[go: up one dir, main page]

EE05731B1 - Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks - Google Patents

Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks

Info

Publication number
EE05731B1
EE05731B1 EEP201200008A EEP201200008A EE05731B1 EE 05731 B1 EE05731 B1 EE 05731B1 EE P201200008 A EEP201200008 A EE P201200008A EE P201200008 A EEP201200008 A EE P201200008A EE 05731 B1 EE05731 B1 EE 05731B1
Authority
EE
Estonia
Prior art keywords
reactor
transfer
daughter
reactors
cultivation
Prior art date
Application number
EEP201200008A
Other languages
English (en)
Inventor
Sten Erm
Raivo Vilu
Kaarel Adamberg
Original Assignee
Tallinna Tehnikaülikool
As Toidu- Ja Fermentatsioonitehnoloogia Arenduskeskus
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tallinna Tehnikaülikool, As Toidu- Ja Fermentatsioonitehnoloogia Arenduskeskus filed Critical Tallinna Tehnikaülikool
Priority to EEP201200008A priority Critical patent/EE05731B1/et
Priority to EP20130728952 priority patent/EP2850173A1/en
Priority to PCT/EE2013/000005 priority patent/WO2013170863A1/en
Priority to US14/401,541 priority patent/US10030222B2/en
Publication of EE201200008A publication Critical patent/EE201200008A/et
Publication of EE05731B1 publication Critical patent/EE05731B1/et

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/40—Manifolds; Distribution pieces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14—Incubators; Climatic chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/44—Multiple separable units; Modules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
    • C12M41/24—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes inside the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M43/00—Combinations of bioreactors or fermenters with other apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/20—Heating; Cooling

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks hõlmab eelisteostuses sensoritega 3 ja segajaga 4 varustatud emareaktorit 1 ja vähemalt ühte tütarreaktorit 2, mis on omavahel ühendatud ülekandekanalitega 5, vedeliku sissevooluga 6 ja väljavooluga 7, gaasi sissevooluga 8 ja väljavooluga 9, mahu kontrollimise seadmeid 12, pumpasid 13 ja 14, kontrollereid 10, kontrollitarkvara ja kultiveerimisprogrammiga arvutit 11, ventiile, lisaseadmeid. Meetodi eelislahenduses teostamiseks täidetakse emareaktor 1 vajaliku ruumala ulatuses toitega, mikroorganismid inokuleeritakse toitesse ja mikroorganismide kultuur stabiliseeritakse. Seejärel suurendatakse ruumala emareaktoris 1 muutumatu füsioloogia tingimustes ja tütarreaktorid 2 valmistatakse ette emareaktori 1 tingimustele vastavaks. Mikroorganismide kultuur kantakse üle tütarreaktoritesse 2. Tütarreaktorites 2 viiakse läbi katse, samal ajal suurendatakse ruumala emareaktoris 1. Katse järgselt puhastatakse ülekandekanalid 5, tütarreaktorid 2 pestakse, steriliseeritakse ja valmistatakse ette järgmiseks ülekandeks. Etappe - ruumala suurendamine, tütarreaktorite ettevalmistamine katseks, tütarreaktorite tühjendamine, jättes keskkonnatingimused muutumatuks, kultuuri ülekanne emareaktorist tütarreaktoritesse, katse tütarreaktorites - korratakse seni kuni soovitud katsed on teostatud.

