EA049816B1

EA049816B1 - Модулирующие т-клетки мультимерные полипептиды и способы их применения

Info

Publication number: EA049816B1
Application number: EA202191707
Authority: EA
Inventors: Рональд Д. Сайдел III; Родольфо Дж. Чапарро
Original assignee: Кью Биофарма, Инк.
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2025-05-07

Abstract

В данном изобретении предлагаются модулирующие Т-клетки мультимерные полипептиды, которые содержат иммуномодулирующий полипептид и которые содержат эпитоппрезентирующий пептид опухоли Вильмса. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид пригоден для модуляции активности Т-клеток, а также для модуляции иммунного ответа у индивидуума.

Description

Перекрестная ссылка

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/782167, поданной 19 декабря 2018 г., и предварительной заявке на патент США № 62/814684, поданной 6 марта 2019 г., данные заявки включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Вступление

Адаптационный иммунный ответ включает взаимодействие рецептора Т-клеток (TCR), присутствующего на поверхности Т-клеток, с небольшим пептидным антигеном нековалентно представленным на поверхности антиген-представляющей клетки (АПК) с помощью главного комплекса гистосовместимости (ГКГС; также называемого в организме человека как комплекс антигена лейкоцитов человека (HLA)). Это взаимодействие представляет собой механизм нацеливания иммунной системы и является необходимым условием для молекулярного взаимодействия модуляции Т-клеток (активации или ингибирования) и эффекторной функции. После эпитоп-специфического нацеливания клеток, Т-клеткимишени активируют посредством взаимодействия с костимулирующими белками, расположенными на АПК, с аналогичными костимулирующими белками Т-клеток. Оба сигнала, связывание эпитопа/TCR и взаимодействие АПК костимулирующих белков с костимулирующими белками Т-клеток, необходимы для управления Т-клеточной специфичностью и активации или ингибирования. TCR является специфическим для данного эпитопа; однако, костимулирующий белок не является эпитоп-специфическим и поэтому, как правило, экспрессируется на всех Т-клетках или на больших субпопуляциях Т-клеток.

Краткое описание изобретения

В данном изобретении предлагаются модулирующие Т-клетки мультимерные полипептиды (ТММР), включающие иммуномодулирующий полипептид и включающие эпитоп-презентирующий пептид опухоли Вильмса. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид пригоден для модуляции активности Т-клеток, а также для модуляции иммунного ответа у индивидуума.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1A-1F представлены схематические изображения различных ТММР по данному изобретению.

На фиг. 2A-2F представлены схематические изображения различных связанных дисульфидной связью ТММР по данному изобретению.

На фиг. 3А-3Е представлена аминокислотная последовательность полипептидов WT-1. Последовательности на фиг. 3А-3Е отображены в SEQ ID NO: 399-403, соответственно.

На фиг. 4А-4Е представлены аминокислотные последовательности типичных полипептидных цепей ТММР по данному изобретению. Последовательности типичных полипептидных цепей на фиг. 4А-4Е отображены в SEQ ID NO: 405-409, соответственно. Эпитопные последовательности отображены следующим образом: фиг. 4D: CMTWNQMNL (SEQ IDNO:266); фиг. 4Е: CYTWNQMNL (SEQ IDNO:267).

На фиг. 5A-5G представлены аминокислотные последовательности полипептидов Fc иммуноглобулина. Последовательности на фиг. 5A-5G отображены в SEQ ID NO: 410-421, соответственно.

На фиг. 6 представлено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей предшественников бета-2 микроглобулина (Р2М) (т.е. включая лидерную последовательность) из

Homo sapiens (NP 004039.1; SEQ ID NO: 19), Pan troglodytes (NP_001009066.1; SEQ ID NO: 19), Macaca mulatto (NP_001040602.1; SEQ ID

NO: 20), Bos taurus (NP_776318.1; SEQ ID NO: 21) и Mus musculus (NP_033865.2; SEQ ID

NO: 22).

Аминокислоты 1-20 представляют собой сигнальный пептид.

На фиг. 7А-7С представлены аминокислотные последовательности полноразмерных тяжелых цепей HLA человека из аллелей А*0101 (SEQ ID NO: 23), А*1101 (SEQ ID NO: 24), A*2402 (SEQ ID NO: 25) и А*3303 (SEQ ID NO: 26) (фиг. 7А); полноразмерная тяжелая цепь HLA человека из аллеля В*0702 (SEQ ID NO: 27) (фиг. 7В) и полноразмерная тяжелая цепь HLA-C (SEQ ID NO: 28) (фиг. 7С).

На фиг. 8 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей одиннадцати зрелых тяжелых цепей ГКГС I класса без их лидерных последовательностей, трансмембранных доменов и внутриклеточных доменов. Сверху вниз: SEQ ID NO: 41-51.

На фиг. 9А-9В представлено выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелой цепи HLA-A (фиг. 9A; SEQ ID NO: 198-206, соответственно) и консенсусной последовательности (фиг. 9В; SEQ ID NO: 29).

На фиг. 10А-10В представлено выравнивание аминокислотная последовательность тяжелой цепи HLA-B (фиг. 10A; SEQ ID NO: 207-213, соответственно) и консенсусной последовательности (фиг. 10В; SEQ ID NO: 30).

На фиг. 11А-11В представлено выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелой цепи HLA-C (фиг. 11А; SEQ ID NO: 214-222, соответственно) и консенсусной последовательности (фиг. 11В; SEQ ID NO: 31).

На фиг. 12 представлена консенсусная аминокислотная последовательность для каждой тяжелой цепи HLA-E, -F и -G (SEQ ID NO: 32-34, соответственно). Вариабельные аминокислотные (ак) положе- 1 049816 ния показаны в виде последовательно пронумерованных остатков X; положения аминокислот 84, 139 и 236 подчеркнуты двойной линией.

На фиг. 13 представлено выравнивание консенсусных аминокислотных последовательностей для HLA-A (SEQ ID NO: 35), -В (SEQ ID NO: 36), -С (SEQ ID NO: 37), -E (SEQ ID NO: 38), -F (SEQ ID NO: 39) и -G (SEQ ID NO: 40).

На фиг. 14A-14I представлены аминокислотные последовательности полипептидных цепей связанных двумя дисульфидными связями ТММР по данному изобретению. Последовательности полипептидных цепей на фиг. 14A-14I отображены в SEQ ID NO: 422-430, соответственно. Эпитопные последовательности отображены следующим образом: на фиг. 14В: VLDFAPPGA (SEQ id NO: 259); фиг. 14С

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 260);

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 264).

фиг. фиг.

14F:

14Н:

VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 259);

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 264);

фиг.

14G:

14I:

На фиг. 15 изображены данные по экспрессии и стабильности для WT1(37-45) эпитоп-содержащего по данному изобретению.

На фиг. 16 изображены данные по экспрессии и стабильности для WT1(126-134) эпитопсодержащего по данному изобретению.

На фиг. 17A-17D представлены схематические изображения связанного двумя дисульфидными связями ТММР по данному изобретению.

На фиг. 18А-18С представлены схематические изображения примеров конфигураций связанных дисульфидными связями ТММР по данному изобретению.

На фиг. 19 представлены схематические изображения примеров положений иммуномодулирующих полипептидов в ТММР по данному изобретению.

На фиг. 20A-20R представлены аминокислотные последовательности типичных полипептидных цепей ТММР по данному изобретению. Последовательности типичных полипептидных цепей на фиг. 20A20R отображены в SEQ ID NO: 431-448, соответственно. Эпитопные последовательности отображены следующим образом: на фиг. 20Н: CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 262); фиг. 20I CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 262);

фиг. 20J: CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 262);

CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 262);

NYMNLGATL (SEQ ID NO: 263);

NYMNLGATL (SEQ ID NO: 263).

фиг. фиг. фиг.

фиг. 20М: 20О: 20Q:

20K CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 262); фиг.

NYMNLGATL (SEQ ID NO: 263);

фиг. фиг. фиг.

20L:

20N:

20Р:

20R:

На фиг. 21 изображено влияние ТММР, содержащих эпитопы пептида WT1 и тяжелые цепи HLAA*02, при наращивании антиген-специфических Т-клеток CD8+.

На фиг. 22 изображено влияние ТММР, содержащих эпитопы пептида WT1 при наращивании WT1специфических Т-клеток CD8+ из общих РВМС в течение 8-дневного рестимулирующего культивирования после 10-дневного культивирования-примирования.

На фиг. 23 изображена продукция TNF-α и IFN-γ нарощенными WT1-специфическими Т-клетками CD8+ с содержащими WT1 37-45 ТММР, имеющими либо каркас G2C, либо R12C/G2C.

На фиг. 24 изображена продукция TNF-α и IFN-γ нарощенными WT1-специфическими Т-клетками CD8+ с содержащими WT1 126-134 ТММР, имеющими каркас R12C/G2C.

На фиг. 25 изображено влияние дисульфидных связей на IL-2-стимулируемую активацию иммунных клеток.

На фиг. 26 изображено влияние содержащего ТММР варианта IL-2, в качестве иммуномодулирующего полипептида, на пролиферацию CGLL-2, по сравнению с пролейкином.

На фиг. 27 изображено связывание 1715 + 2380 ТМРР с различными Fc-рецепторами.

Определения

Термины полинуклеотид и нуклеиновая кислота используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины - рибонуклеотидов, или дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает, без ограничения, единичные, двойные или множественные цепи ДНК или РНК, геномная ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания, или другие природные, химически, или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания.

Термины пептид, полипептид и белок используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме аминокислот любой длины, которая может включать кодирующие и некодирующие аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты и полипептиды, имеющие модифицированный пептидные каркасы.

Полинуклеотид или полипептид имеет определенный процент идентичности последовательности к другому полинуклеотиду или полипептиду, а это означает, что при выравнивании определенный процент оснований или аминокислот являются одинаковыми, и находится в том же относительном положении, при сравнении двух последовательностей. Идентичность последовательности может быть определена несколькими различными способами. Для определения идентичности последовательности, последова

- 2 049816 тельности могут быть выровнены с использованием различных удобных методов и компьютерных программ (например, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT и т.д.), доступны на сайтах интернет, включая ncbi.nlm.nili.gov/BLAST,ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/,ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafftcbrc.jp/aligHMent/software/. См., например, Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi. 215:403-10.

Термин консервативная аминокислотная замена относится к взаимозаменяемости в аминокислотных остатках белков, имеющим сходные боковые цепи. Так, например, группа аминокислот с алифатическими боковыми цепями состоит из глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; группа аминокислот, имеющих алифатические-гидроксильные боковые цепи, состоит из серина и треонина; группа аминокислот, имеющих амид-содержащие боковые цепи, состоящие из аспарагина и глутамина; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, состоит из фенилаланина, тирозина и триптофана; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, состоит из лизина, аргинина и гистидина; группа аминокислот, имеющих кислотные боковые цепи состоит из глутамата и аспартата, а группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, состоит из цистеина и метионина. Типичные консервативные группы замещения аминокислот представляют собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин-глицин и аспарагин-глютамин.

Термин иммунологический синапс или иммунный синапс, используемые в данном документе, как правило, относится к естественной границе взаимодействия между двумя взаимодействующими иммунными клетками адаптивного иммунного ответа, включая, например, границу взаимодействия между антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или клеткой-мишенью и эффекторной клеткой, например, лимфоцитом, Т-клеточным эффектором, натуральной клеткой-киллером, и тому подобным. Иммунологический синапс между АПК и Т-клеткой, как правило, инициируется взаимодействием рецептора антигена Т-клеток и молекулой главного комплекса гистосовместимости, например, как описано в Bromley et al., Annu Rev Immunol. 2001;19:375-96; содержимое которой включено в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

Т-клетка включает все типы иммунных клеток, экспрессирующих CD3, включая Т-клеткихелперы (клетки CD4'). цитотоксические Т-клетки (клетки CD8'). T-регуляторные клетки (Treg) и клетки NK-T.

Термин иммуномодулирующий полипептид (также упоминается как ко-стимулирующий полипептид), используемый в данном документе, включает полипептид на антиген презентирующей клетке (АПК) (например, дендритной клетке, В-клетке и тому подобном), которые специфически связывается с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом на Т-клетке, тем самым обеспечивая сигнал, который, в дополнение к основному сигналу, представленному, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с полипептидом главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), нагруженным пептидом, опосредует ответ Т-клеток, включая без ограничения, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Иммуномодулирующий полипептид может включать, без ограничения, CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, лиганд Fas (FasL), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), межклеточную молекулу адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, бетарецептор лимфотоксина, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, агонист или антитело, которое связывает рецепторлиганд Toll и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3.

Как уже отмечалось выше иммуномодулирующий полипептид (также называемый в данном документе как MOD) специфически связывается с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом на Т-клетке.

Иммуномодулирующий домен (MOD) TMMP по данному изобретению связывает когнатный коиммуномодулирующий полипептид, который может присутствовать на Т-клетке-мишени.

Гетерологичный, используемый в данном описании, означает нуклеотид или полипептид, который не найден в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно.

Термин рекомбинантный, используемый в данном описании, означает, что конкретная нуклеиновая кислота (ДНК или РНК) являются продуктом различных комбинаций клонирования, рестрикции, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или стадий лигирования, приводящих к конструкции, имеющей структурные кодирующие или некодирующие последовательности, отличные от эндогенных нуклеиновых кислот, найденных в природных системах. Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, могут быть собраны из фрагментов кДНК или из серии синтетических олигонуклеотидов, чтобы обеспечить синтетическую нуклеиновую кислоту, которая способна экспрессироваться из рекомбинантной транскрипционной единицы, содержащейся в клетке или в бесклеточной транскрипционной и трансляционной системе.

Термины рекомбинантный вектор экспрессии или конструкция ДНК используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения молекулы ДНК, содержащей вектор, и по меньшей мере одну вставку. Рекомбинантные векторы экспрессии, как правило, создаются с целью экспрессии и/или распространения инсерции (инсерций), или для конструирования других рекомбинантных нуклеотидных последовательностей. Инсерция (инсерции) может или не может быть функционально связана с последовательностью промотора, и могут или не могут быть функционально связана с регуляторными последовательностями ДНК.

- 3 049816

Используемый в данном описании, термин аффинность относится к равновесной константе для обратимого связывания двух агентов (например, антитела и антигена) и выражается в виде константы диссоциации (KD). Аффинность может быть по меньшей мере в 1 раз большей, по меньшей мере в 2 раза большей, по меньшей мере в 3 раза большей, по меньшей мере в 4 раза большей, по меньшей мере в 5 раз большей, по меньшей мере в 6 раз большей, по меньшей мере в 7 раз большей, по меньшей мере в 8 раз большей, по меньшей мере в 9 раз большей, по меньшей мере в 10 раз большей, по меньшей мере в 20 раз большей, по меньшей мере в 30 раз большей, по меньшей мере в 40 раз большей, по меньшей мере в 50 раз большей, по меньшей мере в 60 раз большей, по меньшей мере в 70 раз большей, по меньшей мере в 80 раз большей, по меньшей мере в 90 раз большей, по меньшей мере в 100 раз большей или по меньшей мере в 1000 раз большей или более чем аффинность антитела для несвязанных аминокислотных последовательностей. Аффинности антитела к белку-мишени может составлять, например, от около 100 нМ (нМ) до около 0,1 нМ, от около 100 нМ до около 1 пикомоль (пМ), или от около 100 нМ до около 1 фемтомоль (фМ) или более. Используемый в данном описании, термин авидность относится к сопротивлению комплексов двух или более агентов диссоциировать после разбавления. Термины иммунореактивный и преимущественно связывается используются здесь взаимозаменяемо по отношению к антителам и/или их антигенсвязывающим фрагментам.

Термин связывание, используемый в данном описании (например, со ссылкой на связывание модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида (ТММР) с полипептидом (например, рецептором Тклеток) на Т-клетке), относится к нековалентному взаимодействию между двумя молекулами. Нековалентное связывание относится к прямой связи между двумя молекулами, из-за, например, электростатического, гидрофобного, ионного и/или взаимодействия водородных связей, в том числе взаимодействий, такие как водные мосты и солевые мосты. Взаимодействие нековалентного связывания, как правило, характеризуется константой диссоциации (KD), равной менее чем 10^-6 М, менее чем 10^-7 М, менее чем 10^-8М, менее чем 10^-9 М, менее чем 10^-10 М, менее чем 10^-11 М, менее чем 10^-12 М, менее чем 10^-13 М, менее чем 10^-14 М или менее чем 10^-15 М. Аффинность относится к силе нековалентного связывания, повышенная аффинность связывания коррелирует с более низкой KD. Специфическое связывание обычно относится к связыванию с аффинностью, равной по меньшей мере, около 10^-7 М или более, например, 5х10^-7 М, 10^-8 М, 5х10^-8 М, 10^-9 М и более. Неспецифическое связывание обычно относится к связыванию (например, связывание лиганда с молекулой, отличной от его назначенного сайта связывания или рецептора) с аффинностью менее чем около 10^-7 М (например, связывание с аффинностью, равной 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М). Тем не менее, в некоторых контекстах, например, связывание между TCR и пептидом/комплексом ГКГС специфическое связывание может находиться в диапазоне от 1 мкМ до 100 мкМ, или от 100 мкМ до 1 мМ. Ковалентное связывание или ковалентная связь, используемая в данном описании, относится к образованию одной или более ковалентных химических связей между двумя различными молекулами.

Термины лечение, лечить и т.п. используемые в данном документе, в общем означают получение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полностью или частично предотвращения заболевания или симптома, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или отрицательного влияния, относящегося к этому заболеванию. Термин лечение, используемый в данном документе, охватывает любое лечение заболевания или симптома у млекопитающих, и включает: (а) предотвращение заболевания или симптома, возникающих у субъекта, который может быть предрасположен к приобретению заболевания или симптома, но еще не был диагностирован как имеющий его; (b) ингибирование заболевания или симптома, т.е. прекращение его развития; и/или (с) ослабление заболевания, т.е. регрессию заболевания. Терапевтическое средство может быть введено до, во время или после начала заболевания или травмы. Лечение продолжающегося заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента, представляет особый интерес. Такое лечение желательно осуществлять до полной потери функции в пораженных тканях. Указанное лечение будет желательно вводить в течение симптоматической стадии заболевания, а в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания.

Термины индивидуум, субъект, хозяин и пациент используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому млекопитающему, для которых желательна диагностика, лечение или терапия. Млекопитающие включают, например, людей, отличных от человека приматов, грызунов (например, мышей, крыс), зайцеобразных (например, кроликов), копытных (например, коров, овец, свиней, лошадей, коз и тому подобных) и т.д.

Перед тем как данное изобретение описано далее, следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, поскольку таковые могут, конечно, варьировать. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем данного изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В случае, когда диапазон значений обеспечиваются, следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно указано иначе, между верхним и

- 4 049816 нижним пределом этого диапазона и любым другим оговоренным или промежуточным значением в указанном диапазоне, охватывается данным изобретением. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, и также охватываются данным изобретением, с учетом любого специфически исключенного предела в указанном диапазоне. Там, где указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в изобретение.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как обычно понимаемые специалистом в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут также быть использованы в практике или тестировании данного изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, упомянутые в данном описании, включены в данное описание в качестве ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми эти публикации цитируются.

Использование определений в единственном числе не исключает возможности наличия определений во множественном числе, если обратное прямо не указано в контексте. Так, например, ссылка на модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид включает множество таких полипептидов, и ссылка на иммуномодулирующий полипептид включает в себя ссылку на один или более иммуномодулирующих полипептидов и их эквивалентов, известных специалисту в данной области техники, и так далее. Следует также отметить, что формула изобретения может быть составлена так, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, это утверждение предназначено служить в качестве предшествующей основы для использования такой исключительной терминологии как исключительно, только и тому подобное, в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использования отрицательного ограничения.

Следует понимать, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте. Наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, могут также быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации. Все комбинации вариантов осуществления, относящихся к данному изобретению, в частности, охватываются данным изобретением и описаны в данном документе, как если бы каждая комбинация была индивидуально и явно раскрыта. Кроме того, все подкомбинации различных вариантов осуществления и их элементов, также конкретно охватываются данным изобретением и описаны в данном документе, как если бы каждая такая подкомбинация была индивидуально и явно раскрытые в данном документе.

Публикации, которые обсуждаются в данном документе, приводятся исключительно для их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как признание того, что данное изобретение не имеет права на предшествование такой публикации в силу предшествующего изобретения. Кроме того, даты публикаций могут отличаться от действительных дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

Подробное описание

В данном изобретении предлагаются модулирующие Т-клетки мультимерные полипептиды, которые содержат иммуномодулирующий полипептид и которые содержат эпитоп-презентирующий пептид опухоли-1 Вильмса (WT-1). ТММР является полезным для модуляции активности Т-клеток, а также для модуляции иммунного ответа у индивидуума.

Модулирующие Т-клетки мультимерные полипептиды.

В данном изобретении предложен модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид (ТММР), содержащий: а) первый полипептид; и b) второй полипептид, причем ТММР содержит эпитоп; первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (ГКГС); второй полипептид ГКГС; один или более иммуномодулирующих полипептидов; и, необязательно, полипептид Fc иммуноглобулина (Ig) или каркас не от Ig. В данном изобретении предложен ТММР, причем ТММР представляет собой гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС, при этом первый полипептид или второй полипептид содержит эпитоп; при этом первый полипептид и/или второй полипептид содержит один или более иммуномодулирующих полипептидов, которые могут быть одинаковыми или различными; и необязательно полипептид Fc Ig или каркас не от Ig. TMMP по данному изобретению также упоминается в данном документе как мультимерный полипептид по данному изобретению или synTac. В некоторых случаях пептидный эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет пептид WT-1.

В данном изобретении предложен ТММР, содержащий гетеродимерный полипептид, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп; и ii) первый полипептид ГКГС; b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит по меньшей мере один (т.е. один или более) иммуномодулирующий полипептид. Необязательно, первый или второй полипептид содержит полипептид Fc Ig или каркас не от Ig. По меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих

- 5 049816 полипептидов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного коиммуномодулирующего полипептида. Эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению связывается с рецептором Т-клеток (TCR) на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере, 100 мкМ (например, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 10 нМ, или по меньшей мере 1 нМ). ТММР по данному изобретению связывается с первой Тклеткой с аффинностью, которая по меньшей мере на 25% выше, чем аффинность, с которой ТММР связывает вторую Т-клетку, причем первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный коиммуномодулирующий полипептид, и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 100 мкМ, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхность когнатный коиммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 100 мкМ (например, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 10 нМ или по меньшей мере 1 нМ). В некоторых случаях пептидный эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет пептид WT-1.

В данном изобретении предложен ТММР, в котором ТММР представляет собой:

А) гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС, причем первый полипептид или второй полипептид содержит эпитоп (например, пептид, который презентирует эпитоп Т-клетке); при этом первый полипептид и/или второй полипептид содержат один или более иммуномодулирующих полипептидов, которые могут быть одинаковыми или различными, и при этом по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих полипептидов могут представлять собой иммуномодулирующий полипептид дикого типа или вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, при этом вариант иммуномодулирующего полипептида содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа; и при этом первый полипептид или второй полипептид необязательно содержит полипептид Fc Ig или каркас не от Ig; или

В) гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС, при этом первый полипептид или второй полипептид содержит эпитоп; при этом первый полипептид и/или второй полипептид содержит один или более иммуномодулирующих полипептидов, которые могут быть одинаковыми или различными, при этом по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих полипептидов представляют собой вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, при этом вариант иммуномодулирующего полипептида содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью иммуномодулирующего полипептида дикого типа, при этом по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих доменов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида, и при этом эпитоп связывается с TCR на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М так, что: i) полипептид ТММР связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая на по меньшей мере 25% выше, чем аффинность с которой ТММР связывает вторую Т-клетку, при этом первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М; и/или ii) соотношение аффинности связывания контрольного ТММР, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания ТММР, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, находится в диапазоне от 1,5:1 до 106:1; и при этом вариант иммуномодулирующего полипептида содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью иммуномодулирующего полипептида дикого типа; и при этом первый полипептид или второй полипептид необязательно содержит полипептид Fc Ig или каркас не от Ig; или

С) гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к Сконцу: i) эпитоп; ii) первый полипептид ГКГС и b) второй полипептид, содержащий в направлении от Nконца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС, и ii) необязательно полипептид Fc иммуноглобулина (Ig) или каркас не от Ig, причем ТММР содержит один или более иммуномодулирующих доменов, которые

- 6 049816 могут быть одинаковыми или различными, при этом по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующим доменов расположен: А) на С-конце первого полипептида; В) на N-конце второго полипептида; С) на С-конце второго полипептида или D) на С-конце первого полипептида и на N-конце второго полипептида, и при этом по меньшей мере, один из одного или более иммуномодулирующих доменов может представлять собой иммуномодулирующий полипептид дикого типа или вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, при этом вариант иммуномодулирующего полипептида содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замены по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа; и необязательно при этом по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих доменов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного коиммуномодулирующего полипептида, и при этом эпитоп связывается с TCR на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М так, что: i) ТММР связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая на по меньшей мере 25% выше, чем аффинность с которой ТММР связывает вторую Т-клетку, при этом первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М; и/или ii) соотношение аффинности связывания контрольного ТММР, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным коиммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания ТММР, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1; и при этом вариант иммуномодулирующего полипептида содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью иммуномодулирующего полипептида дикого типа. В некоторых случаях пептидный эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет пептид WT-1.

В данном изобретении предложен ТММР, содержащий: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) эпитоп; ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) необязательно полипептид Fc Ig, или каркас не от Ig. ТММР по данному изобретению содержит один или более иммуномодулирующих полипептидов, при этом по меньшей мере, один из одного или более иммуномодулирующих полипептидов расположен: А) на С-конце первого полипептида; В) на N-конце второго полипептида; С) на С-конце второго полипептида или D) на С-конце первого полипептида и на N-конце второго полипептида. По меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих полипептидов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида. Эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению связывается с рецептором Тклеток (TCR) на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере, 100 мкМ (например, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 10 нМ, или по меньшей мере 1 нМ). ТММР по данному изобретению связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая по меньшей мере на 25% выше, чем аффинность, с которой ТММР связывает вторую Т-клетку, причем первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 100 мкМ, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхность когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 100 мкМ (например, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 10 нМ или по меньшей мере 1 нМ).

В некоторых случаях, эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению связывается с TCR на Т-клетках с аффинностью, равной от около 10^-4 М до около 5х10^-4М, от около 5х10^-4 М до около 10^-5 М, от около 10^-5 М до 5х10^-5 М, от около 5х10^-5 М до 10v⁶ М, от около 10^-6 М до около 5х10^-6 М, от около 5х10^-6 М до около 10^-7 М, от около 10^-7 М до около 5х10^-7 М, от около 5х10^-7 М до около 10^-8 М или от около 10^-8 М до около 10^-9 М. Выражаясь по-другому, в некоторых случаях, эпитоп присутствующий в ТММР по данному изобретению, связывается с TCR на Т-клетках с аффинностью, равной от около 1 нМ до около 5 нМ, от около 5 нМ до около 10 нМ, от около 10 нМ до около 50 нМ, от около 50 нМ до около 100 нМ, от около 0,1 мкМ до около 0,5 мкМ, от около 0,5 мкМ до около 1 мкМ, от около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ, от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

- 7 049816

Иммуномодулирующий полипептид, присутствующий в ТММР по данному изобретению связывается с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом с аффинностью, которая на по меньшей мере 10% меньше, по меньшей мере 15% меньше, по меньшей мере 20% меньше, по меньшей мере 25% меньше, по меньшей мере 30% меньше, по меньшей мере 35% меньше, по меньшей мере 40% меньше, по меньшей мере 45% меньше, по меньшей мере 50% меньше, по меньшей мере 55% меньше, по меньшей мере 60% меньше, по меньшей мере 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85% меньше, по меньшей мере 90% меньше, по меньшей мере 95% меньше или более чем на 95% меньше, чем аффинность соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду.

В некоторых случаях, вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду, которая составляет от 1 нМ до 100 нМ или от 100 нМ до 100 мкМ. Например, в некоторых случаях, вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около

250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около

400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около

700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ. В некоторых случаях, вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которая составляет от около 1 нМ до около 5 нМ, от около 5 нМ до около 10 нМ, от около 10 нМ до около 50 нМ, от около 50 нМ до около 100 нМ.

Сочетание пониженной аффинности иммуномодулирующего полипептида с его когнатным коиммуномодулирующим полипептидом, и аффинность эпитопа с TCR, обеспечивает улучшенную селективность ТММР по данному изобретению. Например, ТММР по данному изобретению избирательно связывается с первой Т-клеткой, которая содержит на поверхности как: i) TCR, специфический для эпитопа, присутствующего в ТММР, так и ii) ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР, по сравнению со связыванием со второй Т-клеткой, которая содержит на поверхности: i) TCR, специфический для эпитопа, отличного от эпитопа, присутствующего в ТММР, и ii) ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР. Например, ТММР по данному изобретению связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 2,5 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 15 раз, по меньшей мере 20 раз, по меньшей мере 25 раз, по меньшей мере 50 раз, по меньшей мере 100 раз или больше чем 100 раз, больше аффинности, с которым он связывает вторую Т-клетку.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, при введении индивидууму, нуждающемуся в этом, индуцирует как эпитоп-специфический Т-клеточный ответ, так и эпитоп-неспецифический Тклеточный ответ. Другими словами, в некоторых случаях ТММР данному изобретению, при введении индивидууму, нуждающемуся в этом, индуцирует эпитоп-специфический ответ Т-клеток, модулируя активность первой Т-клетки, которая содержит на поверхности как: i) TCR, специфический для эпитопа, присутствующего в ТММР; так и ii) ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР; и индуцирует эпитоп-неспецифический ответ Т-клеток путем модулирования активности второй Т-клетки, которая содержит на поверхности: i) TCR, специфический для эпитопа, присутствующего в ТММР; и ii) ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР. Отношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1 или по меньшей мере 100:1. Отношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет от около 2:1 до около 5:1, от около 5:1 до около 10:1, от около 10:1 до около 15:1, от около 15:1 до около 20:1, от около 20:1 до около 25:1, от около 25:1 до около 50:1, или от около 50:1 до около 100:1 или более чем 100:1. Модулирование активности Т-клетки может включать одно или более из: i) активирование цитотоксической Т-клетки (например, CD8'); ii) индукцию цитотоксической активности цитотоксической Т-клетки (например, CD8⁺); iii) индукцию продуцирования и высвобождения цитотоксина (например, перфорина; гранзима; гранулезина) цитотоксической Т-клеткой (например, CD8⁺) iv) ингибирование активности аутореактивной Т-клетки; и тому подобное.

- 8 049816

Сочетание пониженной аффинности иммуномодулирующего полипептида с его когнатным коиммуномодулирующим полипептидом, и аффинность эпитопа с TCR, обеспечивает улучшенную селективность ТММР по данному изобретению. Таким образом, например, ТММР по данному изобретению связывается с повышенной авидностью с первой Т-клеткой, которая содержит на поверхности как: i) TCR, специфический для эпитопа, присутствующего в ТММР, так и ii) ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР, по сравнению с авидностью с которой он связывается со второй Т-клеткой, которая содержит на поверхности: i) TCR, специфический для эпитопа, отличного от эпитопа, присутствующего в ТММР, и ii) коиммуномодулирующий полипептид, который связывается с иммуномодулирующим полипептидом, присутствующим в ТММР.

Аффинность связывания между иммуномодулирующим полипептидом и его когнатным коиммуномодулирующим полипептидом может быть определена с помощью биослойной интерферометрии (BLI) с использованием очищенного иммуномодулирующего полипептида и очищенного когнатного коиммуномодулирующего полипептида. Аффинность связывания между ТММР и его когнатным коиммуномодулирующим полипептидом может быть определена с помощью BLI с использованием очищенного ТММР и когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида. Методы BLI хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4):498-507 и Shah and Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383.

Анализ BLI может быть проведен с использованием прибора Octet RED 96 (Pal ForteBio) или аналогичного прибора следующим образом. ТММР (например, ТММР по данному изобретению; контрольный ТММР (причем контрольный ТММР содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа)) иммобилизируют на нерастворимой подложке (биосенсоре). Иммобилизованный ТММР является мишенью. Иммобилизацию можно осуществлять путем иммобилизации захватывающего антитела на нерастворимой подложке, где захватывающее антитело иммобилизует ТММР. Например, иммобилизация может быть осуществлена путем иммобилизации антителом к Fc (например, антителом против Fc IgG человека) на нерастворимой подложке, где иммобилизующие антитела против Fc связываются и иммобилизуют ТММР (причем ТММР содержит полипептид Fc Ig). Ко-иммуномодулирующий полипептид наносят в нескольких различных концентрациях на иммобилизованный ТММР и регистрируют реакцию прибора. Анализы проводят в жидкой среде, содержащей 25 мМ HEPES рН 6,8, 5% полиэтиленгликоля 6000, 50 мМ KCl, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% неионогенного детергента Tween 20. Связывание ко-иммуномодулирующего полипептида с иммобилизованным ТММР проводят при 30°С. В качестве положительного контроля аффинности связывания можно использовать моноклональное антитело против ГКГС I класса. Например, можно использовать моноклональное антитело W6/32 против HLA I класса (Американская коллекция типовых культур № НВ-95; Parham et al. (1979) J. Immunol. 123:342), который имеет K_D, равную 7 нМ. Стандартная кривая может быть получена с использованием серийных разведений моноклонального антитела против ГКГС I класса. Ко-иммуномодулирующий полипептид, или mAb (моноклональное антитело) против ГКГС I класса, является аналитом. BLI анализирует интерференционную картину белого света, отраженного от двух поверхностей: i) от иммобилизованного полипептида (мишень); и ii) внутреннего эталонного слоя. Изменение количества молекул (аналита; например, ко-иммуномодулирующего полипептида; антитела против HLA), связанных с наконечником биосенсора, вызывает изменение интерференционной картины; этот сдвиг в интерференционной картине может быть измерен в режиме реального времени. Два кинетических термина, которые описывают аффинность взаимодействия мишени и аналита, представляют собой константу ассоциации (k_a) и константу диссоциации (kd). Отношение этих двух переменных (kd/_a) образует константу аффинности KD.

Анализ BLI проводят в многолуночном планшете. Для проведения анализа определяют схему планшета, определяют этапы анализа и назначают биосенсоры в программном обеспечении Octet Data Acquisition. Биосенсорную сборку гидратируют. Гидратированную биосенсорную сборку и планшет для анализа уравновешивают в течение 10 мин на приборе Octet. Как только данные получены, полученные данные загружают в программу анализа данных Octet. Данные обрабатывают в окне Обработка путем указания метода вычитания эталона, выравнивания по оси Y, межшаговой коррекции и фильтрации Савицкого-Голея. Данные анализируют в окне анализа путем указания шагов для анализа (ассоциация и диссоциация), выбора модели подбора кривой (1:1), метода подбора (глобального) и окна интереса (в секундах). Оценивают качество посадки. Значения KD для каждого из данных (концентрация аналита) можно усреднить, если они находятся в 3-кратном диапазоне. Значения ошибки KD должны находиться в пределах одного порядка значений константы аффинности; значения R² должны быть больше 0,95. См., например, Abdiche et al. (2008) J. Anal. Biochem. 377:209.

Если не указано иное, аффинность ТММР по данному изобретению к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду, или аффинность контрольного ТММР (причем контрольный ТММР содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа) к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду, определяют с использованием BLI, как описано выше.

В некоторых случаях соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР (когда кон

- 9 049816 троль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа) к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению, содержащему вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду, измеренная с помощью BLI (как описано выше), составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1. В некоторых случаях соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР (когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа) к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению, содержащему вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду, измеренная с помощью BLI (как описано выше), находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1, например, от 1,5:1 до 10:1, от 10:1 до 50:1, от 50:1 до 10²:1, от 10²:1 до 10³:1, от 10³:1 до 10⁴:1, от 10⁴:1 до 10⁵:1 илиот 10⁵:1 до 10⁶:1.

В качестве примера, когда контрольный ТММР содержит полипептид IL-2 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида IL-2 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида IL-2 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к рецептору IL-2 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к рецептору IL-2, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1. В некоторых случаях, когда контрольный ТММР содержит полипептид IL-2 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида IL-2 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида IL-2 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к рецептору IL-2 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к рецептору IL-2, измеренная с помощью BLI, находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1, например, от 1,5:1 до 10:1, от 10:1 до 50:1, от 50:1 до 10²:1, от 10²:1 до 10³:1, от 10³:1 до 10⁴:1, от 10⁴:1 до 10⁵:1 или от 10⁵:1 до 10⁶:1.

В другом примере, когда контрольный ТММР содержит полипептид PD-L1 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида PD-L1 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида PD-L1 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к полипептиду PD-1 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к полипептиду PD-1, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1.

В другом примере, когда контрольный ТММР содержит полипептид CD80 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида CD80 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида CD80 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к полипептиду CTLA4 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к полипептиду CTLA4, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1.

В другом примере, когда контрольный ТММР содержит полипептид CD80 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида CD80 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида CD80 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к полипептиду CD28 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к полипептиду CD28, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по

- 10 049816 меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1.

В другом примере, когда контрольный ТММР содержит полипептид 4-1BBL дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида 4-1BBL (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида 4-1BBL дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к полипептиду 4-1ВВ (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к полипептиду 4-1ВВ, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1.

В другом примере, когда контрольный ТММР содержит полипептид CD86 дикого типа и когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида CD86 (содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью полипептида CD86 дикого типа) в качестве иммуномодулирующего полипептида, соотношение: i) аффинности связывания контрольного ТММР к полипептиду CD28 (то есть когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду) к ii) аффинности связывания ТММР по данному изобретению к полипептиду CD28, измеренная с помощью BLI, составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1.

Аффинность связывания ТММР по данному изобретению с Т-клеткой-мишенью может быть измерена следующим образом: А) приведение в контакт ТММР по данному изобретению с Т-клеткоймишенью, экспрессирующей на своей поверхности: i) когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) рецептор Тклетки, который связывается с эпитопом, причем ТММР содержит метку эпитопа, так что ТММР связывается с Т-клеткой-мишенью; В) приведение в контакт ТММР, связанного с Т-клеткой-мишенью, с флуоресцентно меченным связывающим агентом (например, флуоресцентно меченным антителом), которое связывается с меткой эпитопа, создавая тем самым комплекс ТММР/Т-клетка-мишень/связывающий агент; С) измерение средней интенсивности флуоресценции (MFI) комплекса ТММР/Т-клеткамишень/связывающий агент с использованием проточной цитометрии. Меткой эпитопа может быть, например, метка FLAG, метка гемагглютинина, метка c-myc, полигистидиновая метка и т.д. MFI, измеренная в диапазоне концентраций члена библиотеки ТММР, обеспечивает меру аффинности. MFI, измеренная в диапазоне концентраций члена библиотеки ТММР, обеспечивает половину максимальной эффективной концентрации (EC₅₀) ТММР. В некоторых случаях EC₅₀ ТММР по данному изобретению для Тклетки-мишени находится в нМ (наномолярном) диапазоне; a EC₅₀ ТММР для контрольной Т-клетки (причем контрольная Т-клетка экспрессирует на своей поверхности: i) когнатный коиммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) Т-клеточный рецептор, который не связывается с эпитопом, присутствующим в ТММР) находится в мкМ (микромолярном) диапазоне. В некоторых случаях соотношение EC50 ТММР по данному изобретению для контрольной Т-клетки к EC50 ТММР для Т-клетки мишени составляет по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 10²:1, по меньшей мере 5x102:1, по меньшей мере 10³:1, по меньшей мере 5x103:1, по меньшей мере 10⁴:1, по меньшей мере 10⁵:1 или по меньшей мере 10⁶:1. Отношение EC₅₀ ТММР по данному изобретению для контрольной Т-клетки к EC₅₀ ТММР для Т-клетки мишени является выражением селективности ТММР.

В некоторых случаях при измерении, описанном в предыдущем пункте, ТММР по данному изобретению проявляет избирательное связывание с Т-клеткой мишенью, по сравнению со связыванием члена библиотеки ТММР с контрольной Т-клеткой мишенью, содержащей: i) когнатный коиммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) Т-клеточный рецептор, который связывается с эпитопом, отличным от эпитопа, присутствующего в члене библиотеки ТММР.

Димеризованные ТММР.

ТММР по данному изобретению может быть димеризован; то есть данное изобретение относится к мультимерному полипептиду, содержащему димер ТММР по данному изобретению. Таким образом, в

- 11 049816 данном изобретении предлагается ТММР, содержащий: А) первый гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп; и ii) первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (ГКГС); и b) второй полипептид i) второй полипептид ГКГС, при этом первый гетеродимер содержит один или более иммуномодулирующих полипептидов; и В) второй гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид i) второй полипептид ГКГС, при этом второй гетеродимер содержит один или более иммуномодулирующих полипептидов, и при этом первый гетеродимер и второй гетеродимер ковалентно связаны друг с другом. В некоторых случаях два ТММР идентичны друг другу по аминокислотной последовательности. В некоторых случаях первый гетеродимер и второй гетеродимер ковалентно связаны друг с другом через С-концевую область второго полипептида первого гетеродимера и С-концевую область второго полипептида второго гетеродимера. В некоторых случаях первый гетеродимер и второй гетеродимер ковалентно связаны друг с другом через С-концевую аминокислоту второго полипептида первого гетеродимера и С-концевую область второго полипептида второго гетеродимера; например, в некоторых случаях С-концевая аминокислота второго полипептида первого гетеродимера и С-концевая область второго полипептида второго гетеродимера связаны друг с другом либо напрямую, либо через линкер. Линкер может представлять собой пептидный линкер. Пептидный линкер может иметь длину от 1 аминокислоты до 200 аминокислот (например, от 1 аминокислоты (ак) до 5 ак, от 5 ак до 10 ак, от 10 ак до 25 ак, от 25 ак до 50 ак, от 50 ак до 100 ак, от 100 ак до 150 ак или от 150 ак до 200 ак). В некоторых случаях пептидный эпитоп первого гетеродимера и пептидный эпитоп второго гетеродимера содержат одну и ту же аминокислотную последовательность. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС первого и второго гетеродимера представляет собой в2-микроглобулин ГКГС I класса, и при этом второй полипептид ГКГС первого и второго гетеродимера представляет собой тяжелую цепь ГКГС I класса. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид первого гетеродимера и иммуномодулирующий полипептид второго гетеродимера содержат одну и ту же аминокислотную последовательность. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид первого гетеродимера и иммуномодулирующий полипептид второго гетеродимера являются вариантами иммуномодулирующих полипептидов, которые содержат от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с соответствующим родительским иммуномодулирующим полипептидом дикого типа, и при этом от 1 до 10 аминокислотных замен приводят к снижению аффинного связывания варианта иммуномодулирующего полипептида с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид первого гетеродимера и иммуномодулирующий полипептид второго гетеродимера каждый независимо выбирают из группы, состоящей из IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1 (CD339), TGFe, CD70 и ICAM. Примеры подходящих полипептидов ГКГС, иммуномодулирующих полипептидов и пептидных эпитопов описаны ниже.

