EA048431B1 - Вектор на основе аденоассоциированного вируса (aav) клады f и его применения - Google Patents

Abstract

Рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий капсид AAVhu68, полученный в системе продуцирования, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ГО NO: 1, или последовательность по меньшей мере на 75% идентичную ей, которая кодирует SEQ ID NO: 2. Капсид AAVhu68 содержит субпопуляции сильно дезамидированных аспарагиновых остатков в парах аспарагин-глицин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Также предложены композиции, содержащие rAAV, и их применения. Дополнительно предложен rAAV, имеющий сконструированный капсид AAV, содержащий по меньшей мере одну субпопуляцию белков vpl или vp2, имеющих Vai в аминокислотном положении 157 относительно нумерации vpl AAVhu68.

Description

Декларация о спонсируемых из федерального бюджета исследованиях или разработках

Эта заявка содержит работу при поддержке Агентства передовых оборонных исследовательских проектов (DARPA) в рамках W911NF-13-2-0036. Правительство США имеет определенные права на данное изобретение.

Уровень техники

Аденоассоциированный вирус (AAV), представитель семейства парвовирусов, представляет собой небольшой икосаэдрический вирус без капсида с геномом из одноцепочечной линейной ДНК (оцДНК) длиной около 4,7 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Геном дикого типа содержит инвертированные концевые повторы (ITR) на обоих концах цепи ДНК, и две открытые рамки считывания (ORF): rep и cap. Rep состоит из четырех перекрывающихся генов, кодирующих белки rep, необходимые для жизненного цикла AAV, и cap содержит перекрывающиеся нуклеотидные последовательности капсидных белков: VP1, VP2 и VP3, которые самоорганизуются с образованием капсида икосаэдрической симметрии.

AAV относится к роду Dependovirus, так как вирус был обнаружен в качестве загрязнителя в очищенных культурах аденовирусов. Жизненный цикл AAV включает в себя латентную фазу, в которой AAV геном, после заражения, сайт-специфично интегрирован в хромосомы хозяина, и инфекционную фазу, в которой после инфекции любого аденовируса или вируса простого герпеса, интегрированные геномы впоследствии извлекаются, реплицируются и упаковываются в инфекционные вирусы. Свойства не-патогенности, инфекционности для широкого круга хозяев, в том числе не делящихся клеток, и потенциальной сайт-специфической хромосомной интеграции делают AAV привлекательным инструментом для переноса генов.

Векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), полученные репликацией дефектного человеческого парвовируса были описаны в качестве подходящих переносчиков для доставки генов. Как правило, функциональные гены rep и ген cap удаляют из вектора, что приводит к получению некомпетентного к репликации вектора. Эти функции предусмотрены в ходе системы продуцирования вектора, но отсутствуют в готовом векторе.

На сегодняшний день было несколько различных хорошо охарактеризованных AAV, выделенных у человека или приматов, отличных от человека (NHP). Было обнаружено, что AAV различных серотипов демонстрируют различную эффективность трансфекции и проявляют тропизм для различных клеток или тканей. Много различных клад AAV было описано в WO 2005/033321, в том числе клада F, которая идентифицируется в них как имеющая только три представителя: AAV9, AAVhu31 и AAVhu32. Структурный анализ AAV9 представлен в М. A. DiMattia и др., J. Virol. (June 2012) vol. 86 no. 12 6947-6958. Эта статья сообщает, что AAV9 имеет 60 копий (в целом) трех различных белков (vp), которые кодируются геном cap и имеют перекрывающиеся последовательности. Они включают в себя VP1 (87 кДа), VP2 (73 кДа) и VP3 (62 кДа), которые присутствуют в прогнозируемом соотношении 1:1:10, соответственно. Вся последовательность VP3 находится в пределах VP2, и вся VP2 находится в пределах VP1. VP1 имеет уникальный N-концевой домен. Уточненные координаты и структурные факторы доступны под инвентарным № 3UX1 из базы данных RCSB PDB.

Несколько различных вариантов AAV9 были разработаны для того, чтобы не таргетировать или таргетировать различные ткани. См., например, N. Pulicheria, Engineering Liver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer, Molecular Therapy, Vol, 19, no. 6, p. 1070-1078 (June 2011). Сообщалось также о разработке вариантов AAV9 для доставки гена через гематоэнцефалический барьер. См., например, В.Е. Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, № 2, p 204-211 (опубликовано 1 февраля 2016) и пресс-релиз Калифорнийского технологического института, A. Wetherston, www.neurologycentral.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/, доступно 10/05/2016. См., также, WO 2016/0492301 и US 8734809.

Желательным является получение конструкций на основе AAV для доставки гетерологичных молекул.

Сущность изобретения

Описаны новый капсид AAVhu68 и последовательности rep, которые могут быть пригодными для производственного процесса и в векторах для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления изобретения обеспечивается рекомбинантный AAV который имеет капсид AAVhu68, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 или последовательностью нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления изобретения предложен рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), который содержит: (А) капсид AAV68, содержащий одно или более из: (1) капсидных белков AAV hu68, содержащих: белки vp1 AAVhu68, полученные путем экспрессии из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность от 1 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp1, полученные из SEQ ID NO: 1, или белки vp1, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной SEQ ID NO: 1, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность от 1 до 736 SEQ ID NO: 2, белки AAVhu68 vp2,

- 1 048431 полученные путем экспрессии из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp2, полученные из последовательности, содержащей по меньшей мере нуклеотиды от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1, или белки vp2, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной по меньшей мере нуклеотидам от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, белки AAVhu68 vp3, полученные путем экспрессии из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 203 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp3, полученные из последовательности, содержащей по меньшей мере нуклеотиды от 607 до 2211 SEQ ID NO: 1, или белки vp3, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной по меньшей мере нуклеотидам от 607 до 2211 SEQ ID NO: 1, которые кодируют предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 203 до 736 SEQ ID NO: 2; и/или (2) капсидных белков AAV, содержащих гетерогенную популяцию белков vp1, необязательно содержащую валин в положении 157 и/или глутаминовую кислоту в положении 67, гетерогенную популяцию белков vp2, необязательно содержащую валин в положении 157, и гетерогенную популяция белков vp3, причем по меньшей мере субпопуляция белков vp1 и vp2 содержит валин в положении 157 и необязательно дополнительно содержит глутаминовую кислоту в положении 67 на основе нумерации капсида vp1 SEQ ID NO: 2; и/или (3) гетерогенной популяции белков vp1, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, гетерогенной популяции белков vp2, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, и гетерогенной популяции белков vp3, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере аминокислоты от 203 до 736 SEQ ID NO: 2, причем белки vp1, vp2 и vp3 содержат субпопуляции с модификациями аминокислот, содержащими по меньшей мере два сильно дезамидированных аспарагина (N) в парах аспарагин-глицин в SEQ ID NO: 2, и необязательно дополнительно включают в себя субпопуляции, содержащие другие дезамидированные аминокислоты, при этом дезамидирование приводит к замене аминокислоты; и (В) векторный геном в капсиде AAVhu68, причем векторный геном содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности инвертированного концевого повтора AAV и последовательность нуклеиновой кислоты не-AAV, кодирующую продукт, функционально связанный с последовательностями, которые направляют экспрессию этого продукта в клетке-хозяине. Например, четыре остатка (N57, N329, N452, N512) обычно показывают высокие уровни дезамидирования. Дополнительные остатки (N94, N253, N270, N304, N409, N477 и Q599) также показывают уровни дезамидирования до ~ 20% по различным партиям.

В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидированные аспарагины дезамидируют до аспарагиновой кислоты, изоаспарагиновой кислоты, взаимопревращающейся пары аспарагиновой кислоты/изоаспарагиновой кислоты или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидированный(е) глутамин(ы) дезамидирован(ы) до (а)-глутаминовой кислоты, γглутаминовой кислоты, взаимопревращающейся пары (а)-глутаминовой кислоты/ γ-глутаминовой кислоты или их комбинаций.

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 содержит субпопуляции, имеющие одно или более из: (а) по меньшей мере 65% аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин, расположенных в положениях 57 белков vp1, дезамидированы, при определении по нумерации SEQ ID NO: 2; (b) по меньшей мере 75% N в парах аспарагин-глицин в положении 329 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, при определении по нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; (с) по меньшей мере 50% N в парах аспарагин-глицин в положении 452 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, при определении по нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и/или (d) по меньшей мере 75% N в парах аспарагин-глицин в положении 512 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, при определении по нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляцию vp1, в которой от 75% до 100% N в положении 57 белков vp1 дезамидировано, как определено с помощью массспектрометрии. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляцию белков vpl, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75% до 100% N в положении 329 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано, как определено с использованием масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75% до 100% N в положении 452 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано, как определено с использованием масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75% до 100% N в положении 512 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей

- 2 048431 белки, представляет собой SEQ ID NO: 1, или последовательность от по меньшей мере на 80% до по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность от по меньшей мере на 80% до 97% идентична SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид rAAVhu68 дополнительно содержит по меньшей мере субпопуляцию белков vp1, vp2 и/или vp3, имеющих аминокислотные модификации из SEQ ID NO: 2, содержащие по меньшей мере от около 50% до 100% дезамидирования по меньшей мере в четырех положениях, выбранных из одного или более из N57, 329, 452, 512 или их комбинаций. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляции белков vp1, vp2 и/или vp3, которые дополнительно содержат от 1% до около 40% дезамидирования по меньшей мере в одном или более положениях N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709 или их комбинациях. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид hu68 содержит субпопуляции белков vp1, vp2 и/или vp3, которые дополнительно содержат одну или более модификаций, выбранных из одной или более модификаций в одном или более из следующего: ацетилированный лизин, фосфорилированный серин и/или треонин, изомеризованная аспарагиновая кислота, окисленный триптофан и/или метионин, или амидированная аминокислота. В определенных вариантах осуществления изобретения rAAVhu68 содержит примерно всего 60 капсидных белков в соотношении примерно 1 vp1 на от около 1 до 1,5 vp2, на от 3 до 10 белков vp3. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 содержит примерно всего 60 капсидных белков в соотношении около 1 vp1 на около 1 vp2 на от 3 до 9 белков vp3. В определенных вариантах осуществления изобретения векторный геном содержит последовательности ITR AAV из источника AAV, отличного от AAVhu68.

В определенных вариантах осуществления изобретения предложена композиция, которая содержит смешанную популяцию рекомбинантного аденоассоциированного вируса hu68 (rAAVhu68), причем каждый из rAAVhu68 независимо выбран из rAAVhu68, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения средний капсид AAVhu68 содержит примерно всего 60 капсидных белков в соотношении около 1 vp1 на от около 1 до 1,5 vp2, на от 3 до 10 белков vp3. В определенных вариантах осуществления изобретения средний капсид AAVhu68 содержит примерно всего 60 капсидных белков в соотношении около 1 vp1 на от около 1 vp2, на от 3 до 6 белков vp3. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция составлена для интратекальной доставки, и векторный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукт для доставки в центральную нервную систему. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция составлена для внутривенной доставки. В определенных вариантах осуществления изобретения векторный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую анти-HER2 антитело. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция составлена для интраназальной или внутримышечной доставки. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция содержит по меньшей мере исходный вектор rAAVhu68 и необязательный носитель, эксципиент и/или консервант.

В определенных вариантах осуществления изобретения предусмотрено применение rAAVhu68 или композиции, как описано в данном документе, для доставки желаемого генного продукта нуждающемуся в этом субъекту.

В определенных вариантах осуществления изобретения обеспечивается система продуцирования rAAV, пригодная для получения рекомбинантного AAVhu68. Система продуцирования включает в себя: (а) последовательность нуклеиновой кислоты капсида AAVhu68, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (b) молекулу нуклеиновой кислоты, подходящую для упаковки в капсид AAVhu68, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR) AAV и последовательность нуклеиновой кислоты не-AAV, кодирующую генный продукт, функционально связанный с последовательностями, которые направляют экспрессию этого продукта в клетке-хозяине; и (с) достаточные функции rep AAV и вспомогательные функции, чтобы обеспечить упаковку молекулы этой нуклеиновой кислоты в рекомбинантный капсид AAVhu68. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит по меньшей мере SEQ ID NO: 1, или последовательность от по меньшей мере на 70% до по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения система дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты от примерно нуклеотида 607 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1, кодирующую vp3 AAVhu68 от примерно аминокислоты 203 до примерно аминокислоты 736 SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения система содержит клетки 293 эмбриональной почки человека или бакуловирусную систему.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ уменьшения дезамидирования капсида AAVhu68. Способ включает продуцирование капсида AAVhu68 из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей модифицированные кодоны vp AAVhu68, причем последовательность нуклеиновой кислоты содержит независимо модифицированные глициновые кодоны в одной-трех парах аргинин-глицин, расположенных в положениях 58, 330, 453 и/или 513 в SEQ ID NO: 2, так что модифи

- 3 048431 цированный кодон кодирует аминокислоту, отличную от глицина. В определенных вариантах осуществления изобретения способ включает в себя продуцирование капсида AAVhu68 из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей модифицированные кодоны vp AAVhu68, причем последовательность нуклеиновой кислоты содержит независимо модифицированные аргининовые кодоны в одной-трех парах аргинин-глицин, расположенных в положениях 57, 329, 452 и/или 512 в SEQ ID NO: 2, так что модифицированный кодон кодирует аминокислоту, отличную от аргинина. В определенных вариантах осуществления изобретения каждый модифицированный кодон кодирует отличающуюся аминокислоту. В определенных вариантах осуществления изобретения два или более модифицированных кодонов кодируют ту же самую аминокислоту. В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный капсид AAVhu68, как описано в данном документе, содержит мутацию в паре аргинин-глицин, так что глицин заменен на аланин или серин. Мутантный капсид AAVhu68 может содержать один, два или три мутанта, причем эталонный AAVhu68 изначально содержит четыре пары NG. В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный капсид AAVhu68 содержит только одну мутацию в паре NG. В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный капсид AAV содержит мутации в двух разных парах NG. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный капсид AAVhu68 содержит мутации в двух разных парах NG, которые расположены в структурно разделенном месте в капсиде AAVhu68. В определенных вариантах осуществления изобретения мутация не находится в VP1уникальном участке. В определенных вариантах осуществления изобретения одна из мутаций находится в VPl-уникальном участке. Необязательно, мутантный капсид AAVhu6 не содержит модификаций в парах NG, но содержит мутации для минимизации или устранения дезамидирования в одном или более аспарагинах или глутамине, расположенных вне пары NG.

В определенных вариантах осуществления изобретения обеспечивается мутантный rAAVhu68, который включает в себя модифицированный капсид rAAVhu68 с пониженным дезамидированием по сравнению с немодифицированным капсидом AAVhu68, который получают с помощью способа, описанного в данном документе.

В еще одном дополнительном аспекте обеспечивается способ повышения выхода и/или эффективности упаковки вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного (rAAV) вируса. Способ включает в себя конструирование гена капсида AAV для экспрессии белка vp1 с Val в аминокислотном положении 157, где нумерация аминокислотных остатков основана на полноразмерном vpl AAVhu68 [SEQ ID NO: 2]. В определенных вариантах осуществления изобретения обеспечивается rAAV клады F, имеющий глутаминовую кислоту (Glu или Е) в положении аминокислоты 67 на основе на нумерации SEQ ID NO: 2.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения обеспечивается сконструированный rAAV, произведенный в соответствии с этим способом.

В дополнительном варианте осуществления изобретения обеспечивается частица AAVhu68, которая экспрессирует анти-HER2 антитело, пригодная для лечения и/или профилактики раковых заболеваний HER2+.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения обеспечивается молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок rep AAVhu68 или его функциональный фрагмент под контролем экзогенных регуляторных последовательностей контроля, которые направляют их экспрессию в клетке-хозяине. В одном варианте осуществления изобретения белок rep имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или ее функциональный фрагмент.

Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлено выравнивание, показывающее аминокислотную последовательность из капсидного белка vp1 AAVhu68 [SEQ ID NO: 16] (обозначенную hu.68.vp1 в выравнивании), с AAV9 [SEQ ID NO: 6], AAVhu31 (обозначенную hu.31 в выравнивании) [SEQ ID NO: 10], AAVhu32 (обозначенную hu.32 в выравнивании) [SEQ ID NO: 11]. По сравнению с AAV9, AAVhu31 и AAVhu32, были обнаружены как критические две мутации (А67Е и A157V) в AAVhu68 и обведены кружком на фигуре.

На фиг. 2А-С приведено выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей капсидный белок vp1 из AAVhu68, с AAV9, AAVhu31 [SEQ ID NO: 12] и AAVhu32 [SEQ ID NO: 13].

На фиг. 3А, В представлены графики, показывающие выходы AAVhu.68 по сравнению с AAV9. Эксперимент проводили, как описано в примере 2, n=6. Значение Р было рассчитано и показано на фигурах.

На фиг. 3А показаны выходы AAVhu.68 и AAV9 из общего лизата. Значение Р было вычислено равным 0,4173 и определено как не имеющее существенного значения.

На фиг. 3В показаны выходы AAVhu.68 и AAV9 из супернатанта культуры. Выход AAVhu.68 в супернатанте значительно выше, чем у AAV9 со значением р равным 0,0003.

На фиг. 4А-С представлено иммуногистохимическое окрашивание различных органов (сердца, печени, легких и мышц) мышей, которым вводили 5x1ο¹¹ GC AAVhu68.CB7.nLacZ. Образцы готовили и обрабатывали, как описано в примере 3. Образцы контрастированные эозином показаны красным цве

- 4 048431 том. Положительное окрашивание на LacZ, показанное синим цветом, указывает на успешную трансдукцию AAVhu68.

На фиг. 4А представлено иммуногистохимическое окрашивание различных органов (сердце, печень, легкое и мышца) мышей, которым вводили 5х 10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nLacZ внутривенно (в/в). Все исследованные органы продемонстрировали трансдукцию AAVhu68 в то время как наблюдался тропизм в пользу сердца и печени по сравнению с легким и мышцей.

На фиг. 4В представлено иммуногистохимическое окрашивание различных органов (сердце, печень, легкое и мышца) мышей, которым вводили 5х 10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nLacZ внутримышечно (в/м). Сердце, печень и мышцы продемонстрировали высокую степень трансдукции AAVhu68 в то время как не было обнаружено никакой видимой трансдукции в легких.

На фиг. 4С представлено иммуногистохимическое окрашивание различных органов (сердце, печень, легкие и мышцы) мышей, которым вводили 5х1011 GC AAVhu68.CB7.nLacZ интраназально (и/н). Рассеянная трансдукция наблюдалась в сердце, печени, мышцах и легких.

На фиг. 5А-С представлены изображения флуоресцентной микроскопии различных участков головного мозга (гиппокамп, фиг. 5А; моторная кора, фиг. 5В, и мозжечок, фиг. 5С) мышей, которым вводили AAVhu68.GFP или AAV9.GFP в дозах 1х10¹⁰ GC или 1х 10¹¹ GC. Образцы готовили и обрабатывали, как описано в примере 4. Положительный сигнал от GFP, показанный зеленым цветом, указывает на успешную трансдукцию векторов AAV.

На фиг. 5А представлены изображения флуоресцентной микроскопии срезов гиппокампа мышей, которым вводили с AAVhu68.GFP или AAV9.GFP в дозах 1х10¹⁰ GC или 1х 10¹¹ GC. Соответствующие образцы от мышей, не получавших лечения, окрашенные красителем нуклеиновых кислот, показанные синим цветом, были предоставлены в качестве отрицательного контроля. Трансдукция векторов AAV наблюдалась во всех протестированных образцах, кроме одной из мышей, которой вводили 1х10¹⁰ GC AAV9.GFP.

На фиг. 5В представлены изображения флуоресцентной микроскопии моторной коры мышей, которым вводили AAVhu68.GFP или AAV9.GFP в дозах 1х10¹⁰ GC или 1х1011 GC. Наблюдалась лучшая трансдукция AAVhu68.GFP по сравнению с AAV9.

На фиг. 5С представлены изображения флуоресцентной микроскопии срезов мозжечка мышей, которым вводили с AAVhu68.GFP или AAV9.GFP в дозах 1х 10¹⁰ GC или 1х 10¹¹ GC. Наблюдалась успешная трансдукция AAVhu68.GFP, когда мышам вводили 1х 10¹¹ GC вектора.

На фиг. 6A-D представлены микроскопические изображения различных органов (печени, почек, сердца и поджелудочной железы) мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно. Образцы готовили и обрабатывали, как описано в примере 4. Положительный сигнал от GFP, показанный зеленым цветом, указывает на успешную трансдукцию указанных векторов AAV. Яркие изображения поля, показанные в черно-белом цвете, были сделаны для определения морфологии органа, в то время как соответствующий красный флуоресцентный канал был выполнен в качестве отрицательного контроля, где это применимо.

На фиг. 6А представлены микроскопические изображения репрезентативного среза печени мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно. Наблюдался положительный сигнал, показанный зеленым цветом.

На фиг. 6В представлены микроскопические изображения репрезентативного среза почки мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно. Наблюдался положительный сигнал, показанный зеленым цветом.

На фиг. 6С представлены микроскопические изображения репрезентативного среза сердца мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно. Наблюдался положительный сигнал, показанный зеленым цветом.

На фиг. 6D представлены микроскопические изображения репрезентативного среза поджелудочной железы мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно. Наблюдался положительный сигнал, показанный зеленым цветом.

Фиг. 7 представляет собой изображение устройства для интрацистернальной доставки, включая опциональную проводниковую иглу для коаксиального способа введения, которое включает в себя шприц объемом 10 куб. см с вектором, предварительно наполненный промывочный шприц объемом 10 куб. см, набор удлинителя с Т-образным соединителем, спинальную иглу 22G х5, дополнительную проводниковую иглу 18G х3,5.

Фиг. 8А, В иллюстрируют выход продукции двух различных векторов AAVhu68, приготовленных в малом масштабе (Фиг. 8А) и очень больших масштабах (мега, фиг. 8В) по сравнению с векторами, имеющими другие капсиды. Данные для векторных препаратов малого масштаба были получены с использованием векторов, имеющих капсид AAVhu68, AAV9, AAV8 или AAV8triple и имеющих векторный геном, содержащий цитомегаловирусный промотор (CMV), последовательность, кодирующую люциферазу светлячка, и поли-А SV40 (CMV.ffLuciferase.SV40). В мега-масштабе препараты были оценены с использованием векторов AAVhu68, AAV9, AAV8 или AAV8triple с векторным геномом, имеющим про

- 5 048431 мотор CMV, интрон, иммуноадгезин-кодирующую последовательность (201Ig IA), и поли-А SV40.

Фиг. 9 представляет чистоту продукции векторов AAVhu68, полученных в мега-масштабе по сравнению с векторами, имеющими другие капсиды, в том числе AAV8triple, AAV9 и AAV8. Препараты были оценены с использованием векторов AAVhu68, AAV9, AAV8 или AAV8triple, имеющих векторный геном, содержащий промотор CMV, интрон, иммуноадгезин-кодирующую последовательность (201Ig IA) и поли A SV40.