Description

Tehnikavaldkond
Käesolev leiutis kuulub teadustööks ja tootmiseks kasutatavate mikroorganismide kultiveerimise lahenduste, täpsemalt mitmest bioreaktorist kombineeritud süsteemide valdkonda. Kultiveerimiste lahendused hõlmavad perioodilisi, poolperioodilisi ja pidevkultivatsioone.
Tehnika tase
Mikroorganismide füsioloogia uuringutel on oluline varieerida vaid parameetrit, mille mõju soovitakse analüüsida. Näiteks analüüsides temperatuuri muutuse mõju peaks pH ja muud parameetrid olema fikseeritud. Lisaks ei tohiks enne katset mikroorganismidele mõjuda substraadi vähesusest või liiast tingitud stress. Kui ülekanne reaktorist-reaktorisse toimub aeglaselt, toimub ülekande voolikutes mikroorganismide kontrollimatu kasv - tarbitakse ära jääksubstraat, tekib viimase nälg, mille tulemusena aktiveeruvad erinevad stressi vastused (mikroorganismide kultuur ei ole enam stabiilse füsioloogiaga). Alustades katset mittestabiilse füsioloogiaga mikroorganismide kultuuriga, eksisteerib võimalus, et saadud tulemus ei ole varieeritud parameetrist tingitud. Seega on füsioloogilise seisundi konstantsus ülekande järgselt kõikides süsteemi bioreaktorites oluline kriteerium, kui soovida teostada katseid või tootmisprotsesse identsetest lähteseisunditest. Ka ruumala suurendamise faasis on oluline säilitada muutumatu füsioloogiline seisund, saavutamaks hilisemas kultivatsioonis üheselt tõlgendatavaid vastuseid keskkonnaparameetrite muutusele.
Alustades pidevkultivatsiooni korral katset mittestabiilse füsioloogiaga kultuuriga, peab üheselt tõlgendatavate tulemuste saamiseks eelnema stabilisatsiooni faas, mis tavaliselt on viis ruumaega. Seega rikkudes mikroorganismide kultiveerimise käigus (ruumala suurendamine või kultuuri ülekanne) füsioloogilise seisundi, suureneb stabilisatsioonifaasi võrra katseaeg.
Varasemalt on teada mitmeid kultiveerimistehnoloogiaid, kus on kasutatud erinevaid bioreaktorite süsteeme. Tuntumate kultiveerimismeetoditena on omavahel ühendatud bioreaktorites kasutatud näiteks pidev-, perioodilist või pool-perioodilist kultivatsiooni.
Artiklis "A multi-bioreactor system for optimal production of malaria vaccines with Pichia pastoris" J. Fricke, K. Pohlmann, F. Tatge, R. Lang, B. Faber, R. Luttmann, Biotechnology Journal 2011, vol 6 (4), lk 437-451 on kirjeldatud süsteemi, mis on koostatud ühest 5L emareaktorist ja kuuest 1L tütarreaktorist. Emareaktoris toimub biomassi ruumala suurendamine pool-perioodilises kultivatsioonis, seejärel toimub kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse. Antud lahenduse puuduseks on, et ruumala suurendamise faasis emareaktoris toimub peale ruumala ka teiste kultiveerimistingimuste muutmine (mikroorganisme töödeldakse metanooliga indutseerimaks rekombinantse valgu sünteesi), suureneva ruumalaga kultiveerimine ei toimu kõigi muude parameetrite (v.a ruumala) konstantsuse tingimustes. Lisaks toimub ruumala suurendamise käigus emareaktori temperatuuri muutmine 30 °C juurest 20 °C juurde, mistõttu muudetakse mikroorganismide füsioloogilist seisundit. Peale ülekannet toimub emareaktoris taas mikroorganismide populatsiooni kasvatamine ülekande ruumalani, kuid tänu eelnenud metanooli ja temperatuuri muutuse mõjule on tegu potentsiaalselt kultuuriga, mis esialgsega võrreldes on muutunud füsioloogilise seisundiga. Samuti ei võimalda antud lahendus ema- ja tütarreaktorites sama füsioloogilise seisundi säilitamist ülekande järgselt. Artiklis kirjeldatud ühes lahenduses on emareaktoris temperatuur 30 °C, tütarreaktorites 20 °C, sellest johtuvalt on oodata erinevat füsioloogilist seisundit. Stabiliseerumine uutele tingimustele on näha ka tulemustes, kus esines peale ülekannet metanooli kontsentratsiooni kõikumine. Teises lahenduses oli algne temperatuur nii ema- kui ka tütarreaktorites identne, kuid tütarreaktorites toimus kultuuri kahekordne lahjendamine värske toitega. Kultuuri ülekanne oli realiseeritud küll perioodiliselt, kuid mõnedes tütarreaktorites on rakendatud emareaktorist erinevaid keskkonnatingimusi (T, pH, metanooli kontsentratsioon). Seega muudetakse ülekandel järsult keskkonnatingimusi, toimingu mõju mikroorganismidele väljendub viimaste stressi vastuses. Tehnilist lahendust ei kirjeldata, seega võib eeldada, et kultuuri kiiret ülekannet ei ole peetud kriitiliseks; samas on pool-perioodilisel kultivatsioonil, kus johtuvalt kultiveerimismeetodist on biomassi kontsentratsioon suur ja seega on suur ka hapniku tarbimise kiirus, tõenäoline anaeroobse keskkonna teke aeglasel kultuuri ülekandel, mis omakorda toob kaasa füsioloogia muutumise. Võimalikud probleemid aeroobse keskkonna säilitamisel on näha mittekonstantsest QO2 joonest artikli joonisel nr 7.
Artiklis A Two-stage CSTR Cascade for Studying the Effect of Inhibitory and Toxic Substances in Bioprocesses", R. Hortsch, C. Löser, T. Bley, Engineering in Life Sciences", 2008, vol 8 (6), lk 650-657 on kirjeldatud kultiveerimissüsteemi, kus kultuuri ülekanne on teostatud reaktorist reaktorisse pidevalt. Kirjeldatud lahendus ei võimalda perioodilist kultuuri ülekannet. Antud lahenduses proovitakse bakterite füsioloogiline seisund hoida mõlemas reaktoris sama, kuid kuna kogu emareaktorist väljuv biomassi voog suunatakse pidevalt edasi tütarreaktorisse on selles biomassi kasvu saavutamiseks vajalik lisasubstraat ja seega on tütarreaktori läbivool kaks korda suurem kui emareaktoris. Sellest johtuvalt ei ole kultiveerimismeetod emareaktoris ja tütarreaktoris ülekande hetkel sama, mis tingib füsioloogilise seisundi muutumise. Biomassi ülekandeks on kirjeldatud lahenduses kasutatud peristaltilist pumpa, mis ei ole piisavalt kiire lahendus muutumatu füsioloogiaga biomassi ülekandeks.
Artiklis Continuous, high-level production and excertion of a plasmid-encoded protein by Escherichia-coli in a two-stage chemostat", J. Fu, D.B. Wilson, M. L. Shuler, Biotechnology and Bioengineering", 1993, vol 41 (10), lk 937-946 on kirjeldatud süsteemi, kus toimus pidev kultuuri ülekanne emareaktorist tütarreaktorisse, kahes reaktoris kasutati erinevat lahjenduskiirust, tütarreaktoris viidi läbi pidev IPTG-ga (Isopropyl (beeta-D-1-thiogalactopyranoside) proteiini sünteesi indutseerimine. Johtuvalt erinevatest keskkonnatingimustest ema- ja tütarreaktorites ei võimalda antud lahendus kultuuri ülekannet füsioloogilist seisundit häirimata, mis omakorda tingib, et tütarreaktoris ei alustata katset emareaktoriga identsetel tingimustel.
Artiklis Bioreactor mixing efficiency modulates the activity of a prpoS::GFP reporter gene in E. coli F. Delvigne, M. Boxus, S. Ingels, P. Thonart, Microbial Cell Factories", 2009, vol 8 on kirjeldatud lahendust, kus biomassi ülekandmine bioreaktorist teise on realiseeritud pool-perioodilisel kultivatsioonil pidevalt segurreaktorist torureaktorisse imiteerimaks tööstusliku bioreaktori sisu heterogeensust (erinevates reaktori osades erinevad toitainete, mingite muude keskkonnaparameetrite gradiendid). Torureaktoris lisati kultuurile kontsentreeritud glükoosi lahust, kultuuri torureaktoris ei aereeritud. Antud lahenduses toimub mikroorganismide kultuuri ülekanne reaktorist reaktorisse pidevalt, seega ei saa alustada tütarreaktoris katset emareaktoris stabiliseerunud kultuuriga. Erinevates reaktorites rakendatakse erinevaid kultiveerimismeetodeid (segureaktoris kemostaat, torureaktoris perioodiline kultivatsioon). Torureaktorist suunati biomass tagasi segurreaktorisse, seega muudeti ka emareaktoris pool-perioodilises reþiimis oleva kultuuri füsioloogilist seisundit.
Artiklis Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli , J. E. Barrick, D. S. Yu, S. H. H. T. K. Oh, D. Schneider, R. E. Lenski, J. F. Kim, Nature", 2009, 461, lk 1243-1247 on kirjeldatud levinuimat reaktorist-reaktorisse ülekande lahendust, kus perioodiline kultiveerimine on korratud saavutamaks suurt mikroorganismide generatsioonide arvu. Eksponentsiaalse kasvu faasist külvatakse bakterid steriilsesse söötmesse, kasvatatakse üles, korratakse ülekannet ja järelejäänud protseduuri. Ülekande hetkel toimub bakterikultuuri lahjendamine, mis võib tingida mikroorganismide stressivastuse. Lisaks peatatakse ülekande hetkeks bioreaktoris segamine, mis tingib hapniku lahustuvuse halvenemise ja sellega mikroorganismide füsioloogia muutmise.
Bioreaktorite süsteeme, kus rakendatakse kultuuri ülekannet, on teada ka erinevatest patendidokumentidest. Senituntud lahenduste puuduseks on, et need ei võimalda mikroorganismide kultuuri ülekannet rangelt kontrollitud tingimustes, erinevates reaktorites on füsioloogiline seisund erinev. Selliste lahenduste näiteks võib tuua järgmistes patendidokumentides kirjeldatud lahendused.
Saksa patenditaotluses DE19547656A1 on kirjeldatud järjestikku ühendatud reaktoreid toksiliste ainete detekteerimiseks reoveest. Kirjeldatud on kultuuri ülekanne reaktorite vahel, kuid puudub füsioloogilise seisundi konstantsuse säilimine. Ülekanne toimub pidevalt, eri reaktorites varieerub füsioloogiline seisund, seega ei saa tütarreaktorites alustada katset emareaktoris stabiliseerunud kultuuriga. Kultiveerimise käigus emareaktoris ruumala ei muutu. Kirjeldatud lahendus ei võimalda mikroorganismide ülekande protsessi optimeerimist. Suurbritannia patendis GB1270006 on kirjeldatud reaktorite seeriat, milles teostatakse kultuuri hoidmine pidevas logaritmilise kasvu faasis. See tähendab, et tänu toitega lahjendamise efektile muutuvad ülekandel kontsentratsioonid ja seetõttu ei säilitata füsioloogilist seisundit muutumatuna. Jaapani patenditaotluses JP8229534A on kirjeldatud kultuuri liikumist ühest reaktorist teise, kuid ei keskenduta katsete alustamisele fikseeritud füsioloogilisest seisundist, vaid eesmärgiks on saavutada erinevates reaktorites erinev summaarne substraadi konversiooniaste. Patenditaotluses WO2005042694A2 on kirjeldatud bakterite ülekanne bioreaktorite vahel, kuid ülekande protsessi käigus muudetakse bakterite füsioloogilist seisundit. Erinevates reaktorites rakendatakse erinevat kultiveerimismeetodit, mistõttu katsete alustamine stabiliseerunud kultuuriga ei ole võimalik. Bulgaaria autoritunnistuses BG50222A on kirjeldatud lahendus ei võimalda kultuuri ülekannet kontrollitud tingimustes, ning füsioloogilise seisundi säilitamist. Ameerika Ühendriikide patenditaotluses US2010041124A1 on kirjeldatud mitme-etapilist bioreaktorite süsteemi, kus mikroorganismide transport viiakse läbi reaktorite vahel, kuid kuna toide sisestatakse vaid esimesse reaktorisse, ei võimalda lahendus alustada katseid samast füsioloogilisest seisundist erinevates reaktorites. Biomassi kontsentratsioon erinevates reaktorites ei ole identne.
