EE01560U1 - Seade vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks - Google Patents

Abstract

Käesolev leiutis käsitleb seadet vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks. Seade on tehtud kasutama orgaaniliste analüütide ja mitmekihilisele analüüsisubstraadile immobiliseeritud selektiivsete sidumiskohtade vahelist spetsiifilist interaktsiooni, mis põhineb sellise substraadi fluorestsentsi indutseerimisel ja registreerimisel, biokeemiliste, geneetiliste ja keskkonnaalaste analüüside läbiviimiseks. Tuvastamine põhineb analüüdi molekuli spetsiifilisel interaktsioonil analüüsi-substraadi pinnale immobiliseeritud mitmekihilise nanostruktuuriga seotud sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga. Analüüsi-substraat on struktureeritud sellisel viisil, et sellega pakutakse FRET-i kvantpunktide ja sensormolekulil oleva spetsiifilise sidumiskohaga seotud analüüdi molekuli fluorestsentsmargise vahel.

Description

 TEHNIKAVALDKOND

Leiutis käsitleb seadet vedelikus orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ning konkreetsemalt seadet vedelikus orgaanilise analüüdi tuvastamiseks fluorestsentsi kasutamise teel, et tuvastada interaktsiooni vastava immobiliseeritud sidumiskohaga.

TEHNIKA TASE

Väikeste orgaaniliste molekulide kindlaks määramine erinevates looduslikes vedelikes on biokeemilistes, geneetilistes ja keskkonnaalastes analüüsides üks kõige olulisemaid ja nõudlikumaid ülesandeid ning nende rakenduste käsitlemiseks kasutatakse erinevaid klassikalisi analüütilisimeetodeid.

Spektromeetrilisi kiirmeetodeid kasutatakse veesaaste keskkonnaseires, teadusuuringutes ja meditsiinilises diagnostikas. Välja on töötatud mitut tüüpi seadmeid, sealhulgas kohapealsete analüüside läbiviimiseks mõeldud kaasaskantavaid seadmeid (Long et al. , 2013). Fluorestsentsspektroskoopia korral töödeldakse nendes seadmetes teadaolevas mahus proovija see pannakse katseklaasi ning selle proovi fluorestsentsi mõõdetakse konkreetsel ergastamise lainepikkusel. See on lihtne ja kiire analüüsimeetod, kui proovi iseloomustavad piisavalt erinevad ergastamise ja kiirgamise spektraalribad. Teatavaid komplikatsioone võib esineda seoses vajadusega seadme kalibreerimise järele igat tüüpi proovi jaoks, et võtta arvesse täiendavate fluorestsentssignaali-emitterite või -kustutite mõju ning analüüsitud proovides sisalduvate tahkete osakeste põhjustatud opalestsentsi mõju. Need tegurid muudavad analüütilise protseduuri keeruliseks ja võivad põhjustada mõõtmisviga.

Selliseid komplikatsioone on võimalik vältida, kui analüüt isoleeritakse vedelast proovist kapillaarelektroforeesi meetodi abil ja seejärel tuvastatakse sobiva tuvastussüsteemiga, näiteks UV-spektri mõõtmise teel, või mõnda muud analüütilist meetodit kasutades. See lähenemisviis annab kaasaskantavate seadmete kasutamisel kõrge tuvastamise tundlikkuse (Lara et al. , 2016). Teisest küljest tuleb selle meetodi puhul täpselt kindlaks määrata analüüdi elektroforeetiline liikuvus erinevat tüüpi proovides, kuna see parameeter võib sõltuda proovi tüübist. Lisaks võivad elektroforeesi jaoks kasutatud kapillaari omadused sõltuda ka proovi omadustest ja selle aja jooksul varieerumisest. Seega on vajalik kapillaari regulaarne asendamine ja seadme uuesti kalibreerimine. Lõpetuseks tuleb selle meetodi puhul lisaks kontrollida, et väljundsignaali põhjustab üksnes analüüt ning see ei hõlma muude sarnase liikuvusega koostisosade genereeritud signaali. Nende tulemuste valideerimiseks võib kasutada teisi analüütilisi meetodeid, millel ei esine selliseid komplikatsioone. Nende meetodite hulgas on kesksel positsioonil tandemtehnoloogiad GC/MS, HPLC/MS või LCMS/MS (Buchberger, 2010; Parre et al., 2007; Petrovic et al., 2010). Kuigi välja on töötatud erinevaid kasutatavaid seadmeid, ei saa neid meetodeid kasutada ilma proovi ettevalmistamiseta, ning nende kasutamiseks on vaja koolitatud töötajaid. Kõige olulisem on asjaolu, et need seadmed on endiselt kallid, eelkõige kui soovitakse teha reaalajas analüütilisi katseid (Staples et al. , 2001). Kaasaskantavates seadmetes kasutatakse laialdaselt elektrokeemilisi sensoreid, mis mõõdavad proovi elektrijuhtivust teatava konkreetse reaktsiooni ajal, mis toimub analüüdi juuresolekul. Neid mõõtmisi saab teha suure täpsusega ning seadmete suurust saab märkimisväärselt vähendada tänu prinditud elektroodidega miniatuursete kiipide kasutamise võimalusele (Couto et al. , 2015). Nende sensorite puudus on seotud tuvastamisprotseduuriga, kus ioonsete ühendite moodustumist või kadumist mõõdetakse teatavas järjestikuste reaktsioonide kogumis, mis toimuvad analüüdi juuresolekul, kuna selle reaktsioonide kaskaadi igat etappi võivad mõjutada lisandite olemasolu, reaktsioonikeskkonna omadused või temperatuur. Kõikidel nendel teguritel on mõõtmise ebamäärasuses oma roll, eelkõige välitingimustes, ning seega kasutatakse neid seadmeid enamasti kvalitatiivsete analüüside tegemise eesmärgil.

Üsna hiljaaegu pakuti analüüdi sidumismolekulidena kasutamiseks välja sünteetilised oligonukleotiidid, mida nimetatakse aptameerideks. Aptameerid moodustavad ruumilise molekulaarse struktuuri, mis tunneb spetsiifiliselt ära analüüdi terve molekuli või teatava osa selle struktuurist. Kuigi aptameeride avastamine on olulisel määral avardanud analüüside tegemise võimalusi, mis põhinevad konkreetse analüüdi suhtes tundlike kattekihtidega analüütiliste kiipide valmistamisel, on tõhusate ja usaldusväärsete tuvastamismeetodite puudumine takistanud odavate ja tõhusate analüütiliste ja diagnostiliste seadmete arendamist.

Aptameere kasutatakse laialdaselt pinnapiasmonresonantstehnikaga (SPR- tehnikaga) kombineeritult (Kodoyianni, 2011). Sellisel juhul immobiliseeritakse aptameerid kiibi pinnale ja kompleksimoodustumise protsessi registreeritakse selle kompleksi molekulmassi osas toimuvate muutuste jälgimise teel. Kuigi see lähenemisviis näib olevat pigem üldine, on sellel mitmeid märkimisväärseid puudusi. Esiteks sõltub sensori tundlikkus proovis muude sarnaste sidumisrühmadega ühendite olemasolust. Teiseks sõltub see analüüdi molekulmassist ning väikesed molekulid ei muuda kompleksi molekulmassi usaldusväärseks tuvastamiseks piisaval määral (Nguyen et al., 2007). Seega võivad need mõõtmised olla väga problemaatilised väga madala molekulmassiga analüütide korral. Lisaks võib nendel sensoritel olla kõrge taustasignaal, mis on tingitud proovis sisalduvate muude koostisosade mittespetsiifilisest sidumisest. See kõrge taustasignaal vähendab selle meetodi tundlikkust. Lõpetuseks võib kompleksimoodustamise protsess olla SPRi-tehnika abil läbiviidavate kiirete ja tõhusate mõõtmiste jaoks liiga aeglane. Need tegurid piiravad aptameeridel põhineva meetodi rakendamist.

Fluorestsentsvärviga märgistatud aptameere sisestati ka analüütide määramiseks vedelas keskkonnas. Selle meetodi kohaselt immobiliseeritakse analüüdi molekulid kiibi pinnale ja seejärel seondub värvainega märgistatud aptameer nende molekulidega. Kui lahuses leidub täiendavaid analüüdi molekule, siis konkureerivad need immobiliseeritud molekulidega aptameeriga seondumise osas ja põhjustavad immobiliseeritud kompleksi eraldumist (Xu et al., 2010). Selle tulemusel lahkuvad märgistatud aptameeri molekulid kiibi pinnalt ja see muudab pinnale seotud molekulide fluorestsentsi (Alsager et al., 2014). Selle meetodi puudus seisneb asjaolus, et aptameeri molekulid jäävad analüüsi keskkonda alles ka pärast nende eraldumist, mistõttu on keeruline eristada pinnale seotud molekulide ja eraldunud molekulide panust fluorestsentsi.

Kvantpunktide kasutamist fluorestsentsi resonantsenergia ülekande (siin edaspidi FRET, mõnikord kasutatakse ka nimetust Försteri resonantsenergia ülekanne) efektiga kombineeritult on kaalutud paljude analüütiliste rakenduste puhul, kus tuvastamine viiakse läbi lähteproovi mahus ning kvantpunktid või nende keemiliselt modifitseeritud analoogid lahustatakse või suspendeeritakse selles mahus. Sellisel juhul sõltub signaal tugevalt analüüsisüsteemis olevate kiirguskeskmete arvust, mille

määrab kindlaks proovi maht, mida tuleks mõõta suure täpsusega (Zhou et al. , 2008). See takistab mõõtmiste tegemist ja muudab tuvastamise kalibreerimise keeruliseks. Lisaks võivad tahkete osakeste olemasolust või muudest põhjustest tingitud proovi heterogeensus ja läbipaistvus takistada otseste fluorestsentsi mõõtmiste tegemist proovis ilma selle eelneva töötlemise ja puhastamiseta. See muudab lähteproovi mahus fluorestsentsi mõõtmiste laialdase rakendamise keeruliseks.

Patenditaotlusest US2009/0227043A1 (publ.10.09.2009) on tuntud meetod, süsteem ja seade vedelikus orgaanilise analüüdi tuvastamiseks fluorestsentsi kasutamise teel, et tuvastada interaktsiooni vastava immobiliseeritud sidumiskohaga. Antud lahenduses kasutatakse läbipaistvat analüüsisubstraati, mille pinnale on fikseeritud komponendid orgaanilise analüüdi tuvastamiseks. Ergastamine/valgustamine toimub selles lahenduses läbi analüüsisubstraadi pinna, st teiselt poolt analüüsisubstraati, et vähendada optilist häiringut tingituna proovis sisalduvatest komponentidest. Fluorestsentsi detekteerimine toimub samuti altpoolt läbi analüüsisubstraadi pinna. Sellel meetodil, süsteemil ja seadmel on enamus eespool kirjeldatud tehnika taseme puudused.

Patenditaotlusest US2009/0227043A1 tuntud lahenduses nii energia doonor kui ka esimene ja teine vahelüli on seotud analüüsisubstraadi pinnale. Sellises teostuses lahendusel on mitu järgnevalt toodud puudust.

Esiteks analüüsisubstraadi komponentide (energia doonor, aktseptor, fluorofoorid) valik on piiratud ainult nendega, mis on vahetult seotavad analüüsisubstraadi pinnale.

Teiseks analüüsisubstraatide valik piirdub ainult nendega, mis on keemiliselt võimelised seonduma testi kõiki komponente üheaegselt.

Kolmandaks on analüüsisubstraatide valik piiratud selliste homogeensete substraadipindadega, mis võimaldavad kvantitatiivse analüüsi teostamiseks immobiliseerida substraadile kontrollitud kogust FRET-paare.