На фиг. 10А, В представлен уровень трансгенной экспрессии векторов AAVhu68 у самцов мышей RAG KO (n=5/группа), которым вводили внутримышечно вектор или 3/10¹¹ GC/мышь (фиг. 10А) или 3/10¹⁰ GC/мышь (фиг. 10В), по сравнению с векторами, имеющими другие капсиды, в том числе AAV8triple, AAV9 и AAV8. Трансген, экспрессированный векторами rAAV, представляет собой иммуноадгезин-кодирующую последовательность (201Ig IA). Эксперимент проводили, как описано подробно в примере 8.

На фиг. 11А, В представлен уровень трансгенной экспрессии векторов AAVhu68 или в печени (фиг. 11А), или мышцах (фиг. 11В) у самцов мышей C57BL/6J (n=5/группа), которым вводили внутримышечно вектор 3/10¹¹ GC/мышь, по сравнению с векторами, имеющими другие капсиды, в том числе AAV8triple, AAV9 и AAV8. Трансген, экспрессируемый векторами rAAV, представляет собой люциферазу светлячка. Эксперимент проводили, как описано подробно в примере 9.

На фиг. 12 представлен уровень трансгенной экспрессии векторов AAVhu68 у самцов и самок яванских макак, которым вводили внутримышечно вектор 1/10¹³ GC/кг массы тела, по сравнению с теми векторами, имеющими другие капсиды, в том числе AAV8triple, AAV9 и AAV8. Трансген, экспрессированный векторами rAAV, представляет собой иммуноадгезин-кодирующую последовательность (201Ig IA). Эксперимент проводили, как описано подробно в примере 10.

Подробное описание изобретения

В данном документе представлены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот нового выделенного аденоассоциированного вируса (AAV), называемый в данном документе AAVhu68, который находится в пределах клады F. AAVhu68 (ранее называемый в данном документе AAV3G2) отличается от другого вируса клады F AAV9 (SEQ ID NO: 5) по двум кодируемым аминокислотам vp1 в положениях 67 и 157, SEQ ID NO: 2. В противоположность этому, другой AAV клады F (AAV9, hu31, hu31) имеет Ala в положении 67 и Ala в положении 157. Представлены новые капсиды AAVhu68 и/или сконструированные капсиды AAV, имеющие валин (Val или V) в положении 157 на основе нумерации SEQ ID NO: 2, и необязательно глутаминовую кислоту (Glu или Е) в положении 67. В определенных вариантах осуществления изобретения отношение белков vp3 в капсиде AAVhu68 по отношению к белкам vp1 и vp2 ниже, чем ранее описано для капсидов AAV9 и других AAV клады F. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 состоит из белков vpl AAVhu68, белков vp2 AAVhu68 и белков vp3 AAVhu68 в соотношении около 1 vp1: от 1 до около 1,5 vp2: от 3 до около 10 vp3. В определенных вариантах осуществления изобретения исходный вирус rAAVhu68 или популяция rAAVhu68 представляет собой композицию, имеющую в среднем примерно всего 60 белков vp1, vp2 и vp3 в капсиде AAVhu68, которые присутствуют в среднем соотношении vp1:vp2:vp3 около 1: около 1: от около 3 до 6. Эти капсиды AAV, описанные в данном документе, пригодны для создания рекомбинантных векторов AAV (rAAV), которые обеспечивают хороший выход и/или эффективность упаковки, и для предоставления векторов rAAV, пригодных для трансдукции ряда различных типов клеток и тканей. Такие клетки и типы тканей включают, без ограничения, легкие, сердце, мышцу, печень, поджелудочную железу, почку, головной мозг, гиппокамп, моторную кору, мозжечок, эпителиальные клетки носа, клетки сердечной мышцы или кардиомиоциты, гепатоциты, эндотелиальные клетки легкого, миоциты, эпителиальные клетки легкого, островковые клетки, ацинарные клетки, почечные клетки и моторные нейроны.

Рекомбинантный AAV или rAAV представляет собой устойчивую к ДНКазе вирусную частицу, содержащую два элемента, капсид AAV и векторный геном, содержащий по меньшей мере не - AAV кодирующие последовательности, упакованные в капсид AAV. Если не указано иное, этот термин может быть использован взаимозаменяемо с фразой вектор rAAV. rAAV представляет собой вирус, дефектный по репликации или вирусный вектор, так как в нем отсутствует какой-либо функциональный ген rep AAV или функциональный ген cap AAV, и он не может создавать потомство. В определенных вариантах осуществления изобретения единственными последовательностями AAV являются последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, обычно расположенные на крайних 5' и 3' концах векторного генома, чтобы обеспечить упаковку гена и регуляторных последовательностей, расположенных между ITR, для упаковки внутрь капсида AAV.

Используемый в данном документе, термин векторный геном относится к последовательности нуклеиновой кислоты, упакованной внутри капсида rAAV, который образует вирусную частицу. Такая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. В приведенных в данном документе примерах векторный геном содержит, как минимум, в направлении от 5' до 3': 5' ITR AAV, кодирующую(ие) последовательность(и) и 3' ITR AAV. Могут быть выбраны ITR из AAV2, источника AAV, отличного от капсида, или отличные от полнораз

- 6 048431 мерных ITR. В определенных вариантах осуществления изобретения ITR получены из того же источника AAV, что и AAV, который обеспечивает функцию rep (репликации) во время продуцирования или транскомплементации AAV. Кроме того, могут использоваться другие ITR. Кроме того, векторный геном содержит регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию генных продуктов. Подходящие компоненты векторного генома обсуждаются более подробно в данном документе.

rAAVhu68 состоит из капсида AAVhu68 и векторного генома. Капсид AAVhu68 представляет собой совокупность гетерогенной популяции белков vp1, гетерогенной популяции белков vp2 и гетерогенной популяции белков vp3. Используемый в данном документе, когда используется для обозначения капсидных белков vp, термин гетерогенный или любая его грамматическая вариация относится к популяции, состоящей из элементов, которые не являются одинаковыми, например, имеющие мономеры (белки) vp1, vp2 или vp3 с различными модифицированными аминокислотными последовательностями. SEQ ID NO: 2 обеспечивает закодированную аминокислотную последовательность белка vp1 AAVhu68.

Капсид AAVhu68 содержит субпопуляции среди белков vp1, среди белков vp2 и среди белков vp3, которые имеют модификации от предсказанных аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 2. Эти субпопуляции включают, как минимум, определенные дезамидированные остатки аспарагина (N или Asn). Например, некоторые субпопуляции содержат по меньшей мере одно, два, три или четыре положения сильно дезамидированных аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин в SEQ ID NO: 2 и необязательно дополнительно содержат другие дезамидированные аминокислоты, причем дезамидирование приводит к изменению аминокислоты и другим необязательным модификациям. SEQ ID NO: 14 обеспечивает аминокислотную последовательность модифицированного капсида AAVhu68, иллюстрирующая положения, которые могут иметь некоторый процент дезамидированных или иным образом модифицированных аминокислот. Различные комбинации этих и других модификаций описаны в данном документе.

Используемый в данном документе термин субпопуляция белков vp относится к группе белков vp, которая имеет по меньшей мере одну общую определенную характеристику и которая состоит по меньшей мере из от одного представителя группы до менее чем всех представителей эталонной группы, если не указано иное. Например, субпопуляция белков vp1 представляет собой по меньшей мере один (1) белок vp1 и менее чем все белки vp1 в собранном капсиде AAV, если не указано иное. Субпопуляция белков vp3 может представлять собой от по меньшей мере одного (1) белка vp3 до менее чем всех белков vp3 в собранном капсиде AAV, если не указано иное. Например, белки vp1 могут представлять собой субпопуляцию белков vp; белки vp2 могут представлять собой отдельную субпопуляцию белков vp, a vp3 представляют собой еще одну дополнительную субпопуляцию белков vp в собранном капсиде AAV. В другом примере белки vp1, vp2 и vp3 могут содержать субпопуляции, имеющие различные модификации, например, по меньшей мере один, два, три или четыре сильно дезамидированных аспарагинов, например в парах аспарагин-глицин.

Если не указано иное, термин сильно дезамидированный относится к по меньшей мере 45% дезамидирования, по меньшей мере 50% дезамидирования, по меньшей мере 60% дезамидирования, по меньшей мере 65% дезамидирования, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 97%, 99%, вплоть до около 100% дезамидирования в положении эталонной аминокислоты по сравнению с предсказанной аминокислотной последовательностью в положении эталонной аминокислоты (например, по меньшей мере 80% аспарагинов по аминокислоте 57 SEQ ID NO: 2 могут быть дезамидированы из расчета общего количества белков vp1 или 20% аспарагинов по аминокислоте 409 SEQ ID NO: 2 могут быть дезамидированы из расчета общего количества белков vp1, vp2 и vp3). Такие проценты могут быть определены с использованием анализа на основе 2D-гель-электрофореза, методов масс-спектрометрии или других подходящих методов.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что дезамидирование по меньшей мере сильно дезамидированных остатков в белках vp в капсиде AAVhu68 в основном является неферментативным по природе, вызванным функциональными группами в капсидном белке, которые дезамидируют выбранные аспарагины и, в меньшей степени, глутаминовые остатки. Эффективная сборка капсида из большинства дезамидированных белков vp1 указывает, что либо эти события происходят после сборки капсида, либо дезамидирование в отдельных мономерах (vp1, vp2 или vp3) хорошо переносится структурно и в значительной степени не влияет на динамику сборки. Обширное дезамидирование в VP1уникальном участке (VP1-u) (~ак 1-137), который обычно считается расположенным внутри до вхождения в клетку, позволяет предположить, что дезамидирование VP может происходить до сборки капсида.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, дезамидирование N может происходить посредством атома азота С-концевого остатка своего остова, что приводит к нуклеофильной атаке на атом углерода амидной группы боковой цепи Asn. Предполагается, что образуется промежуточный сукцинимидный остаток с замкнутым кольцом. Затем остаток сукцинимида проходит быстрый гидролиз, что приводит к получению конечного продукта аспарагиновой кислоты (Asp) или изоаспарагиновой кислоты (IsoAsp). Следовательно, в определенных вариантах осуществления изобретения дезамидирование аспарагина (N или Asn) приводит к Asp или IsoAsp, которые могут взаимно превращаться через сукцинимидное промежуточное соединение, например, как показано ниже.

- 7 048431 о

о

Изоаспарагиновая кислота

Как представлено в данном документе, каждый дезамидированный N из SEQ ID NO: 2 может независимо представлять собой аспарагиновую кислоту (Asp), изоаспарагиновую кислоту (isoAsp), аспартат и/или взаимопревращающуюся смесь Asp и isoAsp, или их комбинации. Может присутствовать любое подходящее соотношение α- и изоаспарагиновой кислоты. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения соотношение может составлять от 10:1 до 1:10 аспарагиновой к изоаспарагиновой, около 50:50 аспарагиновой:изоаспарагиновой, или около 1:3 аспарагиновой:изоаспарагиновой, или другое выбранное соотношение.

В определенных вариантах осуществления изобретения один или более глутаминов (Q) в SEQ ID NO: 2 дезамидируются до глутаминовой кислоты (Glu), т.е. α-глутаминовой кислоты, γ-глутаминовой кислоты (Glu) или смеси α- и γ-глутаминовых кислот, которые могут взаимно превращаться через общий глутаринимидный промежуточный продукт. Может присутствовать любое подходящее соотношение αи γ-глутаминовой кислоты. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения соотношение может составлять от 10:1 до 1:10 α к γ, около 50:50 α: γ или около 1:3 α: γ, или другое выбранное соотношение.

глутаминовая кислота (a-Glu)

изоглутаминовая кислота (γ-Glu)

Таким образом, rAAVhu68 включает в себя субпопуляции в капсиде rAAVhu68 белков vp1, vp2 и/или vp3 с дезамидированными аминокислотами, включая, как минимум, по меньшей мере одну субпопуляцию, содержащую по меньшей мере один сильно дезамидированный аспарагин. Кроме того, другие модификации могут включать изомеризацию, особенно в выбранных положениях остатков аспарагиновой кислоты (D или Asp). В еще других вариантах осуществления изобретения модификации могут включать амидирование в положении Asp.

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 содержит субпопуляции vp1, vp2 и vp3, имеющие по меньшей мере от 4 до по меньшей мере около 25 положений дезамидированных аминокислотных остатков, из которых по меньшей мере от 1 до 10% дезамидированы по сравнению с кодированной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Большинство из них могут быть остатками N. Однако остатки Q также могут быть дезамидированы.

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAV68 дополнительно характеризуется одним или более из следующих. Капсидные белки AAV hu68 содержат: белки vp1 AAVhu68, полученные путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность от 1 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp1, полученные из SEQ ID NO: 1, или белки vp1, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной SEQ ID NO: 1, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность от 1 до 736

- 8 048431

SEQ ID NO: 2; белки vp2 AAVhu68, полученные путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp2, полученные из последовательности, содержащей по меньшей мере нуклеотиды от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1, или белки vp2, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной по меньшей мере нуклеотидам от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, и/или белки vp3 AAVhu68, полученные путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность по меньшей мере из примерно аминокислот от 203 до 736 SEQ ID NO: 2, белки vp3, полученные из последовательности, содержащей по меньшей мере нуклеотиды от 607 до 2211 SEQ ID NO: 1, или белки vp3, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентичной по меньшей мере нуклеотидам от 607 до 2211 SEQ ID NO: 1, которая кодирует предсказанную аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 203 до 736 SEQ ID NO: 2.

Дополнительно или альтернативно обеспечивается капсид AAV, который содержит гетерогенную популяцию белков vp1, необязательно содержащую валин в положении 157, гетерогенную популяцию белков vp2, необязательно содержащую валин в положении 157, и гетерогенную популяцию белков vp3, причем по меньшей мере субпопуляции белков vp1 и vp2 содержат валин в положении 157 и необязательно дополнительно содержат глутаминовую кислоту в положении 67 на основе нумерации капсидного vp1 SEQ ID NO: 2. Дополнительно или альтернативно обеспечивается капсид AAVhu68, который содержит гетерогенную популяцию белков vp1, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, гетерогенной популяции белков vp2, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность из по меньшей мере примерно аминокислот от 138 до 736 SEQ ID NO: 2, и гетерогенную популяцию белков vp3, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере аминокислоты от 203 до 736 SEQ ID NO: 2, причем белки vp1, vp2 и vp3 содержат субпопуляции с модификациями аминокислот.

Белки vp1, vp2 и vp3 AAVhu68 обычно экспрессируются как альтернативные варианты сплайсинга, кодируемые одной и той же последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует полноразмерную аминокислотную последовательность vp1 SEQ ID NO: 2 (аминокислота от 1 до 736). Необязательно, vp1-кодирующая последовательность используется самостоятельно для экспрессии белков vp1, vp2 и vp3. Альтернативно, эта последовательность может быть совместно экспрессирована с одной или более последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотную последовательность vp3 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 203 до 736) без хр1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно ак 137) и/или без хр2-уникальных участков (от примерно ак 1 до примерно ак 202), или комплементарную ей цепь, соответствующую мРНК или тРНК (от примерно нуклеотида 607 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1), или последовательность по меньшей мере от 70% до по меньшей мере 99% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует ак от 203 до 736 SEQ ID NO: 2. Дополнительно или альтернативно, хр1-кодирующая и/или vp2кодирующая последовательность может быть совместно экспрессирована с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность vp2 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 138 до 736) без vp1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно 137), или комплементарной ей цепи, соответствующей мРНК или тРНК (нуклеотид от 412 до 22121 SEQ ID NO: 1), или последовательность по меньшей мере от 70% до по меньшей мере 99% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует примерно ак от 138 до 736 SEQ ID NO: 2.

Как описано в данном документе, rAAVhu68 имеет капсид rAAVhu68, полученный в системе продуцирования, экспрессирующей капсиды из нуклеиновой кислоты AAVhu68, которая кодирует аминокислотную последовательность vp1 SEQ ID NO: 2, и необязательно дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, например кодирующие белок vp3, свободный от участков, уникальных для vp1 и/или vp2.

rAAVhu68, полученный в результате продуцирования с использованием одной последовательности нуклеиновой кислоты vp1, продуцирует гетерогенные популяции белков vp1, белков vp2 и белков vp3. В частности, капсид AAVhu68 содержит субпопуляции среди белков vp1, среди белков vp2 и среди белков vp3, которые имеют модификации от предсказанных аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 2. Эти субпопуляции включают, как минимум, дезамидированные остатки аспарагина (N или Asn). Например, аспарагины в парах аспарагин-глицин сильно дезамидированы.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты vp1 AAVhu68 содержит последовательность SEQ ID NO: 1, или комплементарную ей цепь, например соответствующую мРНК или тРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения белки vp2 и/или vp3 могут экспрессироваться дополнительно или альтернативно из последовательностей нуклеиновых кислот,

- 9 048431 отличных от последовательностей vpl, например для изменения соотношения белков vp в выбранной системе экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения также предоставлена последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность vp3 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 203 до 736) без \р1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно ак 137) и/или без \р2-уникальных участков (от примерно ак 1 до примерно ак 202), или комплементарную ей цепь, соответствующую мРНК или тРНК (от примерно нуклеотида 607 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления изобретения также предоставлена последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность vp2 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 138 до 736) без ур1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно 137), или комплементарной ей цепи, соответствующей мРНК или тРНК (нуклеотид от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1).

Тем не менее, другие последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, могут быть выбраны для использования при получении капсидов rAAVhu68. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или последовательность по меньшей мере 70% до 99% идентична, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 1, которая кодирует SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или последовательность по меньшей мере 70% до 99%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичную от примерно нуклеотида 412 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1, которая кодирует капсидный белок vp2 (примерно ак от 138 до 736) SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты от примерно нуклеотида 607 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1, или последовательность по меньшей мере от 70% до 99%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% идентичную нуклеотидам SEQ ID NO: 1, которая кодирует капсидный белок vp3 (примерно ак от 203 до 736) SEQ ID NO: 2.

Специалист в данной области техники может разработать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие этот капсид AAVhu68, включая ДНК (геномную или кДНК) или РНК (например, мРНК). В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок vp1 AAVhu68, предоставлена в SEQ ID NO: 1. См., также, фиг. 1B-1D. В других вариантах осуществления изобретения может быть выбрана последовательность нуклеиновой кислоты на от 70% до 99,9% идентичная SEQ ID NO: 1, чтобы экспрессировать капсидные белки AAVhu68. В определенных других вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на примерно 75% идентична, по меньшей мере на 80% идентична, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на от 99% до 99,9% идентична SEQ ID NO: 1. Такие последовательности нуклеиновой кислоты могут быть оптимизированы по кодонам для экспрессии в выбранной системе (т.е. типе клеток), которая может быть сконструирована различными способами. Эта оптимизация может быть выполнена с использованием методов, которые доступны в режиме онлайн (например, GeneArt), опубликованных методов или в компании, которая предоставляет услуги по оптимизации кодонов, например DNA2.0 (г. Менло-Парк, штат Калифорния, США). Один способ оптимизации кодонов описан, например, в международной патентной публикации США № WO 2015/012924, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте. См. также, например, патентную публикацию США № 2014/0032186 и патентную публикацию США № 2006/0136184. Соответствующим образом, для продукта модифицируется вся длина открытой рамки считывания (ОРС). Однако в некоторых вариантах осуществления может быть изменен только фрагмент ОРС. Применяя один из этих методов к любой заданной полипептидной последовательности можно использовать частоты встречаемости и получить нуклеотидный фрагмент кодон-оптимизированного кодирующего участка, который кодирует этот полипептид. Доступен ряд опций для выполнения фактических изменений кодонов или для синтезирования кодоноптимизированных кодирующих участков, разработанных в соответствии с тем, как описано в настоящем документе. Такие модификации или синтез могут осуществляться с помощью стандартных и обычных манипуляций молекулярной биологии, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. В одном подходе с помощью стандартных методов синтезируют серию комплементарных олигонуклеотидных пар, каждая из которых имеет 80-90 нуклеотидов в длину и охватывает длину требуемой последовательности. Эти олигонуклеотидные пары синтезируют таким образом, что при ренатурации они образуют двухцепочечные фрагменты из 80-90 пар оснований, содержащие липкие концы, например, каждый олигонуклеотид в паре синтезируется с удлинением на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более оснований за пределы участка, который является комплементарным другому олигонуклеотиду в паре. Одноцепочечные концы каждой пары олигонуклеотидов разработаны с возможностью ренатурации с одноце

- 10 048431 почечным концом другой пары олигонуклеотидов. Олигонуклеотидным парам позволяют ренатурировать, и затем приблизительно пяти или шести из этих двухцепочечных фрагментов позволяют совместно ренатурировать посредством липких одноцепочечных концов, затем их совместно лигируют и клонируют в стандартный бактериальный клонирующий вектор, например вектор ТОРО®, доступный от Invitrogen Corporation, г. Карлсбад, штат Калифорния, США. После этого конструкцию секвенируют с помощью стандартных методов. Несколько из этих конструкций, содержащих 5-6 фрагментов из совместно лигированных фрагментов размером 80-90 пар оснований, т.е. фрагменты из около 500 пар оснований, получают таким образом, что вся требуемая последовательность представлена сериями плазмидных конструкций. Вставки этих плазмид затем разрезаются с помощью соответствующих рестрикционных ферментов и совместно лигируют для образования готовой конструкции. Готовую конструкцию затем клонируют в стандартный бактериальный клонирующий вектор и секвенируют. Дополнительные методы будут очевидны специалисту в данной области техники. Кроме того, коммерчески доступным является синтез генов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аспарагин (N) в парах N-G в белках vp1, vp2 и vp3 AAVhu68 сильно дезамидирован. В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 содержит субпопуляции капсидных белков vp1, vp2 и/или vp3 AAV, имеющие по меньшей мере четыре положения аспарагина (N) в капсидных белках AAVhu68, которые являются сильно дезамидированными. В некоторых вариантах осуществления изобретения около от 20 до 50% пар N-N (исключая триплеты N-N-N) показывают дезамидирование. В определенных вариантах осуществления изобретения первый N является дезамидированным. В определенных вариантах осуществления изобретения второй N является дезамидированным. В определенных вариантах осуществления изобретения дезамидирование составляет между от около 15% до около 25% дезамидирования. Дезамидирование у Q в положении 259 SEQ ID NO: 2 составляет от около 8% до около 42% капсидных белков AAVhu68 vp1, vp2 и vp3 белка AAVhu68.

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид rAAVhu68 дополнительно характеризуется амидированием у D297 белков vp1, vp2 и vp3. В некоторых вариантах осуществления изобретения от около 70% до около 75% D в положении 297 белков vp1, vp2 и/или vp3 в капсиде AAVhu68 амидированы, на основе нумерации SEQ ID NO: 2.

