibition du gène SGS3 de plante et l'étape de transformation de la plante avec un gène hétérologue peuvent être réalisés simultanément sur une même plante ou de manière séquentielle ou encore par croisements de plusieurs plantes. Les procédés selon l'invention peuvent donc également comprendre des étapes de régénération des plantes, de multiplication asexuée ou de croisements des plantes. Gènes hétérologues
Différents gènes hétérologues d'intérêt peuvent être exprimés dans les plantes dans lesquelles l'expression du gène SGS3 est inhibé ou inactivé. De préférence, le gène hétérologue code pour des peptides, des protéines ou des enzymes. Il peut s'agir de protéines rapporteurs, des marqueurs de sélection ou de peptides ou de protéines d'intérêt conférant à l'organisme hôte de nouvelles propriétés, plus particulièrement de nouvelles propriétés agronomiques pour les plantes transformées.
Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.
Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835. US 5,188.642. US 4,971.908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627.061. US 5,633.435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175). ou encore un gène codant pour une FfPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible ΓHPPD comme les isoxazoles, notamment l'isoxafutole (FR 95 06800. FR 95 13570). les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631) ou les tricétones, notamment la sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). De tels gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD sont décrits dans la demande de brevet WO 96/38567. Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases. l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995).
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit et al.. Eur. J. Biochem. 195:329-334, 1991 ; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 : WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines. les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants: l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814. déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Les organismes hôtes de la présente invention peuvent également être utilisés pour la production de protéines d'intérêt dans les plantes ou "molecular farming". En effet l'invention concerne notamment des plantes transformées permettant d'obtenir des niveaux d'expressions de gènes hétérologues plus élevés. Parmi les protéines d'intérêt, on citera notamment les peptides et les protéines de mammifères. La production d'immunoglobulines (US 5,990,385; US 5,639,947, 5,959,177) et d'interféron (US 4,956,282) ont par exemple été décrits dans les plantes.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans les exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989.
Description des figures
FIGURE 1 : Mutants sgs3
Exemples
Exemple 1 Isolement et identification du gène SGS3 d'Arabidopsis Le mutant SGS3 (affecté dans le gène SGS3) a été obtenu à partir du même protocole expérimental que celui ayant permis l'isolement des mutants sgsl et sgs2 (Elmayan et al.. Plant Cell 10:1747-1757, 1998). La lignée de départ était la lignée Ll. Ll est une lignée transgénique obtenue par transformation de plantes de l'écotype Columbia par la construction 23b (Elmayan et Vaucheret, Plant J. 9:787-797, 1996). La lignée Ll ne comporte qu'un seul locus transgénique. L'activité glucuronidase dans la lignée Ll est de 4000 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales dans les premiers jours du développement. Cette activité décroît ensuite très rapidement pour devenir inférieure à 5 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales 11 jours après la germination. L'inactivation de l'expression du transgène 35S-uidA est post-transcriptionnelle, ainsi que l'ont démontré les expériences de "run-on" mettant en évidence une forte transcription du transgène 35S-uidA dans les plantes Ll montrant une très faible activité GUS (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998). Pour l'obtention de plantes mutantes de la lignée Ll, 3000 graines de la lignée Ll ont été imbibées 16 heures dans une solution d'EMS (ethyl methanesulfonate) à 0.4%. Les graines ont ensuite été semées et les plantes obtenues ont été cultivées en serre jusqu'à obtenir des graines d'autofécondation. Celles-ci ont été à nouveau semées en serre et dans les plantes obtenues, l'activité GUS a été mesurée 1 mois après la germination. Les plantes présentant une activité élevée à ce stade ont été à la fois croisées avec des plantes de l'écotype Columbia (pour vérifier que le locus transgénique reste sensible à l'inactivation post-transcriptionnelle), rétrocroisées avec la lignée Ll (pour évaluer l'état de récessivité vs dominance des mutations obtenues) et croisées entre elles (pour classer les différents mutants obtenus en groupe de complémentation, chaque groupe définissant un gène). 