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EP0789582A1 - Composition glycosaminoglycane/facteur de croissance megacaryocytaire, utilisation en therapeutique - Google Patents

Composition glycosaminoglycane/facteur de croissance megacaryocytaire, utilisation en therapeutique

Info

Publication number
EP0789582A1
EP0789582A1 EP95939313A EP95939313A EP0789582A1 EP 0789582 A1 EP0789582 A1 EP 0789582A1 EP 95939313 A EP95939313 A EP 95939313A EP 95939313 A EP95939313 A EP 95939313A EP 0789582 A1 EP0789582 A1 EP 0789582A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
chosen
substance
mixtures
factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95939313A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Zhong Chao Han
Jacques Caen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Original Assignee
IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IVS Institut des Vaisseaux et du Sang filed Critical IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Publication of EP0789582A1 publication Critical patent/EP0789582A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing a glycosaminoglycan component (A) and a megakaryocytic growth factor component (B), as a novel industrial product.
  • GROUP I Central thrombocytopenia due to bone marrow failure.
  • the megakaryocytes which are responsible for the formation of blood platelets, here produce an insufficient number of platelets due to a quantitative or qualitative anomaly.
  • J.P. CAEN and S. BELLUCCI entitled “Megakaryocyte involvement in platelet disorders” and presented in Cancun in 1994 at the plenary assembly of the International Society of Hematology.
  • GROUP la constitutional
  • GROUP Ib due to invasion of the marrow by tu ⁇ moral cells
  • GROUP le following a chemotherapeutic or radiotherapeutic treatment
  • GROUP ⁇ Peripheral thrombocytopenia.
  • the platelets, which are normally produced by the bone marrow, are in this case excessively destroyed at the periphery by the macrophagic system.
  • GROUP Ha we are in the presence of an exaggerated activation of coagulation which leads to consumption (ie coagulation) disseminated intravascular (abbreviated CIVD; in English:
  • DIC dissected intravascular coagulation
  • GROUP Ilb after taking medication, the body produces antibodies which cross-recognize certain platelet constituents; heparin-induced thrombocytopenia, which is exceptional in view of its frequency, belongs to this group; the platelets coated with antibodies are weakened and more easily recognized by the macrophages which destroy them; see to this effect the article by M.C. BERNDT et al., Blood Reviews (1987), pages 111-118, entitled: "Drug-mediated
  • GROUP Ile the patient's organism itself produces abnormally antibodies which are directed autologously against the constituents of the platelets; these are autoimmune thrombocytopenia, the only clinical manifestations of which are hemorrhages essentially localized in the skin; the most common case is immune thrombocytopenic purpura (TTP); see to this effect the article by S. BELLUCCI, Baillière's Clinical Haematology, (1989), 2 (No 3), pages 695-718, entitled "Autoimmune thrombocytopenias".
  • Group I thrombocytopenia has generally been treated in the past with a steroid, mainly prednisone or androgens.
  • Group IVa thrombocytopenia linked to a DIC has generally been treated with an anticoagulant agent, namely an antithrombotic glycosaminoglycan (GAG) such as a heparin substance, in particular standard heparin (Hep) known as "non-fragmented""and having a molecular weight of the order of 12,000 daltons, a low molecular weight heparin (LMWH) called” fragmented "and having a molecular weight of around 3000-5500 daltons, dermatan sulfate or pentosan poly sulfate.
  • GAG antithrombotic glycosaminoglycan
  • Hep standard heparin
  • LMWH low molecular weight heparin
  • Hep the traditional therapeutic treatment consists in administering an anticoagulant agent different from the inducing drug.
  • Thrombocytopenia induced by a heparin substance can be detected early by the method described in published PCT application WO-A-92/02823 or the article by J. AMIRAL et al., Thromb. Haemost., (1992), 68 (No 1), pages 95-96.
  • hematopoietic cells mainly megakaryocytes (MK) and platelets
  • CFU-MK human progenitor cells
  • CFU-MK human progenitor cells
  • Heparin preferably intervenes at a concentration of 0.5-1.5 mg / ml (i.e. at an anticoagulant dose) to prevent the formation of fibroblasts.
  • a growth factor such as IL 1, IL 3, IL 6 or Epo can be used to replace the serum (see page 7 lines 17-21).
  • One of the aims is the production of MK and platelets useful in the treatment of thrombocytopenia (see page 3 lines 5-6 and page 16 lines 9-27).
  • the methods recommended for the treatment of said thrombocytopenia include more specifically the reinjection of MK and / or CFU-MK, if necessary with platelets, to thrombopenic patients (see page 16 lines 12-16).
  • WO-A-93/23059 reports [see example 3 (page 15), table VII (page 16) and results of FIG. 1] of in vitro tests on the formation of megakaryocytic colonies with Hep / megakaryocytic growth factor or LMWH / megakaryocytic growth factor associations where said growth factor is porcine aplasia serum (ASA) [which contains the ligand of C-Mpl], IL 3 , IL 6, G-CSF, GM-CSF or Epo.
  • ASA porcine aplasia serum
  • EP-A-0 497 341 also discloses an antiviral composition
  • an antiviral composition comprising a combination of a particular growth factor (bFGF) and a sulfated polysaccharide (in particular: Hep, CS, OS, pentosan polysulfate, Hep supersulfated and supersulfated dermatan).
  • bFGF growth factor
  • a sulfated polysaccharide in particular: Hep, CS, OS, pentosan polysulfate, Hep supersulfated and supersulfated dermatan.
  • a composition which is superior to that of the teaching of the document WO-A-93/23059 cited above in the treatment of thrombocytopenia, in particular those of group I and especially those of the group Ile.
  • a second aspect of the invention it is proposed to provide a new therapeutic use with respect to thrombocytopenia by means of said composition.
  • the new technical solution which is recommended according to the present invention uses a composition comprising a GAG component and a megakaryocytic growth factor (F) component for the in vivo treatment of thrombocytopenia.
  • F megakaryocytic growth factor
  • a mixture stimulating megakaryocytopoiesis comprising: (A) a substance chosen from the group consisting of glycosaminoglycans, their analogs and mixtures, and (B) a substance chosen from the assembly consisting of megakaryocytic growth factors and their mixtures, for the preparation of a medicament intended for use in therapy with regard to thrombocytopenia.
  • a therapeutic composition is also recommended with regard to thrombocytopenia, characterized in that it comprises, in association with a physiologically acceptable excipient, a mixture of:
  • (A) a substance chosen from the group consisting of glycosaminoglycans, their analogs and their mixtures, and
  • a megakaryocytic growth factor chosen from the group consisting of interleukins 1 to 13 (IL1 to IL13), erythropoietin (Epo), thrombopoietin (Tpo), the factor for stimulating spinal progenitors (SCF), colony stimulating factors (CFSs) [including the factor stimulating granulocyte colonies (G-CSF) and the granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)] and mixtures thereof.
  • IL1 to 13 interleukins 1 to 13
  • Epo erythropoietin
  • Tpo thrombopoietin
  • SCF spinal progenitors
  • CFSs colony stimulating factors [including the factor stimulating granulocyte colonies (G-CSF) and the granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)] and mixtures thereof.