Tuntud lahendused ei võimalda erinevates reaktorites kultuuri ülekannet kontrollitud tingimustes ja sama kultiveerimismeetodi kasutamist, mistõttu ei võimalda kultuuri ülekandel füsioloogilise seisundi, keskkonnatingimuste, biomassi parameetrite säilitamist. Erinevates reaktorites erinevate kultiveerimismeetodite kasutamise tõttu ei ole senituntud lahendustega võimalik vahetult peale ülekannet kultivatsioonide alustamine erinevates reaktorites stabiliseerunud kultuuriga. Erinevate keskkonnatingimuste tõttu erinevates reaktorites ei ole võimalik teostada kultuuri ülekannet füsioloogilist seisundit häirimata ja ei saa alustada tütarreaktoris katset emareaktoris stabiliseerunud kultuuriga identsetel tingimustel.
Leiutise olemus
Käesolevale leiutisele vastava lahenduse eesmärgiks on välja pakkuda eeltoodud puuduste vaba bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks ning järgnevateks füsioloogia uuringuteks, biomassi või metaboliidi (näiteks etanool, rekombinantne proteiin) või muu bioloogilise ühendi (näiteks RNA, valk, polüsahhariid) tootmiseks. Edaspidi on ülekande järgselt toimuv eksperiment või tootmisprotsess defineeritud katsena .
Erinevalt senituntud lahendustest säilitatakse käesolevale leiutisele vastavas bioreaktorite süsteemis nii muutuva ruumalaga kultiveerimisel, kultuuriülekandel, kui ka selle järgselt mikroorganismide kultuuri muutumatu füsioloogiline seisund. St, et biomassi mõõdetavad parameetrid muutuva ruumalaga kultiveerimisel ja erinevates reaktorites ülekande järgselt (0.01 sekundit kuni 100 tundi) ei muutu rohkem kui 20% võrreldes algsete parameetrite väärtustega emareaktoris ruumala suurendamisele eelnevalt, kusjuures protsessi käigus mõõdetavate parameetrite koguarv ei ole piiratud.
Käesolevale leiutisele vastav bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks võimaldab erinevalt senituntud lahendustest füsioloogilist seisundit häirimata:
- rangelt fikseeritud keskkonnatingimuste juures muutuva ruumalaga kultiveerimist emareaktoris (keskkonnatingimuste hajumine mitte suurem kui 20%);
- ülekandele eelnevat tütarreaktorite ettevalmistamist samadele keskkonnatingimustele, mis emareaktoris (lubatud on keskkonnatingimuste hajumine mitte rohkem kui 20%), kusjuures tütarreaktorid ei sisalda vahetult enne ülekannet (0.1 - 3600 sekundit) vedelikku;
- emareaktoris ja tütarreaktorites ülekande hetkel samade keskkonnatingimuste rakendamist (keskkonnatingimuste hajumine mitte rohkem kui 20%);
- ülekannet tühjadesse ettevalmistatud keskkonnaparameetritega tütarreaktoritesse;
- emareaktoris ja tütarreaktorites ülekande järgselt samade keskkonnatingimuste rakendamist (keskkonnatingimuste hajumine mitte rohkem kui 20%);
- ülekande hetkel ja järgselt biomassi kogusele vastavate kultiveerimisparameetrite rakendamist;
- perioodilist kultuuri ülekannet;
- piisavalt kiiret kultuuri ülekannet (tööruumala ülekanne 0.01 - 3600 sekundi jooksul) (kriitiline ülekande kiirus on määratud biomassi tihedusega, substraatide kontsentratsiooni ja nende tarbimise võimsusega, lisaks määrab ülekande kiiruse minimaalne kultivatsiooniprogrammis võimalik kontrollintervall);
- erinevates reaktorites ülekande järgselt sama kultiveerimismeetodi kasutamist;
- erinevates reaktorites ülekande järgselt erineva kultiveerimismeetodi kasutamist;
- pidevkultivatsiooni korral ühekordset mikroorganismide kultuuri stabiliseerimist emareaktoris, mis vähendab igas järgnevas ülekandes ja katses stabilisatsiooniks kuluvat aega ning substraadi kogust;
- biomassi ülekannet emareaktorist tütarreaktoritesse säilitades kõikides süsteemi reaktorites esialgse fikseeritud füsioloogilise seisundi (hajumine mitte rohkem kui 20%);
- alustada kõikides süsteemi reaktorites katset identsete algsete keskkonna-tingimuste juurest (keskkonnatingimuste hajumine mitte rohkem kui 20%);
- alustada kõikides süsteemi reaktorites katset identses füsioloogilises seisundis oleva biomassiga (biomassi füsioloogilise seisundi hajumine mitte rohkem kui 20%);
- varieerida reaktorit, milles toimub muutuva ruumalaga kultiveerimine (eksperimendi alguses tütarreaktori rollis olnud reaktor on järgmisel iteratsioonil kasutatav emareaktorina ja teostada sellest biomassi ülekande kõikidesse teistesse süsteemi reaktoritesse);
- varieerida reaktoreid milledesse toimub kultuuri ülekanne (katse alguses emareaktori rollis olnud reaktor on järgmisel iteratsioonil kasutatav tütarreaktorina).
Eesmärgi saavutamiseks kasutatav bioreaktorite süsteem on moodustatud vähemalt ühest emareaktorist ja vähemalt ühest tütarreaktorist, mis sensorite ja kontrollerite abil on ühendatud vastavat tarkvara sisaldava juhtimisseadmega. Erinevalt senituntud lahendustest on süsteemis uuritavad rakud pidevalt eksperimenteerija poolt defineeritud ja kontrollitavas seisundis, mis saavutatakse erinevate kultiveerimismeetodite kasutamisel (ülekande järgselt ja enne katset tütarreaktorites on eelisteostuses kultiveerimismeetod ja keskkonnatingimused kõikides süsteemi reaktorites samad, alternatiivsetes teostustes kasutatakse erinevates reaktorites erinevaid kultiveerimismeetodeid (emareaktoris näiteks pidevkultivatsiooni, tütarreaktorites pool-perioodilist kultivatsiooni)). Erinevates reaktorites erinevate kultivatsiooniviiside kasutamisel hoitakse vahetult peale ülekannet (0.1 kuni 3600 sekundit) ja enne katset biomassi parameetrid samad (parameetrite kõikumine mitte rohkem kui 20%)).
Käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, eelisteostuses kasutatakse emareaktoris enne mikroorganismide kultuuri ülekannet, selle ajal ja järgselt pidevkultivatsiooni (näiteks kemostaat, akselerostaat, D-staat, turbidostaat, Z-auksostaat, Z-auksoakselerostaat) ja alternatiivsetes teostustes perioodilist või pool-perioodilist kultivatsiooni. Eelisteostuses säilitatakse ülekande järgselt ja enne katset tütarreaktorites sama kultivatsioonimeetod, mis emareaktoris. Kui kultiveerimismeetod tütarreaktorites on erinev emareaktoris kasutatust, rakendatakse kultiveerimisparameetreid selliselt, et biomassi parameetrid jäävad ülekande järgselt (0.1 kuni 3600 sekundit) muutumatuks (samadeks, mis emareaktoris ülekandele eelnevalt, kusjuures erinevus on ligikaudu 20%). Eelisteostuses fikseeritakse uurimise all olevad rakud tasakaaluolekus (steady state), kuid võidakse kasutada rakke kvaasi tasakaaluolekus (quasi steady state), täielikult mitte tasakaaluoleku seisundis või muus eksperimenteerija poolt sobiva kultiveerimismeetodiga reprodutseeritavas seisundis.
Ema- ja tütarreaktoritest bioreaktorite süsteem on eelislahenduses varustatud sensorite, segaja, sisse- ja väljavooluga (kusjuures sisse- ja väljavoolukanaleid on vajadusel vastavalt eraldi sisestatavate substraatide arvule ja proovivõtu spetsiifikale lisatud rohkem kui üks), ülekandekanaliga millega on omavahel ühendatud bioreaktorid mikroorganismide kasvatamiseks, millele materjalivoogude monitoorimiseks on lisatud bioreaktorite ja toiteanumate sisendite (ja vajadusel ka väljundite) kaalud. Alternatiivses teostuses kasutatakse materjalivoogude determineerimisel teisi vahendeid: näiteks vedeliku vooluhulga määramine massivoolu kontrolleriga, materjalibilansside arvutatamist pumba töökiirusest, väljavoolu kaalumisest. Sõltuvalt rakendatavast kultiveerimismeetodist ja kasutatud riistvarast on bioreaktorite süsteemile lisatud pumbad, erinevad analüsaatorid (näiteks gaasianalüüs, optilise tiheduse analüüs, elektromagnetkiirguse spektraalanalüüs näiteks etanooli või mingi teise ühendi määramiseks, kromatograafia erinevad lahendused, massispektromeeter, muud instrumentaalanalüüsi vahendid, biomassi automaatne kollektor, kultuurvedeliku automaatne kollektor, kusjuures erinevates teostustes kasutatakse erinevat arvu analüsaatoreid).
Bioreaktoritena kasutatakse käesolevale leiutisele vastavas bioreaktorite süsteemis näiteks segajaga varustatud laboratoorset bioreaktorit (Stirred Tank Reactor - STR), segajaga varustatud mitte-laboratoorset bioreaktorit, torureaktorit (Plug Flow Reactor -PFR), reaktorit, milles suspensiooni segamine teostatakse gaseerimise tekitatud tiheduse gradientidega (Airlift Reactor), kultivatsiooni koti (Cultivation Bag) tüüpi reaktoreid, minireaktoreid, mikroreaktoreid, mikrokiibile ehitatud reaktoreid (Lab on a Chip), vm. Emareaktorina (mis inokuleeritakse traditsioonilisel viisil) kasutatakse bioreaktorit, millest teostatakse kultuuri ülekanne teistesse reaktoritesse ehk tütarreaktoritesse. Tütarreaktorina kasutatakse bioreaktorit, millesse teostatakse kultuuri ülekanne. Eelistatult järgneb igale ülekandele katse tütarreaktorites, ülekanne koos järgneva katsega on käsitletav ühe iteratsioonina. Sõltuvalt teostusest võib esimeses iteratsioonis tütarreaktorina kasutatud bioreaktor teises iteratsioonis täita emareaktori rolli. Bioreaktorite rollide vahetust katseseerias kasutatakse näiteks segureaktorite korral, kuid ka teiste reaktoritüüpide juures.
Käesolevale leiutisele vastav bioreaktorite süsteem on konstrueeritud selliselt, et ülekannet bioreaktorist teistesse teostatakse mis iganes reaktorist. Bioreaktorite süsteemis saab iga reaktorit steriliseerida ja puhastada ilma süsteemi komponentideks lahti võtmata, steriliseerimine ja puhastamine teostatakse suletud süsteemis steriilsete vedelikega. Ülekande süsteemi moodustavad voolikud on puhastatavad sinna transpordi järgselt jäänud biomassist steriilse gaasiga.
Kultiveerimise kontroll teostatakse kasutades tarkvara, milles on rakendatud kontroll-algoritmid. Eelistatud lahenduses on kultiveerimise kontroll teostatud näiteks BioXpert tarkvaraga ja Applikon Biobundle bioreaktoritega, kuid sobivad ka alternatiivsed lahendused. Eelistatud lahenduses on kriitiliste kontrolliparameetrite (parameetrid, mis sõltuvad reaktori tööruumalast (lahjenduskiirus) või on füsioloogia seisukohalt olulised (gaasi sissevoolu kontroll, lahustunud hapniku kontsentratsioon, pH, temperatuur)) kontrollimise kiirus ülekande momendil minimaalne (näiteks 0,01 - 10 sekundit); kui selle tulemusena ei muutu ruumala suurendamisel või kultuuri ülekandel füsioloogiline seisund, kasutatakse ka muid kontrolli-intervalle. Leiutise täiendavaks selgitamiseks on leiutise kirjeldamisel kasutatud mõisted defineeritud järgnevalt.
Akselerostaat - pidevkultivatsiooni meetod, kus kõik kultiveerimisparameetrid peale lahjenduskiiruse hoitakse konstantsena. Lahjenduskiiruse piisavalt aeglaselt muutmise korral väljendab iga akselerostaadi punkt stabiliseerunud kemostaadi punkti. Opereerib substraadi limitatsiooni ja kvaasi tasakaaluoleku tingimustes.
Biomass - rakkude moodustatud osa kultuurivedelikust.
Biomassi parameetrid - saagised, tarbimisvõimsused, poolestusaeg, generatsiooniaeg, eri kasvukiirus, rakukultuuri kontsentratsioon, rakukomponentide kontsentratsioonid (raku seina erinevad komponendid, peptidoglükaani erinevad komponendid, raku membraanide erinevad komponendid, DNA, RNA, valgud, mineraalsed ained, muud metaboliidid, metaboliitide prekursorid).
D-staat (dilution stat) - lahjenduskiirus hoitakse konstantsena varieerides mingit keskkonna parameetrit.