В определенных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один Asp в vp1, vp2 и/или vp3 капсида изомеризуется в D-Asp. Такие изомеры обычно присутствуют в количестве менее чем около 1% Asp в одном или более положениях остатков 97, 107, 384, основанных на нумерации SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения rAAVhu68 имеет капсид AAVhu68, содержащий белки vp1, vp2 и vp3 с субпопуляциями, содержащими комбинации из двух, трех, четырех или более дезамидированных остатков в положениях, указанных в таблице ниже. Дезамидирование в rAAV может быть определено с использованием 2D гель-электрофореза и/или масс-спектрометрии, и/или методов моделирования белка. Хроматография в режиме онлайн может выполняться с колонкой Acclaim РерМар и системой Thermo UltiMate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific), соединенной с Q Exactive HF с источником NanoFlex (Thermo Fisher Scientific). Данные MC получают с использованием метода, зависимого от данных основных 20 ионов, для Q Exactive HF, динамически выбирая наиболее обширные, еще не секвенированные ионы-предшественники из сканирующих просмотров (200-2000 m/z). Секвенирование, выполняемое посредством высокоэнергетичной фрагментации ударной диссоциации с целевым значением 1е5 ионов, определенным с помощью прогнозирующей автоматической регулировки усиления и выделения предшественников, выполнено с окном 4 m/z. Сканирующие просмотры были получены с разрешением 120000 при значении m/z 200. Разрешение для спектров HCD может быть установлено на 30000 при m/z 200 с максимальным временем введения ионов 50 мс и нормированной энергией столкновения 30. Уровень RF S-объектива может быть установлен на 50, чтобы обеспечить оптимальную передачу области m/z, занятой пептидами, полученными в результате расщепления протеазами. Ионыпредшественники могут быть исключены с единичными, не назначенными или шестью и более высокими зарядовыми состояниями из выбора фрагментации. Для анализа полученных данных может использоваться программное обеспечение BioPharma Finder 1.0 (Thermo Fischer Scientific). Для пептидного картирования поиск проводят с использованием базы данных белков FASTA с одним входом с набором карбамидометилирования в качестве фиксированной модификации; и окислением, дезамидированием и фосфорилированием, заданными как переменные модификации, для спектров МС/МС установлены точность определения массы 10 ppm, высокая специфичность протеаз и уровень достоверности 0,8. Примеры подходящих протеаз могут включать, например, трипсин или химотрипсин. Массспектрометрическая идентификация дезамидированных пептидов относительно проста, поскольку дезамидирование увеличивает массу интактной молекулы на +0,984 Да (разница масс между группами -ОН и -NH2). Процент дезамидирования конкретного пептида определяется площадью массы дезамидированного пептида, деленной на сумму площадей дезамидированного и нативного пептидов. Учитывая количество возможных участков дезамидирования, изобарические типы, которые дезамидированы в разных местах, могут совместно мигрировать в одном пике. Следовательно, фрагментные ионы, происходящие из пептидов с несколькими потенциальными сайтами дезамидирования, могут быть использованы для оп

- 11 048431 ределения местоположения или дифференциации множественных сайтов дезамидирования. В этих случаях относительные интенсивности в пределах наблюдаемых изотопных шаблонов могут использоваться для специфического определения относительного содержания различных дезамидированных пептидных изомеров. Этот способ предполагает, что эффективность фрагментации для всех изомерных типов одинакова и не зависит от сайта дезамидирования. Специалисту в данной области техники будет понятно, что может быть использован ряд вариантов этих иллюстративных способов. Например, подходящие масс-спектрометры могут включать, например, квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр (QTOF), такой как Waters Xevo или Agilent 6530, или прибор с орбитальной ловушкой, такой как Orbitrap Fusion или Orbitrap Velos (Thermo Fisher). Подходящие системы жидкостной хроматографии включают, например, систему Acquity UPLC от Waters или системы Agilent (серии 1100 или 1200). Подходящее программное обеспечение для анализа данных может включать, например, MassLynx (Waters), Pinpoint и Pepfinder (Thermo Fischer Scientific), Mascot (Matrix Science), Peaks DB (Bioinformatics Solutions). Другие способы могут быть описаны, например, в X. Jin et al., Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255267, опубликованной онлайн 16 июня 2017 г.

Дезамидирование На основе предсказанного AAVHu68 [SEQ ID NO: 2]	Средний % в расчете на белки VP1/VP2/VP3 в капсиде AAVhu68
Дезамидированный остаток+1 (соседняя АК)	Широкий диапазон процентных содержаний (%)	Узкие диапазоны (%)
N57 (N-G)	от 78 до 100%	от 80 до 100, от 85 до 97
N66 (N-E)	от 0 до 5	0, от 1 до 5
N94 (N-H)	от 0 до 15,	0, от 1 до 15, от 5 до 12, 8
N113 (N-L)	от 0 до 2	0, от 1 до 2
-N253 (N-N)	от 10 до 25	от 15 до 22
Q259 (Q-D	от 8 до 42	от 10 до 40, от 20 до 35
-N270	от 12 до 30	от 15 до 28

- 12 048431

(N-D)
-N304 (N-N) (положение 303 также N)	от 0 до 5	от 1 до 4
N319 (N-I)	от 0 до 5	0, от 1 до 5, от 1 до 3
N329 * (N-G)*(положение 328 также N)	от 65 до 100	от 70 до 95, от 85 до 95, от 80 до 100, от 85 до 100,
N336 (N-N)	от 0 до 100	0, от 1 до 10, от 25 до 100, от 30 до 100, от 30 до 95
-N409 (N-N)	от 15 до 30	от 20 до 25
N452 (N-G)	от 75 до 100	от 80 до 100, от 90 до 100, от 95 до 100,
N477 (N-Y)	от 0 до 8	0, от 1 до 5
N512 (N-G)	от 65 до 100	от 70 до 95, от 85 до 95, от 80 до 100, от 85 до 100,
-N515 (N-S)	от 0 до 25	0, от 1 до 10, от 5 до 25, от 15 до 25
-Q599 (Asn-Q-Gly)	от 1 до 20	от 2 до 20, от 5 до 15
N628 (N-F)	от 0 до 10	0, от 1 до 10, от 2 до 8
N651 (N-T)	от 0 до 3	0, от 1 до 3
N663 (N-K)	от 0 до 5	0, от 1 до 5, от 2 до 4
N709 (N-N)	от 0 до 25	0, от 1 до 22, от 15 до 25
N735	от 0 до 40	0. от 1 до 35, от 5 до 50, от 20 до 35

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 характеризуется наличием капсидных белков, в которых по меньшей мере 45% N-остатков дезамидированы по меньшей мере в одном из положений N57, N329, N452 и/или N512, основанных на нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере, около 80% или по меньшей мере 90% Nостатков в одном или более из этих N-G положений (т.е. N57, N329, N452 и/или N512, основанных на нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2), дезамидированы. В этих и других вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 дополнительно характеризуется наличием популяции белков, в которой от около 1% до около 20% N-остатков имеют дезамидирование в одном или более положениях: N94, N253, N270, N304, N409, N477 и/или Q599, основанных на нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения AAVhu68 содержит по меньшей мере субпопуляцию белков vp1, vp2 и/или vp3, которые дезамидированы в одном или более положениях N35, N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, N735, основанных на нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсидные белки могут иметь одну или более амидированных аминокислот.

- 13 048431

Наблюдаются и другие модификации, большинство из которых не приводит к превращению одного аминокислотного остатка в другой аминокислотный остаток. Необязательно, по меньшей мере один Lys в vp1, vp2 и vp3 капсида является ацетилированным. Необязательно, по меньшей мере один Asp в vp1, vp2 и/или vp3 капсида изомеризуется в D-Asp. Необязательно, по меньшей мере один S (Ser, серии) в vp1, vp2 и/или vp3 капсида является фосфорилированным. Необязательно, по меньшей мере один Т (Thr, треонин) в vp1, vp2 и/или vp3 капсида является фосфорилированным. Необязательно, по меньшей мере один W (Trp, триптофан) в vp1, vp2 и/или vp3 капсида является окисленным. Необязательно, по меньшей мере один М (Met, метионин) в vp1, vp2 и/или vp3 капсида является окисленным. В определенных вариантах осуществления изобретения капсидные белки имеют одно или более фосфорилирований. Например, некоторые капсидные белки vp1 могут быть фосфорилированы в положении 149.

В определенных вариантах осуществления изобретения капсид AAVhu68 содержит гетерогенную популяцию белков vp1, которые являются продуктом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем белки vp1 содержат глутаминовую кислоту (Glu) в положении 67 и/или валин (Val) в положении 157; гетерогенную популяцию белков vp2, необязательно содержащую валин (Val) в положении 157; и гетерогенную популяцию белков vp3. Капсид AAVhu68 содержит по меньшей мере одну субпопуляцию, в которой по меньшей мере 65% аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин расположены в положении 57 белков vp1 и по меньшей мере 70% аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин в положениях 329, 452 и/или 512 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, на основе нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, причем дезамидирование приводит к изменению аминокислоты. Как обсуждено более подробно в данном документе, дезамидированные аспарагины могут быть дезамидированы до аспарагиновой кислоты, изоаспарагиновой кислоты, пары взаимопревращающихся аспарагиновой кислоты/изоаспарагиновой кислоты или их комбинаций. В определенных вариантах осуществления изобретения rAAVhu68 дополнительно характеризуется одним или более из следующих: (а) каждый из белков vp2 независимо представляет собой продукт последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере белок vp2 SEQ ID NO: 2; (b) каждый из белков vp3 независимо представляет собой продукт последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере белок vp3 SEQ ID NO: 2; (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белки vp1, представляет собой SEQ ID NO: 1, или последовательность по меньшей мере от 70% до по меньшей мере 99% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Необязательно, эта последовательность используется отдельно для экспрессии белков vp1, vp2 и vp3. Альтернативно, эта последовательность может быть совместно экспрессирована с одной или более последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотную последовательность vp3 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 203 до 736) без vp1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно ак 137) и/или без хр2-уникальных участков (от примерно ак 1 до примерно ак 202), или комплементарную ей цепь, соответствующую мРНК или тРНК (от примерно нуклеотида 607 до примерно нуклеотида 2211 SEQ ID NO: 1), или последовательность по меньшей мере от 70% до по меньшей мере 99% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует ак от 203 до 736 SEQ ID NO: 2. Дополнительно или альтернативно, vp1-кодирующая и/или vp2-кодирующая последовательность может быть совместно экспрессирована с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность vp2 AAVhu68 SEQ ID NO: 2 (примерно ак от 138 до 736) без хр1-уникального участка (от примерно ак 1 до примерно 137), или комплементарной ей цепи, соответствующей мРНК или тРНК (нуклеотид от 412 до 2211 SEQ ID NO: 1), или последовательность по меньшей мере от 70% до по меньшей мере 99% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует примерно ак от 138 до 736 SEQ ID NO: 2.

Дополнительно или альтернативно, капсид rAAVhu68 содержит, по меньшей мере субпопуляцию белков vp1, vp2 и/или vp3, которые дезамидированы в одном или более положениях N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N512, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, основанных на нумерации SEQ ID NO: 2, или их комбинациях; (е) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию белков vp1, vp2 и/или vp3, которые содержат от 1% до 20% дезамидирования в одном или более положениях N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, основанных на нумерации SEQ ID NO: 2, или их комбинациях; (f) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию vp1, в которой от 65% до 100% N в положении 57 белков vp1, на основе нумерации SEQ ID NO: 2, дезамидировано; (g) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию белков vp1, в которой от 75% до 100% N в положении 57 белков vp1 дезамидировано; (h) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 80% до 100% N в положении 329, основанном на нумерации SEQ ID NO: 2, дезамидировано; (i) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 80% до 100% N в положении 452, основанном на нумерации SEQ ID NO:

- 14 048431

2, дезамидировано; (j) капсид rAAVhu68 содержит субпопуляцию белков vpl, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 80% до 100% N в положении 512, основанном на нумерации SEQ ID NO: 2, дезамидировано; (k) rAAV содержит всего около 60 капсидных белков в соотношении около 1 vp1 к от около 1 до 1,5 vp2 к от 3 до 10 белков vp3; (l) rAAV содержит всего около 60 капсидных белков в соотношении около 1 vp1 к около 1 vp2 к от 3 до 9 белков vp3.

В определенных вариантах осуществления изобретения AAVhu68 модифицируют, чтобы изменить глицин в паре аспарагин-глицин с целью уменьшения дезамидирования. В других вариантах осуществления изобретения аспарагин заменяется другой аминокислотой, например глутамином, который дезамидируется с более низкой скоростью; или аминокислотой, в которой отсутствуют амидные группы (например, глутамин и аспарагин содержат амидные группы); и/или аминокислотой, в которой отсутствуют аминогруппы (например, лизин, аргинин и гистидин содержат амидные группы). Используемые в данном документе аминокислоты, в которых отсутствуют амидные или аминные боковые группы, относятся, например, к глицину, аланину, валину, лейцину, изолейцину, серину, треонину, цистину, фенилаланину, тирозину или триптофану и/или пролину. Модификации, такие как описанные, могут быть в одной, двух или трех парах аспарагин-глицин, обнаруженных в кодированной аминокислотной последовательности AAVhu68. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие модификации не производятся во всех четырех парах аспарагин-глицин. Таким образом, предложен способ уменьшения дезамидирования AAVhu68 и/или сконструированных вариантов AAVhu68, имеющих более низкие скорости дезамидирования. Дополнительно или альтернативно, одну или более других амидных аминокислот можно заменять неамидной аминокислотой для уменьшения дезамидирования AAVhu68.

Эти модификации аминокислот могут быть сделаны обычными методами генной инженерии. Например, может быть создана последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая модифицированные vp-кодоны AAVhu68, в которой от одного до трех кодонов, кодирующих глицин в положении 58, 330, 453 и/или 513 в SEQ ID NO: 2 (пара аргинин - глицин), модифицированы, чтобы кодировать аминокислоты, не являющиеся глицином. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая модифицированные аргининовые кодоны, может быть сконструирована с одной-тремя парами аргинин-глицин, расположенными в положении 57, 329, 452 и/или 512 в SEQ ID NO: 2, так что модифицированный кодон кодирует аминокислоту, отличную от аргинина. Каждый модифицированный кодон может кодировать разные аминокислоты. Альтернативно, один или более измененных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти модифицированные последовательности нуклеиновых кислот AAVhu68 можно использовать для получения мутанта rAAVhu68, имеющего капсид с более низким дезаминированием, чем нативный капсид hu68. Такой мутантный rAAVhu68 может иметь пониженную иммуногенность и/или повышенную стабильность при хранении, в частности при хранении в форме суспензии. Используемый в данном документе термин кодон относится к трем нуклеотидам в последовательности, которая кодирует аминокислоту.

Используемый в данном документе, термин кодированная аминокислотная последовательность относится к аминокислоте, которая прогнозируется на основе трансляции известного кодона ДНК эталонной последовательности нуклеиновой кислоты, которая транслируется в аминокислоту. Следующая таблица иллюстрирует кодоны ДНК и двадцать обычных аминокислот, показывая как однобуквенный код (SLC), так и трехбуквенный код (3LC).

- 15 048431

Аминокислота	SLC	3 LC	Кодоны ДНК
Изолейцин	I	Не	ATT, АТС, ΑΤΑ
Лейцин	L	Leu	CTT, СТС, СТА, CTG, ТТА, TTG
Валин	V	Vai	GTT, GTC, GTA, GTG
Фенилаланин	F	Phe	ТТТ, ТТС
Метионин	М	Met	ATG
Цистеин	С	Cys	TGT, TGC
Аланин	А	Ala	GCT, GCC, GCA, GCG
Глицин	G	Gly	GGT, GGC, GGA, GGG
Пролин	Р	Pro	ССТ, ССС, CCA, CCG
Треонин	Т	Thr	ACT, ACC, АСА, ACG
Серин	S	Ser	ТСТ, ТСС, ТСА, TCG, AGT, AGC
Тирозин	Y	Tyr	ТАТ, ТАС
Триптофан	W	Trp	TGG
Глутамин	Q	Gin	САА, CAG

Аспарагин	N	Asn	AAT, AAC
Г истидин	Н	His	CAT, CAC
Глутаминовая кислота	Е	Glu	GAA, GAG
Аспарагиновая кислота	D	Asp	GAT, GAC
Лизин	К	Lys	AAA, AAG
Аргинин	R	Arg	CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Стоп-кодоны	Стоп		TAA, TAG, TGA

В некоторых вариантах осуществления изобретения могут применяться капсиды AAVhu68. Например, такие капсиды могут использоваться для создания моноклональных антител и/или создания реагентов, пригодных в анализах для мониторинга уровней концентрации AAVhu68 у пациентов, получающих генную терапию. Методы получения пригодных антител против AAVhu68, мечения таких антител или пустых капсидов и подходящие форматы анализа известны специалистам в данной области техники.

В определенных вариантах осуществления изобретения в данном документе представлена последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 или последовательность по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99%, которая кодирует аминокислотную последовательность vp1 SEQ ID NO: 2 с модификацией (например, дезамидированная аминокислота), как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность vp1 воспроизведена в SEQ ID NO: 14.

Используемый в данном документе термин клада в том смысле, как он относится к группам AAV, относится к группам AAV, которые филогенетически связаны друг с другом, как определено с использованием алгоритма Neighbor-Joining по бутстреп-значению по меньшей мере 75% (из по меньшей мере 1000 повторов) и величине расстояния коррекции Пуассона не более чем 0,05, на основе выравнивания аминокислотной последовательности vp1 AAV. Алгоритм Neighbor-Joining был описан в литературе. См., например, М. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000). Доступны компьютерные программы, которые можно использовать для реализации этого

- 16 048431 алгоритма. Например, программа MEGA v2.1 реализует модифицированный метод Nei-Gojobori. Используя эти методики и компьютерные программы, а также последовательность капсидного белка vp1 AAV, специалист в данной области может легко определить, содержится ли выбранный AAV в одной из указанных в данном документе клад, в другой кладе или находится за пределами этих клад. См., например, G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10: 6381-6388, который идентифицирует клады А, В, С, D, E и F и предоставляет последовательности нуклеиновых кислот нового AAV, регистрационные номера GenBank от AY530553 до AY530629. См., также, WO 2005/033321.

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет сконструированную молекулу, содержащую спейсерную последовательность между кодирующей последовательностью vp1 AAVhu68 и последовательностями, кодирующими повтор AAVhu68. Эта последовательность кодирования: atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. Кодирующую последовательность для rep52 из AAVhu68 воспроизведена в SEQ ID NO: 3. Последовательность белка rep52 воспроизведена в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления изобретения обеспечивается способ увеличения выхода rAAV и, таким образом, увеличения количества rAAV, который присутствует в жидкости супернатанта до лизиса клеток или без необходимости его проведения. Этот способ включает в себя конструирование гена УЛкапсида AAV для экспрессии капсидного белка, имеющего Glu в положении 67, а не на Val в положении 157, основанных на выравнивании с нумерацией аминокислот капсидного белка vp1 AAVhu68. В других вариантах осуществления изобретения способ включает в себя конструирование гена капсида VP1 AAVhu68 для экспрессии капсидного белка, имеющего Val в положении 157, а не Glu в положении 67. Такой другой AAV может быть легко выбран из другой клады F AAV, или AAV в кладе А, В, С, D или Е. В определенных вариантах осуществления изобретения AAV выбирают из клады С, D, Е, или F. В других вариантах осуществления изобретения AAV выбирают из клады С, D или Е.

В других вариантах осуществления изобретения способ включает увеличение выхода rAAV и, таким образом, увеличение количества rAAV, который присутствует в жидкости супернатанта до лизиса клеток или без необходимости его проведения. Этот способ включает в себя конструирование гена УЛкапсида AAV для экспрессии капсидного белка, имеющего Glu в положении 67, Val в положении 157 или оба варианта, основанных на выравнивании с нумерацией аминокислот капсидного белка vp1 AAVhu68. В других вариантах осуществления изобретения способ включает в себя конструирование гена VP2 капсида для экспрессии капсидного белка, имеющего Val в положении 157. В других вариантах осуществления изобретения rAAV имеет модифицированный капсид, содержащий оба варианта Glu в положении 67 и Val в положении 157 капсидных белков vp1 и vp2.

В других вариантах осуществления изобретения могут быть сконструированы AAVhu68, имеющие Ser, Gly, Ser или Thr в положении 67, согласно нумерации vp1 [SEQ ID NO: 2], сохраняя при этом Val в положении 157. В других дополнительных вариантах осуществления изобретения могут быть сконструированы AAVhu68, имеющие Не или Leu в положении 157, согласно нумерации vp1 [SEQ ID NO: 2]. В еще одном варианте осуществления изобретения могут быть сконструированы AAVhu68, имеющие Ser, Gly, Ser или Thr в положении 67 и Не или Leu в положении 157, согласно нумерации vp1 [SEQ ID NO: 2].

В другом варианте осуществления изобретения представлен способ упаковки трансгена в AAV клады F, который обеспечивает по меньшей мере увеличение выхода упакованного вектора на 15% по сравнению с AAV9, причем указанный способ включает в себя: культивирование культуры клетки-хозяина в соответствии с подходящими условиями. В некоторых вариантах осуществления изобретения увеличение является увеличением выхода по меньшей мере на 90%. В других вариантах осуществления изобретения увеличение является увеличением выхода по меньшей мере на 200%.

При сравнении между AAVhu68 и AAVrh10 было обнаружено, что AAVhu68 обеспечивает лучшую эффективность трансдукции, чем AAVrh10 при низкой дозе (например, около 1х 109 GC) после интрацеребровентрикулярного введения. В еще одном сравнении между AAVhu68 и AAV9 было обнаружено, что AAVhu68 обеспечивает лучшую эффективность трансдукции, чем AAV9 в мозжечке, моторной коре и гиппокампе головного мозга (например, при около 1x1011 GC) после интрацеребровентрикулярного введения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения данное изобретение обеспечивает вектор AAVhu68, содержащий векторный геном, который экспрессирует антитело, направленное против рецептора HER2. Такой вектор является пригодным для лечения и/или профилактики раковых заболеваний.

Используемый в данном документе термин капсид AAV9 представляет собой самоорганизующийся капсид AAV, состоящий из множества белков vp AAV9. Белки vp AAV9 обычно экспрессируются как альтернативные варианты сплайсинга, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5 или последовательностью по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% к ней, которая кодирует аминокислотную последовательность vp1 SEQ ID NO: 6 (доступ в GenBank: AAS99264). Эти варианты сплайсинга приводят к белкам различной длины SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид AAV9 включает в себя AAV, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% идентична AAS99264 или на

- 17 048431

99% идентична SEQ ID NO: 6. См., также US7906111 WO 2005/033321. Используемые в данном документе варианты AAV9 включают варианты, описанные, например, в WO2016/049230, US 8927514, US 2015/0344911 и US 8734809.

Описаны способы получения капсида, кодирующие его последовательности, и способы получения вирусных векторов rAAV. См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) и US 2013/0045186 A1.

Термин существенная гомология или значительное сходство, когда речь идет к нуклеиновой кислоте или ее фрагменте, указывает на то, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью), имеется идентичность нуклеотидной последовательности по меньшей мере, от около 95 до 99% выровненных последовательностей. Предпочтительно, гомология приходится на полноразмерную последовательность, или их открытую рамку считывания, или другого подходящего фрагмента, который составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. Примеры подходящих фрагментов описаны в данном документе.