  • ASA aplastic anemia serum (in English: "aplastic anemia serum”);
  • BSA serum bovine albumin in English: "bovine semm albumin”
  • CFU colony forming unit in English: "colony-forming unit”
  • C-Mpl normal cell equivalent of murine myeloproliferative leukemia virus
  • the megakaryocytic growth factor which intervenes according to the invention is the ligand of C-Mpl (this ligand is also called Tpo);
  • Epo erythropoietin 5 F megakaryocytic growth factor
  • FGF fibroblast growth factor in French: "fibroblast growth factor”
  • FGF acid
  • bFGF basic growth factors
  • GAG designates here any glycosaminoglycan proper as well as any o glycosaminoglycan analog
  • G-CSF factor stimulating granulocyte colomas in English: "granulocyte colony-stimulating factor”); by its structure this product is very close to IL 3;
  • GM-CSF factor stimulating granulocyte-macrophage colonies in English: "granulocyte-macrophage colony-stimulating factor”); by its structure this product is very close to IL 3, IL 4 and IL 5;
  • HC II heparin cofactor 2 in English: "heparin cofactor II”); HA hyaluronic acid;
  • IU international unit for the antithrombotic or anticoagulant activity of Hep the international unit is expressed relative to prothrombin (factor II) and 1 IU generally corresponds to 10 ⁇ g of Hep; for LMWH the international unit is expressed by ratio to factor Xa and 1 IU (anti Xa) generally corresponds to 10 ⁇ g of LMWH;
  • SLE generalized lupus erythematosus (in English: “systemic lupus erythematosous”); it is a specific ITP that is encountered in young women;
  • TGF- ⁇ transforming growth factor in English TGF- ⁇ transforming growth factor in English: "transforming growth factor ⁇ ").
  • Tpo thrombopoietin (formerly known as C-Mpl ligand). Brief description of the drawing
  • FIG. 1 relating to comparative tests carried out with the active ingredients of Examples 1 and 2
  • FIG. 2 relating to comparative tests carried out with the active ingredients of Examples 3 and 4
  • FIG. 3 relating to comparative tests carried out with the active ingredients of Examples 5a-5d
  • FIGS. 4a and 4b relating to tests concerning GAG / Tpo and GAG / IL 6 associations.
  • glycosaminoglycan component or GAG is meant here a substance chosen from the group consisting of (i) the glycosaminoglycans proper, (ii) and their analogs as defined below (as is the case in the document WO-A-93/23059 cited above which is introduced here for reference) and (iii) mixtures thereof.
  • Glycosaminoglycans are polymeric substances which comprise a repetition of D-glucosamine units and uronic acid units (ie L-iduronic acid and / or D-glucuronic acid), said units being more or less sulfated. These substances are antithrombotic or have no antithrombotic effect.
  • Antithrombotic glycosaminoglycans include (i) heparinic substances having an average molecular weight in the range of 30,000 to 3,000 daltons, such as Hep and LMWH, which (a) fix and activate AT III, and / or (b) inhibit factor Xa, and (ii) substances of the chondroitin-sulfate type which activate HC II.
  • the antithrombotic glycosaminoglycans are anticoagulants according to different mechanisms, their anticoagulant activities being more or less intense.
  • Heparinic substances generally contain in their formula the pentasaccharide fragment of structure I:
  • Y is SO3- or COCH3,
  • X is H or SO3-, said pentasaccharide fragment being the specific site for the attachment and activation of AT III.
  • GAG substances that activate HC II include polymers of the chondroitin sulfuric acid type, such as dermatan sulfate (DS). They generally have an average molecular weight of 10,000 to 90,000 daltons. Like DS, they include in their structure the repeating disaccharide unitary motif of structure II:
  • Ri is SO3-
  • R2 is H.
  • the disaccharide unitary motif of structure II is that which appears, for DS, in the Merck Index, linked edition, 1989, page 334 (entry No. 2217, "Chondroitin Sulfate”.
  • Non-antithrombotic GAG substances include in particular (i) compounds of the chondroitin-sulfate type of structure III:
  • glycosaminoglycans include antithrombotic and anticoagulant products such as (i) pentosan sulfate which responds to repetitive structure IV:
  • R is SO3 "; (ii) dextran sulfate, on the one hand; and, products which are not antithrombotic or anticoagulant, such as (iii) alginic acid sulfate,
  • R is S ⁇ 3 [Al2 (OH) 5], (seen) hyaluronic acid and,
  • GAG component according to the invention will advantageously be chosen from
  • heparinic substances having an average molecular weight of the order of 3,000-30,000 daltons, in particular Hep, heparan sulfate and LMWH,
  • dextran sulphate pentosan polysulphate, alginic sulphate acid, lactobionic sulphate acid, polyvinyl sulphate, sucralfate, hyaluronic acid, and
  • the megakaryocytic growth factor (F) component which belongs to all the cytokines, is a substance which intervenes in a "positive" way, that is to say which stimulates megakaryocytopoiesis.
  • FGF fibroblast growth factor
  • IL1 to IL13 interleukins 1 to 13
  • Epo erythropoietin
  • Tpo thrombopoietin
  • SCF spinal progenitor stimulating factor
  • CSFs colony stimulating factors [in particular granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and factor stimulating colonies of granulocytes-macrophages (GM-CSF)] and their mixtures.
  • FGF [and in particular its acid (aFGF) and basic (bFGF)] forms, SCF, on the one hand, and especially IL 6 and Tpo, on the other hand, and their mixtures, the products F, are preferred.
  • aFGF acid
  • bFGF basic
  • the most interesting according to the invention being IL 6 and Tpo.
  • IL 3 and IL 6 stimulate the maturation of MK and CFU-MK progenitor cells.
  • FGF, aFGF, bFGF, SCF stimulate the proliferation of MK and CFU-MK.
  • pF4 and TGF- ⁇ are other factors which intervene in the mechanisms of megakaryocytopoiesis as inhibitors. These include pF4 and TGF- ⁇ . These "negative" growth factors are not part of component F according to the invention.
  • ( ⁇ ) R is between 5/20 and 3000/1 for thrombocytopenia of the Ha group, and ( ⁇ ) R is between 1/20 and 500/1 for thrombocytopenia of the Ilb group.
  • GAG is a non-antithrombotic substance (for example sucralfate) since LMWH can cause, like Hep, thrombocytopenia.
  • LMWH a non-antithrombotic substance
  • the patient will be given hirudin in addition to the combination
  • Hep / substance F composition according to the invention can be administered to patients.
  • composition according to the invention is useful with regard to all thrombocytopenia. It is interesting with regard to central thrombocytopenia due to group I spinal cord insufficiency, on the one hand, and with regard to group II peripheral thrombocytopenia, on the other hand. Among peripheral thrombocytopenia, it is more particularly effective with respect to autoimmune thrombocytopenia of the Ile group, namely in particular in the treatment of ITP, as well as that of SLE which are particular immunological ITP affecting young women.
  • the posology that can be recommended is from 10 to 2000 ⁇ g / kg / d in component GAG and from 1 to 200 ⁇ g / kg / d in component F
  • ( ⁇ ) for use with respect to thrombocytopenia of the Ha group an intake of 50 to 2,000 ⁇ g / kg / day in component GAG, and l to 200 ⁇ g / kg / day in component F; and,
  • ⁇ for use with respect to thrombocytopenia of the Ilb group, an intake of 10 to 500 ⁇ g / kg / d in component GAG, and 1 to 200 ⁇ g / kg / d in component F.