Ema-tütarreaktorite skeem (mother-daughter bioreactor system) - tehnoloogiline skeem, milles bioreaktorid on ühendatud biomassi ülekannet võimaldavate voolikutega ja milles on võimalik kultuurivedeliku ülekanne ühest reaktorist teise või mitmesse.
Fikseeritud füsioloogiline seisund - füsioloogiline seisund loetakse fikseerituks, kui antud seisund on taastatav samade kultiveerimistingimuste rakendamisel.
Inhibiitor - keemiline ühend või füüsikaline suurus, mille rakendamine mikroorganismide kultuurile tingib negatiivse mõju nende füsioloogiale.
Kasvuruum - N-mõõtmeline ruum, mida saab kirjeldada erinevate füsioloogiliste seisunditega (füsioloom), kus rakkude kasvuerikiirus on suurem kui null; telgedeks on keskkonna ja biomassi parameetrid.
Kemostaat - pidevkultivatsiooni meetod, kus kõik kultiveerimisparameetrid hoitakse konstantsena ja milles saavutatakse tasakaaluolek. Opereerib substraadi limitatsiooni tingimustes.
Keskkonnaparameetrid - mikroorganismide füsioloogiat mõjutavad keskkonna parameetrid.
Kultiveerimine muutuva ruumalaga - kultivatsioonimeetod, mille rakendamisel toimub mikroorganismide kasvatamine kvaasi tasakaalu olekus, kus ainsaks muudetavaks parameetriks on mikroorganismide kultuuri ruumala.
Kultiveerimismeetod - eeskiri, mille järgi kultiveeritakse mikroorganisme. Hõlmab perioodilisi, pool-perioodilisi ja pidevaid meetodeid.
Kultiveerimisparameetrid - parameetrid, mida kasutatakse kultiveerimise kontrolliks (biomassi tihedus, saagised, tootlikkused) või millede muutmine mõjutab kultivatsiooni (näiteks: temperatuur, pH, rõhk, toite pealevoolu kiirus, väljavoolu kiirus, titreerimise kiirus, aeratsiooni mahuvoog, segamise kiirus, erinevate substraatide kasutamine, erinevate inhibiitorainete kasutamine, erinevate reaktorisse sisestatavate ühendite kontsentratsioon, keskkonnaparameetri muutmise kiirus akselerostaatsetel kultivatsioonidel, erinevate parameetrite kontrollimise intervalli pikkus).
Kultuuriruumala - ruumala, mille moodustab antud kontsentratsioonil biomassi sisaldav suspensioon.
Kvaasi tasakaalulolek (quasi steady state) - kõik kultiveerimise parameetrid ei pruugi olla ajas konstantsed, samas on biomassi karakteristikud igal hetkel määratud keskkonnatingimustega.
Lahjenduskiirus - tähis D. Defineeritakse kui sissevoolu F [L/h] ja tööruumala V [L] jagatis. Sisult näitab lahjenduskiirus, kui mitmekordselt lahjendatakse bioreaktoris olevate ainete kontsentratsioone peale voolava toitega tunni jooksul. Avaldis 1/D annab aja, mille jooksul toimub bioreaktori sisu kahekordne lahjenemine.
Mikroorganismid - organismid, keda saab kasvatada bioreaktoris. Näiteks bakteri-, seene-, imetaja- jt rakud.
Mikroorganismide füsioloogiline seisund - biomassi karakteristikute staatiline ja dünaamiline väljendus. Määratud biomassi komponentide kontsentratsioonidega, kuid võtab arvesse ka võimalikku hüstereesi (biomassi sõltuvus tema ajaloost).
Mikroorganismide kultuur - mikroorganismide suspensioon.
Muutumatu füsioloogiline seisund - füsioloogline seisund loetakse muutumatuks, kui mistahes biomassi parameetri või nende parameetrite mistahes kombinatsiooni muutus ajavahemikus 1 sekund kuni 10 tundi (või pidevkultivatsiooni korral 10 tunni asemel 1 ruumaeg) on väiksem kui 10%.
Perioodiline kultiveerimine (batch cultivation) - fermentatsiooni jooksul ei lisata bioreaktorisse toidet (v.a hapnik ja titrant).
PI kontroll - proportsionaal-integraalne kontrolli osa proportsionaalne-integraalne-diferentsiaalne regulatsioonitehnoloogiast.
Pidev kultiveerimine (continuous cultivation) - fermentatsiooni jooksul lisatakse bioreaktorisse pidevalt toidet, pidevalt toimub ka väljavool.
Pool-perioodiline kultiveerimine (fed-batch cultivation) - fermentatsiooni jooksul lisatakse bioreaktorisse toidet vastavalt etteantud algoritmile, samas väljavool reeglina puudub.
Ruumaeg - tähis t. Määratud avaldisega 1/D, Väljendab aega, mille jooksul toimub reaktorisisu kahekordne lahjenemine.
Saagis - tähistab rakkude kasvu efektiivsust tarbitud substraadi ühiku kohta.
Z-auksoakselerostaat - pidevkultivatsiooni meetod, kus biomassi kontsentratsioon hoitakse konstantsena kontrollides mingit biomassi kontsentratsiooniga hästi korreleeruvat parameetrit Z (näiteks pH, mille vähenemine on seotud prootonite tootmisega biomassi kasvades), samal ajal muutes lineaarselt mingit kultiveerimis-parameetrit. Opereerib substraadi külluse ja kvaasi tasakaaluoleku tingimustes.
Z-auksostaat - pidevkultivatsiooni meetod, kus biomassi kontsentratsioon hoitakse konstantsena kontrollides mingit biomassi kontsentratsiooniga hästi korreleeruvat parameetrit Z (näiteks pH, mille vähenemine on seotud prootonite tootmisega biomassi kasvades) ja milles saavutatakse tasakaaluolek. Opereerib substraadi külluse tingimustes.
Tasakaaluolek - (steady state) - kemostaadis saavutatav mikroorganismide kultuuri seisund, kus kõikide parameetrite (kultiveerimisparameetrid, biomassiparameetrid) väärtused on ajas konstantsed. Läbivoolukultuur loetakse stabiliseerunuks, kui selle sisu on lahjenenud viis korda, selleks kulub viis ruumaega (5/D).
Turbidostaat - pidevkultivatsiooni meetod, kus biomassi kontsentratsioon hoitakse konstantsena kontrollides biomassi kontsentratsiooni ja milles saavutatakse tasakaaluolek. Opereerib substraadi külluse tingimustes.
Jooniste loetelu
Käesolevat leiutist selgitatakse täpsemalt viidetega juurdelisatud joonistele, kus
joonisel fig 1 on kujutatud käesolevale leiutisele vastav bioreaktorite süsteemi üldskeem;
joonisel fig 2 on joonisel fig 1 kujutatud bioreaktorite süsteemi reaktorist-reaktorisse ülekande osa;
joonisel fig 3 on joonisel fig 1 kujutatud bioreaktorite süsteemi komponentide detailne ülevaade;
joonisel fig 4 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava meetodi plokkskeem pidevkultivatsiooni korral;
joonisel fig 5 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava meetodi plokkskeem perioodilise kultivatsiooni korral;
joonisel fig 6 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava meetodi plokkskeem pool-perioodilise kultivatsiooni korral;
joonisel fig 7 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava meetodi plokkskeem juhul kui emareaktoris ja tütareaktorites kasutatakse erinevaid kultivatsiooni meetodeid;
joonisel fig 8 on joonisel fig 1 kujutatud bioreaktorite süsteemis teostatav kultivatsiooni protsess.
Teostusnäide
Joonisel fig 1 on välja toodud bioreaktorite süsteemi kontrolliloogika. Joonisel fig 2 on kujutatud käesolevale leiutisele vastav bioreaktori konfiguratsioon. Joonisel fig 3 bioreaktorite süsteem rõhuga ülekande aparatuuril. Bioreaktorite süsteem mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks hõlmab vähemalt ühte emareaktorit 1 ja vähemalt ühte tütarreaktorit 2, emareaktorina 1 ja tütarreaktorina 2 on eelisteostuses kasutatud sensorite 3, segaja 4, bioreaktoreid, mis on omavahel ühendatud ülekandekanalitega 5, vedeliku sissevooluga 6 ja väljavooluga 7, gaasi sissevooluga 8 ja gaasi väljavooluga 9, emareaktoriga 1 ja tütarreaktoritega 2 ühendatud kontrollereid 10, kontrollitarkvaraga, mis võimaldab ülekande momendil piisavalt kiirelt (0.01 - 100 s jooksul) reageerida ruumala muutusele kultiveerimise parameetrite reguleerimisega, varustatud arvutit 11. Emareaktor 1 ja tütarreaktorid 2 on biomassi kaalu monitoorimiseks ühendatud mahu kontrollimise seadmega 12 (näiteks kaalu, mahusensorit, ülevoolutorusid vm seadmed), mille näite salvestatakse arvutis 11 ja kasutatakse sisse- ning väljavoolu pumpade 13 ja 14 kulu arvutamisel selliselt, et kultiveerimisparameetrid jääksid muutuva ruumalaga kultiveerimisel, ülekande momendil ja selle järgselt konstantseks (lubatud on parameetrite hajumine mitte rohkem kuni 20 % võrra võrreldes samade parameetrite väärtustega emareaktoris kemostaadis). Emareaktorist 1 ja tütarreaktoritest 2 mõõdetud parameetrite näidud edastatakse kultiveerimise programmile. Kontrollparameetrid edastatakse kultiveerimise programmist kõikidele süsteemi bioreaktori kontrolleritele 10.
Hüdrodünaamilise reþiimi säilitamiseks ruumala suurendamise faasis kasutatakse emareaktoris 1 segajat 4, mille võllil 4.1 on iga turbiinsegisti 4.2 diameetri pikkusel lõigul lisatud vähemalt üks turbiinsegisti 4.2. Ruumala suurendamise faasis kasutatakse vajadusel emareaktoris 1 lisahapniku sisestamist lahustunud hapniku kontsentratsiooni hoidmiseks PID algoritmi järgi.
Emareaktoris 1 muutuva ruumalaga kultiveerimise järgselt toimub mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse 2. Tütarreaktorite 2 täitmiseks füsioloogilise lahusega läbi kanali 16 kasutatakse näiteks peristaltilist pumpa, ülerõhku, kolbpumpa, tsentrifugaalpumpa või membraanpumpa. Vahetult enne ülekannet füsioloogilise lahusega täidetud ja emareaktoriga samadel keskkonnatingimustele viidud (parameetrite hajumine mitte rohkem kui 20%) bioreaktorite kiireks tühjendamiseks (0.01 - 10 minutit) läbi väljavoolukanali 7 kasutatakse näiteks peristaltilist või muud pumpa, ülerõhku või alarõhku. Tütarreaktori 2 temperatuuri reguleerimiseks emareaktori 1 tingimustele on tütarreaktorile 2 lisatud temperatuuri kontrollsüsteem 15 (näiteks kuumutusmantel või vesisärk). Katse järgselt steriliseeritakse tütarreaktorid 2 in situ läbi kanali 16 keemilise ainega või temperatuuri abil, näiteks auruga, läbi kanali 16 toimub ka reaktorite 2 puhastamine steriilse veega.
Erinevaid bioreaktoreid ühendavatele ülekandekanalitele 5 on lisatud automaatselt või manuaalselt opereeritavad avamise ja sulgemise ventiilid 17, kusjuures tütarreaktor-emareaktor kanali 5.1 (kus .1 väljendab tütarreaktori numbrit), millesse teostatakse ülekanne esimesena, ventiilid 17.1 ja 17.2 on avatavad samaaegselt, erinevatel aegadel või ette antud intervalliga ülerõhu rakendamisega emareaktoris 1. Ventiili 18 avamisel rakendatakse emareaktorisse 1 lisa gaasivool. Ventiiliga 19 suletakse automaatselt gaasi väljavool emareaktorist 1 samal hetkel või viiteajaga (0.01 - 1000 sekundit), kui avatakse ülekandekanalil 5 asuvad ventiilid 17.1 ja 17.2, nii et emareaktorile 1 rakendatakse ülerõhk 0.01 - 100 atm.
Ülekandekanalile 5.i, mis ühendab reaktorit numbriga i emareaktoriga, on lisatud ventiil 17.i, mis avatakse automaatselt, kui ülekanne reaktorisse numbriga i-1 on teostatud. Sellega alustatakse kultuurvedeliku ülekannet reaktorisse i.
Biomassi kultuuri ülekande järgselt toimib ülekandekanal 5 emareaktorist 1 tütarreaktorisse 2 gaasi väljavoolukanalina, misläbi saavutatakse ülekandekanali puhastamine sinna jäänud biomassist steriilse gaasiga. Antud protsessi tulemusel puhutakse ülekandekanal 5, milles toimus kultuuri ülekanne viimasena, tühjaks. Järelejäänud ülekandekanalite 5 puhastamiseks kasutatakse katsejärgselt puhastamist steriilse gaasiga (steriliseerimiseks kasutatakse näiteks filtrit 23), mis sisestatakse ülekandekanalitesse 5 läbi ventiili 20 (puhastatakse ülekandekanalid, milledesse toimus ülekanne enne kui viimasesse). Bioreaktoritele on lisatud sensorid ja aktuaatorid hoidmaks pH (titrant 22), pO2, gaasi vool samana kui emareaktoris, kusjuures nende parameetrite väärtuste kõikumine erinevates reaktorites mitte rohkem kui 20 % on lubatud.