Термин идентичность последовательности, процент идентичности последовательности или процент идентичности в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются аналогичными при выравнивании на максимальное совпадение. Сравнение идентичности последовательностей может выполняться по всей длине генома, желательна полная длина последовательности, кодирующей ген, или фрагмента из по меньшей мере примерно от 500 до 5000 нуклеотидов. Однако также может быть необходима идентичность между более мелкими фрагментами, например из по меньшей мере около девяти нуклеотидов, как правило, по меньшей мере примерно от 20 до 24 нуклеотидов, по меньшей мере примерно от 28 до 32 нуклеотидов, по меньшей мере около 36 или более нуклеотидов. Аналогичным образом, процент идентичности последовательности могут быть легко определены для аминокислотных последовательностей, по всей длине белка или его фрагмента. Соответственно, фрагмент составляет по меньшей мере 8 аминокислот в длину и может быть вплоть до около 700 аминокислот. Примеры подходящих фрагментов описаны в данном документе.

Термин существенная гомология или значительное сходство когда речь идет об аминокислотах или их фрагментах, указывает на то, что при оптимальном выравнивании с соответствующими вставками или делециями аминокислот с другой аминокислотой (или ее комплементарной цепью) имеется идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере на от около от 95 до 99% выровненных последовательностей. Предпочтительно, гомология распределяется по всей последовательности или ее белку, например белку cap, белку rep или его фрагменту, который составляет в длину по меньшей мере 8 аминокислот или, более желательно, по меньшей мере 15 аминокислот. Примеры подходящих фрагментов описаны в данном документе.

Под термином сильно консервативны подразумевается по меньшей мере 80% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности, а более предпочтительно, более чем 97% идентичности. Идентичность легко определяется специалистом в данной области техники, путем обращения к алгоритмам и компьютерным программам, известным специалистам в данной области техники.

Как правило, когда речь идет об идентичности, гомологии или сходстве между двумя различными аденоассоциированными вирусами, идентичность, гомология или сходство определяются по отношению к выровненным последовательностям. Выровненные последовательности или выравнивания относятся к множеству нуклеотидных последовательностей или белковых (аминокислотных) последовательностей, часто содержащих коррекции для отсутствующих или дополнительных оснований или аминокислот по сравнению с эталонной последовательностью. В примерах выравнивания AAV выполняются с использованием в качестве опорной точки опубликованных последовательностей AAV9. Выравнивания выполняются с помощью любой из разнообразных общедоступных или коммерчески доступных программ для множественного выравнивания последовательностей. К примерам таких программ относится Clustal Omega, Clustal W, CAP Sequence Assembly, MAP и МЕМЕ, доступ к которым можно получить через вебсерверы в интернете. Специалистам в данной области техники известны другие источники таких программ. Альтернативно, также применяются утилиты Vector NTI. В данной области техники также известен ряд алгоритмов, которые могут использоваться для измерения идентичности нуклеотидных последовательностей, включая те алгоритмы, которые входят в описанные выше программы. В качестве другого примера полинуклеотидные последовательности могут сравниваться с помощью Fasta™ -программы в GCG версии 6.1. Fasta™ обеспечивает выравнивания и процентную идентичность последовательностей участков наилучшего перекрытия между запрашиваемой и искомой последовательностями. Например, процент идентичности последовательностей между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с использованием Fasta™ с его параметрами по умолчанию (размер слова 6 и коэффициент NOPAM для матрицы оценки), как это предусмотрено в GCG версии 6.1, включенной в данный документ посредством ссылки. Программы выравнивания множественных последовательностей также доступны для аминокислотных последовательностей, например программы Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, МЕМЕ и Match-Box. Как правило, любая

- 18 048431 из этих программ используется с настройками по умолчанию, хотя специалист в данной области техники может при необходимости менять эти настройки. Альтернативно, специалист в данной области техники может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, которая обеспечивает по меньшей мере такой уровень идентичности или выравнивания, который обеспечивается указанными алгоритмами и программами. См., например, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., A comprehensive comparison of multiple sequence alignments, 27(13):2682-2690 (1999).

I. Векторы rAAV.

Как было указано выше, последовательности и белки нового AAVhu68 пригодны в производстве rAAV, а также пригодны в производстве рекомбинантных векторов AAV, которые могут быть антисмысловыми векторами доставки, векторами для генной терапии или вакцинными векторами. Кроме того, сконструированные капсиды AAV, описанные в данном документе, например те, которые имеют мутантные аминокислоты в положении 67, 157 или обоих положениях относительно нумерации капсидного белка vp1 в SEQ ID NO: 2, могут быть использованы для конструирования векторов rAAV для доставки ряда подходящих молекул нуклеиновых кислот в клетки-мишени и ткани.

Геномные последовательности, которые упакованы в капсид AAV и доставлены в клетку-хозяина, как правило, состоят из, как минимум, трансгена и его регуляторных последовательностей и инвертированных концевых повторов AAV (ITR). И одноцепочечный AAV, и само-комплементарный (sc) AAV охватываются rAAV. Трансген представляет собой кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, гетерологичную по отношению к векторной последовательности, которая кодирует полипептид, белок, функциональную молекулу РНК (например, микроРНК, ингибитор микроРНК) или другой генный продукт, представляющий интерес. Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторными компонентами таким образом, что обеспечивает транскрипцию, трансляцию и/или экспрессию трансгена в клетке ткани-мишени.

Последовательности AAV вектора обычно содержат действующие в цис-положении 5'- и 3'последовательности инвертированных терминальных повторов (см, например, В. J. Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). Последовательности ITR содержат в длину около 145 п.о.. Предпочтительно, по существу, в молекуле используются целые последовательности, кодирующие ITR, хотя допустима некоторая степень незначительной модификации этих последовательностей. Возможность модифицировать эти последовательности ITR находится в пределах данной области техники. (См., например, такие тексты, как Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); and K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)). Пример такой молекулы, используемой в данном изобретении, представляет собой действующую в цисположении плазмиду, содержащую трансген, в котором выбранная трансгенная последовательность и связанные с ней регуляторные элементы фланкированы 5'- и 3'-последовательностями ITR AAV. В одном варианте осуществления изобретения ITR взяты из AAV, отличного от того, который предоставляет капсид. В одном варианте осуществления изобретения последовательности ITR происходят из AAV2. Была описана сокращенная версия 5 'ITR, называемая AITR, в которой удалены D-последовательность и сайт концевого разделения (trs). В других вариантах осуществления изобретения используются полноразмерные 5'- и 3'-ITR AAV. Однако могут быть выбраны ITR из других источников AAV. Если источник ITR взят из AAV2, а капсид AAV - из другого источника AAV, результирующий вектор может быть назван псевдотипированным. Однако могут быть подходящими другие конфигурации этих элементов.

В дополнение к основным элементам, указанным выше для рекомбинантного вектора AAV, вектор также включает в себя необходимые традиционные контрольные элементы, которые функционально связаны с трансгеном таким образом, который обеспечивает его транскрипцию, трансляцию и/или экспрессию в клетке, трансфицированной плазмидным вектором или инфицированной вирусом, полученными в данном изобретении. Как используется в данном документе, функционально связанные последовательности включают в себя как регулирующие экспрессию последовательности, которые являются смежными с представляющим интерес геном, так и регулирующими экспрессию последовательностями, которые действуют в транс-положении или дистанционно для контроля представляющего интерес гена.

Регуляторные контролирующие элементы, как правило, содержат промоторную последовательность, как часть регулирующих экспрессию последовательностей, например расположенную между выбранной 5' последовательностью ITR и кодирующей последовательностью. Конститутивные промоторы, регулируемые промоторы [см., например, WO 2011/126808 и WO 2013/04943], тканеспецифичные промоторы или промотор, чувствительный к физиологическим сигналам, могут быть использованы в векторах, описанных в данном документе. Промотор(-ы) может(могут) быть выбран(-ы) из различных источников, например, немедленный ранний энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV), ранний энхансер/промотор SV40, промотор JC-полимовируса, промоторы основного белка миелина (MBP) или глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), промотор, связанный с латентностью вируса простого герпеса (HSV-1) (LAP), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), нейрон-специфический промотор (NSE), промотор фактора роста тромбоцитов (PDGF), hSYN, промотор меланин-концентрирующего гормона (МСН), СВА, промотор матричного металлопротеина (МРР) и промотор куриного бета-актина. В дополнение к промотору вектор могут содержать одну или более дру

- 19 048431 гих подходящих последовательностей инициации, терминации транскрипции, энхансерных последовательностей, сигналов эффективного процессирования РНК, таких как сигналы сплайсинга и полиаденилирования (полиА); последовательностей, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК, например WPRE; последовательностей, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козак); последовательностей, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательностей, которые усиливают секрецию кодируемого продукта. Примером подходящего энхансера является энхансер CMV. Другие подходящие энхансеры включают те, которые являются подходящими для желательных признаков ткани-мишени. В одном варианте осуществления изобретения экспрессионная кассета содержит один или более энхансеров экспрессии. В одном варианте осуществления изобретения экспрессионная кассета содержит два или более энхансеров экспрессии. Эти энхансеры могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга. Например, энхансер может включать немедленным ранний энхансер CMV. Этот энхансер может присутствовать в двух копиях, которые расположены рядом друг с другом. Альтернативно, двойные копии энхансера могут быть разделены одной или более последовательностями. В еще одном варианте осуществления изобретения экспрессионная кассета дополнительно содержит интрон, например интрон куриного бета-актина. Другие подходящие интроны включают известные в данной области техники, например, такие как описанные в WO 2011/126808. Примеры подходящих последовательностей полиА включают, например, SV40, SV50, бычьего гормона роста (bGH), человеческого гормона роста и синтетические полиА.

Необязательно, одна или более последовательностей могут быть выбраны для стабилизации мРНК. Примером такой последовательности является модифицированная последовательность WPRE, которая может быть сконструирована выше от последовательности полиА и ниже от кодирующей последовательности [см., например, MA Zanta-Boussif et al., Gene Therapy (2009) 16: 605-619.

Эти rAAV особенно хорошо подходят для доставки генов в терапевтических целях, а также для иммунизации, в том числе для индуцирования защитного иммунитета. Кроме того, композиции по данному изобретению также могут быть использованы для получения желаемого генного продукта in vitro. Для продукции in vitro, желаемый продукт (например, белок) может быть получен из желаемой культуры после трансфекции клеток-хозяев с помощью rAAV, содержащего молекулу, кодирующую желаемый продукт, и культивирования культуры клеток в условиях, обеспечивающих экспрессию. Экспрессированный продукт может быть, при желании, затем очищен и выделен. Подходящие способы трансфекции, культивирования клеток, очистки и выделения известны специалистам в данной области техники.

В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV или композиция, как представлено в данном документе, не содержат антитела против гриппа или иммуноглобулиновой конструкции. В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV или композиция, как представлено в данном документе, не содержат последовательность, кодирующую SMN.

Терапевтические гены и генные продукты

Пригодные продукты, кодируемые трансгеном, включают множество генных продуктов, которые заменяют дефектный или дефицитный ген, инактивируют или нокаутируют, или выполнят нокдаун, или уменьшат экспрессию гена, который экспрессируется на нежелательно высоком уровне, или доставляют генный продукт, который обладает желаемым терапевтическим эффектом. В большинстве вариантов осуществления изобретения терапия будет соматической генной терапией, т.е. переносом генов в клетку организма, которая не производит сперму или яйцеклетку. В определенных вариантах осуществления изобретения экспрессируемые трансгенами белки имеют последовательность нативных последовательностей человека. Тем не менее, в других вариантах осуществления изобретения экспрессируются синтетические белки. Такие белки могут быть предназначена для лечения людей или, в других вариантах осуществления изобретения предназначены для лечения животных, включая домашних животных, таких как популяции собачьих или кошачьих, или для лечения скота или других животных, которые вступают в контакт с человеческими популяциями.

Примеры подходящих генных продуктов могут включать в себя те, которые связаны с семейной гиперхолестеринемией, мышечной дистрофией, кистозным фиброзом и редкими или орфанными заболеваниями. Примеры такого редкого заболевания могут включать в себя, среди других, спинальную мышечную атрофию (SMA), болезнь Хантингтона, синдром Ретта (например, с метил-CpG-связывающим белком 2 (МеСР2); UniProtKB - P51608), боковой амиотрофический склероз (БАС), мышечную дистрофию типа Дюшенна, атаксию Фридрихса (например, фратаксин), програнулин (PRGN) (связанный с дегенерацией мозга не связанной с болезнью Альцгеймера, в том числе лобно-височной деменцией (FTD), прогрессивной небеглой афазией (PNFA) и семантической деменцией). См., например, www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php;rarediseases.info.nih.gov/diseases.

Примеры подходящих генов могут включать в себя, например, гормоны и факторы роста и дифференцировки, в том числе, без ограничения, инсулин, глюкагон, глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1), гормон роста (ГР), паратиреоидный гормон (ПТГ), фактор, высвобождающий гормон роста (GRF), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтины, ангиостатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ), эритропоэтин (ЭПО) (в том числе, например, человеческий,

- 20 048431 собачий или кошачий ЭПО), фактор роста соединительной ткани (CTGF), нейтрофильные факторы, в том числе, например, основной фактор роста фибробластов (оФРФ), кислотный фактор роста фибробластов (кФРФ), эпидермальный фактора роста (ЭФР), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиновые факторы роста I и II (ИФР-1 и ИФР-II), любой из суперсемейства трансформирующих факторов роста α, в том числе TGFa, активины, ингибины, или любой из костных морфогенетических белков (BMP) BMP 1-15, любой из семейства факторов дифференцировки хереглуин/ нейрегулин/BCC/neu (NDF) из факторов роста, фактор роста нервов (ФРН), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротрофины NT-3 и NT-4/5, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF), неуртурин, агрин, любой из семейства семафоринов/коллапсинов, нетрин-1 и нетрин-2, фактор роста гепатоцитов (HGF), эфрины, ноггин, sonic hedgehog и тирозингидроксилаза.

Другие пригодные трансгенные продукты включают белки, которые регулируют иммунную систему, включая, без ограничения, цитокины и лимфокины, такие как тромбопоэтин (ТПО), интерлейкины (ИЛ) ИЛ-1 до ИЛ-36 (в том числе, например, интерлейкины человека ИЛ-1, ИЛ-1а, ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-18, ИЛ-31, ИЛ-35), моноцитарный хемоаттрактантный белок, лейкоз-ингибирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, Fas-лиганд, факторы некроза опухолей α и β, интерфероны α, β и γ, фактор стволовых клеток, лиганд flk-2/flt3. Генные продукты, полученные с помощью иммунной системы, также могут быть пригодны в данном изобретении. Они включают в себя, без ограничений, иммуноглобулины IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерные иммуноглобулины, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, Тклеточные рецепторы, химерные Т-клеточные рецепторы, одноцепочечные рецепторы Т-клеток, молекулы ГКГС класса I и класса II, а также сконструированные иммуноглобулины и молекулы ГКГС. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения антитела к rAAV могут быть предназначены для доставки собачьих или кошачьих антител, например, таких как анти-IgE, анти-ИЛ31, анти-CD20, анти-NGF, анти-GnRH. Пригодные генные продукты также включают регуляторные белки комплемента, такие как регуляторные белки комплемента, мембранный кофакторный белок (МСР), фактор ускорения распада (DAF), CR1, CF2, CD59 и ингибитор эстеразы C1 (C1-INH).

Тем не менее другие пригодные генные продукты включают в себя любой из рецепторов гормонов, факторов роста, цитокинов, лимфокинов, регуляторных белков и белков иммунной системы. Изобретение охватывает рецепторы для регуляции холестерина и/или липидной модуляции, в том числе рецептор липопротеидов низкой плотности (ЛГГНП), рецептор липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), рецептор липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП) и фагоцитарный рецептор. Изобретение также охватывает генные продукты, такие как представители суперсемейства рецепторов стероидных гормонов, включая глюкокортикоидные рецепторы и эстрогенные рецепторы, рецепторы витамина D и другие ядерные рецепторы. Кроме того, пригодные продукты включают факторы транскрипции, такие как jun, fos, max, mad, фактор ответа сыворотки (SRF), АР-1, АР2, myb, MyoD и миогенин, содержащие ETS-бокс белки, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, связывающие ССААТ-бокс белки, регуляторный фактор интерферона (IRF-1), белок опухоли Вильмса, ETSсвязывающий белок, STAT, связывающие GATA-бокс белки, например GATA-3, и семейство крылатых спиральных белков Forkhead.

Другие пригодные генные продукты включают в себя, карбамоил синтетазу I, орнитин транскарбамилазу (ОТК), аргиносукцинат синтетазу, аргиносукцинат лиазу (ASL) для лечения дефицита аргиносукцинат лиазы, аргиназу, фумарилацетат гидролазу, фенилаланин гидроксилазу, альфа-1-антитрипсин, резус альфа-фетопротеин (АФП), резус хорионический гонадотропин (ХГ), глюкозо-6-фосфатазу, порфобилиноген дезаминазу, цистатион бета-синтазу, декарбоксилазу кетокислот с разветвленной цепью, альбумин, изовалерил-КоА-дегидрогеназу, пропионил-КоА-карбоксилазу, метилмалонил-КоА мутазу, глутарил-КоА-дегидрогеназу, инсулин, бета-глюкозидазу, пируват карбоксилат печеночную фосфорилазу, киназу фосфорилазы, глицин декарбоксилазу, Н-белок, Т-белок, последовательность трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) и продукт гена дистрофина [например, мини- или микро-дистрофин]. Тем не менее другие пригодные генные продукты включают ферменты, такие как те, что могут быть пригодны в заместительной терапии ферментами, что полезно в различных условиях, в результате недостаточной активности фермента. Так, например, ферменты, которые содержат маннозо-6-фосфат, могут быть использованы в видах терапии против лизосомных болезней накопления (например, подходящий ген, включает в себя тот, который кодирует β-глюкуронидазу (GUSB)).

В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV может быть использован в системах редактирования генов, эта система может включать один rAAV или совместное введение нескольких исходных rAAV. Например, rAAV может быть сконструирован для доставки SpCas9, SaCas9, ARCUS, Cpf1 и других подходящих конструкций редактирования генов.

Тем не менее другие полезные генные продукты включают те, которые используются для лечения гемофилии, в том числе гемофилии В (в том числе фактор IX) и гемофилии А (в том числе фактор VIII и его варианты, такие как легкая цепи и тяжелая цепи гетеродимера и В-удаленный домен; патент США № 6200560 и патент США № 6221349). В некоторых вариантах осуществления изобретения миниген содер

- 21 048431 жит первые 57 пар оснований тяжелой цепи фактора VIII, который кодирует сигнальную последовательность из 10 аминокислот, а также последовательность полиаденилирования гормона роста человека (hGH). В альтернативных вариантах осуществления изобретения миниген дополнительно содержит домены А1 и А2, а также 5 аминокислот из N-конца домена В и/или 85 аминокислот из С-конца домена В, а также домены A3, С1 и С2. В еще других вариантах осуществления изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь фактора VIII, обеспечиваются в одном минигене, разделенным 42 нуклеиновыми кислотами, кодирующими 14 аминокислот домена В [патент США N 6200560].

Другие пригодные генные продукты включают не встречающиеся в природе полипептиды, такие как химерные или гибридные полипептиды, включающие в себя не встречающуюся в природе аминокислотную последовательность, содержащую вставки, делеции или замены аминокислот. Так, например, одноцепочечные сконструированные иммуноглобулины могут быть пригодными для некоторых пациентов с ослабленным иммунитетом. Другие типы не встречающихся в природе последовательностей генов включают антисмысловые молекулы и каталитические нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, которые могут быть использованы для уменьшения сверхэкспрессии мишени.

Снижение и/или модуляция экспрессии гена являются особенно желательными для лечения гиперпролиферативных состояний, для которых характерны гиперпролиферирующие клетки, таких как рак и псориаз. Полипептиды-мишени включают те полипептиды, которые производятся исключительно или на более высоком уровне в гиперпролиферативных клетках по сравнению с нормальными клетками. Антигены-мишени включают полипептиды, кодируемые онкогенами, такими как myb, myc, fyn, и геном транслокации bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk и EGRF. В дополнение к онкогенным продуктам в качестве антигенов-мишеней, полипептиды-мишени для противоракового лечения и защитных режимов включают вариабельные участки антител, сделанные В-клеточными лимфоцитами, и вариабельные участки Тклеточных рецепторов Т-клеточных лимфоцитов, которые, в некоторых вариантах осуществления изобретения, также используются в качестве антигенов-мишеней для аутоиммунного заболевания. Другие ассоциированные с опухолью полипептиды могут быть использованы в качестве полипептидовмишеней, таких как полипептиды, которые находятся на более высоком уровне в опухолевых клетках, включая полипептид, узнаваемый моноклональным антителом 171А, и фолатсвязывающие полипептиды.

Другие подходящие терапевтические полипептиды и белки включают те, которые могут быть пригодны для лечения индивидуумов, страдающих от аутоиммунных заболеваний и расстройств путем придания широкого защитного иммунного ответа против мишеней, которые связаны с аутоиммунностью, в том числе клеточных рецепторов и клеток, которые производят само-направленные антитела. Аутоиммунные заболевания, опосредованные Т-клетками, включают в себя ревматоидный артрит (РА), рассеянный склероз (MS), синдром Шегрена, саркоидоз, инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД), аутоиммунный тиреоидит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, склеродермию, полимиозит, дерматомиозит, псориаз, васкулит, гранулематоз Вегенера, болезнь Крона и язвенный колит. Каждое из этих заболеваний характеризуется рецепторами Т-клеток (TCR), которые связываются с эндогенными антигенами и инициируют воспалительный каскад, связанный с аутоиммунными заболеваниями.