  • a dose of GAG less than or equal to 300 ⁇ g / kg / d.
  • This preferred dose of 300 ⁇ g / kg / day according to the invention is lower than the minimum anticoagulant dose (i.e. 500 ⁇ g / kg / day) of the antithrombotic GAG component, in particular Hep and LMWH.
  • the usual doses of Hep are 2000 ⁇ g / kg / d in the curative treatment of venous thrombosis, 1000 ⁇ g / kg / d in the treatment of DICs, and 500 to 700 ⁇ g / kg / d in the prophylactic treatment of venous thrombosis, and the usual dose of
  • LMWH is 1000 to 1500 ⁇ g / kg / day.
  • composition according to the invention takes account of the dosage recommended above ;. it can be presented in unit form for a single daily intake, or in the form of divided doses for several (in particular 2 to 3) daily intakes.
  • the preferred mode of administration of the composition according to the invention is the injectable route.
  • Injectable compositions were prepared containing, in a liquid vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of Hep and aFGF according to the following concentrations:
  • Example 1a
  • Example 2a Injectable compositions were prepared containing, in a liquid vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of Hep and bFGF according to the following concentrations: Example 2a
  • Example 3 Was prepared injectable compositions containing in a suitable liquid carrier for administration of GAGs, a mixture of LMWH (enoxaparin ®) and aFGF in the following concentrations: Example 3a - LMWH at a concentration of 50 mcg / ml;
  • Injectable compositions were prepared containing, in a liquid vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of LMWH (ENOXAPARINE) and bFGF according to the following concentrations: Example 4a - LMWH at the concentration of 50 ⁇ g / ml,
  • injectable compositions containing a GAG component and a F component were prepared in an appropriate liquid vehicle: Example 5a - CS at a concentration of 50 ⁇ g / ml,
  • Injectable compositions were prepared containing, in a vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of Hep and IL 6 according to the following concentrations:
  • Example 6a
  • Injectable compositions were prepared containing, in a vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of Hep and Tpo according to the following concentrations:
  • Example 7a
  • Injectable compositions were prepared containing, in a vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of CS and IL 6 according to the following concentrations:
  • Injectable compositions were prepared containing, in a vehicle suitable for the administration of GAGs, a mixture of CS and Tpo according to the following concentrations:
  • mice Male Balb / c mice (IFFA CREDO) 8 weeks old are sacrificed by cervical elongation.
  • the bone marrow cells are removed from the femurs using an ⁇ MEM base medium (EUROBIO) and then washed twice by centrifugation (250 g; 10 minutes; 22 ° C) in ⁇ MEM.
  • EUROPIO ⁇ MEM base medium
  • Murine CFU-MKs were tested using a plasma clot system. Briefly 2 x 10 * 5 mononuclear marrow cells are cultured on Petri dishes in a total volume of 1 ml C'-Î ⁇ MEM medium containing 1% deionized serum bovine albumin (SIGMA CHEMICAL Co.), 10% plasma bovine citrate (FLOW LABORATORY), ÎO ⁇ M of 2-mercaptoethanol, 0.34 mg of CaCl2, 15 IU of penicillin and 15 ⁇ g of streptomycin. In this culture medium, the GAG + F mixtures of Examples 1 to 4 were also added, the components of these mixtures (ie GAG alone or F only corresponding).
  • the clots were dried with filter paper, fixed with 1% paraformaldehyde, then identified by staining of acetylcholinesterase, a group of at least 3 MK constituting a colony of MK.
  • Mutine mononuclear bone marrow cells at a concentration of 2 x 10 ⁇ * 5 cells / ml are incubated in triplicate for 7 days at 37 ° C with 1 ml of an ⁇ MEM medium containing 0.3% agar (GIBCO) , 10 "M of 2-mercaptoethanol, 30% of serum substitute and various doses of component GAG and / or component F, in order to test the mixtures of examples 5a-5d with respect to the components of said mixtures.
  • GABCO ⁇ MEM medium containing 0.3% agar
  • Clinical trials were carried out on a group of 30 adult patients (17 women and 13 men, aged 18 to 60), all suffering from ITP and randomly divided into three groups of 10 people. MK, CFU-MK and platelets were counted before treatment.
  • the first group (Gl) was treated with prednisone (0.3 mg / kg / day) and was used as a control group.
  • the second group (G2) was treated with the same dose of prednisone
  • the third group (G3) was treated with the same dose of prednisone and by daily subcutaneous injection of the Hep + mixture aFGF according to the example la [10 mg (ie 1000 IU) of Hep + 1 mg of aFGF per day].

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Abstract

La présente invention a trait à l'utilisation d'un mélange stimulant la méga-caryocytopoïèse et comprenant: (A) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les glycosaminoglycanes, leurs analogues et leurs mélanges; et (B) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les facteurs de croissance mégacaryocytaires et leurs mélanges, pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies. Elle concerne également une composition thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies qui comporte lesdites substances (A et B).

Description

COMPOSΓΠON GLYCOSAMINOGLYCANE/FACTEUR DE CROISSANCE MEGACARYOCYTAIRE, UTILISATION EN
THERAPEUTIQUE
Domaine de l'invention
La présente invention a trait à une composition renfermant un composant glycosaminoglycane (A) et un composant facteur de croissance mégacaryocytaire (B), en tant que produit industriel nouveau.
Elle concerne également l'utilisation de cette composition en thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies. Arrière-plan technologique
On sait que l'on classe les thrombopénies selon les groupes (ou types) suivants.
GROUPE I : Thrombopénies centrales par insuffisance médullaire.
Les mégacaryocytes, qui sont à l'origine de la formation des plaquettes sanguines, produisent ici un nombre insuffisant de plaquettes en raison d'une anomalie quantitative ou qualitative. Voir à cet effet l'exposé de J.P. CAEN et S. BELLUCCI intitulé "Megakaryocyte involvement in platelet disorders" et présenté à Cancun en 1994 lors de l'assemblée plénière de l'International Society of Hematology.
Le plus souvent l'insuffisance médullaire est : GROUPE la : constitutionnelle, GROUPE Ib : due à un envahissement de la moelle par des cellules tu¬ morales, ou GROUPE le : consécutive à un traitement chimiothérapeutique ou radiothérapeutique. GROUPE π : Thrombopénies périphériques. Les plaquettes, qui sont normalement produites par la moelle osseuse, sont dans ce cas détruites de façon excessive à la périphérie par le système macrophagique.
Les principales causes sont les suivantes. GROUPE Ha : on est en présence d'une activation exagérée de la coagulation qui entraîne une consommation (i.e. coagulation) intravasculaire disséminée (en abrégé CIVD ; en anglais:
"disseminated intravascular coagulation" ou DIC) ; dans le cas d'une CIVD (qui peut être d'origine toxique, immunolo- gique, bactérienne, fongique, virale, traumatique etc.) une quantité importante de plaquettes est consommée ce qui diminue le nombre de plaquettes présentes dans le sang;
GROUPE Ilb : après prise médicamenteuse, l'organisme produit des anticorps qui reconnaissent de façon croisée certains constituants plaquettaires ; les thrombopénies induites par l'héparine, qui sont exceptionnelles eu égard à leur fréquence, appartiennent à ce groupe ; les plaquettes recouvertes d'anticorps sont fragilisées et reconnues plus aisément par les macrophages qui les détruisent ; voir à cet effet l'article de M.C. BERNDT et al., Blood Reviews (1987), pages 111-118, intitulé : "Drug-mediated
Thrombocytopenia" ; et,
GROUPE Ile : l'organisme du patient produit lui-même de façon anormale des anticorps qui sont dirigés de façon autologue contre les constituants des plaquettes ; il s'agit ici de thrombopénies auto-immunes dont les seules manifestations cliniques sont des hémorragies essentiellement localisées au niveau cutané; le cas le plus fréquent est le purpura thrombopénique immun (TTP) ; voir à cet effet l'article de S. BELLUCCI, Baillière's Clinical Haematology, (1989), 2 (No 3) , pages 695-718, intitulé "Autoimmune thrombocytopenias" .