Neljandaks on analüüsisubstraatide valik piiratud seetõttu, et analüüsisubstraat peab FRET-paaride ergutus- ja emissioonilainepikkusi läbi laskma.

Viiendaks nn valikulise vahelüli FRET-paari analüüsisubstraadile sidumiseks eeldab kirjeldatud efekti saavutamiseks selle täpset paigutamist analüüsisubstraadi pinnal

FRET-paari suhtes, ent selline täpne positsioneerimine on äärmiselt raskelt teostatav.

Sellega seoses on jätkuv vajadus vedelikus orgaanilise analüüdi tuvastamiseks mõeldud alternatiivse meetodi, süsteemi ja/või seadme järele, mille puhul on ületatud üks või mitu eespool märgitud puudust. Kasulik võib olla pakkuda meetodit, süsteemi ja/või seadet, mis lihtsustab orgaaniliste analüütide optilist tuvastamist mitut erinevat tüüpi proovides ilma vajaduseta proovist analüüt isoleerida.

LEIUTISE OLEMUS

Leiutise eesmärk on pakkuda kõrget selektiivsust ja spetsiifilisust erinevate orgaaniliste analüütide tuvastamiseks erinevates vedelikes, kasutades selleks kaasaskantavat optilist seadet, mis on varustatud analüüsisubstraatide komplektiga , mille keemilise koostise määrab kindlaks analüüdi tüüp.

Käesoleva leiutise eesmärk on pakkuda välja seade vedelas proovis sisalduva ü he või mitme konkreetse orgaanilise analüüdi või kõigi konkreetsete orgaaniliste ana-

lüütide absoluutse või suhtelise sisalduse (mida sageli väljendatakse kontsentratsioonina) kindlaks määramiseks.

Eespool määratletud eesmärkide saavutamiseks pakutakse välja süsteem väikeses mahus vedelas proovis analüütide vahetuks kindlaksmääramiseks. See süsteem hõlmab tuvastusmeetodit, analüüsisubstraati ja optilist seadet vesilahustes analüütide tuvastamiseks. See tuvastamine põhineb analüüdi molekuli spetsiifilisel interaktsioonil analüüsisubstraadi pinnale immobiliseeritud mitmekihilise nanostruktuuriga seotud sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga. Analüüsisubstraat on struktureeritud sellisel viisil, et sellega pakutakse FRET-i kvantpunktide ja sensormolekulil oleva spetsiifilise sidumiskohaga seotud analüüdi molekuli fluorestsentsmärgise vahel. Selle pind on ehitatud mitmekihilise struktuurina, kus keemiliste koostisosade erinevad kihid on lisatud üksteise peale, alustades substraadi pinnast. Analüüsisubstraati analüüsitakse optilise seadmega, mis pakub fluorestsentsi ergastamist ja FRET-efekti tõttu indutseeritud fluorestsentsi voolu registreerimist , et saada analüüdi kontsentratsioon.

Selle meetodi selektiivsus on tingitud analüüdi molekuli interaktsioonist selle sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga , mis on seotud analüüsisubstraadi pinnale

fikseeritud mitmekihilise nanostruktuuriga. See spetsiifiline interaktsioon põhjustab nimetatud substraadist toimuva fluorestsentsi voolu muutust ning selline muutus registreeritakse ja seda kasutatakse analüüdi kontsentratsiooni kindlaks määramiseks. Selle meetodi iseloomulik tunnus on spetsiifilise fluorestsentsi registreerimine analüüsisubstraadi interaktsiooni pindmisest kihist ilma vedelikuproovi optiliste omaduste märkimisväärse mõjuta ja kiirgamise peatamiseta proovi maatriksi poolt. Leiutisekohaselt kasutatakse meetodit vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ja kvalifitseerimiseks, kasutades nimetatud orgaanilise analüüdi spetsiifilist interaktsiooni sensormolekulide selektiivsete sidumiskohtadega, mis põhineb fluorestsentsi resonantsenergia ülekande (FRET) efektil.

Nimetatud tuvastamine ja kvantifitseerimine põhinevad sellise FRET-efektil põhineva interaktsiooni mõõtmis(t)el.

Nimetatud meetod hõlmab etappe, milles:

nähakse ette analüüsisubstraat, millel on konfigureeritud esimest komponenti ja teist komponenti sisaldav analüüsisubstraadi pind;

esimene koostisosa sisaldab esimese fluorestsentsmarkeriga märgistatud sensormolekuli , mis on immobiliseeritud analüüsisubstraadi pinnale esimese vahe-

lüliga, nimetatud esimene vahelüli on bipolaarne vahelüli , mis sisaldab esimest sidumisrühma esimese fluorestsentsmarkeri spetsiifiliseks sidumiseks ja teist sidumisrühma analüüsisubstraadi pinna spetsiifiliseks sidumiseks, kus sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht orgaanilise analüüdi jaoks, nimetatud sensormolekui on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga positsioonis, mis ei avalda mingit mõju spetsiifilise sidumiskohaga seonduvale orgaanilisele analüüdile;

teine koostisosa sisaldab orgaanilise analüüdi keemilist analoogi, nimetatud keemiline analoog on märgistatud teise fluorestsentsmarkeriga , keemiline analoog on seotud esimese fluorestsentsmarkeriga teise vahelüliga , mille pikkus on Försteri raadiusest suurem, ning keemiline analoog seondub pöörduvalt esimese koostisosa sensormoiekuli spetsiifilise sidumiskohaga;

nimetatud esimese ja teise koostisosa vahel toimub interaktsioon , et paigutada esimene fluorestsentsmarker teise fluorestsentsmarkeri lähedale kaugusel, mis

on lühem kui Försteri raadius, et võimaldada FRET-efekti nimetatud esimese ja teise fluorestsentsmarkeri vahel;

vedelikuproov kantakse analüüsisubstraadile;

analüüsisubstraati valgustatakse valgusega, mis on spektraalselt sobitatud esimese fluorestsents-markeri ergastusspektriga;

tuvastatakse teise fluorestsentsmarkeri fluorestsents;

tuvastatakse orgaaniline analüüt teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi vähenemise kindlaksmääramise teel, mis on tingitud sellest, et orgaaniline analüüt tõrjub keemilise analoogi spetsiifilisest sidumiskohast välja ja vaigistab FRET-efekti. Veel ühes teises aspektis on pakutud välja seade vedelas proovis orgaanilise ana-

lüüdi tuvastamiseks, nimetatud seade sisaldab:

analüüsisubstraati , millel on konfigureeritud esimest komponenti ja teist komponenti sisaldav analüüsisubstraadi pind;

esimene koostisosa sisaldab esimese fluorestsentsmarkeriga märgistatud sensormolekuli, mis on immobiliseeritud analüüsisubstraadi pinnale esimese vahelüliga, nimetatud esimene vahelüli on bipolaarne vahelüli , mis sisaldab esimest sidumisrühma esimese fluorestsentsmarkeri spetsiifiliseks sidumiseks ja teist sidumisrühma analüüsisubstraadi pinna spetsiifiliseks sidumiseks, kus sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht orgaanilise analüüdi jaoks, nimetatud sensormolekul on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga positsioonis, mis ei avalda mingit mõju spetsiifilise sidumiskohaga seonduvale orgaanilisele analüüdile; teine koostisosa sisaldab orgaanilise analüüdi keemilist analoogi, nimetatud keemiline analoog on märgistatud teise fluorestsentsmarkeriga, keemiline analoog on seotud esimese fluorestsentsmarkeriga teise vahelüliga , mille pikkus on Försteri raadiusest suurem, ning keemiline analoog seondub pöörduvalt esimese koostisosa sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga ; analüüsisubstraadiga määratletud analüüsisubstraadi kambrike vedela proovi analüüsisubstraadi pinnale kandmiseks;

valgusallikat, mis on konfigureeritud kiirgama spetsiifilist spektrit esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi indutseerimiseks;

optoelektroonilist detektorit, mis on konfigureeritud tuvastama teise

fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ja genereerima fluorestsentsi intensiivsusele vastavat signaali;

töötlusvahendit, mis on konfigureeritud registreerima optoelektroonilisest detektorist saadud signaali ja määrama kindlaks orgaanilise analüüdi olemasolu tuvastatud fluorestsentsi vähenemise alusel.

Osas teostustes on sensormolekul valitud looduslikult esinevate või sünteesitud molekulide hulgast, sealhulgas mittepiiravalt valkude ja oligonukleotiidide hulgast. Osas teostustes on esimene fluorestsentsmarker kvantpunkt ( quantum dot, QD), millel on fluorestsentsi kiirgusspekter, mis sobib teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ergastamiseks.

Osas teostustes viiakse nimetatud mõõtmised läbi vedelikuproovi õhukeses kihis, kus nimetatud vedela proovi interaktsiooni pindmise kihi paksus analüüsisubstraadil on piiratud Försteri raadiuse füüsilise piiranguga (selle kohaselt).

Osas teostustes viiakse nimetatud vedela proovi mõõtmised läbi ilma nimetatud kasutatud proovi mis tahes ettevalmistuseta ja/või eeltöötluseta.

Osas teostustes on substraadi pind tahke ja keemiliselt inertne.

Osas teostustes sisaldavad nimetatud substraadi kihid vähemalt ühte keemiliselt seotud esimest fluorestsentsmarkerit sensormolekuliga ja analüüdi analoogi molekuli, millega nimetatud teine fluorestsentsmarker on seotud.

Osas teostustes on nimetatud esimene fluorestsentsmarker kvantpunkt (QD), millel on fluorestsentsi kiirgusspekter, mis sobib teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ergastamiseks.

Osas teostustes on nimetatud teine fluorestsentsmarker fluorestsentsvärv, millel on iseloomulik fluorestsentsi kiirgusspekter, mis erineb esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist.

Osas teostustes on nimetatud teine fluorestsentsmarker fluorestsentsvalk , millel on iseloomulik fluorestsentsi kiirgusspekter, mis erineb esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist.

Osas teostustes sisaldab substraat spetsiifiliselt määratletud analüütilist kompositsiooni ühe analüüdi mõõtmiste tegemiseks.

Osas teostustes sisaldab substraat mitut analüütilist kompositsiooni mitme analüüdi samaaegsete mõõtmiste tegemiseks.

Osas teostustes on substraat valmistatud ühekordselt kasutatava kiibina.

Osas teostustes on nimetatud analüüsisubstraat konfigureeritud võtma mõõtmiste tegemiseks vastu mitte rohkem kui ühe mikroliitri suuruses mahus proovi.

Osas teostustes on nimetatud seadme optiline skeem konfigureeritud fluorestsentsi mõõtmiste tegemiseks ühest analüüsisubstraadil olevast analüütilisest kompositsioonist.

Osas teostustes on nimetatud optiline skeem konfigureeritud fluorestsentsi mõõtmiste tegemiseks mitmest analüüsisubstraadil olevast analüütilisest kompositsioonist.

Osas teostustes on nimetatud juht- ja töötlusvahend konfigureeritud tuletama analüüdi kontsentratsiooni registreeritud fluorestsentsi suhtelisest vähenemisest aja jooksul selle esialgsest väärtusest.

Osas teostustes on analüüsisubstraadile kantud nimetatud vedela proovi interaktsiooni pindmise kihi paksus piiratud Försteri raadiuse füüsilise piirangu kohaselt. Osas teostustes hõlmab nimetatud meetod lisaks vedelas proovis orgaanilise analüüdi koguse kvalifitseerimist teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi vähenemise mõõtmise teel, nimetatud mõõdetud vähenemise määr vastab vedelas proovis sisalduva orgaanilise analüüdi kogusele.