Также иллюстративные гены, которые могут быть доставлены посредством rAAV включают, без ограничения, глюкозо-6-фосфатазу, связанную с болезнью накопления гликогена или дефицита типа 1А (GSD1), фосфоенолпируват-карбоксикиназу (PEPCK), связанную с дефицитом PEPCK; циклинзависимый киназо-подобный белок 5 (CDKL5), также известный как серин/треонин киназа 9 (STK9), связанная с конвульсиями и тяжелым нарушением развития нервной системы; галактозо-1-фосфатуридил трансферазу, связанную с галактоземией; фенилаланин гидроксилазу, связанную с фенилкетонурией (ФК); дегидрогеназу альфа-кетокислот с разветвленной цепью, связанную с болезнью кленового сиропа; фумарилацетоацетат гидролазу, связанную с тирозинемией 1-го типа; метилмалонил-КоА мутазу, связанную с метилмалоновой ацидемией; ацил-КоА-дегидрогеназу жирных кислот со средней длиной цепи, связанную с ацетил-КоА-дефицитом жирных кислот со средней цепью; орнитин транскарбамилазу (ОТК), связанную с дефицитом орнитин транскарбамилазы; аргининосукцинат синтетазу (ASS1), связанную с цитруллинемией; дефицит лецитинхолестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ); метилмалоновую ацидемию (ММА); болезнь Ниманна-Пика, тип С1); пропионовую академию (ПА); белок рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR), связанный с семейной гиперхолестеринемией (FH); UDPглюкуронозилтрансферазу, связанную с болезнью Криглера-Наджар; аденозиндезаминазу, связанную с тяжелой болезнью комбинированного иммунодефицита; гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазу, связанную с подагрой и синдромом Леша-Ньян; биотимидазу, связанную с дефицитом биотимидазы; альфа-галактозидазу A (a-Gal А), связанную с болезнью Фабри); АТР7В, связанную с болезнью Вильсона; бета-глюкоцереброзидазу, связанную с болезнью Гоше типа 2 и 3; пероксисомный мембранный белок размером 70 кДа, связанный с синдромом Зельвегера; арилсульфатазу A (ARSA), связанную с метахроматической лейкодистрофией, фермент галактоцеребросидераза (GALC), связанный с болезнью Краббе, альфа-глюкозидазу (GAA), связанную с болезнью Помпе; ген сфингомиелиназы (SMPD1), связанный с болезнью Нимана Пика типа А; аргининосукцинат синтазу, связанную с цитруллинемией типа II начинающейся во взрослом состоянии (CTLN2); карбамоил-фосфат синтазу 1 (CPS1), связанную с нарушениями цикла мочевины; белок выживания двигательных нейронов (SMN), связанный со спинальной мы

- 22 048431 шечной атрофией; керамидазу, связанную с липогранулематозом Фарбе; b-гексозаминидазу, связанную с GM2-raHrauo3ugo3OM и заболеваниями Тея-Сакса и Санхоффа; аспартилглюкозаминидазу, связанную с аспартил-глюкозаминурией; а-фукозидазу, связанную с фукозидозом; α-маннозидазу, связанную с альфа-маннозидозом; порфобилиноген дезаминазу, связанную с острой перемежающейся порфирией (AIP); альфа-1-антитрипсин для лечения дефицита альфа-1 антитрипсина (эмфизема); эритропоэтин для лечения анемии вследствие талассемии или почечной недостаточности; фактор роста эндотелия сосудов, ангиопоэтин-1 и фактор роста фибробластов для лечения ишемических заболеваний; тромбомодулин и ингибитор пути тканевого фактора для лечения окклюзии кровеносных сосудов, как предусмотрено, например, при атеросклерозе, тромбозе или эмболиях; декарбоксилазу ароматических аминокислот (AADC) и тирозин гидроксилазу (ТН) для лечения болезни Паркинсона; бета-адренергические рецепторы, анти-смысловая или мутантная форма фосфоламбана, аденозин трифосфатазу-2 сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA2) и сердечную аденилилциклазу для лечения застойной сердечной недостаточности; ген-супрессор опухолей, такой как р53, для лечения различных видов рака; цитокин, такой как один из различных интерлейкинов для лечения воспалительных и иммунных расстройств и раковых заболеваний; дистрофии или минидистрофин, и утрофин или миниутрофин для лечения мышечных дистрофий; и инсулин или GLP-1, для лечения сахарного диабета.

Дополнительные гены и болезни представляющие интерес, включают, например, заболевания, связанные с геном дистонина, такие как наследственные сенсорные и вегетативные нейропатии типа VI (ген DST кодирует дистонин; могут потребоваться двойные векторы AAV из-за размера белка (~ 7570 ак); связанные с SCN9A заболевания, при которых потеря функциональных мутантов вызывает неспособность чувствовать боль, а усиление функциональных мутантов вызывает болевые состояния, такие как эритромелалгия. Другим состоянием является синдром Шарко-Мари-Тута типа 1F и 2Е из-за мутаций в гене NeFL (легкая цепь нейрофиламентов), характеризующийся прогрессирующей периферической моторной и сенсорной нейропатией с различным клиническим и электрофизиологическим выражением.

В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV, описанный в данном документе, может быть использован при лечении расстройств мукополисахаридозов (MPS). Такой rAAV может содержать переносимую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей a-L-идуронидазу (IDUA) для лечения MPS I (синдромы Херлера, Херлера-Шайя и Шайя); последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) для лечения MPS II (синдром Хантера); последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сульфамидазу (SGSH) для лечения MPSIII А, В, С и D (синдром Санфилиппо); последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую №ацетилгалактозамин-6-сульфат сульфатазу (GALNS) для лечения MPS IV А и В (синдром Моркио); последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую арилсульфатазу В (ARSB) для лечения MPS VI (синдром Марото-Лами); последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гиалуронидазу для лечения MPSI IX (дефицит гиалуронидазы), и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую бета-глюкуронидазу для лечения MPS VII (синдром Слая).

Иммуногенные трансгены

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую генный продукт, связанный с раком (например, супрессоры опухоли), может использоваться для лечения рака путем введения rAAV, несущего вектор rAAV, имеющему рак субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую небольшую интерферирующую нуклеиновую кислоту (например, кшРНК, микроРНК), которая ингибирует экспрессию генного продукта, связанного с раком (например, онкогены), может использоваться для лечения рака, путем введения rAAV, несущего вектор rAAV, имеющему рак субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую генный продукт, связанный с раком (или функциональной РНК, которая ингибирует экспрессию гена, связанного с раком), может использоваться в исследовательских целях, например, для изучения рака или для идентификации терапевтических средств, которые лечат рак. Ниже приведен не ограничивающий перечень иллюстративных генов, которые, как известно, связаны с развитием рака (например, онкогены и супрессоры опухолей):

- 23 048431

AARS, ABCB1, ABCC4, ABI2, ABL1, ABL2, ACK1, ACP2, ACY1, ADSL, AKI, AKR1C2, AKT1, ALB, ANPEP, ANXA5, ANXA7, AP2M1, APC, ARHGAP5, ARHGEF5, ARID4A, ASNS, ATF4, ATM, ATP5B, ATP5O, AXL, BARD1, BAX, BCL2, BHLHB2, BLMH, BRAF, BRCA1, BRCA2, ВТК, CANX, CAP1, CAPN1, CAPNS1, CAV1, CBFB, CBLB, CCL2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCT5, CCYR61, CD24, CD44, CD59, CDC20, CDC25, CDC25A, CDC25B, CDC2L5, CDK10, CDK4, CDK5, CDK9, CDKL1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2D, CEBPG, CENPC1, CGRRF1, CHAF1A, CIB1, CKMT1, CLK1, CLK2, CLK3, CLNS1A, CLTC, C0L1A1, COL6A3, COX6C, COX7A2, CRAT, CRHR1, CSF1R, CSK, CSNK1G2, CTNNA1, CTNNB1, CTPS, CTSC, CTSD, CUL1, CYR61, DCC, DCN, DDX10, DEK, DHCR7, DHRS2, DHX8, DLG3, DVL1, DVL3, E2F1, E2F3, E2F5, EGFR, EGR1, EIF5, EPHA2, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC3, ETV1, ETV3, ETV6, F2R, FASTK, FBN1, FBN2, FES, FGFR1, FGR, FKBP8, FN1, FOS, F0SL1, F0SL2, FOXG1A, FOXO1A, FRAP1, FRZB, FTL, FZD2, FZD5, FZD9, G22P1, GAS6, GCN5L2, GDF15, GNA13, GNAS, GNB2, GNB2L1, GPR39, GRB2, GSK3A, GSPT1, GTF2I, HDAC1, HDGF, HMMR, HPRT1, HRB, HSPA4, HSPA5, HSPA8, HSPB1, HSPH1, HYAL1, HYOU1, ICAM1, ID1, ID2, IDUA, IER3, IFITM1, IGF1R, IGF2R, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IL1B, ILK, ING1, IRF3, ITGA3, ITGA6, ITGB4, JAKI, JARID1A, JUN, JUNB, JUND, K-ALPHA-1, KIT, KITLG, KLK10, KPNA2, KRAS2, KRT18, KRT2A, KRT9, LAMB1, LAMP2, LCK, LCN2, LEP, LITAF, LRPAP1, LTF, LYN, LZTR1, MADH1, MAP2K2, MAP3K8, MAPK12, MAPK13, MAPKAPK3, MAPRE1, MARS, MASI, MCC, MCM2, MCM4, MDM2, MDM4, MET, MGST1, MICB, MLLT3, MME, MMP1, MMP14, MMP17, MMP2, MNDA, MSH2, MSH6, MT3, MYB, MYBL1, MYBL2, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYL9, MYLK, ΝΕΟΙ, NF1, NF2, NFKB1, NFKB2, NFSF7, NID, NINE, NMBR, NME1, NME2, NME3, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH4, NPM1, NQO1, NR1D1, NR2F1, NR2F6, NRAS, NRG1, NSEP1, OSM, PA2G4, PABPC1, PCNA, PCTK1, PCTK2, PCTK3, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDPK1, PEA15, PFDN4, PFDN5, PGAM1, PHB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIM1, PKM2, PKMYT1, PLK2, PPARD, PPARG, PPIH, PPP1CA, PPP2R5A, PRDX2, PRDX4, PRKAR1A, PRKCBP1, PRNP, PRSS15, PSMA1, PTCH, PTEN, PTGS1, PTMA, PTN, PTPRN, RAB5A, RAC1, RAD50, RAFI, RALBP1, RAP1A, RARA, RARB, RASGRF1, RBI, RBBP4, RBL2, REA, REL, RELA, RELB, RET, RFC2, RGS19, RHOA, RHOB, RHOC, RHOD, RIPK1, RPN2, RPS6 KB1, RRM1, SARS, SELENBP1, SEMA3C, SEMA4D, SEPPI, SERPINH1, SFN, SFPQ, SFRS7, SHB, SHH, SIAH2, SIVA, SIVA TP53, SKI, SKIL, SLC16A1, SLC1A4, SLC20A1, SMO, сфингомиелин фосфодиэстераза 1 (SMPD1), SNAI2, SND1, SNRPB2, S0CS1, S0CS3, SOD1, SORT1, SPINT2, SPRY2, SRC, SRPX, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STC1, TAF1, TBL3, TBRG4, TCF1, TCF7L2, TFAP2C, TFDP1, TFDP2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGFBR2, TGFBR3, THBS1, TIE, TIMP1, TIMP3, TJP1, TK1, TLE1, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6, TNFSF7, TNK1, TOBI, TP53, TP53BP2, TP5313, TP73, TPBG, TPT1, TRADD, TRAM1, TRRAP, TSG101, TUFM, TXNRD1, TYRO3, UBC, UBE2L6, UCHL1, USP7, VDAC1, VEGF, VHL, VIL2, WEE1, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WT1, XRCC1, YES1, YWHAB, YWHAZ, ZAP70 и ZNF9.

Вектор rAAV может содержать в качестве трансгена нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или функциональную РНК, которые модулируют апоптоз. Ниже приведен не ограничивающий перечень генов, связанных с апоптозом, и нуклеиновые кислоты, кодирующие продукты этих генов и их гомологи и кодирующие малые интерферирующие нуклеиновые кислоты (например, кшРНК, микроРНК), которые ингибируют экспрессию этих генов и их гомологи пригодны в качестве трансгенов в определенных вариантах осуществления изобретения:

- 24 048431

RPS27A, ABL1, AKT1, APAF1, BAD, BAG1, BAG3, BAG4, BAKI, BAX, BCL10, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L10, BCL2L11, BCL2L12, BCL2L13, BCL2L2, BCLAF1, BFAR, BID, BIK, NAIP, BIRC2, BIRC3, XIAP, BIRC5, BIRC6, BIRC7, BIRC8, BNIP1, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BOK, BRAF, CARDIO, CARD11, NLRC4, CARD14, NOD2, NODI, CARD6, CARDS, CARDS, CASP1, CASP10, CASP14, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CFLAR, CIDEA, CIDEB, CRADD, DAPK1, DAPK2, DFFA, DFFB, FADD, GADD45A, GDNF, HRK, IGF1R, LTA, LTBR, MCL1, NOL3, PYCARD, RIPK1, RIPK2, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF14, TNFRSF19, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF14, TNFSF18, CD40LG, FASLG, CD70, TNFSF8, TNFSF9, TP53, TP53BP2, TP73, TP63, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4 и TRAF5.

Пригодные генные продукты также включают микроРНК. МикроРНК и другие малые интерферирующие нуклеиновые кислоты, регулирующие экспрессию генов с помощью расщепления/деградации целевого РНК-транскрипта или трансляционной репрессии целевой матричной РНК (мРНК). МикроРНК изначально экспрессированы, как правило, в качестве готовых 19-25 нетранслированных продуктов РНК. МикроРНК проявляют свою активность через последовательность-специфические взаимодействия с нетранслируемыми 3'-участками (UTR) мРНК-мишеней. Эти эндогенно экспрессированные микроРНК образуют предшественники в форме шпильки, которые впоследствии процессируются в дуплексную микроРНК и далее в зрелую одноцепочечную молекулу микроРНК. Эта зрелая микроРНК направляет мультибелковый комплекс, miRISC, который идентифицирует сайт-мишень, например в 3'-участках UTR, целевых мРНК на основе их комплементарности к зрелой микроРНК.

Следующий не ограничивающий список генов микроРНК и их гомологов пригоден в качестве генов или в качестве мишеней для малых интерферирующих нуклеиновых кислот, кодируемых генами (например, микроРНК-губки, антисмысловые олигонуклеотиды, TuD-PHK) в определенных вариантах осуществления способов:

hsalet-7a, hsa-let-7a*, hsa-let-7b, hsa-let-7b*, hsa-let-7c, hsa-let-7c*, hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let-7e, hsa-let-7e*, hsa-let-7f, hsa-let-7f-l*, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-7g*, hsa-let-71, hsa-let-71*, hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR-101, hsa-miR101*, hsa-miR-103, hsa-miR-105, hsa-miR-105*, hsa-miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR106b, hsa-miR-106b*, hsa-miR-107, hsa-miR-lOa, hsa-miR-10a*, hsa-miR-lOb, hsa-miR10b*, hsa-miR-1178, hsa-miR-1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR-1182, hsamiR-1183, hsa-miR-1184, hsa-miR-1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR-1204, hsa-miR-1205, hsa-miR-1206, hsa-miR1207-3p, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1208, hsa-miR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-12243p, hsa-miR-1224-5p, hsa-miR-1225-Зр, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1226, hsa-miR1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa-miR-1229, hsa-miR-1231, hsamiR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR-1236, hsa-miR-1237, hsa-miR-1238, hsa-miR-124, hsamiR-124*, hsa-miR-1243, hsa-miR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR-1247, hsa-miR-1248, hsa-miR-1249, hsa-miR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsa-miR1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa-miR-1255b, hsa-miR-1256, hsa-miR-1257, hsamiR-1258, hsa-miR-1259, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR125b-l*, hsa-miR-125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR-1260, hsa-miR-1261, hsa-miR-1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR-1266, hsa-miR1267, hsa-miR-1268, hsa-miR-1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsamiR-1273, hsa-miR-127-Зр, hsa-miR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa-miR-127- 25 048431

5p, hsa-miR-1276, hsa-miR-1277, hsa-miR-1278, hsa-miR-1279, hsa-miR-128, hsa-miR1280, hsa-miR-1281, hsa-miR-1282, hsa-miR-1283, hsa-miR-1284, hsa-miR-1285, hsamiR-1286, hsa-miR-1287, hsa-miR-1288, hsa-miR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR-1292, hsa-miR-1293, hsa-miR-129-Зр, hsa-miR-1294, hsa-miR1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-1297, hsa-miR-1298, hsa-miR-1299, hsamiR-1300, hsa-miR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR-1303, hsa-miR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR-1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR-130a*, hsa-miR130b, hsa-miR-130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132*, hsa-miR-1321, hsa-miR-1322, hsamiR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsamiR-135a*, hsa-miR-135b, hsa-miR-135b*, hsa-miR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsa-miR-138, hsa-miR-138-1*, hsa-miR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p, hsamiR-140-Зр, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR-141*, hsa-miR-142-Зр, hsa-miR142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143*, hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, hsa-miR145*, hsa-miR-146a, hsa-miR-146a*, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-147, hsa-miR-147b, hsa-miR-148a, hsa-miR-148a*, hsa-miR-148b, hsa-miR-148b*, hsa-miR149, hsa-miR-149*, hsa-miR-150, hsa-miR-150*, hsa-miR-151-Зр, hsa-miR-151-5p, hsamiR-152, hsa-miR-153, hsa-miR-154, hsa-miR-154*, hsa-miR-155, hsa-miR-155*, hsamiR-15a, hsa-miR-15a*, hsa-miR-15b, hsa-miR-15b*, hsa-miR-16, hsa-miR-16-1*, hsamiR-16-2*, hsa-miR-17, hsa-miR-17*, hsa-miR-181a, hsa-miR-181a*, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181c*, hsa-miR-181d, hsa-miR-182, hsa-miR-182*, hsa-miR-1825, hsa-miR-1826, hsa-miR-1827, hsa-miR-183, hsa-miR-183*, hsa-miR-184, hsa-miR-185, hsa-miR-185*, hsa-miR-186, hsa-miR-186*, hsa-miR-187, hsa-miR-187*, hsa-miR-188-Зр, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-18a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-18b, hsa-miR18b*, hsa-miR-190, hsa-miR-190b, hsa-miR-191, hsa-miR-191*, hsa-miR-192, hsa-miR192*, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b, hsa-miR-193b*, hsa-miR-194, hsa-miR-194*, hsa-miR-195, hsa-miR-195*, hsa-miR-196a, hsa-miR-196a*, hsa-miR-196b, hsa-miR-197, hsa-miR-198, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsamiR-19a, hsa-miR-19a*, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b-l*, hsa-miR-19b-2*, hsa-miR-200a, hsa-miR-200a*, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-200c, hsa-miR-200c*, hsa-miR202, hsa-miR-202*, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-206, hsa-miR208a, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20a*, hsa-miR-20b, hsa-miR-20b*, hsa-miR21, hsa-miR-21*, hsa-miR-210, hsa-miR-211, hsa-miR-212, hsa-miR-214, hsa-miR-214*, hsa-miR-215, hsa-miR-216a, hsa-miR-216b, hsa-miR-217, hsa-miR-218, hsa-miR-218-1*, hsa-miR-218-2*, hsa-miR-219-l-3p, hsa-miR-219-2-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-22, hsa-miR-22*, hsa-miR-220a, hsa-miR-220b, hsa-miR-220c, hsa-miR-221, hsa-miR-221*, hsa-miR-222, hsa-miR-222*, hsa-miR-223, hsa-miR-223*, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b, hsa-miR-23b*, hsa-miR-24, hsa-miR-24-1*, hsa-miR-24-2*, hsa-miR-25, hsa-miR-25*, hsa-miR-26a, hsa-miR-26a-l*, hsa-miR-26a-2*, hsa-miR-26b, hsa-miR-26b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-27a*, hsa-miR-27b, hsa-miR-27b*, hsa-miR-28-Зр, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-296-Зр, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-297, hsa-miR-298, hsa-miR

- 26 048431

299-3p, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-29a*, hsa-miR-29b, hsa-miR-296-1*, hsa-miR-296-2*, hsa-miR-29c, hsa-miR-29c*, hsa-miR-300, hsa-miR-301a, hsa-miR-301b, hsa-miR-302a, hsa-miR-302a*, hsa-miR-302b, hsa-miR-302b*, hsa-miR-302c, hsa-miR302c*, hsa-miR-302d, hsa-miR-302d*, hsa-miR-302e, hsa-miR-302f, hsa-miR-30a, hsamiR-30a*, hsa-miR-30b, hsa-miR-30b*, hsa-miR-30c, hsa-miR-30c-l*, hsa-miR-30c-2*, hsa-miR-30d, hsa-miR-30d*, hsa-miR-30e, hsa-miR-30e*, hsa-miR-31, hsa-miR-31*, hsamiR-32, hsa-miR-32*, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-320d, hsamiR-323-3p, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-325, hsa-miR326, hsa-miR-328, hsa-miR-329, hsa-miR-33O-3p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-331-3p, hsamiR-331-5p, hsa-miR-335, hsa-miR-335*, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-337-5p, hsa-miR338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-339-3p, hsa-miR-339-5p, hsa-miR-33a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-33b, hsa-miR-33b*, hsa-miR-340, hsa-miR-340*, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-3425p, hsa-miR-345, hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34a*, hsa-miR-34b, hsa-miR-34b*, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363, hsa-miR-363*, hsa-miR-365, hsa-miR-367, hsa-miR-367*, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-369-5p, hsa-miR-370, hsa-miR-371-3p, hsa-miR-371-5p, hsamiR-372, hsa-miR-373, hsa-miR-373*, hsa-miR-374a, hsa-miR-374a*, hsa-miR-374b, hsamiR-374b*, hsa-miR-375, hsa-miR-376a, hsa-miR-376a*, hsa-miR-376b, hsa-miR-376c, hsa-miR-377, hsa-miR-377*, hsa-miR-378, hsa-miR-378*, hsa-miR-379, hsa-miR-379*, hsa-miR-380, hsa-miR-380*, hsa-miR-381, hsa-miR-382, hsa-miR-383, hsa-miR-384, hsamiR-409-Зр, hsa-miR^409-5p, hsa-miR-410, hsa-miR-411, hsa-miR-411*, hsa-miR-412, hsa-miR-421, hsa-miR-422a, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-424, hsa-miR424*, hsa-miR-425, hsa-miR-425*, hsa-miR^429, hsa-miR-431, hsa-miR-431*, hsa-miR432, hsa-miR-432*, hsa-miR-433, hsa-miR-448, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR450a, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-452, hsa-miR-452*, hsa-miR-453, hsa-miR-454, hsa-miR-454*, hsa-miR-455-Зр, hsa-miR-455-5p, hsa-miR483-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-484, hsa-miR-485-Зр, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-4863p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-487a, hsa-miR-487b, hsa-miR-488, hsa-miR-488*, hsa-miR489, hsa-miR-490-Зр, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-491-Зр, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-492, hsa-miR-493, hsa-miR^493*, hsa-miR-494, hsa-miR-495, hsa-miR-496, hsa-miR-497, hsamiR-497*, hsa-miR-498, hsa-miR-499-Зр, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-500, hsa-miR-500*, hsa-miR-501-Зр, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-502-Зр, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-503, hsamiR-504, hsa-miR-505, hsa-miR-505*, hsa-miR-506, hsa-miR-507, hsa-miR-508-Зр, hsamiR-508-5p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-509-Зр, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-510, hsamiR-511, hsa-miR-512-Зр, hsa-miR-512-5p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-513a-5p, hsamiR-513b, hsa-miR-513c, hsa-miR-514, hsa-miR-515-Зр, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-516a3p, hsa-miR-516a-5p, hsa-miR-516b, hsa-miR-517*, hsa-miR-517a, hsa-miR-517b, hsamiR-517c, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-518a-5p, hsa-miR-518b, hsa-miR-518c, hsa-miR518c*, hsa-miR-518d-3p, hsa-miR-518d-5p, hsa-miR-518e, hsa-miR-518e*, hsa-miR-518f, hsa-miR-518f*, hsa-miR-519a, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-519d, hsa