Art antérieur
Les thrombopénies du groupe I ont été généralement traitées dans le passé au moyen d'un stéroïde, principalement la prednisone ou des androgènes. Les thrombopénies du groupe lia liées à une CIVD ont été en général traitées au moyen d'un agent anticoagulant, à savoir un glycosaminoglycane (GAG) antithrombotique tel qu'une substance héparinique, notamment l'héparine standard (Hep) dite "non-fragmentée" et ayant un poids moléculaire de l'ordre de 12000 daltons, une héparine de bas poids moléculaire (LMWH) dite "fragmentée" et ayant un poids moléculaire de l'ordre de 3000-5500 daltons, le dermatan sulfate ou le pentosane poly sulfate.
Quand on est en présence de thrombopénies du groupe Ilb induites par
Hep, le traitement thérapeutique classique consiste à administrer un agent anticoagulant différent de la drogue inductrice. Les thrombopénies induites par une substance héparinique peuvent être détectées de façon précoce par la méthode décrite dans la demande PCT publiée WO-A-92/02823 ou l'article de J. AMIRAL et al., Thromb. Haemost., (1992), 68 (No 1), pages 95-96.
Les thrombopénies auto-immunes du groupe Ile ont été traitées dans le passé par la prednisone. Or il se trouve que dans de nombreux cas, les FTP sont résistants à la prednisone.
On connaît de la demande PCT publiée WO-A-92/06178 une solution technique selon laquelle on produit des cellules hématopoïé tiques, principalement des mégacaryocytes (MK) et des plaquettes, par culture de cellules progénitrices (CFU-MK) humaines sur un milieu nutritif (plasma humain ou sérum foetal de veau) contenant un anticoagulant (héparine, citrate), dans des conditions inhibant la croissance des fibroblastes.
L'héparine intervient de préférence à la concentration de 0,5-1,5 mg/ml (i.e. à une dose anticoagulante) pour empêcher la formation de fibroblastes. Un facteur de croissance tel que IL 1, IL 3, IL 6 ou Epo peut être utilisé pour remplacer le sérum (voir page 7 lignes 17-21). Un des buts poursuivis est la production de MK et de plaquettes utiles dans le traitement des thrombopénies (voir page 3 lignes 5-6 et page 16 lignes 9-27). Les modalités préconisées pour le traitement desdites thrombopénies comprennent plus précisément la réinjection de MK et/ou CFU-MK, le cas échéant avec des plaquettes, aux patients thrombopéniques (voir page 16 lignes 12-16).
Plus récemment dans la demande PCT publiée WO-A-93/23059, la Demanderesse a proposé de traiter les thrombopénies des groupes I et surtout Ile au moyen d'un GAG antithrombotique ou non-antithrombotique, ledit GAG étant susceptible d'être administré à une faible dose. Ainsi selon WO- A-93/23059, quand le GAG a des propriétés antithrombotiques, il est en particulier recommandé de le faire intervenir à une dose nettement inférieure à la dose anticoagulante.
Le document WO-A-93/23059 précité fait état [voir exemple 3 (page 15), tableau VII (page 16) et résultats de la figure 1] d'essais in vitro sur la formation de colonies mégacaryocytaires avec des associations Hep/facteur de croissance mégacaryocytaire ou LMWH/facteur de croissance mégacaryo- cytaire où ledit facteur de croissance est le sérum d'aplasie porcine (AAS) [qui contient le ligand de C-Mpl], IL 3, IL 6, G-CSF, GM-CSF ou Epo. Les résultats fournis enseignent que la mégacaryocytopoïese est seulement stimulée par Hep/ AAS et LMWH/AAS in vitro, alors que Hep et LMWH en association avec un facteur de croissance mégacaryocytaire différent de AAS n'ont aucune influence bénéfique sur la mégacaryocytopoïese in vitro selon WO-A-93/23059. II se trouve que AAS n'est pas un produit administrable à l'homme dès lors qu'il peut comporter des ingrédients susceptibles d'être néfastes, d'une part, et que sa production ne peut pas être standardisée aisément, d'autre part.
On connaît par ailleurs du document EP-A-0 497 341 une composition antivirale comprenant une association d'un facteur de croissance particulier (bFGF) et d'un polysaccharide sulfaté (en particulier : Hep, CS, OS, pentosan polysulfate, Hep supersulfaté et dermatan supersulfaté). But de l'invention
Il existe un besoin en ce qui concerne une solution technique permettant de stimuler la mégacaryocytopoïese et par suite d'améliorer la formation de plaquettes in vivo dans le cas de thrombopénies, sans avoir à injecter des plaquettes aux patients.
La nouvelle solution technique, que l'on se propose de fournir va à encontre de l'enseignement de l'art antérieur, en ce sens que, dans le cas de patients souffrant d'ITP, on va pouvoir administrer un GAG, notamment antithrombotique et déjà connu en tant qu'agent anticoagulant tel que Hep, pour fabriquer in vivo des plaquettes et empêcher les hémorragies spécifiques des thrombopénies du groupe Ile. Il est en effet surprenant de préconiser selon l'invention d'administrer Hep dans les cas de thrombopénies induites par l'héparine, alors que pour le traitement desdites thrombopénies il était impératif selon l'art antérieur de supprimer l'administration de Hep.
De plus la nouvelle solution technique va à encontre de l'enseignement de WO-A-93/23059 qui n'incite pas l'homme du métier à utiliser in vivo une composition glycosaminoglycane/facteur de croissance mégacaryocytaire qui s'est révélée être in vitro soit inactive soit aussi active que le seul composant glycosaminoglycane, quand il s'agit de remédier à une insuffisance plaquettaire. Cette nouvelle solution technique se distingue de l'enseignement du document EP-A-0 497 341 qui préconise en tant que moyen antiviral une association bFGF/GAG antithrombotique. Selon un premier aspect de l'invention, on se propose de fournir une nouvelle solution technique faisant appel à une composition qui soit supérieure à celle de l'enseignement du document WO-A-93/23059 précité dans le traitement des thrombopénies, notamment celles du groupe I et surtout celles du groupe Ile. Selon un second aspect de l'invention, on se propose de fournir une nouvelle utilisation thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies au moyen de ladite composition. Objet de l'invention
La nouvelle solution technique que l'on recommande selon la présente invention fait appel à une composition comprenant un composant GAG et un composant facteur de croissance mégacaryocytaire (F) pour le traitement in vivo des thrombopénies.