6 mutants indépendants sgs3 ont ainsi été isolés. Ces 6 mutations sont récessives. L'activité GUS dans ces 6 lignées mutantes, 1 mois après germination, est comprise entre 2500 et 3500 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales. . L'activité GUS dans ces lignées mutantes, 1 mois après germination, est comprise entre 2500 et 3500 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales. Pour confirmer que les mutations sgs3 affectent l'expression du transgène 35S- GUS au niveau transcriptionnel, l'activité GUS, l'accumulation de l'ARNm et le taux de transcription ont été mesurés par des tests fluorimétriques, par l'analyse de blots d'ARNm et par des expériences de "run-on". L'activité GUS est multipliée par un facteur de 300 dans les mutants sgs2 par rapport à la lignée Ll alors que l'accumulation de l'ARNm est multipliée par un facteur de 250. Le taux de transcription n'est que multiplié par un facteur de 2.6 par rapport à la lignée Ll . Pour vérifier que les mutations sgs33 protégeaient de l'inactivation post-transcriptionnelle d'un autre gène que le gène uidA, un des mutants sgs3 (nommé sgs3-2) a été croisée avec la lignée 2a3 (Elmayan et al.. Plant Cell 10:1747-1757, 1998). La lignée 2a3 est une lignée transgénique d'Arabidopsis thaliana résultant de la transformation d'une plante de l'écotype Columbia par la construction 2a (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998) contenant la partie transcrite du gène NIA2 d'Arabidopsis codant la nitrate reductase sous le contrôle du promoteur 35S et le gène de résistance à l'hygromycine hpt. Toutes les plantes de la lignée 2a3 homozygotes pour la construction 2a présentent une inactivation post-transcriptionnelle des gènes Nia2 (transgéniques et endogènes) conduisant à la chlorose de la plante puis à sa mort. Lorsque le locus transgénique 2a3 est à l'état hétérozygote, seule une partie des plantes subissent l'inactivation post-transcriptionnelle. Le stade à laquelle se met en place cette inactivation est variable d'une plante à l'autre. Chez certaines plantes l'inactivation est suffisamment tardive pour permettre la production de pollen et de graines. Les plantes hybrides issues du croisement entre le mutant sgs3-2 et la lignée 2a3 ont été cultivées en serre et les graines d'autofécondation ont été récoltées. Celles-ci ont été semées en serre et les plantes obtenues ne présentant pas de chlorose ont été conservées pour récolter leur graines d'autofécondation. Nous avons alors semé les différents lots de graines sur un milieu gélose contenant 20mg/l d'hygromycine. Parmi ceux-ci, certains ne donnaient que des plantes résistantes à l'hygromycine et ne montrant aucun signe de chlorose tout au long de leur développement. Parmi ces lignées résistantes à l'inactivation post-transcriptionnelle des gènes de nitrate reductase, certaines étaient également homozygotes pour la construction 23b. Nous avons également montré que les plantes de toutes ces lignées présentaient une activité GUS élevée tout au long de leur développement. Ces résultats montrent donc que la mutation sgs3, non seulement protège de l'inactivation post- transcriptionnelle du transgène 35S-uidA mais également des transgènes et gènes endogènes NIA2. Certaines de ces lignées résistantes à l'inactivation post- transcriptionnelle des gènes de nitrate reductase et homozygote pour le locus 2a3 ne possédaient plus la construction 23b. Ces plantes ont été nommées SGS3-2 2a3.
Afin de déterminer le rôle biologique du gène correspondant aux mutations sgs3, des mutant sgs3-l ont été inoculées avec le virus de la mosaique du concombre (CMV) souche II 7F. Sur les plantes sauvages, l'infection par cette souche virale conduit à des plantes dont le développement est plus lent et altérée: feuilles de la rosette plus petites, hampe florale longue mais très souple, fertilité réduite mais non nulle. Chez les mutants sgs3-l, l'infection par cette souche virale conduit à une altération accrue du développement : les plantes ont un port particulièrement buissonant, les feuilles de la rosette sont petites et vrillées, la hampe florale atteint en fin de développement une taille de l'ordre de 5 cm, les plantes sont complètement stériles. Ces expériences montrent donc que le gène correspondant aux mutations sgs3 permet de limiter les effets négatifs sur le développement causés par l'infection du virus CMV.