Materjalivoogude monitoorimiseks kaalutakse mahu kontrollimise seadmetel 12.1 ja 12.2 bioreaktorite ja toiteanumate sisendid ja väljundid. Sõltuvalt kasutatavast kultiveerimismeetodist on bioreaktorite süsteemile lisatud lisaseadmed 21, näiteks pumbad, gaasi- ja vedelikuvoogude monitoorimiseks massivoolu kontrollerid, erinevad analüsaatorid (gaasianalüüs, optilise tiheduse analüüs, elektromagnetkiirguse spektraalanalüüs näiteks etanooli või mingi teise ühendi määramiseks, kromatograafia erinevad lahendused, massispektomeeter, biomassi automaatne kollektor, kultuurvedeliku automaatne kollektor), kusjuures erinevates teostustes kasutatakse erinevat arvu lisaseadmeid.
Bioreaktoritena kasutatakse käesolevale leiutisele vastavas bioreaktorite süsteemis näiteks seguriga bioreaktorit (Stirred Tank Reactor - STR), nii laboratoorne kui ka tööstuslik), torureaktorit (plug flow reactor), reaktorit, milles suspensiooni segamine teostatakse aeratsiooni tekitatud tiheduse gradientidega (airlift reactor), kultivatsiooni koti (cultivation bag) tüüpi reaktoreid, minireaktoreid, mikroreaktoreid, mikrokiibile ehitatud reaktoreid (lab on a chip). Sõltuvalt kasutatava bioreaktori konstruktsioonist võib alternatiivses lahenduses osa või kõik eespool mainitud riistvarast puududa, va bioreaktorid ja ülekande kanal.
Eelislahenduses on emareaktor 1 konfigureeritud selliselt, et võimaldab üheselt fikseerida ja monitoorida kultiveerimise ja keskkonnaparameetrid. Tütarreaktorites 2 on kultiveerimise ja keskkonnaparameetrid küll kasutaja poolt kultiveermisparameetritega fikseeritud, kuid ei pruugi olla monitooritavad samas mahus, mis emareaktoris. Näiteks, kui emareaktoris kasutatakse tuumamagnet resonants detektorit füsioloogilise seisundi hindamisel, siis tütarreaktoris eeldades, et kultiveerimisparameetrid on samad mis emareaktoris, on ka füsioloogiline seisund sama, ei ole tuumamagnet resonants detektori kasutamine vajalik.
Emareaktorina 1 kasutatakse bioreaktorit, millest teostatakse kultuuri ülekanne teistesse reaktoritesse ehk tütarreaktoritesse 2. Tütarreaktorina 2 kasutatakse bioreaktorit, millesse teostatakse kultuuri ülekanne. Eelisteostuses on süsteem konstrueeritud selliselt, et vajadusel on bioreaktorite rollid muudetavad (iteratsioonis nr 1 emareaktori rollis olnud bioreaktorit saab iteratsioonis nr 2 kasutada tütarreaktorina ja vastupidi).
Käesolevale leiutisele vastavas bioreaktorite süsteemi eelisteostuses on bioreaktoritena kasutatud kolme STR tüüpi reaktorit, mis on omavahel ühendatud ülekandekanalitega 5. Eelisteostuses fikseeritakse bioreaktorite, emareaktori 1 ja tütarreaktorite 2, temperatuur vesisärgiga, millega fikseeritakse bioreaktori temperatuuri minimaalse temperatuuri hajumisega (0.01 - 5 °C) ka juhul, kui bioreaktoris ei ole pikemat aega (üle 10 minuti) vedelikku. Alternatiivses teostuses kasutatakse veesärgi asemel küttemantlit.
Katse teostatakse tütarreaktorites 2, kultuuri ruumala suurendamine emareaktoris 1. Ülekande protsessile eelnevalt, samal ajal emareaktoris 1 muutuva ruumalaga kultiveerimisega, teostatakse tütarreaktorites 2 (kus enne kultuuriülekannet sisaldub füsioloogiline lahus) keskkonnatingimuste viimine katse algtingimuste juurde (emareaktoriga 1 identsed keskkonnatingimused).
Mikroorganismide kultuuri mahu emareaktoris 1 soovitud väärtuse saavutamisel tühjendatakse 0.01 - 10 minuti jooksul tütarreaktorid ja teostatakse nendesse mikroorganismide kultuuri ülekanne. Tütarreaktorite tühjendamiseks kasutatakse näiteks peristaltilisi pumpasid. Bioreaktorite tühjendamise tulemusena ei muudeta tühjendamisele eelnevatega ja emareaktoris rakendatutega võrreldes keskkonnaparameetreid, kusjuures parameetrite hajumine ei ole rohkem kui 20%.
Enne ülekannet lülitatakse tütarreaktorites 2 tööle kontrollialgoritmid (pumpade ja kultuurvedeliku mahu kontroll), et sissevoolu korral vastavalt kontrolliintervallile rakendada korrektne pumba töökiirus. Ülekande momendil kasutatakse kontrolli-algoritmide juures minimaalset kontrolliintervalli vahemikus 0.01 kuni 100 sekundit.
Mikroorganismide kultuuri ülekanne teostatakse eelistatud lahenduses ülerõhuga, mis rakendatakse emareaktorile 1 ja saavutatakse emareaktori 1 gaasi väljavoolu ajutisel sulgemisel ning ühe ülekandekanali 5 tütarreaktorisse 2 samaaegsel või hilinemisega avamisel. Kui tütarreaktoris 2 on kultuuriruumala saavutanud etteantud väärtuse, suletakse ülekandekanal 5 antud reaktorisse ja avatakse järgmine. Ülekande teostamise kordade arvu määrab süsteemis olevate tütarreaktorite arv. Süsteem on ehitatud selliselt, et viimase ülekande toimumisega tühjeneb ka antud bioreaktorisse suunduv voolikuharu. Järelejäänud voolikuharudesse jääb biomassi kultuur sisse, see eemaldatakse sealt tütarreaktoritesse gaasiga läbipuhumise teel peale katse lõppu.
Süsteem on konstrueeritud selliselt, et kõik bioreaktorid on autonoomselt puhastatavad ja steriliseeritavad vastavate lahustega (näiteks steriilne deioniseeritud vesi ja etanool). Steriliseerimise järgselt loputatakse bioreaktoreid steriilse deioniseeritud veega, et eemaldada desinfektsioonivedeliku jäägid. Ülekandekanal 5 on reaktorisse paigutatud selliselt, et ülekande järgselt jääb emareaktorisse kultuurvedelikku vastavalt soovitud kogusele, kuid mitte vähem, kui on vajalik bioprotsessi häiringuteta toimimiseks. Mida väiksem on tööruumala, seda vähem kulub pidevkultivatsioonil toidet. Samas, kui ruumala on liiga väike, võivad sensorid vedelikust välja jääda, mis tekitab kultivatsiooni kontrollil probleeme. Biomassi kultuurivedelik peab katma sensorite mõõtva osa.
Joonisel fig 1 kujutatud bioreaktorite süsteemi eelisteostuses on ülekandekanalite 5 avamine/sulgemine realiseeritud avamise ja sulgemise ventiilidega 17, millega teostatakse avamine/sulgemine automaatselt. Samaaegselt ülekandeks vajaliku ülerõhu tekitamisega avatakse esimene ülekandekanal 5 tütarreaktorisse 2, olles saavutanud piisava ruumala esimeses tütarreaktoris, avatakse järgmine ülekandekanal 5 teise tütarreaktorisse 2. Protsessi korratakse kuni viimane tütarreaktor on täidetud, misjärel lõpetatakse ülerõhu tekitamine emareaktoris 1 (suletakse ventiil 18 ja avatakse ventiil 19). Kultuuri ülekandel kasutatakse vedelikuvoo kiirust, millega välditakse toitainete äratarbimist mikroorganismide poolt ülekande käigus. Eelistatud teostusnäites on kasutatud tütarreaktorit 2 töömahuga 300 mL mille ülekanne teostatakse ligikaudu 10 sekundi jooksul.
Joonisel fig 4 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, plokkskeem pidevkultivatsiooni korral; mis hõlmab järgmise etappe:
- mikroorganismide stabilisatsioon kemostaadis hõlmab inokulatsiooni reaktorisse, ettekasvatamist perioodilises kultivatsioonis, läbivoolu rakendamist ja kultivatsiooniparameetrite konstantsuse saavutamist viie ruumaja vältel;
- emareaktoris 1 suurendatakse ruumala D-staatsel kultivatsioonil, kõik muud keskkonnaparameetrid hoitakse konstantsed ja võrdsed kemostaadi omadega, muudetakse vaid ruumala;
- samaaegselt teostatakse tütarreaktorite 2 ettevalmistamine mikroorganismide kultuuri ülekandeks ja viiakse läbi kultuuri ülekanne. Kultuuri ülekanne teostatakse tühjadesse, ettevalmistatud tütarreaktoritesse, kus on eelnevalt rakendatud kõik vajalikud kontrollialgoritmid ja mille keskkonnaparameetrid omavad samu väärtusi, mis emareaktoris, kusjuures lubatud on hajumine mitte rohkem kui 20%;
- teostatakse katse tütarreaktorites 2, samaaegselt suurendatakse tööruumala D-staatses kultivatsioonis emareaktoris 1. Ruumala suurendamine teostatakse eelistatult selliselt, et tagatakse minimaalne kultivatsiooniks vajalik toitekogus;
- tütarreaktorid 2 pestakse ja steriliseeritakse;
- emarektoris 1 soovitud mahu saavutamisel ja tütarreaktorite 2 emareaktoriga 1 identsetele tingimustele viimise järgselt teostatakse ülekanne;
- teostatakse katse tütarreaktorites 2, samaaegselt suurendatakse tööruumala D-staatses kultivatsioonis emareaktoris 1;
- emareaktoris 1 soovitud mahu saavutamisel teostatakse tütarreaktorite 2 ettevalmistamine katseks, teostatakse uus ülekanne ja katse tütarreaktorites 2, etappe korratakse kuni soovitud katsed on sooritatud.
Joonisel fig 5 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, plokkskeemi perioodilise kultivatsiooni korral, mis hõlmab järgmise etappe:
- emareaktor 1 täidetakse piisava koguse toitega (toite kogus peab võimaldama bioreaktorite süsteemis olevate tütarreaktorite summaarse töömahu) ja teostatakse inokuleerimine;
- tütarreaktorid 2 valmistatakse ette emareaktori 1 tingimustele;
- ettenähtud biomassi tiheduse või katse faasi (laag, eksponentsiaalne kasv, statsionaarne faas) saavutamisel tühjendatakse tütarreaktorid füsioloogilisest lahusest ja teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse 2;
- teostatakse katse tütarreaktorites 2, samaaegselt lisatakse emareaktorisse 1 toiteportsjoni ja teostatakse kultuuri ettekasvatamine selles, kusjuures algne biomassi kontsentratsioon emareaktoris on valitud selliselt, et biomass saavutab järgmiseks ülekandeks vajaliku kriteeriumi (eelistatult) vahetult peale tütarreaktorites katse lõppu ja ettevalmistamist ülekandeks;
- katse järgselt tütarreaktorid 2 pestakse, steriliseeritakse, valmistatakse ette ülekandeks, ettenähtud biomassi tiheduse või katse faasi (laag, eksponentsiaalne kasv, statsionaarne kasv) saavutamisel teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne;
- etappe korratakse kuni soovitud katsed on sooritatud.
Joonisel fig 6 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, plokkskeem pool-perioodilise kultivatsiooni korral, mis hõlmab järgmise etappe:
- emareaktorisse 1 sisestatakse algne toitekogus ja teostatakse inokuleerimine;
- teostatakse pool-perioodiline kultiveerimine emareaktoris 1;
- tütarreaktorid 2 valmistatakse ette emareaktori 1 tingimustele;
- soovitud momendil (sobiv biomassi tihedus) teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse 2;
- teostatakse katse tütarreaktorites, samaaegselt viiakse läbi pool-perioodiline kultiveerimine emareaktoris 1;
- tütarreaktorid pestakse, steriliseeritaks, valmistatakse ette ülekandeks, soovitud momendil (sobiv biomassi tihedus) teostatakse ülekanne;
- etappe korratakse kuni soovitud katsed on sooritatud.
Joonisel fig 7 on kujutatud käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks plokkskeem, kus emareaktoris kasutatakse pidevkultivatsioonimeetodit, tütarreaktorites pool-perioodilist või perioodilist kultivatsioonimeetodit, mis hõlmab järgmisi etappe:
- mikroorganismide stabilisatsioon kemostaadis hõlmab inokulatsiooni reaktorisse, ettekasvatamist perioodilises kultivatsioonis, läbivoolu rakendamist ja kultivatsiooniparameetrite konstantsuse saavutamist viie ruumaja vältel;
- emareaktoris 1 suurendatakse ruumala D-staatsel kultivatsioonil, kõik muud keskkonnaparameetrid hoitakse konstantsed ja võrdsed kemostaadi omadega, muudetakse vaid ruumala;
- samaaegselt teostatakse tütarreaktorite 2 ettevalmistamine mikroorganismide kultuuri ülekandeks ja viiakse läbi kultuuri ülekanne. Kultuuri ülekanne teostatakse tühjadesse, ettevalmistatud tütarreaktoritesse, kus on eelnevalt rakendatud kõik vajalikud kontrollialgoritmid ja mille keskkonnaparameetrid omavad samu väärtusi, mis emareaktoris, kusjuures lubatud on hajumine mitte rohkem kui 20%;
- teostatakse pool-perioodiline katse tütarreaktorites 2, samaaegselt suurendatakse tööruumala D-staatses kultivatsioonis emareaktoris 1. Ruumala suurendamine teostatakse eelistatult selliselt, et tagatakse minimaalne kultivatsiooniks vajalik toitekogus;
- tütarreaktorid 2 pestakse ja steriliseeritakse;
- emarektoris 1 soovitud mahu saavutamisel ja tütarreaktorite 2 emareaktoriga 1 identsetele tingimustele viimise järgselt teostatakse ülekanne;
- teostatakse pool-perioodiline katse tütarreaktorites 2, samaaegselt suurendatakse tööruumala D-staatses kultivatsioonis emareaktoris 1;
- emareaktoris 1 soovitud mahu saavutamisel teostatakse tütarreaktorite 2 ettevalmistamine katseks, teostatakse uus ülekanne ja pool-perioodiline katse tütarreaktorites 2, etappe korratakse kuni soovitud katsed on sooritatud.
Käesolevas leiutises on katseks kultivatsiooni eksperiment (näiteks pidevkultivatsioon, pool-perioodiline kultivatsioon, perioodiline kultivatsioon) või tootmisprotsess kasutades suvalist kultivatsioonimeetodit (näiteks rekombinantse valgu tootmine). Vahetult peale ülekannet katsele eelnevalt (0.1 sekundit kuni 1 tund) ja vajadusel ka selle järgselt (1 tund kuni 100 tundi) tagatakse tütarreaktorites 2 sama füsioloogiline seisund, mis emareaktoris 1 ülekande momendile eelnevalt.
Joonisel fig 7 on täiendavalt selgitatud joonisel fig 4 kujutatud plokkskeemi, kus käesolevale leiutisele vastava bioreaktorite süsteemis on emareaktoris 1 ja tütarreaktorites 2 teostatud kultivatsiooni protsess. Kultivatsiooni A faasis teostatakse mikroorganismide üleskasvatamine perioodilises kultivatsioonis ja stabiliseeritakse kemostaat reþiimis. B faasis kultiveeritakse mikroorganisme varieeruva ruumalaga. Antud faasi lõpus teostatakse ülekanne tütarreaktoritesse. Faasis C viiakse läbi katse tütarreaktorites, kusjuures emareaktoris teostatakse samaaegselt muutuva ruumalaga kultiveerimine. Emareaktoris toimub eelistatud lahenduses ruumala suurendamine selliselt, et ära kasutatakse minimaalne vajalik toitekogus (varieeritava ruumalaga kultiveerimist alustatakse hetkel, mil tütarreaktorites on jäänud katse lõpuni aeg, mis kulub ruumala suurendamiseks). Faasis D puhastatakse ja steriliseeritakse tütarreaktorid. Samas faasis, peale steriliseerimist ja tütarreaktorite viimist emareaktoriga identsete keskkonnaparameetrite juurde, teostatakse ka mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse. E faasis korratakse C faasi, F faasis korratakse D faasi. E ja F faasid on korratavad seni kuni soovitud katsed on valmis.
Emareaktoris 1 ruumala suurendamise faasis tagatakse homogeenne keskkond kogu protsessi vältel, mis saavutatakse segajaga 4, kusjuures eelistatult on segaja 4 võllile lisatud üks või mitu Rushtoni turbiini.
Käesolevale leiutisele vastava lahenduse, meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, mikroorganismid kultiveeritakse emareaktoris 1 suureneva ruumalaga ruumala väärtuseni, millega tagatakse mikroorganismide kultuuri ülekande järgselt süsteemi kõikide bioreaktorite summaarne tööruumala.
Keskkonnatingimused viiakse mikroorganismide ülekandele eelnevalt tütarreaktorites 2 emareaktori 1 tingimustele. Mikroorganismid kantakse üle emareaktorist 1 tütarreaktoritesse 2 ja puhastatakse ülekandekanalid 5 sinna ülekande järgselt jäänud mikroorganismidest.
Kloonimise alustamiseks lahenduse eelisteostuses stabiliseeritakse biomass emareaktoris 1 kasutades pidevkultivatsioonimeetodit (näiteks kemostaat, turbidostaat, akselerostaat, auksostaat, auksoakselerostaat), peale stabilisatsiooni teostatakse stabiliseerunud kultuuri ruumala suurendamine emareaktoris 1 ja ülekanne tütarreaktoritesse 2.
Teostatakse katse või tootmisprotsess tütarreaktorites 2, misjärel viimased steriliseeritakse in situ. Katse kujutab enesest ülekande järgset fermentatsiooni tütarreaktorites, mis lähtub emareaktori keskkonna ja kultiveerimise parameetritest, millele järgneb koheselt või viiteajaga huvipakkuva keskkonna või kultiveerimise parameetri muutmine ja selle muutuse mõju monitoorimine.
Samaaegselt katse või tootmisprotsessiga tütarreaktorites 2 suurendatakse ruumala emareaktoris 1 väärtuseni, millega tagatakse mikroorganismide kultuuri ülekande järgselt süsteemi kõikide bioreaktorite summaarne tööruumala. Katse või tootmisprotsessi järgselt tütarreaktorid pestakse ja steriliseeritakse in situ. Katse või tootmisprotsessi järgselt saab bioreaktorite esialgsed rollid vajadusel vahetada ning ruumala suurendamine toimub eelmise iteratsiooni tütarreaktoris.
Kultiveerimise meetod vahetult ülekande järgselt tütarreaktorites võib olla pidev, pool-perioodiline või perioodiline kultivatsioon. Pidevkultivatsiooni korral jätkub tütarreaktoris ülekande järgselt emareaktoris kasutatud kultivatsioon, vahetult peale ülekannet või kasutaja määratud hetkel alustatakse huvipakkuva keskkonnaparameetri mõju monitoorimist. Otstarbekas on juba tütarreaktorites 2 keskkonnaparameetri monitoorimise ajal alustada emareaktoris 1 uus biomassi koguse suurendamine, et tütarreaktorites 2 katse lõppedes oleks tagatud uueks ülekandeks vajalik biomassi kogus. Uurides tütarreaktorites 2 keskkonna parameetri mõju pool-perioodilises kultivatsioonis, tagatakse tütarreaktorites algselt mikroorganismide füsioloogiline seisund, mis neil oli emareaktoris vahetult enne ülekannet, kuid ülekande järgselt võivad reaktorites olla erinevad kultiveerimisparameetrid (erikasvukiirus hoitakse konstantsena, kuid lahjenduskiirus mitte). Peale soovitud keskkonnaparameetri mõju määramist, teostatakse reaktorite 2 steriliseerimine ning puhastamine in situ, järgneb uus ülekanne emareaktorist 1 ning katseseeria tütarreaktorites 2. Protsessi sterilisatsiooni-ülekanne-katse korratakse seni kuni soovitud katsed on teostatud, kusjuures katse all on antud juhul mõistetud lisaks keskkonnaparameetri mõju monitoorimisele ka tootmisprotsessi.
Pidevkultivatsioonide teostamiseks valmistatakse mikroorganismid katseks ette ja viiakse läbi stabilisatsioon ehk biomassi viimine tasakaaluolekusse (steady state). Stabilisatsiooniks hoitakse kultiveerimistingimused bioreaktoris stabiilsed viie ruumaja vältel (so aeg mis kulub viie bioreaktori mahu voolutamiseks läbi bioreaktori). Tuntud lahenduste korral uurides näiteks kolmes bioreaktoris kolme inhibiitori kümne erineva kontsentratsiooni mõju fikseeritud lahjenduskiirusel (0.2 h-1) on ajakulu 430 tundi. Erinevalt senituntud lahendustest samade tingimuste korral teostatakse sama käesolevale leiutisele vastava lahendusega korral kiiremini kui 400 tunniga, tabelites 1 ja 2 toodud teostusnäidetes näiteks 139 tunniga. Tabelis 1. on toodud kolme inhibiitori kümne erineva kontsentratsiooni mõju uurimine lahjenduskiirusel kolmes bioreaktoris traditsioonilisel kemostaat kultivatsioonil lahjenduskiiruse 0.2h-1 juures.
Tabel 1. Kolme inhibiitori kümne erineva kontsentratsiooni mõju uurimine kemostaatsel kultivatsioonil.
Tabel 2. Kolme inhibiitori kümne erineva kontsentratsiooni mõju uurimine kolmes bioreaktoris käesolevale leiutisele vastavat bioreaktorite süsteemi ja meetodit mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks kasutades lahjenduskiiruse 0.2h-1 juures. Ruumala suurendamine järgmiste ülekannete tarvis algab toimuva katse jooksul, mis antud tingimuste juures võtab aega 1 h rohkem kui kestab katse. Selle aja jooksul valmistatakse ette tütarreaktorid (puhastatakse, steriliseeritakse).
Meetodi eelisteostuses kasutatakse nii emareaktoris 1 kui ka tütarreaktorites 2 pidevkultivatsiooni ja alternatiivsetes teostustes perioodilist või pool-perioodilist kultivatsiooni. Eelistatud teostuses fikseeritakse uuritavad rakud emareaktoris 1 tasakaaluolekus, kvaasi tasakaalu olekus või mitte-tasakaaluolekus, kusjuures mikroorganismid on kultiveerimismeetodiga reprodutseeritavas seisundis ja see seisund on reprodutseeritav ülekande järgselt tütarreaktorites 2.
Eelistatud teostuses viiakse emareaktoris 1 läbi kultuuri stabiliseerimine pidevkultivatsioonil minimaalse võimaliku töömahu juures. Seejärel teostatakse mikroorganismide kultuuri ruumala suurendamine kvaasi tasakaalu tingimustes, st kõik kultiveerimise ja keskkonna parameetrid hoitakse konstantsena va kultuuri ruumala. Saavutatakse D-staatne fermentatsioon muutuva ruumalaga. Kultuuriruumala emareaktoris suurendatakse seni, kuni saavutatakse tütarreaktorite summaarne töömaht. Eelistatud teostuses säilitatakse ruumala suurendamise jooksul mikroorganismide füsioloogiline seisund.
Alternatiivses teostuses muudetakse ruumala suurendamise käigus mikroorganismide füsioloogilist seisundit etteantud juhtimise algoritmide järgi, kusjuures mikroorganismide füsioloogilise seisundi muutmine on reprodutseeritav. Etteantud ruumala saavutamisel teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse. Ülekande liikumapanevaks jõuks kasutatakse eelistatult ülerõhku, kuid ülekanne võib olla lahendatud ka näiteks alarõhu, pumpade või muu vahendi kasutamisega.
Ülekande tulemusena säilitatakse mikroorganismide füsioloogiline seisund ehk tütarreaktorites 2 säilitatakse sama füsioloogiline seisund, mis emareaktoris 1 kultuuri ülekande momendil, kusjuures seisundit väljendavate parameetrite hajumine on mitte rohkem kui 20%.
Aeroobsete organismide korral on lahustunud hapniku kontsentratsioon kriitiline parameeter. Seoses vedelikunivoo liikumisel segajate suhtes ruumala suurenemise käigus tekkiva hüdrodünaamilise reþiimi mõningase muutumise ja sellest omakorda tuleneva näiteks lahustunud hapniku kontsentratsiooni heterogeensuse vältimiseks kasutatakse PI kontrolli - õhu vool reaktorisse hoitakse konstantsena, vajadusel lisatakse PI algoritmi järgi puhast hapnikku.
Käesolevale leiutisele vastav lahendus, bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, on maksimaalselt efektiivne, kui ruumala suurendamiste ja ülekannete arv on maksimaalne (stabilisatsioon on ühekordne, seega katsete arvu suurenedes väheneb stabilisatsiooni suhteline kestvus kogu katseaja suhtes). Sellisel juhul lühendatakse stabilisatsioonifaasi ja reaktorite ettevalmistamise faasi võrreldes katseajaga.