Selon cette nouvelle solution technique, on préconise l'utilisation d'un mélange stimulant la mégacaryocytopoïese et comprenant : (A) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les glycosaminoglycanes, leurs analogues et leurs mélanges, et (B) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les facteurs de croissance mégacaryocytaires et leurs mélanges, pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies.
On préconise également vis-à-vis des thrombopénies une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, un mélange de :
(A) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les glycosaminoglycanes, leurs analogues et leurs mélanges, et
(B) un facteur de croissance mégacaryocytaire choisi parmi l'ensemble constitué par les interleukines 1 à 13 (IL1 à IL13), l'érythropoïétine (Epo), la thrombopoïétine (Tpo), le facteur de stimulation des progéniteurs médullaires (SCF), les facteurs stimulants les colonies (CFSs) [notamment le facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF)] et leurs mélanges.
Abréviations 5 Dans ce qui suit, on a utilisé par commodité les abréviations suivantes. . :
AAS sérum d'anémie aplasique (en anglais : "aplastic anémia sérum") ;
AT m antithrombine m ;
BSA albumine bovine sérique (en anglais : "bovine semm albumin") ; 0 CFU unité formant colonie (en anglais : "colony-forming unit") ;
CFU-GM progéniteur de granulocytes-macrophages (en anglais : "granulo- cyte-macrophage colony-forming unit")
CFU-MK progéniteur mégacaryocytaire (en anglais "granulocyte- macrophage colony-forming unit"); 5 CIVD coagulation intravasculaire disséminée (en anglais : "disseminated intravascular coagulation" ou "DIC") ;
C-Mpl équivalent cellulaire normal du virus de la leucémie myéloproliférative murine ; le facteur de croissance mégacaryo¬ cytaire qui intervient selon l'invention est le ligand de C-Mpl (ce o ligand est également dénommé Tpo) ;
CS chondroïtine-4-sulfate et/ou chondroïtine-6-sulfate ;
CSF facteur stimulant les colomes ;
DS dermatan sulfate ;
Epo érythropoiétine ; 5 F facteur de croissance mégacaryocytaire ;
FGF facteur de croissance de fibroblastes (en anglais: "fibroblast growth factor") ; on distingue parmi les FGFs les facteurs de croissance acide (aFGF) et basique (bFGF) ; GAG désigne ici tout glycosaminoglycane proprement dit ainsi que tout o analogue de glycosaminoglycane ;
G-CSF facteur stimulant les colomes de granulocytes (en anglais : "granulocyte colony-stimulating factor") ; par sa structure ce produit est très voisin de IL 3 ; GM-CSF facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (en anglais : "granulocyte-macrophage colony-stimulating factor") ; par sa structure ce produit est très voisin de IL 3, IL 4 et IL 5; HC II cofacteur 2 de l'héparine (en anglais : "heparin cofactor II") ; HA acide hyaluronique ;
Hep héparine standard purifiée ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 12 000 daltons et dite "héparine non-fractionnée" (le terme "non-fractionnée" étant utilisé dans la littérature pour distinguer Hep de LMWH), il s'agit d'un produit de référence utilisé en thérapeutique et dans les dosages biologiques ou immunologiques des facteurs de l'hémostase ; HS héparan sulfate ;
IL cytokine appartenant à l'ensemble des interleukines ;
IL 1 interleukine 1 IL 2 interleukine 2
IL 3 interleukine 3
IL 4 interleukine 4
IL 5 interleukine 5
IL 6 interleukine 6 IL 7 interleukine 7
IL 8 interleukine 8
IL 9 interleukine 9
IL 10 interleukine 10 IL 11 interleukine 11 IL 12 interleukine 12 IL 13 interleukine 13 ΓTP purpura thrombopénique idiopathique (en anglais : "idiopathic thrombocytopenic purpura") autres nomenclatures : purpura thrombopénique immun (en anglais : "immune thrombocytopenic purpura") ou purpura thrombopénique auto-immun ;
IU unité internationale ; pour l'activité antithrombotique ou anticoa¬ gulante de Hep l'unité internationale est exprimée par rapport à la prothrombine (facteur II) et 1 IU correspond en général à 10 μg de Hep ; pour les LMWH l'unité internationale est exprimée par rapport au facteur Xa et 1 IU (anti Xa) correspond en général à 10 μg de LMWH ;
KS kératan sulfate ; LMWH héparine de bas poids moléculaire (en anglais : "low molecular weight heparin") ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de
3 000-5 500 daltons et dite "héparine fractionnée" ;
MEM milieu essentiel minimal ; αMEM MEM modifié :
MK mégacaryocyte ; pF4 facteur plaquettaire 4 (en anglais : "platelet factor 4") ;
SCF facteur de stimulation des progéniteurs médullaires (en anglais :
"stem-cell factor") ;
SLE lupus érythémateux généralisé (en anglais : "systemic lupus erythematosous") ; il s'agit d'un ITP particulier que l'on rencontre chez la jeune femme ;
TGF-β facteur de croissance transformant en anglais : "transforming growth factor β").
Tpo thrombopoïétine (produit dénommé autrefois ligand de C-Mpl). Brève description du dessin
Dans le dessin annexé, qui illustre l'invention, on a consigné un certain nombre de résultats d'essais qui ont été entrepris, à savoir : la figure 1 relative à des essais comparatifs réalisés avec les ingrédients actifs des exemples 1 et 2 ; la figure 2 relative à des essais comparatifs réalisés avec les ingrédients actifs des exemples 3 et 4 ; la figure 3 relative à des essais comparatifs réalisés avec les ingrédients actifs des exemples 5a-5d ; et, les figures 4a et 4b relatives à des essais concernant des associations GAG/Tpo et GAG/IL 6. Description détaillée de l'invention
Par "composant glycosaminoglycane" ou GAG, on entendu ici une substance choisie parmi l'ensemble constitué par (i) les glycosaminoglycanes proprement dits, (ii) et leurs analogues tels que définis ci-après (ainsi que cela est le cas dans le document WO-A-93/23059 précité qui est introduit ici à titre de référence) et (iii) leurs mélanges. Les glycosaminoglycanes sont des substances polymères qui comprennent une répétition d'unités D-glucosamine et d'unités acide uronique (i.e. acide L-iduronique et/ou acide D-glucuronique), lesdites unités étant plus ou moins sulfatées. Ces substances sont antithrombotiques ou dépourvues d'effet antithrombotique. Les glycosaminoglycanes antithrombotiques comprennent (i) les substances hépariniques ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 30 000 à 3 000 daltons, telles que Hep et LMWH, qui (a) fixent et activent AT III, et/ou (b) inhibent le facteur Xa, et (ii) les substances du type chondroïtine-sulfate qui activent HC II. En bref les glycosaminoglycanes antithrombotiques sont anticoagulants selon des mécanismes différents, leurs activités anticoagulantes étant plus ou moins intenses.
Les substances hépariniques contiennent en général dans leur formule le fragment pentasaccharidique de structure I :
dans laquelle
Y est SO3- ou COCH3, et
X est H ou SO3-, ledit fragment pentasaccharidique étant le site spécifique de la fixation et de l' activation de AT III.