Osas teostustes on nimetatud teine vahelüli sellise suurusega, et vältida keemilise analoogi seondumist naabruses paikneva esimese koostisosa spetsiifilise sidumiskohaga, mis ei ole keemilise analoogiga seotud.

Osas teostustes on analüüsisubstraat konfigureeritud siduma mitut tüüpi orgaanilisi analüüte, mitut tüüpi sensormoiekuie, mis on vastavalt märgistatud mitut tüüpi esimeste fluorestsentsmarkeritega, mis on immobiliseeritud sama analüüsisubstraadi pinnale, ning tuvastatud fluorestsentsil on muitispektraalsed karakteristikud.

Osas teostustes toimub orgaanilise analüüdi tuvastamine vedelikuproovi õhukeses kihis, kus vedelikuproovi interaktsiooni pindmise kihi paksus analüüsisubstraadil on piiratud Försteri raadiuse kohaselt.

Leiutisekohaselt kasutatakse meetodit vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise

analüüdi tuvastamiseks ja kvalifitseerimiseks, kasutades nimetatud orgaanilise analüüdi spetsiifilist interaktsiooni sensormolekulide selektiivsete sidumiskohtadega, mis põhineb fluorestsentsi resonantsenergia ülekande (FRET) efektil, kus nimetatud meetod hõlmab etappe, kus:

esialgses faasis etapis 1 kantakse nimetatud orgaanilisi analüüte sisaldav vedelikuproov analüüsisubstraadile, mis sisaldab vähemalt ühte kahe interakteeruva koostisosaga komplekti, mis moodustavad sensorsüsteemi;

kus nimetatud esimene koostisosa hõlmab sensormolekuli, mis on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga, ja nimetatud marker on immobiliseeritud analüüsisubstraadi pinnale spetsiifilise bipolaarse vahelüli kaudu;

kus nimetatud sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht uuritava analüüdi jaoks;

kus nimetatud sensormolekul on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga sidumispositsioonis, kus nimetatud valitud esimese märgistava fluorestsentsmarkeri

ühendus ei avalda mingit mõju analüüdi sidumiskohale;

kus nimetatud bipolaarne vahelüli sisaldab ühel poolel spetsiifilist sidumisrühma spetsiifilise esimese fluorestsentsmarkeri jaoks, ja selle vastaspool sisaldab spetsiifilist sidumisrühma töödeldud substraadi pinna jaoks;

kus nimetatud erinevat tüüpi vahelüli molekulide komplekt võimaldab samal substraadi pinnal erinevate sensormolekulidega seotud erinevate esimeste fluorestsentsmarkerite samaaegset immobiiiseerimist;

nimetatud teine koostisosa hõlmab teise fluorestsentsmarkeriga seotud analüüdi keemilist analoogi, kus nimetatud analüüdi keemiline analoog on pöörduvalt seotud nimetatud sensormolekuliga;

kus nimetatud analüüdi keemiline analoog on seotud esimese fluorestsentsmarkeriga, millel on vahelüli, mille pikkus on Försteri raadiusest (mõnikord kasutatakse ka nimetust FRET-i raadius) suurem;

kus nimetatud erinevate analüütide keemilised analoogid (analoogide komplekt) on seotud spetsiifiliste vastavaid sidumiskohti omavate sensormolekulidega;

kus nimetatud fluorestsentsmarkerite komplektil on eristavad spektraalkarakteristikud; kus esimese ja teise koostisosa kompositsioon on valitud selliselt, et esimene fluorestsentsmarker viiakse teise fluorestsentsmarkeri lähedale, nii et nimetatud fluorestsentsmarkerite vaheline kaugus on lühem kui Försteri raadius, et võimaldada nende vahel FRET-efekti toimumist, nimetatud kompositsioon vastab analüüsisubstraadi esialgsele faasile.

Esialgses faasis etapis 2 vahetult peale orgaaniliste analüütide analüüsisubstraadile kandmise etappi valgustatakse (ergastatakse) nimetatud analüüsisubstraati valgusega, mis on spektraalselt sobitatud esimese fluorestsentsmarkeri ergastusspektriga, ning toimub FRET-efektist tingitud teise fluorestsentsmarkeri energia ülekanne, mis indutseerib teise markeri fluorestsentsi, ning nimetatud fluorestsents tuvastatakse ja selle intensiivsus registreeritakse, kus nimetatud analüüsisubstraadi tuvastatud fluorestsents esialgses faasis vastab teise fluorestsentsmarkeri spektraalkarakteristikutele;

kus nimetatud tuvastatud fluorestsentsil on multispektraalsed karakteristikud substraadi pinnal valitud sensorsüsteemide komplekti kohaselt.

Järgnevas faasis etapis 3 korratakse eelnevalt kindlaks määratud ajavahemiku jooksul nimetatud ergastamist ja tuvastamist eelnevalt kindlaks määratud intervallide tagant ja igal korral registreeritakse tuvastatud fluorestsentsi intensiivsus, võimaldades nimetatud eelnevalt kindlaks määratud ajavahemiku jooksul analüüsisubstraadile kantud vedelas proovis analüüdi olemasolul nimetatud analüüdi analoogi molekulide asendamist sensormolekulide sidumiskohtadel analüüdi molekulidega , kus sellise asendamise tulemusel kasvab nimetatud kahe fluorestsentsmarkeri vaheline kaugus Försteri raadiusest suuremaks, põhjustades FRET-efekti vaibumist aja jooksul.

Etapis 4 arvutatakse / määratakse kindlaks analüüdi kogus vedelikuproovis nimetatud eelnevalt kindlaks määratud ajavahemike tagant registreeritud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi intensiivsuse vähenemisena, kus nimetatud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi vähenemine aja jooksul on tingitud FRET-efekti vaibumisest , ning sellise vähenemise määr vastab vedelikuproovis sisalduva analüüdi kogusele.

Leiutise ühes teises aspektis on välja pakutud analüüsisubstraat vedelas proovis erinevate orgaaniliste analüütide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, kus nimetatud analüüsisubstraat koosneb substraadi pinnale kantud mitmekihilistest nanostruktuuridest.

Leiutise veel ühe aspekti kohaselt on vedelas proovis analüüdi mõõtmisteks välja pakutud seade, mis sisaldab valgusallikat, proovikambrikest, optoelektroonilist detektorit, juht-, töötlus- ja sidevahendit, kus

nimetatud mõõtmiste tegemiseks mõeldud proovikambrike on konfigureeritud võtma vastu analüüsisubstraati , mis kannab mikrokoguses nimetatud analüüsisubstraadile kantud vedelat proovi;

nimetatud valgusallika kiirgusspekter on valitud selliselt, et indutseerida nimetatud analüüsikambrikesel kvantpunktide fluorestsentsi;

nimetatud optoelektrooniline detektor on seadistatud tuvastama kvantpunktist nimetatud markerile energia ülekande teel indutseeritud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi;

nimetatud elektrooniline detektor on seadistatud tuvastama selektiivselt analüüsisubstraadi pinnale immobiliseeritud erinevate sensorsüsteemide komplekti fluorestsentsi;

nimetatud juht- ja töötlusvahend on seadistatud registreerima iga sensorsüsteemi nimetatud tuvastatud fluorestsentsi ajakõverat aja jooksul, et tuletada analüütide kontsentratsiooni;

nimetatud sidevahend on seadistatud väljastama mõõtmiste tulemusi.

Osas teostustes on seadme töötlusvahend konfigureeritud registreerima optoelektroonilise detektori poolt genereeritud signaali aja jooksul, et määrata kindlaks orgaanilise analüüdi kontsentratsioon.

Osas teostustes on nimetatud töötlusvahend konfigureeritud tuletama analüüdi kontsentratsiooni registreeritud fluorestsentsi suhtelisest vähenemisest aja jooksul selle esialgsest väärtusest.

Osas teostustes on nimetatud teine vahelüli valitud sellise suurusega, et vältida keemilise analoogi seondumist naabruses paikneva esimese koostisosa spetsiifilise sidumiskohaga, mis ei ole keemilise analoogiga seotud.

Osas teostustes on analüüsisubstraat konfigureeritud siduma mitut tüüpi orgaanilisi analüüte, kus mitut tüüpi sensormolekufid , mis on vastavalt märgistatud mitut tüü pi esimeste fluorestsentsmarkeritega , mis on immobiliseeritud sama analüüsisubstraadi pinnale, ning töötlusvahend on konfigureeritud tuvastama fluorestsentsi, millel

on multispektraalsed karakteristikud.

Käesoleva leiutisega on välja pakutud sensorsüsteemi immobiliseefimine, mis koosneb mitmekihilisest kvantpunktiga seotud struktuurist , mis on omakorda immobiliseeritud substraadile mitmeosalise vahelüli abil. See võimaldab valmistada sensorsüsteemi, millel puuduvad eespool väljatoodud tehnika taseme dokumendist US2009/0227043A1 tuntud lahenduse puudused ning millel on täiendavad järgnevalt loetletud kasulikud omadused.

Käesolevas lahenduses on substraadi pind reaktiivse rühma abil funktsionaliseeritud. Polümeeri vahelülid on ette nähtud substraadi pinna homogeniseerimiseks ja need määratlevad sensorsüsteemi tiheduse bipolaarsete vahelülidega immobiliseeritud kvantpunktidega. Sellest tulenevalt on sensorsüsteemi muud komponendid seotud üksteisega ja mitte vahetult substraadiga . See võimaldab kasutada laia valikut sensorsüsteemi komponente ja sellega nende optimeerimist erinevate analüütide jaoks.

Analüüsisubstraadi mitmekihiline struktuur võimaldab kasutada erinevaid substraadi materjale, ka neid, mis ilmtingimata ei lase läbi FRET lainepikkusi, kuna kasutada saab mitmesuguseid optilisi skeeme.

Kvantpunkti ja analüüdi analoogi sidumine vahelüliga, mille pikkus on Försteri raadiusest suurem, võimaldab tulemuste saamiseks muuta võistluskineetika kiiremaks.

Ning erinevate bipolaarsete vahelülide kasutamine kvantpunkide jaoks, mis on seondunud erinevate sensormolekulidega, võimaldab samale substraadile ehitada kvantitatiivse mitme analüüdi detekteerimise süsteemi.

ILLUSTRATSIOONIDE LOETELU

Järgnevalt on käesolevat leiutist kirjeldatud allpool loetletud illustratsioonide abil.

Joonis fig 1: substraadi pinna ettevalmistamise reaktsiooni faaside skeemid ja fotod: a) - aktiveeritud pinna struktuur ja vormi aktiivsed keskmed; b) - QD-ga immobiliseeritud pinna struktuur (ketta roheline värv näitab pinnal QD olemasolu); c) - QD analüüdiga immobiliseeritud kompleksi moodustamise struktuur.1 - substraadi pind; 2- kvantpunkt (QD); 3- sensoritaoline molekul; 19-substraadi pinna olev reaktiivne rühm; 20 - polümeeri vahelüli; 21 - bipolaarne keemiline vahelüli; 22-QD reaktiivsed rühmad erinevate vahelülide jaoks; 23 - funktsionaalne vahelüli sensormolekuli QD-ga sidumiseks.

Joonis fig 2: analüüsisubstraadi fluorestsentsi skeem: (a) QD-ga immobiliseeritud substraadi pind (mitte-FRET-süsteem); (b) FRET-süsteemiga analüüsisubstraat: 4 - vahelüli fluorestsentsvärvi jaoks; 5 - fiuorestsentsvärv; 19 - substraadi pinnal olev reaktiivne rühm; 20 -polümeeri vahelüli; 21- bipolaarne keemiline vahelüli.