- 27 048431 miR-519e, hsa-miR-519e*, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR520c-3p, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-521, hsa-miR-522, hsa-miR-523, hsa-miR-524-Зр, hsa-miR524-5p, hsa-miR-525-Зр, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-526b, hsa-miR-526b*, hsa-miR-5323p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-539, hsa-miR-541, hsa-miR-541*, hsa-miR-542-Зр, hsamiR-542-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-544, hsa-miR-545, hsa-miR-545*, hsa-miR-548a-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548b-3p, hsa-miR-5486-5p, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-548c5p, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548e, hsa-miR-548f, hsa-miR-548g, hsamiR-548h, hsa-miR-548i, hsa-miR-548j, hsa-miR-548k, hsa-miR-5481, hsa-miR-548m, hsa-miR-548n, hsa-miR-548o, hsa-miR-548p, hsa-miR-549, hsa-miR-550, hsa-miR-550*, hsa-miR-551a, hsa-miR-551b, hsa-miR-551b*, hsa-miR-552, hsa-miR-553, hsa-miR-554, hsa-miR-555, hsa-miR-556-Зр, hsa-miR-556-5p, hsa-miR-557, hsa-miR-558, hsa-miR559, hsa-miR-561, hsa-miR-562, hsa-miR-563, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-567, hsa-miR-568, hsa-miR-569, hsa-miR-570, hsa-miR-571, hsa-miR-572, hsa-miR-573, hsamiR-574-Зр, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-575, hsa-miR-576-Зр, hsa-miR-576-5p, hsa-miR577, hsa-miR-578, hsa-miR-579, hsa-miR-580, hsa-miR-581, hsa-miR-582-Зр, hsa-miR582-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-584, hsa-miR-585, hsa-miR-586, hsa-miR-587, hsa-miR588, hsa-miR-589, hsa-miR-589*, hsa-miR-590-Зр, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-591, hsamiR-592, hsa-miR-593, hsa-miR-593*, hsa-miR-595, hsa-miR-596, hsa-miR-597, hsamiR-598, hsa-miR-599, hsa-miR-600, hsa-miR-601, hsa-miR-602, hsa-miR-603, hsa-miR604, hsa-miR-605, hsa-miR-606, hsa-miR-607, hsa-miR-608, hsa-miR-609, hsa-miR-610, hsa-miR-611, hsa-miR-612, hsa-miR-613, hsa-miR-614, hsa-miR-615-Зр, hsa-miR-6155p, hsa-miR-616, hsa-miR-616*, hsa-miR-617, hsa-miR-618, hsa-miR-619, hsa-miR-620, hsa-miR-621, hsa-miR-622, hsa-miR-623, hsa-miR-624, hsa-miR-624*, hsa-miR-625, hsamiR-625*, hsa-miR-626, hsa-miR-627, hsa-miR-628-Зр, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-629, hsa-miR-629*, hsa-miR-630, hsa-miR-631, hsa-miR-632, hsa-miR-633, hsa-miR-634, hsamiR-635, hsa-miR-636, hsa-miR-637, hsa-miR-638, hsa-miR-639, hsa-miR-640, hsa-miR641, hsa-miR-642, hsa-miR-643, hsa-miR-644, hsa-miR-645, hsa-miR-646, hsa-miR-647, hsa-miR-648, hsa-miR-649, hsa-miR-650, hsa-miR-651, hsa-miR-652, hsa-miR-653, hsamiR-654-Зр, hsa-miR-654-5p, hsa-miR-655, hsa-miR-656, hsa-miR-657, hsa-miR-658, hsa-miR-659, hsa-miR-660, hsa-miR-661, hsa-miR-662, hsa-miR-663, hsa-miR-663b, hsamiR-664, hsa-miR-664*, hsa-miR-665, hsa-miR-668, hsa-miR-671-Зр, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-675, hsa-miR-7, hsa-miR-708, hsa-miR-708*, hsa-miR-7-1*, hsa-miR-7-2*, hsamiR-720, hsa-miR-744, hsa-miR-744*, hsa-miR-758, hsa-miR-760, hsa-miR-765, hsamiR-766, hsa-miR-767-Зр, hsa-miR-767-5p, hsa-miR-768-Зр, hsa-miR-768-5p, hsa-miR769-3p, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-802, hsa-miR-873, hsa-miR-874, hsamiR-875-Зр, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-876-Зр, hsa-miR-876-5p, hsa-miR-877, hsa-miR877*, hsa-miR-885-Зр, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-886-Зр, hsa-miR-886-5p, hsa-miR-887, hsa-miR-888, hsa-miR-888*, hsa-miR-889, hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR-891b, hsa-miR-892a, hsa-miR-892b, hsa-miR-9, hsa-miR-9*, hsa-miR-920, hsa-miR-921, hsamiR-922, hsa-miR-923, hsa-miR-924, hsa-miR-92a, hsa-miR-92a-l*, hsa-miR-92a-2*, hsa-miR-92b, hsa-miR-92b*, hsa-miR-93, hsa-miR-93*, hsa-miR-933, hsa-miR-934, hsamiR-935, hsa-miR-936, hsa-miR-937, hsa-miR-938, hsa-miR-939, hsa-miR-940, hsa-miR941, hsa-miR-942, hsa-miR-943, hsa-miR-944, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR-96*, hsa-miR-98, hsa-miR-99a, hsa-miR-99a*, hsa-miR-99b и hsa-miR-99b*.

Например, может представлять интерес микроРНК, направленная на открытую рамку считывания 72 (C9orf72) хромосомы 8, которая экспрессирует супероксиддисмутазу (SOD1), связанную с боковым амиотрофическим склерозом (ALS).

МикроРНК ингибирует функцию мРНК, на которые она направлена и, как следствие, ингибирует

- 28 048431 экспрессию полипептидов, кодируемых этими мРНК. Таким образом, блокирование (частично или полностью) активности микроРНК (например, сайленсинг микроРНК) может эффективно индуцировать или восстанавливать экспрессию полипептида, чья экспрессия ингибируется (дерепрессия полипептида). В одном варианте осуществления изобретения дерепрессия полипептидов, кодируемых мРНК на которые направлена микроРНК, осуществляется путем ингибирования активности микроРНК в клетках любым из множества способов. Например, блокирование активности микроРНК может быть достигнуто путем гибридизации с малой интерферирующей нуклеиновой кислотой (например, антисмысловой олигонуклеотид, микроРНК-губка, TuD-PHK), которая комплементарна или по существу комплементарна микроРНК, тем самым блокируя взаимодействие микроРНК с ее мРНК-мишенью. Как использовано в данном документе, малая интерферирующая нуклеиновая кислота, которая по существу комплементарна микроРНК, является той, которая способна к гибридизации с микроРНК и блокированию активности микроРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения малая интерферирующая нуклеиновая кислота, которая по существу комплементарна микроРНК, является малой интерферирующей нуклеиновой кислотой, которая комплементарна с микроРНК по всем, кроме 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 оснований. Ингибитор микроРНК является агентом, который блокирует функционирование, экспрессию и/или процессинг микроРНК. Например, эти молекулы включают, но не ограничиваются ими, специфические антисмысловые микроРНК, микроРНК-губки, жесткие ложные РНК (TuD-PHK) и микроРНК-олигонуклеотиды (двухцепочечные, шпильковые, короткие олигонуклеотиды), которые ингибируют взаимодействие микроРНК с комплексом Drosha.

Кроме того, другие пригодные гены могут включать в себя гены, кодирующие иммуноглобулины, которые придают пассивный иммунитет к патогену. Молекула иммуноглобулина представляет собой белок, содержащий иммунологически активные части тяжелой цепи иммуноглобулина и легкой цепи иммуноглобулина, ковалентно соединенные вместе и способные специфически объединяться с антигеном. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. Термины антитело и иммуноглобулин могут быть использованы в данном документе взаимозаменяемо.

Тяжелая цепь иммуноглобулина представляет собой полипептид, который содержит по меньшей мере часть антигенсвязывающего домена иммуноглобулина и по меньшей мере часть вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина или по меньшей мере часть константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, полученная из иммуноглобулина тяжелая цепь имеет значительные участки гомологии аминокислотной последовательности с представителем суперсемейства генов иммуноглобулинов. Например, тяжелая цепь во фрагменте Fab представляет собой тяжелую цепь производную иммуноглобулина. Легкая цепь иммуноглобулина представляет собой полипептид, который содержит по меньшей мере часть антигенсвязывающего домена иммуноглобулина и по меньшей мере часть вариабельного участка или по меньшей мере часть константного участка легкой цепи иммуноглобулина. Таким образом, полученная из иммуноглобулина легкая цепь имеет значительные участки аминокислотной гомологии с представителем суперсемейства генов иммуноглобулинов. Иммуноадгезин представляет собой химерную антитело-подобную молекулу, которая сочетает в себе функциональный домен связывающего белка, как правило, рецептор, лиганд или молекула клеточной адгезии, с константными доменами иммуноглобулина, как правило, включая шарнир и Fc-участки.

Антигенсвязывающий фрагмент (Fab) представляет собой участок на антителе, которое связывается с антигенами. Она состоит из одного константного и одного вариабельного участка каждой тяжелой и легкой цепи.

Конструкция антипатогена выбирается на основе возбудителя болезни (патоген), против которого необходима защита. Эти патогены могут быть вирусного, бактериального или грибкового происхождение, и могут быть использованы для предотвращения инфекции у людей, против болезни человека или у млекопитающих, отличных от человека, или других животных для предотвращения ветеринарного заболевания.

rAAV может включать в себя гены, кодирующие антитела и, в частности, нейтрализующие антитела против вирусного патогена. Такие антивирусные антитела могут включать в себя антитела против гриппа, направленные против одного или более из гриппа А, гриппа В, и гриппа С. Вирусы типа А являются наиболее вирулентными патогенами человека. Серотипы гриппа А, которые были связаны с пандемиями, включают, H1N1, вызвавший испанку в 1918 году, и свиной грипп в 2009 году; H2N2, который вызвал азиатский грипп в 1957 году; H3N2, который вызвал Гонконгский грипп в 1968 году; H5N1, который вызвал птичий грипп в 2004 году; H7N7; H1N2; H9N2; H7N2; H7N3 и H10N7. Другие целевые патогенные вирусы включают в себя аренавирусы (включая Фунин, Мачупо и Ласса), филовирусы (включая Марбург и Эбола), хантавирусы, пикорновирусы (включая риновирусы, эховирус), коронавирусы, парамиксовирусы, морбилливирус, респираторно-синцитиальный вирус, тогавирус, коксакивирус, вирус JC, парвовирус В19, парагрипп, аденовирусы, реовирусы, оспу (Variola major (черная оспа)) и Vaccinia (коровья оспа) из семейства поксвирусов, и ветряную оспу (псевдобешенство). Вирусные геморрагические лихорадки вызывают представители семейства ареновируса (лихорадка Ласса) (это семейство также связано с лимфоцитарным хориоменингитом (LCM)), филовируса (вирус Эбола) и хантавируса (пуумала). Представители

- 29 048431 пикорнавирусов (подсемейство риновирусов) связаны с обычной простудой у человека. Семейство коронавирусов, которая включает в себя ряд нечеловеческих вирусов, таких как вирус инфекционного бронхита (птицы), свиной трансмиссивный желудочно-кишечный вирус (свинья), свиной вирус гемагглютинатинового энцефаломиелита (свинья), кошачий инфекционный вирус перитонита (кошка), кошачий кишечный коронавирус (кошка), собачий коронавирус (собака). Респираторные коронавирусы человека, которые были предположительно связаны с простудой, гепатитом неА, В или С и внезапным острым респираторным синдромом (SARS). Семейство парамиксовируса включает в себя вирус парагриппа типа 1, вирус парагриппа типа 3, бычий вирус парагриппа типа 3, рубулавирус (вирус эпидемического паротита), вирус парагриппа типа 2, вирус парагриппа типа 4, вирус болезни Ньюкасла (куры), чума крупного рогатого скота, морбилливирус, который включает в себя корь и собачью чуму, и пневмовирус, который включает в себя респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Семейство парвовирусов включает в себя кошачий парвовирус (кошачий энтерит), кошачий панлейкопениявирус, собачий парвовирус и свиной парвовирус. Семейство аденовируова включает в себя вирусы (ЕХ, AD7, ARD, O.B.), которые вызывают респираторные заболевания. Таким образом, в определенных вариантах осуществления изобретения, вектор rAAV, как описано в данном документе, может быть сконструирован для экспрессии антитела против вируса Эбола, например 2G4, 4G7, 13С6, антитела против гриппа, например FI6, CR8033, и антитела против RSV, например паливизумаб, мотавизумаб.

Конструкция нейтрализующего антитела против бактериальных патогенов также может быть выбрана для использования в данном изобретении. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нейтрализующего антитела направлена против самих бактерий. В другом варианте осуществления изобретения конструкция нейтрализующего антитела направлена против токсина, вырабатываемого бактериями. Примеры переносимых по воздуху бактериальных патогенов включают, например, Neisseria meningitidis (менингит), Klebsiella pneumonia (пневмония), Pseudomonas aeruginosa (пневмония), Pseudomonas pseudomallei (пневмония), Pseudomonas mallei (пневмония), Acinetobacter (пневмония), Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Alkaligenes, Cardiobacterium, Haemophilus influenzae (грипп), Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis (коклюш), Francisella tularensis (пневмония/лихорадка), Legionella pneumonia (болезнь легионеров), Chlamydia psittaci (пневмония), Chlamydia pneumoniae (пневмония), Mycobacterium tuberculosis (туберкулез (ТБ)), Mycobacterium kansasii (ТБ), Mycobacterium avium (пневмония), Nocardia asteroides (пневмония), Bacillus anthracis (сибирская язва), Staphylococcus aureus (пневмония), Streptococcus pyogenes (скарлатина), Streptococcus pneumoniae (пневмония), Corynebacteria diphtheria (дифтерия), Mycoplasma pneumoniae (пневмония).

rAAV может включать в себя гены, кодирующие антитела и, в частности, нейтрализующие антитела против бактериального патогена, такого как возбудитель сибирской язвы, токсина, вырабатываемого Bacillius anthracis. Были описаны нейтрализующие антитела против защищающего агента (ЗА), одного из трех пептидов, которые образуют анатоксин,. Остальные два полипептида состоят из летального фактора (LF) и фактора отека (EF). Анти-ЗА нейтрализующие антитела были описаны как эффективные в пассивной иммунизации против сибирской язвы. См., например, патент США номер 7442373; R. Sawada-Hirai et al, J Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2: 5. (онлайн с 12 мая 2004). Были описаны и/или могут быть созданы еще другие нейтрализующие антитела против токсина сибирской язвы. Точно так же нейтрализующие антитела против других бактерий и/или бактериальных токсинов, могут быть использованы для создания AAV-доставляемых антипатогенных конструкций, как описано в данном документе.

Антитела против инфекционных заболеваний могут быть вызваны паразитами или грибами, в том числе, например, видами Aspergillus, Absidia corymbifera, Rhixpus stolonifer, Mucor plumbeaus, Cryptococcus neoformans, Histoplasmcapsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, виды Penicillium, Mcropolyspora faeni, Thermoactinomyces vulgaris, Alternaria alternate, видами Cladosporium, видами Helminthosporium и Stachybotrys.

rAAV может включать в себя гены, кодирующие антитела и, в частности, нейтрализующие антитела против патогенных факторов заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD), болезни Паркинсона (PD), GBA-Паркинсона, ревматоидного артрита (РА), синдрома раздраженного кишечника (СРК), хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), рака, опухолей, системного склероза, астмы и других заболеваний. Такими антителами могут быть, без ограничения, например, альфа-синуклеин, антитело против фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (анти-VEGF), анти-VEGFA, анти-PD-1, αнтu-PDL1, антиCTLA-4, анти-ФНО-альфа, анти-ИЛ-17, анти-ИЛ-23, анти-ИЛ-21, анти-ИЛ-6, антитело против рецептора ИЛ-6, анти-ИЛ-5, анти-ИЛ-7, антитело против фактора XII, анти-ИЛ-2, анти-ВИЧ, анти-IgE, антитело против рецептор-1 фактора некроза опухолей (TNFR1), анти-notch 2/3, анти-notch 1, анти-ОХ40, антитело против рецептора тирозинкиназы 3 erb-b2 (ErbB3), анmи-ErbB2, антитело против антигена созревания бета-клеток, антитело против стимулятора В-лимфоцитов, анти-CD20, анти-HER2, антитело против гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, антитело против онкостатина М (OSM), антитело против белка гена 3 активации лимфоцитов (LAG-3), анти-CCL20, антитело против компонента сывороточного амилоида Р (SAP), антитело против ингибитора пролил гидроксилазы, антиCD38, анти-гликопротеин IIb/IIIa, анти-CD52, анти-CD30, анти-ИЛ-1бета, антитело против рецептора эпидермального фактора роста, анти-CD25, антитело против лиганда RANK, антитело против белка С5

- 30 048431 системы комплемента, анти-CDlla, антитело против рецептора CD3, антитело против интегрина альфа-4 (α4), антитело против белка F RSV и анти-интегрин α₄β₇. Тем не менее другие патогены и болезни будут очевидны для специалиста в данной области техники. Другие подходящие антитела могут включать в себя те, которые пригодны для лечения болезни Альцгеймера, такие как, например, антитело против бета-амилоида (например, кренезумаб, соланезумаб, адуканумаб), антитела против бета-амилоидных фибрилл, антитела против бета-амилоидных бляшек, анти-тау, бапинеузамаб, среди прочих. Другие подходящие антитела для лечения различных показаний включают в себя те, которые описаны, например, в PCT/US2016/058968, поданной 27 октября 2016 года, опубликованной как WO 2017/075119 А1.

II. Производство rAAV вектора.

Для использования при производстве вирусного вектора AAV (например, рекомбинантного (r) AAV), экспрессионные кассеты могут быть перенесены на любой подходящий вектор, например плазмиду, которая доставляется в упаковывающую клетку-хозяина. Плазмиды, используемые в данном изобретении, могут быть сконструированы таким образом, что они стали пригодны для репликации и упаковки in vitro в прокариотические клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих, среди прочих. Подходящие методы трансфекции и упаковки для клеток-хозяев известны и/или могут быть легко разработаны специалистом в данной области техники.

Способы получения и выделения AAV, пригодных для использования в качестве векторов, известны в данной области техники. См., как правило, например, Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, Recent developments in adeno-associated virus vector technology, J. Gene Med. 10:717-733; и ссылки, приведенные ниже, каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Для упаковки гена в вирионы ITR являются единственными компонентами AAV, требуемыми в цис-положении в одной и той же конструкции, что и молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную(ые) кассету(ы). Гены cap и rep могут быть поставлены в транс-положение.

В одном варианте осуществления изобретения экспрессионная кассета, описанная в данном документе, встроена в генетический элемент (например, челночная плазмида), который передает сконструированные последовательности иммуноглобулина, переносимые в ней, в упаковывающую клетку-хозяина для производства вирусного вектора. В одном варианте осуществления изобретения выбранный генетический элемент может быть доставлен в AAV-упаковывающую клетку любым подходящим способом, в том числе трансфекцией, электропорацией, доставкой липосомами, методами слияния мембран, высокоскоростными гранулами, покрытыми ДНК, вирусной инфекцией и слиянием протопластов. Могут также быть получены стабильные AAV-упаковывающие клетки. В качестве альтернативы, экспрессионные кассеты могут быть использованы для создания вирусного вектора, отличного от AAV, или для производства смесей антител in vitro. Способы, которые используются для создания таких конструкций, известны специалистам в области манипуляций с нуклеиновыми кислотами и включают в себя генную инженерию, рекомбинантную инженерию и синтетические методики. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

Термин промежуточный AAV или промежуточный вектор AAV относится к собранному капсиду rAAV, у которого отсутствуют желаемые геномные последовательности, упакованные в нем. Эти конструкции также могут быть названы пустым капсидом. Такой капсид может не содержать обнаруживаемые геномные последовательности экспрессионной кассеты, или содержать только частично упакованные геномные последовательности, которые являются недостаточными для достижения экспрессии генного продукта. Эти пустые капсиды являются нефункциональными для переноса представляющего интерес гена в клетку-хозяина.

Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (AAV), описанный в данном документе, может быть создан с использованием способов, которые известны в данной области техники. См., например, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 В2. Такой способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую капсидный белок AAV; функциональный ген rep; экспрессионную кассету, состоящую из, как минимум, инвертированных концевых повторов (ITR) AAV и трансгена; и достаточные вспомогательные функции, чтобы обеспечить упаковку экспрессионной кассеты в капсидный белок AAV. Описаны способы получения капсида, кодирующие его последовательности, и способы получения вирусных векторов rAAV. См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) и US 2013/0045186 A1.

В одном варианте осуществления изобретения представлено производство клеточной культуры, пригодной для получения рекомбинантного AAVhu68. Такая культура клеток содержит нуклеиновую кислоту, которая экспрессирует капсидный белок AAVhu68 в клетке-хозяине; молекулу нуклеиновой кислоты, подходящую для упаковки в капсид AAVhu68, например векторный геном, который содержит ITR AAV, и последовательность нуклеиновой кислоты не-AAV, кодирующую генный продукт, функционально связанный с последовательностями, которые направляют экспрессию этого продукта в клетке-хозяине; и достаточные функции rep AAV и вспомогательные функции аденовируса для обеспечения упаковки молекулы нуклеиновой кислоты в рекомбинантный капсид AAVhu68. В одном варианте осу

- 31 048431 ществления изобретения клеточная культура состоит из клеток млекопитающих (например, клеток 293 эмбриональной почки человека, среди прочих) или клеток насекомых (например, бакуловирус).

Необязательно функции rep обеспечиваются с помощью AAV, отличного от hu68. В определенных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере часть функций rep взята из AAVhu68. См., например, последовательности rep, кодирующие белки rep с SEQ ID NO: 4, и их функциональные фрагменты. AAV rep может быть кодирован последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретения белок rep представляет собой гетерологичный белок rep, отличный от AAVhu68rep, например, но не ограничиваясь ими, белок rep AAV1, белок rep AAV2, белок rep AAV3, белок rep AAV4, белок rep AAV5, белок rep AAV6, белок rep AAV7, белок rep AAV8; или rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep 68/78 и rep40/52; или его фрагмент; или белок из другого источника. Необязательно, последовательности rep и cap находятся на одном и тот же генетическом элементе в культуре клеток. Может быть спейсер между последовательностью rep и геном cap. Необязательно, спейсер представляет собой atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. Любой из этих AAVhu68 или мутантных капсидных последовательностей AAV может быть под контролем экзогенных регуляторных последовательностей контроля, которые направляют их экспрессию в клетке-хозяине.

В одном варианте осуществления изобретения клетки производятся в подходящей клеточной культуре (например, НЕК 293) клеток. Способы производства векторов генной терапии, описанные в данном документе, включают способы, хорошо известные в данной области техники, такие как образование плазмидной ДНК, используемой для получения векторов генной терапии, генерации векторов и очистки векторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор для генной терапии представляет собой вектор AAV, a создаваемые плазмиды являются цис-плазмидой AAV, кодирующей геном AAV и представляющий интерес ген, транс-плазмидой AAV, содержащей rep и cap гены AAV, и аденовирусную вспомогательную плазмиду. Процесс генерации вектора может включать в себя этапы способа, такие как инициация клеточной культуры, пассаж клеток, посев клеток, трансфекция клеток с помощью плазмидной ДНК, пост-трансфекционная замена среды на среду без сыворотки и сбор клеток, содержащих вектор, и культуральной среды. Собранные содержащие вектор клетки и культуральные среды, упоминаются в данном документе, как неочищенный сбор клеток. В еще одной системе, векторы генной терапии, вводят в клетки насекомых инфекцией векторами на основе бакуловируса. Обзоры этих систем продуцирования см., в целом, например, у Zhang et al, 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for largescale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Способы создания и использования этих и других систем продуцирования AAV также описаны в следующих патентах США, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки: 5139941; 5741683; 6057152; 6204059;6268213;6491907;6660514;6951753; 7094604; 7172893; 7201898; 7229823; и 7439065.