Le fragment pentasaccharidique de structure I ci-dessus est celui qui est donné dans le Merck Index, lié édition, 1989, page 735 (entrée No 4571, "Heparin "). Les substances GAG qui activent HC II comprennent les polymères du type acide chondroïtinesulfurique, tels que le dermatan sulfate (DS). Elles ont en général un poids moléculaire moyen de 10 000 à 90 000 daltons. Comme DS, elles comportent dans leur structure le motif unitaire répétitif disaccharidique de structure II :
dans laquelle
Ri est SO3-, et
R2 est H.
Le motif unitaire disaccharidique de structure II est celui qui figure, pour DS, dans le Merck Index, lié édition, 1989, page 334 (entrée No 2217, "Chondroitin Sulfate ".
Les substances GAG non-antithrombotiques comprennent notamment (i) les composés du type chondroïtine-sulfate de structure III :
dans laquelle (a) Rj = SO3" et R2 = H, pour le chondroïtine-4-sulfate, et
(b) Ri = H et R2 = SO3-, pour le chondroïtine-6-sulfate ; et, (ii) la chondrosine et l'acide hyaluronique.
Les analogues des glycosaminoglycanes comprennent des produits antithrombotiques et anticoagulants tels que (i) le pentosane sulfate qui répond à la structure répétitive IV :
( IV)
dans laquelle R est SO3" ; (ii) le dextrane sulfate, d'une part; et, des produits qui ne sont pas antithrombotiques ni anticoagulants, tels que (iii) l'acide alginique sulfaté,
(iv) l'acide lactobionique sulfaté,
(v) le polyvinyl sulfate,
(vi) le sucralfate qui présente la structure V suivante :
dans laquelle R est Sθ3[Al2(OH)5], (vu) l'acide hyaluronique et,
(viii) le kératan sulfate, d'autre part.
En pratique, le composant GAG selon l'invention sera avantageuse- ment choisi parmi
- les substances hépariniques ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 3 000-30 000 daltons, notamment Hep, héparane sulfate et LMWH,
- les chondroïtine-4-sulfate, chondroïtine-6-sulfate et dermatan sulfate (DS),
- les substances choisies parmi l'ensemble constitué parmi le dextran sulfate, le pentosane polysulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate, le sucralfate, l'acide hyaluronique, et
- leurs mélanges.
Le composant facteur de croissance mégacaryocytaire (F), qui appartient à l'ensemble des cytokines, est une substance qui intervient de façon "positive", c'est-à-dire qui stimule la mégacaryocytopoïese. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner notamment celles qui sont choisies parmi l'ensemble constitué par le facteur de croissance de fibroblastes (FGF), les interleukines 1 à 13 (IL1 à IL13), l'érythropoïétine (Epo), la thrombopoïétine (Tpo), le facteur de stimulation des progéniteurs médullaires (SCF), les facteurs stimulant la formation de colonies (CSFs) [en particulier le facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF)] et leurs mélanges.
Parmi ces substances, on préfère FGF [et notamment ses formes acide (aFGF) et basique (bFGF)], SCF, d'une part, et surtout IL 6 et Tpo, d'autre part, ainsi que leurs mélanges, les produits F les plus intéressants selon l'invention étant IL 6 et Tpo.
En particulier IL 3 et IL 6 stimulent la maturation des MK et des cellules progénitrices CFU-MK. En revanche FGF, aFGF, bFGF, SCF, stimulent la prolifération des MK et CFU-MK. II existe d'autres facteurs qui interviennent dans les mécanismes de la mégacaryocytopoïese en tant qu'inhibiteurs. Il s'agit notamment de pF4 et TGF-β. Ces facteurs de croissance "négatifs" ne font pas partie du composant F selon l'invention.
Dans la composition thérapeutique selon l'invention, le rapport pondéral R = composant GAG/composant F sera globalement compris entre 1/20 et 3000/1.
De façon avantageuse on a intérêt de moduler ledit rapport pondéral en fonction des thrombopénies que l'on veut traiter. On a ainsi observé que pour avoir une synergie, il est important que : (α) R soit compris entre 1/20 et 500/1 pour les thrombopénies des groupes I et Ile,
(β) R soit compris entre 5/20 et 3000/1 pour les thrombopénies du groupe Ha, et (γ) R soit compris entre 1/20 et 500/1 pour les thrombopénies du groupe Ilb.
De préférence, vis-à-vis des thrombopénies induites par Hep on recommande une association GAG/F dans laquelle GAG est une substance non-antithrombotique (par exemple le sucralfate) dès lors que LMWH peut provoquer, comme Hep, des thrombopénies. Si un effet anticoagulant est requis on admimstrera alors au patient de l'hirudine en plus de l'association
GAG/F. Cependant même en cas de thrombopénies induites par Hep on peut administrer aux patients une composition Hep/substance F selon l'invention.
La composition selon l'invention est utile vis-à-vis de toutes les thrombopénies. Elle est intéressante vis-à-vis des thrombopénies centrales par insuffisance médullaire du groupe I, d'une part, et vis-à-vis des thrombopénies périphériques du groupe II, d'autre part. Parmi les thrombopénies périphériques, elle est plus particulièrement efficace vis-à-vis des thrombopénies auto-immunes du groupe Ile, à savoir notamment dans le traitement des ITP, ainsi que celui des SLE qui sont des ITP immunologiques particuliers affectant les jeunes femmes.
Eu égard à l'intervalle global 1/20 < R < 2000/1 précité, la posologie pouvant être préconisée est de 10 à 2 000 μg/kg/j en composant GAG et de 1 à 200 μg/kg/j en composant F. En pratique, on recommande, selon les groupes de thrombopénies (αα) pour utilisation vis-à-vis des thrombopénies des groupes I et Ile, un apport de 10 à 500 μg/kg/j en composant GAG, et 1 à 200 μg/kg/j en composant F ; (ββ) pour utilisation vis-à-vis des thrombopénies du groupe Ha, un apport de 50 à 2 000 μg/kg/j en composant GAG, et l à 200 μg/kg/j en composant F ; et,
(γγ) pour utilisation vis-à-vis des thrombopénies du groupe Ilb, un apport de 10 à 500 μg/kg/j en composant GAG, et 1 à 200 μg/kg/j en composant F. De préférence, on utilisera vis-à-vis de toutes les thrombopénies une dose de GAG inférieure ou égale à 300 μg/kg/j. Cette dose de 300 μg/kg/j préférée selon l'invention est inférieure à la dose minimale anticoagulante (i.e. 500 μg/kg/j) du composant GAG antithrombotique, notamment Hep et LMWH.
A toutes fins utiles il est rappelé que les doses usuelles de Hep sont de 2000 μg/kg/j dans le traitement curatif des thromboses veineuses, de 1000 μg/kg/j dans le traitement des CIVD, et de 500 à 700 μg/kg/j dans le traitement prophylactique des thromboses veineuses, et la dose usuelle de
LMWH est de 1000 à 1500 μg/kg/j.