Joonis fig 3: (a) ilma värvainega märgistatud aineta ja (b) värvainega märgistatud ainega mudelsubstraadi kiirgusspekter ergastamise lainepikkusel 320 nm.

Joonis fig 4: analüüdi interaktsioon analüüsisubstraadiga. Väljatõrjumise meetod.

6 - looduslik analüüt; 7 - värvainega märgistatud analüüdi analoog; 8 - sensormolekul, mis on pöörduvalt seotud fluorestsentsvärviga märgistatud analüüdi analoogiga; 23 - funktsionaalne vahelüli sensormolekuli (8) kovalentseks sidumiseks QD-le; 24 - vahelüli teise fluorestsentsmarkeri jaoks; 28 - vahelüli, mis ühendab värvainega märgistatud analüüdi analoogi QD-ga (2).

Joonis fig 5: analüüsisubstraat, millel on mitu sensorsüsteemi, mis on immobiliseeritud pinnale ühendatud vahelülidega: 2 ja 29 - erinevat tüüpi QD-d; 5 ja 33 -erinevat tüüpi fluorestsentsvärvid; 7 ja 32-erinevat tüüpi analüüdi analoogid; 8 ja 31 -erinevat tüüpi sensormolekulid; 20-polümeeri vahelüli; 21 ja 30-erinevat tüüpi bipolaarsed vahelülid.

Joonis fig 6: analüüsisubstraat, millel on mitu sensorsüsteemi, mis on seotud QD-ga (2): 5, 33, 36 - erinevat tüüpi fluorestsentsvärvid; 7, 32, 35 - erinevat tüüpi analüüdi analoogid; 8, 31, 34 - erinevat tüüpi sensormolekulid; 20 - polümeeri vahelüli; 21- bipolaarne vahelüli.

Joonis fig 7: väljatõrjumise meetodi signaali registreerimise skeem reaktsiooni eri faasides, mis on määratletud analüüdi kontsentratsioonidega proovides: (a) väga madal või 0% lähedane kontsentratsioon; (b) kontsentratsioon, mis on piisav sidumiskohtadest poolte värvainega märgistatud analüüdi analoogide väljatõrjumiseks; (c) küllastusfaas, mille määratleb täielik väljatõrjumine sidumiskohtades.

Joonis fig 8: a) seadme plokkskeem; b) analüüsisubstraadi kambrikese optilised

paigutused: 9- valgusallikas, 10 - valgusallika kiirgus, 11- analüüsisubstraat, 12 - analüüsisubstraadi kambrike, 13 - fluorestsentsi vool, 14 - optoelektrooniline detektor, 15 - töötlusvahend; 16 - juhtvahend, 17 - sidevahend.

Joonis fig 9 - näide: väljatõrjumise meetodi põhimõtete illustratsioon.7 - värvainega märgistatud analüüdi analoog; 8 - sensormolekui, mis on pöörduvalt seotud fluorestsentsvärviga märgistatud analüüdi analoogiga; 25 - ergastamisvalgus; 26 - substraadi esialgne kiirgusspekter FRET-efektiga; 27 - kürgusspekter pärast analüüdi analoogi väljatõrjumist.

Joonis fig 10 - näide: kiirguse intensiivsuse lagunemise sõltuvus ajast: (a) kogu reaktsiooniskeem; (b) reaktsiooni esialgne osa.

TEOSTUSNÄIDETE KIRJELDUS

Siin on kirjeldatud tuvastamismeetodit, süsteemi ja/või seadet, analüüsisubstraadi struktuuri ja optilist seadet analüütide tuvastamiseks vesilahuses.

Välja pakutud analüütilises analüüsis toimub analüüdi tuvastamine FRET-efekti abil, mida põhjustab energia ülekanne kvantpunktide ja spetsiifilise analüüdi sidumiskohaga seotud analüüdi molekuli fluorestsentsmärgise vahel. Selle meetodi kõrge selektiivsus saavutatakse analüüdi molekuli interaktsiooni kaudu sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga, mis on seotud analüüsisubstraadi pinnale mitmekihiliste nanostruktuuridega. Selline substraat võib olla plaat, kiip, sfäär või mis tahes muu ruumiline struktuur, millel on tahke pind sellel oleva mitmekihilise paigutusega, miile eesmärk on interaktsioon vedelikuprooviga. Analüüsisubstraadi materjalide kompositsioon ja selle spetsiifiline interaktsioon analüüdi molekuliga määratleb optilise signaali analüüsisubstraadist iseloomuliku fluorestsentskiirguse kujul. See kiirgus registreeritakse ja seda kasutatakse analüüdi kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks.

Mõõtmissüsteem hõlmab ainespetsiifilist analüüsisubstraati ja seadet selle spetsiifilise fluorestsentsi indutseerimiseks ja tuvastamiseks. Süsteemi spetsiifilisuse märklauaks oleva analüüdi tüübi suhtes määrab kindlaks substraadi mitmekihiline kompositsioon, samas kui tuvastamine püsib samasugusena. Selle süsteemi oluline tunnus on analüüsisubstraadil toimuva interaktsiooni fikseeritud pindmisest kihist

fluorestsentssignaali registreerimine ilma vedelikuproovi optiliste omaduste märkimisväärse mõjuta ja kiirgamise peatamiseta proovi maatriksi poolt. Nende tingimuste saavutamiseks ja mõõdetud pindmise kihi paksuse fikseerimiseks kasutatakse FRET-i kvantpunktide osalemisega , kuna see efekt on tundlik molekulidevahelise kauguse suhtes ja seda saab mõõta üksnes Försteri raadiuse vahemikus (Lakowicz, 2006).

Mõõtmissüsteemi analüüsisubstraat hõlmab jä rgmist kahte interakteeruvat koostisosa. Esimene koostisosa hõlmab sensormolekuli, mis on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga ja nimetatud marker on immobiliseeritud substraadi pinnale

ühendatud vahelüli kaudu. Sellisel sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht uuritava analüüdi jaoks ning seega seob see selektiivselt analüüdi molekuli. Pakutud süsteemi konkreetne tunnus seisneb võimaluses kasutada erinevaid sensormolekule koos analüüdi spetsiifiliste sidumiskohtadega. Selliste sensormolekulide teostused võivad hõlmata valke, oligonukleotiide või sünteetilisi molekule, mis interakteeruvad selektiivselt analüüdi molekuliga. Sensormolekulid on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga, näiteks kvantpunktiga (QD) positsioonis, kus see märgistamine ei avalda mingit mõju analüüdi sidumiskohale. See on esimene ana-

lüüsisubstraadi struktuurile esitatav funktsionaalne nõue. Ja selline esimene koostisosa on seotud ka teise interakteeruva koostisosaga.

Teine koostisosa hõlmab teise fluorestsentsmarkeriga seotud analüüdi keemilist analoogi. Teine marker võib olla orgaaniline fluorestsentsvärv või fluorestsentsvalk, mis on seotud sobiva vahelü li abil analüüdi keemilise analoogiga, mis peaks olema suuteline interakteeruma loodusliku või sünteetilise sensormolekuli sidumiskohaga.

Siinkohal on äärmiselt oluline, et esimese fluorestsentsmarkeri iseloomulikku fiuorestsents kiirgusspektrit on võimalik eristada teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist ning see sobib teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ergastamiseks.

Selle süsteemi eelis seisneb selles, et see annab kvantitatiivseid analüüsitulemusi vedelikuprooviga , mis on sisestatud analüüsisubstraati ilma proovi ettevalmistamise ja eelneva töötlemiseta , lihtsustades seega analüüsi protseduuri. Teine eelis seisneb selles, et analüüsi viiakse läbi vedelikuproovi väikeses mahus, mis on äärmiselt oluline selle meetodi kasutamiseks piiratud proovimahuga rakendustes. Sellise süsteemi pakutud täiendav parendus seisneb analüüdi usaldusväärses tuvastamises analüüsisubstraadi pinnal , see ei sõltu proovide optilistest omadustest, ja mida saab samaväärselt kasutada läbipaistvate ja läbipaistmatute proovide ning tahkeid osakesi sisaldavate proovide puhul.

Nende tingimuste saavutamiseks ja interakteeruva pindmise kihi fikseeritud paksuse saamiseks kasutatakse FRET-i kvantpunktide osalemisega. See efekt toimib üksnes Försteri raadiuse vahemikus (tüüpiline skaala kuni 10 nM) ning viimane määratleb analüüsisubstraadil mõõdetud kihi paksuse. Mitmekihilised nanostruktuurid , mis koosnevad analüüsisubstraadi inertsele tahkele pinnale ühendatud vahelüliga fikseeritud kvantpunktist ja on keemiliselt seotud sensori makromolekuliga ana-

lüüdi suhtes spetsiifilise sidumiskohaga, mis on pöörduvalt ühendatud analüüdi analoogi molekuliga, millega on seotud märgistatud värvaine märgis, annavad kvantpunkti ja värvaine märgise vahelise kauguse Försteri raadiuse ulatuses.

Eelistatud teostuste kohane tuvastamismeetod toimib järgmisel viisil . Esialgses faasis annab analüüsisubstraat fluorestsentsi voolu FRET-efekti kohaselt. Kui uuritav vedelik, mis sisaldab analüüdi molekule, lisatakse analüüsisubstraadile, siis tõrjutakse analüüdi analoogi molekul analüüdi poolt mitmekihilisest nanostruktuurist välja. Selline väljatõrjumine peatab FRET-efekti. Fluorestsentsi voolu muutus registreeritakse optilise seadme abil ja seda kasutatakse analüüdi kontsentratsiooni kindlaks määramiseks.

Funktsionaalselt aktiivne analüüsisubstraat moodustatakse kahe eespool mainitud koostisosa kombineerimise teel ning need kaks koostisosa moodustavad substraadi pinnal kompleksi. Selline kompleks viib esimese fluorestsentsmarkeri teise fluorestsentsmarkeri lähedale, muutes nende fluorestsentsmarkerite vahelise kauguse Försteri raadiusest lühemaks, et võimaldada nende vahel FRET-efekti iseloomulikus spektraalses vahemikus. Sellist kompositsiooni nimetatakse sensorsüsteemiks analüüsisubstraadi esialgses faasis. Selline QD ja fluorestsentsvärvi lähedus on teine funktsionaalne nõue, kui värvaine molekuliga märgistatud analüüdi analoogi molekul paigutatakse sensormolekuli.

Kui esialgses faasis olevat analüüsisubstraati, millele on lisatud vedel proov, valgustatakse (ergastatakse) valgusega, siis sobitatakse spektraalselt esimese fluorestsentsmarkeri ergastusspektrit, ning energia ülekanne teise fluorestsentsmarkerisse toimub FRET-efekti tõttu, indutseerides teise markeri fluorestsentsi, ja täheldatud analüüsisubstraadi fluorestsents vastab teise fluorestsentsmarkeri spektraalkarakteristikutele. Sellele osutatakse kui analüüsi lähtepunktile.

Kui analüüdi molekulid on uuritavas proovis olemas, siis konkureerivad need molekulid pöörduvalt seotud analüüdi analoogi molekulidega (analüüsisubstraadi teise koostisosaga) sensormolekulil (analüüsisubstraadi esimene koostisosa) olevate selektiivsete sidumiskohtade osas ning asendavad aja jooksul sensormolekuli sidumiskohtadel olevad analüüdi analoogi molekulid, seega toimub analüüdi analoogi molekulide substraadi pinnalt välja tõrjumine aja jooksul. Selle tulemusel suureneb kahe fluorestsentsmarkeri, näiteks pinnaga seotud QD ja fluorestsentsmärgisega seotud analüüdi analoogi vaheline kaugus ja ületab Försteri raadiuse ning see lülitab FRET-efekti välja. Seejärel vastab vedela prooviga analüüsisubstraadi täheldatud fluorestsents vaibuvast FRET-efektist tingitud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi vähenemisele aja jooksul. FRET-i signaali vähenemise määr määratakse kindlaks proovis sisalduva analüüdi kontsentratsiooni abil ning seda vähenemist kasutatakse uuritavas proovis analüüdi kontsentratsiooni arvutamiseks. Kuna analüüdi kontsentratsiooni saamiseks kasutatakse registreeritud fluorestsentsi suhtelist vähenemist aja jooksul selle esialgsest väärtusest, siis puudub vajadus seadme kohandamise järele.