Полипептиды ГКГС.

Как отмечено выше, ТММР по данному изобретению содержит полипептиды ГКГС. Для целей данного изобретения термин полипептиды основного комплекса гистосовместимости (ГКГС) включает полипептиды ГКГС различных видов, включая ГКГС человека (также называемые полипептидами лейкоцитарного антигена человека (HLA)), грызунов (например, мыши, крысы и т.д.) полипептиды ГКГС и полипептиды ГКГС других видов млекопитающих (например, зайцеобразных, приматов, отличных от человека, собачьих, кошачьих, копытных (например, лошадей, быков, овец, коз и т.д.) и т.п. Термин полипептид ГКГС предназначен для обозначения полипептидов ГКГС I класса (например, Р-2 микроглобулина и тяжелой цепи ГКГС I класса).

В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М (в2М) ГКГС I класса; а второй полипептид ГКГС представляет собой тяжелую цепь (цепь Н) ГКГС I класса (ГКГС-Н). В других случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, а второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М. В некоторых случаях как в2М, так и цепь ГКГС-Н человеческого происхождения; т.е. цепь ГКГС-Н представляет собой тяжелую цепь HLA или ее вариант. Если прямо не указано иное, ТММР по данному изобретению не включает в себя домены прикрепления к мембране (трансмембранные области) тяжелой цепи ГКГС I класса, или часть тяжелой цепи ГКГС I класса, достаточная для прикрепления получаемого ТММР к клетке (например, эукариотической клетке, такой как клетка млекопитающего), в которой он экспрессируется. В некоторых случаях тяжелая цепь ГКГС I класса, присутствующая в ТММР по данному изобретению, не включает в себя сигнальный пептид, трансмембранный домен или внутриклеточный домен (цитоплазматический хвост), связанный с нативной тяжелой цепью ГКГС I класса. Таким образом, например, в некоторых случаях, тяжелая цепь ГКГС I класса, присутствующая в ТММР по данному изобретению, включает в себя только домены α1, α2 и α3 тяжелой цепи ГКГС I класса. В некоторых случаях тяжелая цепь ГКГС I класса, присутствующая в ТММР по данному изобретению, имеет длину от около 270 аминокислот (ак) до около 290 ак. В некоторых случаях тяжелая цепь ГКГС I класса, присутствующая в ТММР по данному изобретению, имеет длину 270 ак, 271 ак, 272, ак, 273 ак, 274 ак, 275 ак, 276 ак, 277 ак, 278 ак, 279 ак, 280 ак, 281 ак, 282 ак, 283 ак, 284 ак, 285 ак, 286 ак, 287 ак, 288 ак, 289 ак или 290 ак.

- 12 049816

В некоторых случаях полипептид ГКГС ТММР представляет собой полипептид ГКГС человека, причем полипептиды ГКГС человека также называют полипептидами лейкоцитарного антигена человека (HLA). В некоторых случаях полипептид ГКГС ТММР представляет собой полипептид HLA I класса, например, полипептид в2-микроглобулина или полипептид тяжелой цепи HLA I класса. Полипептиды тяжелой цепи HLA I класса включают полипептиды тяжелой цепи HLA-A, полипептиды тяжелой цепи HLA-B, полипептиды тяжелой цепи HLA-C, полипептиды тяжелой цепи HLA-E, полипептиды тяжелой цепи HLA-F и полипептиды тяжелой цепи HLA-G.

Тяжелые цепи ГКГС I класса.

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательными аминокислотами) аминокислотной последовательности любого из полипептидов тяжелой цепи HLA человека, изображенных на фиг. 713. В некоторых случаях тяжелая цепь ГКГС I класса имеет длину 270 ак, 271 ак, 272, ак, 273 ак, 274 ак, 275 ак, 276 ак, 277 ак, 278 ак, 279 ак, 280 ак, 281 ак, 282 ак, 283 ак, 284 ак, 285 ак, 286 ак, 287 ак, 288 ак, 289 ак или 290 ак. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 1-30, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен (в дополнение к тем положениям, указанным как вариабельные в консенсусных последовательностях тяжелой цепи) любой из аминокислотных последовательностей, изображенных на фиг. 7-13. В некоторых случаях тяжелая цепь ГКГС I класса не содержит трансмембранные или цитоплазматические домены. В качестве примера, полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 25-300 (без каких-либо, или частично без каких-либо, из лидерной, трансмембранной или цитоплазматической последовательностей) или аминокислот 25-365 (без лидера) полипептидов тяжелой цепи HLA-A человека, изображенных на фиг. 7А, 7В и 7С.

На фиг. 7А, 7В и 7С представлены аминокислотные последовательности полипептидов тяжелых цепей лейкоцитарного антигена человека (HLA) I класса. Сигнальные последовательности, аминокислоты 1-24, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. На фиг. 7А элемент: 3A.1 представляет собой тяжелую цепь HLA-A (HLA-A*O1:O1:O1:O1 или А*0101) (код NCBI NP_001229687.1), SEQ ID NO: 23; элемент 3А.2 происходит из HLA-A*1101 SEQ ID NO: 24; элемент 3А.3 происходит из HLA-A*2402 SEQ ID NO: 25 и элемент 3А.4 происходит из HLA-A*3303 SEQ ID NO: 26. На фиг. 7В представлена последовательность HLA-B*07:02:01 (HLA-B*0702) код доступа GenBank NCBI NP_005505.2 (см. также код GenBank AUV50118.1). На фиг. 7С представлена последовательность HLA-C*O7O1 (код GenBank NP_001229971.1) (HLA-C*07:01:01:01 или HLA-Cw*070101, HLA-Cw*07 см. код GenBank CAO78194.1).

На фиг. 8 представлено выравнивание последовательностей одиннадцати пептидов зрелых тяжелых цепей ГКГС I класса без их лидерных последовательностей, или трансмембранных доменов, или внутриклеточных доменов. Выровненные последовательности представляют собой HLA-A, HLA-B и HLA-C человека, последовательность белка Н2К мыши, три варианта HLA-A (вар. 1, вар. 2С и вар. 2СР) и 3 варианта HLA-A человека (HLA-A*1101; HLA-A*2402 и HLA-A*3303). В выравнивании указаны положения (84 и 139 зрелых белков), в которые могут быть вставлены остатки цистеина (например, путем замены) для образования дисульфидной связи для стабилизации комплекса цепи ГКГС-Н - в2М. В выравнивании также показано положение 236 (зрелого полипептида), которое может быть заменено остатком цистеина, который может образовывать внутрицепочечную дисульфидную связь с в2М (например, по ак 12). Над каждым из этих мест находится стрелка, а остатки выделены жирным шрифтом. Седьмая последовательность HLA-A, показанная в выравнивании (вар. 2с), демонстрирует последовательность варианта 2, замещенную остатками С в положениях 84, 139 и 236. Рамки, окружающие остатки 84, 139 и 236, показывают группы из пяти аминокислот по обе стороны от этих шести наборов из пяти остатков, обозначенные акк1 (для аминокислотного кластера 1), акк2 (для аминокислотного кластера 2), акк3 (для аминокислотного кластера 3), акк4 (для аминокислотного кластера 4), акк5 (для аминокислотного кластера 5) и акк6 (для аминокислотного кластера 6), которые могут быть заменены на 1-5 аминокислот, независимо выбранных из (i) любой встречающейся в природе аминокислоты или (ii) любой встречающейся в природе аминокислоты, за исключением пролина или глицина.

Согласно фиг. 8 в некоторых случаях: i) акк1 (аминокислотный кластер 1) может представлять собой аминокислотную последовательность GTLRG (SEQ ID NO: 287) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, L замещен на I, V, А или F); ii) акк2 (аминокислотный кластер 2) может представлять собой аминокислотную последовательность YNQSE (SEQ ID NO: 288) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе

- 13 049816 аминокислотами (например, N замещен на Q, Q замещен на N и/или Е замещен на D); iii) акк3 (аминокислотный кластер 3) может представлять собой аминокислотную последовательность TAADM (SEQ ID NO: 289) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, Т замещен на S, А замещен на G, D замещен на Е, и/или М замещен на L, V или I); iv) акк4 (аминокислотный кластер 4) может представлять собой аминокислотную последовательность AQTTK (SEQ ID NO: 290) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, А замещен на G, Q замещен на N или Т замещен на S, и/или K замещен на R или Q); v) акк5 (аминокислотный кластер 5) может представлять собой аминокислотную последовательность VETRP (SEQ ID NO: 291) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, V замещен на I или L, Е замещен на D, Т замещен на S, и/или R замещен на K); и/или vi) акк6 (аминокислотный кластер 6) может представлять собой аминокислотную последовательность GDGTF (SEQ ID NO: 292) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, D замещен на Е, Т замещен на S, или F замещен на L, W или Y).

На фиг. 9-11 представлены выравнивания аминокислотных последовательностей тяжелые цепи HLA I класса (без лидерных последовательностей, или трансмембранных доменов, или внутриклеточных доменов). Выровненные аминокислотных последовательности на фиг. 9А представляют собой тяжелые цепи HLA-A I класса следующих аллелей: А*0101, А*0201, А*0301, А* 1101, А*2301, А*2402, А*2407, А*3303 и А*3401. Выровненные аминокислотных последовательности на фиг. 10А представляют собой тяжелые цепи HLA-B I класса следующих аллелей: В*0702, В*0801, В*1502, В*3802, В*4001, В*4601 и В*5301. Выровненные аминокислотных последовательности на фиг. 11А представляют собой тяжелые цепи HLA-C I класса следующих аллелей: С*0102, С*0303, С*0304, С*0401, С*0602, С*0701, С*0801 и С*1502. В выравнивании указаны положения (84 и 139 зрелых белков), в которые могут быть вставлены остатки цистеина (например, путем замещения) для образования дисульфидной связи для стабилизации комплекса цепи Н ΒΕΛ-βΣΜ. В выравнивании также показано положение 236 (зрелого полипептида), которое может быть заменено остатком цистеина, который может образовывать внутрицепочечную дисульфидную связь с β2Μ (например, по ак 12). Рамки, окружающие остатки 84, 139 и 236, показывают группы из пяти аминокислот по обе стороны от этих шести наборов из пяти остатков, обозначенные акк1 (для аминокислотного кластера 1), акк2 (для аминокислотного кластера 2), акк3 (для аминокислотного кластера 3), акк4 (для аминокислотного кластера 4), акк5 (для аминокислотного кластера 5) и акк6 (для аминокислотного кластера 6), которые могут быть заменены на 1-5 аминокислот, независимо выбранных из (i) любой встречающейся в природе аминокислоты или (ii) любой встречающейся в природе аминокислоты, за исключением пролина или глицина.

На фиг. 9А, 10А и 11А представлены выравнивания аминокислотных последовательностей тяжелых цепей зрелых HLA-A, -В и -С I класса соответственно. Последовательности представлены для внутриклеточной части зрелого белка (без лидерных последовательностей, или трансмембранных доменов, или внутриклеточных доменов). Как описано на фиг. 8, положения ак остатков 84, 139 и 236 и их фланкирующих остатков (от акк1 до акк6), которые могут замещаться от 1 до 5 аминокислотами, независимо выбранными из также показанных (i) любой встречающейся в природе аминокислоты или (ii) любой встречающейся в природе аминокислоты, за исключением пролина или глицина. На фиг. 9В, 10В и 11В представлены консенсусные аминокислотные последовательности для последовательностей HLA-A, -В и -С, соответственно представленные на фиг. 9А, 10А и 11А. Консенсусные последовательности показывают вариабельные положения аминокислот в виде последовательно пронумерованных остатков X, а положения аминокислот 84, 139 и 236 дважды подчеркнуты.

Согласно фиг. 9А в некоторых случаях: i) акк1 (аминокислотный кластер 1) может представлять собой аминокислотную последовательность GTLRG (SEQ ID NO: 287) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, L замещен на I, V, А или F); ii) акк2 (аминокислотный кластер 2) может представлять собой аминокислотную последовательность YNQSE (SEQ ID NO: 288) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, N замещен на Q, Q замещен на N и/или Е замещен на D); iii) акк3 (аминокислотный кластер 3) может представлять собой аминокислотную последовательность TAADM (SEQ ID NO: 289) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, Т замещен на S, А замещен на G, D замещен на Е, и/или М замещен на L, V или I); iv) акк4 (аминокислотный кластер 4) может представлять собой аминокислотную последовательность AQTTK (SEQ ID NO: 290) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, А замещен на G, Q замещен на N или Т замещен на S, и или K замещен на R или Q); v) акк5 (аминокислотный кластер 5) может представлять собой аминокислотную последователь

- 14 049816 ность VETRP (SEQ ID NO: 291) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, V замещен на I или L, Е замещен на D, Т замещен на S, и/или R замещен на K); и/или vi) акк6 (аминокислотный кластер 6) может представлять собой аминокислотную последовательность GDGTF (SEQ ID NO: 292) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, D замещен на Е, Т замещен на S, или F замещен на L, W или Y).

Согласно фиг. 10А в некоторых случаях: i) акк1 (аминокислотный кластер 1) может представлять собой аминокислотную последовательность RNLRG (SEQ ID NO: 293) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, N замещен на Т или I; и/или L замещен на А; и/или второй R замещен на L; и/или G замещен на R); ii) акк2 (аминокислотный кластер 2) может представлять собой аминокислотную последовательность YNQSE (SEQ ID NO: 288) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, N замещен на Q, Q замещен на N и/или Е замещен на D); iii) акк3 (аминокислотный кластер 3) может представлять собой аминокислотную последовательность TAADT (SEQ ID NO: 294) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, первый Т замещен на S, и/или А замещен на G, и/или D замещен на Е, и/или второй Т замещен на S); iv) акк4 (аминокислотный кластер 4) может представлять собой аминокислотную последовательность AQITQ (SEQ ID NO: 295) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, А замещен на G, и/или первый Q замещен на N; и/или I замещен на L или V; и/или Т замещен на S); v) акк5 (аминокислотный кластер 5) может представлять собой аминокислотную последовательность VETRP (SEQ ID NO: 291) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, V замещен на I или L, Е замещен на D, Т замещен на S, и/или R замещен на K); и/или vi) акк6 (аминокислотный кластер 6) может представлять собой аминокислотную последовательность GDRTF (SEQ ID NO: 296) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, D замещен на Е, и/или Т замещен на S; и/или R замещен на K или Н; и/или F замещен на L, W или Y).

Согласно фиг. 11А в некоторых случаях: i) акк1 (аминокислотный кластер 1) может представлять собой аминокислотную последовательность RNLRG (SEQ ID NO: 293) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, N замещен на K; и/или L замещен на А или I; и/или второй R замещен на Н; и/или G замещен на Т или S); ii) акк2 (аминокислотный кластер 2) может представлять собой аминокислотную последовательность YNQSE (SEQ ID NO: 288) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, N замещен на Q, Q замещен на N и/или Е замещен на D); iii) акк3 (аминокислотный кластер 3) может представлять собой аминокислотную последовательность TAADT (SEQ ID NO: 294) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, первый Т замещен на S, и/или А замещен на G, и/или D замещен на Е, и/или второй Т замещен на S); iv) акк4 (аминокислотный кластер 4) может представлять собой аминокислотную последовательность AQITQ (SEQ ID NO: 295) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, А замещен на G, и/или первый Q замещен на N; и/или I замещен на L; и/или второй Q замещен на N или K); v) акк5 (аминокислотный кластер 5) может представлять собой аминокислотную последовательность VETRP (SEQ ID NO: 291) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, V замещен на I или L, Е замещен на D, Т замещен на S, и/или R замещен на K или Н); и/или vi) акк6 (аминокислотный кластер 6) может представлять собой аминокислотную последовательность GDGTF (SEQ ID NO: 292) или эту последовательность с одной или двумя аминокислотами, удаленными или замещенными другими встречающимися в природе аминокислотами (например, D замещен на Е; и/или Т замещен на S; и/или F замещен на L, W или Y).

HLA-A.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-A. Последовательности пептида тяжелой цепи HLA-A или их части, которые могут включаться в ТММР по данному изобретению, включают в себя аллели, но не ограничиваются ими: А*0101, А*0201, А*0301, А* 1101, А*2301, А*2402, А*2407, А*3303, and A*3401, которые выровнены без каких-либо, или по существу без каких-либо, лидерных, трансмембранных и цитоплазматических последовательностей на фиг. 9А. Любые из таких аллелей могут содержать мутацию в одном или более положениях 84, 139 и/или 236 (как показано на фиг. 9А), выбранную из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и аланина на цистеин в

- 15 049816 положении 236 (А236С). Кроме того, может также применяться последовательность HLA-A, имеющая по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательных аминокислот) из последовательности таких аллелей HLA-A (например, она может содержать 1-25, 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-A, содержащий следующую консенсусную аминокислотную последовательность HLA-A:

GSHSMRYFX1TSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQX2MEPRAPWIE

OEGPEYWDX3X4TX5X6X7KAX8SQX9X10RX11X12LX13X14X15X16X17YYNOSEX18 GSHTX19QX20MX21GCDVGX22DX23RFLRGYX24QX25AYDGKDYIALX26EDLRSWT AADMAAOX27TX287X29KWEX30X31X32EAEQX33RX34YLX35GX36CVX37X38LRRY LENGKETLQRTDX39PKTHMTHHX40X41SDHEATLRCWALX42FYPAEITLTWQRDGE DOTODTELVETRPAGDGTFOKWAX43VVVPSGX44EORYTCHVOHEGLPKPLTLRWEX 45 (SEQ ID NO:29), в которой X1 представляет собой F, Y, S или Т; Х2 представляет собой K или R; X3 представляет собой Q, G, Е или R; Х4 представляет собой N или Е; Х5 представляет собой R или G; Х6 представляет собой N или K; Х7 представляет собой М или V; Х8 представляет собой Н или Q; X9 представляет собой Т или I; X10 представляет собой D или Н; X11 представляет собой А, V или Е; Х12 представляет собой N или D; X13 представляет собой G или R; X14 представляет собой Т или I; X15 представляет собой L или А; X16 представляет собой R или L; X17 представляет собой G или R; X18 представляет собой А или D; X19 представляет собой I, L, или V; Х20 представляет собой I, R или М; Х21 представляет собой F или Y; X22 представляет собой S или Р; Х23 представляет собой W или G; X24 представляет собой R, Н или Q; X25 представляет собой D или Y; X26 представляет собой N или K; Х27 представляет собой Т или I; X28 представляет собой K и Q; X29 представляет собой R или Н; X30 представляет собой А или Т; Х31 представляет собой А или V; Х32 представляет собой Н или R; X33 представляет собой R, L, Q или W; X34 представляет собой V или А; Х35 представляет собой D или Е; Х36 представляет собой R или Т; Х37 представляет собой D или Е; Х38 представляет собой W или G; X39 представляет собой Р или А; Х40 представляет собой Р или А; Х41 представляет собой V или I; X42 представляет собой S или G; X43 представляет собой А или S; X44 представляет собой Q или Е; и Х45 представляет собой Р или L.

В качестве одного примера, полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A человека:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID

NO:297).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, подходящий для включения в ТММР по данному изобретению, содержит следующую аминокислотную последовательность:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

NO:297).

Этот полипептид тяжелой цепи HLA-A также называют HLA-A*0201 или просто HLA-A02. В некоторых случаях С-концевой Pro не включен в ТММР по данному изобретению. Например, в некоторых случаях, полипептид HLA-A02, подходящий для включения в ТММР по данному изобретению, содержит следующую аминокислотную последовательность:

- 16 049816

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE

LVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:449).

HLA-A (Y84A; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит замены Y84A и А236С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A человека (Y84A; А236С):

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE

LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID

NO:298), где аминокислота 84 представляет собой Ala, а аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-236 образует межцепочечную дисульфидную связь с Cys-12 варианта в2М полипептида, который содержит замену R12C.

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, подходящий для включения в ТММР по данному изобретению, представляет собой полипептид HLA-A02 (Y84A; А236С), содержащий следующую аминокислотную последовательность:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID

NO:298).

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE

LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:450).

HLA-A (Y84C; А139С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит замены Y84C и А139С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A человека (Y84C; А139С):

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMCAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE

LVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID

NO:299), где аминокислота 84 представляет собой Cys, а аминокислота 139 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-84 образует внутрицепочечную дисульфидную связь c Cys-139.

HLA-A11 (HLA-A*1101).

В качестве одного неограничивающего примера полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР

- 17 049816 может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A11 человека:

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQD

AYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGTCVEWLRRYL

ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL

VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:300).

Такая тяжелая цепь ГКГС I класса может быть выражена в азиатских популяциях, включая популяции лиц азиатского происхождения.

HLA-A11 (Y84A; А236С).

В качестве одного неограничивающего примера, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса представляет собой аллель HLA-A11, который содержит замены Y84A и А236С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A A11 человека (Y84A; А236С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGAYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQD

AYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGTCVEWLRRYL

ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL

VETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:301), где аминокислота 84 представляет собой Ala, а аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-236 образует межцепочечную дисульфидную связь с Cys-12 варианта в2М полипептида, который содержит замену R12C.

HLA-A24 (HLA-A*2402).

В одном неограничивающем примере полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80% по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A24 человека:

GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQY

AYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYL

ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL

VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTVPIVGIIA GLVLLGAVITGAVVAAVMWRRNSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTACKV (SEQ ID NO:302).

Такая тяжелая цепь ГКГС I класса может быть выражена в азиатских популяциях, включая популяции лиц азиатского происхождения. В некоторых случаях аминокислота 84 представляет собой Ala. В некоторых случаях аминокислота 84 представляет собой Cys. В некоторых случаях аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях аминокислота 84 представляет собой Ala, а аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях аминокислота 84 представляет собой Cys, a аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-A33 (HLA-A*3303).

В одном неограничивающем примере полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-A33 человека:

- 18 049816

GSHSMRYFTTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDRNTRNVKAHSQIDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQMMYGCDVGSDGRFLRGYQQD AYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYL ENGKETLQRTDPPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL VETRPAGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIVGIIAG LVLFGAVFAGAVVAAVRWRRKSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDMSLTACKV (SEQ ID NO:303).

HLA-B.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-B. Последовательности пептида тяжелой цепи HLA-B или их части, которые могут включаться в ТММР по данному изобретению, включают в себя аллели, но не ограничиваются ими: В*0702, В*0801, В*1502, В*3802, В*4001, В*4601 и В*5301, которые выровнены без каких-либо, или по существу без каких-либо, лидерных, трансмембранных и цитоплазматических последовательностей на фиг. 10А. Любые из таких аллелей могут содержать мутацию в одном или более положениях 84, 139 и/или 236 (как показано на фиг. 10А), выбранную из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и аланина на цистеин в положении 236 (А236С). Кроме того, может также применяться полипептид HLA-B, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательных аминокислот) из последовательности таких аллелей HLA-B (например, она может содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-B, содержащий следующую консенсусную аминокислотную последовательность HLA-B:

GSHSMRYFX1TX2X3SRPGRGEPRFIX4VGYVDDTX5FVRFDSDAX6SPRX7X8PR

APWIEOEGPEYWDRX9TQX10X11KTX12X13TQX14YX15X16NLX17X18X19X20YYNO

SEAGSHX21X22QX23MYGCDLGPDGRLLRGHDOSAYDGKDYIALNEDLX24SWTAADT

AAOIX25ORKX26EAARX27AEQX28RX29YLEGX30CVEWLRRYLENGKX31X32LX33R

ADPPKTHVTHHPX34SDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGD

RTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:30), в которой X1 представляет собой Н, Y или D; X2 представляет собой А или S; X3 представляет собой М или V; Х4 представляет собой A, S или Т; Х5 представляет собой Q или L; X6 представляет собой А или Т; Х7 представляет собой Е, М K или Т; Х8 представляет собой А или Т; Х9 представляет собой Е или N; X10 представляет собой I или K; XII представляет собой Y, F, S или С; Х12 представляет собой N или Q; X13 представляет собой А или Т; Х14 представляет собой D или Y; X15 представляет собой Е или V; Х16 представляет собой S или N; X17 представляет собой Т, N или I; X18 представляет собой А или L; X19 представляет собой L или R; X20 представляет собой R или G; X21 представляет собой Т или I; X22 представляет собой L или I; X23 представляет собой R или S; X24 представляет собой R или S; X25 представляет собой S или Т; Х26 представляет собой L или W; X27 представляет собой Е или V; Х28 представляет собой R, D, L или W; Х29 представляет собой А или Т; Х30 представляет собой L, Е или Т; Х31 представляет собой Е или D; X32 представляет собой K или Т; X33 представляет собой Е или Q; и Х34 представляет собой I или V.

В одном неограничивающем примере полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-B человека:

- 19 049816 gshsmryfttsvsrpgrgeprfiavgyvddtqfvrfdsdaasqrmeprapwieqegpeywdrntrnvkahsqidrvdlgtlrgyynqs eagshtiqmmygcdvgsdgrflrgyqqdaydgkdyialnedlrswtaadmaaqitqrkweaarvaeqlraylegtcvewlrryleng ketlqrtdppkthmthhavsdheatlrcwalsfypaeitltwqrdgedqtqdtelvetrpagdgtfqkwasvvvpsgqeqrytchvqhe glpkpltlrwepssqptipivgiiaglvlfgavfagavvaavrwrrkssdrkggsysqaassdsaqgsdmsltackv (SEQ ID NO:304).

HLA-B (Y84A; А236С).

В качестве одного неограничивающего примера, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса представляет собой полипептид HLA-B, который содержит замены Y84A и А236С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-B человека (Y84A; А236С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEY

WDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGAYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQY AYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLE NGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:305), где аминокислота 84 представляет собой Ala, а аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-236 образует межцепочечную дисульфидную связь с Cys-12 варианта в2М полипептида, который содержит замену R12C.

HLA-B (Y84C; А139С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит замены Y84C и А139С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-B человека (Y84C; А139С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEY

WDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQY AYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLE NGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:306), где аминокислота 84 представляет собой Cys, а аминокислота 139 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-84 образует внутрицепочечную дисульфидную связь с Cys-139.

HLA-B*4702.

В качестве примера, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит аминокислотную последовательность HLA-B*0702 (SEQ ID NO: 207) на фиг. 10А, или последовательность, имеющую по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательными аминокислотами) такой последовательности (например, она может содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен). В некоторых случаях, когда полипептид тяжелой цепи HLA-B ТММР по данному изобретению имеет менее 100% идентичности с последовательностью, обозначенной HLA-B на фиг. 8, или обозначенной В*0702 на фиг. 10А, она может содержать мутацию в одном или более положений 84, 139 и/или 236, выбранных из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); замены тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и замены аланина на цистеин в положении 236 (А236С). В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B ТММР по данному изобретению содержит замены Y84A и А236С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B*0702 ТММР по данному изобретению содержит замены Y84C и А139С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B ТММР по данному изобретению содержит замены Y84C, А139С и А236С.

HLA-C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-C. Полипептид тяжелой цепи HLA-C или его части, которые могут включаться в ТММР по данному изобретению, включают в себя аллели, но не ограничиваются ими: С*0102, С*0303, С*0304, С*0401, С*0602, С*0701, С*0801 и С*1502, которые выровнены без каких-либо, или по существу без каких-либо,

- 20 049816 лидерных, трансмембранных и цитоплазматических последовательностей на фиг. 11А. Любые из таких аллелей могут содержать мутацию в одном или более положениях 84, 139 и/или 236 (как показано на фиг. 11А), выбранную из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); замены тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); замены аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и замены аланина на цистеин в положении 236 (А236С). Кроме того, может также применяться полипептид HLA-C, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательных аминокислот) из последовательности таких аллелей HLA-C (например, она может содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит полипептид тяжелой цепи HLA-C, содержащий следующую консенсусную аминокислотную последовательность HLA-C:

X1SHSMX2YFX3TAVSX4PGRGEPX5FIX6VGYVDDTQFVX7FDSDAASPRGEPRX

8PWVEQEGPEYWDRETQX9YKRQAQX10DRVX11LRX12LRGYYNOSEX13X14SHX15X 16QX17MX18GCDX19GPDGRLLRGX20X21QX22AYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQ ITORKX23EAARX24AEQX25RAYLEGX26CVEWLRRYLX27NGKX28TLORAEX29PKTH VTHHPX3QSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQX31DGEDOTODTELVETRPAGDGTFOK WAAVX32VPSGX33EORYTCHX34OHEGLX35EPLTLX36WX37P (SEQ ID NO:31),

Где X1 представляет собой С или G; X2 представляет собой R или K; X3 представляет собой F, Y, S или D; X4 представляет собой R или W; X5 представляет собой Н или R; X6 представляет собой А или S; X7 представляет собой Q или R; X8 представляет собой А или Е; Х9 представляет собой N или K; Х10 представляет собой Т или А; X11 представляет собой S или N; X12 представляет собой N или K; Х13 представляет собой А или D; X14 представляет собой G или R; X15 представляет собой Т или I; X16 представляет собой L или I; X17 представляет собой W или R; X18 представляет собой С, Y, F или S; X19 представляет собой L или V; Х20 представляет собой Y или Н; Х21 представляет собой D или N; X22 представляет собой Y, F, S или L; X23 представляет собой L или W; X24 представляет собой Е, А или Т; Х25 представляет собой R, L или W; X26 представляет собой L или Т; Х27 представляет собой Е или K; Х28 представляет собой Е или K; Х29 представляет собой Н или Р; Х30 представляет собой R или V; Х31 представляет собой W или R; X32 представляет собой V или М; X33 представляет собой Е или Q; X34 представляет собой М или V; Х35 представляет собой Р или Q; X36 представляет собой R или S; и Х37 представляет собой Р или G.

В одном неограничивающем примере полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-C человека:

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEY

WDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQ SAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLE NGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:307).

HLA-C (Y84A; А236С).

В качестве одного неограничивающего примера, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса представляет собой полипептид HLA-C, который содержит замены Y84A и А236С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-C человека (Y84A; А236С):

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEY

WDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGAYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQ SAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLE NGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:308), где аминокислота 84 представляет собой Ala, а аминокислота 236 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-236 образует межцепочечную дисульфидную связь с Cys-12 варианта в2М полипептида, который содержит замену R12C.

- 21 049816

HLA-C (Y84C; А139С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит замены Y84C и А139С. Например, в некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью тяжелой цепи HLA-C человека (Y84C; А139С):

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEY

WDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQ SAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLE NGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:397), , где аминокислота 84 представляет собой Cys, а аминокислота 139 представляет собой Cys. В некоторых случаях Cys-84 образует внутрицепочечную дисульфидную связь с Cys-139.

HLA-C*0701.

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса ТММР по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность HLA-C*0701 фиг. 11А (обозначенную HLA-C на фиг. 8), или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательными аминокислотами) такой последовательности (например, она может содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен). В некоторых случаях, когда полипептид тяжелой цепи HLA-C ТММР по данному изобретению имеет менее 100% идентичности с последовательностью, обозначенной HLA-C*0701 на фиг. 11А, она может содержать мутацию в одном или более положений 84, 139 и/или 236, выбранных из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); замены тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и замены аланина на цистеин в положении 236 (А236С). В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C ТММР по данному изобретению содержит замены Y84A и А236С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C*0701 Тклеточного-ММР или его эпитопный конъюгат содержит замены Y84C и А139С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C ТММР по данному изобретению содержит замены Y84C, А139С и А236С.

Неклассические тяжелые цепи HLA-E, -F и -G ГКГС I класса.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит неклассический полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса. Среди неклассических полипептидов тяжелой цепи HLA или их частей, которые могут включаться в ТММР по данному изобретению, включают в себя аллели, но не ограничиваются ими, такие из аллелей HLA-E, -F и -G. Аминокислотные последовательности для полипептидов тяжелой цепи HLA-E, -F и -G (и аллелей HLA-A, В и С) могут быть найдены во Всемирной сети Интернета на сайтах hla.alleles.org/nomenclature/index.html, Европейского института биоинформатики (www.ebi.ac.uk), который является частью Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL), и Национального центра биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Неограничивающие примеры подходящих аллелей HLA-E включают в себя, но не ограничиваются ими,

HLA-E*0101 (HLA-E*01:01:01:01), HLA-E*01:03(HLAЕ*01:03:01:01), HLA-E*01:04, HLA-E*01:05, HLA-E*01:06, HLA-E*01:07, HLA-E*01:09 и HLA-E*01:10.

Неограничивающие примеры подходящих аллелей HLA-F включают в себя, но не ограничиваются ими,

HLA-F*0101 (HLA-F*01:01:01:01), HLA-F*01:02, HLAF*01:03(HLA-F*01:03:01:01), HLA-F*01:04, HLA-F*01:05 и HLA-F*01:06.

Неограничивающие примеры подходящих аллелей HLA-G включают в себя, но не ограничиваются ими,

HLA-G*0101 (HLA-G*01:01:01:01), HLA-G*01:02, HLAG*01:03(HLA-G*01:03:01:01), HLA-G*01:04 (HLA-G*01:04:01:01), HLA-G*01:06, HLAG*01:07, HLA-G*01:08, HLA-G*01:09: HLA-G*01:10, HLA-G*01:10, HLA-G*01:ll, HLAG*01:12, HLA-G*01:14, HLA-G*01:15, HLA-G*01:16, HLA-G*01:17, HLA-G*01:18: HLAG*01:19, HLA-G*01:20 и HLA-G*01:22.

Консенсусные последовательности для таких аллелей HLA Е, -F и -G без каких-либо, или по существу без каких-либо, из лидерных, трансмембранных и цитоплазматических последовательностей пред

- 22 049816 ставлены на фиг. 12, и выровнены с консенсусными последовательностями вышеупомянутых аллелей HLA-A, -В и -С на фиг. 13.

На фиг. 12 представлена консенсусная последовательность для каждого из HLA-E, -F и -G с вариабельными положениями ак, показанными в виде последовательно пронумерованных остатков X, а положения ак 84, 139 и 236 дважды подчеркнуты.

На фиг. 13 представлено выравнивание консенсусных аминокислотных последовательностей для HLA-A, -В, -С, -Е, -F и -G, которые даны на фиг. 9-13. Вариабельные остатки в каждой последовательности перечислены в виде X с удаленной последовательной нумерацией. Как указано на фиг. 8, положения ак 84, 139 и 236 указаны с их фланкирующими кластерами из пяти аминокислот, которые могут быть замещены от 1 до 5 аминокислотами, независимо выбранными из также показанных (i) любой встречающейся в природе аминокислоты или (ii) любой встречающейся в природе аминокислоты, за исключением пролина или глицина.

Любые из вышеупомянутых аллелей HLA-E, -F и/или -G могут содержать замену в одном или более положениях 84, 139 и/или 236 как показано на фиг. 13 для консенсусных последовательностей. В некоторых случаях замены могут выбирать из: положения 84 замены тирозина на аланин (Y84A) или цистеин (Y84C), или, в случае HLA-F, замены R84A или R84C; положения 139 замены аланина на цистеин (А139С), или, в случае HLA-F, V139C; и замены аланина на цистеин в положении 236 (А236С). Кроме того, также может применяться последовательность HLA-E, -F и/или -G, имеющая по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%) или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательных аминокислот) любой из консенсусных последовательностей из изложенных на фиг. 13 (например, последовательности могут содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен в дополнение к изменениям по вариабельным остаткам, перечисленным в данном документе).

Н2К мыши.

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит аминокислотную последовательность MOUSE H2K (SEQ ID NO: 45) на (MOUSE H2K фиг. 8, или последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со всей или частью (например, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 последовательными аминокислотами) такой последовательности (например, она может содержать 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотных вставок, делеций и/или замен). В некоторых случаях, когда полипептид тяжелой цепи MOUSE H2K ТММР по данному изобретению имеет менее 100% идентичности с последовательностью, обозначенной MOUSE H2K на фиг. 8, она может содержать мутацию в одном или более положений 84, 139 и/или 236, выбранных из: замены тирозина на аланин в положении 84 (Y84A); тирозина на цистеин в положении 84 (Y84C); аланина на цистеин в положении 139 (А139С); и аланина на цистеин в положении 236 (А236С). В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи MOUSE H2K ТММР по данному изобретению содержит замены Y84A и А236С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи MOUSE H2K ТММР по данному изобретению содержит замены Y84C и А139С. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи MOUSE H2K ТММР по данному изобретению содержит замены Y84C, А139С и А236С.

- 23 049816

Примеры комбинаций

Ниже в табл. 1 представлены различные комбинации модификаций последовательности тяжелой цепи ГКГС I класса, которые могут включаться в ТММР по данному изобретению.

______________________________Таблица 1______________________________

Номер п/п	Последовательность тяжелой цепи HLA	Диапазон идентичностей последовательностей □	Конкретные замены в ак положении 84, 139 и/или 236
1	HLA-A Консенсусные (фиг. 9В)	75%-99,8%, 80%-99,8%, 85%-99,8%, 90%-99,8%, 95%-99,8%, 98%-99,8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен (не учитывая вариабельные остатки)	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
2	А0101, А0201, А0301, А1101, А2402, А2301, А2402, А2407, А3303 или А3401 (фиг. 9А)	75%-99,8%; 80%-99,8%; 85%-99,8%; 90%-99,8%; 95%-99,8%; 98%-99.8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
3	HLA-B Консенсусные (фиг. 10В)	75%-99,8%, 80%-99,8%, 85%-99,8%, 90%-99,8%, 95%-99,8%, 98%-99,8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен (не учитывая вариабельные остатки)	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
4	В0702, В0801, В1502, В3802, В4001, В4601 или В*5301 (фиг. 10А)	75%-99,8%; 80%-99,8%; 85%-99,8%; 90%-99,8%; 95%-99,8%; 98%-99.8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
5	HLA-C Консенсусные (фиг. 11В)	75%-99,8%, 80%-99,8%, 85%-99,8%, 90%-99,8%, 95%-99,8%, 98%-99,8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен (не учитывая вариабельные остатки)	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
6	С0102, С0303, С0304, С0401, С0602, С0701, С0801 или С1502 (фиг. ПА)	75%-99,8%; 80%-99,8%; 85%-99,8%; 90%-99,8%; 95%-99,8%; 98%-99.8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
7	HLA-E, F или G Консенсусные (фиг. 12)	75%-99,8%, 80%-99,8%, 85%-99,8%, 90%-99,8%, 95%-99,8%, 98%-99,8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен (не учитывая вариабельные остатки)	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)
8	Н2К мыши (фиг. 8)	75%-99,8%; 80%-99,8%; 85%-99,8%; 90%-99,8%; 95%-99,8%; 98%-99.8% или 99%-99,8%; или 1-25, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 или 20-25 ак вставок, делеций и/или замен	Отсутствует; Y84C; Y84A; А139С; А236С; (Y84A и А236С); (Y84C и А139С); или (Y84C, А139СиА236С)

□ Диапазон идентичностей последовательностей представляет собой допустимый диапазон идентичности последовательностей полипептидной последовательности ГКГС-Н, включенной в ТММР, относительно соответствующей части последовательностей, перечисленных на фиг. 8-13, не учитывая вариабельные остатки в консенсусных последовательностях.

Бета-2 микроглобулин.

Полипептид в2-микроглобулина (в2М) ТММР по данному изобретению может представлять собой полипептид в2М человека, полипептид в2М примата, отличного от человека, полипептид в2М мыши и тому подобное. В некоторых случаях полипептид в2М содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью в2М, представленной на фиг. 6. В некоторых случаях полипептид в2М содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 21-119 аминокислотной последовательностью в2М, представленной на фиг. 6.

В некоторых случаях пригодный полипептид в2М содержит следующую аминокислотную последовательность:

- 24 049816

IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:311);

а полипептид тяжелой цепи HLA I класса содержит следующую аминокислотную последовательность:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQE

GPEYWDGETRK VKAHSQTHRVDL(aa 1) { С } (аа2) AGSHT VQRM YGCD VGSD WRFLRGY HQ YAYDGKD YIALKEDLRS W(aa3 ) { С } (aa4))HKWE AAHVAEQLRAYLEGTC VEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE L(aa5)(C)(aa6)QKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID ΝΘ:309), где остатки цистеина, обозначенные как {С} образуют дисульфидную связь между спиралями α1 и α2-1, а остатки (С) образует дисульфидную связь с цистеином полипептида в2М в положении 12. В приведенной выше последовательности акк1 означает аминокислотный кластер 1; акк2 означает аминокислотный кластер 2; акк3 означает аминокислотный кластер 3, акк4 означает аминокислотный кластер 4, акк5 означает аминокислотный кластер 5; а акк6 означает аминокислотный кластер 6; см., например, фиг. 10. Каждое появление ак1, ак2, ак3, ак4, ак5 и ак6 независимо выбирают из 1-5 аминокислотных остатков, причем аминокислотные остатки i) выбирают независимо из любой встречающейся в природе (например, кодированной) аминокислоты или ii) любой встречающейся в природе аминокислоты, кроме пролина или глицина.