Claims (24)

1. Bioreaktorite süsteem mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, mis hõlmab sensoritega (3) ja segajaga (4) varustatud bioreaktoreid, mis on omavahel ühendatud ülekandekanalitega (5), vedeliku sissevooluga (6) ja väljavooluga (7), sissevooluga (8) ja väljavooluga (9), mahu kontrollimise seadmega (12), pumpadega (13 ja 14), emareaktoriga (1) ja tütarreaktoritega (2) ühendatud kontrolleritega (10), kontrollitarkvaraga varustatud arvutiga (11), temperatuuri kontrollsüsteemiga (15), ülerõhu avamise ventiiliga (20), lisaseadmetega (21), titrandiga (22), õhu filtriga (23), mis erineb selle poolest, et bioreaktoriteks on omavahel ühendatud vahetatavate rollidega vähemalt üks emareaktor (1) ja vähemalt üks tütarreaktor (2), emareaktorile (1) on lisatud ülekandekanal (5), millega emareaktor (1) on ühendatud tütarreaktoriga (2), lisa-gaseerimise ventiil (18) ja väljavooluventiil (19), segaja (4) võllile (4.1) on iga turbiinsegisti (4.2) diameetri pikkusel lõigul lisatud vähemalt üks turbiinsegisti (4.2), tütarreaktorile (2) on steriliseerimiseks lisatud kanal (16), ülekandekanalitele (5) on lisatud automaatsed või manuaalsed avamise ja sulgemise ventiilid (17).
2. Bioreaktorite süsteem vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et ülekandekanali (5), ventiilid (17) on ülerõhu rakendamiseks emareaktoris (1) avatud samaaegselt, erinevatel aegadel või ette antud intervalliga ja et ülekandekanal (5) on asetatud emareaktorisse (1) selliselt, et ülekande järgselt on jäetud emareaktorisse (1) kultuurvedelikku mitte vähem, kui on vajalik bioprotsessi häiringuteta toimimiseks.
3. Bioreaktorite süsteem vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et reaktoritesse numbriga (i-1) on lisatud ventiil (17), mis on avatud automaatselt, kui ülekanne reaktorisse numbriga (i) on teostatud.
4. Meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks, mis hõlmab etappe, kus emareaktor (1) täidetakse toitega, teostatakse mikroorganismide inokuleerimine toitesse, teostatakse mikroorganismide kultuuri stabiliseerimine, kui mikroorganismide kultuuri stabiliseerimine pidevkultivatsioonil ei ole soovitud, alustatakse kohe sobiva kultivatsioonimeetodi rakendamisega, teostatakse biomassi kultuuri ruumala suurendamine, teostatakse bioreaktorite vaheline biomassi ülekanne ja teostatakse katse, mis erineb selle poolest, et kasutatakse vahetatavate rollidega vähemalt ühte emareaktorit (1) ja vähemalt ühte tütarreaktorit (2) ja meetod hõlmab järgmisi etappe: - emareaktoris (1) teostatakse muutuva ruumalaga kultivatsioon, hoitakse biomassi parameetrite hajumise mitte rohkem kui 20%; - tütarreaktorid (2) valmistatakse ette emareaktori (1) tingimustele; - teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse (2) hoitakse biomassi parameetrite hajumise mitte rohkem kui 20% ja tööruumala ülekanne teostatakse 0.01 - 3600 sekundi jooksul; - puhastatakse ülekandekanal (5) millesse toimus ülekanne viimasena; - teostatakse katse tütarreaktorites (2); - puhastatakse puhastamata ülekandekanalid (5); - tütarreaktorid (2) pestakse, steriliseeritakse ja valmistatakse ette uueks ülekandeks; - suurendatakse ruumala emareaktoris (1), ruumala suurendamist alustatakse tütarreaktorites (2) katse toimumise ajal, kusjuures tagatakse minimaalne toitekulu; - teostatakse mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse muutmata seejuures nende füsioloogilist seisundit (2); - etappe korratakse kuni soovitud katsed on sooritatud; - emareaktorist (1) ja tütarreaktoritest (2) mõõdetud parameetrite näidud edastatakse vastavalt reageerivale kultiveerimise programmile, kusjuures kontrollparameetrid edastatakse kultiveerimise programmist kontrolleritele (10) ja mahu kontrollimise seadmete (12) näidud salvestatakse arvutis (11) ning kasutatakse sisse- ning väljavoolu pumpade (13) ja (14) kulu arvutamiseks.
5. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ülekande momendil rakendatakse kultivatsiooni kontrollil kontrolliintervalli eelistatult vahemikus 0.01 -3600 sekundit.
6. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ülekanne emareaktorist (1) tütarreaktorisse i (2) lõpetatakse tütarreaktor i (2) tööruumala saavutamisel, kusjuures tööruumala saavutamisel suletakse ülekandekanal (5) emareaktori (1) ja iga tütarreaktori i (2) vahel ventiili (17.2) sulgemisel ja avatakse ülekandekanal i+1 (5) reaktorisse ventiil (17.2) avamisel.
7. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ülekande järgselt kasutatakse ülekandekanalit (5) viimasesse tütarreaktorisse (2) gaasiväljavoolu kanalina (9), misläbi puhastatakse emareaktorist (1) lähtuva steriilse gaasiga ülekandekanal (5) tütarreaktorisse (2).
8. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ruumala suurendamine emareaktoris (1) teostatakse pidevkultivatsioonil või pool-perioodilisel kultivatsioonil.
9. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et katses teostatakse pidevkultivatsioon, perioodiline kultivatsioon, pool-perioodiline kultivatsioon või tootmisprotsess.
10. Meetod vastavalt punktile 9, mis erineb selle poolest, et tootmisprotsessis toodetakse biomassi või metaboliiti või muud bioloogilist ühendit (RNA, valk, polüsahhariid).
11. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ruumala emareaktoris (1) suurendatakse väärtuseni, millega tagatakse mikroorganismide kultuuri ülekande järgselt süsteemi kõikide bioreaktorite summaarne tööruumala.
12. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et kultiveerides muutuva ruumalaga hoitakse biomassi parameetrite hajumine, mikroorganismide, keskkonna ja kultiveerimise parameetrite muutus esialgsete parameetrite väärtustega võrreldes mitte rohkem kui 20%.
13. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et mikroorganismide kultuuri ülekanne tütarreaktoritesse (2) teostatakse perioodiliselt, järjestikku või paralleelselt, kusjuures paralleelse teostuse korral avatakse korraga kõik ülekande kanalid (5) ja ülekanne teostatakse korraga kõikidesse tütarreaktoritesse.
14. Meetod vastavalt punktile 4 ja 13, mis erineb selle poolest, et mikroorganismide kultuuri ülekanne teostatakse kiirusega, millega tagatakse ülekande järgselt emareaktoris (1) biomassi füsioloogilise seisundi muutus mitte rohkem kui 20% võrreldes mikroorganismide füsioloogilise seisundiga emareaktoris (1) kultuuriülekandele eelnevalt ja tagatakse mikroorganismide füsioloogilise seisundi muutus tütarreaktorites (2) mitte rohkem kui 20 % võrreldes samade parameetrite väärtustega ülekandele eelnevalt emareaktoris (1).
15. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ruumala suurendamise faasis muudetakse lisaks kultuuriruumalale reprodutseeritavalt keskkonna või kultivatsiooni parameetreid, kusjuures kultiveerimise parameetreid reguleeritakse ülekande momendil toimuva ruumala muutusel eelistatult ajavahemiku 0.01 - 1000 sekundi jooksul.
16. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ülekande liikumapanevaks jõuks kasutatakse ülerõhku või alarõhku.
17. Meetod vastavalt punktile 16, mis erineb selle poolest, et ülerõhu saavutamiseks suletakse gaasi väljavooluventiil (19) ja avatakse lisa-gaseerimise ventiil (18) ning ülerõhu lõpetamiseks emareaktoris (1) suletakse ventiil (18) ja avatakse ventiil (19).
18. Meetod vastavalt punktile 4 ja 16, mis erineb selle poolest, et ülekande tütarreaktorisse i-1 (2) teostamisel suletakse ventiiliga (19) gaasi väljavool emareaktorist (1) samal hetkel, kui avatakse ülekandekanalil (5.i) asuvad ventiilid (17.i) selliselt, et emareaktorile (1) rakendatakse ülerõhk 0.01 - 100 atm.
19. Meetod vastavalt punktile 4 ja 16, mis erineb selle poolest, et kultuurvedeliku juhtimiseks peale ülerõhu rakendamist emareaktorist (1) tütarreaktorisse (2) avatakse emareaktoris (1) emareaktorit (1) ja tütarreaktorit (2) ühendavas ülekandekanalis (5) ventiilid (17).
20. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et puhastamata ülekandekanalite (5) katse järgselt puhastamiseks rakendatakse ülekandekanalitele (5) ülerõhku ventiili (20) avamisel.
21. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et emareaktoris (1) ruumala suurendamise faasis ja järgnevates katsetes tütarreaktorites (2) kasvatakse mikroorganisme anaeroobses re iimis.
22. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et muutuva ruumalaga kultiveerimine teostatakse konstantse lahustunud hapniku kontsentratsiooni juures, kusjuures kontsentratsiooni kõikumine hoitakse kuni 20% piires.
23. Meetod vastavalt punktile 22, mis erineb selle poolest, et lahustunud hapniku kontsentratsioon hoitakse konstantsena kasutades lahustunud hapniku kontsentratsiooni kontrolliks O2 lisamist PID algoritmi järgi, mida kontrollitakse arvutis (11).
24. Meetod vastavalt punktile 22, mis erineb selle poolest, et ruumala suurendamise faasis emareaktoris kasutatakse segamise parendamiseks segaja (4.1) võllil iga turbiini (4.2) diameetri pikkusel lõigul vähemalt üht turbiinsegistit (4.2).
EEP201200008A 2012-05-16 2012-05-16 Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks EE05731B1 (et)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP201200008A EE05731B1 (et) 2012-05-16 2012-05-16 Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks
EP20130728952 EP2850173A1 (en) 2012-05-16 2013-05-15 Bioreactor system and method for cloning the physiological state of microorganisms
PCT/EE2013/000005 WO2013170863A1 (en) 2012-05-16 2013-05-15 Bioreactor system and method for cloning the physiological state of microorganisms
US14/401,541 US10030222B2 (en) 2012-05-16 2013-05-15 Bioreactor system and method for cloning the physiological state of microorganisms