Eelistatud teostuses pakutakse vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamise ja kvantifitseerimise meetodit, kasutades selle spetsiifilist interaktsiooni sensormolekulide selektiivsete sidumiskohtadega koos sellise interaktsiooni edasise mõõtmisega FRET-efekti alusel. Nimetatud meetod hõlmab allpool määratletud etappe.

Esialgses faasis etapis 1 kantakse nimetatud orgaanilisi analüüte sisaldav vedelikuproov analüüsisubstraadiie, mis sisaldab vähemalt ühte kahe interakteeruva koostisosa komplekti:

nimetatud esimene koostisosa hõlmab esimese fluorestsentsmarkeriga märgistatud sensormolekuli ning nimetatud marker on immobiliseeritud analüüsisubstraadi pinnale ühendatud vahelüliga, kus nimetatud sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht uuritava analüüdi jaoks;

kus nimetatud sensormolekul on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga sidumispositsioonis, kus nimetatud valitud esimene märgistav fluorestsentsmarker ei avalda mingit mõju analüüdi seondumisele selle sidumiskohaga;

nimetatud teine koostisosa hõlmab teise fluorestsentsmarkeriga seotud analüüdi keemilist analoogi ja see on seotud nimetatud esimese koostisosaga;

kus esimese ja teise koostisosa kompositsioon on valitud selliselt, et esimene fluorestsentsmarker viiakse teise fluorestsentsmarkeri lähedale, nii et nimetatud fluorestsentsmarkerite vaheline kaugus on lühem kui Försteri raadius, et võimaldada nende vahel FRET-efekti toimumist , nimetatud kompositsioon vastab analüüsisubstraadi esialgsele faasile.

Esialgses faasis etapis 2 , mis järgneb vahetult orgaaniliste analüütide analüüsisubstraadile kandmise etapile, valgustatakse (ergastatakse) nimetatud analüüsisubstraati valgusega, mis on spektraalselt sobitatud esimese fluorestsentsmarkeri ergastusspektriga, ning teise fluorestsentsmarkeri energia ülekanne FRET-efekti

tõttu , mis indutseerib teise markeri fluorestsentsi, tuvastatakse ja fluorestsentsi intensiivsus registreeritakse , nimetatud analüüsisubstraadi tuvastatud fluorestsents esialgses faasis vastab teise fluorestsentsmarkeri spektraalkarakteristikutele.

Järgnevas faasis etapis 3 korratakse eelnevalt kindlaks määratud ajavahemiku jooksul nimetatud ergastamist ja tuvastamist eelnevalt kindlaks määratud intervallide tagant ja igal korral registreeritakse tuvastatud fluorestsentsi intensiivsus, võimaldades nimetatud eelnevalt kindlaks määratud ajavahemiku jooksul analüüsisubstraadile kantud vedelas proovis analüüdi olemasolul nimetatud analüüdi analoogi molekulide asendamist sensormolekulide sidumiskohtadel analüüdi molekulidega. Sellise asendamise tulemusel suureneb kahe fluorestsentsmarkeri vaheline kaugus Försteri raadiusest pikemaks, põhjustades FRET-efekti vaibumist aja jooksul.

Etapis 4 arvutatakse / määratakse kindlaks analüüdi kogus vedelikuproovis nimetatud eelnevalt kindlaks määratud ajavahemike tagant registreeritud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi intensiivsuse vähenemisena , kus nimetatud teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi vähenemine aja jooksul on tingitud FRET-efekti vaibumisest, ning kus sellise vähenemise määr vastab vedelikuproovis sisalduva ana-

lüüdi kogusele.

Eelistatult on nimetatud sensormolekul valitud looduslikult esinevate või sünteesitud molekulide hulgast, sealhulgas mittepiiravalt valkude ja oligonukleotiidide hulgast.

Eelistatult on nimetatud esimene fluorestsentsmarker kvantpunkt (QD), millel on fluorestsentsi kiirgusspekter, mis sobib teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ergastamiseks.

Eelistatult on nimetatud teine fluorestsentsmarker fluorestsentsvärv, millel on iseloomulik fluorestsentsi kiirgusspekter, mis erineb esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist.

Eelistatult viiakse kõik nimetatud mõõtmised läbi vedelikuproovi õhukeses kihis, kus nimetatud vedela proovi interaktsiooni pindmise kihi paksus analüüsisubstraadil on piiratud Försteri raadiuse füüsilise piirangu kohaselt (piiratud sellega).

Eelistatult viiakse nimetatud vedela proovi mõõtmised läbi ilma nimetatud kasutatud proovi mis tahes ettevalmistuseta ja/või eeltöötluseta.

Eelistatud teostuse kohaselt on välja pakutud ka analüüsisubstraat vedelas proovis erinevate orgaaniliste analüütide tuvastamiseks ja kvalifitseerimiseks, nimetatud analüüsisubstraat koosneb substraadi pinnale kantud mitmekihilistest nanostruktuuridest.

Nimetatud substraadi pind on tahke ja keemiliselt inertne.

Nimetatud mitmekihiliste nanostruktuuride kihid sisaldavad vähemalt ühte keemiliselt seotud esimest fluorestsentsmarkerit sensormolekuliga ja analüüdi analoogi molekuli, millega nimetatud teine fluorestsentsmarker on seotud.

Eelistatult on nimetatud esimene fluorestsentsmarker kvantpunkt (QD), millel on fluorestsentsi kiirgusspekter, mis sobib teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi ergastamiseks.

Eelistatult on nimetatud teine fluorestsentsmarker fluorestsentsvärv, millel on iseloomulik fluorestsentsi kiirgusspekter, mis erineb esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist.

Eelistatult on nimetatud teine fluorestsentsmarker fluorestsentsvalk, millel on iseloomulik fluorestsentsi kiirgusspekter, mis erineb esimese fluorestsentsmarkeri fluorestsentsspektrist.

Esimese eelistatud teostuse kohaselt sisaldab nimetatud analüüsisubstraat spetsiifiliselt määratletud analüütilist kompositsiooni, mis moodustab sensorsüsteemi ühe analüüdi mõõtmiste tegemiseks.

Teise eelistatud teostuse kohaselt sisaldab nimetatud substraat mitut analüütilist

kompositsiooni mitme analüüdi samaaegsete mõõtmiste tegemiseks.

Kolmanda eelistatud teostuse kohaselt on nimetatud analüüsisubstraat valmistatud ühekordselt kasutatava kiibina.

Neljanda eelistatud teostuse kohaselt on nimetatud analüüsisubstraat konfigureeritud võtma mõõtmiste tegemiseks vastu mitte rohkem kui ühe mikroliitri suuruses mahus proovi.

Leiutise eelistatud teostus hõlmab ka vedelas proovis analüüdi mõõtmiste tegemiseks mõeldud seadet.

Analüüdi tuvastamiseks mõeldud seade hõlmab lisaks analüüsisubstraadile ka järgmisi komponente:

- valgusallikas, mille valguskiir on eelnevalt valitud kiirgamise lainepikkusel analüüsisubstraadi fluorestsentsi indutseerimiseks;

analüüsisubstraadi kambrike vedela proovi sisestamiseks ja mõõtmiseks;

optoelektrooniline detektor FRET-efektist põhjustatud fluorestsentsi registreerimiseks;

- juht-, töötlemis- ja sidevahend mõõtmiste kontrolli all hoidmiseks, analüüdi kontsentratsiooni kindlaks määramiseks ja tulemustest teatamiseks.

Leiutisekohase meetodi läbiviimiseks on välja pakutud seade vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, kasutades nimetatud orgaanilise analüüdi spetsiifilist interaktsiooni sensormolekuiide seiektiivsete sidumiskohtadega, mis põhineb fluorestsentsi resonantsenergia ülekande efektil.

Nimetatud seade, mis on mõeldud vedelas proovis analüüdi mõõtmiste tegemiseks eelistatud teostuse kohaselt, sisaldab valgusallikat, proovikambrikest, optoelektroonilist detektorit, juht-, töötlus- ja sidevahendit.

Nimetatud mõõtmiste tegemiseks mõeldud proovikambrike on konfigureeritud võtma vastu analüüsisubstraati, mis kannab mikrokoguses nimetatud analüüsisubstraadile kantud vedelat proovi.

Nimetatud valgusallika kiirgusspekter on valitud selliselt, et indutseerida nimetatud analüüsi kambrikesel kvantpunktide fluorestsentsi.

Nimetatud optoelektrooniline detektor on seadistatud tuvastama kvantpunktist nimetatud markerile energia ülekande teel indutseeritud sensormolekuli fluorestsentsmarkeri fluorestsentsi.

Nimetatud juht- ja töötlusvahend on seadistatud registreerima nimetatud tuvastatud fluorestsentsi ajakõverat aja jooksul, et tuletada analüüdi kontsentratsiooni.

Nimetatud sidevahend on seatud väljastama mõõtmiste tulemusi.

Seadme esimese eelistatud teostuse kohaselt võimaldab nimetatud seadme nimetatud optiline skeem fluorestsentsi mõõtmiste tegemist analüüsisubstraadil olevast ühest kompositsioonist.

Seadme teise eelistatud teostuse kohaselt võimaldab nimetatud seadme nimetatud optiline skeem fluorestsentsi mõõtmiste tegemist analüüsisubstraadil olevast mitmest analüütilisest kompositsioonist.

Seadme eelistatud teostuse kohaselt võimaldab töötlusvahend toimingu juhtimist ja signaali töötlemist, et tuletada analüüdi kontsentratsioon registreeritud fluorestsentsi suhtelisest vähenemisest aja jooksul selle esialgsest väärtusest.

Seadme eelistatud teostuse kohaselt on anaLüüsisubstraadile kantud nimetatud vedela proovi interaktsiooni pindmise kihi paksus piiratud Försteri raadiuse füüsilise piirangu kohaselt (piiratud sellega).

Lõpetuseks on kirjeldatud meetodi vedelas proovis otsitava aine ( target substance) kindlaks määramiseks järgmised iseloomulikud omadused.

1. Tuvastamisprotseduuri selektiivsus ja tundlikkus on kindlaks määratud sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga, ning kui analüüsisubstraadis on kasutatud looduslikult esinevaid sensormolekule, st valke ja oligonukleotiide, siis saavutatakse selektiivsus ja tundlikkus, mis vastab relevantsetele (tähendusrikastele) analüüdi tasemetele vastavates proovides.

2. Tuvastataval fluorestsentssignaalil , mida põhjustab FRET-efekt, on spetsiifiline kiirgusspekter, ning seda saab hõlpsasti eraldada QD fluorestsentskiirgusest ja see peatatakse täielikult värvainega märgistatud analüüdi analoogi molekuli selle kompleksist sensori makromolekuliga väljatõrjumise teel.

3. FRET-i kiirguse range lokaliseerimine analüüsisubstraadi pinnale vähendab takistusi , mida põhjustavad vedela proovi optilised omadused , muudab tuvastamise proovi mahust sõltumatuks ja kõrvaldab vajaduse proovi töötlemise järele.