В некоторых случаях полипептид ГКГС содержит одну аминокислотную замену относительно эталонного полипептида ГКГС (где эталонный полипептид ГКГС может представлять собой полипептид ГКГС дикого типа), где одиночная аминокислотная замена заменяет аминокислоту остатком цистеина (Cys). Такие остатки цистеина, когда они присутствуют в полипептиде ГКГС первого полипептида ТММР по данному изобретению, могут образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим во второй полипептидной цепи ТММР по данному изобретению.

В некоторых случаях первый полипептид ГКГС в первом полипептиде ТММР по данному изобретению и/или второй полипептид ГКГС во втором полипептиде ТММР по данному изобретению содержат аминокислотную замену с заменой аминокислоты цистеином, причем замененный цистеин в первом полипептиде ГКГС образует дисульфидную связь с цистеином во втором полипептиде ГКГС, при этом цистеин в первом полипептиде ГКГС образует дисульфидную связь с замененным цистеином во втором полипептиде ГКГС, или при этом замененный цистеин, находящийся в первом полипептиде ГКГС, образует дисульфидную связь с замененным цистеином во втором полипептиде ГКГС.

Например, в некоторых случаях одна из следующих пар остатков в в2-микроглобулине HLA и тяжелой цепи HLA I класса заменяется цистеинами (где номера остатков соответствуют номерам в зрелом полипептиде): 1) остаток 12 в2М, остаток 236 тяжелой цепи HLAI класса; 2) остаток 12 в2М, остаток 237 тяжелой цепи HLAI класса; 3) остаток 8 в2М, остаток 234 тяжелой цепи HLA I класса; 4) остаток 10 в2М, остаток 235 тяжелой цепи HLAI класса; 5) остаток 24 в2М, остаток 236 тяжелой цепи HLAI класса; 6) остаток 28 в2М, остаток 232 тяжелой цепи HLA I класса; 7) остаток 98 в2М, остаток 192 тяжелой цепи HLAI класса; 8) остаток 99 в2М, остаток 234 тяжелой цепи HLAI класса; 9) остаток 3 в2М, остаток 120 тяжелой цепи HLA I класса; 10) остаток 31 в2М, остаток 96 тяжелой цепи HLA I класса; 11) остаток 53 в2М, остаток 35 тяжелой цепи HLA I класса; 12) остаток 60 в2М, остаток 96 тяжелой цепи HLA I класса; 13) остаток 60 в2М, остаток 122 тяжелой цепи HLA I класса; 14) остаток 63 в2М, остаток 27 тяжелой цепи HLA I класса; 15) остаток Arg3 e2M, остаток Gly120 тяжелой цепи HLA I класса; 16) остаток His31 e2M, остаток Gln96 тяжелой цепи HLA I класса; 17) остаток Asp53 e2M, остаток Arg35 тяжелой цепи HLA I класса; 18) остаток Trp60 в2М, остаток Gln96 тяжелой цепи HLA I класса; 19) остаток Trp60 в2М, остаток Asp122 тяжелой цепи HLA I класса; 20) остаток Tyr63 в2М, остаток Tyr27 тяжелой цепи HLA I класса; 21) остаток Lys6 e2M, остаток Glu232 тяжелой цепи HLA I класса; 22) остаток Gln8 e2M, остаток Arg234 тяжелой цепи HLA I класса; 23) остаток Tyr10 в2М, остаток Pro235 тяжелой цепи HLA I класса; 24) остаток Ser11 e2M, остаток Gln242 тяжелой цепи HLA I класса; 25) остаток Asn24 e2M, остаток А1а236 тяжелой цепи HLA I класса; 26) остаток Ser28 e2M, остаток Glu232 тяжелой цепи HLA I класса; 27) остаток Asp98 e2M, остаток Hisl92 тяжелой цепи HLA I класса и 28) остаток Met99 e2M, остаток Arg234 тяжелой цепи HLA I класса. Нумерация аминокислот тяжелой цепи ГКГС/HLA I класса относится к зрелой тяжелой цепи ГКГС/HLA I класса без сигнального пептида. Например, в некоторых случаях, остаток 236 зрелой аминокислотной последовательности HLA-A заменен на Cys. В некоторых случаях, остаток 236 зрелой аминокислотной последовательности HLA-B заменен на Cys. В некоторых случаях, остаток 236 зрелой аминокислотной последовательности HLA-C заменен на Cys. В некоторых случаях остаток 32 (соответствующий Arg-12 зрелого в2М) аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6 заменен на Cys.

- 25 049816

В некоторых случаях полипептид β2Μ содержит аминокислотную последовательность: IQRTPKIQVY SRHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:310).

В некоторых случаях полипептид в2М содержит аминокислотную последовательность: IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:311).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA I класса содержит аминокислотную последовательность:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:297).

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:312).

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:313).

В некоторых случаях полипептид в2М содержит следующую аминокислотную последовательность: IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE

HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:311);

а полипептид тяжелой цепи HLA I класса ТММР по данному изобретению содержит следующую аминокислотную последовательность:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQE GPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLR GYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVE WLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGED QTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:312), где остатки Cys, которые подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь друг с другом в ТММР.

В некоторых случаях полипептид в2М содержит аминокислотную последовательность: IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDW SFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:314).

В некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны дисульфидной связью друг с другом посредством: i) остатка Cys, присутствующего в линкере, соединяющем пептидный эпитоп и полипептид в2М в первой полипептидной цепи; и ii) остаток Cys, присутствующий в тяжелой цепи ГКГС I класса во второй полипептидной цепи. В некоторых случаях остаток Cys, присутствующий в тяжелой цепи ГКГС I класса, представляет собой Cys, введенный в качестве замены Y84C. В некоторых случаях линкер, соединяющий пептидный эпитоп и полипептид в2М в

- 26 049816 первой полипептидной цепи, представляет собой GCGGS(G4S)n (SEQ ID NO: 315), где n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Например, в некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:316).

В качестве другого примера, линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:317).

Примеры связанных дисульфидной связью первого и второго полипептидов ТММР по данному изобретению схематически изображены на фиг. 2A-2F.

Связанные множественными дисульфидными связями ТММР.

В некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны друг с другом по меньшей мере двумя дисульфидными связями (т.е. двумя межцепочечными дисульфидными связями). Примеры таких связанных множественными дисульфидными связями ТММР схематически изображена на фиг. 17А и 17В, и на фиг. 18А-18С. Кроме того, когда ТММР по данному изобретению содержит полипептид IgFc, гетеродимерный ТММР может димеризоваться, так что дисульфидные связи соединяют полипептиды IgFc в два гетеродимерных ТММР. Такое расположение схематически изображено на фиг. 17С и 17D, где дисульфидные связи представлены пунктирными линиями. Если не указано иное, по меньшей мере две дисульфидные связи, описанные у связанных множественными дисульфидными связями ТММРР в этой разделе, не относятся к дисульфидным связям, связывающим полипептиды IgFc в димеризованных ТММР.

Как отмечалось выше, в некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны друг с другом по меньшей мере двумя дисульфидными связями (т.е. двумя межцепочечными дисульфидными связями). Например, в некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны между собой 2 межцепочечными дисульфидными связями. В качестве другого примера, в некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны между собой 3 межцепочечными дисульфидными связями. В качестве другого примера, в некоторых случаях первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению связаны между собой 4 межцепочечными дисульфидными связями.

В некоторых случаях, когда пептидный эпитоп в первом полипептиде ТММР по данному изобретению связан с полипептидом в2М линкером, содержащим Cys по меньшей мере одной из двух дисульфидный связей Cys в линкере, с Cys в тяжелой цепи ГКГС I класса во втором полипептиде. В некоторых случаях, когда пептидный эпитоп в первом полипептиде ТММР по данному изобретению связан с полипептидом тяжелой цепи ГКГС I класса линкером, по меньшей мере одной из двух дисульфидный связей Cys в линкере, с Cys в полипептиде в2М во втором полипептиде.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) проявляет повышенную стабильность по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей. В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) по данному изобретению проявляет повышенную стабильность in vitro по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей. Например, в некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) проявляет по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз большую стабильность in vitro, по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей.

Можно определить, проявляет ли связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) повышенную стабильность in vitro по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей, путем измерения количества связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР по данному изобретению, присутствующего в образце в течение определенного времени и/или при определенном состоянии, и/или во время очистки ТММР.

Например, в некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) по данному изобретению проявляет по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз большую устойчивость in vitro по сравнению с контрольным ТММР, который включает только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей, когда ТММР хранится при температуре 37°С в течение определенного периода времени (например, в течение периода времени от около 1 недели до около 2 недель, от около 2 недель до около 4 недель или от около 4 недель до около 2 месяцев). Например, в некоторых случаях количество связанного дисульфидной связью гетеродимерного ТММР, оставшееся после хранения связанного множественными дисульфидными связями ТММР (на

- 27 049816 пример, связанного двумя дисульфидными связями ТММР) по данному изобретению in vitro при 37°С в течение 28 дней составляет по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз большее количество связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР, оставшегося после хранения контрольного ТММР (ТММР, включающего только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей, присутствующих в связанном множественными дисульфидными связями ТММР) в пробирке при 37°С в течение 28 дней.

В качестве примера, связанный двумя дисульфидными связями ТММР, содержащий полипептиды 1715 и 2380, как изображено на фиг. 14А и 14В, проявляет более высокую стабильности in vitro, по сравнению с ТММР, содержащим полипептиды 2405 и 2380, причем полипептид 2405 изображен на фиг. 14D, при этом такой ТММР содержит только одну дисульфидную связь, где одна дисульфидная связь образована между: i) Cys из линкера G2C между эпитопом и в2М; и ii) Cys, предоставленного заменой Y84C в тяжелой цепи ГКГС I класса. В качестве другого примера, связанный двумя дисульфидными связями ТММР, содержащий полипептиды 1715 и 2380, как изображено на фиг. 14А и 14В, проявляет более высокую стабильности in vitro, по сравнению с ТММР, содержащим полипептиды 1380 и 2380, причем полипептид 1380 изображен на фиг. 14Е, причем такой ТММР содержит только одну дисульфидную связь, при этом одна дисульфидная связь образована: i) Cys, предоставленного заменой R12C в полипептиде в2М; и ii) Cys, предоставленного заменой А236С в тяжелой цепи ГКГС I класса.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР данному изобретению проявляет повышенную стабильность in vitro по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей. Например, в некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению проявляет по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раза или по меньшей мере в 10 раз большую стабильность in vivo, по сравнению с контрольным ТММР, включающим только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей.

В некоторых случаях наличие двух дисульфидных связей в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР) создается для увеличения продуцирования связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР, по сравнению с количеством связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР, получаемого когда ТММР представляет собой контрольный ТММР, включающий только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей. Например, связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) могут продуцировать в клетке млекопитающего при культивировании клеток in vitro, когда клетку млекопитающего культивируют в жидкой среде для культивирования клеток. ТММР может секретироваться в среду для культивирования клеток. Клетки могут лизировать, создавая лизат клеток, и в лизате клеток может присутствовать ТММР. ТММР могут очищать от среды культивирования клеток и/или лизата клеток. Например, когда ТММР содержит полипептид Fc IgG1, среду культивирования клеток и/или лизат клеток могут приводить в контакт с иммобилизированным белком А (например, среду культивирования клеток и/или лизат клеток могут наносить на колонку с белком А, где белок А иммобилизирован на гранулах). ТММР, присутствующий в среде культивирования клеток и/или лизате клеток, связывается с иммобилизированным белком А. После промывания колонки для удаления несвязанных веществ элюируют связанный ТММР, получая элюат белка А. Количество связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР, присутствующего в элюате белка А, составляет по меньшей мере на 0,5%, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9% или по меньшей мере на 10% больше количества связанного дисульфидными связями гетеродимерного ТММР, присутствующего в элюате белка А, когда ТММР представляет собой контрольный ТММР, который содержит только одну из по меньшей мере двух дисульфидных связей, присутствующих в связанном множественными дисульфидным связями ТММР (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР). В некоторых случаях процентное содержание общего белка ТММР в элюате, который представляет собой неагрегированный связанный дисульфидными связями гетеродимерный ТММР, составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%. Элюат белка А могут подвергать эксклюзионной хроматографии (SEC) и/или одному или более другим дополнительным этапам очистки.

В некоторых случаях модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по данному изобретению включает по меньшей мере один гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп WT1, причем пептид WT1 имеет длину по меньшей мере 4 аминокислоты (например, от 4 аминокислот до 25 аминокислот; например пептид WT1 имеет длину 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-15, 15-20 или 20-25 аминокислот); и ii) первый полипептид ГКГС; b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС, и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, при этом первый и/или вто

- 28 049816 рой полипептид содержит иммуномодулирующий полипептид, и причем гетеродимер содержит 2 дисульфидные связи между первым полипептидом и вторым полипептидом (т.е. гетеродимер состоит из: i) первой дисульфидной связи, связывающей первый полипептид и второй полипептид; и ii) второй дисульфидной связи, связывающей первый полипептид и второй полипептид). Другими словами, первый полипептид содержит первый остаток Cys, образующий дисульфидную связь (первая дисульфидная связь) с первым остатком Cys во втором полипептиде; и первый полипептид содержит второй остаток Cys, образующий дисульфидную связь (вторую дисульфидную связь) со вторым остатком Cys во втором полипептиде.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп; ii) пептидный линкер и iii) полипептид в2М; и b) второй полипептид, содержащий полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса, причем один или оба из первого и второго полипептидов содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, при этом ТММР содержит: а) первую дисульфидную связь между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидным эпитопом и полипептидом в2М; и ii) первый Cys, введенный в полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и b) по меньшей мере вторую дисульфидную связь между первым полипептидом и вторым полипептидом, где по меньшей мере вторая дисульфидная связь находится между: i) Cys в первом полипептиде, который является С-концевым к Cys, присутствующему в линкере; и ii) Cys во втором полипептиде, который является С-концевым к первому Cys, введенному в полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса.

В некоторых случаях первый и второй образующие дисульфидные связи остатки Cys в первом или втором полипептиде ТММР по данному изобретению находятся на расстоянии от около 10 аминокислот до около 200 аминокислот друг от друга. Например, в некоторых случаях, первый и второй образующие дисульфидные связи остатки Cys в первом или втором полипептиде ТММР по данному изобретению находятся на расстоянии от около 10 аминокислот (ак) до около 15 ак, от около 15 ак до около 20 ак, от около 20 ак до около 25 ак, от около 25 ак до около 30 ак, от около 30 ак до около 40 ак, от около 40 ак до около 50 ак, от около 50 ак до около 60 ак, от около 60 ак до около 70 ак, от около 70 ак до около 80 ак, от около 80 ак до около 90 ак, от около 90 ак до около 100 ак, от около 100 ак до около 110 ак, от около 110 ак до около 120 ак, до около 120 ак до около 130 ак, от около 130 ак до около 140 ак, от около 140 ак до около 150 ак, от около 150 ак до около 160 ак, от около 160 ак до около 170 ак, от около 170 ак до около 180 ак, от около 180 ак до около 190 ак или от около 190 ак до около 200 ак.

В качестве примера, в некоторых случаях первый и второй образующие дисульфидные связи остатки Cys в первом полипептиде ТММР по данному изобретению находятся на расстоянии от около 10 аминокислот до около 80 аминокислотных остатков друг от друга. Например, в некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys в первом полипептиде находится на расстоянии от около 10 аминокислот до около 80 аминокислот (например, от около 10 аминокислот (ак) до около 15 ак, от около 15 ак до около 20 ак, от около 20 ак до около 25 ак, от около 25 ак до около 30 ак, от около 30 ак до около 40 ак, от около 40 ак до около 50 ак, от около 50 ак до около 60 ак, от около 60 ак до около 70 ак или от около 70 ак до около 80 ак) в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys в первом полипептиде. В некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys в первом полипептиде является 10 ак, 11 ак, 12 ак, 13 ак, 14 ак, 15 ак, 16 ак, 17 ак, 18 ак, 19 ак, 20 ак, 21 ак, 22 ак, 23 ак, 24 ак или 25 ак в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys в первом полипептиде. В некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys в первом полипептиде является 15 ак в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys в первом полипептиде. В некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys в первом полипептиде является 20 ак в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys в первом полипептиде. В некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys в первом полипептиде является 25 ак в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys в первом полипептиде.

В некоторых случаях первый и второй образующие дисульфидные связи остатки Cys во втором полипептиде ТММР по данному изобретению находятся на расстоянии от около 140 аминокислот до около 160 аминокислотных остатков друг от друга. Например, в некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys во втором полипептиде находится на расстоянии от около 140 аминокислот до около 160 аминокислот в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys во втором полипептиде. В некоторых случаях второй образующий дисульфидную связь остаток Cys во втором полипептиде является 140 аминокислотой (ак), 141 ак, 142 ак, 143 ак, 144 ак, 145 ак, 146 ак, 147 ак, 148 ак, 149 ак, 150 ак, 151 ак, 152 ак, 153 ак, 154 ак, 155 ак, 156 ак, 157 ак, 158 ак, 159 ак или 160 ак в направлении С-конца к первому образующему дисульфидную связь остатку Cys во втором полипептиде.

Связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) может содержать: а) первый полипептид содержащий: i) пептид WT1 (например, пептид WT1 из от 4 аминокислот до около 25 аминокислот); и ii) первый по

- 29 049816 липептид ГКГС, причем первый полипептид содержит пептидный линкер между пептидом WT1 и первым полипептидом ГКГС, причем пептидный линкер содержит остаток Cys, и при этом первый полипептид ГКГС представляет полипептид в2М, содержащий аминокислотную замену, которая вводит остаток Cys; b) и второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС, причем второй полипептид ГКГС представляет собой тяжелую цепь I класса, содержащую замену Y84C и замену А236С, на основе аминокислотной нумерации HLA-A*O2O1 (изображенной на фиг. 9А), или в соответствующих положениях другого аллеля тяжелой цепи I класса, причем ТММР содержит дисульфидную связь между остатком Cys в пептидном линкере и остатком Cys в аминокислотном положении 84 тяжелой цепи I класса или соответствующего положения другого аллеля тяжелой цепи I класса, и при этом ТММР содержит дисульфидную связь между введенным остатком Cys в полипептиде в2М и Cys в аминокислотном положении 236 тяжелой цепи I класса или соответствующего положения другого аллеля тяжелой цепи I класса; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. Примеры схематически изображены на фиг. 17А и фиг. 17В.

В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS (SEQ ID NO: 318). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 319), где n является целым числом от 1 до 10. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 398), где n равен 1. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 320), где n равен 2. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 321), где n равен 3. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 322), где n равен 4. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 323), где n равен 5. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID ID NO: 324), где n равен 6. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 325), где n равен 7. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 326), где n равен 8. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 327), где n равен 9. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 328), где n равен 10.

В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS (SEQ ID NO: 329). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 330), где n является целым числом от 1 до 10. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 331), где n равен 1. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 332), где n равен 2. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 333), где n равен 3. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 334), где n равен 4. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 335), где n равен 5. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 336), где n равен 6. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n(SEQ ID NO: 337), где n равен 7. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 338), где n равен 8. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 339), где n равен 9. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность CGGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 340), где n равен 10.

Следующие примеры представляют собой неограничивающие примеры тяжелой цепи ГКГС I класса, содержащие замену Y84C и замену А236С, на основе аминокислотной нумерации HLA-A*0201 (изображенной на фиг. 9А), или в соответствующих положениях в другом аллеле тяжелой цепи I класса.

HLA-A.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит: а) первый полипептид содержащий: i) пептид WT1 (например, пептид WT1 из от 4 аминокислот до около 25 аминокислот); и ii) первый полипептид ГКГС, причем первый полипептид содержит пептидный линкер между пептидом WT1 и первым полипептидом ГКГС, причем пептидный линкер содержит остаток Cys, и при этом первый полипептид ГКГС представляет полипептид в2М, содержащий аминокислотную замену, которая вводит остаток Cys; b) и второй полипептид, содержащий тяжелую цепь HLA-A ГКГС I класса, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей

- 30 049816 мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:341), где аминокислота 84 представляет собой Cys и аминокислота 236 представляет собой Cys; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS (SEQ ID NO: 318). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 319), где n является целым числом от 1 до 10. В некоторых случаях полипептид в2М содержит замену R12C. Например, полипептид в2М может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDW

SFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:314), где аминокислота 12 представляет собой Cys. По меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может быть полипептидом, который оказывает активирующее/стимулирующее воздействие на Тклетку-мишень или супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку-мишень. Например, по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может представлять собой цитокин (например, полипептид IL2, полипептид IL7, полипептид IL12, полипептид IL15, полипептид IL17, полипептид IL21, полипептид IL27, полипептид IL-23, полипептид TGFe и т.п.; и включая все члены семейства, например, IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-17E), полипептид 4-1BBL, полипептид ICOS-L, полипептид OX-40L, полипептид CD80, полипептид CD86, (CD80 и CD86 также известные как В7-1 и В7-2 соответственно), полипептид CD40, полипептид CD70, полипептид JAG1 (CD339), полипептид ICAM (CD540), полипептид PD-L1, полипептид FasL, полипептид PD-L2, полипептид PD-1H (VISTA), полипептид ICOS-L (CD275), полипептид GITRL, полипептид HVEM, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 и полипептид CX3CL1, полипептид галектин-9, полипептид CD83, полипептид CD30L, полипептид HLA-G, полипептид MICA, полипептид MICB, полипептид HVEM (CD270), полипептид рецептора лимфотоксина бета, полипептид 3/TR6, полипептид ILT3, полипептид ILT4, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 или полипептид CX3CL1. Эти иммуномодулирующие полипептиды могут представлять собой полипептид дикого типа или вариант полипептида дикого типа. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой активирующий (стимулирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить активирующее/стимулирующее воздействие на Т-клетку. Примеры активирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, например, CD80, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD70, ICOS-L, CD40, ICAM (CD54), IL2, IL7, IL12, IL15, IL17, IL21, IL27, IL23, GITRL, TGFe и рецептор лимфотоксина бета. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой ингибирующий (супрессирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку. Примеры ингибирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, например, PD-1H, PD-L1, PD-L2, TGFe, FasL, HVEM, галектин-9, ILT3 и ILT4. В зависимости от контекста, полипептиды TGFe могут производить либо активирующее/стимулирующее воздействие или супрессирующее/ингибирующее воздействие.

В некоторых случаях по меньшей мере одни иммуномодулирующий полипептид является вариантом с пониженной аффинностью, как описанные в другом месте данного документа. В некоторых случаях первый или второй полипептид содержит полипептид Fclg

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит полипептид тяжелой цепи HLA-A l класса. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

- 31 049816

HLAA*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A* 1101, HLA-A*2301, HLA-A*2402, HLAA*2407, HLA-A*3303 или HLA-A*3401, изображенной на фиг. 9А, причем полипептид тяжелой цепи HLA-A содержит замены Y84C и А236С. HLA-A*0101 (Y84C; A236C).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*0101 (Y84C; А236С): GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQ

EGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGCYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLR GYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDG LRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQT QDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:343), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*0201 (Y84C; A236C).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*0201 (Y84C; А236С): GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:341), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*0202 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*O2O2 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:341), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*1101 (Y84C; A236C).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*1101 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGCYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQD AYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGRCVEWLRRYL ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL VETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:344), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*2301 (Y84C; A236C).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множест- 32 049816 венными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*2301 (Y84C; А236С): GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQY AYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVDGLRRYLE NGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:345), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*2402 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*2402 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQY AYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYL ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL VETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:346), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-A*2407 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*2407 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDEETGKVKAQSQTDRENLRIALRCYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQY AYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYL ENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL VETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:347), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-A*3303 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*3303 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFTTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQ

EGPEYWDRNTRNVKAHSQIDRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTIQMMYGCDVGSDGRFLR

GYQQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGTCVEW

LRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQT

QDTELVETRPCGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID

NO:348), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-A*3401 (Y84C; A236C).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-A, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-A*3401 (Y84C; А236С):

- 33 049816

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDRNTRKVKAQSQTDRVDLGTLRGCYNQSEDGSHTIQRMYGCDVGPDGRFLRGYQQ DAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWETAHEAEQWRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:349), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-B.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит: а) первый полипептид содержащий: i) пептид WT1 (например, пептид WT1 из от 4 аминокислот до около 25 аминокислот); и ii) первый полипептид ГКГС, причем первый полипептид содержит пептидный линкер между пептидом WT1 и первым полипептидом ГКГС, причем пептидный линкер содержит остаток Cys, и при этом первый полипептид ГКГС представляет полипептид в2М, содержащий аминокислотную замену, которая вводит остаток Cys; b) и второй полипептид, содержащий тяжелую цепь HLA-B ГКГС I класса, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEY

WDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQY AYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLE NGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:350), где аминокислота 84 представляет собой Cys и аминокислота 236 представляет собой Cys; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS (SEQ ID NO: 318). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 342), где n является целым числом от 1 до 10. В некоторых случаях полипептид в2М содержит замену R12C. Например, полипептид в2М может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDW

SFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:314), где аминокислота 12 представляет собой Cys. По меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может быть полипептидом, который оказывает активирующее/стимулирующее воздействие на Тклетку-мишень или супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку-мишень. Например, по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может представлять собой цитокин (например, полипептид IL2, полипептид IL7, полипептид IL12, полипептид IL15, полипептид IL17, полипептид IL21, полипептид IL27, полипептид IL-23, полипептид TGFe и т.п.; и включая все члены семейства, например, IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-17E), полипептид 4-1BBL, полипептид ICOS-L, полипептид OX-40L, полипептид CD80, полипептид CD86, (CD80 и CD86 также известные как В7-1 и В7-2 соответственно), полипептид CD40, полипептид CD70, полипептид JAG1 (CD339), полипептид ICAM (CD540), полипептид PD-L1, полипептид FasL, полипептид PD-L2, полипептид PD-1H (VISTA), полипептид ICOS-L (CD275), полипептид GITRL, полипептид HVEM, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 и полипептид CX3CL1, полипептид галектин-9, полипептид CD83, полипептид CD30L, полипептид HLA-G, полипептид MICA, полипептид MICB, полипептид HVEM (CD270), полипептид рецептора лимфотоксина бета, полипептид 3/TR6, полипептид ILT3, полипептид ILT4, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 или полипептид CX3CL1. Эти иммуномодулирующие полипептиды могут представлять собой полипептид дикого типа или вариант полипептида дикого типа. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой активирующий (стимулирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить активирующее/стимулирующее воздействие на Т-клетку. Примеры активирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, например, CD80, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD70, ICOS-L, CD40, ICAM (CD54), IL2, IL7, IL12, IL15, IL17, IL21, IL27, IL23, GITRL, TGFe и рецептор лимфотоксина бета. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой ингибирующий (супрессирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку. Примеры ингибирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, на

- 34 049816 пример, PD-1H, PD-L1, PD-L2, TGFe, FasL, HVEM, галектин-9, ILT3 и ILT4. В зависимости от контекста, полипептиды TGFe могут производить либо активирующее/стимулирующее воздействие или супрессирующее/ингибирующее воздействие.

В некоторых случаях по меньшей мере одни иммуномодулирующий полипептид является вариантом с пониженной аффинностью, как описанные в другом месте данного документа. В некоторых случаях первый или второй полипептид содержит полипептид FcIg

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит полипептид тяжелой цепи HLA-B I класса. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью HLA-B*O7O2, HLA-B*0801, HLA-B*1502, HLA-B*3802, HLA-B*4001, HLA-B*4601 или HLA-B*5301, изображенной на фиг. 10А, причем полипептид тяжелой цепи HLA-B содержит замены Y84C и А236С.

HLA-B*0702 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*0702 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQE

GPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRG HDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLR RYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQD TELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:350), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-B*0801 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*0801 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFDTAMSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQE

GPEYWDRNTQIFKTNTQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGH NQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQDRAYLEGTCVEWLR RYLENGKDTLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQD TELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID

NO:351), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-B*1502 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*1502 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQ

EGPEYWDRNTQISKTNTQTYRESLRNLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRG YDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWLR RYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQD TELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID

NO:352), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-B*3802 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисуль

- 35 049816 фидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*3802 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQE GPEYWDRNTQICKTNTQTYRENLRTALRCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLRG HNQFAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRTYLEGTCVEWLR RYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQD TELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:353), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-B*4001 (Y84C; А2346С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*4001 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFHTAMSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDATSPRKEPRAPWIEQE GPEYWDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLRGH NQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQISQRKLEAARVAEQLRAYLEGECVEWLRR YLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDT ELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO :3 54) где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-B*4601 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*4601 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQ EGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDVGPDGRLLR GHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQWRAYLEGLCVEW LRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQ DTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:355), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-B*5301 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-B, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-B*5301 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQ EGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRENLRIALRCYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGH DQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRR YLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDT ELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:356), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-C.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит: а) первый полипептид содержащий: i) 1 пептид WT-1 (например, пептид WT-1 из от 4 аминокислот до около 25 аминокислот); и ii) первый полипептид ГКГС, причем первый полипептид содержит пептидный линкер между пептидом WT-1 и первым полипептидом ГКГС, причем пептидный линкер содержит остаток Cys, и при этом первый полипептид ГКГС представляет полипептид в2М, содержащий аминокислотную замену,

- 36 049816 которая вводит остаток Cys; b) и второй полипептид, содержащий тяжелую цепь HLA-C ГКГС I класса, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEY WDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYDQ SAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLE NGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV ETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:357), где аминокислота 84 представляет собой Cys и аминокислота 236 представляет собой Cys; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS (SEQ ID NO: 318). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)n (SEQ ID NO: 342), где n является целым числом от 1 до 10. В некоторых случаях полипептид в2М содержит замену R12C. Например, полипептид в2М может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

TQRTPKTQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDTEVDLLKNGERTEKVEHSDLSFSKDW

SFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:314), где аминокислота 12 представляет собой Cys. По меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может быть полипептидом, который оказывает активирующее/стимулирующее воздействие на Тклетку-мишень или супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку-мишень. Например, по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид может представлять собой цитокин (например, полипептид IL2, полипептид IL7, полипептид IL12, полипептид IL15, полипептид IL17, полипептид IL21, полипептид IL27, полипептид IL-23, полипептид TGFe и т.п.; и включая все члены семейства, например, IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, Il-Ite, IL-17F, IL-17E), полипептид 4-1BBL, полипептид ICOS-L, полипептид OX-40L, полипептид CD80, полипептид CD86, (CD80 и CD86 также известные как В7-1 и В7-2 соответственно), полипептид CD40, полипептид CD70, полипептид JAG1 (CD339), полипептид ICAM (CD540), полипептид PD-L1, полипептид FasL, полипептид PD-L2, полипептид PD-1H (VISTA), полипептид ICOS-L (CD275), полипептид GITRL, полипептид HVEM, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 и полипептид CX3CL1, полипептид галектин-9, полипептид CD83, полипептид CD30L, полипептид HLA-G, полипептид MICA, полипептид MICB, полипептид HVEM (CD270), полипептид рецептора лимфотоксина бета, полипептид 3/TR6, полипептид ILT3, полипептид ILT4, полипептид CXCL10, полипептид CXCL9, полипептид CXCL11, полипептид CXCL13 или полипептид CX3CL1. Эти иммуномодулирующие полипептиды могут представлять собой полипептид дикого типа или вариант полипептида дикого типа. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой активирующий (стимулирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить активирующее/стимулирующее воздействие на Т-клетку. Примеры активирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, например, CD80, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD70, ICOS-L, CD40, ICAM (CD54), IL2, IL7, IL12, IL15, IL17, IL21, IL27, IL23, GITRL, TGFe и рецептор лимфотоксина бета. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой ингибирующий (супрессирующий) иммуномодулирующий полипептид, например, иммуномодулирующий полипептид может производить супрессирующее/ингибирующее воздействие на Т-клетку. Примеры ингибирующих иммуномодулирующих полипептидов включают, например, PD-1H, PD-L1, PD-L2, TGFe, FasL, HVEM, галектин-9, ILT3 и ILT4. В зависимости от контекста, полипептиды TGFe могут производить либо активирующее/стимулирующее воздействие или супрессирующее/ингибирующее воздействие.

В некоторых случаях по меньшей мере одни иммуномодулирующий полипептид является вариантом с пониженной аффинностью, как описанные в другом месте данного документа. В некоторых случаях первый или второй полипептид содержит полипептид FcIg.

В некоторых случаях связанный множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанный двумя дисульфидными связями ТММР) содержит полипептид тяжелой цепи HLA-C I класса. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью HLA-C*O1O2, HLA-C*0303, HLA-C*0304, HLA-C*0401, HLA-C*0602, HLA-C*0701, HLA-C*0702, HLA-C*0801 или HLA-C*1502, изображенной на

- 37 049816 фиг. 11А, причем полипептид тяжелой цепи HLA-C содержит замены Y84C и А236С.

HLA-C*01:02 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*01:02 (Y84C; А236С):

CSHSMKYFFTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQE

GPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQWMCGCDLGPDGRLLR

GYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEW

LRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQT

QDTELVETRPCGDGTFQKWAAVMVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP (SEQ ID

NO:358), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-^0303 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*03:03 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ

EGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEARSHIIQRMYGCDVGPDGRLLR

GYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWL

RRYLKNGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQT

QDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP (SEQ ID

NO:359), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-C*0304 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*03:04 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ

EGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLR

GYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGLCVEWL

RRYLKNGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQT

QDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP (SEQ ID

NO :3 60), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-C*0401 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*04:01 (Y84C; А236С):

GSHSMRYFSTSVSWPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPREPWVEQ

EGPEYWDRETQKYKRQAQADRVNLRKLRGCYNQSEDGSHTLQRMFGCDLGPDGRLLR

GYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWL

RRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQT

QDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWKP (SEQ ID

NO:361), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

HLA-C*0602 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисуль

- 38 049816 фидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*06:02 (Y84C; А236С):

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ EGPEYWDRETQKYKRQAQADRVNLRKLRGCYNQSEDGSHTLQWMYGCDLGPDGRLL RGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQWRAYLEGTCVE WLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGED QTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP (SEQ ID NO :3 62), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-C*0701 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*07:01 (Y84C; А236С):

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ EGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLR GYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWL RRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQ DTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:357), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-C*0702 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*07:02 (Y84C; А236С):

CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ EGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMSGCDLGPDGRLLR GYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLEGTCVEWL RRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQ DTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:404), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-C*0801 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*08:01 (Y84C; А236С):

CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQ EGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGCYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLR GYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARTAEQLRAYLEGTCVEWL RRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQ DTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGP (SEQ ID NO:363), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys. HLA-C*1502 (Y84C; А236С).

В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA-C, присутствующий в связанном множественными дисульфидными связями ТММР по данному изобретению (например, связанном двумя дисульфидными связями ТММР), содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью HLA-C*15:02 (Y84C; А236С):

- 39 049816

CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPHFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQ EGPEYWDRETQNYKRQAQTDRVNLRKLRGCYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLR GHDQLAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGTCVEWL RRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQ DTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEP (SEQ ID NO :3 64), где аминокислота 84 представляет собой Cys, и аминокислота 236 представляет собой Cys.

Каркасные полипептиды.

ТММР может содержать полипептид Fc или может содержать другой подходящий каркасный полипептид.

Подходящие каркасные полипептиды включают каркасные полипептиды на основе антител и каркасы не на основе антител. Не основанные на антителах каркасы включают, например, альбумин, полипептид XTEN (удлиненный рекомбинантный), трансферрин, полипептид рецептора Fc, эластиноподобный полипептид (см., например, Hassouneh et al. (2012) Methods Enzymol. 502:215; например, полипептид, содержащий пентапептидную повторяющуюся единицу (Val-Pro-Gly-X-Gly; SEQ ID NO: 59), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от пролина), альбумин-связывающий полипептид, шелкоподобный полипептид (см., например, Valluzzi et al. (2002) Philos Trans R Soc bond В Biol Sci. 357:165), шелк-эластиноподобный полипептид (SELP; см., например, Megeed et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54:1075) и тому подобное. Подходящие полипептиды XTEN включают, например, полипептиды, раскрытые в WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682 и US 2009/0092582; см. также Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol. 27:1186). Пригодные полипептиды альбумина включают, например, человеческий сывороточный альбумин.

Подходящие каркасные полипептиды в некоторых случаях будут представлять собой полипептиды, увеличивающие период полувыведения. Таким образом, в некоторых случаях подходящий каркасный полипептид увеличивает период полувыведения in vivo (например, период полувыведения из сыворотки) ТММР по сравнению с контрольным ТММР, в котором отсутствует каркасный полипептид. Например, в некоторых случаях каркасный полипептид увеличивает период полувыведения in vivo (например, период полувыведения из сыворотки) ТММР по сравнению с контрольным ТММР, в котором отсутствует каркасный полипептид, на по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 50%, в по меньшей мере около 2 раза, в по меньшей мере около 2,5 раза, в по меньшей мере около 5 раз, в по меньшей мере около 10 раз, в по меньшей мере около 25 раз, в по меньшей мере около 50 раз, в по меньшей мере около 100 раз или более чем в 100 раз. В качестве примера, в некоторых случаях полипептид Fc увеличивает период полувыведения in vivo (например, период полувыведения из сыворотки) ТММР по сравнению с контрольным ТММР, в котором отсутствует полипептид Fc, на по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 50%, в по меньшей мере около 2 раза, в по меньшей мере около 2,5 раза, в по меньшей мере около 5 раз, в по меньшей мере около 10 раз, в по меньшей мере около 25 раз, в по меньшей мере около 50 раз, в по меньшей мере около 100 раз или более чем в 100 раз.

Полипептиды Fc.

В некоторых случаях первая и/или вторая полипептидная цепь ТММР по данному изобретению содержит полипептид Fc. Полипептид Fc ТММР может представлять собой Fc IgG1 человека, Fc IgG2 человека, Fc IgG3 человека, Fc IgG4 человека и т.д. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности области Fc, изображенной на фиг. 5A-5G. В некоторых случаях область Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgG1 человека, представленным на фиг. 5А. В некоторых случаях область Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgG1 человека, представленным на фиг. 5А; и содержит замену N77; например, полипептид Fc содержит замену N77A. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности

- 40 049816 аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgG2 человека, представленным на фиг. 5А; например, полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 99-325 полипептида Fc IgG2 человека, представленного на фиг. 5А. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgG3 человека, представленным на фиг. 5А; например, полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 19-246 полипептида Fc IgG3 человека, представленного на фиг. 5А. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgM человека, представленным на фиг. 5В; например, полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 1-276 полипептида Fc IgM человека, представленного на фиг. 5В. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgA человека, представленным на фиг. 5С; например, полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 1-234 полипептида Fc IgA человека, представленного на фиг. 5С.

В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом Fc IgG4 человека, представленным на фиг. 5С. В некоторых случаях полипептид Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами от 100 до 327 полипептида Fc IgG4 человека, представленного на фиг. 5С.

В некоторых случаях полипептид Fc IgG4 содержит следующую аминокислотную последовательность:

PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:365).

В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5А (Fc IgG1 человека). В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5А (Fc IgG1 человека), за исключением замены N297 (N77 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотой, отличной от аспарагина. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5С (Fc IgG1 человека, содержащий замену N297A), которая представляет собой N77 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А). В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5А (Fc IgG1 человека), за исключением замены L234 (L14 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотой, отличной от лейцина. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5A (Fc IgG1 человека), за исключением замены

- 41 049816

L235 (L15 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотой, отличной от лейцина.

В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5Е. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5F. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5G (Fc IgG1 человека, содержащий замену L234A и замену L235A, соответствующие положениям 14 и 15 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5G). В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5А (Fc IgG1 человека), за исключением замены Р331 (Р111 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотой, отличной от пролина; в некоторых случаях замена представляет собой замену P331S. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5A (Fc IgG1 человека), за исключением замен в L234 и L235 аминокислотами (L14 и L15 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) с аминокислотами, отличными от лейцина. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5A (Fc IgG1 человека), за исключением замен в L234 и L235 аминокислотами (L14 и L15 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотами, отличными от лейцина, и заменой Р331 (Р111 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А) аминокислотой, отличной от пролина. В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, содержит аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5Е (Fc IgG1 человека, содержащий замены L234F, L235E и P331S (соответствующие аминокислотным положениям 14, 15 и 111 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5Е). В некоторых случаях полипептид Fc, присутствующий в ТММР, представляет собой полипептид Fc IgG1, который содержит замены L234A и L235A (замены L14 и L15 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5А с Ala), как изображено на фиг. 5G.

Линкеры.

ТММР по данному изобретению может содержать один или более линкеров, причем один или более линкеров находятся между одним или более из: i) полипептида ГКГС I класса и полипептида Fc Ig, при этом такой линкер упоминается в данном документе, как L1; ii) иммуномодулирующего полипептида и полипептида ГКГС I класса, при этом такой линкер обозначен в данном документе как L2; iii) первого иммуномодулирующего полипептида и второго иммуномодулирующего полипептида, причем такой линкер обозначен в данном документе как L3; iv) пептидного антигена (эпитопа) и полипептида ГКГС I класса; v) полипептида ГКГС I класса и димеризационного полипептида (например, первый или второй член димеризующей пары); и vi) димеризационного полипептида (например, первый или второй член димеризующей пары) и полипептида IgFc.

Подходящие линкеры (также называемые спейсерами) могут быть легко выбраны и могут иметь любую из ряда подходящих длин, таких как от 1 аминокислоты до 25 аминокислот, от 3 аминокислот до 20 аминокислот, от 2 аминокислот кислот до 15 аминокислот, от 3 до 12 аминокислот, в том числе от 4 до 10 аминокислот, от 5 до 9 аминокислот, от 6 до 8 аминокислот или от 7 до 8 аминокислот. Подходящий линкер может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину. В некоторых случаях линкер имеет длину от 25 аминокислот до 50 аминокислот, например, от 25 до 30, от 30 до 35, от 35 до 40, от 40 до 45 или от 45 до 50 аминокислот.