Deux mutants sgs3-l et sgs3-2 ont été croisées avec des plantes de l'écotype Landsberg. Sur ces plantes hybrides (FI) résultant de ces croisements, les graines d'autofécondation ont été récoltées. Ces graines ont été semées in vitro sur un milieu gélose contenant 50 mg/1 de kana ycine afin de sélectionner les plantes (F2) possédant le transgène 23 b. Ces plantes résistantes à la kanamycine ont été repiquées et cultivées en serre. L'activité GUS dans ces plantes a été mesurée à différents stades de leur développement. Seules les plantes présentant une activité GUS élevée tout au long du développement (et donc homozygote pour la mutation sgs3) ont été conservées et les graines d'autofécondation ont été récoltées. 120 lignées F2 homozygotes pour la mutation sgs3-\ (lignées F2-1) et 90 lignées F2 homozygotes pour la mutation sgs3-2 (lignées F2-2) ont été ainsi obtenues. Les graines d'autofécondation de chacune de ces lignées ont été semées en serre et pour chaque lignée un pool de plantes a été récolté afin d'en extraire l'ADN. Ces ADN ont été utilisés pour localiser les mutations sgs3 sur le génome d'Arabidopsis. La localisation initiale a été réalisé grâce aux lignées F2-1. Les lignées F2- 2 nous ont ensuite permis de vérifier que la mutation sgs3-2 était localisée dans la même région du génome que la mutation sgs3-l. Ces analyses ont montré que les mutations sgs3 étaient situées entre les marqueurs moléculaires 13H2L et 3B3D. Le polymorphisme correspondant au marqueur moléculaire 13H2L a été révélé par l'hybridation (de type Southern blot) de l'ADN total de plantes d'Arabidopsis, digéré par l'enzyme de restriction HindIII, par un fragment d'ADN radioactif correspondant à l'extrémité gauche du chromosome artificiel de levure (YAC) 13H2 (sonde 13H2L). Le polymorphisme correspondant au marqueur moléculaire 3B3D a été révélé par l'hybridation (de type
Southern blot) de l'ADN total de plantes d'Arabidopsis, digéré par l'enzyme de restriction HindIII, par un fragment d'ADN radioactif correspondant à l'extrémité droit du YAC 3B3 (sonde 3B3).
Par hybridation moléculaire de type Southern sur une membrane sur laquelle a été transférée l'ADN d'une banque de chromosome artificiel de bactéries (BAC IGF) par les fragment d'ADN radioactif correspondant aux sondes 13H2L et 3B3D, nous avons pu déterminer que ces 2 fra ments d'ADN hybridaient sur un même BAC : le BAC F20I20. Ces résultats montrent donc que les mutations sgs3-l et sgs3-2 affectaient une séquence d'ADN comprise dans le BAC F20I20. De l'ADN du BAC F20I20 a ensuite été purifié. Il a été partiellement digéré par l'enzyme de restriction Sau3AI. Les fragments d'ADN résultant ont été clones au site Ba HI de l'ADN de transfert du plasmide binaire (permettant la transformation de plantes via Agrobacterium) pBin+. Les plasmides résultant ont été introduit dans E. coli puis dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58pMP90. Les souches bactériennes résultantes ont été utilisées pour transformer des plantes des lignées sgs3-2 2a3. La souche bactérienne 356 a permis d'obtenir 20 lignées transgéniques. Parmi ces 20 lignées. 19 ont montré des signes de chlorose identiques à ceux observés sur la lignée 2a3. Sur 3 de ces plantes nous avons pu montré par hybridation de type northem en utilisant comme sonde le gène NIA2 d'Arabidopsis thaliana. que cette chlorose résultait de la non accumulation des transcrits des gènes de nitrate reductase (transgéniques et endogènes) et donc était due à l'inactivation post-transcriptionnelle des gènes de nitrate reductase. Parmi ces 19 plantes, 2 ont donné des graines d'autofécondation. Les plantes issues de ces graines, cultivées en serre, ont également montré des signes de chlorose.