Неочищенный сбор клеток после этого может быть подвергнут этапам способа, таким как концентрирование сбора вектора, диафильтрация сбора вектора, микрофлюидизация сбора вектора, расщепление нуклеазой сбора вектора, фильтрация микрофлуидизированного промежуточного продукта, очистка неочищенного сбора с помощью хроматографии, очистка неочищенного сбора с помощью ультрацентрифугирования, буферный обмен путем фильтрации с тангенциальным потоком и/или составление и фильтрование с получением нерасфасованной субстанции вектора.

Двухэтапная аффинная хроматографическая очистка при высокой концентрации соли с последующей хроматографией на анионообменной смоле используется для очистки векторного лекарственного препарата и удаление пустых капсидов. Эти способы описаны более подробно в международной патентной заявке PCT/US2016/065970, поданной 9 декабря 2016 года, и ее приоритетных документах, заявке на патент США № 62/322,071, поданной 13 апреля 2016 г. и 62/226,357, поданной 11 декабря 2015 г. и озаглавленной Масштабируемый способ очистки AAV9, которые включены в данный документ посредством ссылки. Способы очистки AAV8, международная патентная заявка № PCT/US2016/065976, поданная 9 декабря 2016 г., и ее приоритетные документы -патентная заявка США № 62/322,098, поданная 13 апреля 2016 г., и 62/266,341, поданная 11 декабря 2015 г., и rhlO, международная патентная заявка № PCT/US16/66013, поданная 9 декабря 2016 г., и ее приоритетные документы - патентная заявка США № 62/322,055, поданная 13 апреля 2016 г. и 62/266,347, озаглавленная Масштабируемый способ очистки AAVrh10, также поданная 11 декабря 2015 г., и AAV1, международная патентная заявка № PCT/US2016/065974, поданная 9 декабря 2016 г., и ее приоритетные документы - патентная заявка США № 62/322,083, поданная 13 апреля 2016 г. и 62/26,351 под названием Масштабируемый способ очистки AAV1, поданная 11 декабря 2015 года, включенные в данный документ посредством ссылки.

Чтобы рассчитать содержании пустых и полных частицы, объемы полос VP3 для выбранного образца (например, в примерах в данном документе очищенный препарат в градиенте йодиксанола, где колич. GC=колич. частиц) приведены на графике зависимости от нагруженных GC частиц. В результате используется линейное уравнение (y=mx+c) для расчета количества частиц в объемах полос тестируемого препарата. Количество частиц (ч.) на 20 мкл нанесения затем умножается на 50 с получением значения частиц (ч.)/мл. Значение ч./мл, деленное на GC/мл, дает соотношение частиц к копиям генома (ч./GC). Расчет ч./мл^С/мл дает значение пустые ч./мл. Значение пустые ч./мл делятся на ч./мл и х100, давая

- 32 048431 процент пустых частиц.

Как правило, способы анализа на пустые капсиды и векторные частицы AAV с упакованными геномами известны в данной области техники. См., например, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:13221330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128. Для проверки денатурированного капсида, способы включают в себя прохождение обработанного исходного AAV электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, состоящего из любого геля, способного отделять три капсидных белка, например градиентный гель, содержащий 3-8% Трис-ацетата в буфере, затем проводят гель-электрофорез, пока материал образца не разделится, и блоттинг геля на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах, предпочтительно нейлоновых. Затем используют антитела против капсида AAV в качестве первичных антител, которые связываются с денатурированными капсидными белками, предпочтительно -моноклональное антитело против капсида AAV, наиболее предпочтительно моноклональное антитело В1 против AAV-2 (Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). Затем используется вторичное антитело, то, которое связывается с первичным антителом и содержит средство для определения связывания с первичным антителом, более предпочтительно представляет собой анти-IgG антитело, содержащее молекулу обнаружения, ковалентно связанную с ним, наиболее предпочтительно овечье антитело против мышиного IgG, ковалентно связанное с пероксидазой хрена. Способ определения связывания используется для полуколичественного определения связывания между первичными и вторичными антителами, предпочтительно способ обнаружения, способен обнаруживать радиоактивные излучения изотопов, электромагнитное излучение или колориметрические изменения, наиболее предпочтителен набор для обнаружения хемилюминесценции. Например, для SDS-PAGE образцы из фракций колонки могут быть взяты и нагреты в загрузочном буфере для SDS-PAGE, содержащем восстанавливающий агент (например, DTT), и капсидные белки разделяли на предварительно полученных полиакриламидных гелях с градиентом (например, Novex). Окрашивание серебром может быть выполнено с использованием SilverXpress (Invitrogen, штат Калифорния, США) в соответствии с инструкциями изготовителя или другим подходящим способом окрашивания, т.е. красителями SYPRO руби или кумасси. В одном варианте осуществления изобретения концентрация векторных геномов (вг) AAV во фракциях колонки может быть измерена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (Q-PCR). Образцы разводят и расщепляют с помощью ДНКазы I (или другой подходящей нуклеазы), чтобы удалить экзогенную ДНК. После инактивации нуклеазы, образцы дополнительно разбавляют и амплифицируют с использованием праймеров и флуорогенного зонда TaqMan™, специфичного для ДНК-последовательности между праймерами. Количество циклов, необходимых для достижения определенного уровня флуоресценции (пороговый цикл, Ct), измеряется для каждого образца на системе обнаружения последовательности Applied Biosystems Prism 7700. Плазмидная ДНК, содержащая идентичные последовательности, которая содержится в векторе AAV, используется для получения стандартной кривой в реакции Q-PCR. Значения порогового цикла (Ct), полученные для образцов, используют для определения титра векторных геномов путем нормализации его со значением Ct стандартной кривой для плазмиды. Также можно использовать анализы по конечным точкам, основанные на цифровой ПЦР.

В одном аспекте, используют оптимизированный способ q-PCR, в котором применяется сериновая протеаза широкого спектра, например протеиназа К (например, коммерчески доступная от Qiagen). Более конкретно, оптимизированный кПЦР-анализ титра генома похож на стандартный анализ, за исключением того, что после расщепления ДНКазой I, образцы разбавляют буфером для протеиназы К и обрабатывают протеиназой К с последующим термической инактивацией. Подходящие образцы разбавляют буфером для протеиназы К в количестве, равном размеру образца. Буфер для протеиназы К может быть сконцентрирован до 2 раз или выше. Как правило, обработка протеиназой К составляет около 0,2 мг/мл, но может изменяться в пределах от 0,1 мг/мл до около 1 мг/мл. Этап обработки обычно проводят при температуре около 55 °С в течение около 15 мин, но она может быть выполнена при более низкой температуре (например, от около 37°С до около 50°С) в течение большего периода времени (например, от около 20 мин до около 30 мин), или более высокой температуре (например, около вплоть до 60°С) в течение более короткого периода времени (например, около от 5 до 10 мин). Аналогичным образом, термическая инактивация, как правило, при температуре около 95 °С в течение около 15 мин, но температура может быть снижена (например, от около 70 до около 90°С) и время увеличено (например, от около 20 мин до около 30 мин). Образцы затем разбавляют (например, в 1000 раз) и подвергают анализу TaqMan, как описано в стандартном анализе.

Кроме того, или в качестве альтернативы, может быть использована капельная цифровая ПЦР (кцПЦР). Например, были описаны способы определения титров одноцепочечного и самокомплементарного векторного генома AAV с помощью кцПЦР. См., например, М. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14.

Вкратце, способ отделения частиц rAAVhu68, имеющих упакованные геномные последовательности, от дефицитных по геному промежуточных частиц AAVhu68, включает в себя прохождение суспензии, содержащей рекомбинантные вирусные частицы AAVhu68 и промежуточные капсидные частицы AAVhu689, через жидкостную хроматографию быстрого разрешения, при которой вирусные частицы AAVhu68 и промежуточные частицы AAVhu68 связываются с сильной анионообменной смолой, уравно

- 33 048431 вешенной при рН 10,2, и воздействие солевого градиента, отслеживая элюат на ультрафиолетовую абсорбцию при около 260 и около 280. Несмотря на то, что это является менее оптимальным для rAAV9hu68, значение, рН может находиться в диапазоне около от 10,0 до 10,4. В этом способе полные капсиды AAVhu68 собирают из фракции, которую элюируют, когда отношение А260/А280 достигает точки перегиба. В одном примере для этапа аффинной хроматографии, диафильтрованный продукт может быть нанесен на аффинную смолу Capture Select™ Poros-AAV2/9 (Life Technologies), которая эффективно захватывает серотип AAV2/hu68. В этих ионных условиях значительный процент остаточной клеточной ДНК и белков протекает через колонку, в то время как частицы AAV эффективно захватываются.

III. Композиции и применение.

Представленные в данном документе композиции содержат по меньшей мере один исходный rAAV (например, исходный rAAVhu68 или мутантный исходный rAAV) и дополнительный носитель, эксципиент и/или консервант. Исходный rAAV относится к множеству векторов rAAV, которые являются одинаковыми, например, такими, как в количествах, описанных ниже при обсуждении концентраций и единиц дозирования.

Используемый в данном документе термин носитель включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, носители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы носителей, суспензии, коллоиды и тому подобное. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в эти композиции. Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным веществам и композициям, которые при введении в организм хозяина не вызывают аллергическую или подобную неблагоприятную реакцию. Носители доставки, такие как липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, микросферы, липидные частицы, везикулы и тому подобное, могут быть использованы для введения композиций по данному изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, вектор rAAV, доставляющий векторные геномы, может быть приготовлен для доставки либо инкапсулированным в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, либо наночастице или тому подобном.

В одном варианте осуществления изобретения композиция включает в готовый состав, пригодный для доставки субъекту, например, представляет собой водную жидкую суспензию, забуференную до физиологически совместимого рН и концентрации соли. Необязательно, в композиции присутствует одно или более поверхностно-активных веществ. В другом варианте осуществления изобретения композиция может транспортироваться в виде концентрата, который разбавляют для введения субъекту. В других вариантах осуществления изобретения композиция может быть лиофилизирована и восстановлена во время введения.

Подходящее поверхностно-активное вещество или комбинация поверхностно-активных веществ могут быть выбраны среди неионогенных поверхностно-активных веществ, которые являются нетоксичными. В одном варианте осуществления изобретения выбирают поверхностно-активное вещество с бифункциональным блок-сополимером, оканчивающееся первичными гидроксильными группами, например, такое как Pluronic® F68 [BASF], также известное как полоксамер 188, которое имеет нейтральный рН и среднюю молекулярную массу 8400. Могут быть выбраны другие поверхностно-активные вещества и другие полоксамеры, т.е. неионогенные триблок-сополимеры, состоящие из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)), SOLUTOL HS 15 (макрогол-15 гидроксистеарат), LABRASOL (полиоксикаприловый глицерид), полиокси-10-олеиловый эфир, TWEEN (сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот), этанол и полиэтиленгликоль. В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит полоксамер. Эти сополимеры обычно называют буквой Р (по полоксамеру), за которой следуют три цифры: первые две цифры х100 дают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра х10 показывает процентное содержание полиоксиэтилена. В одном варианте осуществления изобретения выбран полоксамер 188. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в суспензии в количестве от около 0,0005% до около 0,001%.

Векторы вводят в количествах, достаточных для трансфекции клеток и обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов, чтобы обеспечить терапевтический эффект без нежелательных побочных эффектов, или с медицинской точки зрения приемлемых физиологических эффектов, которые могут быть определены специалистами в области медицины. Обычные и их фармацевтически приемлемые способы введения включают, но не ограничиваются ими, прямую доставку до требуемого органа (например, печени (необязательно через печеночную артерию), легкого, сердца, глаза, почки), оральный, ингаляционный, интраназальный, интратекальный, интратрахеальный, внутриартериальный, внутриглазной, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутридермальный и другие парэнтеральные пути введения. Пути введения при желании можно комбинировать.

Дозировки вирусного вектора будут зависеть главным образом от таких факторов, как состояние, которое лечится, возраст, вес и состояние здоровья пациента, и таким образом, могут меняться в зависимости от пациентов. Например, терапевтически эффективная дозировка для человека вирусного вектора

- 34 048431 находится, как правило, в интервале от около 25 до около 1000 микролитров, до около 100 мл раствора, содержащего концентрации от около 1х 10⁹ до 1х 10¹⁶ геномов вирусного вектора. Дозировка будет подбираться таким образом, чтобы сбалансировать терапевтическую пользу с любыми побочными эффектами, и такие дозы могут варьироваться в зависимости от терапевтического применения, для которого используется рекомбинантный вектор. Уровни экспрессии трансгенного продукта можно отслеживать, чтобы определить результирующую частоту дозирования вирусных векторов, предпочтительно векторов AAV, содержащих миниген. Необязательно, режимы дозирования, аналогичные тем, которые описаны для терапевтических целей, могут быть использованы для иммунизации с использованием композиций согласно изобретению.

Композиции дефектного по репликации вируса может быть приготовлена в виде дозированных единиц так, чтобы содержать количество дефектного по репликации вируса, который находится в диапазоне от около 1,0х10⁹ GC до около 1,0х10¹⁶ GC (для лечения среднего субъекта с массой тела 70 кг), включая все целые или дробные значения в пределах этого диапазона, и предпочтительно от 1,0х10¹² GC до 1,0х10¹⁴ GC для пациента-человека. В одном варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1х10⁹, 2х10⁹, 3х10⁹, 4х10⁹, 5х10⁹, 6х10⁹, 7х10⁹, 8х10⁹ или 9х10⁹ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1 х 10¹⁰, 2х10¹⁰, 3х10¹⁰, 4х10¹⁰, 5х10¹⁰, 6х10¹⁰, 7х10¹⁰, 8х10¹⁰ или 9х10¹⁰ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1х 10¹¹, 2х1011, 3х 10¹¹, 4х1011, 5х 10¹¹, 6х 10¹¹, 7х1011, 8х 10¹¹ или 9х 10¹¹ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1 х 10¹², 2х10¹², 3х10¹², 4х10¹², 5х10¹², 6х10¹², 7х10¹², 8х10¹² или 9х10¹² GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1х 10¹³, 2х10¹³, 3х10¹³, 4х10¹³, 5х10¹³, 6х10¹³, 7х10¹³, 8х10¹³ или 9х10¹³ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1 х 10¹⁴, 2х10¹⁴, 3х10¹⁴, 4х10¹⁴, 5х10¹⁴, 6х10¹⁴, 7х10¹⁴, 8х10¹⁴ или 9х10¹⁴ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения композиции составлены с возможностью содержать по меньшей мере 1х 10¹⁵, 2х10¹⁵, 3х10¹⁵, 4х10¹⁵, 5х10¹⁵, 6х10¹⁵, 7х10¹⁵, 8х 10¹⁵ или 9х 10¹⁵ GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне. В одном варианте осуществления изобретения с целью применения для человека доза может находиться в диапазоне от 1 х 10¹⁰ до около 1х 10¹² GC на дозу, включая все целые или дробные значения в этом диапазоне.

Эти указанные выше дозы могут вводиться в различных объемах носителей, эксципиентов или буферных составов в диапазоне от около 25 до около 1000 микролитров, включая все числа в этом диапазоне, в зависимости от размера области, предназначенной для обработки, используемого вирусного титра, пути введения и желаемого воздействия способа. В одном варианте осуществления объем носителя, эксципиента или буфера составляет по меньшей мере около 25 мкл. В одном варианте осуществления изобретения объем составляет около 50 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 75 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 100 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 125 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 150 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 175 мкл. В еще другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 200 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 225 мкл. В еще другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 250 мкл. В еще другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 275 мкл. В еще другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 300 мкл. В еще другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 325 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 350 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 375 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 400 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 450 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 500 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 550 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 600 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 650 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет около 700 мкл. В другом варианте осуществления изобретения объем составляет между около 700 и 1000 мкл.

В определенных вариантах осуществления изобретения доза может находиться в диапазоне от около 1х 10⁹ GC/г массы головного мозга до около 1х 10¹² GC/г массы головного мозга. В определенных вариантах осуществления изобретения доза может находиться в диапазоне от около 3х10¹⁰ GC/г массы головного мозга до около 3х1011 GC/г массы головного мозга. В определенных вариантах осуществления

- 35 048431 изобретения доза может находиться в диапазоне от около 5х10¹⁰ GC/г массы головного мозга до около 1,85 х 1011 GC/г массы головного мозга.

В одном варианте осуществления изобретения вирусные конструкции могут быть доставлены в дозах от по меньшей мере около по меньшей мере 1х10⁹ GC до около 1х 10¹⁵, или около 1x1011 до 5х10¹³ GC. Подходящие объемы для доставки этих доз и концентраций могут быть определены специалистом в данной области. Например, могут быть выбраны объемы от 1 мкл до 150 мл, причем более высокие объемы выбираются для взрослых. Как правило, для новорожденных младенцев подходящий объем составляет от около 0,5 мл до около 10 мл, для более старших младенцев может быть выбран объем от около 0,5 мл до около 15 мл. Для детей преддошкольного возраста может быть выбран объем от около 0,5 мл до около 20 мл. Для детей, могут быть выбраны объемы до около 30 мл. Для предпубертатных подростков и подростков, могут быть выбраны объемы до около 50 мл. В еще других вариантах осуществления изобретения пациент может получать интратекальное введение в выбранном объеме от около 5 мл до около 15 мл, или от около 7,5 мл до около 10 мл. Могут быть определены другие подходящие объемы и дозировки. Дозировка будет подбираться таким образом, чтобы сбалансировать терапевтическую пользу с любыми побочными эффектами, и такие дозы могут варьироваться в зависимости от терапевтического применения, для которого используется рекомбинантный вектор.

Описанные выше рекомбинантные векторы могут быть доставлены к клеткам-хозяевам согласно опубликованным способам. rAAV, предпочтительно суспендированные в физиологически совместимом носителе, могут быть введены в организм пациента-человека или млекопитающего, не являющегося человеком. В определенных вариантах осуществления изобретения для введения пациенту-человеку rAAV подходящим образом суспендируют в водном растворе, содержащем солевой раствор, поверхностноактивное вещество и физиологически совместимую соль или смесь солей. Соответственно, состав доводят до физиологически приемлемого значения рН, например, в диапазоне рН от 6 до 9 или рН от 6,5 до 7,5, рН от 7,0 до 7,7 или рН от 7,2 до 7,8. Поскольку рН спинномозговой жидкости составляет от около 7,28 до около 7,32, для интратекальной доставки может быть желательным значение рН в этом диапазоне; тогда как для внутривенной доставки может быть желательным рН от около 6,8 до около 7,2. Однако другие значения рН в самых широких диапазонах и эти поддиапазоны могут быть выбраны для другого пути доставки.

В другом варианте осуществления изобретения композиция включает в себя носитель, разбавитель, эксципиент и/или адъювант. Подходящие носители могут быть легко выбраны специалистом в данной области с учетом показания, для которого предназначен вирус переноса. Например, один подходящий носитель включает физиологический раствор, который может быть приготовлен с различными буферными растворами (например, натрий-фосфатным буфером). Другие типичные носители включают в себя стерильный физиологический раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстран, агар, пектин, арахисовое масло, кунжутное масло и воду. Буфер/носитель должен включать в себя компонент, который предотвращает прилипание rAAV к инфузионной трубке, но не мешает активности связывания rAAV in vivo. Подходящее поверхностно-активное вещество или комбинация поверхностно-активных веществ могут быть выбраны среди неионогенных поверхностно-активных веществ, которые являются нетоксичными. В одном варианте осуществления изобретения выбирают поверхностно-активное вещество с бифункциональным блок-сополимером, оканчивающееся первичными гидроксильными группами, например, такое как Pluronic® F68 [BASF], также известное как полоксамер 188, которое имеет нейтральный рН и среднюю молекулярную массу 8400. Могут быть выбраны другие поверхностно-активные вещества и другие полоксамеры, т.е. неионогенные триблок-сополимеры, состоящие из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)), SOLUTOL HS 15 (макрогол-15 гидроксистеарат), LABRASOL (полиоксикаприловый глицерид), полиокси-олеиловый эфир, TWEEN (сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот), этанол и полиэтиленгликоль. В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит полоксамер. Эти сополимеры обычно называют буквой Р (по полоксамеру), за которой следуют три цифры: первые две цифры х 100 дают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра х 10 показывает процентное содержание полиоксиэтилена. В одном варианте осуществления изобретения выбран полоксамер 188. Поверхностноактивное вещество может присутствовать в суспензии в количестве от около 0,0005% до около 0,001%. · В одном примере композиция может содержать, например, забуференный солевой раствор, содержащий один или более из хлорида натрия, бикарбоната натрия, декстрозы, сульфата магния (например, сульфат магния · 7Н2О), хлорида калия, хлорида кальция (например, хлорид кальция 2Н2О), двухосновный фосфат натрия и их смеси в воде. Соответственно, для интратекальной доставки осмолярность находится в диапазоне, совместимом со спинномозговой жидкостью (например, от около 275 до около 290); см., например, emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview. Необязательно, для интратекальной доставки коммерчески доступный разбавитель может быть использован в качестве суспендирующего агента или в комбинации с другим суспендирующим агентом и другими необязательными эксципиентами. См., например, раствор Эллиота В® [Lukare Medical]. В других вариантах осуществления изобретения состав

- 36 048431 может содержать один или более усилителей проницаемости. Примеры подходящих усилителей проницаемости могут включать в себя, например, маннит, гликохолат натрия, таурохолат натрия, дезоксихолат натрия, салицилат натрия, каприлат натрия, капрат натрия, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9лауреловый эфир или ЭДТА.

Необязательно, композиция данного изобретения может содержать, помимо rAAV и носителя(-ей), другие традиционные фармацевтические ингредиенты, такие как консерванты или химические стабилизаторы. К подходящим примерам консервантов относится хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновая кислота, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол и парахлорфенол. К подходящим химическим стабилизаторам относятся желатин и альбумин.

Композиции согласно данному изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, такой как определено выше. Соответственно, композиции, описанные в данном документе, содержат эффективное количество одного или более AAV, суспендированных в фармацевтически подходящем носителе и/или смешанных с подходящими эксципиентами, предназначенных для доставки субъекту посредством инъекции, осмотического насоса, интратекального катетера или для доставки другим устройством или путем. В одном примере композиция составлена для интратекальной доставки.

Используемые в данном документе термины интратекальная доставка или интратекальное введение относятся к пути введения лекарственных средств посредством инъекции в позвоночный канал, более конкретно в субарахноидальное пространство, так что он достигает спинномозговой жидкости (СМЖ). Интратекальная доставка может включать люмбальную пункцию, внутрижелудочковую (включая интрацеребровентрикулярную (ICV)), субокципитальную/интрацистернальную и/или С1-2 пункцию. Например, материал может быть введен для диффузии по всему субарахноидальному пространству посредством люмбальной пункции. В другом примере инъекция может осуществляться в мостомозжечковую цистерну.