Типичные линкеры включают полимеры глицина (G)n, полимеры глицина-серина (включая, например, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 366) и (GGGS)n(SEQ ID NO: 367), где n представляет собой целое число, по меньшей мере один), полимеры глицин-аланин, полимеры аланин-серин и другие гибкие линкеры, известные в данной области техники. Могут быть использованы полимеры глицина и глицинасерина; как Gly, так и Ser относительно неструктурированы и, следовательно, могут служить нейтральной связью между компонентами. Могут быть использованы полимеры глицина; глицин получает доступ к значительно большему пространству phi-psi, чем даже аланин, и гораздо менее ограничен, чем остатки с более длинными боковыми цепями (см. Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Типичные линкеры могут содержать аминокислотные последовательности, включающие, но не ограниченные ими, GGSG (SEQ ID NO: 368), GGSGG (SEQ ID NO: 369), GSGSG (SEQ ID NO: 370), GSGGG (SEQ ID NO: 371), GGGSG (SEQ ID NO: 372), GSSSG (SEQ ID NO: 373) и тому подобные. Иллюстративные линкеры могут включать, например, Gly(Ser4)_n (SEQ ID NO: 374), где n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GSSSS)n (SEQ ID NO: 375), где n равен 4. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GSSSS)_n (SEQ ID NO: 376), где n равен 5. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 377), где n равен 1. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 378), где n равен 2. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 379), где n равен 3. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 380), где n равен 4. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n

- 42 049816 (SEQ ID NO: 381), где n равен 5. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 382), где n равен 6. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 383), где n равен 7. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 384), где n равен 8. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 385), где n равен 9. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)n (SEQ ID NO: 386), где n равен 10. В некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность AAAGG (SEQ ID NO: 387).

В некоторых случаях линкерный полипептид, присутствующий в первом полипептиде ТММР по данному изобретению, содержит остаток цистеина, который может образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим во втором полипептиде ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях, например, подходящий линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:317).

В качестве другого примера, подходящий линкер может содержать аминокислотную последовательность GCGGS(G4S)_n (SEQ ID NO: 315), где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Например, в некоторых случаях линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:316).

В качестве другого примера, линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ IDNO:317).

Эпитопы.

В некоторых случаях эпитоп (пептид, презентирующий один или более эпитопов), присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой пептид WT-1, например, пептид WT-1, который вместе с ГКГС презентирует эпитоп для TCR. Аминокислотные последовательности изоформ WT-1 представлены на фиг. 3А-3Е. Пептид WT-1, презентирующий один или более эпитопов, называется в данном документе как пептид WT-1 или эпитоп WT-1. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 2025 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на любой фиг. 3А-3Е. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 20-25 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на фиг. 3А. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 20-25 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на фиг. 3В. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 20-25 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на фиг. 3С. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 20-25 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на фиг. 3D. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может представлять собой пептид из от 4 до 25 последовательных аминокислот (например, 4 аминокислот (ак), 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10-15 ак, 15-20 ак или 20-25 ак) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью WT-1, изображенной на фиг. 3Е. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 6 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 7 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 8 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 9 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 10 аминокислот. В некоторых случаях

- 43 049816 эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину 11 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину от 6 аминокислот до 25 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину от 6 аминокислот до 20 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину от 7 аминокислот до 25 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину от 7 аминокислот до 20 аминокислот. В некоторых случаях эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, составляет в длину по меньшей мере 4 аминокислоты, по меньшей мере 6 аминокислот в длину или по меньшей мере 7 аминокислот в длину.

Эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может иметь длину от около 4 аминокислот до около 25 аминокислот, например, эпитоп может иметь длину от 4 аминокислот (ак) до 10 ак, от 10 ак до 15 ак, от 15 ак до 20 ак или от 20 ак до 25 ак. Например, эпитоп, присутствующий в ТММР по данному изобретению, может иметь длину 4 аминокислоты (ак), 5 ак, 6 ак, 7, ак, 8 ак, 9 ак, 10 ак, 11 ак, 12 ак, 13 ак, 14 ак, 15 ак, 16 ак, 17 ак, 18 ак, 19 ак, 20 ак, 21 ак, 22 ак, 23 ак, 24 ак или 25 ак. В некоторых случаях эпитоп, присутствующий в ТММР, имеет длину от 5 до 10 аминокислот, например, 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак или 10 ак.

Эпитоп WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой пептид, специфически связанный с Т-клеткой, т.е. эпитоп специфически связанный со специфической по эпитопу WT-1 Т-клеткой. Эпитоп-специфическая Т-клетка связывает эпитоп, имеющий контрольную аминокислотную последовательность, но по существу не связывает эпитоп, который отличается от контрольной аминокислотной последовательности. Например, эпитоп-специфическая Т-клетка связывает эпитоп, имеющий контрольную аминокислотную последовательность, и связывает эпитоп, который отличается от контрольной аминокислотной последовательности, если в целом имеет, аффинность, которая составляет менее, чем 10^-6 М, менее, чем 10^-5 М или менее, чем 10^-4 М. Эпитоп-специфическая Т-клетка может связывать эпитоп, для которого она специфична, с аффинностью, составляющей по меньшей мере 10^-7 М, по меньшей мере 10^-8 М, по меньшей мере 10^-9 М или по меньшей мере 10^-10 М.

Примеры пептидов WT-1, подходящих для включения в ТММР по данному изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими,

CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO:223), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:224), CMTWNYMNLGATLKG (SEQ ID NO:225), WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:226), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO:227), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:228), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:229), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:230), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:231), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:232), MNLGATLK (SEQ ID

NO:233), MTWNYMNLGATLKGV (SEQ ID NO:234), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID

NO:235), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:236), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:237), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:238), GYLRNPTAC (SEQ ID NO:239), GALRNPTAL (SEQ ID NO:240), YALRNPTAC (SEQ ID NO:241), GLLRNPTAC (SEQ ID NO:242), RYRPHPGAL (SEQ ID NO:243), YQRPHPGAL (SEQ ID NO:244), RLRPHPGAL (SEQ ID NO:245), RIRPHPGAL (SEQ ID NO:246), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO:247), HSFKHEDPY (SEQ ID NO:248), QFPNHSFKHEDPM (SEQ ID NO:249), QFPNHSFKHEDPY (SEQ ID NO:250), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:251), KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO:252), FMCAYPGCY (SEQ ID NO:253), FMCAYPGCK (SEQ ID NO:254), KRPFMCAYPGCNKRY (SEQ ID NO:255), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:256), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO:257), NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259); RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260); CMTWNQMN (SEQ ID NO:261); CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269); NYMNLGATL (SEQ ID NO:263);

YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264); SLGEQQYSV (SEQ ID NO:265); CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) и NQMNLGATL (SEQ ID NO:267).

В некоторых случаях пептид WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой CMTWNQMN (SEQ ID NO: 261). В некоторых случаях пептид WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 269).

В некоторых случаях пептид WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, презентирует HLA-A*2402-ограниченный эпитоп. Пептиды WT-1, которые презентируют HLA-A*2402ограниченный эпитоп, включают в себя, например,

- 44 049816

CMTWNQMN (SEQ ID NO:261); NYMNLGATL (SEQ ID NO:263) (WT-1 239-247; Q240Y);

CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269) (WT-1 235-243); CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) (WT-1 235-243); NQMNLGATL (SEQ ID NO:267) (WT-1 239-247) и NLMNLGATL (SEQ ID NO:258) (WT-1 239-247; Q240L).

В некоторых случаях пептид WT-1, присутствующий в ТММР по данному изобретению, презентирует НЬА-А*0201-ограниченный эпитоп. Пептиды WT-1, которые презентируют HLA-A*0201ограниченный эпитоп, включают в себя, например,

VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259) (WT-1 37-45); RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260) (WT-1 126134); YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264) (WT-1 126-134; R126Y); SLGEQQYSV (SEQ ID

NO:265) (WT-1 187-195) и NLMNLGATL (SEQ ID NO:258) (WT-1 239-247; Q240L).

Анализы связывания HLA/пептида.

Вопрос о том, связывает ли данный пептид (например, пептид WT-1) HLA I класса (содержащий тяжелую цепь HLA и полипептид в2М) и, будучи связанным с комплексом HLA, может эффективно презентировать эпитоп для TCR, может быть разрешен с помощью любого из ряда хорошо известных методов. Методы анализа включают в себя анализы связывания и анализы определения активации Т-клеток.

Анализ связывания на основе клеток.

В качестве одного примера для определения связывания пептида-HLA I класса могут применять анализ индуцированной пептидом стабилизации на основе клеток. В этом анализе интересующему пептиду обеспечивают возможность связываться с ТАР-дефицитной клеткой, т.е. клеткой, которая содержит дефективный транспортер, связанный с механизмом процессинга антигенов (ТАР) и, соответственно, редкими поверхностными молекулами I класса. Такие клетки включают в себя, например, линию клеток Т2 человека (Т2 (174хСЕМ.Т2; Американская коллекция типовых культур (АТСС) № CRL-1992). Henderson et al. (1992) Science 255:1264. Без эффективного ТАР-опосредованного транспорта цитозольных пептидов в эндоплазматический ретикулум, собранные комплексы I класса структурно нестабильны и только временно удерживаются на поверхности клетки. Однако, когда клетки Т2 инкубируют с экзогенным пептидом, способным связывать антигены I класса, комплексы поверхностного пептида-HLA I класса стабилизируются и могут обнаруживаться методом проточной цитометрии, например, с помощью сортированного (pan) моноклонального антитела к антигену I класса. Стабилизация и результирующее увеличение времени жизни комплексов пептид-HLA на поверхности клетки вследствие добавления пептида подтверждает их идентичность. Анализ могут проводить с использованием проточной цитометрии, например, в которой антитело pan-HLA I класса содержит флуоресцентную метку. Связывание пептида с различными аллельными формами цепей Н HLA могут тестировать по тому как генетически модифицированные клетки Т2 способны экспрессировать интересующую аллельную цепь Н HLA.

Ниже приведен неограничивающий пример использования анализа Т2 для оценки связывания пептидов с HLA А*0201. Клетки Т2 промывают в среде для культивирования клеток, и концентрируют до 10⁶ клеток/мл. Готовят интересующие пептиды в среде для культивирования клеток и серийно разводят, обеспечивая концентрации 200 мкМ, 100 мкМ, 20 мкМ и 2 мкМ. Клетки смешивают 1:1 с каждым пептидным разбавлением для получения конечного объема 200 мкМ и конечных концентраций пептидов 100 мкМ, 50 мкМ, 10 мкМ и 1 мкМ. Связывающий пептид A HLA A*0201, GILGFVFTL (SEQ ID NO: 395), не-HLA А*0201-ограниченный пептид, HPVGEADYF (SEQ ID NO: 396) (HLA-B*35O1), включены в анализ как положительный и отрицательный контроли соответственно. Смеси клеток/пептидов выдерживают при 37°С 5% CO2 в течение десяти минут; затем инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Потом клетки инкубируют в течение 2 ч при 37°С и окрашивают флуоресцентно меченным антителом к HLA человека. Клетки дважды промывают фосфатно-солевым буферным раствором и анализируют с использованием проточной цитометрии. Для измерения прочности связывания используется среднее значение средней интенсивности флуоресценции (MFI) окрашивания антителом к HLA.

Биохимический анализ связывания.

Полипептиды HLA (полипептид тяжелой цепи HLA в комплексе с полипептидом в2М) могут тестировать на связывание с интересующим пептидом в системе бесклеточного анализа in vitro. Например, меченому эталонному пептиду (например, флуоресцентно меченому) дают возможность связываться с полипептидами HLA (полипептид тяжелой цепи HLA, образовавший комплекс с полипептидом в2М), чтобы образовывался комплекс HLA-эталонный пептид. Тестируется способность исследуемого интересующего пептида замещать меченый эталонный пептид из комплекса HLA-эталонный пептид. Относительная аффинность связывания рассчитывается как количество исследуемого пептида, необходимое для замещения связанного эталонного пептида. См., например, van der Burg et al. (1995) Human Immunol. 44:189.

В качестве другого примера, интересующий пептид могут инкубировать с молекулой HLA (тяжелой цепью HLA, образовавшей комплекс с полипептидом в2М), а стабилизацию комплекса HLA/пептида могут измерять в иммуноферментном формате. Способность интересующего пептида стабилизировать

- 45 049816 молекулу HLA сравнивается со способностью контрольного пептида, презентировать известный Тклеточный эпитоп. Обнаружение стабилизации основано на наличии или отсутствии нативной конформации HLA/пептидного комплекса, обнаруживаемой с использованием антитела к HLA. См., например, Westrop et al. (2009) J. Immunol. Methods 341:76; Steinitz et al. (2012) Blood 119:4073; и патент США № 9 205 144.

Анализы активации Т-клеток.

Вопрос о том, связывает ли данный пептид HLA I класса (содержащий тяжелую цепь HLA и полипептид в2М) и, будучи связанным с комплексом HLA, может эффективно презентировать эпитоп для TCR, может быть разрешен путем оценивания Т-клеточной реакции на комплекс пептид-HLA. Тклеточные реакции, которые могут измерять включают, например, продукцию интерферона-гамма (IFNy), цитотоксическую активность и т.п.

Анализ ELISPOT.

Подходящие анализы включают, например, иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT). В этом анализе продукцию IFNy Т-клетками CD8+ измеряют, добавляя антиген-презентирующую клетку (АРС), которая презентирует интересующий пептид, образовавший комплекс с HLA I класса. Антитело к IFNy иммобилизировано на лунках многолуночного планшета. K лункам добавляют АРС и инкубируют в течение некоторого периода времени с интересующим пептидом, так что пептид связывает HLA I класса на поверхности АРС. В лунки добавляют Т-клетки CD8'. специфические для данного пептида, и планшет инкубируют в течение около 24 ч. Затем лунки промывают, и весь IFNy, связанный с иммобилизированным антителом к IFNy выявляют с использованием выявляемо меченого антитела к IFNy. Можно использовать любой колориметрический анализ. Например, выявляемо меченое антитело к IFNy может представлять собой меченое биотином антитело к IFNy, которое могут выявлять с использованием, например, стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Для проявления анализа добавляют раствор BCIP/NBT (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфата/нитросинего тетразолия). Присутствие IFNyсекретирующих Т-клеток идентифицируют по окрашенным пятнам. Отрицательные контроли включают АРС, не контактировавшие с пептидом. АРС, экспрессирующие различные аллели цепи Н HLA, могут использовать для определения того, действительно ли интересующий пептид эффективно связывается с молекулой HLAI класса, состоящей из конкретной цепи Н HLA.

Анализы цитотоксичности.

Вопрос о том, связывается ли данный пептид с конкретной цепью Н HLA I класса и, будучи связанным с комплексом HLA I класса, содержащим цепь Н, может эффективно представлять эпитоп для TCR, также может быть разрешен с использованием анализа цитотоксичности. Анализ цитотоксичности включает инкубацию клетки-мишени с цитотоксичной Т-клеткой CD8+. Клетка-мишень отображает на своей поверхности комплекс пептида/HLA I класса, содержащий интересующий пептид, и молекулу HLA I класса, содержащую цепь Н HLA, подлежащую тестированию. Клетки-мишени могут метить радиоактивными изотопами, например ⁵¹Cr. Эффективно ли клетка-мишень презентирует эпитоп для TCR на цитотоксической Т клетке CD8+, таким образом индуцируя цитотоксическую активность от Т клетки CD8+ в направлении клетки-мишени, определяют путем измерения высвобождения ⁵¹Cr из лизируемой клетки-мишени. Специфическую цитотоксичность можно рассчитывать как количество цитотоксической активности в присутствии пептида минус количество цитотоксической активности в отсутствие пептида.

Выявление антиген-специфических Т-клеток с помощью тетрамеров пептид-HLA.

В качестве другого примера, создают мультимеры (например, тетрамеры) комплексов пептида-HLA с флуоресцентными маркерами или маркерами тяжелых металлов. Затем мультимеры могут применять для идентификации и количественного определения специфических Т-клеток посредством проточной цитометрии (FACS) или масс-цитометрии (CyTOF). Выявление эпитоп-специфических Т-клеток дает прямое доказательство того, что связанная с пептидом молекула HLA способна связываться со специфической TCR на подмножестве антиген-специфических Т-клеток. См., например, Klenerman et al. (2002) Nature Reviews Immunol. 2:263.

Иммуномодулирующие полипептиды.

В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой иммуномодулирующий полипептид дикого типа. В других случаях иммуномодулирующий полипептид, присутствующий в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность для ко-иммуномодулирующего полипептида по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для ко-иммуномодулирующего полипептида, подходящие иммуномодулирующие домены, которые проявляют пониженную аффинность к ко-иммуномодулирующему домену, могут иметь от 1 аминокислотного (ак) до 20 ак отличий от иммуномодулирующего домена дикого типа. Например, в некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, отличается по аминокислотной последовательности на 1 ак, 2 ак, 3 ак, 4 ак, 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак или 10 ак от соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант иммуномодулирующего поли

- 46 049816 пептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, отличается по аминокислотной последовательности на 11 ак, 12 ак, 13 ак, 14 ак, 15 ак, 16 ак, 17 ак, 18 ак, 19 ак или 20 ак от соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа. В качестве примера, в некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен по сравнению с соответствующим эталонным (например, дикого типа) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит одиночную аминокислотную замену по сравнению с соответствующим эталонным (например, дикого типа) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 2 аминокислотные замены (например, не более 2 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 3 аминокислотных замен (например, не более 3 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 4 аминокислотных замен (например, не более 4 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 5 аминокислотных замен (например, не более 5 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 6 аминокислотных замен (например, не более 6 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 7 аминокислотных замен (например, не более 7 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 8 аминокислотных замен (например, не более 8 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 9 аминокислотных замен (например, не более 9 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 10 аминокислотных замен (например, не более 10 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 11 аминокислотных замен (например, не более 11 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 12 аминокислотных замен (например, не более 12 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 13 аминокислотных замен (например, не более 13 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 14 аминокислотных замен (например, не более 14 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 15 аминокислотных замен (например, не более 15 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 16 аминокислотных замен (например, не более 16 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 17 аминокислотных замен (например, не более 17 аминокислотных за

- 47 049816 мен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 18 аминокислотных замен (например, не более 18 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 19 аминокислотных замен (например, не более 19 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, содержит 20 аминокислотных замен (например, не более 20 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим эталонным (например, диким типом) иммуномодулирующим полипептидом.

Как обсуждалось выше, вариант иммуномодулирующего полипептида, подходящий для включения в ТММР по данному изобретению, проявляет пониженную аффинность к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду.

Типичные пары иммуномодулирующего полипептида и когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида включают, но не ограничиваются ими:

a) 4-1BBL (иммуномодулирующий полипептид) и 4-1ВВ (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

b) PD-L1 (иммуномодулирующий полипептид) и PD1 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

c) IL-2 (иммуномодулирующий полипептид) и рецептор IL-2 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

d) CD80 (иммуномодулирующий полипептид) и CD86 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

e) CD86 (иммуномодулирующий полипептид) и CD28 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

f) OX40L (CD252) (иммуномодулирующий полипептид) и ОХ40 (CD134) (когнатный коиммуномодулирующий полипептид);

g) лиганд Fas (иммуномодулирующий полипептид) и Fas (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

h) ICOS-L (иммуномодулирующий полипептид) и ICOS (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

i) ICAM (иммуномодулирующий полипептид) и LFA-1 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

j) CD30L (иммуномодулирующий полипептид) и CD30 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

k) CD40 (иммуномодулирующий полипептид) и CD40L (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

l) CD83 (иммуномодулирующий полипептид) и CD83L (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

m) HVEM (CD270) (иммуномодулирующий полипептид) и CD160 (когнатный ко- иммуномодулирующий n олипептид);

n) JAG1 (CD339) (иммуномодулирующий полипептид) и Notch (когнатный ко- иммуномодулирующий полипептид);

о) JAG1 (иммуномодулирующий полипептид) и CD46 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

р) CD80 (иммуномодулирующий полипептид) и CTLA4 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид);

q) CD86 (иммуномодулирующий полипептид) и CTLA4 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид); и

r) CD70 (иммуномодулирующий полипептид) и CD27 (когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид).

В некоторых случаях, вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. Например, в некоторых случаях, вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около

- 48 049816

300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

Вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующий в ТММР по данному изобретению, проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду. Подобным образом, ТММР по данному изобретению, который содержит вариант иммуномодулирующего полипептида, проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду. Таким образом, например, ТММР по данному изобретению, который содержит вариант иммуномодулирующего полипептида, имеет аффинность связывания для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. Например, в некоторых случаях, ТММР по данному изобретению, содержащий вариант иммуномодулирующего полипептида, имеет аффинность связывания с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

Как схематически изображено на фиг. 19, иммуномодулирующий полипептид (т.е. один или более иммуномодулирующих полипептидов) может присутствовать в ТММР по данному изобретению в любом из разнообразия положений. На фиг. 19 изображено положение двух копий варианта полипептида IL-2; однако иммуномодулирующий полипептид может быть любым из разнообразия иммуномодулирующих полипептидов, описанных в данном документе. Как изображено на фиг. 19, иммуномодулирующий полипептид может быть: 1) N-концевым к тяжелой цепи ГКГС I класса; 2) С-концевым к тяжелой цепи ГКГС I класса и N-концевым к полипептиду Fc Ig; другими словами, находится между тяжелой цепью ГКГС I класса и полипептидом Fc Ig; 3) С-концевым к полипептиду Fc Ig; 4) N-концевым к пептидному эпитопу; или 5) С-концевым к полипептиду в2М.

Варианты PD-L1.

В качестве одного неограничивающего примера, в некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант полипептида PD-L1. PD-L1 дикого типа связывается с PD1.

Полипептид PD-L1 человека дикого типа может содержать следующую аминокислотную последо вательность:

MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV

EYGSNMTIEC

YRQRARLLKD

NAPYNKINQR

KFPVEKQLDL QLSLGNAALQ ILVVDPVTSE

AALIVYWEME

ITDVKLQDAG

HELTCQAEGY

DKNIIQFVHG

VYRCMISYGG

PKAEVIWTSS

EEDLKVQHSS

ADYKRITVKV

DHQVLSGKTT

TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKICLT

LSPST (SEQIDNO:1).

Эктодомен PD-L1 человека дикого типа может содержать следующую аминокислотную последова тельность:

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL

AALIVYWEME

ITDVKLQDAG

HELTCQAEGY

DKNIIQFVHG

VYRCMISYGG

PKAEVIWTSS

EEDLKVQHSS

ADYKRITVKV

DHQVLSGKTT

YRQRARLLKD

NAPYNKINQR

TTNSKREEKL

QLSLGNAALQ

ILVVDPVTSE

FNVTSTLRIN

TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:2).

Полипептид PD-1 дикого типа может содержать следующую аминокислотную последовательность:

PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS

ESFVLNWYRM VRARRNDSGT RPAGQFQTLV EDPSAVPVFS

SPSNQTDKLA

YLCGAISLAP

VGVVGGLLGS

VDYGELDFQW

AFPEDRSQPG KAQIKESLRA LVLLVWVLAV

REKTPEPPVP

QDCRFRVTQL

ELRVTERRAE

ICSRAARGTI

CVPEQTEYAT

PNGRDFHMSV

VPTAHPSPSP

GARRTGQPLK

IVFPSGMGTS

SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL (SEQ ID NO:3).

В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида PD-L1,

- 49 049816 когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид PD-1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 проявляет пониженную аффинность связывания к PD-1 (например, полипептиду PD-1, содержащему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3), по сравнению с аффинностью связывания полипептида PD- L1, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Например, в некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 по данному изобретению связывает PD-1 (например, полипептид PD-1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3) с аффинностью связывания, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 55% меньше по меньшей мере на 60% меньше по меньшей мере на 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% меньше, или более чем на 95% меньше, чем аффинность связывания полипептида PD-L1, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 обладает аффинностью связывания с PD-1, которая составляет от 1 нМ до 1 мМ. В некоторых случаях, вариант полипептида PD-L1, присутствующий в ТММР по данному изобретению имеет аффинность связывания с PD-1, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет аффинность связывания с PD1 (например, полипептидом PD1, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3), которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 2 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 3 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 4 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 5 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 6 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PDL1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 7 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 8 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 9 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых случаях вариант полипептида PD-L1 имеет 10 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью PD-L1, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Подходящий вариант PD-L1 включает полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности со следующей аминокислотной последовательностью:

FT VTVPKXLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG

EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG

ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO: 52), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях X представляет собой Ala. В некоторых случаях X представляет собой Arg.

- 50 049816

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALXVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS

DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO: 53), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Не. В некоторых случаях X представляет собой Asp.

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EXDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS

DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:54), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях X представляет собой Arg.

Варианты CD80.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант полипептида CD80. CD80 дикого типа связывается с CD28. CD80 дикого типа также связывается с CD86.

Аминокислотная последовательность дикого типа эктодомена CD80 человека может быть следующей:

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD

MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:4).

Аминокислотная последовательность CD28 дикого типа может быть следующей: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE

FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ

NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS

KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (SEQ ID NO:5).

В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида CD80, когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Аминокислотная последовательность CD28 дикого типа может быть следующей:

MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSW KHLCPSPLFP

GPSKPFWVLV VVGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR

RPGPTRKHYQ PYAPPRDFAA YRS (SEQ ID NO:6)

Аминокислотная последовательность CD28 дикого типа может быть следующей: MLRLLLALNL FPSIQVTGKH LCPSPLFPGP SKPFWVLVVV GGVLACYSLL VTVAFIIFWV RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S (SEQ ID NO:7).

В некоторых случаях вариант полипептида CD80 проявляет пониженную аффинность связывания с полипептидом CD28 по сравнению с аффинностью связывания полипептида CD80, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, с CD28. Например, в некоторых случаях вариант полипептида CD80 связывает CD28 с аффинностью связывания, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% по меньшей

- 51 049816 мере 55% меньше по меньшей мере на 60% меньше по меньшей мере на 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% меньше или более чем на 95% меньше, чем аффинность связывания полипептида CD80, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, с CD28 (например, полипептидом CD28, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 5, 6 или 7).

В некоторых случаях, вариант полипептида CD80 имеет аффинность связывания с CD28, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант полипептида CD80 по данному изобретению имеет аффинность связывания с CD28 (например, полипептидом CD28, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7), которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 2 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 3 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 4 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 6 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 8 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 9 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях вариант полипептида CD80 имеет 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD80, представленной в SEQ ID NO: 4.

Подходящие варианты CD80 включают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей:

VIHVTK EVKEVATLSC GHXVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD

MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO: 55), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD

MNIWPEYKNR TIFDITXNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO: 56), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

- 52 049816

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS XVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:57), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ile. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLX YEKDAFKREH

LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :5 8), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Lys. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH

LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS XDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :60), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QXPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:61), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEEXA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :62), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIXWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:63), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWXKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :64), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

- 53 049816

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KXVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:65), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Met. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMXLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :66), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNXWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :67), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ile. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEXKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:68), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFXITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :69), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DXPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :70), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVX QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ IDNO:71), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях X представляет собой Ala; и

- 54 049816

VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD

MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH

LAEVTLSVKA DFPTXSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO :72), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Pro. В некоторых случаях X представляет собой Ala.

Варианты CD86.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант полипептида CD86. CD86 дикого типа связывается с CD28. В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида CD86, когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Аминокислотная последовательность полного эктодомена CD86 дикого типа человека может быть следующей:

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:8).

Аминокислотная последовательность домена IgV CD86 дикого типа человека может быть следующей:

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:9).

В некоторых случаях вариант полипептида CD86 проявляет пониженную аффинность связывания с полипептидом CD28 по сравнению с аффинностью связывания полипептида CD86, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 с CD28. Например, в некоторых случаях вариант полипептида CD86 связывает CD28 с аффинностью связывания, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 55% меньше по меньшей мере на 60% меньше по меньшей мере на 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% меньше или более чем на 95% меньше, чем аффинность связывания полипептида CD86, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, с CD28 (например, полипептидом CD28, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 5, 6 или 7).

В некоторых случаях, вариант полипептида CD86 имеет аффинность связывания с CD28, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант полипептида CD86 по данному изобретению имеет аффинность связывания с CD28 (например, полипептидом CD28, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, 6 или 7), которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 2 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 3 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 4 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 6 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представ

- 55 049816 ленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 8 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 9 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 8.

В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 2 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 3 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 4 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 6 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 8 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 9 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях вариант полипептида CD86 имеет 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью CD86, представленной в SEQ ID NO: 9.

Подходящие варианты CD86 включают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей:

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF

SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD

VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:73), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFXSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:74), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFDSDSXTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFS QPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:75), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Trp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:76), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

- 56 049816

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:77), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFXSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:78), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSXTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO :79), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Trp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:80), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLXLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:81), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLXLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:82), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWXDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:83), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWXDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:84), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVXWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:85), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVXWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:86), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTXRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF

- 57 049816

SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD

VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:87), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKYMNRTSFDSDSWTXRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:88), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKXMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:89), где X представляет собой любую аминокислоту, кроме Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS

VHSKXMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:90), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIHQMNSELSVLANF SQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYD VSISLSVSFPDVTShMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:91), где первый X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn, а второй X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях первый и второй X оба представляют собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:92), где первый X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn, а второй X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях первый и второй X оба представляют собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFX1SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX2KKPTGMIRIHQMNSELSVLAN FSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELY DVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:93), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp, а X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, а Х₂ представляет собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFX1SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX2KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:94), где первый X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn, а второй X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях первый и второй X оба представляют собой Ala;

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMX1RTSFX2SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX3KKPTGMIRIHQMNSELSVLA NFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTEL YDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:95), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn, X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp, а X₃ представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala; и

- 58 049816

APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMX1RTSFX2SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX3KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:96), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn, X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp, а X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, Х₂ представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala.

Варианты 4-1BBL.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант полипептида 4-1BBL. 4-1BBL дикого типа связывается с 4-1ВВ (CD137).

Аминокислотная последовательность 4-1BBL дикого типа может быть следующей MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFLA CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 10).

В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL представляет собой вариант домена гомологии (THD) фактора некроза опухоли (ФНО) 4-1BBL человека.

Аминокислотная последовательность дикого типа THD 4-1BBL человека может представлять собой, например, одну из SEQ ID NO: 11-13, т.е. следующую: PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 11).

D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 12).

D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPA (SEQ ID NO: 13).

Аминокислотная последовательность 4-1ВВ дикого типа может быть следующей: MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP

NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS

MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG

TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL (SEQ ID NO: 14).

В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида 41BBL, когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид 4-1ВВ, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL проявляет пониженную аффинность связывания с полипептидом 4-1ВВ по сравнению с аффинностью связывания полипептида 4-1BBL, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10-13. Например, в некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL по данному изобретению связывает 4-1ВВ с аффинностью связывания, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 55% меньше по меньшей мере, на 60% меньше по меньшей мере на 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% меньше, по меньшей мере 95% меньше или более чем на 95% меньше, чем аффинность связывания полипептида 4-1BBL, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10-13, с полипептидом 4-1ВВ (например, полипептидом 4-IBB, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 14), при анализе в одинаковых условиях.

В некоторых случаях, вариант полипептида 4-1BBL имеет аффинность связывания с 4-1ВВ, которая

- 59 049816 составляет от 100 нМ до 100 мкМ. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет аффинность связывания с 4-1ВВ (например, полипептидом 4-1ВВ, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14), которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10 -13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10 -13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 2 аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10 -13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 3 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 4 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 6 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 8 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 1013. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 9 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13. В некоторых случаях вариант полипептида 4-1BBL имеет 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 4-1BBL, представленной в одной из SEQ ID NO: 10-13.

Подходящие варианты 4-1BBL включают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей:

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYXEDT

KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA

LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ

GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 97), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Lys. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT

KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWXLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 98), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG XFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT

KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 99), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Met. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MXAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT

KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 100), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X пред- 60 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAXLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 101), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQXVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 102), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLXAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 103), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAXNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 104), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAXNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 105), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNX LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 106), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV XLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 107), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LXIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 108), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLXDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 109), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ile. В некоторых случаях, X пред- 61 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIXGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 110), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDXPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:111), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGXLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 112), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Pro. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPXSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 113), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLXWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 114), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSXY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 115), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Trp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWX SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 116), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY X DPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 117), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SX PGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 118), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X пред- 62 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDXGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 119), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Pro. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPXLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 120), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGXAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 121), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAXVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 122), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGXSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 123), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVXL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 124), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSX TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 125), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL XGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 126), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Thr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TXGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 127), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X пред- 63 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGXLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 128), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGXSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 129), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLXYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 130), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSXKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 131), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKXDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 132), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEXT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 133), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDX KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 134), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Thr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT XELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 135), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Lys. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KXLVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 136), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X пред- 64 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVXFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 137), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFXQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 138), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFXLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 139), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQXELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 140), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLXLR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 141), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLEXR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 142), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELX RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 143), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR XVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 144), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RXVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 145), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X пред- 65 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVXAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 146), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAXEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 147), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGXGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 148), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEXSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 149), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGXGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 150), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVXLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 151), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDXPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 152), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLXPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 153), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Pro. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPAXS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 154), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X пред- 66 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASX EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 155), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS XARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 156), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EAXNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 157), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARXSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 158), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asn. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNXAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 159), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Ser. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AXGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 160), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGX RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 161), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ XLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 162), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RXGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 163), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X пред- 67 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLXVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 164), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGXHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 165), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVXLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 166), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHXHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 167), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLXTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 168), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHXEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 169), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Thr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTXA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 170), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA XARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 171), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RAXHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 172), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Arg. В некоторых случаях, X пред- 68 049816 ставляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARXAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 173), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAXQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 174), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Trp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQXTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 175), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Leu. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLXQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 176), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Thr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTX GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 177), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ XATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 178), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gly. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GAXVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 179), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Thr. В некоторых случаях X представляет собой Ala; и

PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNS AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATXLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO: 180), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Val. В некоторых случаях X представляет собой Ala.

Варианты IL-2.

В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в ТММР по данному изобретению, представляет собой вариант полипептида IL-2. IL-2 дикого типа связывается с рецептором IL-2 (IL-2R), то есть гетеротримерным полипептидом, содержащим IL-2Ra, IL-2Re и IL-2Ry.

Аминокислотная последовательность IL-2 дикого типа может быть следующей:

- 69 049816

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 15).

IL2 дикого типа связывается с рецептором IL2 (IL2R) на поверхности клетки. Рецептор IL2 представляет собой в некоторых случаях гетеротримерный полипептид, содержащий альфа-цепь (IL-2Ra, также называемую CD25), бета-цепь (IL-2Re, также называемую CD122) и гамма-цепь (IL-2RY, также называемую CD132). Аминокислотные последовательности IL-2Ra, IL2RP и IL-2Ry человека могут быть следующими.

IL-2Ra человека:

ELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE CKRGFRRIKS

GSLYMLCTGN

SPMQPVDQAS

RGPAESVCKM

SSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE

LPGHCREPPP WENEATERIY HFVVGQMVYY

TSCLVTTTDF

THGKTRWTQP

QIQTEMAATM

QLICTGEMET

ETSIFTTEYQ

SQFPGEEKPQ

VAVAGCVFLL

QKERKTTEMQ QCVQGYRALH ASPEGRPESE

ISVLLLSGLT

WQRRQRKSRR TI (SEQ ID NO: 16).

IL-2Re человека:

VHAWPDRRRW

REGVRWRVMA

FERHLEFEAR KPLQGEFTTW VYLLINCRNT

VNG

NQTCELLPVS

IQDFKPFENL

TLSPGHTWEE

SPWSQPLAFR

GPWLKKVLKC

TSQFTCFYNS

QASWACNLIL RLMAPISLQV APLLTLKQKQ TKPAALGKDT

NTPDPSKFFS

RANISCVWSQ

GAPDSQKLTT

VHVETHRCNI

EWICLETLTP

IPWLGHLLVG

QLSSEHGGDV

DGALQDTSCQ

VDIVTLRVLC

SWEISQASHY

DTQYEFQVRV LSGAFGFIIL

QKWLSSPFPS

SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ DKVPEPASLS SNHSLTSCFT NQGYFFFHLP

DALEIEACQV

FPSRDDLLLF

YFTYDPYSEE

DPDEGVAGAP

SPSLLGGPSP

PSTAPGGSGA

PLGPPTPGVP

DLVDFQPPPE

LVLREAGEEV

TGSSPQPLQP GEERMPPSLQ PDAGPREGVS

LSGEDDAYCT

ERVPRDWDPQ

FPWSRPPGQG

EFRALNARLP LNTDAYLSLQ ELQGQDPTHL V (SEQ ID NO: 17).

IL-2RY человека:

LNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL

SVSTLPLPEV

QCFVFNVEYM ITSGCQLQKK TLHKLSESQL PSVDGQKRYT EAVVISVGSM

NCTWNSSSEP

EIHLYQTFVV

ELNWNNRFLN

FRVRSRFNPL

GLIISLLCVY

QPTNLTLHYW QLQDPREPRR HCLEHLVQYR CGSAQHWSEW

FWLERTMPRI

YKNSDNDKVQ QATQMLKLQN TDWDHSWTEQ

SHPIHWGSNT

PTLKNLEDLV

KCSHYLFSEE

LVIPWAPENL

SVDYRHKFSL

SKENPFLFAL

TEYHGNFSAW

SGVSKGLAES

LQPDYSERLC

LVSEIPPKGG

ALGEGPGASP

CNQHSPYWAP

PCYTLKPET (SEQ ID NO: 18).

В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит вариант полипептида IL-2, когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид IL-2R, содержащий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 17 и 18.

В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 проявляет пониженную аффинность связывания с полипептидом IL-2R по сравнению с аффинностью связывания полипептида IL-2, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15. Например, в некоторых случаях вариант полипептида IL-2 связывает IL-2R с аффинностью связывания, которая на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 55% меньше по меньшей мере, на 60% меньше по меньшей мере на 65% меньше, по меньшей мере 70% меньше, по меньшей мере 75% меньше, по меньшей мере 80% меньше, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% меньше, по меньшей мере 95% меньше или более чем на 95% меньше, чем аффинность связывания полипептида IL-2, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, с полипептидом IL-2R (например, полипептидом IL-2R, содержащим полипептид, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-18), при анализе в одинаковых условиях.

В некоторых случаях, вариант полипептида IL-2 имеет аффинность связывания с IL-2R, которая составляет от 100 нМ до 100 мкМ. В качестве другого примера, в некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет аффинность связывания с IL-2R (например, полипептидом IL-2R, содержащим полипептид,

- 70 049816 содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16-18), которая составляет от около 100 нМ до 150 нМ, от около 150 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 250 нМ, от около 250 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 350 нМ, от около 350 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ, от около 900 нМ до около 1 мкМ, до около 1 мкМ до около 5 мкМ, от около 5 мкМ до около 10 мкМ, от около 10 мкМ до около 15 мкМ, от около 15 мкМ до около 20 мкМ, от около 20 мкМ до около 25 мкМ, от около 25 мкМ до около 50 мкМ, от около 50 мкМ до около 75 мкМ или от около 75 мкМ до около 100 мкМ.

В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет от 2 до 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 2 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 3 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 4 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 6 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 8 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 9 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях вариант полипептида IL-2 имеет 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-2, представленной в SEQ ID NO: 15.

Подходящие варианты IL-2 включают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей:

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TXI<FYMPI<I<A

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 181), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях X представляет собой Ala. В некоторых случаях X представляет собой Met. В некоторых случаях X представляет собой Pro. В некоторых случаях X представляет собой Ser В некоторых случаях X представляет собой Thr. В некоторых случаях X представляет собой Trp. В некоторых случаях X представляет собой Tyr. В некоторых случаях X представляет собой Val. В некоторых случаях X представляет собой His;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLX LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 182), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLXHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 183), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu. В некоторых случаях X представляет собой Ala.