La séquence d'ADN inséré au site BamHI du plasmide pBin+ et ayant conduit à l'isolement de la souche bactérienne 356 a été déterminée. Des sous-clones du clone 356 ont été réalisés dans le vecteur pBin+ et la même lignée sgs3-2 2a3 a été transformée par ces sous-clones afin de déterminer ceux capables de restaurer la fonction du gène SGS3. Le plus petit sous-clone capable de restaurer cette fonction constitue le gène SGS3 tel qu'il est décrit dans ce brevet. Par analyse informatique l'ORF de SGS3 a pu être prédite. La séquence du cDNA contenant l'ORF du gène SGS3 et donc la position des séquences promotrices, terminatrices et introniques de SGS3 ont été vérifiées après avoir isolé et clone cette séquence. Pour l'isoler nous avons d'abord réalisé une réaction de reverse- transcription à partir d'ARN total d Arabidopsis thaliana. Puis nous avons réalisé une réaction de PCR sur ce pool de cDNA à l'aide du couple de primers p356AD' AAAATGAGTTCTAGGGCTGGTCC) et P356Y'
(GTCTCAATCATCTTCATTGTGAAGGCC). Ces primers sont situés aux 2 extrémités de l'ORF de SGS3. Ce produit de PCR a été clone et séquence.
En utilisant le logiciel BLAST aucune homologie significative n'a pu être trouvée entre la séquence SGS3 (en nucléotides ou en acides aminés) et une quelconque séquence présente dans les bases de données.
Exemple 2 Analyse des mutants sss3
La séquence du gène SGS3 a été déterminée dans 5 mutants sgs3. Une réaction de
PCR a été effectuée sur l'ADN génomique de ces 5 mutants en utilisant les primers p356AD' et P356Y' (voir exemple 1). Cette réaction permet l'amplification de tout le gène SGS3. Le fragment amplifié grâce à cette réaction de PCR a été séquence.
Cinq mutations ponctuelles distinctes ont ainsi été identifiés chez les différents mutants sgs3. Ces mutations correspondent à quatre codons stop et un changement d'acide aminé. Les différentes mutations observés chez les mutants sgs3 sont représentés dans la figure 1. L'acide aminé marqué en gras indique la position de la mutation dans le polypeptide SGS3. * indique la présence d'un codon stop et 0 indique un nouvel acide aminé substitué à l'acide aminé marqué en gras touché par la mutation. Exemple 3 Construction de cassettes d'expression pour la surexpression et l'inhibition de SGS3 On réalise d'abord une réaction de type PCR sur de l'ADN complémentaire d'Arabidopsis thaliana en utilisant comme amorces les oligonucléotidiques suivants : p356AD* : AAAATGAGTTCTAGGGCTGGTCC P356Y' : GTCTCAATCATCTTCATTGTGAAGGCC
La séquence nucléotidique ainsi obtenue est ensuite traitée avec l'enzyme « klenow » pour générer aux extrémités de la séquence amplifiée des extrémités « franches ». Puis la séquence est clonée entre le promoteur 35S et le terminateur du virus de la mosaïque du chou-fleur au site Smal du vecteur pRTl 00.
Pour la surexpression de SGS3 on sélectionne les clones tels que la séquence correspondant à p356AD' se situe près du promoteur 35S. Pour l'inhibition de SGS3 on sélectionne les clones tels que la séquence correspondant à p356Y' se situe près du promoteur 35S. Cette construction Assgs3 permet l'expression d'un ARNm anti-sens de l'ARNm de SGS3.
Exemple 4 Transformation des plantes Les cassettes d'expression construites tel qu'il est décrit ci-dessus sont ensuite introduites dans un vecteur binaire pour permettre leur introduction via Agrobacterium tumefaciens dans les plantes. Le vecteur binaire utilisé est le plasmide pBIN+ (Van Engelen et al., Transgenic Research 4, 288-290, 1995). Ceci est réalisé en digérant les constructions obtenues ci-dessus par l'enzyme SphI (qui libère les cassettes d'expression) et en liguant le produit de cette digestion au plasmide pBIN+ digéré par l'enzyme SphI.