4. Suhtelise fluorestsentsi mõõtme muudab nimetatud seadme mis tahes analüüsisubstraadi saasteaine mittespetsiifilise adsorptsiooni suhtes tundetuks.

5. Analüüsi jaoks vajatakse kõigest ühe mikroliitri suuruses mahus proovi.

6. Vedela proovi tuvastamiskihi paksus on füüsiliselt piiratud Försteri raadiusega ja see ei sõltu proovi keskkonna optilistest omadustest.

7. Ühe või mitme analüüdi tuvastamist on võimalik saavutada analüüsisubstraadiga, millel on vastavalt üks või mitu analüütilist kompositsiooni.

8. Analüüsisubstraat interakteerub vedelikuprooviga ja seega on sellel ühekordse kasutusega kujundus.

9. Analüüsi tehakse ühe etapina ilma vajaduseta proovi ettevalmistamise ja vedela proovi omaduste kontrollimise järele.

10. Tuvastamine ei ole tundlik lisandite, suspendeeritud tahkete ainete, viskoossuse või proovi läbipaistmatuse suhtes.

11. Süsteem ei vaja standardsete proovi lahustega kohandamist ja kalibreerimist.

12. Tuvastamine ei ole tundlik mis tahes saasteainete substraadi pinnale mittespetsiifilise adsorptsiooni suhtes.

Analüüsisubstraat on üles ehitatud mitmekihilise struktuurina , kus keemiliste koostisosade erinevad kihid on lisatud üksteise peale , alustades substraadi pinnast (joonis fig 1 ). Pinna materjal peaks olema hõlpsasti töödeldav, et võimaldada soovitud kuju ja paksuse moodustamist, peaks võimaldama selle fikseerimist substraadi põhiosa külge ja peaks kandma keemiliselt aktiivseid rühmi analüüsi koostisosade kovalentseks sidumiseks. Selline materjal võib olla õhuke vilgukiviplaat, mida saab hõlpsasti töödelda sileda pinnaga õhukesteks plaatideks, on optiliselt läbilaskev peaaegu UV-piirkonnas ja selle pinda saab keemiliselt modifitseerida. Vilgukivi mit

mekihiline struktuur on oluline identsete omadustega substraatide valmistamiseks.

Analüüsisubstraadi kujundamiseks saab kasutada ka kvartsklaasi, ka sellel on pindmised hüdroksüülrühmad, mida saab kasutada selle materjali keemiliseks modifitseerimiseks, ja selle optiline läbipaistvus on peaaegu täielik. Kuna see materjal on mehaaniliselt habras, siis tuleb selle materjali töötlemiseks kasutada keerukaid meetodeid, mis muudavad selle kasutamise viigukiviga võrreldes kalliks ja keeruliseks.

Käesoleva patenditaotluse puhul on universaalne lahendus plastide kasutamine. Neid materjale saab hõlpsasti töödelda, et saada vajalik kuju kontrollitud paksusega, ja nende pindmised rühmad võivad toimida vahelülidena edasiseks keemiliseks modifitseerimiseks, ning on olemas paljusid plaste, millel on erinev pindmiste rühmade kompositsioon. Plastide optilised omadused on tugevalt seotud nende keemilise koostisega, kuna aromaatsed tsüklid ja suured konjugeeritud struktuurid võivad tugevalt absorbeerida UV-kiirgust. Kuid on veel mitmeid materjale, mida võib kasutada käesoleva patenditaotluse jaoks analüüsisubstraatide kujundamiseks, näiteks polü(metüülmetakrülaat) (PMMA) ja selle derivaadid.

Pärast substraadi materjali valimist tuleks pinna keemilist töötlemist teha koos funktsionaalsete rühmade aktivatsiooniga. Kuna valitud materjali pind võib olla määrdunud ja saastunud, tuleks läbi viia selle materjali puhastamise protsess, kasutades selleks tõhusaid mehaanilisi või elektrilisi meetodeid ja/või lahustitega pesemist.

Vilgukivi või kvartsklaasi pindmiste rühmade aktiveerimiseks töödeldakse neid materjale 1 M vesinikkloriidhappega tund aega kõrgemal temperatuuril umbes 50 °C. Pärast kahekordselt destilleeritud veega pesemist kuivatatakse seda materjali 12 tundi temperatuuril 110-120 °C, et eemaldada materjali pooridest kogu niiskus. Plaste, mis ei ole kõrge temperatuuri suhtes vastupidavad, kuivatatakse vaakumis.

Substraadi aktiveeritud ja puhastatud pinda töödeldakse (3-aminopropüül)trimetoksüsilaani (APTMS) 20% lahusega 20% tolueenis 12 tundi toatemperatuuril. See reaktsiooniaeg on piisav, et moodustada substraadi pinnale äärmiselt reaktiivsete rühmade kiht (19, joonis fig 1), mida kasutatakse reaktsioonisaitidena vahelüli jaoks, mis kinnitatakse analüüsisubstraadi mitmekihilise struktuuri järgmisele kihile.

Pinna mittehomogeensused võivad põhjustada reaktiivsete rühmate laiguti jaotumist ning seega mõjutada järgmise kihi ruumilisi omadusi , piirates potentsiaalselt sellel olevate sensorsüsteemide tihedust ja kontsentratsiooni. Selleks, et kõrvaldada pinna mittehomogeensuste sellist mõju sensorsüsteemide immobiliseerimisele, kaetakse substraadi pind (1 ) polümeerikihiga , mis sisaldab polümeeri vahelüli (20), näiteks PEG-i , mida iseloomustab kõrge keemiline stabiilsus ja millel on reaktiivsed rühmad järgmise kihi bipolaarse vahelüli (21) sidumiseks. Vahelüli molekulide (21 ) keemiline koostis sõltub järgmise struktuurse kihi keemilisest olemusest. Üldiselt peaks sellel bipolaarsel vahelülil olema kaks reaktsioonirühma. Üks rühm on vajalik selle kovalentseks sidumiseks substraadi materjali silaniseeritud pinnaga polümeerkihi (20) kaudu. Teine rühm on vajalik kvantpunktidega (2) ühendatud funktsionaalsete rühmadega (22) seondumiseks. Kõrvalreaktsioonide vältimiseks vahelüli teine rühm kaitstakse ja seda saab kaitsest vabastada pärast esimese vahelüli rühma reaktsiooni substraadi pinnaga.

Järgmine struktuurne rühm koosneb immobiliseeritud kvantpunktidest (2). See immobiliseerimisreaktsioon sõltub kvantpunktide pinnale kantud keemiliste rühmade (22) olemusest, et minimeerida nende osakeste lahuses agregeerumise võimalust. Selliste funktsionaalsete rühmade ülesanne on kvantpunktide sidumine erinevate sensormolekulidega (8) ning nende funktsionaalsete rühmade keemiline struktuur määrab kindlaks sensorsüsteemi sünteesimiseks kasutatava strateegia.

Osal juhtudel võib olla võimalik asendada kvantpunktid orgaanilise fluorofoori või fluorestsentsvalkudega ja endiselt omada võrreldavat fluorestsents kvantvälja. Kuid sellise kvantpunktide asendamisega kaasnevad järgmised piirangud. Esiteks ei ole võimalik luua multivalentset fluorofoori, mis oleks suuteline siduma samaaegselt mitut sensormolekuli. Teine komplikatsioon on seotud orgaaniliste fluorestsentsvärvide või -valkude ergastus- ja kiirgusspektrite osalise kattumisega. Seega võib sellise fluorofooriga asendamisega kaasneda väga kitsa ergastusriba nõue ja vajadus impulssrežiimi kasutamise järele. Neid puudusi võimaldavad vältida kvantpunktide spektraalkarakteristikud.

Kuna järgmine näide kirjeldab kvantpunktide kasutamist, mille pinnal on karboksüülrühmad , siis immobiliseeritakse need osakesed substraadi pinnale amiidsideme kaudu. Seega on vahelüli molekuli teine funktsionaalne rühm aminorühm. Nagu on amiidi moodustamise reaktsioonide puhul tavaline , aktiveeritakse karboksüülrühmad EDC ja NSH lisamise teel, et aidata viia sidumisreaktsioon lõpule tunni aja jooksul toatemperatuuril. Näites kasutatud kvantpunkte iseloomustab fluorestsentskiirgus lainepikkusel 540 nm (roheline).

Analüüsisubstraadile järgmise struktuurse kihi moodustamiseks modifitseeriti kvantpunkte lisaks funktsionaalse vahelüliga (23). Kuna kvantpunktide karboksüülrühmi, mis olid jäänud struktuurse kihi välispinnale, kasutati teise vahelüliga sidumiseks amiidsideme moodustamise kaudu, on funktsionaalse vahelüli esimene funktsionaalne rühm uuesti aminorühm.

Selleks, et vähendada immobiliseeritud kvantpunktide lagunemist funktsionaalse vahelüliga toimuva reaktsiooni ajal, viidi see sidumine läbi veevabas reaktsioonikeskkonnas, näiteks DMFA-s. Selle reaktsiooni jaoks töödeldakse immobiliseeritud kvantpunkte sisaldavat substraati aktivaatoriga ja seejärel pannakse reageerima vahelüliga. See sidumisreaktsioon viiakse lõpule 30 minuti jooksul toatemperatuuril ning liigsed reaktiivid saab eemaldada substraatide pesemise teel.

Funktsionaalse vahelüli teine funktsionaalne rühm sõltub analüüsisubstraadi sensormolekuli (8) funktsionaalse rühma struktuurist. See sensormolekul on seotud substraadi mitmekihilise struktuuri väliskihiga ja see muudab substraadi spektrit selle analüüdiga toimuva spetsiifilise interaktsiooni tõttu. Seda muutust jälgitakse seadme abil ja seda kasutatakse analüüsisubstraadil oleva analüüdi kontsentratsiooni arvutamiseks.Kuna erinevate analüütide puhul tuleb kasutada erinevaid sensormolekule, peaks nende molekulide sidumiseks kasutatav funktsionaalne vahelüli võimaldama teise funktsionaalse rühma suurt varieerumist.

Kuigi selle analüüsi jaoks võib kasutada erinevaid sensormolekule, sealhulgas polümeerseid struktuure või biopolümeere, peaks kõigil nendel sensormolekulidel olema mitu ühist omadust: need peaksid spetsiifiliselt interakteeruma analüüdiga ning selline interaktsioon peaks muutma analüüsisubstraadi fluorestsentsspektrit. Analüüsisubstraadi ettevalmistamise kõikide etappide skemaatiline illustratsioon on näidatud joonisel fig 1 koos fotodega saadud substraadist, mida on kiiritatud UV-valgusega lainepikkusel 312 nm. Esialgne substraadi materjal fotol (a) on täielikult läbipaistev ja see ei paku mis tahes valguskiirgust UV-ergastamisel, samas kui nähtav fluorestsents (rohelist värvi), mis on tingitud substraadile immobiliseeritud QDst, fotodel (b) ja (c) kinnitab, et kirjeldatud protseduuri abil saadud mitmekihilisel struktuuril on vajalikud spektraalkarakteristikud ja keemilised omadused.

FRET-efekti iseloomustamiseks samal analüüsisubstraadil konstrueeritakse mudelsüsteem, nagu on illustreerivalt näidatud joonisel fig 2, kus fluorestsentsvärv 5(6)-karboksütetrametüül-rodamiin (TAMRA) (5) on seotud oligopeptiidiga ja seejärel on see seotud immobiliseeritud kvantpunktidega vahelüliga (4). Kuna selle värvi ergastamise lainepikkused on samasugused nagu kasutatud kvantpunktide kiirguse lainepikkused (530-540 nm), siis võib selles mudelsüsteemis täheldada FRET-efekti.