APTSSSTKKT QLQLEXLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 184), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях X представляет собой Ala. В некоторых случаях X представляет собой Thr. В некоторых случаях X представляет собой Asn. В некоторых случаях X представляет собой Cys. В некоторых случаях X представляет собой Gln. В некоторых случаях X представляет собой Met. В некоторых случаях X представляет собой Val. В некоторых случаях X представляет собой Trp;

- 71 049816

APTSSSTKKT QLQLEXLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 185), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от His. В некоторых случаях X представляет собой Ala. В некоторых случаях X представляет собой Arg. В некоторых случаях X представляет собой Asn. В некоторых случаях X представляет собой Asp. В некоторых случаях X представляет собой Cys. В некоторых случаях X представляет собой Glu. В некоторых случаях X представляет собой Gln. В некоторых случаях X представляет собой Gly. В некоторых случаях X представляет собой Ile. В некоторых случаях X представляет собой Lys. В некоторых случаях X представляет собой Leu. В некоторых случаях X представляет собой Met. В некоторых случаях X представляет собой Phe. В некоторых случаях X представляет собой Pro. В некоторых случаях X представляет собой Ser. В некоторых случаях X представляет собой Thr. В некоторых случаях X представляет собой Tyr. В некоторых случаях X представляет собой Trp. В некоторых случаях X представляет собой Val;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFXMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 186), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCXSIIS TLT (SEQ ID NO: 187), где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях, X представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEX1LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 188), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His, и где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях X₁ представляет собой Ala. В некоторых случаях X2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala, и Х2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X1 представляет собой Thr, a Х2 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 189), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; и где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях X₁ представляет собой Ala. В некоторых случаях X2 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, а X2 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLFHLLLF LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 190), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Glu; где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; и где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях Х2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEFLLLF LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 191), где X₁ представляет собой любую аминокислоту, отличную от His; где X₂ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; и где X₃ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях Х2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLF LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCFSIIS TLT (SEQ ID NO: 192), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; где X2 представляет собой лю

- 72 049816 бую аминокислоту, отличную от Phe; и где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях Х2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFX3MPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 193), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe; и где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях Х₂ представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEX1LLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFX4MPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO: 194), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His; где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe; и где Х₄ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях X₂ представляет собой Ala. В некоторых случаях X₃ представляет собой Ala. В некоторых случаях Х4 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, X3 представляет собой Ala, a X4 представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFX3MPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX4SIIS TLT (SEQ ID NO: 195), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; где X₂ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe; где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr; и где Х4 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях X₂ представляет собой Ala. В некоторых случаях X₃ представляет собой Ala. В некоторых случаях Х4 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, X₃ представляет собой Ala, a X₄ представляет собой Ala;

APTSSSTKKT QLQLEX1LLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFX4MPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX5SIIS TLT (SEQ ID NO: 196), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His; где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Asp; где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe; где Х₄ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Tyr; и где Х₅ представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях X1 представляет собой Ala. В некоторых случаях X2 представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях Х4 представляет собой Ala. В некоторых случаях X5 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X₂ представляет собой Ala, X₃ представляет собой Ala, X₄ представляет собой Ala, a X5 представляет собой Ala; и

APTSSSTKKT QLQLEX1LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFYMPKKA

TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE

TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX3SIIS TLT (SEQ ID NO: 197), где X1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от His; где X2 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe; и где X3 представляет собой любую аминокислоту, отличную от Gln. В некоторых случаях X₁ представляет собой Ala. В некоторых случаях Х₂ представляет собой Ala. В некоторых случаях X3 представляет собой Ala. В некоторых случаях, X1 представляет собой Ala, X2 представляет собой Ala, а X3 представляет собой Ala.

Дополнительные полипептиды.

Полипептидная цепь ТММР по данному изобретению может содержать один или несколько полипептидов в дополнение к тем, которые описаны выше. Подходящие дополнительные полипептиды включают эпитопные метки и аффинные домены. Один или более дополнительных полипептидов могут быть включены на N-конце полипептидной цепи ТММР, на С-конце полипептидной цепи ТММР или внутри полипептидной цепи ТММР.

Эпитопная метка.

Подходящие эпитопные метки включают, но не ограничиваются ими, гемагглютинин (НА; например, YPYDVPDYA (SEQ ID NO:271); FLAG (например, DYKDDDDK (SEQ ID NO:272); с-myc (например,

- 73 049816

EQKLISEEDL; SEQ ID NO:273) _{и тому} подобные.

Домен аффинности.

Домены аффинности включают пептидные последовательности, которые могут взаимодействовать с партнером по связыванию, например, таким как иммобилизованный на твердой подложке, полезным для идентификации или очистки. Последовательности ДНК, кодирующие несколько последовательных отдельных аминокислот, таких как гистидин, при слиянии с экспрессированным белком, могут быть использованы для одностадийной очистки рекомбинантного белка путем связывания с высокой аффинностью с колонкой со смолой, такой как никель-сефароза. Типичные аффинные домены включают

His5 (ННННН) (SEQ ID NO:271), HisX6 (НННННН) (SEQ ID NO:275),

C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:276), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:277), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:278), гемагглютинин, например, ^{HA Tag} Α^ρΥ1)\Ί4)ΥΛ) (^SEQ ID NO:279), глутатион^-трансферазу (GST), тиоредоксинредуктазу, домен связывания целлюлозы, RYIRS (SEQ ID NO: 280), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 281), хитин-связывающий домен, S-пептид, пептид Т7, домен SH2, С-концевая РНК-метка, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:282), связывающие металл домены, например, цинксвязывающие домены или кальцийсвязывающие домены, такие как домены из кальцийсвязывающих белков, например, кальмодулина, тропонина С, кальцийнейрина В, легкой цепи миозина, рековерина, S-модулина, визинина, VILIP, нейрокальцина, гиппокальцина, фрекенина, кальтрацина, большой субъединицы кальпаина, белков S100, парвальбумина, кальбиндина D9K, кальбиндина D28K и кальретинина, интеины, биотин, стрептавидин, MyoD, Id, последовательности лейциновой молнии и мальтозосвязывающий белок.

Конъюгаты с лекарственным средством.

Полипептидная цепь ТММР по данному изобретению может содержать низкомолекулярное лекарственное средство, связанное (например, ковалентно присоединенное) с полипептидной цепью. Например, когда ТММР по данному изобретению содержит полипептид Fc, полипептид Fc может содержать ковалентно связанное низкомолекулярное лекарственное средство. В некоторых случаях низкомолекулярное лекарственное средство представляет собой химиотерапевтический агент против рака, например, цитотоксический агент. Полипептидная цепь ТММР по данному изобретению может содержать цитотоксический агент, связанный (например, ковалентно связанный) с полипептидной цепью. Например, когда ТММР по данному изобретению содержит полипептид Fc, полипептид Fc может содержать ковалентно связанный цитотоксический агент. Цитотоксические агенты включают пролекарства.

Лекарственное средство (например, химиотерапевтический противораковый агент) может быть связано прямо или косвенно с полипептидной цепью ТММР по данному изобретению. Например, когда ТММР по данному изобретению содержит полипептид Fc, лекарственное средство (например, химиотерапевтический противораковый агент) может быть связано прямо или косвенно с полипептидом Fc. Прямая связь может включать связь непосредственно с боковой цепью аминокислоты. Косвенная связь может быть связана через линкер. Лекарственное средство (например, химиотерапевтический противораковый агент) может быть связано с полипептидной цепью (например, полипептидом Fc) ТММР по данному изобретению через тиоэфирную связь, амидную связь, карбаматную связь, дисульфидную связь или эфирную связь.

Линкеры включают расщепляемые линкеры и нерасщепляемые линкеры. В некоторых случаях линкер представляет собой расщепляемый протеазой линкер. Подходящие линкеры включают, например, пептиды (например, длиной от 2 до 10 аминокислот; например, длиной 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), алкильные цепи, поли(этиленгликоль), дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидазные лабильные группы и эстеразные лабильные группы. Неограничивающими примерами подходящих линкеров являются: i) Х-сукцинимидиз-ЦХмалеимидпропионамид)-тетраэтиленгликол]сложный эфир (NHS-PEG4-мαлеимидин); ii) Nсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)2сульфбутаноат (сульф-SPDB); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио) пентаноат (SPP); N-сукцинимидил4-(N-мaлеимидметил)-циклогексан-1 -карбокси-(б-амидокапроат) (LC-SMCC); к-малеимидундеканодная кислота N-сукцинимидиловый сложный эфир (KMUA); γ-малеимид-масляная кислота Nсукцинимидиловый сложный эфир (GMBS); ε-малеимидокапроновая кислота Nгидроксисукцинимидный сложный эфир (EMCS); м-малеимид бензоил-Х-гидроксисукцинимидный эфир (MBS); N-(α-малеимидацетокси)сукцинимидный сложный эфир (AMAS); сукцинимидил-6-(вмалеимидпропионамид)гексаноат (SMPH); N-сукцинимидил 4-(п-малеимидфенил)бутират (SMPB); №(пмалеимидфенил)изоцианат (PMPI); N-сукцинимидил 4(2-пиридилтио)пентаноат (SPP); Nсукцинимидил(4-йод-ацетил)аминобензоат (SIAB); 6-малеимидкапроил (МС); малеимидпропаноил (МР); п-аминобензилоксткарбонил (РАВ); N-сукцинимидил 4-(малеимидметил)циклогексанкарбоксилат (SMCC); N-сукцинимидил-4-(N-мaлеимидметил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидкапроат), длинноцепочечный аналог SMCC (LC-SMCC); N-сукцинимидиловый эфир 3-малеимидпропановой кислоты (BMPS); N-сукцинимидил йодацетат (SIA); N-сукцинимидил бромацетат (SBA) и N-сукцинимидил 3

- 74 049816 (бромацетомид)пропионат (SBAP).

Полипептид (например, полипептид Fc) может быть модифицирован сшивающими реагентами, такими как сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сульфо-SMCC, малеимидбензоил-Ы-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), сульфо-MBS или сукцинимидил-йодацетат, как описано в литературе, для введения 1-10 реакционноспособных групп. Затем модифицированный полипептид Fc реагирует с тиолсодержащим цитотоксическим агентом с образованием конъюгата.

Например, когда ТММР по данному изобретению содержит полипептид Fc, причем полипептидная цепь, содержащая полипептид Fc, может иметь формулу (A)-(L)-(C), где (А) представляет собой полипептидную цепь, содержащую полипептид Fc; где (L), если присутствует, является линкером; и где (С) представляет собой цитотоксический агент. (L), если присутствует, связывает (А) с (С). В некоторых случаях полипептидная цепь, содержащая полипептид Fc, может содержать более одного цитотоксического агента (например, 2, 3, 4 или 5 или более 5 цитотоксических агентов).

Подходящие лекарственные средства включают, например, рапамицин.

Подходящие лекарственные средства включают, например, ретиноиды, такие как полностью трансретиноевая кислота (ATRA); витамин D3; аналог витамина D3; и тому подобное. Как отмечено выше, в некоторых случаях лекарственное средство представляет собой цитотоксический агент. Цитотоксические агенты известны в данной области техники. Подходящим цитотоксическим агентом может быть любое соединение, которое приводит к гибели клетки или вызывает гибель клетки, или каким-либо образом снижает жизнеспособность клеток и включает, например, мейтанзиноиды и аналоги майтанзиноидов, бензодиазепины, таксоиды, аналоги СС-1065 и СС -1065, дуокармицины и аналоги дуокармицина, энедиины, таких как калихеамицины, аналоги доластатина и доластатина, в том числе ауристатины, производные томаймицина, производные лептомицина, метотрексат, цисплатин, карбоплатин, даунорубицин, митохлоруксусный спирт, цуклофинсульфин, моринцилсульфин, моринфинцилоксин, моринфинцилоксин, молибуцин, рифинсульфин, цикоцилфосфин, моринцилсульфин, моринхолуксин, моринфинцил, альбумин, моринфуцин, хлоргин, хлоргин, рифин, хлоргин, рифин, хлоргинцин, молибуксин, цилоксин, хлоргинцин, альфа-хинсульфин доксорубицин.

Например, в некоторых случаях цитотоксический агент представляет собой соединение, которое ингибирует образование микротрубочек в эукариотических клетках. Такие агенты включают, например, майтанзиноид, бензодиазепин, таксоид, СС-1065, дуокармицин, аналог дуокармицина, калихеамицин, доластатин, аналог доластатина, ауристатин, томаймицин и лептомицин или пролекарство любого из вышеперечисленных. Майтанзиноидные соединения включают, например, Ы(2')-деацетил-Ы(2')-(3меркапто-1-оксопропил)мейтанзин (DM1); Ы(2')-деацетил-Ы(2')-(4-меркапто-1-оксопентил)-мейтанзин (DM3) и Ы(2')-деацетил-Ы2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-мейтанзин (DM4). Бензодиазепины включают, например, индолинобензодиазепины и оксазолидинобензодиазепины.

Цитотоксические агенты включают таксол; цитохалазин В; грамицидин D; этидиум бромид; эметин; митомицин; этопосид; тенопсид; винкристин; винбластин; колхицин; доксорубицин; даунорубицин; дигидрокси антрациндион; майтанзин или его аналог или производное; ауристатин или функциональный пептидный аналог или его производное; доластатин 10 или 15, или его аналог; иринотекан или его аналог; митоксантрон; митрамицин; актиномицин D; 1-дегидротестостерон; глюкокортикоид; прокаин; тетракаин; лидокаин; пропранолол; пуромицин; калихеамицин или его аналог или производное; антиметаболит; 6 меркаптопурин; 6 тиогуанин; цитарабин; флударабин; 5 фторурацил; декарбазин; гидроксимочевина; аспарагиназа; гемцитабин; кладрибин; алкилирующий агент; производное платины; дуокармицин А; дуокармицин SA; рахелмицин (СС-1065) или его аналог или производное; антибиотик; пиррол[2,1-с][1,4]-бензодиазепины (PDB); дифтерийный токсин; рицин-токсин; холерный токсин; Шигаподобный токсин; токсин LT; токсин С3; Шига токсин; токсин коклюша; столбнячный токсин; соевый ингибитор протеазы Боумана-Бирка; экзотоксин Pseudomonas; алорин; сапорин; модекцин; геланин; А-цепь абрина; А-цепь модекцина; альфа-сарцин; белки Aleurites fordii; белки диантина; белки Phytolacca americana; ингибитор момордики харансткой; курцин; кротин; ингибиторы мыльнянки лекарственной; гелонин; митогеллин; рестриктоцин; феномицин; токсины эномицина; рибонуклеазы (РНКазы); ДНКазы I; стафилококковый энтеротоксин А; противовирусный белок фитолакки; дифтерийный токсин и эндотоксин Pseudomonas.

Примеры ТММР.

ТММР по данному изобретению содержит по меньшей мере один гетеродимерный полипептид, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит иммуномодулирующий полипептид. Таким образом, в некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит по меньшей мере один гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС. В некоторых примерах ТММР по данному изобретению содержит по меньшей мере один гетеродимерный полипептид, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипеп

- 75 049816 тид, содержащий второй полипептид ГКГС; и ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит по меньшей мере один гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b) второй полипептид, содержащий: i) второй полипептид ГКГС, и ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях, по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой иммуномодулирующий полипептид дикого типа. В других случаях по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность для ко-иммуномодулирующего полипептида по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для коиммуномодулирующего полипептида. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях первый полипептид содержит от Nконца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены H16A и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный линкер находится между одним или более из: i) второго полипептида ГКГС и полипептида Fc Ig; ii) эпитопа и первого полипептида ГКГС; iii) первого полипептида ГКГС и иммуномодулирующего полипептида; и (когда ТММР содержит два иммуномодулирующих полипептида на первой полипептидной цепи) iv) между двумя иммуномодулирующими полипептидами. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность AAAGG (SEQ ID NO: 283). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10 (например, где n равно 2, 3 или 4). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN (SEQ ID NO: 261). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 286).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) по меньшей мере иммуномодулирующий полипептид; ii) второй полипептид ГКГС; и iii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность; ii) второй полипептид ГКГС; и iii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены H16A и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный линкер находится между одним или более из: i) второго полипептида ГКГС и полипептида Fc Ig; ii) эпитопа и первого полипептида ГКГС; iii) первого полипептида ГКГС и иммуномодулирующего полипептида; и (когда ТММР содержит два иммуномодулирующих полипептида на второй полипептидной цепи) iv) между двумя иммуномодулирующими полипептидами. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность AAAGG (SEQ ID NO: 283). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10 (например, где n равно 2, 3 или 4). В некоторых случаях

- 76 049816 пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN (SEQ ID NO: 261). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 286).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; ii) полипептид Fc Ig; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; ii) полипептид Fc Ig; и iii) два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16А и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный линкер находится между одним или более из: i) второго полипептида ГКГС и полипептида Fc Ig; ii) эпитопа и первого полипептида ГКГС; iii) полипептида Fc Ig и иммуномодулирующего полипептида; и (когда ТММР содержит два иммуномодулирующих полипептида на второй полипептидной цепи) iv) между двумя иммуномодулирующими полипептидами. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность AAAGG (SEQ ID NO: 283). В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)n (SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10 (например, где n равно 2, 3 или 4). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN (SEQ ID NO: 261). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 286).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) по меньшей мере иммуномодулирующий полипептид; ii) второй полипептид ГКГС; и iii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены H16A и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN (SEQ ID NO: 261).

В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 286).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; ii) пептидный эпитоп WT-1; и iii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность; ii) пептидный эпитоп WT-1; и iii) первый полипептид ГКГС. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены H16A и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный линкер находится между одним или более из: i) второго полипептида ГКГС и полипептида Fc Ig; ii) эпитопа и первого полипептида ГКГС; iii) иммуномодулирующего полипептида и эпитопа; и (когда ТММР содержит два иммуномодулирующих полипептида на

- 77 049816 первой полипептидной цепи) iv) между двумя иммуномодулирующими полипептидами. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность ^^Αθθ (SEQ ID NO: 283).

В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)n (SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10 (например, где n равно 2, 3 или 4). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN(SEQ id NO: 261).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца до С-конца: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и iii) по меньшей мере полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи HLA. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой полипептид HLA-A24. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи HLA представляет собой HLA-A24 с заменой А236С. В некоторых случаях второй полипептид содержит в направлении от N-конца до С-конца: i) второй полипептид ГКГС; ii) два иммуномодулирующих полипептида, причем два иммуномодулирующих полипептида имеют одинаковую аминокислотную последовательность; и iii) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1 человека. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, содержащий замены L234A и L235A. В некоторых случаях первый и второй полипептиды связаны друг с другом дисульфидной связью. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены H16A и F42A. В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий замены Н16Т и F42A. В некоторых случаях пептидный линкер находится между одним или более из: i) второго полипептида ГКГС и иммуномодулирующего полипептида; ii) иммуномодулирующего полипептида и полипептида Fc Ig; iii) эпитопа и первого полипептида ГКГС; iii) первого полипептида ГКГС и иммуномодулирующего полипептида; и (когда ТММР содержит два иммуномодулирующих полипептида на второй полипептидной цепи) iv) между двумя иммуномодулирующими полипептидами. В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность AAAGG (SEQ ID NO: 283).

В некоторых случаях пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n(SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10 (например, где n равно 2, 3 или 4). В некоторых случаях пептидный эпитоп WT-1 представляет собой CMTWNQMN (SEQ id NO: 261).

Как отмечалось выше, и как схематично изображено на фиг. 19, иммуномодулирующий полипептид (т.е. один или более иммуномодулирующих полипептидов) может присутствовать в ТММР по данному изобретению в любом из разнообразия положений. На фиг. 19 изображено положение двух копий варианта полипептида IL-2; однако иммуномодулирующий полипептид может быть любым из разнообразия иммуномодулирующих полипептидов, описанных в данном документе. Как изображено на фиг. 19, иммуномодулирующий полипептид может быть: 1) N-концевым к тяжелой цепи ГКГС I класса (положение 1); 2) С-концевым к тяжелой цепи ГКГС I класса и N-концевым к полипептиду Fc Ig; другими словами, находится между тяжелой цепью ГКГС I класса и полипептидом Fc Ig (положение 2); 3) С-концевым к полипептиду Fc Ig (положение 3); 4) N-концевым к пептидному эпитопу (положение 4); или 5) Сконцевым к полипептиду в2М (положение 5). Положение 1 относится к положению иммуномодулирующего полипептида на той же полипептидной цепи, что и тяжелая цепь ГКГС I класса, и является Nконцевым к тяжелой цепи ГКГС I класса; например, когда ТММР содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп (например, пептид WT-1); и ii) полипептид в2М; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) один или более иммуномодулирующих полипептидов; и ii) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса. Положение 2 относится к положению иммуномодулирующего полипептида на той же полипептидной цепи, что и тяжелая цепь ГКГС I класса, и находится на С-конце к тяжелой цепи ГКГС I класса; но не на С-конце полипептидной цепи; например, когда ТММР содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп (например, пептид WT-1); и ii) полипептид в2М; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; ii) один или более иммуномодулирующих полипептидов; и iii) полипептид Fc Ig. Положение 3 относится к положению иммуномодулирующего полипептида на той же полипептидной цепи, что и тяжелая цепь ГКГС I класса, и находится на С-конце полипептидной цепи; например, когда ТММР содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп (например, пептид WT-1); и ii) полипептид в2М; и b) второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; ii) полипептид Fc Ig; и iii) один или более иммуномодулирующих полипептидов. Положение 4 относится к положению иммуномодулирующего полипептида на той же полипептидной цепи, что и полипептид в2М, и является N-концевым к пептидному эпитопу и полипептиду в2М; например, когда ТММР содержит: а) первый полипептид, содержа

- 78 049816 щий в направлении от N-конца к С-концу: i) один или более иммуномодулирующих полипептидов; ii) пептидный эпитоп (например, пептид WT-1); и iii) полипептид в2М; и b) второй полипептид, содержащий полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса (например, второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и ii) полипептид Fc Ig. Положение 5 относится к положению иммуномодулирующего полипептида на той же полипептидной цепи, что полипептид в2М, и является С-концевым к полипептиду в2М (например, находится на С-конце полипептидной цепи); например, когда ТММР содержит: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп (например, пептид WT-1); и ii) полипептид в2М; iii) один или более иммуномодулирующих полипептидов; и b) второй полипептид, содержащий полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса (например, второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и ii) полипептид Fc Ig.

Кроме того, как обсуждалось выше и как схематично изображено на фиг. 18А-18С, первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ТММР по данному изобретению могут связываться одной или более дисульфидными связями. Например, ТМММР по данному изобретению может содержать: а) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид в2М с заменой R12C; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса с заменой А236С; таким образом дисульфидная связь образуется между Cys в положении 12 полипептида в2М в первой полипептидной цепи, и Cys в положении 236 полипептида тяжелой цепи ГКГС I класса во второй полипептидной цепи. В качестве другого примера, ТМММР по данному изобретению может содержать: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп; ii) пептидный линкер, содержащий последовательность GCGG(G4S)n (SEQ ID NO: 393), где n равно 1, 2 или 3; и iii) полипептид р2М; и b) второй полипептид, содержащий полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса с заменой Y84C, так что дисульфидная связь между Cys в пептидном линкере в первой полипептидной цепи и Cys в положении 84 полипептида ГКГС I класса во второй полипептидной цепи. В других примерах ТММР по данному изобретению может содержать: а) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп; ii) пептидный линкер, содержащий последовательность GCGG(G4S)_n (SEQ ID NO: 393), где n равно 1, 2 или 3; и iii) полипептид в2М с заменой R12C; и b) второй полипептид, содержащий полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса с заменой Y84C и заменой А236С; так что: i) первая дисульфидная связь образуется между Cys в первом линкере в первой полипептидной цепи и Cys в положении 84 полипептида тяжелой цепи ГКГС I класса во второй полипептидной цепи; и ii) вторая дисульфидная связь между Cys в положении 12 полипептида в2М в первой полипептидной цепи и Cys в положении 236 полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса во второй полипептидной цепи. Для упрощения первая дисульфидная связь называется G2C/Y84C; а вторая дисульфидная связь называется R12C/A236C. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; b) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; или с) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную связь R12C/A236C.

ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; и b) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 1. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; и b) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 2. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; и b) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 3. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; и b) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 4. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C, но не дисульфидную связь R12C/A236C; и b) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 5.

ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 1. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 2. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 3. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 4. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь R12C/A236C, но не дисульфидную связь G2C/Y84C; и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 5.

ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную связь R12C/A236C; и b) и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 1. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную связь R12C/A236C; и b) и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 2. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную

- 79 049816 связь R12C/A236C; и b) и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 3. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную связь R12C/A236C; и b) и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 4. ТММР по данному изобретению может включать: а) дисульфидную связь G2C/Y84C и дисульфидную связь R12C/A236C; и b) и по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид в положении 5.

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей первой и второй полипептидных цепей ТММР по данному изобретению представлены на фиг. 4А-4К и фиг. 20A-20R.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2752, как изображено на фиг. 4D; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3159, как изображено на фиг. 4С.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2753, как изображено на фиг. 4Е; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3159, как изображено на фиг. 4С. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2752, как изображено на фиг. 4D; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2750, как изображено на фиг. 4В.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2753, как изображено на фиг. 4Е; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2750, как изображено на фиг. 4В. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2752, как изображено на фиг. 4D; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3158, как изображено на фиг. 4А.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2753, как изображено на фиг. 4Е; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3158, как изображено на фиг. 4А.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2380, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 1715, как изображено на фиг. 14А.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2381, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 1715, как изображено на фиг. 14А.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2380, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2405, как изображено на фиг. 14D.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2381, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2405, как изображено на фиг. 14D. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2762, как изображено на фиг. 14F; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2405, как изображено на фиг. 14D.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2380, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 1380, как изображено на фиг. 14Е.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2381, как изображено на фиг. 14В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 1380, как изображено на фиг. 14Е.

- 80 049816

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3592, как изображено на фиг. 20А; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3188, как изображено на фиг. 20Н. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3425, как изображено на фиг. 20В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3188, как изображено на фиг. 20Н. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3196, как изображено на фиг. 20С; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3604, как изображено на фиг. 201. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 5, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2764, как изображено на фиг. 20D; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3603, как изображено на фиг. 20J. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 5, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3593, как изображено на фиг. 20Е; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3192, как изображено на фиг. 20К. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3426, как изображено на фиг. 20F; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3192, как изображено на фиг. 20K. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3197, как изображено на фиг. 20G; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3605, как изображено на фиг. 20L. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 5, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3592, как изображено на фиг. 20А; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3529, как изображено на фиг. 20М. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3425, как изображено на фиг. 20В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3529, как изображено на фиг. 20М. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C; и также содержит эпитоп WT1 239-247 (Q240Y).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3196, как изображено на фиг. 20С; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3709, как изображено на фиг. 20N. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) как дисульфидную связь G2C/Y84C, так и дисульфидную связь R12C/A236C.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2750, как изображено на фиг. 4В; и

- 81 049816

b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3528, как изображено на фиг. 20О. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3159, как изображено на фиг. 4С; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3528, как изображено на фиг. 20О. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 2764, как изображено на фиг. 20D; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3708, как изображено на фиг. 20Р. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 5, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3593, как изображено на фиг. 20Е; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3530, как изображено на фиг. 20Q. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 1, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3426, как изображено на фиг. 20F; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3530, как изображено на фиг. 20Q. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3197, как изображено на фиг. 20G; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3710, как изображено на фиг. 20R. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 5, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3426, как изображено на фиг. 20F; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3529, как изображено на фиг. 20М. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C), и также включает эпитоп WT1 239-247 (Q240Y).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3425, как изображено на фиг. 20В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3528, как изображено на фиг. 20О. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C) и также включает эпитоп WT1 239-247 (Q240Y).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3425, как изображено на фиг. 20В; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3530, как изображено на фиг. 20Q. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь G2C/Y84C (но не дисульфидную связь R12C/A236C), и также включает эпитоп WT1 239-247 (Q240Y).

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению содержит: а) первую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3159, как изображено на фиг. 4С; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую аминокислотную последовательность, обозначенную 3188, как изображено на фиг. 20Н. Такой ТММР содержит: а) иммуномодулирующий полипептид в положении 3, как изображено на фиг. 19; и b) дисульфидную связь R12C/A236C (но не дисульфидную связь G2C/Y84C), и также включает эпитоп WT1 235-243 (M236Y).

Способы получения мультимерного модулирующего Т-клетки полипептида. В данном изобретении предложен способ получения ТММР, содержащего один или более вариантов иммуномодулирующих полипептидов, которые проявляют уменьшенную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего родительского иммуномодулирующего

- 82 049816 полипептида дикого типа к ко-иммуномодулирующему полипептиду, включающий: А) создание библиотеки ТММР, содержащей множество членов, причем каждый член содержит: а) первый полипептид, содержащий: i) эпитоп и ii) первый основной полипептид ГКГС, и b) второй полипептид, содержащий: i) второй полипептид ГКГС; и ii) необязательно полипептид Fc Ig или каркас не от Ig, причем каждый член содержит разный вариант иммуномодулирующего полипептида на первом полипептиде, втором полипептиде или как на первом, так и на втором полипептиде; В) определение аффинности каждого члена библиотеки с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом; и С) выбор члена, который проявляет пониженную аффинность с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях аффинность определяют с помощью биослойной интерферометрии (BLI) с использованием очищенных членов библиотеки ТММР и когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида. Методы BLI хорошо известны специалистам в данной области техники. Анализ BLI описан выше. См., например, Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4): 498-507 и Shah and Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383.

В данном изобретении предложен способ получения ТММР, который проявляет селективное связывание с Т-клеткой, включающий: А) создание библиотеки ТММР, содержащей множество членов, причем каждый член содержит: а) первый полипептид, содержащий: i) эпитоп; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий: i) второй полипептид ГКГС; и ii) необязательно полипептид Fc иммуноглобулина (Ig) или каркас не от Ig, причем каждый член включает другой вариант иммуномодулирующего полипептида на первом полипептиде, втором полипептиде, или как на первом, так и на втором полипептиде, при этом вариант иммуномодулирующего полипептида отличается по аминокислотной последовательности 1-10 аминокислотами от родительского иммуномодулирующего полипептида дикого типа; В) приведение в контакт члена библиотеки ТММР с Т-клеткой-мишенью, экспрессирующей на своей поверхности: i) когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) Т-клеточный рецептор, который связывается с эпитопом, причем член библиотеки ТММР содержит метку эпитопа, так, что член библиотеки ТММР связывается с Т-клеткой-мишенью; С) приведение в контакт члена библиотеки ТММР, связывающегося с Т-клеткой-мишенью с помощью флуоресцентно меченного связывающего агента, который связывается с меткой эпитопа, создание комплекса член библиотеки ТММР/Т-клеткамишень/связывающий агент; D) измерение средней интенсивности флуоресценции (MFI) комплекса член библиотеки ТММР/Т-клетка-мишень/связывающий агент с использованием проточной цитометрии, при этом MFI, измеряемая в диапазоне концентраций члена библиотеки ТММР, обеспечивает меру аффинность и очевидной авидности; и Е) выбор члена библиотеки ТММР, который выборочно связывает Тклетку мишень, по сравнению со связыванием члена библиотеки ТММР с контрольной Т-клеткой, которая содержит: i) когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) Т-клеточный рецептор, который связывается с эпитопом, отличным от эпитопа, присутствующего в члене библиотеки ТММР. В некоторых случаях член библиотеки ТММР, который идентифицирован как избирательно связывающийся с Т-клеткоймишенью, выделяются из библиотеки.

В некоторых случаях родительские пары иммуномодулирующего полипептида дикого типа и когнатного иммуномодулирующего полипептида выбирают из:

IL-2 и рецептора IL-2;

4-1BBL и 4-1ВВ;

PD-L1 и PD-1;

CD70 и CD27;

TGFe и рецептора TGFe;

CD80 и CD28;

CD86 и CD28;

OX40L и ОХ40;

FasL и Fas;

ICOS-L и ICOS;

ICAM и LFA-1;

JAG1 и Notch;

JAG1 и CD46;

CD80 и CTLA4; и

CD86 и CTLA4.

В данном изобретении предложен способ получения ТММР, содержащего один или более вариантов иммуномодулирующих полипептидов, которые проявляют пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего родительского иммуномодулирующего полипептида дикого типа к ко-иммуномодулирующему полипептиду, включающий отбор из библиотеки ТММР, включающей множество членов, члена, который проявляет пониженную аффинность к когнатному ко-иммуномодулирующему полипептиду, причем множество членов содержит: а) первый полипептид, содержащий: i) эпитоп; и ii) первый полипептид ГКГС; и b) второй полипептид, содержащий: i) второй полипептид ГКГС; и ii) необязательно полипептид Fc Ig или каркас

- 83 049816 не от Ig, при этом члены библиотеки содержат множество вариантов иммуномодулирующего полипептида, присутствующего в первом полипептиде, во втором полипептиде или как в первом, так и во втором полипептиде. В некоторых случаях этап отбора включает определение аффинности с использованием биослойной интерферометрии связывания между членами библиотеки ТММР и когнатным коиммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях ТММР является таким, как описанный выше.

В некоторых случаях способ дополнительно включает: а) приведение в контакт выбранного члена библиотеки ТММР с Т-клеткой-мишенью, экспрессирующей на своей поверхности: i) когнатный коиммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) Т-клеточный рецептор, который связывается с эпитопом, причем член библиотеки ТММР содержит метку эпитопа, так что член библиотеки ТММР связывается с Т-клеткой-мишенью; b) приведение в контакт выбранного члена библиотеки ТММР с Т-клеткой-мишенью с флуоресцентно меченным связывающим агентом, который связывается с меткой эпитопа, создавая комплекс выбранный член библиотеки ТММР/Т-клетка-мишень/связывающий агент; и с) измерение средней интенсивности флуоресценции (MFI) комплекс выбранный член библиотеки ТММР/Т-клетка-мишень/связывающий агент с использованием проточной цитометрии, при этом MFI, измеренная в диапазоне концентраций выбранного члена библиотеки ТММР, обеспечивает измерение аффинности и кажущейся авидности. Выбранный член библиотеки ТММР, который специфически связывается с Т-клеткой мишенью, по сравнению со связыванием члена библиотеки ТММР с контрольной Т-клеткой мишенью, содержащей: i) когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, который связывает родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа; и ii) T-клеточный рецептор, который связывается с эпитопом, отличным от эпитопа, присутствующего в члене библиотеки ТММР, идентифицируют как селективное связывание с Т-клеткой-мишенью. В некоторых случаях связывающий агент представляет собой антитело, специфическое к метке эпитопа. В некоторых случаях вариант иммуномодулирующего полипептида содержит от 1 до 20 аминокислотных замен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен) по сравнению с соответствующим родительским иммуномодулирующим полипептидом дикого типа. В некоторых случаях ТММР содержит два варианта иммуномодулирующих полипептидов. В некоторых случаях два варианта иммуномодулирующих полипептидов содержат одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых случаях первый полипептид содержит один из двух вариантов иммуномодулирующих полипептидов, и при этом второй полипептид содержит второй из двух вариантов иммуномодулирующих полипептидов. В некоторых случаях два варианта иммуномодулирующих полипептидов находятся в одной и той же полипептидной цепи ТММР. В некоторых случаях два варианта иммуномодулирующих полипептидов находятся в первой полипептидной цепи ТММР. В некоторых случаях два варианта иммуномодулирующих полипептидов находятся во второй полипептидной цепи ТММР.

В некоторых случаях способ дополнительно включает выделение выбранного члена библиотеки ТММР из библиотеки. В некоторых случаях способ дополнительно включает обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую выбранный член библиотеки ТММР. В некоторых случаях нуклеиновая кислота присутствует в рекомбинантном векторе экспрессии. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность функционально связана с элементом контроля транскрипции, который функционирует в эукариотической клетке. В некоторых случаях способ дополнительно включает введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку-хозяина и культивирование клетки в жидкой среде для синтеза кодированного выбранного члена библиотеки ТММР в клетке. В некоторых случаях способ дополнительно включает выделение синтезированного выбранного члена библиотеки ТММР из клетки или из жидкой культуральной среды, содержащей клетку. В некоторых случаях выбранный член библиотеки ТММР содержит полипептид Fc Ig. В некоторых случаях способ дополнительно включает конъюгирование лекарственного средства с полипептидом Fc Ig. В некоторых случая, лекарственное средство представляет собой цитотоксических агент, выбранный из майтанзиноида, бензодиазепина, таксоида, СС-1065, дуокармицина, аналога дуокармицина, калихеамицина, доластатина, аналога доластатина, ауристатина, томаймицина и лептомицина или пролекарства любого из вышеперечисленных. В некоторых случаях лекарственное средство представляет собой ретиноид. В некоторых случаях родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа и когнатные иммуномодулирующие полипептиды выбирают из: IL-2 и рецептора IL-2; 4-1BBL и 4-1ВВ; PD-L1 и PD-1; CD70 и CD27; TGFe и рецептора TGFe; CD80 и CD28; CD86 и CD28; OX40L и ОХ40; FasL и Fas; ICOS-L и ICOS; ICAM и LFA-1; JAG1 и Notch; JAG1 и CD46; CD80 и CTLA4, и CD86 и CTLA4.

В данном изобретении предложен способ получения ТММР, содержащего один или более вариантов иммуномодулирующих полипептидов, которые проявляют сниженную аффинность к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего родительского иммуномодулирующего полипептида дикого типа к ко-иммуномодулирующему полипептиду, включающий: А) обеспечение библиотеки ТММР, содержащей множество членов, причем множество членов содержит: а) первый полипептид, содержащий: i) эпитоп и ii) первый основной полипептид ГКГС, и b) второй полипептид, содержащий: i) второй полипептид ГКГС; и ii) необязательно полипептид Fc Ig или

- 84 049816 каркас не от Ig, причем члены библиотеки содержат разные варианты иммуномодулирующего полипептида, представленного в первом полипептиде, втором полипептиде или как на первом, так и на втором полипептиде; и В) выбор из библиотеки члена, который проявляет пониженную аффинность с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях этап отбора включает определение аффинности с использованием биослойной интерферометрии связывания между членами библиотеки ТММР и когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом. В некоторых случаях ТММР является таким, как описанный выше.

В некоторых случаях способ дополнительно включает выделение выбранного члена библиотеки ТММР из библиотеки. В некоторых случаях способ дополнительно включает обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую выбранный член библиотеки ТММР. В некоторых случаях нуклеиновая кислота присутствует в рекомбинантном векторе экспрессии. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность функционально связана с элементом контроля транскрипции, который функционирует в эукариотической клетке. В некоторых случаях способ дополнительно включает введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку-хозяина и культивирование клетки в жидкой среде для синтеза кодированного выбранного члена библиотеки ТММР в клетке. В некоторых случаях способ дополнительно включает выделение синтезированного выбранного члена библиотеки ТММР из клетки или из жидкой культуральной среды, содержащей клетку. В некоторых случаях выбранный член библиотеки ТММР содержит полипептид Fc Ig. В некоторых случаях способ дополнительно включает конъюгирование лекарственного средства с полипептидом Fc Ig. В некоторых случая, лекарственное средство представляет собой цитотоксических агент, выбранный из майтанзиноида, бензодиазепина, таксоида, СС-1065, дуокармицина, аналога дуокармицина, калихеамицина, доластатина, аналога доластатина, ауристатина, томаймицина и лептомицина или пролекарства любого из вышеперечисленных. В некоторых случаях лекарственное средство представляет собой ретиноид. В некоторых случаях родительский иммуномодулирующий полипептид дикого типа и когнатные иммуномодулирующие полипептиды выбирают из IL-2 и рецептора IL-2; 4-1BBL и 4-1ВВ; PD-L1 и PD-1; TGFe и рецептора TGFe; CD80 и CD28; CD86 и CD28; OX40L и ОХ40; FasL и Fas; ICOS-L и ICOS; CD70 и CD27; ICAM и LFA-1; JAG1 и Notch; JAG1 и CD46; CD80 и CTLA4, и CD86 и CTLA4.

Нуклеиновые кислот.

Данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ТММР по данному изобретению. Данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ТММР по данному изобретению.

Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим нуклеотидные последова

- 85 049816 тельности, кодирующие ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях отдельные полипептидные цепи ТММР по данному изобретению кодируются отдельными нуклеиновыми кислотами. В некоторых случаях все полипептидные цепи ТММР по данному изобретению кодируются одной нуклеиновой кислотой. В некоторых случаях первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению, а вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях одиночная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению и второй полипептид ТММР по данному изобретению.

Отдельные нуклеиновые кислоты, кодирующие отдельные полипептидные цепи мультимерного полипептида.

Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР по данному изобретению. Как указано выше, в некоторых случаях отдельные полипептидные цепи ТММР по данному изобретению кодируются отдельными нуклеиновыми кислотами. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие отдельные полипептидные цепи ТММР по данному изобретению, функционально связаны с элементами контроля транскрипции, например промоторами, такими как промоторы, которые функционируют в эукариотической клетке, причем промотор может быть конститутивным промотором или индуцибельным промотором.

Данное изобретение обеспечивает первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту, причем первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению, при этом первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: а) эпитоп (например, Т-клеточный эпитоп); b) первый полипептид ГКГС; и с) иммуномодулирующий полипептид (например, вариант с пониженной аффинностью, как описано выше); и при этом вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид ТММР по данному изобретению, при этом второй полипептид содержит, в направлении от N-конца к С-концу: а) второй полипептид ГКГС; и b) полипептид Fc Ig. Подходящие Т-клеточные эпитопы, полипептиды ГКГС, иммуномодулирующие полипептиды и полипептиды Fc Ig описаны выше. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие первый и второй полипептиды, функционально связаны с элементами контроля транскрипции. В некоторых случаях элемент контроля транскрипции представляет собой промотор, который функционирует в эукариотической клетке. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты присутствуют в отдельных векторах экспрессии.

Данное изобретение обеспечивает первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту, причем первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению, при этом первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: а) эпитоп (например, Т-клеточный эпитоп); b) первый полипептид ГКГС; и при этом вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид ТММР по данному изобретению, при этом второй полипептид содержит, в направлении от Nконца к С-концу: а) иммуномодулирующий полипептид (например, вариант с пониженной аффинностью, как описано выше); b) второй полипептид ГКГС; и с) полипептид Fc Ig. Подходящие Т-клеточные эпитопы, полипептиды ГКГС, иммуномодулирующие полипептиды и полипептиды Fc Ig описаны выше. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие первый и второй полипептиды, функционально связаны с элементами контроля транскрипции. В некоторых случаях элемент контроля транскрипции представляет собой промотор, который функционирует в эукариотической клетке. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты присутствуют в отдельных векторах экспрессии.

Нуклеиновая кислота, кодирующая два или более полипептида, присутствующих в мультимерном полипептиде.

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях, когда ТММР по данному изобретению содержит первый, второй и третий полипептид, нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый, второй и третий полипептиды. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению, включают протеолитически расщепляемый линкер, вставленный между нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый полипептид, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй полипептид. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению, включают внутренний участок посадки рибосомы (IRES), вставленный между нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый полипептид, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй полипептид. В некоторых случаях нуклеотидные последовательности, кодирующие первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению, включают сигнал пропуска рибосомы (или цис-действующий гидролазный элемент, CHYSEL (SEQ ID NO: 394)) вставленный между нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый полипептид, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй полипептид. Примеры нуклеиновых кислот описаны ни

- 86 049816 же, в которых протеолитически расщепляемый линкер предусмотрен между нуклеотидными последовательностями, кодирующими первый полипептид и второй полипептид ТММР по данному изобретению; в любом из этих вариантов осуществления вместо нуклеотидной последовательности, кодирующей протеолитически расщепляемый линкер, можно использовать IRES или сигнал пропуска рибосомы.