La composition selon l'invention tient compte de la posologie préconisée ci-dessu;. elle pourra être présentée sous une forme unitaire pour une seule prise quotidienne, ou sous la forme de doses fractionnées pour plusieurs (en particulier 2 à 3) prises quotidiennes. Le mode préféré d'administration de la composition selon l'invention est la voie injectable.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre de la description d'exemples de réalisation et d'essais comparatifs. Bien entendu l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration. Exemples 1
On a préparé des compositions injectables contenant, dans un véhicule liquide approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de Hep et aFGF selon les concentrations suivantes : Exemple la
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- aFGF à la concentration de 1 μg/ml ; Exemple lb
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- aFGF à la concentration de 10 μg/ml ; Exemple le
- Hep à la concentration de 10 μg/ml, - aFGF à la concentration de 20 μg/ml ;
Exemple ld
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- aFGF à la concentration de 50 μg/ml. Exemples 2 On a préparé des compositions injectables contenant, dans un véhicule liquide approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de Hep et bFGF selon les concentrations suivantes : Exemple 2a
- Hep à la concentration de 10 μg/ml, - bFGF à la concentration de 1 μg/ml ;
Exemple 2b
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- bFGF à la concentration de 10 μg/ml ; Exemple 2c - Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- bFGF à la concentration de 20 μg/ml ; Exemple 2d
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- bFGF à la concentration de 50 μg/ml. Exemples 3 On a préparé des compositions injectables contenant dans un véhicule liquide approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de LMWH (ENOXAPARINE®) et aFGF selon les concentrations suivantes : Exemple 3a - LMWH à la concentration de 50 μg/ml ;
- aFGF à la concentration de 1 μg/ml ; Exemple 3b
- LMWH à la concentration de 50 μg/ml ;
- aFGF à la concentration de 20 μg/ml. Exemples 4
On a préparé des compositions injectables contenant, dans un véhicule liquide approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de LMWH (ENOXAPARINE ) et bFGF selon les concentrations suivantes : Exemple 4a - LMWH à la concentration de 50 μg/ml,
- bFGF à la concentration de 1 μg/ml ; Exemple 4b
- LMWH à la concentration de 50 μg/ml,
- bFGF à la concentration de 20 μg/ml. Exemples 5
On a préparé comme indiqué ci-dessus des compositions injectables contenant un composant GAG et un composant F dans un véhicule liquide approprié : Exemple 5a - CS à la concentration de 50 μg/ml,
- GM-CSF à la concentration de 5 μg/ml ; Exemple 5b
- CS à la concentration de 50 μg/ml,
- GM-CSF à la concentration de 5 μg/ml ; Exemple 5c
- Hep à la concentration de 10 μg/ml,
- SCF à la concentration de 5 μg/ml ; Exemple 5d
- Hep à la concentration de 10 μg/ml, - GM-CSF à la concentration de 5 μg/ml ; Exemple 5e
- CS à la concentration de 50 μg/ml,
- IL 6 à la concentration de 5 μg/ml ; Exemple 5f -Hep à la concentration de 20 μg/ml,
- IL 6 à la concentration de 1 μg/ml ; Exemple 5g
- pentosane sulfate à la concentration de 50 μg/ml,
- ligand de C-Mpl à la concentration de 10 μg/ml ; Exemple 5h
- sucralfate à la concentration de 100 μg/ml,
- Epo à la concentration de 20 μg/ml ; Exemple 5i
- DS à la concentration de 50 μg/ml, - Epo à la concentration de 20 μg/ml.
Exemples 6
On a préparé des compositions injectables contenant dans un véhicule approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de Hep et IL 6 selon les concentrations suivantes : Exemple 6a
- Hep à la concentration de 50 μg/ml,
- IL 6 à la concentration de 20 ng/ml ; Exemple 6b
- Hep à la concentration de 50 μg/ml, - IL 6 à la concentration de 30 ng/ml ;
Exemples 7
On a préparé des compositions injectables contenant, dans un véhicule approprié pour l' administration des GAGs, un mélange de Hep et Tpo selon les concentrations suivantes : Exemple 7a
- Hep à la concentration de 50 μg/ml,
- Tpo à la concentration de 20 ng/ml ; Exemple 7b
- Hep à la concentration de 50 μg/ml, - Tpo à la concentration de 30 ng/ml ; Exemples 8
On a préparé des compositions injectables contenant dans un véhicule approprié pour l' administration des GAGs, un mélange de CS et IL 6 selon les concentrations suivantes : Exemple 8a
- CS à la concentration de 50 μg/ml,
- IL 6 à la concentration de 20 ng/ml ; Exemple 8b
- CS à la concentration de 50 μg/ml, - IL 6 à la concentration de 30 ng/ml ;
Exemples 9
On a préparé des compositions injectables contenant, dans un véhicule approprié pour l'administration des GAGs, un mélange de CS et Tpo selon les concentrations suivantes : Exemple 9a
- CS à la concentration de 50 μg/ml,
- Tpo à la concentration de 20 ng/ml ; Exemple 9b
- CS à la concentration de 50 μg/ml, - Tpo à la concentration de 30 ng/ml ;
Essais A - Formation de colonies de mégacaryocytes
Des souris mâles Balb/c (IFFA CREDO) âgées de 8 semaines sont sacrifiées par élongation cervicale. Les cellules de la moelle osseuse sont prélevées des fémurs au moyen d'un milieu de base αMEM (EUROBIO) puis lavées deux fois par centrifugation (250 g ; 10 minutes ; 22°C) dans αMEM.
Les CFU-MK murins ont été testés au moyen d'un système en caillot plasmatique. En bref 2 x 10*5 cellules mononucléées de moelle sont cultivées sur boîtes de Pétri dans un volume total de 1 ml C'-Î milieu αMEM contenant 1 % d'albumine bovine sérique désionisée (SIGMA CHEMICAL Co.), 10 % de plasma bovin citrate (FLOW LABORATORY), ÎO^M de 2-mercaptoéthanol, 0,34 mg de CaCl2, 15 IU de pénicilline et 15 μg de streptomycine. Dans ce milieu de culture on a également ajouté les mélanges GAG + F des exemples 1 à 4, les composants de ces mélanges (i.e. GAG seul ou F seul correspondants). Après 7 jours d'incubation à 37°C, les caillots ont été séchés avec du papier filtre, fixés avec 1 % de paraformaldéhyde, puis identifiés par coloration d'acétylcholinestérase, un groupe d'au moins 3 MK constituant une colonie de MK.
Les résultats consignés dans les figures 1 (moyenne de 3 essais par produit testé) et 2 (moyenne de 2 essais par produit testé) montrent que les mélanges Hep/aFGF des exemples la-ld, Hep/bFGF des exemples 2a-2d, LMWH/aFGF des exemples 3a-3b et LMWH/bFGF des exemples 4a-4b potentialisent de façon statistiquement significative la formation de colonies de mégacaryocytes par rapport à Hep ou LMWH, d'une part, et aFGF ou bFGF, d'autre part.
Essais B - Formation de colonies de CFU-MK et CFU-GM
Des cellules mutines mononucléées de moelle osseuse à la concentration de 2 x 10~*5 cellules/ml sont incubées en triple pendant 7 jours à 37°C avec 1 ml d'un milieu αMEM contenant 0,3 % d'agar (GIBCO), 10" M de 2-mercaptoéthanol, 30 % de substitut de sérum et diverses doses de composant GAG et/ou composant F, afin de tester les mélanges des exemples 5a-5d par rapport aux composants desdits mélanges.
Les résultats obtenus ont été consignés dans la figure 3 (moyenne de trois essais par produit testé) montrent que les mélanges CS/SCF (Ex 5a), CS/GM-CSF (Ex 5b), Hep/SCF (Ex 5c) et Hep/GM-CSF (Ex 5d) augmen¬ tent la formation de colonies de progéniteurs CFU-GM par rapport aux composants desdits mélanges respectifs. Essais C - Essais cliniques
Des essais cliniques ont été réalisés sur un ensemble de 30 patients adultes (17 femmes et 13 hommes, âgés de 18 à 60 ans) souffrant tous d'ITP et répartis au hasard en trois groupes de 10 personnes. On a procédé à la numération des MK, CFU-MK et plaquettes avant traitement.