Joonise fig 3 on võrreldud joonise fig 2 kohase analüüsisubstraadi fluorestsentsspektreid immobiliseeritud TAMRA-ga ja ilma selle värvaineta. Selgelt on näha, et immobiliseeritud kvantpunktidega substraat kiirgab nähtavat rohelist värvi (maksimaalne spektraalne intensiivsus 540 nm), samas kui substraat, mis kannab ka immobiliseeritud värvaine molekuli, on oranži värvi, mis vastab TAMRA puhul kiirguse lainepikkusele 580 nm.

Seda fluorestsentsspektri osas toimuvat muutust on üksikasjalikult iseloomustatud eelistatud teostuses kirjeldatud seadme abil. Mõlemal juhul kasutati ergastamist lainepikusel 360 nm. Immobiliseeritud kvantpunktidega substraatide puhul täheldati kiirguse piiki lainepikkusel 540 nm ning lainepikkusel 580 nm väheneb see kiirguse intensiivsus rohkem kui 10 korda, st vastab 10% maksimaalsest kiirguse intensiivsusest (joonis fig 3a).

Immobiliseeritud TAMRA-ga substraadi maksimaalset intensiivsust on näidatud joonisel fig 3b. Selle kombinatsiooni maksimaalset fluorestsentsi intensiivsust täheldatakse lainepikkusel 580 nm, samas kui kiirguse intensiivsus lainepikkusel 540 nm on piigi väärtusest 5 korda väiksem. Järelikult on kvantpunkti kiirguse mõju TAMRA kiirguse peamisele piigile ligikaudu 2%. See madal panus välistab vea kuhjumise võimaluse ja seda saab arvutuste tegemisel hõlpsasti arvesse võtta.

Kasutada võib fluorestsentsi analüüdi kontsentratsiooni kindlaksmääramise meetodit, mis hõlmab fiuorestsentsvärviga märgistatud analüüdi analoogi sidumiskohast väljatõrjumist. Selle meetodi puhul küllastatakse sensormolekuli sidumiskohad eelnevalt fluorestsentsi reporter-ligandiga ning analüüdi juuresolekul tõrjutakse see

fluorestsentsi ligand kompleksist välja, mis vähendab täheldatud FRET-efekti.

Seda väljatõrjumise skeemi on illustreerivalt kujutatud joonisel fig 4 ning signaali sõltuvust analüüdi kontsentratsioonist saab iseloomustada tuntud matemaatilise funktsiooni abil. Tuvastamine põhineb asjaolul, et analüüdi molekuli (6) üleviimine lähtelahusest substraadile immobiliseeritud sidumiskohta peatab FRET-efekti, mida jälgitakse seadme abil. Sellel eesmärgil on vahelüli (28), mis seob analüüdi analoogi (7) QD-ga, pikkus, mis on Försteri raadiusest suurem. See vahelüli ennetab väljatõrjutud analüüdi analoogi konkureerimist loodusliku analüüdiga teisel sensormolekulil (8) olevate selektiivsete sidumiskohtade osas. See minimeerib ümberpaigutamise vastandmõju, määrates seega kindlaks kineetika ja andes prognoositava tulemuse ümberpaigutamise meetodis.

Vahelüli (28) pikkust võib varieerida tingimusel, et selle minimaalne pikkus on valitud FRET-i paari puhul Försteri raadiusest suurem. Vahelüli (28) maksimaalne pikkus võib varieeruda soovitud rakenduse kohaselt. Osas teostustes on see maksimaalne pikkus piisavalt lühike, et vähendada analüüdi analoogi seondumist naabruses paikneva sidumata sensormolekuliga, nii et analüüdi analoogi selle vastava seotud sensormolekuliga ühinemise kiirus on suurem kui analüüdi analoogi naabruses paikneva sensormolekuliga, mis ei ole analüüdi analoogiga seotud, ühinemise kiirus. Osas teostustes on vahelüli (28) maksimaalne pikkus piisavalt lühike, et ennetada analüüdi analoogi seondumist naabruses paikneva sidumata sensormolekuliga.

Mitme analüüdi tuvastamiseks kasutatava sensorsüsteemi teostuse esimest valikut on näidatud joonisel fig 5. Ühendatud vahelüli kasutamine, mis koosneb polümeeri vahelülist (20) ja bipolaarsetest vahelülidest (21, 30), võimaldab immobiliseerida erinevate funktsionaalsete rühmadega (22) kvantpunkte (2, 29) samale substraadi pinnale. See omakorda võimaldab erinevate sensormolekulide (8, 31) sidumist pöörduvalt seotud analüüdi erinevate analoogidega (7, 32), mis on märgistatud erinevate fiuorestsentsmarkeritega (5, 33). Selle tulemusel konstrueeritakse mitme sensoriga süsteem substraadi pinnale proovis erinevate analüütide samaaegseks tuvastamiseks.

Mitme analüüdi tuvastamiseks kasutatava sensorsüsteemi teostuse teist valikut on näidatud joonisel fig 6. Selles kasutatakse QD (2) pinnale kantud keemiliste rühmade (22) tunnuseid. Selles teostuses seotakse erinevad sensormolekulid (8, 31,

34) QD-ga, millele järgneb pöörduvalt sidumine analüüdi erinevate analoogidega (7, 32, 35). Sellise sensorsüsteemi immobiliseerimine substraadi pinnale vahelüliga (20, 21) võimaldab kasutada erinevaid QD-sid, integreerides seeläbi esimese valiku tunnused teise valikusse, mille tulemusel saadakse laiendatud mitme sensoriga süsteem mitme analüüdi samaaegseks tuvastamiseks.

Sensorsüsteemi fluorestsentsi multispektraalne tuvastamine mõlema valiku kohaselt võimaldab erinevate analüütide eristamist samas analüüsisubstraadis.

Sidumisprotsessi ja signaali genereerimist on illustreerivalt kujutatud joonisel fig 7. Meediumina kasutatavas vedelikuproovis analüüdi puudumise korral jälgib detektor üksnes taustasignaali (joonis fig 7a). Kui pooled sidumiskohad on analüüdiga hõivatud, siis tuvastatakse pool maksimaalsest signaalist (joonis fig 7B), samas kui maksimaalne signaal vastab sidumiskohtade küllastusele (joonis fig 7C) ning edasist suurenemist analüüdi kontsentratsiooni osas ei ole võimalik tuvastada. Maksimaalse signaali absoluutne väärtus sõltub sidumiskohtade arvust. Tasakaalustatud süsteemi signaali skeemil analüüdi kontsentratsiooni kohta võib olla ka teatav lineaarne osa, samas kui analüüdi kõrgemates kontsentratsioonides tuleks skeemi kirjeldamiseks kasutada keerukamat funktsiooni.

Väljatõrjumise meetodi kasutamine laiendab märkimisväärselt analüütide nimekirja, mida saab kirjeldatud analüüsisubstraati kasutades tuvastada, kuna analüüdi molekuli analoogid võivad ka kompleksi välja tõrjuda. Kuid selline väljatõrjumine toimub erinevate kontsentratsioonivahemike juures ning seda saab kasutada analüüdi analoogi eristamiseks tõelisest analüüdist.

Mõõtmissüsteem hõlmab ainespetsialist analüüsisubstraati ja seadet substraadi spetsiifilise fluorestsentsi indutseerimiseks ja tuvastamiseks. Substraadi mitmekihiline kompositsioon määratleb süsteemi spetsiifilisuse märklauaks oleva analüüdi suhtes. Substraadi mitmekihilise kompositsiooni varieerimine võimaldab erinevate analüütide tuvastamist. Lisaks annab ühe analüüsisubstraadi seadistus erinevate mitmekihiliste kompositsioonidega võimaluse tuvastada proovis sisalduvaid erinevaid analüüte samaaegselt.

Analüüsisubstraadiga analüüdi tuvastamiseks mõeldud seadme plokkskeem on näidatud joonisel fig 8a. Nimetatud seade koosneb valgusallikast (9), millel on iseloomulik valguskiirgus (10) eelnevalt valitud lainepikkusel, et indutseerida analüüsisubstraadi (11) fluorestsentsi; analüüsisubstraadi kambrikesest (12), et sisestada ja mõõta analüüsisubstraati vedela prooviga; optoelektroonilisest detektorist (14), et registreerida FRET-efektist tingitud fluorestsentsi (13); töötlusvahendist, et hallata mõõtmisi; juhtvahendit (16), et määrata kindlaks analüüdi kontsentratsioon; ja sidevahendist (17), et edastada tulemus.

Valgusallika kiirguse (10) spektraalkarakteristikud vastavad QD või muud tüüpi esimese fluorestsentsmarkeri ergastusspektrile, et tagada edasine energia ülekanne analüüsisubstraadil (11) olevasse teise fluorestsentsmarkerisse FRET-efekti tõttu. Substraadikambrikese (12) optiliste paigutuste osa teostusi on kujutatud joonisel fig 8b. Analüüsisubstraadil (11) oleva teise fluorestsentsmarkeri fluorestsentskiirgust (13) tuvastatakse optoelektroonilise detektori (14) abil. Sellel detektoril võib olla ühe- või mitmekanaline paigutus. Kui analüüsisubstraat sisaldab mitut mitmekihilist struktuuri, mille eesmärk on osade analüütide samaaegne tuvastamine, siis võib kasutada mitmekanalilist detektorit. Sellises teostuses täidab iga kanal konkreetse analüüdi tuvastamise ülesannet. Töötlusvahendi (15) ülesanne on seadme käitamine ja analüüsisubstraadi fluorestsentsi intensiivsuse vähenemise mõõtmine aja jooksul joonisel fig 7 kujutatud skeemi kohaselt. Sidevahend (17) võimaldab käskluste traadiga või traadita kohaletoimetamist seadmesse ja mõõdetud andmete kohaletoimetamist välisesse juhtvahendisse (16), et tuletada analüüdi kontsentratsiooni nimetatud fluorestsentsi mõõdetud ajakõverast, ning nende edasiseks visualiseerimiseks ja säilitamiseks, ning sidevahend (18) võimaldab edastada andmeid välisele vastuvõtjale. Nimetatud juhtvahend (16) võib olla mittepiiravalt arvuti, paneelarvuti, tahvelarvuti, nutitelefon jne ning nimetatud väline vastuvõtja võib olla kaugserver, pilve andmebaas jne.

NÄIDE

Alljärgnev näide illustreerib siin kirjeldatud meetodite rakendatavust nende ulatust piiramata ning käsitleb analüüdi kontsentratsiooni kindlaks määramist, mis on vees lahustuv bioaktiivne molekul, kasutades selleks joonisel fig 9 illustreerivalt kujutatud väljatõrjumise meetodit.

Analüüsisubstraadi valmistamine

Valmistati reaktsioonisegu, mis koosnes järgmistest koostisosadest:

400 pl 10 mM boorhappe soolalahuse puhvrit, mis sisaldab 50 mM NaCl-i, pH 7,5; 25 pl QD suspensiooni (1 mg/ml) vees;

90 pl (3 mM) 1,6-diaminoheksaani;

7 pl 10 mM aptameeri, mis sisaldab karboksüülrühmi

15 pl EDC (20 mg/mi) ja NHS-i (1 mg/ml) segu.

See segu lisati vilgukiviketastele, mida oli eelnevalt (EtO)3Si(CH2)3NH2-ga modifitseeritud. Neidkettaid inkubeeriti reaktsiooniseguga tund aeg ning seejärel pesti neid veega ja kuivatati vaakumis. Substraadi sünteesimise lõpetamiseks immutati modifitseeritud vilgukivikettaid 10 mM fosfaatpuhvris, mis sisaldas 150 mM NaCl, ning spetsiifilist TAMRA-ga märgistatud analüüdi analoogi lisati kontsentratsioonis 4 pM.