В некоторых случаях первая нуклеиновая кислота (например, рекомбинантный вектор экспрессии, мРНК, вирусная РНК, и т.д.) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первую полипептидную цепь ТММР по данному изобретению, а вторая нуклеиновая кислота (например, рекомбинантный вектор экспрессии, мРНК, вирусная РНК, и т.д.) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую полипептидную цепь мультимерного полипептида по данному изобретению. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая первый полипептид, и вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая второй полипептид, каждый функционально связана с элементами контроля транскрипции, например, с промоторами, такими как промоторы, которые функционируют в эукариотической клетке, при этом промотор может быть конститутивным промотором или индуцибельным промотором.

Данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид, причем рекомбинантный полипептид содержит, в направлении от N-конца к С-концу: а) эпитоп (например, Т-клеточный эпитоп); b) первый полипептид ГКГС; с) иммуномодулирующий полипептид (например, вариант с пониженной аффинностью, как описано выше); d) протеолитически расщепляемый линкер; е) второй полипептид ГКГС; и f) полипептид Fc иммуноглобулина (Ig). Данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид, причем рекомбинантный полипептид содержит, в направлении от N-конца к С-концу: а) первый лидерный пептид; b) эпитоп; с) первый полипептид ГКГС; d) иммуномодулирующий полипептид (например, вариант с пониженной аффинностью, как описано выше); е) протеолитически расщепляемый линкер; f) второй лидерный пептид; g) второй полипептид ГКГС; и h) полипептид Fc Ig. Данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид, причем рекомбинантный полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: а) эпитоп; b) первый полипептид ГКГС; с) протеолитически расщепляемый линкер; d) иммуномодулирующий полипептид (например, вариант с пониженной аффинностью, как описано выше); е) второй полипептид ГКГС; и f) полипептид Fc Ig. В некоторых случаях первый лидерный пептид и второй лидерный пептид представляют собой лидерный пептид в2-М. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность функционально связана с элементом контроля транскрипции. В некоторых случаях элемент контроля транскрипции представляет собой промотор, который функционирует в эукариотической клетке.

Подходящие полипептиды ГКГС описаны выше. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2-микроглобулина; и при этом второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса. В некоторых случаях полипептид в2-микроглобулина содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью в2М, изображенной на фиг. 6. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса представляет собой тяжелую цепь HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K или HLA-L. В некоторых случаях полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изображенной на любой из фиг. 3А-3С.

Подходящие полипептиды Fc описаны выше. В некоторых случаях полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1, полипептид Fc IgG2, полипептид Fc IgG3, полипептид Fc IgG4, полипептид Fc IgA или полипептид Fc IgM. В некоторых случаях полипептид Fc Ig содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг. 5A-5G.

Подходящие иммуномодулирующие полипептиды описаны выше.

Подходящие протеолитически расщепляемые линкеры описаны выше. В некоторых случаях протеолитически расщепляемый линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

a) LEVLFQGP (SEQ ID NO:388); b) ENLYTQS (SEQ

ID NO:389); c) DDDDK (SEQ ID NO:390); d) LVPR (SEQ ID NO:391); и e) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:392).

В некоторых случаях линкер между эпитопом и первым полипептидом ГКГС содержит первый остаток Cys, а второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную замену для обеспечения второго остатка Cys, так что первый и второй остатки Cys обеспечивают дисульфидную связь между линкером и вторым полипептидом ГКГС. В некоторых случаях первый полипептид ГКГС содержит аминокислотную замену для получения первого остатка Cys, а второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную замену для получения второго остатка Cys, так что первый остаток Cys и второй остаток Cys обеспечивают дисульфидную связь между первым полипептидом ГКГС и вторым полипептидом ГКГС.

- 87 049816

Рекомбинантные векторы экспрессии.

Данное изобретение предоставляет рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие нуклеиновые кислоты по данному изобретению. В некоторых случаях рекомбинантный вектор экспрессии является вектором, не происходящим из вируса. В некоторых случаях рекомбинантный вектор экспрессии представляет собой вирусную конструкцию, например, рекомбинантную аденоассоциированную вирусную конструкцию (см., например, патент США № 7078387), рекомбинантную аденовирусную конструкцию, рекомбинантную лентивирусную конструкцию, рекомбинантную ретровирусную конструкцию, неинтегрирующий вирусный вектор и др.

Подходящие векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы (например, вирусные векторы на основе вируса коровьей оспы; полиовируса; аденовируса (см., например, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655); аденоассоциированного вируса (см., например, АН et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava в WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; и Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; вируса простого герпеса; вируса иммунодефицита человека (см., например, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); ретровирусного вектора (например, вируса мышиной лейкемии, вируса некроза селезенки и векторы, полученные из ретровирусов, таких как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы Харви, вирус птичьего лейкоза, лентивирус, вирус иммунодефицита человека, вирус миелопролиферативной саркомы и вирус опухоли молочной железы); и тому подобное.

Специалистам в данной области техник известны многочисленные подходящие векторы экспрессии, и многие из них коммерчески доступны. Следующие векторы представлены в качестве примера; для эукариотических клеток-хозяев: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG и pSVLSV40 (Pharmacia). Однако может использоваться любой другой вектор, если он совместим с клеткой-хозяином.

В зависимости от используемой системы хозяин/вектор, любой из подходящих элементов управления транскрипцией и трансляцией, включая конститутивные и индуцибельные промоторы, элементы энхансера транскрипции, терминаторы транскрипции и т.д., могут использоваться в векторе экспрессии (см., например, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).

В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая ДНК-нацеленную РНК и/или сайт-направленный модифицирующий полипептид, функционально связана с контрольным элементом, например, с транскрипционным контрольным элементом, таким как промотор. Элемент контроля транскрипции может быть функциональным в любой эукариотической клетке, например, в клетке млекопитающего; или прокариотической клетке (например, бактериальной клетке или клетке архей). В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая ДНК-нацеленную РНК и/или сайтнаправленный модифицирующий полипептид, функционально связана с несколькими контрольными элементами, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ДНКнацеленную РНК, и/или сайт-направленный модифицирующий полипептид как в прокариотических, так и в эукариотических клетках.

Неограничивающие примеры подходящих эукариотических промоторов (промоторы, функционирующие в эукариотической клетке) включают промоторы цитомегаловируса (CMV) с крайне ранней стадии, тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV), ранние и поздние SV40, длинные концевые повторы (LTR) ретровируса и мышиный металлотионеин-I. Выбор подходящего вектора и промотора находится в пределах обычного уровня знаний в данной области техники. Вектор экспрессии также может содержать сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор экспрессии также может содержать соответствующие последовательности для усиления экспрессии.

Г енетически модифицированные клетки-хозяева.

Данное изобретение обеспечивает генетически модифицированную клетку-хозяина, причем клеткахозяин генетически модифицирована нуклеиновой кислотой по данному изобретению.

Подходящие клетки-хозяева включают эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих. В некоторых случаях клетка-хозяин является клеткой линии клеток млекопитающих. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают клеточные линии человека, клеточные линии приматов, отличных от человека, клеточные линии грызунов (например, мышей, крыс) и тому подобное. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки HeLa (например, № CCL-2 Американской коллекции типовых культур (АТСС)), клетки СНО (например, АТСС № CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, АТСС № CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3T3 (например, АТСС № CRL-1658), клетки Huh-7, клетки ВНК (например, АТСС № CCL10), клетки PC12 (АТСС № CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (АТСС № CRL1651), клетки RAT1, клетки L мыши (АТСС № CCLI.3), клетки эмбриональной почки человека (HEK) (АТСС № CRL1573), клетки HLHepG2, и тому подобное.

- 88 049816

В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, которая была генетически модифицирована таким образом, что она не синтезирует эндогенный МНС в2-М.

В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, которая была генетически модифицирована таким образом, что она не синтезирует эндогенную тяжелую цепь ГКГС I класса. В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, которая была генетически модифицирована таким образом, что она не синтезирует эндогенный в2-М ГКГС, и таким образом, что она не синтезирует эндогенную тяжелую цепь ГКГС I класса.

Композиции.

Данное изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие ТММР (synTac) по данному изобретению. Данное изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие ТММР по данному изобретению. Данное изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению.

Композиции, содержащие мультимерный полипептид.

Композиция по данному изобретению может содержать, помимо ТММР по данному изобретению, один или более из следующих компонентов: соль, например, NaCl, MgCl₂, KCl, MgSO₄, и т.д.; буферный агент, например, Трис-буфер, Н-(2-гидроксиэтил) пиперазин-Ы-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES), 2(N-морфолино) этансульфоновая кислота (MES), натриевая соль 2-(Я-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), 3-(№морфолино) пропансульфоновая кислота (MOPS), №трис[гидроксиметил]метил-3аминопропансульфоновая кислота (TAPS) и т.п.; солюбилизирующий агент; детергент, например, неионный детергент, такой как Tween-20, и т.д.; ингибитор протеазы; глицерин; и тому подобное.

Композиция может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, разнообразие которого известно в данной области техники и не нуждается в подробном обсуждении в данном документе. Фармацевтически приемлемые эксципиенты подробно описаны в различных публикациях, включая, например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Ed. (1995), или последнее издание, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7^th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3^rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

Фармацевтическая композиция может содержать ТММР по данному изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых случаях рассматриваемая фармацевтическая композиция будет подходящей для введения субъекту, например будет стерильной. Например, в некоторых случаях рассматриваемая фармацевтическая композиция будет подходящей для введения субъекту-человеку, например, когда композиция является стерильной и не содержит обнаруживаемых пирогенов и/или других токсинов.

Белковые композиции могут содержать другие компоненты, такие как фармацевтические степени чистоты маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, магния, карбоната и тому подобное. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН и буферные агенты, регулирующие токсичность агенты и тому подобное, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия, гидрохлорид, сульфат соли, сольваты (например, смешанные ионные соли, вода, органика), гидраты (например, вода) и тому подобное.

Например, композиции могут включать водный раствор, порошковую форму, гранулы, таблетки, пилюли, суппозитории, капсулы, суспензии, спреи и тому подобное. Композиция может быть составлена в соответствии с различными путями введения, описанными ниже.

Когда ТММР по данному изобретению вводят в виде инъекций (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно и/или внутривенно) непосредственно в ткань, состав может быть предоставлен в виде готовой к употреблению лекарственной формы или в виде водной формы (например, восстанавливаемый стабильный при хранении порошок) или водной формы, такой как жидкость, состоящая из фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов. Также могут быть предоставлены белоксодержащие препараты для увеличения периода полувыведения ТММР из сыворотки после введения. Например, ТММР может быть представлен в виде липосомной композиции, приготовленной в виде коллоида, или другими общепринятыми способами увеличения периода полувыведения из сыворотки. Существует множество способов получения липосом, как описано, например, в Szoka et al., 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, патентах США № 4235871, 4501728 и 4837028. Препараты могут также предоставляться в формах с контролируемым или замедленным высвобождением.

Другие примеры составов, подходящих для парентерального введения, включают изотонические стерильные инъекционные растворы, антиоксиданты, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента, суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Например, рассматриваемая фармацевтиче

- 89 049816 ская композиция может присутствовать в контейнере, например, стерильном контейнере, таком как шприц. Композиции могут быть представлены в герметичных контейнерах с единичными или многократными дозами, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в замороженных (лиофилизированных) условиях, требующих только добавления стерильного жидкого эксципиента, например воды, для инъекций, непосредственно перед использованием. Инъекционные растворы и суспензии для немедленного введения могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток.

Концентрация ТММР по данному изобретению в композиции может широко варьировать (например, от менее чем около 0,1%, обычно от или от по меньшей мере около 2% вплоть до от 20% до 50% или более по массе) и будет обычно выбираться в основном на основе объемов жидкости, вязкости и факторов, связанных с пациентом, в соответствии с выбранным конкретным способом введения и потребностями пациента.

Данное изобретение обеспечивает контейнер, содержащий композицию по данному изобретению, например жидкую композицию. Контейнер может представлять собой, например, шприц, ампулу и тому подобное. В некоторых случаях контейнер является стерильным. В некоторых случаях как контейнер, так и композиция являются стерильными.

Данное изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие ТММР по данному изобретению. Композиция может содержать: а) ТММР по данному изобретению; и b) эксципиент, как описано выше. В некоторых случаях эксципиент представляет собой фармацевтически приемлемый эксципиент.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению присутствует в жидкой композиции. Таким образом, данное изобретение относится к композициям (например, жидким композициям, включая фармацевтические композиции), содержащие ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях композиция по данному изобретению содержит: а) ТММР по данному изобретению; и b) физиологический раствор (например, 0,9% NaCl). В некоторых случаях композиция является стерильной. В некоторых случаях композиция является подходящей для введения субъекту-человеку, например, когда композиция является стерильной и не содержит обнаруживаемых пирогенов и/или других токсинов. Таким образом, данное изобретение относится к композиции, содержащей: а) ТММР по данному изобретению; и b) физиологический раствор (например, 0,9% NaCl), причем композиция является стерильной и не содержит детектируемых пирогенов и/или других токсинов.

Композиции, содержащие нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии

Данное изобретение относится к композициям, например, фармацевтические композиции, содержащие нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению. В данной области техники известно широкое разнообразие фармацевтически приемлемых эксципиентов, и нет необходимости подробно обсуждать их в данном документе. Фармацевтически приемлемые эксципиенты подробно описаны в различных публикациях, включая, например, A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. С Ansel et al, eds 7^th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3^rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

Композиция по данному изобретению может содержать: а) одну или более нуклеиновых кислот или один или более рекомбинантных векторов экспрессии, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР; и b) один или более из: буфера, поверхностно-активного вещества, антиоксиданта, гидрофильного полимера, декстрина, хелатирующего агента, суспендирующего агента, солюбилизатора, загустителя, стабилизатора, бактериостатического агента, смачивающего агента, и консерванта. Подходящие буферы включают без ограничения, (такие как К№бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота (BES), бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метан (BIS-Tris), N-(2гидроксиэтил)пиперазин-Ы'3-пропансульфоновая кислота (EPPS или HEPPS), глицилглицин, N-2гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота (HEPES), 3-(№морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS), пиперазин-Ы,№бис(2-этан-сульфоновая кислота) (PIPES), бикарбонат натрия, 3-(Nтрис(гидроксиметил)-метил-амино-)-2-гидрокси-пропансульфоновая кислота) TAPSO, (Nтрис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота (TES), №трис(гидроксиметил)метилглицин (Tricine), трис(гидроксиметил)-аминометан (Tris) и т.д.). Подходящие соли включают, например, NaCl, MgCl₂, KCl, MgSO₄, и т.д.

Фармацевтический состав по данному изобретению может включать нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению в количестве от около 0,001% до около 90% (мас./мас.). В описании составов ниже рассматриваемая нуклеиновая кислота или рекомбинантный вектор экспрессии следует понимать как включающий нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению. Например, в некоторых случаях состав по данному изобретению содержит нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению.

Целевая нуклеиновая кислота или рекомбинантный вектор экспрессии могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими соединениями или смесями соединений; такие соединения могут включать, например, липосомы или молекулы, нацеленные на рецепторы. Целевая нуклеиновая кислота или рекомбинантный вектор экспрессии могут быть объединены в составе

- 90 049816 с одним или более компонентами, которые способствуют поглощению, распределению и/или абсорбции.

Композиция рассматриваемой нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора экспрессии может быть представлена в виде любой из множества возможных лекарственных форм, таких как, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Целевая композиция нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора экспрессии также может быть приготовлена в виде суспензии в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включая, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

Состав, содержащий нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии, может представлять собой липосомальный состав. Используемый в данном документе термин липосома означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, расположенных в сферическом двойном слое или двойных слоях. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю часть, которая содержит доставляемую композицию. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые могут взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Считается, что липосомы, чувствительные к рН или отрицательно заряженные, захватывают ДНК, а не образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы могут быть использованы для доставки целевой нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора экспрессии.

Липосомы также включают стерически стабилизированные липосомы, термин, который при использовании в данном документе относится к липосомам, содержащим один или более специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению продолжительности циркуляции по сравнению с липосомами, в которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами стерически стабилизированных липосом являются те, в которых часть образующей пузырьки липидной части липосомы содержит один или более гликолипидов или дериватизирована одним или более гидрофильными полимерами, такими как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Составы и композиции по данному раскрытию могут также включать поверхностно-активные вещества. Использование поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях хорошо известно в данной области техники. Поверхностно активные вещества и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860.

В одном варианте осуществления включены различные усилители проникновения для эффективной доставки нуклеиновых кислот. В дополнение к содействию диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны усилители проникновения также увеличивают проницаемость липофильных лекарственных средств. Усилители проникновения могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий, то есть поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, желчные соли, хелатообразующие агенты и нехелатообразующие несурфактанты. Усилители проникновения и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связующие вещества могут быть желательны. Подходящие пероральные препараты включают препараты, в которых указанную антисмысловую нуклеиновую кислоту вводят в сочетании с одним или более усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли и жирные кислоты и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860. Также подходящими являются комбинации усилителей проникновения, например, жирных кислот/солей в сочетании с желчными кислотами/солями. Примером подходящей комбинации является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA (урсодезоксихолиевая кислота). Другие усилители проникновения включают, но не ограничиваются ими, полноксиэтилен-9-лауриловый эфир и полноксиэтилен-20-цетиловый эфир. Подходящие усилители проникновения также включают пропиленгликоль, диметилсульфоксид, триэтаноамин, Ν,Ν-диметилацетамид, КН-диметилформамид. 2-пирролидон и его производные, тетрагидрофурфуриловый спирт и AZONE™.

Способы модуляции активности Т-клеток.

Данное изобретение обеспечивает способ селективной модуляции активности эпитопспецифической Т-клетки, включающий приведение в контакт Т-клетки с ТММР по данному изобретению, причем контакт Т-клетки с ТММР по данному изобретению селективно модулирует активность эпитоп-специфической Т-клетки. В некоторых случаях приведение в контакт происходит in vitro. В неко

- 91 049816 торых случаях приведение в контакт происходит in vivo. В некоторых случаях приведение в контакт происходит ex vivo.

В некоторых случаях, например, когда Т-клетка мишень представляет собой Т-клетку CD8+, ТММР содержит полипептиды ГКГС I класса (например, в2-микроглобулин и тяжелую цепь ГКГС I класса).

Когда ТММР по данному изобретению содержит иммуномодулирующий полипептид, который является активирующим полипептидом, контакт Т-клетки с ТММР активирует эпитоп-специфическую Тклетку. В некоторых случаях эпитоп-специфическая Т-клетка представляет собой Т-клетку, которая специфична для эпитопа, присутствующего на раковой клетке, и контакт эпитоп-специфической Т-клетки с ТММР увеличивает цитотоксическую активность Т-клетки по отношению к раковой клетке. В некоторых случаях эпитоп-специфическая Т-клетка представляет собой Т-клетку, которая специфична для эпитопа, присутствующего на раковой клетке, и контакт эпитоп-специфической Т-клетки с ТММР увеличивает количество эпитоп-специфических Т-клеток

В некоторых случаях эпитоп-специфическая Т-клетка представляет собой Т-клетку, которая специфична для эпитопа, присутствующего на клетке, зараженной вирусом, и контакт эпитоп-специфической Т-клетки с ТММР увеличивает цитотоксическую активность Т-клетки по отношению к клетке, зараженной вирусом. В некоторых случаях эпитоп-специфическая Т-клетка представляет собой Т-клетку, которая специфична для эпитопа, присутствующего на клетке, зараженной вирусом, и контакт эпитопспецифической Т-клетки с ТММР увеличивает количество эпитоп-специфических Т-клеток.

Когда ТММР по данному изобретению содержит иммуномодулирующий полипептид, который является ингибирующим полипептидом, контакт Т-клетки с ТММР ингибирует эпитоп-специфическую Тклетку. В некоторых случаях эпитоп-специфическая Т-клетка представляет собой аутореактивную Тклетку, которая специфична для эпитопа, присутствующего в аутоантигене, и приведение в контакт уменьшает количество аутореактивных Т-клеток.

В данном изобретении предложен способ модулирования иммунного ответа у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению. Введение ТММР индуцирует эпитоп-специфический Т-клеточный ответ (например, эпитопспецифический Т-клеточный ответ WT-1) и эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ, при котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 2:1. В некоторых случаях соотношение эпитоп-специфического Тклеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 5:1. В некоторых случаях соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитопнеспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 10:1. В некоторых случаях соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 25:1. В некоторых случаях соотношение эпитоп-специфического Тклеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 50:1. В некоторых случаях соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитопнеспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 100:1. В некоторых случаях индивид представляет собой человека. В некоторых случаях модулирование увеличивает цитотоксической Тклеточный ответ на раковую клетку, например, WT-1-экспрессирующую раковую клетку. В некоторых случаях введение является внутривенным, подкожным, внутримышечным, системным, внутрилимфатическим, дистальным по отношению к месту лечения, местным или в месте лечения или рядом с ним.

В данном изобретении предложен способ доставки костимулирующего (т.е. иммуномодулирующего) полипептида, селективного к Т-клеткам-мишеням, включающий приведение в контакт смешанной популяции Т-клеток с ТММР по данному изобретению, причем смешанная популяция Т-клеток содержит Т-клетки-мишени и Т-клетки, не являющиеся мишенями, причем Т-клетка-мишень является специфической для эпитопа, присутствующего в ТММР (например, когда Т-клетка-мишень является специфической для эпитопа WT-1, присутствующего в ТММР), и при этом указанный этап приведения в контакт доставляет один или более костимулирующих полипептидов (иммуномодулирующих полипептидов), присутствующих в ТММР, к Т-клетке-мишени. В некоторых случаях популяция Т-клеток представляет собой популяцию in vitro. В некоторых случаях популяция Т-клеток представляет собой популяцию in vivo у индивидуума. В некоторых случаях способ включает введение индивидууму ТММР. В некоторых случаях Т-клетка представляет собой цитотоксическую Т-клетку. В некоторых случаях смешанная популяция Т-клеток представляет собой in vitro популяцию смешанных Т-клеток, полученных от индивидуума, и этап приведения в контакт приводит к активации и/или пролиферации Т-клетки-мишени, в результате чего образуется популяции активированных и/или пролиферированных Т-клеток-мишеней; в некоторых из этих примеров метод дополнительно содержит введение популяции активированных и/или пролиферированных Т-клеток-мишеней индивидууму.

В данном изобретении предложен способ обнаружения в смешанной популяции Т-клеток, полученных от индивидуума, наличия Т-клетки-мишени, которая связывает интересующий эпитоп (например, эпитоп WT-1), способ включает: а) приведение в контакт in vitro смешанной популяции Т-клеток с ТММР по данному изобретению, причем ТММР содержит интересующий эпитоп (например, эпитоп WT1); и b) обнаружение активации и/или пролиферации Т-клеток в ответ на упомянутое приведение в кон

- 92 049816 такт, причем активированные и/или пролиферированные Т-клетки указывают на присутствие Т-клеткимишени.

Способы лечения.

Данное изобретение обеспечивает способ лечения индивидуума, включающий введение индивидууму количества ТММР по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих ТММР, эффективных для лечения индивидуума. Также предоставлен ТММР по данному изобретению для применения в способе лечения организма человека или животного. В некоторых случаях способ лечения по данному изобретению включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, одного или более рекомбинантных экспрессирующих векторов, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях способ лечения по данному изобретению включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, одной или более молекул мРНК, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР по данному изобретению. В некоторых случаях способ лечения по данному изобретению включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, ТММР по данному изобретению. Состояния, которые можно лечить, включают, например, рак и аутоиммунные расстройства, как описано ниже.

Настоящее изобретение относится к способу селективной модуляции активности эпитопспецифической Т-клетки у индивидуума, включающему введение индивидууму эффективного количества мультимерного полипептида по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот (например, векторов экспрессии; мРНК и т.д.), содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР, причем ТММР избирательно модулирует активность эпитоп-специфической Т-клетки у индивидуума. Избирательно модулирующая активность эпитоп-специфической Т-клетки может лечить заболевание или расстройство у индивидуума. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ лечения, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению.

В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид (MOD) является активирующим полипептидом, а ТММР активирует эпитоп-специфическую Т-клетку. В некоторых случаях эпитоп представляет собой эпитоп, ассоциированный с раком, и ТММР увеличивает активность Т-клетки, специфической для эпитопа, ассоциированного с раком. В некоторых случаях MOD является активирующим полипептидом, а ТММР активирует специфическую по эпитопу WT-1 Т-клетку. В некоторых случаях Тклетки представляет собой Т-хелперные клетки (клетки CD4+), цитотоксические Т-клетки (клетки CD8+) или NK-T-клетки. В некоторых случаях эпитоп представляет собой эпитоп WT-1, и ТММР увеличивает

- 93 049816 активность Т-клеток специфических для раковой клетки, экспрессирующей эпитоп WT-1 (например, Тхелперные клетки (клетки CD4'), цитотоксические Т-клетки (клетки CD8') и/или NK-T-клетки). Активация Т-клеток CD4+ может включать увеличение пролиферации Т-клеток CD4+ и/или включение или усиление высвобождения цитотоксинов Т-клетками CD4 + Активация NK-T-клеток и/или клеток CD8+ может включать: увеличение пролиферации NK-T-клеток и/или клеток CD8+; и/или включение высвобождения таких цитокинов, как интерферон у NK-T-клетками и/или клетками CD8+. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению снижает пролиферацию и/или активность регуляторных Т-клеток (Treg). Treg представляют собой Т-клетки FoxP3⁺, CD4⁺. В некоторых случаях, например, когда ТММР по данному изобретению содержит ингибирующий иммуномодулирующий полипептид (например, PDL1, FasL и т.п.), ТММР снижает пролиферацию и/или активность Treg.

В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид является активирующим полипептидом, а ТММР активирует эпитоп-специфическую Т-клетку. В некоторых случаях эпитоп представляет собой эпитоп, ассоциированный с раком, и ТММР увеличивает активность Т-клетки, специфической для эпитопа, ассоциированного с раком.

Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить индивидууму с WT-1-экспрессирующим раком. K WT1-экспрессирующим раковым заболеваниям относятся: лейкемия, десмопластическая мелкокруглоклеточная опухоль, рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, герминогенная опухоль, рак яичников, рак матки, рак щитовидной железы, рак печени, рак почек, саркома Капоши, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, опухоль Вильмса, острый миелогенный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), немелкоклеточный рак легких (NSCLC), миелома, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, мезотелиома, саркома мягких тканей, нейробластома и нефробластома.

Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума острого миелоидного лейкоза (AML). Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума миеломы. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума рака яичников. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума рака поджелудочной железы. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума немелкоклеточного рака легких (NSCLC). Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума колоректального рака (CRC). Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума рака молочной железы. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума опухоли Вильмса. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума мезотелиомы. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума саркомы мягких тканей. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума нейробластомы. Когда ТММР по данному изобретению содержит пептидный эпитоп WT-1, ТММР могут вводить нуждающемуся в этом индивидууму для лечения у индивидуума нефробластомы.

Данное изобретение обеспечивает способ лечения рака у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот (например, векторов экспрессии; мРНК и т.д.), содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР, причем ТММР содержит Т-клеточный эпитоп, который является злокачественным эпитопом, и при этом ТММР содержит стимулирующий иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество раковых клеток у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество раковых клеток у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с количеством раковых клеток у индивидуума перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество раковых клеток у индивидуума до неопределяемых уровней.

В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет со

- 94 049816 бой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает массу опухоли у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму (индивидууму, имеющему опухоль) уменьшает массу опухоли у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с массой опухоли у индивидуума перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму (индивидууму, имеющему опухоль) уменьшает объем опухоли у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму (индивидууму, имеющему опухоль) уменьшает объем опухоли у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с объемом опухоли у индивидуума перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму увеличивает время выживания у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму увеличивает время выживания индивидуума на по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, от 3 месяцев до 6 месяцев, от 6 месяцев до 1 года, от 1 года до 2 лет, от 2 лет до 5 лет, от 5 лет до 10 лет или более 10 лет, по сравнению с ожидаемым временем выживания индивидуума при отсутствии введения мультимерного полипептида.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ лечения вирусной инфекции у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР, причем ТММР содержит Т-клеточный эпитоп, который является вирусным эпитопом, и при этом ТММР содержит стимулирующий иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях эффективное количество ТММР представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество пораженных вирусом клеток у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество пораженных вирусом клеток у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с количеством пораженных вирусом клеток у индивидуума перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество пораженных вирусом клеток у индивидуума до неопределяемых уровней.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ лечения инфекции у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР, причем ТММР содержит Т-клеточный эпитоп, который является патоген-ассоциированным эпитопом, и при этом ТММР содержит стимулирующий иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество патогенов у индивидуума. Например, в некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество патогенов у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с количеством патогенов у индивидуума

- 95 049816 перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество патогенов у индивидуума до невыявляемых уровней. Патогены включают вирусы, бактерии, простейшие и тому подобное.

В некоторых случаях иммуномодулирующий полипептид является ингибирующим полипептидом, а ТММР ингибирует активность эпитоп-специфической Т-клетки. В некоторых случаях эпитоп является аутоэпитопом, а ТММР избирательно ингибирует активность Т-клеток, специфических для этого эпитопа.

Данное изобретение обеспечивает способ лечения аутоиммунного нарушения у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму эффективного количества ТММР по данному изобретению или одной или более нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР, причем ТММР содержит Т-клеточный эпитоп, который является аутоэпитопом, и при этом ТММР содержит ингибирующий иммуномодулирующий полипептид. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает количество аутореактивных Тклеток у индивидуума на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% по сравнению с количеством аутореактивных Т-клеток у индивидуума перед введением ТММР или при отсутствии введения ТММР. В некоторых случаях эффективное количество ТММР представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму уменьшает продуцирование цитокинов Th2 у индивидуума. В некоторых случаях эффективное количество ТММР по данному изобретению представляет собой количество, которое при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму облегчает один или более симптомов, связанных с аутоиммунным заболеванием у индивидуума.

Как отмечено выше, в некоторых случаях при осуществлении способа лечения субъекта ТММР по данному изобретению вводят нуждающемуся в этом индивидууму в качестве ТММР per se. В других случаях при осуществлении способа лечения субъекта одну или более нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие ТММР по данному изобретению, вводят индивидууму, нуждающемуся в этом. Таким образом, в других случаях одну или более нуклеиновых кислот по данному изобретению, например, один или несколько рекомбинантных векторов экспрессии по данному изобретению, вводят индивидууму, нуждающемуся в этом.

Составы.

Подходящие составы описаны выше, причем подходящие составы включают фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых случаях подходящая композиция содержит: а) ТММР по данному изобретению; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых случаях подходящая композиция содержит: а) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую ТММР по данному изобретению; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент; в некоторых случаях нуклеиновая кислота представляет собой мРНК. В некоторых случаях подходящая композиция содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению; b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид ТММР по данному изобретению; и с) фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых случаях подходящая композиция содержит: а) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мультимерный полипептид по данному изобретению; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент; в некоторых случаях нуклеиновая кислота представляет собой мРНК. В некоторых случаях подходящая композиция содержит: а) первый рекомбинантный векторы экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид ТММР по данному изобретению;

b) второй рекомбинантный векторы экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид ТММР по данному изобретению; и

c) фармацевтически приемлемый эксципиент.

Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты описаны выше.

Дозы.

Подходящая доза может быть определена лечащим врачом или другим квалифицированным медицинским персоналом, основываясь на различных клинических факторах. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретный полипептид или нуклеиновую кислоту, которые следует вводить, пол пациента, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. ТММР по данному изобретению может вводиться в количествах от 1 нг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела на дозу, например, от 0,1 мг/кг массы тела до 10 мг/кг массы тела, например, от 0,5 мг/кг массы тела до 5 мг кг массы тела; однако предусмотрены дозы ниже или выше этого примерного диапазона, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. Если режим представляет собой непре- 96 049816 рывную инфузию, она также может составлять от 1 мкг до 10 мг на килограмм массы тела в минуту. ТММР по настоящему изобретению можно вводить в количестве от около 1 мг/кг массы тела до 50 мг/кг массы тела, например, от около 1 мг/кг массы тела до около 5 мг/кг массы тела, от около 5 мг/кг массы тела до около 10 мг/кг массы тела, от около 10 мг/кг массы тела до около 15 мг/кг массы тела, от около 15 мг/кг массы тела до около 20 мг/кг массы тела, от около 20 мг/кг массы тела до около 25 мг/кг массы тела, от около 25 мг/кг массы тела до около 30 мг/кг массы тела, от около 30 мг/кг массы тела до около 35 мг/кг массы тела, от около 35 мг/кг массы тела до около 40 мг/кг массы тела или от около 40 мг/кг массы тела до около 50 мг/кг массы тела.

В некоторых случаях подходящая доза ТММР по данному изобретению составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, от 0,1 мкг до 10 г на кг массы тела, от 1 мкг до 1 г на кг массы тела, масса от 10 мкг до 100 мг на кг массы тела, от 100 мкг до 10 мг на кг массы тела или от 100 мкг до 1 мг на кг массы тела. Специалисты в данной области техники могут легко оценить частоту повторения для дозирования на основании измеренных времен пребывания и концентраций введенного агента в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть желательно, чтобы пациент проходил поддерживающую терапию для предотвращения рецидива болезненного состояния, при котором ТММР по данному изобретению вводят в поддерживающих дозах, начиная от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, от 0,1 мкг до 10 г на кг массы тела, от 1 мкг до 1 г на кг массы тела, масса от 10 мкг до 100 мг на кг массы тела, от 100 мкг до 10 мг на кг массы тела или от 100 мкг до 1 мг на кг массы тела.

Специалистам в данной области техники легко понять, что уровни доз могут варьировать в зависимости от конкретного ТММР, степени выраженности симптомов и подверженности субъекта побочным эффектам. Предпочтительные дозы для данного соединения легко могут быть определены специалистами в данной области техники с помощью различных средств.

В некоторых случаях вводят множественные дозы ТММР по данному изобретению, нуклеиновой кислоты по данному изобретению или рекомбинантного вектора экспрессии по данному изобретению. Частота введения ТММР по данному изобретению, нуклеиновой кислоты по данному изобретению или рекомбинантного вектора экспрессии по данному изобретению может варьировать в зависимости от любого из множества факторов, например, серьезности симптомов и т.д. Например, в некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновая кислота по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц, каждую вторую неделю (qow), один раз в неделю (qw), два раза в неделю (biw), три раза в неделю (tiw), четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, каждые двое суток (qod), ежесуточно (qd), два раза в сутки (qid) или три раза в сутки (tid).

Продолжительность введения ТММР по данному изобретению, нуклеиновой кислоты по данному изобретению или рекомбинантного вектора экспрессии по данному изобретению, например, период времени, в течение которого ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению, или вводимый рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению может варьировать в зависимости от любого из множества факторов, например реакции пациента и т.д. Например, ТММР по данному изобретению, нуклеиновая кислота по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению можно вводить в течение периода времени, составляющего от около одних суток до около одной недели, от около двух недель до четырех недель, от одного месяца до двух месяцев, от двух месяцев до четырех месяцев, от четырех месяцев до шести месяцев, от шести месяцев до восьми месяцев, от восьми месяцев до 1 года, от около 1 года до около 2 лет или от около 2 лет до около 4 лет или более.

Пути введения.

Активный агент (ТММР по данному изобретению, нуклеиновая кислота по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению) вводят индивидууму с использованием любого доступного способа и пути, подходящего для доставки лекарственного средства, включая методы in vivo и ex vivo, а также системные и локализованные пути введения.

Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают внутриопухолевое, перитуморальное, внутримышечное, внутрилимфатическое, внутритрахеальное, внутричерепное, подкожное, внутрикожное, местное применение, внутривенное, внутриартериальное, ректальное, назальное, оральное и другие энтеральные и парентеральные пути введения. Пути введения могут быть объединены, если желательно, или скорректированы в зависимости от ТММР и/или желаемого эффекта. ТММР по данному изобретению или нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению можно вводить в однократной или многократных дозах.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят внутривенно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят внутримышечно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят интралимфатически. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экс

- 97 049816 прессии по данному изобретению вводят местно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят через опухоль. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят внутрь опухоли. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят внутрь черепа. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению, нуклеиновую кислоту по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению вводят подкожно.

В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят внутривенно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят внутримышечно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению применяют местно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят через опухоль. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят внутрь опухоли. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению применяют внутрь черепа. В некоторых случаях ТММР вводят подкожно. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят интралимфатически.

ТММР по данному изобретению, нуклеиновая кислота по данному изобретению или рекомбинантный вектор экспрессии по данному изобретению могут быть введены хозяину с использованием любых доступных общепринятых способов и путей, подходящих для доставки обычных лекарственных средств, включая системные или местные пути. В общем, способы введения, предполагаемые для применения в способе по данному изобретению, включают, но не ограничиваются ими, энтеральный, парентеральный и ингаляционный пути.

Парентеральные пути введения, отличные от ингаляционного введения, включают, но не ограничиваются ими, местный, трансдермальный, подкожный, внутримышечный, внутриорбитальный, внутрикапсулярный, внутриспинальный, внутристенный, внутриопухолевый, внутрилимфатический, перитуморальный и внутривенный пути, т.е. любой путь введения, кроме как через пищеварительный канал. Парентеральное введение может быть осуществлено для осуществления системной или местной доставки ТММР по данному изобретению, нуклеиновой кислоты по данному изобретению или рекомбинантного вектора экспрессии по данному изобретению. Там, где желательна системная доставка, введение обычно включает инвазивное или системно абсорбированное местное или слизистое введение фармацевтических препаратов.

Комбинированная терапия.

В некоторых случаях способ по данному изобретению лечения рака у индивидуума включает: а) введение ТММР по данному изобретению; и b) введение по меньшей мере одного терапевтического агента или оказание терапевтического воздействия. Подходящие дополнительные терапевтические средства включают в себя, но не ограничиваются ими, низкомолекулярный химиотерапевтический противораковый агент и ингибитор иммунной контрольной точки. Подходящими дополнительными терапевтическими воздействиями являются, например, радиация, хирургия (например, хирургическая резекция опухоли) и т.п.

Способ лечения по данному изобретению может включать совместное введение ТММР по данному изобретению и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент. Под совместным введением подразумевается, что как ТММР по данному изобретению, так и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят индивидууму, хотя и не обязательно в одно и то же время, для достижения терапевтического эффекта, который является результатом введения как ТММР, так и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. Введение ТММР и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента может быть по существу одновременным, например ТММР могут вводить индивидууму в течение от около 1 мин до около 24 ч (например, в течение около 1 мин, в течение около 5 мин, в течение около 15 мин, в течение около 30 мин, в течение около 1 ч, в течение около 4 ч, в течение около 8 ч, в течение около 12 ч или в течение около 24 ч) с момента введения по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят индивидууму, проходящему лечение или прошедшему лечение по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. Введение ТММР может происходить в разное время и/или с различной частотой.

В качестве примера, способ лечения по данному изобретению может включать совместное введение ТММР по данному изобретению и ингибитора иммунной контрольной точки, такого как антитело, специфическое для иммунной контрольной точки. Под совместным введением подразумевается, что как ТММР по данному изобретению, так и ингибитор иммунной контрольной точки (например, антитело, специфическое для полипептида иммунной контрольной точки) вводят индивидууму, хотя и не обязательно одновременно, с целью достижения терапевтического эффекта, который является результатом введения как ТММР, так и ингибитора иммунной контрольной точки (например, антитела, специфического для полипептида иммунной контрольной точки). Введение ТММР и ингибитора иммунной контрольной точки (например, антитела, специфического для полипептида иммунной контрольные точки) может быть по существу одновременным, например ТММР могут вводить индивидууму в течение от около 1 мин до около 24 ч (например, в течение около 1 мин, в течение около 5 мин, в течение около 15

- 98 049816 мин, в течение около 30 мин, в течение около 1 ч, в течение около 4 ч, в течение около 8 ч, в течение около 12 ч или в течение около 24 ч) с момента введения ингибитора иммунной контрольной точки (например, антитела, специфического для полипептида иммунной контрольной точки). В некоторых случаях ТММР по данному изобретению вводят индивидууму, проходящему лечение или прошедшему лечение ингибитором иммунной контрольной точки (например, антителом, специфическим для полипептида иммунной контрольной точки). Введение ТММР и ингибитора иммунной контрольной точки (например, антитела, специфического для полипептида иммунной контрольной точки) может происходить в разное время и/или с различной частотой.

Типичные ингибиторы иммунных контрольных точек включают ингибиторы, которые нацелены на полипептид иммунной контрольной точки, такие как CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, ОХ40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K дельта, PI3K гамма, ТАМ, аргиназа, CD137 (также известная как 4-1ВВ), ICOS, A2AR, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2. В некоторых случаях полипептид иммунной контрольной точки представляет собой стимулирующую молекулу контрольной точки, выбранную из CD27, CD28, CD40, ICOS, OX40, GITR, CD122 и CD137. В некоторых случаях полипептид иммунной контрольной точки представляет собой молекулу, ингибирующую контрольную точку, выбранную из A2AR, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM3, CD96, TIGIT и VISTA.

В некоторых случаях ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело, специфическое к полипептиду иммунной контрольной точки. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке представляет собой моноклональное антитело. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке является гуманизированным или деиммунизированным, так что антитело по существу не вызывает иммунного ответа у человека. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке представляет собой деиммунизированное моноклональное антитело. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке является полностью человеческим моноклональным антителом. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке ингибирует связывание полипептида иммунной контрольной точки с лигандом полипептида иммунной контрольной точки. В некоторых случаях антитело к иммунной контрольной точке ингибирует связывание полипептида иммунной контрольной точки с рецептором полипептида иммунной контрольной точки.