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP201200008A EE05731B1 (et) 2012-05-16 2012-05-16 Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EE201200008A EE201200008A (et) 2013-12-16
EE05731B1 true EE05731B1 (et) 2014-12-15

Family

ID=48626236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP201200008A EE05731B1 (et) 2012-05-16 2012-05-16 Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10030222B2 (et)
EP (1) EP2850173A1 (et)
EE (1) EE05731B1 (et)
WO (1) WO2013170863A1 (et)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA031512B1 (ru) * 2013-07-04 2019-01-31 Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед Многореакторная система и способ непрерывной ферментации газов
GB2554334A (en) * 2016-05-17 2018-04-04 Tap Biosystems Phc Ltd Automated bioprocess development
CN110093256A (zh) * 2019-05-23 2019-08-06 华东理工大学 一种自动溶氧周期性波动装置
RU2728193C1 (ru) * 2019-06-11 2020-07-28 Общество с ограниченной ответственностью "Биопрактика" (ООО "Биопрактика") Ферментер и ферментационная установка для непрерывного культивирования микроорганизмов
KR102383013B1 (ko) * 2020-03-23 2022-04-05 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 제균 필터 시스템 및 그 작동 방법
CN113667590A (zh) * 2021-08-24 2021-11-19 品玺汇(厦门)生物科技有限公司 一种生物培养系统
DE102023125142A1 (de) * 2023-09-18 2025-03-20 Kynda Biotech GmbH Kaskadensystem zur Fermentation von Biomasse

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1270006A (en) 1968-08-08 1972-04-12 Inst Gas Technology Improvements in or relating to the fermentation of methane utilizing microorganisms
DE1954765C3 (de) 1969-10-30 1978-05-24 Bunker Ramo Corp., Oak Brook, Ill. (V.St.A.) Mehrpoliger Steckerverbinder
DE3887792T2 (de) * 1987-08-21 1994-05-19 Fuji Photo Film Co Ltd Einrichtung zum Messen von Flüssigkeitsmengen.
BG50222A1 (en) 1990-03-27 1992-06-15 Nis Pri Sofijski Uni Kliment O Device for the cultivation of microorganisms, vegetable and animal cells
JPH08229534A (ja) 1995-02-24 1996-09-10 Shibuya Mach Kk 有機性廃棄物処理装置の運転方法
DE19547656A1 (de) * 1995-12-20 1997-06-26 Abb Research Ltd Vorrichtung und Verfahren zur Überprüfung von Flüssigkeiten
DE60238863D1 (de) * 2001-08-31 2011-02-17 Bayer Schering Pharma Ag Vorrichtung und verfahren zur fermentation in hohen zelldichten
US7732174B2 (en) 2003-10-01 2010-06-08 Alliance For Sustainable Energy, Llc Multi-stage microbial system for continuous hydrogen production
CN101611147A (zh) * 2006-12-01 2009-12-23 得克萨斯A&M大学系统 将生物质转化成混合醇的方法
KR100834110B1 (ko) 2007-01-25 2008-06-02 한국과학기술원 상류 충전탑 세포재순환 장치가 장착된 다단계 ｃｓｔｒ생물반응기 시스템
US20110236937A1 (en) * 2010-03-24 2011-09-29 The Texas A&M University System Multi-Stage Fermenter Nutrient Feeding

Also Published As

Publication number Publication date
US20150140544A1 (en) 2015-05-21
EE201200008A (et) 2013-12-16
EP2850173A1 (en) 2015-03-25
US10030222B2 (en) 2018-07-24
WO2013170863A1 (en) 2013-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EE05731B1 (et) Bioreaktorite süsteem ja meetod mikroorganismide füsioloogilise seisundi kloonimiseks
US12281297B2 (en) Systems and methods for producing bioproducts
Burmeister et al. A microfluidic co-cultivation platform to investigate microbial interactions at defined microenvironments
JP6154439B2 (ja) より適切な細胞変異体を選択可能であり、継続的に培養液を製造する移動型容器を備える連続培養装置
US11292999B2 (en) Bioreactor with multiple coupled vessels
CN112662551B (zh) 一种细胞培养控制方法以及系统
CN110462018A (zh) 用于控制生物技术过程的方法
JP2007522825A (ja) より適切な細胞変異体を選択可能な移動型容器を備えた連続培養装置
EP2126036A1 (en) Biotechnical and microbiological production method and equipment
Kheradmandnia et al. Development of parallel miniature bubble column bioreactors for fermentation process
Ritonja et al. Control of milk fermentation in batch bioreactor
Sivaprakasam et al. Biocalorimetry as a process analytical technology process analyser; robust in-line monitoring and control of aerobic fed-batch cultures of crabtree-negative yeast cells
Alcântara et al. Evolution and design of continuous bioreactors for the production of biological products
Allman Bioreactors: design, operation, and applications
Takahashi et al. Development of a feed-forward control system for medium in shake-flask culture
RU2473677C1 (ru) Установка для наработки плазмидосодержащих углеводородокисляющих микроорганизмов
US20250034509A1 (en) Apparatus and corresponding method of ascertaining an optimized composition of a culture medium
RU113738U1 (ru) Установка для наработки плазмидосодержащих углеводородокисляющих микроорганизмов
WO2024202322A1 (ja) 細胞培養装置、培養条件決定装置及び培養条件決定方法
Richards Bio0reactor modelling & control
CN108102906A (zh) 一种平行反应器系统以及平行对照实验的方法
Kumar et al. Fundamentals on bioreactors, operation modes and control system mechanisms
Rocha et al. An Integrated System for Advanced Monitoring and Control of Fed-Batch Fermevtations of Recombinant E. coli
ENGASSER CELLS FOR BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES
Samygin et al. Design of a Plant for Submerged Culturing of Aerobic Pathogens

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapsed by not paying the annual fees

Effective date: 20190516