30-minutilise toatemperatuuril inkubeerimise ajal seondus TAMRA-ga märgistatud analüüdi analoog aptameeriga ning see protsess viis lõpule analüüsisubstraadi mitmekihilise struktuuri moodustamise, mis sisaldab kovalentselt seotud QD ja aptameeri kihte, mis on pöörduvalt seotud analüüdi analoogiga TAMRA kompleksiga. Kuna QD ja TAMRA paiknesid sellel substraadil üksteisele lähedal, täheldati intensiivset FRET-efekti kiirgusspektri vahemikus 500-600 nm ergastamise lainepikkusel 320 nm. Kiirgusspektrid vastasid TAMRA fluorestsentsile, mille piigi intensiivsus oli lainepikkusel 580 nm.

Analüüsi protseduur

Valmistati analüüdilahus, mis sisaldab koostisosi, mis imiteerivad vere füsioloogilisi tingimusi. Lahuse pH stabiliseeriti vahemikus 7,0 kuni 7,5 fosfaatpuhvriga koos soolalahusega. Selleks, et imiteerida valgu koostisosade mõju, kasutati lõplikus lahuses veise seerumi albumiini kontsentratsioonis 6 g/dl. Analüüsimeetodi testimiseks lisati analüüdilahused kontsentratsioonides 100 nM ja 200 nM vilgukiviketastele ning tuvastati fluorestsentsspektri osas toimunud muutused. Need muutused peegeldavad TAMRA-ga märgistatud analüüdi analoogi väljatõrjumist selle immobiliseeritud aptameeriga moodustatud kompleksist analüüsisegus sisalduva analüüdi poolt. Selle väljatõrjumisega kaasneb TAMRA märgise lahkumine analüüsisubstraadi pinnalt, mis peatab FRET-efekti fluorofoori ja QD vahel.

See analüüs viidi läbi kahes režiimis. Esiteks vaadeldi FRET-efekti vähenemise ajalist kulgu ja jälgiti selle protsessi esialgset kiirust. Teiseks inkubeeriti süsteemi tasakaaluoleku saavutamiseni ning seejärel tuvastati FRET-i väärtus ja seda kasutati analüüsisüsteemi iseloomustamiseks.

FRET-efekti muutumise illustreerimiseks võrreldi QD kiirguse intensiivsust lainepikkusel 540 nm ja TAMRA kiirgust lainepikkusel 580 nm.TAMRA-ga märgistatud analüüdi analoogi väljatõrjumisega immobiliseeritud aptameeriga moodustatud kompleksist, mis käivitati proovis sisalduvate analüüdi molekulide juuresolekul, kaasnes FRET-efekti kadumine. Selle tulemusel vähenes TAMRA fluorestsents lainepikkusel 580 nm ja suurenes QD fluorestsents lainepikkusel 540 nm (26,27). Nende spektraalandmete analüüsi kokkuvõte on näidatud tabelis 1.

Tabel1.Doonori (QD, piigi kiirgus lainepikkusel 540 nm) ja aktseptori (TAMRA, piiki kiirgus lainepikkusel 580 nm) fluorestsentsi intensiivsuste suhe vastavatel lainepikkustel 540 nm ja 580 nm protsendina maksimaalsetest tasemetest.

TAMRA-ga märgistatud immobiliseeritud analüüdi analoogi väljatõrjumist immobiiiseeritud aptameeriga moodustatud kompleksist tuvastati ka TAMRA kiirgustaseme mõõtmise teel. Selle fluorestsentsi intensiivsuse muutused katsete ajal on näidatud tabelis 2. Esialgse väärtuseni normaliseeritud intensiivsused demonstreerisid selget vähenemist ajajooksul. Väljundsignaali platoo määrati kindlaks 5 minuti pärast analüüdi 200 nM kontsentratsioonis ja 15 minuti pärast 100 nM analüüdi lahuse puhul.

Tabel 2. TAMRA fluorestsentskiirguse intensiivsus lainepikkusel 580 nm. SPR

Kompleksi eraldumise esialgne kiirus, mille käivitas meediumina kasutatud proovis sisalduva analüüdi abil, arvutati spektraalsete muutuste ajalise kulu esialgse lineaarse osa kaldest. Need skeemid on näidatud joonisel fig 10. Mõõdetud kineetiiiste kõverate esialgsete osade kalded olid 100 nM ja 200 nM ligandi lahuste juuresolekul erinevad. Esialgsete kiiruste väärtused on loetletud tabelis 3. Kuna kineetilise analüüsi tulemused sõltuvad süsteemi tasakaaluoleku saavutamiseks kuluvast ajavahemikust, mis võib olla märkimisväärne analüüsi ebamäärasuse allikas, on kineetilise analüüsi tulemused usaldusväärsemad. Lisaks on neid tulemusi võimalik saada mitme minuti jooksu, mis lühendab analüüsi tegemiseks kuluvat aega. See aspekt on väga oluline väga tugevate analüütide analüüsimise korral, kuna enamik tugevatest interaktsioonidest substraadi ja analüüdi vahel on aeglased.

Tabel 3. Esialgse reaktsioonikiiruse kindlaks määramine konkureeriva analüüdi erinevate kontsentratsioonide kohta

Eespool kirjeldatud leiutis ei ole piiratud eespool kirjeldatud ja joonistel kujutatud teostustega, vaid nimetatud leiutis võib lisatud patendinõudluse ulatuses hõlmata ka teisi teostusi.

KASUTATUD KIRJANDUS

Alsager O. A., Kumar S., Willmott G. R., McNatty К. P., Hodgkiss J. M., „Small molecule detection in solution via the size contraction response of aptamer functionalized nanoparticles”, Biosens Bioelectron., 15, juuli 2014; 57:262-8. doi:

10.1016/j.bios.2014.02.004.

Buchberger W. W., „Current approaches to trace analysis of pharmaceuticals and personal care products in the environment", J Chromatogr A. , 28. jaanuar 2011 ;1218(4):603-18. doi: 10.1016/j.chroma.2010.10.040.

Couto R. A., Lima J. L., Quinaz M, B., „Recent developments, characteristics and potential applications of screen-printed electrodes in pharmaceutical and biological analysis”, Talanta , 1. jaanuar 2016;146:801-14. doi: 10.1016/j.talanta.2015.06.011.

Farre M., Petrovic M., Barcelo D., „Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples", Anal Bioanal Chem., veebruar 2007;387(4):1203-14.

Kodoyianni V., „Label-free analysis of biomolecular interactions using SPR imaging", Biotechniques., jaanuar 2011 ;50(1):32-40. doi: 10.2144/000113569.

Lakowicz J. R., „Principles of Fluorescent Spectroscopy”, 3. trükk, New York, NY: Springer, 2006. doi: 10.1007/978-0-387-46312-4

Lara F. J., Airado-Rodriguez D., Moreno-González D., Huertas-Perez J. F., Garcia-Campafia A. M., „Applications of capillary electrophoresis with chemiluminescence detection in clinical, environmental and food analysis. A review”, Anal Chim Acta., 24. märts 2016;913:22-40. doi: 10.1016/j.aca.2016.01.046.

Long F., Zhu A., Shi H., „Recent advances in optical biosensors for environmental monitoring and early warning”, Sensors (Basel), 15. oktoober 2013; 13(10) : 13928-48. doi: 10.3390/S131013928.

Nguyen B., Tanious F. A., Wilson W. D., „Biosensor-surface plasmon resonance: quantitative analysis of small molecule-nucleic acid interactions”, Methods., juuni 2007;42(2):150-61.

Petrovic M., Farre M., de Alda M. L., Perez S., Postigo C., Köck M., Radjenovic J., Gros M., Barcelo D., „Recent trends in the liquid chromatography-mass

spectrometry analysis of organic contaminants in environmental samples”, J ChromatogrA,, 18. juuni 2010;1217(25):4004-17. doi: 10.1016/j.chroma.2010.02.059. Staples C. A., Naylor C. G., Williams J. B., Gtedhill W.E., "Ultimate biodegradation of alkylphenol ethoxylate surfactants and their biodegradation intermediates”, Environ Toxicol Chem., november 2001; 20(11):2450-5.

Xu Y., Yang X., Wang E., "Review: Aptamers in microfluidic chips”, Anal Chim Acta. , 17. detsember 2010;683(1):12-20. doi: 10.1016/j.aca.2010.10.007.

Zhou D., Ying L, Hong X., Hall E. A., Abell C., Klenerman D., „A compact functional quantum Dot-DNA conjugate: preparation, hybridization, and specific label-free DNA detection”, Langmuir., 4. märts 2008;24(5):1659-64. doi: 10.1021/la703583u.

Claims (2)

1. 1.Seade vedelas proovis vähemalt ühe orgaanilise analüüdi tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, kasutades nimetatud orgaanilise analüüdi spetsiifilist interaktsiooni sensormolekulide selektiivsete sidumiskohtadega, mis põhineb fluorestsentsi resonantsenergia ülekande efektil, nimetatud seade sisaldab valgusallikat, proovikambrikest, optoelektroonilist detektorit, juht-, töötlus- ja sidevahendit, kus nimetatud valgusallika kiirgusspekter on valitud analüüsisubstraadil kvantpunktide fluorestsentsi indutseerimiseks, kus analüütide kontsentratsiooni tuletamiseks on nimetatud juhtja töötlusvahend seadistatud registreerima ajas iga sensorsüsteemiga tuvastatud fluorestsentsi ajakõverat, nimetatud sidevahend on seadistatud väljastama mõõtmiste tulemusi, mõõtmisteks ette nähtud proovikambrike on konfigureeritud vastu võtma mikrokoguses vedelat proovi kandvat analüüsisubstraati, mis erineb selle poolest, et analüüsisubstraadile on tekitatud esimest komponenti ja teist komponenti sisaldav analüüsisubstraadi pind, kus esimene komponent sisaldab esimese fluorestsentsmarkeriga märgistatud sensormolekuli, kus esimene fluorestsentsmarker on immobiliseeritud analüüsisubstraadi pinnale esimese bipolaarse vahelüliga, mis sisaldab esimest sidumisrühma esimese fluorestsentsmarkeri spetsiifiliseks sidumiseks ja teist sidumisrühma analüüsisubstraadi pinna spetsiifiliseks sidumiseks, kus sensormolekulil on spetsiifiline sidumiskoht orgaanilise analüüdi jaoks, nimetatud sensormolekul on märgistatud esimese fluorestsentsmarkeriga positsioonis, mis ei avalda mingit mõju spetsiifilise sidumiskohaga seonduvale orgaanilisele analüüdile; kus teine komponent sisaldab orgaanilise analüüdi keemilist analoogi, nimetatud keemiline analoog on märgistatud teise fluorestsentsmarkeriga, keemiline analoog on seotud esimese fluorestsentsmarkeriga teise vahelüliga, mille pikkus on Försteri raadiusest suurem, ning keemiline analoog seondub pöörduvalt esimese komponendi sensormolekuli spetsiifilise sidumiskohaga; analüüsisubstraadil on määratletud analüüsisubstraadi kambrike vedela proovi analüüsisubstraadi pinnale kandmiseks; nimetatud optoelektrooniline detektor on seadistatud tuvastama kvantpunktist nimetatud markerile energia ülekande teel indutseeritud teise fluorestsentsmarkeri fluo restsentsi; nimetatud optoelektrooniline detektor on seadistatud tuvastama selektiivselt analüüsisubstraadi pinnale immobiliseeritud erinevate sensorsüsteemide komplekti fluorestsentsi.
2. 2. Seade vastavalt nõudluspunktile 1, mis erineb selle poolest, et nimetatud esimene fiuorestsentsmarker on kvantpunkt (QD).