Подходящие антитела к иммунной контрольной точке включают, но не ограничиваются ими, ниволумаб (Bristol-Myers Squibb), пембролизумаб (Merck), пидилизумаб (Curetech), AMP-224 (GlaxoSmithKline/Amplimmune), MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Medarex, Inc./Bristol Myer Squibb), MEDI-4736 (Medimmune/AstraZeneca), арелумаб (Merck Serono), ипилимумаб (YERVOY, Bristol-Myers Squibb), тремелимумаб (Pfizer), пидилизумаб (CureTech, Ltd.), IMP321 (Immutep SA), MGA271 (Macrogenics), BMS986016 (Bristol-Meyers Squibb), лирилумаб (Bristol-Myers Squibb), урелумаб (Bristol-Meyers Squibb), PF05082566 (Pfizer), IPH2101 (Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb), MEDI-6469 (Medlmmune/AZ), CP-870, 893 (Genentech), могамулизумаб (Kyowa Hakko Kirin), варлилумаб (CellDex Therapeutics), авелумаб (EMD Serono), галиксимаб (Biogen Idec), AMP-514 (Amplimmune/AZ), AUNP 12 (Aurigene and Pierre Fabre), индоксимод (NewLink Genetics), NLG-919 (NewLink Genetics), INCB024360 (Incyte), KN035 и их комбинации. Например, в некоторых случаях ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело к PD-1. Подходящие антитела к PD-1 включают, например, ниволумаб, пембролизумаб (также известный как МК-3475), пидилизумаб, SHR-1210, PDR001 и АМР-224. В некоторых случаях моноклональное антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб, пембролизумаб или PDR001. Подходящие антитела к PD1 описаны в патентной публикации США № 2017/0044259. В отношении пидилизумаба см., например, Rosenblatt et al. (2011) J. Immunother. 34:409-18. В некоторых случаях ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой моноклональное антитело к CTLA-4. В некоторых случаях антитело к CTLA-4 представляет собой ипилимумаб или тремелимумаб. В отношении тремелимумаба см., например, Ribas et al. (2013) J. Clin. Oncol. 31:616-22. В некоторых случаях ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой моноклональное антитело к PD-L1. В некоторых случаях моноклональное антитело к PD-L1 представляет собой BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A (также известное как RG7446), KN035 или MSB0010718C. В некоторых случаях моноклональное антитело к PD-L1 представляет собой MPDL3280A (атезолизумаб) или MEDI4736 (дурвалумаб). В отношении дурвалумаба см., например, WO 2011/066389. В отношении атезолизумаба, см., например, патент США № 8 217 149.

Подходящие для лечения субъекты.

Субъекты, подходящие для лечения способом по данному изобретению, включают индивидуумов, у которых присутствует рак, включая индивидуумов, у которых был диагностирован рак, индивидуумов, которых лечили от рака, но которые не смогли ответить на лечение, и индивидуумов, которых лечили от рака и который первоначально ответил, но впоследствии стал невосприимчивым к лечению. Субъекты, подходящие для лечения способом по настоящему изобретению, включают индивидуумов, у которых есть инфекция (например, инфекция патогеном, таким как бактерия, вирус, простейший и т.д.), включая индивидуумов, у которых была диагностирована инфекция и индивидуумов, которые прошли лечение от инфекции, но не смогли ответить на лечение. Субъекты, подходящие для лечения способом по данному

- 99 049816 изобретению, включают индивидуумов, у которых есть бактериальная инфекция, включая индивидуумов, у которых была диагностирована бактериальная инфекция, и индивидуумов, которых лечили от бактериальной инфекции, но которые не смогли ответить на лечение. Субъекты, подходящие для лечения способом по данному изобретению, включают индивидуумов, у которых есть вирусная инфекция, включая индивидуумов, у которых была диагностирована вирусная инфекция, и индивидуумов, которых лечили от вирусной инфекции, но которые не смогли ответить на лечение. Субъекты, подходящие для лечения способом по данному изобретению, включают индивидуумов, у которых есть аутоиммунное заболевание, включая индивидуумов, у которых диагностировали аутоиммунное заболевание, и индивидуумов, которых лечили от аутоиммунного заболевания, но которые не смогли ответить на лечение.

Примеры неограничивающих аспектов изобретения.

Аспекты набора А.

Аспекты, включая варианты осуществления, данного изобретения, описанного выше, могут быть полезны отдельно или в комбинации с одним или более другими аспектами или вариантами осуществления. Не ограничивая вышеприведенное описание, некоторые неограничивающие аспекты изобретения, пронумерованные 1-95, представлены ниже. Как будет понятно специалистам в данной области техники после прочтения данного описания, каждый из отдельно пронумерованных аспектов может использоваться или комбинироваться с любым из предшествующих или следующих отдельно пронумерованных аспектов. Это предназначено для обеспечения поддержки всех таких комбинаций аспектов и не ограничивается комбинациями аспектов, явно предоставленными ниже:

Аспект 1. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид, содержащий по меньшей мере один гетеродимерный полипептид, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп опухоли-1 Вильмса (WT-1); и ii) первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (ГКГС); b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС; и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит иммуномодулирующий полипептид.

Аспект 2. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 1, в котором по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих доменов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида, и при этом эпитоп связывается с Т-клеточным рецептором (TCR) на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М так, что: i) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Тклеткой с аффинностью, которая на по меньшей мере 25% выше, чем аффинность с которой модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывает вторую Т-клетку, при этом первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М; и/или ii) соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным коиммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1.

Аспект 3. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 2, в котором а) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая составляет на по меньшей мере 50%, в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 5 раз или по меньшей мере 10 раз больше аффинности, с которой он связывает вторую Т-клетку; и/или b) вариант иммуномодулирующего полипептида связывает ко-иммуномодулирующий полипептид с аффинностью от около 10^-4 М до около 10^-7 М, от около 10^-4 М до около 10^-6 М, от около 10^-4 М до около 10^-5 М; и/или с) причем соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид, с когнатным коиммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют бислойной интерферометрией, составляет по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 10²:1 или по меньшей мере 10³:1.

Аспект 4. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-3, в котором первый или второй полипептид содержит полипептид Fc иммуноглобулина (Ig).

Аспект 5. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 4, в котором полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1.

Аспект 6. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 5, в котором Fc IgG1 содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из N297A, L234A, L235A, L234F, L235E и

- 100 049816

P331S.

Аспект 7. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-6, в котором: a1) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b2) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc иммуноглобулина (Ig); или а2) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к Сконцу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b2) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; ii) второй полипептид ГКГС; и iii) полипептид Fc Ig; или а3) первый полипептид содержит в направлении от Nконца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b3) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc Ig; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а4) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b4) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) второй полипептид ГКГС; и ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а5) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b5) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и ii) второй полипептид ГКГС; или а6) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу: i) пептидный эпитоп WT-1; ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b6) второй полипептид содержит: i) второй полипептид ГКГС.

Аспект 8. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-7, в котором первый полипептид содержит пептидный линкер между эпитопом WT-1 и первым полипептидом ГКГС и/или в котором второй полипептид содержит пептидный линкер между иммуномодулирующим полипептидом и вторым полипептидом ГКГС.

Аспект 9. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 8, в котором пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 284), где n является целым числом от 1 до 10.

Аспект 10. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-9, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2-микроглобулина; и в котором второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса.

Аспект 11. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-10, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид выбран из группы, состоящей из цитокина (например, полипептида IL2, полипептида IL7, полипептида IL12, полипептида IL15, полипептида IL17, полипептида IL21, полипептида IL27, полипептида IL-23, полипептида TGFe и т.п.; и включая все члены семейства, например, IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-17E), полипептида 41BBL, полипептида ICOS-L, полипептида OX-40L, полипептида CD80, полипептида CD86, (CD80 и CD86 также известные как В7-1 и В7-2 соответственно), полипептида CD40, полипептида CD70, полипептида JAG1 (CD339), полипептида ICAM (CD540), полипептида PD-L1, полипептида FasL, полипептида PD-L2, полипептида PD-1H (VISTA), полипептида ICOS-L (CD275), полипептида GITRL, полипептида HVEM, полипептида CXCL10, полипептида CXCL9, полипептида CXCL11, полипептида CXCL13 и полипептида CX3CL1, полипептида галектин-9, полипептида CD83, полипептида CD30L, полипептида HLA-G, полипептида MICA, полипептида MICB, полипептида HVEM (CD270), полипептида рецептора лимфотоксина бета, полипептида 3/TR6, полипептида ILT3, полипептида ILT4, полипептида CXCL10, полипептида CXCL9, полипептида CXCL11, полипептида CXCL13 и полипептида CX3CL1, и их комбинаций.

Аспект 12. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-11, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид IL-2.

Аспект 13. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-12, причем мультимерный полипептид содержит по меньшей мере два иммуномодулирующих полипептида, и при этом по меньшей мере два из иммуномодулирующих полипептидов одинаковы.

Аспект 14. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 13, в котором 2 или более иммуномодулирующих полипептидов находятся в тандеме.

Аспект 15. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-14, в котором первый полипептид и второй полипептид ковалентно связаны друг с другом.

Аспект 16. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 15, в котором ковалентная связь осуществляется через дисульфидную связь.

Аспект 17. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-16, в котором первый полипептид ГКГС или линкер между эпитопом и первым полипептидом ГКГС содержит аминокислотную замену для обеспечения первого остатка Cys, в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную замену для обеспечения второго остатка Cys, и в котором дисульфидная связь

- 101 049816 находится между первым и вторым остатками Cys.

Аспект 18. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-17, в котором пептидный эпитоп WT-1 имеет длину от около 4 до около 25 аминокислот.

Аспект 19. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-18, в котором пептидный эпитоп WT-1 содержит аминокислотную последовательность из группы, состоящей из:

NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO:223), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:224), CMTWNYMNLGATLKG (SEQ ID NO:225), WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:226), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO:227), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:228), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:229), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:230), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:231), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:232), MNLGATLK (SEQ ID NO:233), MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO:234), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:235), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:236), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:237), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:238), GYLRNPTAC (SEQ ID NO:239), GALRNPTAL (SEQ ID NO:240), YALRNPTAC (SEQ ID NO:241), GLLRNPTAC (SEQ ID NO:242), RYRPHPGAL (SEQ ID NO:243), YQRPHPGAL (SEQ ID NO:244), RLRPHPGAL (SEQ ID NO:245), RIRPHPGAL (SEQ ID NO:246), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO:247), HSFKHEDPY (SEQ ID NO:248), QFPNHSFKHEDPM (SEQ ID NO:249), QFPNHSFKHEDPY (SEQ ID NO:250), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:251), KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO:252), FMCAYPGCY (SEQ ID NO:253), FMCAYPGCK (SEQ ID NO:254), KRPFMCAYPGCNKRY (SEQ ID NO:255), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:256), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO:257), NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260), CMTWNQMN (SEQ ID NO:261), CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269), NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:265), CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) и NQMNLGATL (SEQ ID NO:267).

Аспект 20. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-18, в котором пептид WT-1 содержит аминокислотную последовательность CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) или CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269).

Аспект 21. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый или второй полипептид ГКГС содержит: а) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

HLAА*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2301, HLA-A*2402, HLAA*2407, HLA-A*3303 или HLA-A*3401, изображенной на фиг. 9А; или b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

HLAВ*0702, HLA-B*0801, HLA-B*1502, HLA-B*3802, HLA-B*4001, HLA-B*4601 или HLAB*5301, изображенной на фиг. 10А; или с) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с

HLA-C*0102, HLA-C*0303, HLA-C*0304, HLA-C*0401, HLA-C*0602, HLA-C*0701, HLAC*0702, HLA-C*0801 или HLA-C* 1502, изображенной на фиг. 11А.

Аспект 22. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*2402.

Аспект 23. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид HLA-A*1101.

- 102 049816

Аспект 24. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*3303.

Аспект 25. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HL А-А*0201.

Аспект 26. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 21-25, в котором второй полипептид тяжелой цепи ГКГС содержит Cys в положении 236.

Аспект 27. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 21-26, в котором полипептид в2М содержит Cys в положении 12.

Аспект 28. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-27, в котором иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий: i) замену Н16А и замену F42A; или ii) замену Н16Т и замену F42A.

Аспект 29. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 4-28, причем мультимерный полипептид содержит первый и второй гетеродимеры, и в котором первый и второй гетеродимеры ковалентно связаны одной или более дисульфидными связями между полипептидами Fc Ig первого и второго гетеродимеров.

Аспект 30. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую последовательность, кодирующую первый или второй полипептид по любому из аспектов 1-28, причем первый или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий домен.

Аспект 31. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по аспекту 30.

Аспект 32. Способ селективного модулирования активности Т-клетки, специфической для эпитопа опухоли-1 Вильмса (WT-1), включающий приведение в контакт Т-клетки с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 1-29, причем указанное приведение в контакт селективно модулирует активность специфической по эпитопу WT-1 Т-клетки.

Аспект 22. Способ лечения пациента с раковым заболеванием, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-29,

Аспект 34. Способ по аспекту 33, в котором раковое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, рак поджелудочной железы, рак желудка, колоректальный рак, гепатобластому или опухоль желтого тела яичников.

Аспект 35. Способ по аспекту 33 или аспекту 34, в котором указанное введение осуществляется внутримышечно.

Аспект 36. Способ по аспекту 33 или аспекту 34, в котором указанное введение осуществляется внутривенно.

Аспект 37. Способ модулирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида (ТММР) по любому из аспектов 1-29, причем указанное введение индуцирует эпитоп-специфический Т-клеточный ответ (например, Т-клеточный ответ, специфический для эпитопа WT-1, присутствующего в ТММР) и эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ, причем соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 2:1.

Аспект 38. Способ по аспекту 37, в котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 5:1.

Аспект 39. Способ по аспекту 37, в котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 10:1.

Аспект 40. Способ по аспекту 37, в котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 25:1.

Аспект 41. Способ по аспекту 37, в котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 50:1.

Аспект 42. Способ по аспекту 37, в котором соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 100:1.

Аспект 43. Способ по любому из аспектов 37-42, в котором индивидуум представляет собой человека.

Аспект 44. Способ по любому из аспектов 37-43, в котором указанное модулирование включает усиление цитотоксического Т-клеточного ответа на раковую клетку (например, WT-1-экспрессирующую раковую клетку).

Аспект 45. Способ по любому из аспектов 37-44, в котором указанное введение является внутривенным, подкожным, внутримышечным, системным, внутрилимфатическим, дистальным по отношению к месту лечения, местным или в месте лечения или рядом с ним.

- 103 049816

Аспект 46. Способ по любому из аспектов 37-45, в котором эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ меньше, чем эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ, который индуцируется контрольным модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом, содержащим соответствующий иммуномодулирующий полипептид дикого типа.

Аспект 47. Способ доставки костимулирующего (т.е. иммуномодулирующего) полипептида, селективного к Т-клеткам-мишеням, включающий приведение в контакт смешанной популяции Т-клеток с мультимерным полипептидом (ТММР) по любому из аспектов 1-29, причем смешанная популяция Тклеток содержит Т-клетки-мишени и Т-клетки, не являющиеся мишенями, причем Т-клетка-мишень является специфической для эпитопа, присутствующего в ТММР (например, Т-клетка-мишень является специфической для эпитопа WT-1, присутствующего в ТММР), и при этом указанное приведение в контакт доставляет один или более костимулирующих полипептидов, присутствующих в ТММР, к Т клеткемишени.

Аспект 48. Способ по аспекту 47, в котором популяция Т-клеток применяется in vitro.

Аспект 49. Способ по аспекту 47, в котором популяция Т-клеток применяется у индивидуума in vivo.

Аспект 50. Способ по аспекту 49, включающий введение мультимерного полипептида индивидууму.

Аспект 51. Способ по любому из аспектов 47-50, в котором Т-клетка-мишень представляет собой цитотоксическую Т-клетку.

Аспект 52. Способ по аспекту 47, в котором смешанная популяция Т-клеток представляет собой популяцию in vitro смешанных Т-клеток, полученных от индивидуума, и при этом указанное приведение в контакт приводит к активации и/или пролиферации Т-клетки-мишени, создавая популяцию активированных и/или пролиферированных Т-клеток-мишеней.

Аспект 53. Способ по аспекту 52, дополнительно включающий введение популяции активированных и/или пролиферированных Т-клеток-мишеней индивидууму.

Аспект 54. Способ обнаружения в смешанной популяции Т-клеток, полученных от индивидуума, наличия Т-клетки-мишени, которая связывает интересующий эпитоп WT-1, включающий: а) приведение в контакт in vitro смешанной популяции Т-клеток с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом (ТММР) по любому из аспектов 1-29, причем ТММР содержит интересующий эпитоп WT-1; и b) обнаружение активации и/или пролиферации Т-клеток в ответ на указанное приведение в контакт, причем активированные и/или пролиферированные Т-клетки указывают на наличие Т-клетки-мишени.

Аспект 55. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид, содержащий: по меньшей мере один гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп опухоли-1 Вильмса (WT-1), причем пептид WT-1 имеет длину от около 4 аминокислот до около 25 аминокислот; и ii) первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I класса; b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС I класса, и с) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит иммуномодулирующий полипептид, и при этом первый и второй полипептиды ковалентно связаны с друг с другом посредством по меньшей мере 2 дисульфидных связей.

Аспект 56. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 55, причем по меньшей мере один из по меньшей мере одного иммуномодулирующего полипептида представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида, и при этом эпитоп связывается с Т-клеточным рецептором (TCR) на Т-клетке с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М так, что: i) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Тклеткой с аффинностью, которая на по меньшей мере 25% выше, чем аффинность с которой модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывает вторую Т-клетку, при этом первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М; и/или ii) соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным коиммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1.

Аспект 57. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 56, в котором а) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая составляет на по меньшей мере 50%, в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 5 раз или по меньшей мере 10 раз больше аффинности, с которой он связывает вторую Т-клетку; и/или b) вариант иммуномо

- 104 049816 дулирующего полипептида связывает ко-иммуномодулирующий полипептид с аффинностью от около 10^-4 М до около 10^-7 М, от около 10^-4 М до около 10^-6 М, от около 10^-4 М до около 10^-5 М; и/или с) причем соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид, с когнатным коиммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют бислойной интерферометрией, составляет по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 10²:1 или по меньшей мере 10³:1.

Аспект 58. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-57, в котором первый или второй полипептид содержит полипептид Fc иммуноглобулина (Ig).

Аспект 59. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 58, в котором полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG1.

Аспект 60. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 58, в котором полипептид Fc Ig представляет собой полипептид Fc IgG4.

Аспект 61. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 59, в котором Fc IgG1 содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из N297A, L234A, L235A, L234F, L235E и P331S.

Аспект 62. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-61, в котором a1) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1;

ii) первый полипептид ГКГС I класса; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b1) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС I класса; и ii) полипептид Fc иммуноглобулина (Ig); или а2) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС I класса; и b2) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид;

ii) второй полипептид ГКГС I класса; и iii) полипептид Fc Ig; или а3) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС I класса; и b3) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС I класса; и ii) полипептид Fc Ig; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а4) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС I класса; и b4) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС I класса; и ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а5) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС I класса; и b5) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и ii) второй полипептид ГКГС I класса; или а6) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1;

ii) первый полипептид ГКГС I класса; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b6) второй полипептид содержит:

i) второй полипептид ГКГС I класса.

Аспект 63. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-62, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2-микроглобулина; и в котором второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса.

Аспект 64. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-63, в

- 105 049816 котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид выбран из группы, состоящей из цитокина (например, полипептида IL2, полипептида IL7, полипептида IL12, полипептида IL15, полипептида IL17, полипептида IL21, полипептида IL27, полипептида IL-23, полипептида TGFe и т.п.; и включая все члены семейства, например, IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-17E), полипептида 41BBL, полипептида ICOS-L, полипептида OX-40L, полипептида CD80, полипептида CD86, (CD80 и CD86 также известные как В7-1 и В7-2 соответственно), полипептида CD40, полипептида CD70, полипептида JAG1 (CD339), полипептида ICAM (CD540), полипептида PD-L1, полипептида FasL, полипептида PD-L2, полипептида PD-1H (VISTA), полипептида ICOS-L (CD275), полипептида GITRL, полипептида HVEM, полипептида CXCL10, полипептида CXCL9, полипептида CXCL11, полипептида CXCL13 и полипептида CX3CL1, полипептида галектин-9, полипептида CD83, полипептида CD30L, полипептида HLA-G, полипептида MICA, полипептида MICB, полипептида HVEM (CD270), полипептида рецептора лимфотоксина бета, полипептида 3/TR6, полипептида ILT3, полипептида ILT4, полипептида CXCL10, полипептида CXCL9, полипептида CXCL11, полипептида CXCL13 и полипептида CX3CL1, и их комбинаций.

Аспект 65. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-63, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид IL2.

Аспект 66. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-65, причем мультимерный полипептид содержит по меньшей мере два иммуномодулирующих полипептида, и при этом по меньшей мере два из иммуномодулирующих полипептидов одинаковы.

Аспект 67. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 66, в котором 2 или более иммуномодулирующих полипептидов находятся в тандеме.

Аспект 68. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-67, в котором: а) первая дисульфидная связь находится между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидным эпитопом WT-1 и первым полипептидом ГКГС I класса, причем первый полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид в2М; и ii) остатком Cys, введенным посредством замены Y84C во второй полипептид ГКГС I класса, при этом второй полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и b) вторая дисульфидная связь находится между: i) остатком Cys, введенным в полипептид в2М посредством замены R12C; и ii) остатком Cys, введенным в полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса посредством замены А236С.

Аспект 69. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 68, в котором линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS (SEQ ID NO: 318).

Аспект 70. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 69, в котором линкер содержит аминокислотную последовательность GCGGS(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 342), где n является целым числом от 1 до 10.

Аспект 71. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-70, в котором пептидный эпитоп WT-1 имеет длину от около 4 до около 15 аминокислот.

Аспект 72. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-71, в котором пептидный эпитоп WT-1 содержит аминокислотную последовательность из группы, состоящей из:

- 106 049816

NLMNLGATL (SEQ ID NO:258),

NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO:223), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:224), CMTWNYMNLGATLKG (SEQ ID NO:225), WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:226), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO:227), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:228), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:229), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:230), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:231), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:232), MNLGATLK (SEQ ID NO:233), MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO:234), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:235), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:236), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:237), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:238), GYLRNPTAC (SEQ ID NO:239), GALRNPTAL (SEQ ID NO:240), YALRNPTAC (SEQ ID NO:241), GLLRNPTAC (SEQ ID NO:242), RYRPHPGAL (SEQ ID NO:243), YQRPHPGAL (SEQ ID NO:244), RLRPHPGAL (SEQ ID NO:245), RIRPHPGAL (SEQ ID NO:246), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO:247), HSFKHEDPY (SEQ ID NO:248), QFPNHSFKHEDPM (SEQ ID NO:249), QFPNHSFKHEDPY (SEQ ID NO:250), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:251), KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO:252), FMCAYPGCY (SEQ ID NO:253), FMCAYPGCK (SEQ ID NO:254), KRPFMCAYPGCNKRY (SEQ ID NO:255), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:256), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO:257), NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260), CMTWNQMN (SEQ ID NO:261), CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269), NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:265), CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) и NQMNLGATL (SEQ ID NO:267).

Аспект 73. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-71, в котором пептид WT-1 содержит аминокислотную последовательность VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259) или RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260).

Аспект 74. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-73, в котором первый или второй полипептид ГКГС I класса содержит: а) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

HLAА*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0201, HLA-A* 1101, HLA-A*2301, HLA-A*2402, HLAA*2407, HLA-A*3303 или HLA-A*3401, изображенной на фиг. 9А; или b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью ^1ПАВ*0702, HLA-B*0801, HLA-B*1502, HLA-B*3802, HLA-B*4001, HLA-B*4601 или HLAB*5301, изображенной на фиг. 10А; или с) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с

Аспект 75. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-74, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*2402.

Аспект 76. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-74, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид HLA-A*1101.

Аспект 77. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-74, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*3303.

Аспект 78. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-74, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид

- 107 049816

ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*O2O 1.

Аспект 79. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-78, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, содержащий: i) замену H16A и замену F42A; или ii) замену Н16Т и замену F42A.

Аспект 80. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-79, в котором мультимерный полипептид содержит первый и второй гетеродимеры.

Аспект 81. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую последовательность, кодирующую первый или второй полипептид по любому из аспектов 55-80, причем первый или второй полипептид содержит по меньшей мере один иммуномодулирующий домен.

Аспект 82. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по аспекту 81.

Аспект 83. Способ селективного модулирования активности Т-клетки, специфической для эпитопа опухоли-1 Вильмса (WT-1), включающий приведение в контакт Т-клетки с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 55-80, причем указанное приведение в контакт селективно модулирует активность специфической по эпитопу WT-1 Т-клетки.

Аспект 84. Способ лечения пациента с раковым заболеванием, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 55-80,

Аспект 85. Способ по аспекту 84, в котором рак экспрессирует белок WT-1.

Аспект 86. Способ по аспекту 84 или аспекту 85, в котором раковое заболевание представляет собой острый миелоидный лейкоз, миелому, рак яичников, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак молочной железы, опухоль Вильмса, мезотелиому, саркому мягких тканей, нейробластому или нефробластому.

Аспект 87. Способ по любому из аспектов 84-86, в котором указанное введение осуществляется внутримышечно.

Аспект 88. Способ по любому из аспектов 84-86, в котором указанное введение осуществляется внутривенно.

Аспект 89. Способ по любому из аспектов 84-88, дополнительно включающий введение индивидууму одного или более ингибиторов контрольных точек.

Аспект 90. Способ по аспекту 89, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, которое связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, ОХ40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K дельта, PI3K гамма, ТАМ, аргиназы, CD137, ICOS, A2AR, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

Аспект 91. Способ по аспекту 90, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, специфическое для PD-1, PD-L1 или CTLA4.

Аспект 92. Способ по аспекту 89, в котором один или более ингибиторов контрольных точек выбраны из группы, состоящей из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, АМР-224, MPDL3280A, MDX-1105, MEDI-4736, арелумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, пидилизумаба, IMP321, MGA271, BMS-986016, лирилумаба, урелумаба, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, СР-870,893, могамулизумаба, варлилумаба, авелумаба, галиксимаба, АМР-514, AUNP 12, индоксимода, NLG-919, INCB024360, KN035, и их комбинаций.

Аспект 93. Способ модулирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества модулирующего Т-клетку мультимерного полипептида по любому из аспектов 55-80, причем указанное введение индуцирует эпитоп-специфический Т-клеточный ответ и эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ, причем соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 2:1.

Аспект 94. Способ доставки иммуномодулирующего полипептида, селективного к Т-клеткимишени, включающий приведение в контакт смешанной популяции Т-клеток с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 55-80, причем смешанная популяция Т-клеток содержит Т-клетки-мишени и Т-клетки, не являющиеся мишенями, причем Т-клетки-мишени являются специфическими для эпитопа WT-1, присутствующего в модулирующем Т-клетки мультимерном полипептиде, и при этом указанное приведение в контакт доставляет один или более иммуномодулирующих полипептидов, присутствующих в модулирующем Т-клетки мультимерном полипептиде, к Т клеткемишени.

Аспект 95. Способ обнаружения в смешанной популяции Т-клеток, полученных от индивидуума, наличия Т-клетки-мишени, которая связывает эпитоп опухоли-1 Вильмса (WT-1), включающий: а) приведение в контакт in vitro смешанной популяции Т-клеток с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 55-80, причем модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид содержит эпитоп WT-1; и b) обнаружение активации и/или пролиферации Т-клеток в ответ на указанное приведение в контакт, причем активированные и/или пролиферированные Т-клетки указывают на наличие Т-клетки-мишени.

- 108 049816

Аспекты набора В.

Аспекты, включая варианты осуществления, данного изобретения, описанного выше, могут быть полезны отдельно или в комбинации с одним или более другими аспектами или вариантами осуществления. Не ограничивая вышеприведенное описание, некоторые неограничивающие аспекты изобретения, пронумерованные 1-36, представлены ниже. Как будет понятно специалистам в данной области техники после прочтения данного описания, каждый из отдельно пронумерованных аспектов может использоваться или комбинироваться с любым из предшествующих или следующих отдельно пронумерованных аспектов. Это предназначено для обеспечения поддержки всех таких комбинаций аспектов и не ограничивается комбинациями аспектов, явно предоставленными ниже:

Аспект 1. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид, содержащий: по меньшей мере один гетеродимер, содержащий: а) первый полипептид, содержащий: i) пептидный эпитоп опухоли-1 Вильмса (WT-1), причем пептид WT-1 имеет длину по меньшей мере 4 аминокислоты; и ii) первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I класса; b) второй полипептид, содержащий второй полипептид ГКГС I класса, и с) по меньшей мере один активирующий иммуномодулирующий полипептид, причем первый и/или второй полипептид содержит иммуномодулирующий полипептид, и при этом пептидный эпитоп WT-1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO:223), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:224), CMTWNYMNLGATLKG (SEQ ID NO:225), WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:226), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO:227), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:228), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:229), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:230), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:231), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO:232), MNLGATLK (SEQ ID NO:233), MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO:234), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO :23 5), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:236), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:237), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:238), GYLRNPTAC (SEQ ID NO:239), GALRNPTAL (SEQ ID NO:240), YALRNPTAC (SEQ ID NO:241), GLLRNPTAC (SEQ ID NO:242), RYRPHPGAL (SEQ ID NO:243), YQRPHPGAL (SEQ ID NO:244), RLRPHPGAL (SEQ ID NO:245), RIRPHPGAL (SEQ ID NO:246), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO:247), HSFKHEDPY (SEQ ID NO:248), QFPNHSFKHEDPM (SEQ ID NO:249), QFPNHSFKHEDPY (SEQ ID NO:250), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:251), KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO:252), FMCAYPGCY (SEQ ID NO:253), FMCAYPGCK (SEQ ID NO:254), KRPFMCAYPGCNKRY (SEQ ID NO:255), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO:256), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO:257), NLMNLGATL (SEQ ID NO:258), VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260), CMTWNQMN (SEQ ID NO:261), CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269), NYMNLGATL (SEQ ID NO:263), YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:265), CMTWNQMNL (SEQ ID NO:266) и NQMNLGATL (SEQ ID NO:267), при этом необязательно первой или второй полипептид содержит полипептид Fc иммуноглобулина (Ig).

Аспект 2. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 1, в котором по меньшей мере один из одного или более иммуномодулирующих доменов представляет собой вариант иммуномодулирующего полипептида, который проявляет пониженную аффинность к когнатному коиммуномодулирующему полипептиду по сравнению с аффинностью соответствующего иммуномодулирующего полипептида дикого типа для когнатного ко-иммуномодулирующего полипептида, и при этом эпитоп связывается с Т-клеточным рецептором (TCR) на Т-клетке с аффинностью по меньшей мере 10^-7М, так что:

i) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая по меньшей мере на 25% выше, чем аффинность, с которой модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывает вторую Т-клетку, причем первая Т-клетка экспрессирует на своей поверхности когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид и TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М, и при этом вторая Т-клетка экспрессирует на своей поверхность когнатный ко-иммуномодулирующий полипептид, но не экспрессирует на своей поверхности TCR, который связывает эпитоп с аффинностью, равной по меньшей мере 10^-7 М; и/или ii) соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным ко

- 109 049816 иммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, находится в диапазоне от 1,5:1 до 10⁶:1.

Аспект 3. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 2, причем:

a) модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид связывается с первой Т-клеткой с аффинностью, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз выше, чем аффинность, с которой он связывает со второй Т-клеткой; и/или

b) вариант иммуномодулирующего полипептида связывается с ко-иммуномодулирующим полипептидом с аффинностью от около 10^-4 М до около 10^-7 М, от около 10^-4 М до около 10^-6 М, от около 10^-4 М до около 10^-5 М; и/или

c) при этом соотношение аффинности связывания контрольного модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, когда контроль содержит иммуномодулирующий полипептид дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом к аффинности связывания модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида, содержащего вариант иммуномодулирующего полипептида дикого типа, с когнатным ко-иммуномодулирующим полипептидом, которое измеряют с помощью биослойной интерферометрии, составляет по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 10²:1 или по меньшей мере 10³:1.

Аспект 4. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-3, в котором a1) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1;

ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b1) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc иммуноглобулина (Ig); или а2) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b2) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

ii) второй полипептид ГКГС; и iii) полипептид Fc Ig; или а3) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b3) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС; и ii) полипептид Fc Ig; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а4) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b4) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) второй полипептид ГКГС; и ii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; или а5) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) первый полипептид ГКГС; и b5) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и ii) второй полипептид ГКГС; или а6) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1;

ii) первый полипептид ГКГС; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид; и b6) второй полипептид содержит: i) второй полипептид ГКГС.

Аспект 5. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-4, в котором:

a) первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2-микроглобулина; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; или

- 110 049816

b) первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и второй полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2-микроглобулина.

Аспект 6. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 5, причем:

a) первый полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1; и ii) полипептид в2-микроглобулина; и

b) второй полипептид содержит в направлении от N-конца к С-концу:

ii) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и iii) полипептид Fc Ig.

Аспект 7. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 5, причем:

i) полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и ii) полипептид Fc Ig; и iii) по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид.

Аспект 8. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-7, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид выбран из группы, состоящей из цитокина, полипептида 4-1BBL, полипептида ICOS-L, полипептида OX-40L, полипептида CD80, полипептида CD86, полипептида CD40, полипептида CD70 и их комбинаций.

Аспект 9. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-8, в котором по меньшей мере один иммуномодулирующий полипептид представляет собой полипептид IL-2.

Аспект 10. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-9, причем мультимерный полипептид содержит по меньшей мере два иммуномодулирующих полипептида, и при этом по меньшей мере два из иммуномодулирующих полипептидов одинаковы, необязательно при этом 2 или более иммуномодулирующих полипептидов находятся в тандеме.

Аспект 11. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-10, в котором иммуномодулирующий полипептид представляет собой вариант полипептида IL-2, который проявляет пониженную аффинность к рецептору IL-2 по сравнению с аффинностью полипептида IL-2 дикого типа для рецептора IL-2.

Аспект 12. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 11, в котором вариант полипептида IL-2 содержит: i) замену H16A и замену F42A; или ii) замену Н16Т и замену F42A.

Аспект 13. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-12, в котором первый полипептид и второй полипептид ковалентно связаны друг с другом, необязательно в котором ковалентная связь осуществляется посредством дисульфидной связи.

Аспект 14. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-13, в котором первый полипептид ГКГС или линкер между эпитопом и первым полипептидом ГКГС содержит аминокислотную замену для обеспечения первого остатка Cys, в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную замену для обеспечения второго остатка Cys, и в котором дисульфидная связь находится между первым и вторым остатками Cys.

Аспект 15. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-14, причем: а) полипептид содержит дисульфидную связь между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидным эпитопом WT-1 и первым полипептидом ГКГС I класса, причем первый полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид в2М; и ii) остатком Cys, введенным посредством замены Y84C во второй полипептид ГКГС I класса, при этом второй полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса.

Аспект 16. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-14, причем полипептид содержит дисульфидную связь между i) остатком Cys, введенным в первый полипептид ГКГС I класса посредством замены R12C, причем первый полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид в2М; и ii) остатком Cys, введенным во второй полипептид ГКГС I класса посредством замены А236С, при этом второй полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса.

Аспект 17. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-14, причем полипептид содержит первую дисульфидную связь между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидным эпитопом WT-1 и первым полипептидом ГКГС I класса, причем первый полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид в2М; и ii) остатком Cys, введенным посредством замены Y84C во второй полипептид ГКГС I класса, при этом второй полипептид ГКГС I класса представляет собой полипептид тяжелой цепи ГКГС I класса; и вторую дисульфидную связь между: i) остатком Cys, введенным в полипептид в2М посредством замены R12C; и ii) остатком Cys, введенным в полипептид тяжелой цепи

- 111 049816

ГКГС I класса посредством замены А236С.

Аспект 18. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по аспекту 15 или аспекту 17, в котором линкер между пептидным эпитопом WT-1 и первым ГКГС представляет собой GCGGS(G4S)n (SEQ ID NO: 315), где n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9.

Аспект 19. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-18, в котором пептидный эпитоп WT-1 имеет длину от около 4 до около 25 аминокислот.

Аспект 20. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-19, в котором пептид WT-1 содержит аминокислотную последовательность

CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 266), CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269), NYMNLGATL (SEQ

ID NO:263), VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259), YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:265), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260) и NLMNLGATL (SEQ ID NO:258).

Аспект 21. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-20, в котором первый или второй полипептид ГКГС содержит:

а) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLAA*2301, HLA-A*2402, HLA-A*2407, HLA-A*3303 или HLA-A*3401, изображенной на фиг. 9А; или

b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*1502, HLA-B*3802, HLAB*4001, HLA-B*4601 или HLA-B*5301, изображенной на фиг. 10А; или

с) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с

HLA-C*0102, HLA-C*0303, HLAС*0304, HLA-C*0401, HLA-C*0602, HLA-C*0701, HLA-C*0702, HLA-C*0801 или HLAC*1502, изображенной на фиг. 11А.

Аспект 22. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-21, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*2402, и при этом эпитоп выбран из группы, состоящей из:

RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260), CYTWNQMNL (SEQ ID NO:269) и NYMNLGATL (SEQ

ID NO:263).

Аспект 23. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-21, в котором первый полипептид ГКГС представляет собой полипептид в2М; и в котором второй полипептид ГКГС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом HLA-A*O2O1, и при этом эпитоп выбран из группы, состоящей из:

VLDFAPPGA (SEQ ID NO:259), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260) и YMFPNAPYL (SEQ ID

NO:264).

Аспект 24. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-23, причем мультимерный полипептид содержит первый и второй гетеродимеры, и в котором первый и второй гетеродимеры ковалентно связаны одной или более дисульфидными связями между полипептидами Fc Ig первого и второго гетеродимеров.

Аспект 25. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую последовательность, кодирующую первый или второй полипептид по любому из аспектов 1-24.

Аспект 26. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по аспекту 25.

Аспект 27. Способ селективного модулирования активности Т-клетки, специфической для эпитопа опухоли-1 Вильмса (WT-1), включающий приведение в контакт Т-клетки с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 1-24, причем указанное приведение в контакт селективно модулирует активность специфической по эпитопу WT-1 Т-клетки.

Аспект 28. Способ лечения пациента с раковым заболеванием, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид по любому из аспектов 1-24,

Аспект 29. Способ по аспекту 28, в котором раковое заболевание представляет собой острый мие

- 112 049816 лоидный лейкоз, миелому, рак яичников, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак молочной железы, опухоль Вильмса, мезотелиому, саркому мягких тканей, нейробластому или нефробластому.

Аспект 30. Способ по аспекту 28 или аспекту 29, дополнительно включающий введение индивидууму одного или более ингибиторов контрольных точек.

Аспект 31. Способ по аспекту 30, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, которое связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, ОХ40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K дельта, PI3K гамма, ТАМ, аргиназы, CD137, ICOS, A2AR, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

Аспект 32. Способ по аспекту 31, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, специфическое для PD-1, PD-L1 или CTLA4.

Аспект 33. Способ по аспекту 30, в котором один или более ингибиторов контрольных точек выбраны из группы, состоящей из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, АМР-224, MPDL3280A, MDX-1105, MEDI-4736, арелумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, пидилизумаба, IMP321, MGA271, BMS-986016, лирилумаба, урелумаба, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, СР-870,893, могамулизумаба, варлилумаба, авелумаба, галиксимаба, АМР-514, AUNP 12, индоксимода, NLG-919, INCB024360, KN035, и их комбинаций.

Аспект 34. Способ модулирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества модулирующего Т-клетки мультимерного полипептида по любому из аспектов 1-24, причем указанное введение индуцирует эпитоп-специфический Т-клеточный ответ и эпитоп-неспецифический Т-клеточный ответ, и причем соотношение эпитоп-специфического Т-клеточного ответа к эпитоп-неспецифическому Т-клеточному ответу составляет по меньшей мере 2:1.

Аспект 35. Способ доставки иммуномодулирующего полипептида, селективного к Т-клеткимишени, включающий приведение в контакт смешанной популяции Т-клеток с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 1-24, причем смешанная популяция Т-клеток содержит Т-клетки-мишени и Т-клетки, не являющиеся мишенями, причем Т-клетки-мишени являются специфическими для эпитопа WT-1, присутствующего в модулирующем Т-клетки мультимерном полипептиде, и при этом указанное приведение в контакт доставляет один или более иммуномодулирующих полипептидов, присутствующих в модулирующем Т-клетки мультимерном полипептиде, к Т клеткемишени.

Аспект 36. Способ обнаружения в смешанной популяции Т-клеток, полученных от индивидуума, наличия Т-клетки-мишени, которая связывает эпитоп WT-1, включающий: а) приведение в контакт in vitro смешанной популяции Т-клеток с модулирующим Т-клетки мультимерным полипептидом по любому из аспектов 1-24, причем модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид содержит эпитоп WT-1; и b) обнаружение активации и/или пролиферации Т-клеток в ответ на указанное приведение в контакт, причем активированные и/или пролиферированные Т-клетки указывают на наличие Т-клеткимишени.

Примеры

Следующие примеры приводятся с тем, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как осуществлять и применять настоящее изобретение, однако они не претендуют ни на ограничение объема того, что авторы рассматривают как свое изобретение, ни на то, что нижеприведенные эксперименты представляют собой все или единственные проведенные эксперименты. Были приняты меры для того, чтобы сохранить точность в отношении используемых чисел (например, количеств, значений температуры и т.д.), однако следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части означают массовые части, молекулярная масса означает среднюю молекулярную массу, температура выражена в градусах Цельсия, а давление представляет атмосферное давление или давление, близкое к атмосферному. Могут употребляться стандартные сокращения, например, п. о., пара(-ы) оснований; т.п. н., тысяча(-и) пар нуклеотидов; пл, пиколитр(-ы); с или сек, секунда(-ы); мин, минута(-ы); ч или час, час(-ы); ак, аминокислота(-ы); тысяча(-и) пар нуклеотидов; п. о., пара(-ы) оснований; нт, нуклеотид(-ы); в/м, внутримышечный(-о); в/б, внутрибрюшинный(-о); п/к, подкожный(-о) и т.п.