Le premier groupe (Gl) a été traité avec la prednisone (0,3 mg/kg/j) et a été utilisé en tant que groupe témoin. Le second groupe (G2) a été traité avec la même dose de prednisone
(0,3 mg/kg/j) et par injection quotidienne sous-cutanée de 25 mg (i.e. 2500 IU) de Hep.
Le troisième groupe (G3) a été traité avec la même dose de prednisone et par injection sous-cutanée quotidienne du mélange Hep + aFGF selon l'exemple la [10 mg (i.e. 1000 IU) de Hep + 1 mg de aFGF par jour].
Après 1 mois de traitement on a compté le nombre de MK, CFU-MK et plaquettes. Quand on considère la variation du nombre de MK, CFU-MK et plaquettes entre le début et la fin du traitement, on constate une amélioration statistiquement significative pour les groupes G2 et G3 par rapport au groupe témoin Gl.
Par ailleurs, on a observé chez les patients les succès et échecs des traitements. Les résultats correspondants sont consignés dans le tableau I ci- après.
TABLEAU I
TRAITEMENT DES ITP
Groupe Nombre de succès Nombre d'échecs complets ou partiels
Gl (témoin) 2 8 G2 7 3 G3 10 0
Les échecs des groupes Gl et G2 ont ensuite été soumis à un traitement comprenant, pendant 1 mois, l'injection quotidienne du mélange de l'exemple la (10 mg de Hep + 1 mg de aFGF) c'est-à-dire le traitement du groupe G3 sans prednisone. Pour ces 11 patients on a constaté 11 succès complets ou partiels. Essais D - Essais complémentaires
Des essais complémentaires ont été entrepris avec les produits des exemples 6-9.
Dans une première série d'expérimentations, les compositions des exemples 6a, 7a, 8a et 9a ont été ajoutées à des cultures de caillots plasmatiques dans les conditions opératoires décrites dans les essais A ci- dessus. On a constaté que l'effet stimulant de Hep et CS sur la croissance des colonies de mégacaryocytes est (i) augmenté en présence de IL 6 ou respectivement Tpo et (ii) diminué quand on ajoute en plus des anticorps antitTL 6) ou respectivement anti(Tpo). Un partie des résultats correspondants relatifs à la taille des mégacaryocytes est consignée dans le tableau II ci-après.
TABLEAU π
Effet sur la taille des mégacaryocytes
Dans une seconde série d'expérimentations on a évalué l'effet de Tpo et IL 6, à différentes concentrations, sur la croissance de colonies de mégacaryocytes en milieu gélifié (système agar dépourvu de sérum). Le protocole utilisé est le suivant. Des cellules nuclées de moelle osseuse murine à la concentration de 2 x 10*5 cellules/ml sont incubées (trois lots) pendant 7 jours avec 1 ml d'un milieu contenant 3 % d'agar (GIBCO), 10"4M de 2-mercaptoéthanol, 30 % de substitut de sérum et diverses doses de GAG/substance F. Le substitut de sérum a été préparé selon la méthode décrite par Z.C. HAN et al., Int. J. Hematol, __ : 281-286 (1992). En bref, de la tranferrine humaine purifiée (SIGMA) a été diluée dans un milieu alpha (90 mg/ml) et saturée avec 7,0 mM de chlorure ferrique ; on ajoute 0,65 ml de transferrine saturée à 49,35 ml de milieu alpha contenant 10 % de BSA désionnisée, 0,02 mg/ml d'asparagine et 0,15 mg/ml de glutamine pour obtenir un volume de substitut de sérum. Les résultats obtenus sont consignés dans les figures 4a et 4b (où Tpo est désigné C-Mpl ligand).
L'ensemble des résultats complémentaires montrent que les compositions GAG/Tpo et GAG/IL 6 stimulent la mégacaryocytopoïese de façon statistiquement significative.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un mélange stimulant la mégacaryocytopoïese et comprenant :
(A) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les glycosaminoglycanes, leurs analogues et leurs mélanges, et
(B) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les facteurs de croissance mégacaryocytaires et leurs mélanges, pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des thrombopénies.
2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance (B) est choisie parmi l'ensemble constitué par le facteur de croissance de fibroblastes (FGF), les interleukines 1 à 13 (IL1 à IL13), l'érythropoïétine (Epo), la thrombopoïétine (Tpo), le facteur de stimulation des progéniteurs médullaires (SCF), les facteurs stimulant les colonies (CSFs) et leurs mélanges.
3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance (B) est choisie parmi l'ensemble constitué par le facteur acide de croissance de fibroblastes (aFGF), le facteur basique de croissance de fibroblastes (bFGF) et leurs mélanges.
4. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance (B) est choisie parmi l'ensemble constitué par le facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) .
5. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance (B) est choisie parmi l'ensemble constitué par Tpo et IL 6.
6. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit mélange des substances A et B est destiné aux thrombopénies centrales par insuffisance médullaire.
7. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit mélange des substances A et B est destiné aux thrombopénies périphériques.
8. Utilisation suivant la revendication 7, caractérisée en ce que ledit mélange A/B est destiné aux thrombopénies auto-immunes telles que le purpura thrombopénique immun.
9. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, un mélange de :
(A) une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les glycosaminoglycanes, leurs analogues et leurs mélanges, et
(B) un facteur de croissance mégacaryocytaire choisi parmi l'ensemble constitué par les interleukines 1 à 13 (IL1 à IL13), l'érythropoïétine (Epo), la thrombopoïétine (Tpo), le facteur de stimulation des progéniteurs médullaires (SCF), les facteurs stimulants les colonies (CFSs) [notamment le facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF)] et leurs mélanges.
10. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce que la substance (B) est choisie parmi l'ensemble constitué par Tpo, IL 6 et leurs mélanges.
11. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce que la substance (A) est choisie parmi l'ensemble constitué par les substances hépariniques ayant un poids moléculaire compris entre 3000 et 30000 daltons.
12. Composition suivant la revendication 11 , caractérisée en ce que la substance héparinique est choisie parmi l'ensemble constitué par l'héparine standard ayant un poids moléculaire de l'ordre de 12 000 daltons, les héparines fractionnées de bas poids moléculaire et leurs mélanges.
13. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce que la substance (A) est choisie parmi l'ensemble constitué par les chondroïtine-4- sulfate, chondroïtine-6-sulfate, dermatan sulfate et leurs mélanges.
14. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce que la substance (A) est choisie parmi l'ensemble constitué par le dextran sulfate, le pentosane polysulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate, le sucralfate, l'acide hyaluronique et leurs mélanges.
15. Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient des quantités de substances A et B telles que le rapport pondéral R = A/B soit compris entre 1/20 et 3000/1.
16. Composition suivant la revendication 15, caractérisée en ce que ledit rapport pondéral R est compris entre 1/20 et 500/1.
17. Composition suivant la revendication 15, caractérisée en ce que ledit rapport pondéral R est compris entre 5/20 et 3000/1.
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