Exemple 5 Inhibition de l'expression du gène SGS3 par des antisens L'ADNc complet du gène SGS3 a été clone en orientation antisens (aSGS3) entre le promoteur 35S (p35S) et le terminateur 35S (t35S). Le gène chimérique p35S-aSGS3-t35S a été re-cloné dans le vecteur binaire pBiB-Hyg puis transféré dans Agrobacterium tumefaciens. Des plantes de la lignée Ll (gène p35S-GUS-tRbcS soumis a la PTGS) ont été transformées par trempage dans les agrobacteries. Les plantes transformées ont été sélectionnées sur milieu additionné d'hygromycine. L'activité GUS du transgène p35S- GUS-tRbcS a été mesurée dans les plantes Ll non transformées, dans 28 transformants hygromycine-resistants, ainsi que dans les mutants sgs3 obtenus par mutagenèse EMS de la lignée Ll. L'activité GUS dans les plantes Ll non transformées est comprise entre 0 et 10 nmol MU / mn / ug de protéines tandis que l'activité GUS dans les mutants sgs3 est comprise entre 3000 et 5500 nmol MU / mn / ug de protéines. 11 des 28 transformants hygromycine-resistants ont montré une activité GUS comprise entre 3000 et 5500 nmol MU / mn / ug de protéines, montrant que le gène SGS3 peut être inhibe par le gène chimérique p35S-aSGS3-t35S, mimant ainsi une mutation sgs3.

Claims

Revendications
1) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID No. 1, et b) le polynucléotide de la SEQ ID No. 2.
2) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide selon la revendication 1 , et b) un polynucléotide homologue à au moins 80 % à un polynucléotide selon la revendication 1.
3) Polynucléotide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il restaure un mutant sgs3 d'Arabidopsis thaliana.
4) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID No. 1.
5) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide selon la revendication 4, et b) un polynucléotide homologue à au moins 80 % à un polynucléotide selon la revendication 4.
6) Polynucléotide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il a une activité promotrice dans les cellules végétales et les plantes.
7) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend le polypeptide de la SEQ ID No. 3.
8) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants : a) un fragment biologiquement actif du polypeptide de la SEQ ID No. 3; et b) un polypeptide homologue à au moins 80 % au polypeptide de la SEQ ID No. 3.
9) Polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il restaure un mutant sgs3 d'Arabidopsis thaliana. 10) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 7-9.
11) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; et b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1-3 etlO; et c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
12) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: d) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; et e) un polynucléotide, selon l'une des revendications 1 -3 et 10, en orientation antisens ; et f) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
13) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription : a) un polynucléotide selon l'une des revendications 4-6; b) un polynucléotide codant pour un polypeptide hétérologue; c) une séquence terminatrice dans les cellules végétales ou les plantes.
14) Vecteur d'expression ou de transformation comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1-6 et 10 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11-13.
15) Procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales ou des plantes, par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1 -6 et 10 et/ou d'au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 11-13 et/ou d'au moins un vecteur selon la revendication 14.
16) Procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; et b) on inhibe l'expression d' un polynucléotide selon l'une des revendications 1-3 et 10 dans ladite plante.
17) Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'étape b) comprend la transformation de ladite plante avec une cassette d'expression selon la revendication 12. 18) Procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: b) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; c) on inactive l'expression d' un polynucléotide selon l'une des revendications 1 -3 et 10 dans ladite plante.
19) Organisme hôte transformé comprenant au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1-6 et 10 et/ou d'au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 11-13 et/ou d'au moins un vecteur selon la revendication 14.
20) Organisme hôte selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine d'intérêt.
21) Organisme hôte selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules végétales ou les plantes.
22) Organisme hôte selon la revendication 21, caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la betterave, le tabac, le coton.
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