Пример 1.

Исследовали влияние соединения двух полипептидных цепей гетеродимера ТММР посредством двух дисульфидных связи на стабильность и продукцию.

Создали следующие ТММР: а) ТММР, содержащий полипептиды 1715 + 2380; и b) ТММР, содержащий полипептиды 1715 и 2381. Аминокислотные последовательности полипептидных цепей представлены на фиг. 14А-14С. Как показано на фиг. 15 и фиг. 16, ТММР включают в себя: i) полипептиды тяжелой цепи HLA-A I класса из аллеля А02:01; и ii) две копии IL2 (Н16А; F42A) иммуномодулирующих (MOD) полипептидов.

Полипептид 2380 содержит WT1-пептид WT1(37-45), тогда как полипептид 2381 содержит WT1пептид WT1(126-134). TMMP 1715-2380 представляет собой гомодимер из гетеродимера, содержащего

- 113 049816 полипептид 1715 и полипептид 2380. Аналогично, ТММР 1715-2381 представляет собой гомодимер из гетеродимера, содержащего полипептид 1715 и полипептид 2381. Таким образом, ТММР включают в себя: i) 2 копии гетеродимера 1715 + 2380, соединенного 2 дисульфидными связями между полипептидом IgFc, присутствующим в полипептидах 1715; или ii) 2 копии гетеродимера 1715 + 2381, соединенного 2 дисульфидными связями между полипептидом IgFc, присутствующим в полипептидах 1715. Это расположение схематически изображено на фиг. 17С.

ТММР 1715 + 2380 представляет собой гетеродимер с двумя дисульфидными связями: а) первая дисульфидная связь находится между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидом WT1 и цепью в2М в полипептиде 2380; и ii) Cys, введенным заменой Y84C в тяжелую цепь I класса, присутствующую в полипептиде 1715; и b) вторая дисульфидная связь находится между: i) Cys, введенным заменой R12C в полипептид в2М, присутствующий в полипептиде 2380; и ii) Cys, введенный заменой А236С в тяжелую цепь I класса, присутствующую в полипептиде 1715.

ТММР 1715 + 2381 представляет собой гетеродимер с двумя дисульфидными связями: а) первая дисульфидная связь находится между: i) Cys, присутствующим в линкере между пептидом WT1 и цепью в2М в полипептиде 2381; и ii) Cys, введенным заменой Y84C в тяжелую цепь I класса, присутствующую в полипептиде 1715; и b) вторая дисульфидная связь находится между: i) Cys, введенным заменой R12C в полипептид в2М, присутствующий в полипептиде 2381; и ii) Cys, введенный заменой А236С в тяжелую цепь I класса, присутствующую в полипептиде 1715.

ТММР продуцировали в клетках ExpiCHO (адаптированных их клеток яичника китайского хомячка (СНО); ThermoFisher; см., например, Jain et al. (2017) Protein Expr. Purif. 134:38) и очищали из среды культивирования клеток, в которой клетки выращивали. Выполняли два этапа очистки. На первом этапе среду культивирования клеток осветляли, и осветленную среду культивирования клеток подвергали очистке на колонке для очистки с белком А. На втором этапе очистки элюат из колонки с белком подвергали эксклюзионной хроматографии.

Исследовали стабильность очищенных ТММР. Количество присутствующего гетеродимерного ТММР определяли после хранения очищенных ТММР в жидком растворе (фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 365 мМ NaCl, pH 7,4) в течение 28 суток при 37°С или в течение 28 суток при 42°С.

Кроме того, очищенные ТММР подвергали 3 циклам замораживания/оттаивания.

Результаты приведены на фиг. 15 и фиг. 16.

Как показано на фиг. 15, гомодимер из гетеродимера 1715-2380 (называется на фиг. 15 мономер) представляет 80% элюата из колонки с белком А. Как показано на фиг. 16, гомодимер из гетеродимера 1715-2381 (называется на фиг. 16 мономер) представляет 79% элюата из колонки с белком А.

Обнаружили, что гомодимеры из гетеродимеров 1715-2380 и 1715-2381 являются стабильными к 3 циклам замораживания/оттаивания.

Температуры разворачивания пептида/HLA, IL-2 и доменов Fc различных ТММР, выраженные в виде T_m (°С), представлены на фиг. 15 и фиг. 16. Кроме того, температура, при которой происходит агрегация (T_m °С), представлена на фиг. 15 и фиг. 16.

Пример 2. Биохимическое определение характеристик ТММР, содержащих эпитопы WT1, тяжелые цепи HLA-A*02, либо одну, либо две дисульфидные цепи между 2 полипептидными цепями гетеродимера, и иммуномодулирующие полипептиды варианта IL-2 в положении 1.

Характеристики использованных в этом исследовании конструкций обобщены в табл. 2.

Таблица 2

Конструкции	Эпитоп	S-S связь(-и)	Положение IL-2
2405 + 2762	WT-1 (37-45)	G2C	1
1715 +2380	WT-1 (37-45)	G2C + R12C	1
2405 + 2763	WT-1 (126-134)	G2C	1
1715 +2381	WT-1 (126-134)	G2C + R12C	1
2405 + 3626	WT-1 (126-134 (R126Y))	G2C	1
1715 + 3625	WT-1 (126-134 (R126Y))	G2C + R12C	1

Аминокислотные последовательности полипептидных цепей конструкций представлены на фиг. 14A-14I.

G2C указывает на то, что ТММР включает дисульфидную связь между: i) Cys в пептидном линкере между пептидным эпитопом и полипептидом в2М; и ii) Cys в положении 84 тяжелой цепи ГКГС I класса, причем тяжелая цепь ГКГС I класса содержит замену Y84C.

R12C указывает на то, что ТММР включает дисульфидную связь между: i) Cys в положении 12 в полипептиде в2М, причем полипептид в2М содержит замену R12C; и ii) Cys в положении 236 тяжелой цепи ГКГС I класса, причем тяжелая цепь ГКГС I класса содержит замену А236С.

G2C + R12C указывает на то, что ТММР содержит как дисульфидную связь G2C, так и дисульфидную связь R12C.

WT-1 (37-45) представляет собой VLDFAPPGA (SEQ IDNO:259).

WT-1 (126-134) представляет собой RMFPNAPYL (SEQ ID NO:260).

WT-1 (126-134 (R126Y)) представляет собой YMFPNAPYL (SEQ ID NO:264) и также называется ми

- 114 049816 мотоп 126-134.

Положение 1 IL-2 схематически изображено на фиг. 19.

Полученные результаты.

Исследовали способность ТММР стимулировать антигенспецифическую пролиферацию Т-клеток CD8+. ТММР включали, в качестве эпитопа: i) WT1 37-45; ii) WT1 126-134; или iii) WT1 126-134 (R126Y). Все ТММР включали тяжелые цепи ГКГС I класса аллеля А02.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), полученные от доноров-людей, инкубировали in vitro с ТММР при различных концентрациях (0 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 300 нМ или 1000 нМ) в течение 10 дней. После 10-дневного периода инкубации определяли количество клеток, специфических для данного эпитопа. Данные МКПК, полученных от двух доноров (лейкопак 7 и лейкопак 12) показаны на фиг. 21.

Данные, представленные на фиг. 21, демонстрируют для двух доноров, что WT1-специфические ТММР могут индуцировать наращивание WT1-специфических Т-клеток CD8+ из суммарных МКПК в течение 10-дневной стимуляции культуры. Это наращивание достигнуто для МКПК, которые содержали малое количество WT1-специфических предшественников Т-клеток или не содержали их на выявляемом уровне, указывая на то, что ТММР были способны индуцировать антигенспецифические ответы у доноров из непримированного или наивного репертуара. Данные демонстрируют, что ТММР, специфические для любого из 3 выбранных пептидов WT1 (37-45, 126-134 и 126-134 R126Y) и на любом из двух исследованных дисульфидных каркасов (G2C и R12C/G2C), индуцируют наращивание WT1-специфических Тклеток CD8+ из суммарных МКПК.

МКПК, полученные от разных доноров-людей (L7, L10 и L12), стимулировали в течение 10 дней in vitro с помощью указанных пептидов WT1 в присутствии рекомбинантного человеческого IL-2, а затем рестимулировали в течение 8 дней с помощью ТММР, содержащих такие же пептиды, и содержащих либо дисульфидную связь G2C, либо обе дисульфидные связи R12C и G2C. Данные изображены на фиг. 22.

Данные, представленные на фиг. 22, демонстрируют на МКПК от трех доноров, что WT1содержащие ТММР могут наращивать WT1-специфические Т-клетки CD8+ из суммарных МКПК в течение периода 8-дневного рестимулирующего культивирования после 10-дневного культивированияпримирования. Это наращивание происходило из клеток, которые содержат обнаруживаемое количество WT1-специфических предшественников Т-клеток, указывая на то, что ТММР были способны приводить к наращиванию антигенспецифических Т-клеток у доноров с примированным/предварительно существующим репертуаром специфических по WT-1 Т-клеток. Данные демонстрируют, что ТММР, специфические для 3 пептидов WT1 (37-45, 126-134 и 126-134 R126Y) и на любом из двух исследованных дисульфидных каркасов (G2C и R12C/G2C), индуцируют такое наращивание.

Исследовали способность Т-клеток CD8'. нарощенных вследствие приведения в контакт с ТММР, содержащих пептид WT1 37-45 и содержащих либо дисульфидную связь G2C, либо обе дисульфидные связи R12C и G2C, для продуцирования TNF-α и IFN-γ в ответ на клетки-мишени (клетки Т2), презентирующие пептид WT1-37-45 или нерелевантный пептид(SL9). В качестве положительного контроля использовали 12-миристат 13-ацетат форбола (РМА) и иономицин (iono). В качестве отрицательного контроля использовали Т-клетки CD8+, обработанные средой. Т-клетки CD8+, нарощенные благодаря ТММР, инкубировали с клетками-мишенями (клетки Т2), которые нагружали либо пептидом WT1, либо нерелевантным пептидом (пептид SL9 из ВИЧ). Ответ, показанный путем продукции IFN-γ и TNFα, Т-клеток CD8+ по отношению с клетками Т2, в которые вводили пептид WT 37-45, сравнивали с ответом клеток Т2, в которые вводили пептид SL9. Данные показаны на фиг. 23.

Данные, представленные на фиг. 23, демонстрируют селективную полифункциональность WT1 3745-специфических Т-клеток CD8+, нарощенных с помощью содержащих WT1 37-45 ТММР, имеющих каркас либо G2C, либо R12C/G2C. Измеряемый ответ (продукция TNF-α и IFN-γ) наблюдали только при распознавании клеток-мишеней, презентирующих пептид WT1 37-45, но не пептид SL9. Лунки с положительными и отрицательными контролями показывают, что в отсутствии стимуляции нет исходной активности в Т-клетках CD8+ (как показано в лунках с только средой) и что как антигенспецифические, так и неантигенспецифические клетки способны демонстрировать функциональные реакции на сильную антиген-неспецифическую стимуляцию (РМА + иономицин).

Используя тот же анализ, исследовали способность Т-клеток CD8, нарощенных благодаря ТММР, содержащих пептид WT1 126-134 (WT1 126) и содержащих дисульфидные связи R12C и G2C, для продуцирования TNF-α и IFN-γ в ответ на клетки-мишени (клетки Т2), презентирующие пептид WT1-126134, пептид WT1-126-134 R126Y или нерелевантный пептид (SL9). Данные показаны на фиг. 24.

Данные, представленные на фиг. 24, демонстрируют селективную полифункциональность WT1 126134-специфических Т-клеток CD8⁺, нарощенных с помощью специфических по WT1 126-134 иммуноSTAT на каркасе R12C/G2C.

Измеряемый ответ (продукция TNF-α и IFN-γ) наблюдали только при распознавании клетокмишеней, презентирующих пептид WT1 126-134 или пептид WT1 126-134 R126Y, но не пептид SL9.

- 115 049816

Лунки с положительными и отрицательными контролями показывают, что в отсутствии стимуляции нет исходной активности в Т-клетках CD8' (как показано в лунках с только средой) и что как антигенспецифические, так и неантигенспецифические клетки способны демонстрировать функциональные реакции на сильную антиген-неспецифическую стимуляцию (РМА + иономицин).

Исследовали влияние дисульфидных связей на IL-2-стимулируемую активацию иммунных клеток. CD69 представляет маркер ранней активации на большинстве лимфоцитов и некоторых других иммунных клеток. Клетки повышают регуляцию CD69 при различных типах стимулирующих условий, включая стимуляцию IL-2. Оценивали повышение регуляции CD69 на клетках NK, Т-клетках CD4⁺ и Т-клетках CD8⁺. Повышение регуляции CD69 демонстрирует, что полипептиды IL-2, присутствующие в ТММР, являются активными и их функция аттенуирована по сравнению с контролем (рекомбинантный IL-2 человека). Инкубировали МКПК от различных доноров-людей с различными ТММР (IST), изложенными в табл.. В качестве контролей включали ТММР, содержащие эпитоп ЦМВ или эпитоп MART-1. Показаны данные, полученные от одного донора-человека (лейкопак 6). Данные показаны на фиг. 25. На фиг. 25 показано повышение регуляции CD69 на клетках NK в качестве соответствующего и репрезентативного примера клетки, которая легко повышает регуляцию CD69 в ответ на IL-2. Аналогичные данные наблюдали на гейтах Т-клеток CD8⁺ и гейтах Т-клеток CD4⁺.

Данные, представленные на фиг. 25, демонстрируют, что иммуномодулирующий полипептид IL-2, сконструированный по положению 1 в HLA-A02-специфические иммуно-STAT, построенные на различных дисульфидных каркасах (R12C, G2C и R12C/G2C), является функциональным (что наблюдается по индукции CD69 на поверхности соответствующей иммунной клетки) и аттенуированным по сравнению с рекомбинантным человеческим IL-2 дикого типа.

Для оценки активности вариантов иммуномодулирующих полипептидов IL-2, присутствующих в ТММР, провели анализ с пролиферацией CTLL-2. Рост клеток CTLL-2 зависим от IL-2; поэтому пролиферация CTLL-2 является показателем количества и/или активности IL-2, присутствующего в культуральной среде (например, когда IL-2 продуцируется Т-клетками, контактировавшими с ТММР). Gillis et al. (1978) J. Immunol. 120:2027.

Данные показаны на фиг. 26. Данные, представленные на фиг. 26, демонстрируют, что иммуномодулирующий полипептид IL-2, сконструированный по положению 1 в HLA-А02-специфические иммуноSTAT (ТММР), построенные на различных дисульфидных каркасах (R12C, G2C и R12C/G2C), является функциональным (что наблюдается по индукции пролиферации CTLL-2) и аттенуированным по сравнению с пролейкином.

Исследовали способность ТММР, используемых в этих экспериментах, связываться с FcRn. ТММР содержат область Fc Ig, которая может связываться с FcRn. Связывание с FcRn является показателем пролонгированного периода полувыведения in vivo. Souders et al. (2015) MAbs 7:912. Данные для ТМРР 1715 + 2380 показаны на фиг. 27.

Исследовали способность ТМРР 1715 + 2380 к связыванию с другими рецепторами Fc. ТМРР 1715 + 2380 содержит область Fc Ig с заменами LALA, которые снижают связывание Fc Ig с FcRI, RIIA, IIB, IIIA-F и IIIB, тем самым снижая Ig Fc-опосредованные эффекторные функции. Данные показаны на фиг. 27.

Материалы и методы.

Фиг. 21.

Лейкопаки (обогащенные лейкоцитами препараты крови) от двух здоровых доноров получали с использованием оборудования для афереза. Лейкопаки разбавляли равным объемом фосфатно-солевого буфера (PBS) комнатной температуры. МКПК выделяли из разбавленных лейкопаков путем центрифугирования в градиенте плотности следующим образом: наносили 30 мл разбавленного лейкопака на слой из 13 мл Ficoll-Paque в конической пробирке на 50 мл и центрифугировали при 400 g в течение 30 мин при комнатной температуре на роторе с качающимися корзинами без использования тормоза. С поверхности раздела фаз плазма-Ficoll собирали слой клеток (лимфоциты, моноциты и тромбоциты), переносили в новую коническую пробирку на 50 мл и промывали 3-кратным избытком PBS путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин при комнатной температуре. После осторожного удаления супернатанта клетки ресуспендировали и промывали 50 мл PBS путем центрифугирования при 200 g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления тромбоцитов. После промывания и удаления тромбоцитов полученные МКПК объединяли из пробирок на 50 мл, ресуспендировали в PBS, подсчитывали, осаждали центрифугированием при 300 g в течение 10 мин и ресуспендировали до конечной концентрации 50х10⁶клеток на мл в среде для замораживания клеток.

МКПК здоровых доноров-людей готовили из двух лейкопаков, как описано выше. В день эксперимента клетки оттаивали в водяной бане при 37°С и промывали в теплой среде для наращивания клеток ImmunoCult™-XF (Stemcell Technologies) путем центрифугирования при 350xg в течение 6 мин. Супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в среде ImmunoCult™. Оценивали число живых клеток с использованием автоматизированного счетчика клеток Countess (Invitrogen, Калифорния). Объем среды корректировали до получения концентрации клеток 5х10⁶ клеток/мл, и высевали 2 мл клеток (эквива

- 116 049816 лентно 10x10⁶ клеток) на 6-луночный планшет. МКПК стимулировали указанными количествами иммуно-STAT или только одной средой в общем объеме среды 4 мл. Клетки стимулировали в течение 10 дней при 37°С, 5% CO2 с заменой среды на 5 и 7 сутки аспирацией из лунок 2 мл культурального супернатанта и восполнением 2 мл свежей среды.

После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 xg в течение 5 мин, определяли число живых клеток автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния), и клетки подвергали анализу проточной цитометрией, окрашивая: красителем для определения жизнеспособности, подходящими WT1-пептид-специфическuми тетрамерами HLA-A*0201 (MBL International) и антителами против CD69, CD3, CD14, CD19, CD127, CD56, CD4 (Biolegend), CD8, CD25 (BD Biosciences). Окрашенные клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии.

Сбор данных выполняли с использованием прибора для проточной цитометрии Attune NxT (Invitrogen). Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

Основываясь на частоте встречаемости антигенспецифических Т-клеток, проанализированных проточной цитометрией объемах и событиях и количестве собранных в конце культивирования клеток, подсчитали количество антигенспецифических Т-клеток и отметили его на показанных графиках.

Фиг. 22.

МКПК от двух доноров наращивали в течение 10 дней с 10 микрограммами/мл указанных пептидов и 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. Наращивание выполнено в 6-луночных планшетах с общим количеством 10 миллионов клеток в 4 мл среды Immunocult на лунку. Клетки стимулировали в течение 10 дней при 37°С, 5% CO2 с заменой среды на 5 и 7 сутки аспирацией из лунок 2 мл культурального супернатанта и восполнением 2 мл свежей среды с 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин, число живых клеток определяли автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния). Каждое условие стимуляции выполняли в по меньшей мере 3 лунках шестилуночного планшета. МКПК из одной лунки использовали для оценки частоты встречаемости/количества в культуре WT1-специфических Тклеток CD8' проточной цитометрией при окрашивании: красителем для определения жизнеспособности, подходящих WT1-пепmид-специфических тетрамеров HLA-A*0201 (MBL International) и антител против CD69, CD3, CD14, CD19, CD127, CD56, CD4 (Biolegend), CD8, CD25 (BD Biosciences). Окрашенные клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии. По меньшей мере две лунки использовали для обогащения Т-клеток CD8+ с использованием набора для отрицательного отбора для Тклеток CD8+ из Stem Cell Technologies. Очищенные Т-клетки CD8+ рестимулировали в течение 8 дней с помощью указанных ТММР в присутствии аутологических МКПК, предварительно обработанных митомицином С, в соотношении 1:2, с конечным содержанием 5-10 миллионов клеток в объеме 4 мл среды Immunocult на лунку. Использовали ТММР в концентрациях, раннее установленных как оптимальные для комбинации донора и конкретного ТММР.

После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин, определяли число живых клеток автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния), и их подвергали анализу проточной цитометрией, окрашивая: красителем для определения жизнеспособности, подходящими WT1-пептид-специфическими тетрамерами HLA-A*0201 (MBL International) и антителами против CD69, CD3, CD14, CD19, CD127, CD56, CD4 (Biolegend), CD8, CD25 (BD Biosciences). Окрашенные клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии.

Фиг. 23.

МКПК от двух доноров наращивали в течение 10 дней с 10 микрограммами/мл пептида WT1 37-45 и 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. Наращивание выполнено в 6-луночных планшетах с общим количеством 10 миллионов клеток в 4 мл среды Immunocult на лунку. Клетки стимулировали в течение 10 дней при 37°С, 5% CO₂ с заменой среды на 5 и 7 сутки аспирацией из лунок 2 мл культурального супернатанта и восполнением 2 мл свежей среды с 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин, число живых клеток определяли автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния). Каждую стимуляцию выполняли в по меньшей мере 3 лунках шестилуночного планшета. МКПК из одной лунки использовали для оценки частоты встречаемости/количества в культуре специфических по пептиду WT1 37-45 Т-клеток CD8+ проточной цитометрией при окрашивании: красителем для определения жизнеспособности, подходящих специфических по пептиду WT1 37-45 тетрамеров HLA-A*O2O1 (MBL International) и антител против CD69, CD3, CD14, CD19, CD127, CD56, CD4 (Biolegend), CD8, CD25 (BD Biosci

- 117 049816 ences). Окрашенные клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии. Сбор данных выполняли с использованием прибора для проточной цитометрии Attune NxT (Invitrogen). Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

По меньшей мере две лунки использовали для обогащения Т-клеток CD8+ с использованием набора для отрицательного отбора для Т-клеток CD8+ из Stem Cell Technologies. Очищенные Т-клетки CD8+ рестимулировали в течение 8 дней с помощью указанных специфических по WT1 37-45 иммуно-STAT либо на каркасе G2C, либо на R12C/G2C в присутствии аутологических МКПК, предварительно обработанных митомицином С, в соотношении 1:2, с конечным содержанием 5-10 миллионов клеток в объеме 4 мл среды Immunocult на лунку. Использовали специфический по WT1 37-45 иммуно-STAT либо на каркасе G2C, либо на R12C/G2C, в концентрации, раннее установленной как оптимальная для такого донора.

После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин, число живых клеток определяли автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния), и Т-клетки CD8' обогащали с использованием набора для отрицательного отбора Т-клеток Cd8⁺ от Stem Cell Technologies.

Клеткам-мишеням, клетки Т2 (АТСС), вводили 5 мкг/мл пептида WT1 37-45 или пептида SL9 Gag77-85 вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) в течении 2 ч при 37°С, 5% СО₂. После нагрузки пептидами клетки Т2 дважды промывали и ресуспендировали в среде для наращивания клеток ImmunoCult™-XF (Stemcell Technologies).

Обогащенные Т-клетки CD8⁺ и клетки Т2, нагруженными пептидами, перемешивали в соотношении 1:1 (по 1 х 10⁶ клеток для каждого случая) в конечном объеме 200 мкл на лунку в 96-луночных планшетах. В контрольные лунки добавляли среду и 12-миристат; 13-ацетат форбола (РМА)/иономицина в качестве отрицательных и положительных контролей соответственно. Через от 0,5 до 1 ч после стимуляции непосредственно к клеткам добавляли антитело против CD107а. Клетки стимулировали в течение 5 ч, промывали PBS и окрашивали на жизнеспособность с использованием FVS780 в течение 10 мин на льду. Клетки промывали, окрашивали специфическими по пептиду WT1 37-45 тетрамерами (меченые АРС и РЕ) в течение 15 мин при комнатной температуре. Впоследствии, клетки промывали и окрашивали антителами против CD3 и CD8 в течение 30 мин на льду. Окрашенные клетки дважды промывали и ресуспендировали в буфере для внутриклеточной фиксации (intracellular, IC) в течение ночи при 4°С. На следующий день клетки промывали и ресуспендировали в буфере для пермеабилизации и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Пермеабилизированные клетки промывали и окрашивали антителами против интерферона-γ (IFN-γ), фактора некроза опухолей-α (TNF-α), ресуспендировали в буфере для пермеабилизации в течение 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные клетки промывали, ресуспендировали в 2 мл буфера для FACS и трансфицировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Сбор данных выполняли с использованием прибора для проточной цитометрии Attune NxT (Thermofisher Scientific, Массачусетс). Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

Фиг. 24.

МКГЖ от двух доноров наращивали в течение 10 дней с 10 микрограммами/мл пептида WT1 126134 и 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. Наращивание выполнено в 6-луночных планшетах с общим количеством 10 миллионов клеток в 4 мл среды Immunocult на лунку. Клетки стимулировали в течение 10 дней при 37°С, 5% CO2 с заменой среды на 5 и 7 сутки аспирацией из лунок 2 мл культурального супернатанта и восполнением 2 мл свежей среды с 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. После культивирования клетки собирали и осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин, число живых клеток определяли автоматизированным счетчиком клеток Countess (Invitrogen, Калифорния). Каждую стимуляцию выполняли в по меньшей мере 3 лунках шестилуночного планшета. МКПК из одной лунки использовали для оценки частоты встречаемости/количества в культуре специфических по пептиду WT1 126-134 Т-клеток CD8⁺ проточной цитометрией при окрашивании: красителем для определения жизнеспособности, подходящих специфических по пептиду WT1 126-134 тетрамеров HLA-A*0201 (MBL International) и антител против CD69, CD3, CD14, CD19, CD127, CD56, CD4 (Biolegend), CD8, CD25 (BD Biosciences). Окрашенные клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии. Сбор данных выполняли с использованием прибора для проточной цитометрии Attune NxT (Invitrogen). Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

По меньшей мере две лунки использовали для обогащения Т-клеток CD8⁺ с использованием набора для отрицательного отбора для Т-клеток CD8⁺ из Stem Cell Technologies. Очищенные Т-клетки CD8⁺ рестимулировали в течение 8 дней с помощью специфических по WT1 126-134 иммуно-STAT на каркасе R12C/G2C в присутствии аутологических МКПК, предварительно обработанных митомицином С, в соотношении 1:2, с конечным содержанием 5-10 миллионов клеток в объеме 4 мл среды Immunocult на лунку. Использовали специфический по WT1 126-134 иммуно-STAT на каркасе R12C/G2C в концентрации, раннее установленной как оптимальная для такого донора.

- 118 049816

Клеткам-мишеням, клетки Т2 (АТСС), вводили 5 мкг/мл пептида WT1 126-134, пептида WT1 126134 R126Y или пептида SL9 Gag77-85 вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) в течении 2 ч при 37°С, 5% CO₂. После нагрузки пептидами клетки Т2 дважды промывали и ресуспендировали в среде для наращивания клеток ImmunoCult™-XF (Stemcell Technologies).

Обогащенные Т-клетки CD8⁺ и клетки Т2, нагруженными пептидами, перемешивали в соотношении 1:1 (по 1 х 10⁶ клеток для каждого случая) в конечном объеме 200 мкл на лунку в 96-луночных планшетах. В контрольные лунки добавляли среду и 12-миристат; 13-ацетат форбола (РМА)/иономицина в качестве отрицательных и положительных контролей соответственно. Через от 0,5 до 1 ч после стимуляции непосредственно к клеткам добавляли антитело против CD107а. Клетки стимулировали в течение 5 часов, промывали PBS и окрашивали на жизнеспособность с использованием FVS780 в течение 10 мин на льду. Клетки промывали, окрашивали специфическими по пептиду WT1 126-134 тетрамерами (меченые АРС и РЕ) в течение 15 мин при комнатной температуре. Впоследствии, клетки промывали и окрашивали антителами против CD3 и CD8 в течение 30 мин на льду. Окрашенные клетки дважды промывали и ресуспендировали в буфере для внутриклеточной фиксации (intracellular, IC) в течение ночи при 4°С. На следующий день клетки промывали и ресуспендировали в буфере для пермеабилизации и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Пермеабилизированные клетки промывали и окрашивали антителами против интерферона-γ (IFN-γ), фактора некроза опухолей-α (TNF-α), ресуспендировали в буфере для пермеабилизации в течение 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные клетки промывали, ресуспендировали в 2 мл буфера для FACS и трансфицировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Сбор данных выполняли с использованием прибора для проточной цитометрии Attune NxT (Thermofisher Scientific, Массачусетс). Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

Фиг. 25.

МКПК здоровых доноров-людей готовили из лейкопаков, полученных от Hemacare (Northridge, Калифорния), и хранили криоконсервированными при -150°С до дня эксперимента.

В день эксперимента клетки оттаивали в водяной бане в течение 1 мин, промывали 10 мл теплой среды для наращивания клеток ImmunoCult™-XF (Stemcell Technologies, г. Ванкувер, Канада), осаждали путем центрифугирования (350 g, 5 мин) и ресуспендировали в 10 мл среды. Подсчитывали клетки с использованием автоматизированного счетчика клеток Countess (Invitrogen, Калифорния), объем среды корректировали до концентрации клеток 3,8х10⁶ клеток/мл, и добавляли по 237,5 мкл клеточных суспензий в круглодонные 96-луночные планшеты.

В среде Immunocult готовили 20х серий разведений указанных иммуно-STAT и rh-IL-2. Для стимуляции МКПК добавляли по 12,5 мкл 20х серий разведений в лунки, содержащие клетки, и смешивали до получения конечных концентраций анализируемых лекарственных средств. МКПК инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение от 20 до 24 ч.

После стимуляции клетки осаждали центрифугированием при 350 g в течение 5 мин. Супернатанты собирали, замораживали и хранили при -20°С до проведения дальнейшего анализа. Осажденные МКПК промывали дважды с помощью PBS и окрашивали в течение 10 мин при 4°С в 50 мкл фиксирующим живые/мертвые клетки красителем FVS780. Окрашивание гасили 200 мкл буфера для окрашивания, и клетки осаждали центрифугированием (350xg, 5 мин). Клетки окрашивали в течение 30 мин при 4°С антителами против CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56 и CD69 в объеме 50 мкл. При окрашивании клетки промывали буфером для окрашивания, осаждали центрифугированием (350xg, 5 мин), ресуспендировали в 130 мкл буфера для окрашивания и анализировали проточной цитометрией с использованием проточного цитометра Attune®. Собранные данные экспортировали в виде fcs-файлов и анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Орегон).

Оценивали повышение регуляции CD69 на различных субпопуляциях клеток, которые чувствительны к повышению регуляции CD69 при стимуляции IL-2. На основании уровней экспрессии поверхностных маркеров, используемых в окрашивании, создавали гейты для идентификации клеток NK, Тклеток CD8⁺, Т-клеток CD4⁺.

Фиг. 26.

За один день до анализа клетки CTLL-2 промывали средой и культивировали при 1х 10⁵ клеток/мл в колбе 75-Т в течение 24 ч при 37°С, 5% CO2 для истощения IL-2. После 24 ч истощающего культивирования клетки высевали по 5000 клеток на лунку в объеме 100 микролитров/лунку 96-луночного плоскодонного планшета с крышкой из кластера для культивирования клеток (Costar corning, № 3599 по кат.). Проверяли жизнеспособность и число клеток перед стимуляцией с использованием анализатора для определения жизнеспособности клеток Vi (Beckman-Coulter).

Готовили серии разведений (10 точек; разведения с 3-кратным шагом) указанных иммуно-STAT

- 119 -

Claims

(ТММР) или пролейкина (Prometheus Therapeutics) в полной среде RPMI с добавкой 10% HI FBS в виде 2х исходных растворов для конечных анализируемых концентраций. Добавляли по 100 мкл этих 2х серий разведений к предварительно высеянным на 96-луночные планшеты клеткам и смешивали их для получения конечных концентраций анализируемых лекарственных средств. Каждую концентрацию проверяли в трех повторностях. Клетки инкубировали в течение трех дней при 37°С, 5% CO₃.

Через три дня культивирования из каждой лунки переносили по 100 мкл клеток в плоскодонные белые 96-луночные планшеты, обработанные для прикрепления тканевых культур. Готовили 100 мкл реагента CellTiter-Glo® с использованием набора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell (Promega cat № G7571), следуя инструкциям предоставленным производителем, и добавляли его к клеткам. Смешивали клетки и реагент CellTiter-Glo®, помещая планшеты на орбитальный шейкер в течение 2 минут, чтобы индуцировать лизис клеток. Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин для стабилизации люминесцентного сигнала. Измеряли люминесценцию на многорежимном ридере Biotek synergy neo2, программное обеспечение Gen5 3.04.

Фиг. 27.

Все эксперименты выполняли на системе Octet HTX (ForteBio). Биосенсоры анти-пента-гис (HIS1K) для кинетических измерений (ForteBio, № 18-5122) гидратировали в аналитическом буфере и предварительно адаптировали в глицине при рН 1,7. Аналитический буфер использовали для всех анализов за исключением анализа с FcRn. Буфер, использованный для FcRn, содержал PBS, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,02% Tween-20, рН 7,2. Аналитический буфер, использованный для реагентов FcRn, содержал PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, pH 6.

Каждый His-меченый рецептор иммобилизировали на биосенсорах HIS1K при концентрации 5 мкг/мл (исключение FcRI: 10 мкг/мл) в течение 120 с. Затем нагруженные антигеном биосенсоры HIS1K погружали в 7-точечные серии разведений 1:3 каждого индивидуального антитела, начиная с концентрации 300 нМ. Содержащую только аналитический буфер лунку использовали для проверки на неспецифическое связывание между буфером и нагруженными биосенсорами. В течение 60 с наблюдали ассоциацию, с последующей диссоциацией за 60 с. Создавали короткий период исходного состояния (60 с) с использованием буфера для диссоциации после загрузки HIS1K.

Хотя данное изобретение было описано со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны различные изменения и могут быть заменены эквиваленты без отклонения от истинной сущности и объема изобретения. Кроме того, может быть сделано множество модификаций для адаптации конкретной ситуации, материала, состава вещества, процесса, этапа или этапов процесса к цели, сущности и объему данного изобретения. Предполагается, что все такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Модулирующий Т-клетки мультимерный полипептид (ТММР), содержащий по меньшей мере один гетеродимер, содержащий:

a) первый полипептид, содержащий:

i) пептидный эпитоп-1 опухоли Вильмса (WT-1), где пептид WT-1 имеет длину от 4 до 25 аминокислот; а также ii) первый полипептид главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, где первый полипептид МНС класса I представляет собой полипептид в2-микроглобулина (в2М);

b) второй полипептид, содержащий:

i) второй полипептид МНС класса I, где второй полипептид МНС класса I представляет собой полипептид тяжелой цепи МНС класса I;

ii) один или несколько иммуномодулирующих полипептидов, где один или несколько иммуномодулирующих полипептидов представляют собой один или несколько вариантных полипептидов IL-2, которые проявляют уменьшенную аффинность к рецептору IL-2 и которые содержат замену H16 или замену H16 и замену F42 согласно нумерации аминокислот SEQ ID NO: 15; а также iii) полипептид Fc иммуноглобулина (Ig), где первый полипептид и второй полипептид ковалентно связаны друг с другом за счет, по меньшей мере, первой и второй дисульфидных связей, причем первая дисульфидная связь образована между остатком Cys в содержащем Cys линкере между эпитопным пептидом WT-1 и полипептидом в2М из указанного первого полипептида и остатком Cys в полипептиде тяжелой цепи МНС класса I из указанного второго полипептида, и где вторая дисульфидная связь образована между остаком Cys в полипептиде в2М из указанного первого полипептида и остатком Cys в полипептиде тяжелой цепи МНС класса I из указанного второго полипептида.
2. ТММР по п.1, отличающийся тем, что

а) первый полипептид включает в порядке от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1,

- 120 049816 ii) содержащий Cys линкер, а также iii) полипептид β2Μ, а

b) второй полипептид включает в порядке от N-конца к С-концу:

i) один или несколько вариантных полипептидов IL-2, ii) необязательный линкер, iii) полипептид тяжелой цепи МНС класса I, iv) необязательный линкер и

v) полипептид Fc из Ig, где когда ТММР содержит более чем один вариантный полипептид IL-2, то этот ТММР может содержать один или более линкеров между указанными вариантными полипептидами IL-2.
3. ТММР по п.1, отличающийся тем, что

a) первый полипептид включает в порядке от N-конца к С-концу:

i) пептидный эпитоп WT-1, ii) содержащий Cys линкер, а также iii) полипептид в2М, а

b) второй полипептид включает в порядке от N-конца к С-концу:

i) полипептид тяжелой цепи МНС класса I, ii) необязательный линкер, iii) полипептид Fc из Ig, iv) необязательный линкер, а также

v) один или несколько вариантных полипептидов IL-2, где когда ТММР содержит более чем один вариантный полипептид IL-2, то этот ТММР может содержать один или более линкеров между указанными вариантными полипептидами IL-2.
4. ТММР по любому из пп.1-3, где вариантный полипептид IL-2 включает:

i) замену H16A и замену F42A или ii) замену Н16Т и замену F42A.
5. ТММР по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что полипептид тяжелой цепи МНС класса I включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную с SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 203.
6. ТММР по п.2, где ТММР содержит два вариантных полипептида IL-2, которые находятся в тандеме и необязательно соединены линкером, и где каждый из вариантов IL-2 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 188, где Х1 представляет собой Ala, и X₂ представляет собой Ala, или Х1 представляет собой Thr, и Х₂ представляет собой Ala, где первая дисульфидная связь образована между (i) остатком Cys в линкере между пептидным эпитопом WT-1 и полипептидом в2М, и (ii) остатком Cys в положении 84 в полипептиде тяжелой цепи МНС класса I, и где вторая дисульфидная связь образуется между остатком Cys в положении 12 полипептида в2М, исходя из нумерации аминокислот SEQ ID NO: 311, и остатком Cys в положении 236 полипептида тяжелой цепи МНС класса I согласно нумерации аминокислот SEQ ID NO: 199, причем полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам, представленным в SEQ ID NO: 199, где аминокислота в положении 84 представляет собой Cys, и аминокислота в положении 236 представляет собой Cys, и где полипептид Fc из Ig имеет по меньшей мере 95% идентичность по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 418-421.
7. ТММР по п.6, в котором вариантные полипептиды IL-2 соединены линкером, и каждый вариантный полипептид IL-2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188, где Х1 представляет собой Ala, и Х₂ представляет собой Ala.
8. ТММР по п.6 или 7, где полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности по аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 199, и где эпитоп представляет собой VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 259).
9. ТММР по п.3, который содержит два вариантных полипептида IL-2 в тандеме и необязательно соединенных линкером, и где каждый из вариантных полипептидов IL-2 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 188, где Х1 представляет собой Ala и Х₂ представляет собой Ala, или где Х1 представляет собой Thr и Х₂ представляет собой Ala, где первая дисульфидная связь образована между (i) остатком Cys в линкере между пептидным эпитопом WT-1 и полипептидом в2М и (ii) остатком Cys в положении 84 полипептида тяжелой цепи МНС класса I, и где вторая дисульфидная связь образована между остатком Cys в положении 12 полипептида в2М, исходя из нумерации аминокислот SEQ ID NO: 311, и остатком Cys в положении 236 полипептида тяжелой цепи МНС класса I, исходя из нумерации аминокислот SEQ ID NO: 199, где полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, име

- 121 049816 ющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами, представленными в любой из SEQ ID NO: 41-43 и 198-206, где аминокислота 84 представляет собой Cys и аминокислота 236 представляют собой Cys, и при этом полипептид Fc из Ig имеет по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 418-421.
10. ТММР по п.9, где полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 201.
11. ТММР по п.9, где полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 203.
12. ТММР по любому из пп.9-11, где вариантные полипептиды IL-2 соединены линкером, и каждый из вариантных полипептидов IL-2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188, где X1 представляет собой Ala, и X2 представляет собой Ala.
13. ТММР по любому из пп.1-12, где линкер между пептидным эпитопом WT-1 и полипептидом в2М содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 316 или SEQ ID NO: 317.
14. ТММР по п.7, в котором первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 423, полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEh полипептид Fc из Ig содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 421.
15. ТММР по п.14, где полипептид тяжелой цепи МНС класса I содержит аминокислотную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE LVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE.
16. ТММР, содержащий первый и второй гетеродимер по любому из пп.1-14, где первый и второй гетеродимеры являются одинаковыми по аминокислотной последовательности и ковалентно связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями между полипептидами Fc из Ig этих первого и второго гетеродимеров.
17. ТММР, содержащий первый и второй гетеродимеры по п.15, где первый и второй гетеродимеры идентичны по аминокислотной последовательности и ковалентно связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями между полипептидами Fc из Ig этих первого и второго гетеродимеров.
18. ТММР по п.17, где две дисульфидные связи связывают полипептид Fc из Ig одного гетеродимера с полипептидом Ig Fc другого гетеродимера.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая ТММР по п.17.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая ТММР по п.18.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие первый и второй полипептиды ТММР по любому из пп.1-18.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один вектор экспрессии, где указанный по меньшей мере один вектор экспрессии содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие первый и второй полипептиды ТММР по любому из пп.1-18.
23. Способ получения ТММР по любому из пп.1-18, включающий культивирование клетки-хозяина, генетически модифицированной одним или более векторами экспрессии, содержащими нуклеотидные последовательности, кодирующие первый и второй полипептиды мультимерного полипептида, в условиях, при которых генетически модифицированная клетка-хозяин продуцирует ТММР.
24. Композиция in vitro из генетически модифицированных клеток-хозяев, где клетки-хозяева со

- 122 -