Используемые в данном документе термины интрацистернальная доставка или интрацистернальное введение относятся к способу введения лекарственных средств непосредственно в спинномозговую жидкость большой церебелломодярной цистерны, более конкретно, через субокципитальную пункцию или путем прямой инъекции в мостомозжечковую цистерну или через постоянно установленную трубку.

IV. Устройство и способ доставки фармацевтической композиции в спинномозговую жидкость.

В одном аспекте векторы, представленные в данном документе, можно вводить интратекально с помощью способа и/или устройства, представленного в этом разделе и описанного далее на фиг. 7. В качестве альтернативы могут быть выбраны другие устройства и способы. Способ включает в себя этапы введения в позвоночник иглы в мостомозжечковую цистерну пациента, соединения отрезка гибкой трубки с проксимальной канюлей спинномозговой иглы и выпускного отверстия клапана с проксимальным концом гибкой трубки и после указанных этапов введения и соединения и после того, как трубка сможет самонаполняться спинномозговой жидкостью пациента, подсоединяют первый сосуд, содержащий некоторое количество изотонического раствора, к промывочному впускному отверстию клапана и затем соединяют второй сосуд, содержащий некоторое количество фармацевтической композиции, с векторным впускным отверстием клапана. После подключения первого и второго сосудов к клапану открывается путь для потока жидкости между векторным впускным отверстием и выпускным отверстием клапана, и фармацевтическая композиция вводится пациенту через спинальную иглу, и после введения фармацевтической композиции путь для потока жидкости открывается через промывочное впускное отверстие и выпускное отверстие клапана, и изотонический раствор вводится в спинальную иглу для смывания фармацевтической композиции в организм пациента.

В другом аспекте предложено устройство для интрацистернальной доставки фармацевтической композиции. Устройство включает в себя первый сосуд, содержащий некоторое количество фармацевтической композиции, второй сосуд, содержащий изотонический раствор, и спинальную иглу, через которую фармацевтическая композиция может быть впрыснута из устройства непосредственно в спинномозговую жидкость внутрь мостомозжечковой цистерны пациента. Устройство дополнительно включает в себя клапан, имеющий первое впускное отверстие, соединенное с первым сосудом, второе впускное отверстие, соединенное со вторым сосудом, выпускное отверстие, соединенное со спинальной иглой, и затвор конуса Люэра для управления потоком фармацевтической композиции и изотонического раствора, проходящих через спинальную иглу.

Используемый в данном документе термин компьютерная томография (КТ) относится к рентгенографии, в которой трехмерное изображение структуры тела создается компьютером из серии плоских изображений поперечного сечения, сделанных вдоль оси.

Устройство или медицинское устройство 10, как показано на фиг. 7, включает в себя один или более сосудов 12 и 14, соединенных между собой клапаном 16. Сосуды 12 и 14 обеспечивают свежий источник фармацевтической композиции, лекарственного средства, вектора или подобного вещества и свежий источник изотонического раствора, такого как физиологический раствор, соответственно. Сосуды 12 и 14 могут представлять собой медицинское устройство любой формы, которое позволяет вводить жидкости пациенту.

- 37 048431

Например, каждый сосуд 12 и 14 может быть выполнен в форме шприца, канюли или тому подобного. Например, в проиллюстрированном варианте осуществления изобретения сосуд 12 выполнен в виде отдельного шприца, содержащего некоторое количество фармацевтической композиции, и он называется в данном документе векторным шприцем. Только для целей примера сосуд 12 может содержать около 10 куб. см фармацевтической композиции или тому подобного.

Аналогично, сосуд 14 может быть выполнен в форме отдельного шприца, канюли или тому подобного, который содержит некоторое количество солевого раствора и может называться промывочным шприцем. Только для целей примера сосуд 14 может содержать около 10 куб. см солевого раствора.

В качестве альтернативы, сосуды 12 и 14 могут быть выполнены в формах, отличных от шприцов, и могут быть интегрированы в одно устройство, например интегрированное медицинское инъекционное устройство, иметь пару отдельных камер, одну для фармацевтической композиции и одну для солевого раствора. Кроме того, размер камер или сосудов может быть предоставлен по необходимости, чтобы содержать желаемое количество жидкости.

В показанном варианте осуществления изобретения клапан 16 предусмотрен в качестве 4-ходового запорного крана, имеющего поворотный шарнир конуса Люэра 18. Клапан 16 соединяет сосуды 12 и 14 (т.е. векторный шприц и промывочный шприц в проиллюстрированном варианте осуществления изобретения), и поворотный шарнир конуса Люэра позволяет закрывать или открывать путь через клапан 16 к каждому из сосудов 12 и 14. Таким образом, путь через клапан 16 может быть закрыт как для векторного шприца, так и для промывочного шприца, или может быть открыт для выбранного одного из векторного шприца и промывочного шприца. В качестве альтернативы 4-ходового запорного крана, клапан может быть 3-ходовым запорным краном или устройством управления жидкостью.

В проиллюстрированном варианте осуществления изобретения клапан 16 соединен с одним концом удлинительной трубки 20 или подобного контура для жидкости. Трубка 20 может быть выбрана на основе желаемой длины или внутреннего объема. Только в качестве примера длина трубки может составлять от 6 до 7 дюймов.

В проиллюстрированном варианте осуществления изобретения противоположный конец 22 трубки 12 соединен с набором 24 удлинителей Т-образного соединителя, который, в свою очередь, соединен со спинальной иглой 26. В качестве примера, игла 26 может представлять собой пятидюймовую спинальную иглу 22 или 25 калибра. Кроме того, в качестве опции, спинальная игла 26 может быть соединена с проводниковой иглой 28, такой как проводниковая игла на три с половиной дюйма 18 калибра.

При использовании спинальная игла 26 и/или необязательная проводниковая игла 28 могут продвигаться у пациента по направлению к мостомозжечковой цистерне. После продвижения иглы могут быть получены изображения компьютерной томографии (КТ), которые позволяют визуализировать иглу 26 и/или 28 и соответствующие мягкие ткани (например, параспинальные мышцы, кости, ствол головного мозга и спинной мозг). Правильное размещение иглы подтверждается наблюдением за спинномозговой жидкостью (СМЖ) в игольной канюле и визуализацией кончика иглы в мостомозжечковой цистерне. После этого относительно короткая удлинительная трубка 20 может быть прикреплена к вставленной спинальной игле 26, а затем 4-ходовой запорный кран 16 может быть прикреплен к противоположному концу трубки 20.

Вышеуказанная сборка может стать самонаполняющейся СМЖ пациента. После этого, предварительно наполненный физиологическим раствором промывочный шприц 14 прикрепляется к промывному впускному отверстию 4-ходового запорного крана 16, а затем векторный шприц 12, содержащий фармацевтическую композицию, прикрепляется к векторному впускному отверстию 4-ходового запорного крана 16. После этого выпускное отверстие 16 запорного крана открывается к векторному шприцу 12, и содержимое векторного шприца может быть медленно введено через клапан 16 и собранный аппарат в организм пациента в течение определенного периода времени. Только для целей примера этот период времени может составлять приблизительно 1-2 минуты и/или любое другое время по желанию.

После впрыскивания содержимое векторного шприца 12 поворотные затворы 18 на запорном кране 16 поворачиваются во второе положение, таким образом, чтобы запорный кран 16 и узел иглы может быть промыт с желаемым количеством физиологического раствора с использованием присоединенного предварительно наполненного промывочного шприца 14. В качестве примера можно использовать от 1 до 2 куб. см физиологического раствора; хотя при необходимости могут использоваться большее или меньшее количество. Обычный физиологический раствор обеспечивает принудительное введение всей или большей части фармацевтической композиции через собранное устройство пациенту и, таким образом, небольшое количество фармацевтической композиции остается на собранном устройстве или не остается совсем.

После того, как собранное устройство было промыто физиологическим раствором, собранное устройство целиком, включая иглу(ы), удлинительную трубку, запорный кран и шприцы, медленно удаляется из субъекта и помещается на хирургический лоток для переноса в емкость для биологически опасных отходов или жесткий контейнер (для иглы (игл)).

Главный исследователь может провести процесс скрининга, что в конечном итоге приведет к интрацистернальной (IC) процедуре. Главный исследователь может описать процесс, процедуру, саму про

- 38 048431 цедуру введения и все потенциальные риски для безопасности с целью того, чтобы субъект (или назначенный опекун) был полностью информирован. Получают данные истории болезни, сопутствующих лекарств, медицинского осмотра, показателей жизненно важных функций, электрокардиограмму (ЭКГ) и результатов лабораторных исследований или они выполняются и предоставляются нейрорадиологу, нейрохирургу и анестезиологу для использования при скрининговой оценке пригодности субъекта для проведения процедуры IC.

Чтобы обеспечить достаточное время для проверки соответствия требованиям, в любое время между первым визитом скрининга и до одной недели до визита исследования могут быть выполнены следующие процедуры. Например, в день 0 может быть получена магнитно-резонансная томография (МРТ) головы/шеи с гадолинием и без него (т.е. eGFR >30 мл/мин/1,73 м2). В дополнение к МРТ головы/шеи, исследователь может определить необходимость любой дальнейшей оценки шеи с помощью исследований сгибания/разгибания. Протокол МРТ может включать в себя изображения протокола Т1, Т2, DTI, FLAIR и CINE.

Кроме того, MRA/MRV головы/шеи может быть получено в соответствии с институциональным протоколом (т.е. субъекты с историей интра/трансдуральных операций могут быть исключены или могут нуждаться в дальнейшем тестировании (например, радионуклеотидная цистернография)), что позволяет адекватно оценивать поток СМЖ и определять возможную блокировку или отсутствие сообщения между пространствами СМЖ.

Нейрорадиолог, нейрохирург и анестезиолог в конечном итоге обсуждают и определяют пригодность каждого субъекта для проведения процедур IC на основе всей доступной информации (сканы, история болезни, медицинский осмотр, лабораторные анализы и т.д.). Предоперационная оценка анестезии может быть также получена с дня -28 до дня 1, которая обеспечивает детальную оценку дыхательных путей, шеи (укороченная/утолщенная) и диапазона движения головы (степень сгибания шеи), имея в виду особые физиологические потребности субъекта MPS.

Перед процедурой IC, комплекс КТ подтвердит наличие следующего оборудования и лекарств: набор для люмбальной пункции у взрослых (LP) (предоставляется для каждого учреждения); BD (Becton Dickinson) спинальная игла калибра 22 или 25x3-7(Quincke bevel); коаксиальная проводниковая игла, используемая по усмотрению интервенциониста (для введения спинальной иглы); 4-х ходовой запорный кран малого диаметра с поворотным шарниром конуса Люэра (Spin); набор удлинителей с Т-образным соединителем (трубки) с адаптером канюли Люэра, приблизительной длины 6,7 дюйма; Omnipaque 180 (йогексол) для интратекального введения; йодированный контраст для внутривенного (в/в) введения; 1% раствор лидокаина для инъекций (если не входит в комплект LP для взрослых); предварительно заполненный 10 куб. см физиологического раствора (стерильного) промывочный шприц; рентгеноконтрастный(-ые) маркер(-ы); оборудование для хирургической подготовки/бритва для бритья; подушки/опоры для правильного позиционирования интубированного субъекта; оборудование для эндотрахеальной интубации, аппарат общей анестезии и аппарат искусственной вентиляции легких; оборудование для интраоперационного нейрофизиологического мониторинга (IONM) (и необходимый персонал); и шприц объемом 10 куб. см, содержащий вектор; подготовленные и доставленные в комплекс КТ/операционной комнаты (OR) в соответствии с отдельным аптечным справочником.

Информированное соглашение на проведение процедуры подтверждено и задокументировано в медицинской карте и/или файле исследования. Отдельное согласие на проведение процедуры от рентгенологов и анестезиологов получено в соответствии с институциональными требованиями. Субъект имеет внутривенный доступ, размещенный в соответствующем отделении стационарной помощи в соответствии с институциональными инструкциями (например, два сайта для в/в доступа). Внутривенные жидкости назначаются по усмотрению анестезиолога. По усмотрению анестезиолога и в соответствии с институциональными инструкциями субъекту может быть осуществлена и проведена эндотрахеальная интубация под общей анестезией в соответствующем отделении ухода за пациентами, в зоне ожидания или в комплексе хирургических/КТ процедур.

Выполняется люмбальная пункция, сначала для удаления 5 куб. см спинномозговой жидкости (СМЖ), а затем для внутрикожного введения контраста (Omnipaque 180), чтобы помочь визуализации мостомозжечковой цистерны. Соответствующие маневры для позиционирования субъекта могут быть выполнены для облегчения диффузии контраста в мостомозжечковую цистерну.

Оборудование интраоперационного нейрофизиологического мониторинга (IONM) прикрепляют к субъекту. Субъект помещается на стол сканера КТ в положении лежа или в положении лежа на боку. Должен присутствовать соответствующий персонал для обеспечения безопасности субъекта во время транспортировки и размещения. Если это будет сочтено целесообразным, субъект может быть расположен таким образом, который обеспечивает сгибание шеи до степени, определяемой как безопасная во время предоперационной оценки, и с нормальными сигналами нейрофизиологического монитора, задокументированными после позиционирования.

Соответствующий персонал может быть подтвержден в отношении присутствия и идентифицирован в медицинском центре: интервенционист/нейрохирург, выполняющий процедуру; анестезиолог и лаборант(-ы) обеспечения дыхания; медсестры и помощники врача; лаборанты КТ (или OR); специалист

- 39 048431 по нейрофизиологии; и координатор центра. Тайм-аут может быть выполнен в соответствии с протоколом Объединенной комиссии/больницы, чтобы проверить соответствие субъекта, процедуры, центра, расположения и наличия всего необходимого оборудования в комнате. Ведущий исследователь центра может затем подтвердить сотрудникам, что он/она может приступить к подготовке субъекта.

Кожа субъекта под основанием черепа выбривается соответствующим образом. Выполняются снимки предварительного сканирования КТ с последующим КТ предпроцедурного планирования с в/в контрастом, если интервенционист посчитает необходимым локализовать целевое местоположение и изображение сосудистой системы. После того, как целевой участок (мостомозжечковая цистерна) определен и спланирована траектория иглы, кожа подготавливается и драпируется с использованием стерильной техники в соответствии с установленными инструкциями. Рентгеноконтрастный маркер помещается на целевую область кожи, как указано интервенционистом. Кожа под маркером анестезируется путем инфильтрации 1% лидокаином. Спинальная игла 22G или 25G затем продвигается к мостомозжечковой цистерне с возможностью использования коаксиальной проводниковой иглы.

После продвижения иглы КТ-изображения получают с использованием наименьшей толщины среза КТ, возможной с использованием установленного оборудования (в идеале <2,5 мм). Получают серийные КТ-изображения с использованием минимально возможной дозы облучения, которая обеспечивает адекватную визуализацию иглы и соответствующих мягких тканей (например, параспинальных мышц, кости, ствола мозга и спинного мозга). Правильное размещение иглы подтверждается наблюдением за СМЖ в игольной канюле и визуализацией кончика иглы в мостомозжечковой цистерне.

Интервенционист подтверждает, что векторный шприц расположен близко, но вне стерильного поля. Перед обработкой или введением фармацевтической композиции в векторный шприц персонал, выполняющий процедуру в стерильной области, надевает перчатки, маску и средства защиты глаз.

Удлинительная трубка прикрепляется к вставленной спинальной игле, которая затем прикрепляется к 4-ходовому запорному крану. После того, как этот аппарат самонаполняется СМЖ субъекта, 10 куб. см предварительно заполненный обычным физиологическим раствором промывочный шприц прикрепляется к промывочному впускному отверстию 4-ходовой запорного крана. Векторный шприц затем предоставляется интервенционистам и присоединяется к векторному впускному отверстию на 4-ходовом запорном кране.

После того, как выпускное отверстие из крана открыто к векторному шприцу путем помещения поворотного шарнира запорного крана в первое положение, содержимое векторного шприца вводят медленно (в течение примерно 1-2 мин), с осторожностью, чтобы не применять чрезмерное усилие к поршню шприца во время инъекции. После впрыскивания содержимого векторного шприца поворотные затворы запорного крана поворачиваются во второе положение, таким образом, чтобы запорный кран и узел иглы может быть промыт с 1-2 куб.см физиологического раствора с использованием присоединенного предварительно наполненного промывочного шприца.

При готовности, интервенционист предупреждает персонал, чтобы он/она снимал аппарат с субъекта. Одним движением иглу, удлинительную трубку, запорный кран и шприцы медленно удаляют из субъекта и помещают на хирургический лоток для переноса в емкость для биологически опасных отходов или жесткий контейнер (для иглы).

Место введения иглы исследуется на наличие признаков кровотечения или утечки СМЖ и обрабатывается в соответствии с указаниями исследователя. Место закрывается с помощью марли, хирургической ленты и/или повязки Tegaderm, как указано. Затем субъекта убирают из КТ-сканера и помещают в положении на спине на носилки. Соответствующий персонал присутствует для обеспечения безопасности субъекта во время транспортировки и размещения.

Анестезия прекращается, и пациент должен соблюдать следующие институциональные рекомендации по лечению после анестезии. Нейрофизиологические мониторы удаляют с субъекта. Изголовок носилок, на которых лежит субъект, должен быть слегка приподнят (~30°) во время восстановления. Субъект доставляется в подходящее отделение ухода после анестезии в соответствии с институциональными инструкциями. После того, как субъект адекватно восстановил сознание и находится в стабильном состоянии, он/она будет допущен к соответствующему этажу/блоку для обязательных оценок, указанных в протоколе. В соответствии с протоколом будут проводиться неврологические оценки, и главный исследователь наблюдает за уходом за субъектом в сотрудничестве с больничным и исследовательским персоналом.

В одном варианте осуществления изобретения способ доставки композиции, представленный в данном документе, включает этапы: введение спинномозговой иглы в мостомозжечковую цистерну пациента; соединение отрезка гибкой трубки с проксимальной канюлей спинномозговой иглы и выпускного отверстия клапана с проксимальным концом гибкой трубки; после указанных этапов введения и соединения и после того, как трубка сможет самонаполняться спинномозговой жидкостью пациента, подсоединяют первый сосуд, содержащий некоторое количество изотонического раствора, к промывочному впускному отверстию клапана и затем соединяют второй сосуд, содержащий некоторое количество фармацевтической композиции, с векторным впускным отверстием клапана; после соединения указанных

- 40 048431 первого и второго сосудов с клапаном открывают путь для потока жидкости между векторным впускным отверстием и выпускным отверстием клапана и вводят фармацевтическую композицию пациенту через спинномозговую иглу; и после инъекции фармацевтической композиции открывают путь для потока жидкости через промывочное впускное отверстие и выпускное отверстие клапана и впрыскивают изотонический раствор в спинномозговую иглу, чтобы смыть фармацевтическую композицию пациенту. В определенном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает подтверждение правильного размещения дистального кончика спинномозговой иглы внутри мостомозжечковой цистерны перед тем, как соединить трубку и клапан с канюлей спинномозговой иглы. В некоторых вариантах осуществления изобретения этап подтверждения включает визуализацию дистального кончика спинномозговой иглы в пределах мостомозжечковой цистерны с помощью визуализации компьютерной томографии (КТ). В некоторых вариантах осуществления изобретения этап подтверждения включает в себя наблюдение за наличием спинномозговой жидкости пациента в канюле спинномозговой иглы.

В вышеописанном способе клапан может быть запорным краном с поворотным шарниром Люэра, выполненным с возможностью поворота в первое положение, открывающее поток из векторного впускного отверстия в выпускное отверстие, одновременно блокируя поток через промывочное впускное отверстие, и во второе положение открывающее поток от промывочного впускного отверстия до выпускного отверстия, одновременно блокируя поток через векторное впускное отверстия, и при этом поворотный шарнир Люэра расположен в указанном первом положении, когда указанная фармацевтическая композиция впрыскивается пациенту, и расположен в указанном втором положении, когда указанную фармацевтическую композицию промывают указанному пациенту изотоническим раствором. В некоторых вариантах осуществления изобретения после введения изотонического раствора в спинальную иглу для промывки фармацевтической композиции пациенту спинальная игла у пациента извлекается с трубкой, клапаном и первым и вторым сосудами, соединенными с ней в этой сборке. В определенных вариантах осуществления изобретения клапан представляет собой 4-ходовой запорный кран с поворотным шарнирным конусом Люэра. В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй сосуды представляют собой отдельные шприцы. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-образный соединитель расположен на канюле спинномозговой иглы и соединяет трубку со спинальной иглой. Необязательно, спинальная игла включает в себя проводниковую иглу на дистальном конце спинальной иглы. Спинальная игла может представлять собой пятидюймовую спинальную иглу 22 или 24 калибра. В некоторых вариантах осуществления изобретения проводниковая игла представляет собой 3,5-дюймовую проводниковую иглу 18 калибра.

В определенных аспектах в способе используется устройство, которое состоит, как минимум, из первого сосуда для содержания некоторого количества фармацевтической композиции; второго сосуда для содержания изотонического раствора; спинномозговой иглы, через которую фармацевтическая композиция может быть извлечена из устройства непосредственно в спинномозговую жидкость внутри мостомозжечковой цистерны пациента; и клапана, имеющего первое впускное отверстие, соединенное с первым сосудом, второе впускное отверстие, соединенное со вторым сосудом, выпускное отверстие, соединенное со спинальной иглой, и люэровский затвор для управления потоком фармацевтической композиции и изотонического раствора через спинальную иглу. В некоторых вариантах осуществления изобретения клапан представляет собой запорный кран с поворотным шарниром Люэра, выполненным с возможностью поворота в первое положение, открывающее поток из первого впускного отверстия в выпускное отверстие, одновременно блокируя поток через второе впускное отверстие, и во второе положение, открывающее поток из второго впускного отверстия к выпускному отверстию, одновременно блокируя поток через первое впускное отверстие. Необязательно, клапан представляет собой 4-ходовой запорный кран с поворотным шарнирным конусом Люэра. В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй сосуды представляют собой отдельные шприцы. В некоторых вариантах осуществления изобретения спинальная игла соединена с клапаном посредством длины гибкой трубки. Тобразный соединитель может соединять трубку со спинальной иглой. В некоторых вариантах осуществления изобретения спинальная игла представляет собой пятидюймовую спинальную иглу 22 или 24 калибра. В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство дополнительно содержит проводниковую иглу, соединенную с дистальным концом спинальной иглы. Необязательно, проводниковая игла представляет собой 3,5-дюймовую проводниковую иглу 18 калибра.

Этот способ и это устройство каждый необязательно может использовать для интратекальной доставки композиций, представленных в данном документе. Альтернативно, для такой интратекальной доставки могут использоваться другие способы и устройства.

В определенных вариантах осуществления изобретения представлена композиция, которая содержит антитело rAAVhu68.anti-HER2 таким образом, чтобы векторы AAV несли экспрессионные кассеты нуклеиновых кислот, кодирующие иммуноглобулиновые конструкции, и регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию такого иммуноглобулина в выбранной клетке. После введения векторов в ЦНС, векторы доставляют экспрессионные кассеты в ЦНС и экспрессируют белковые конструкции иммуноглобулина in vivo. Использование композиций, описанных в данном документе в качестве противоопухолевого способа описано, как и использование этих композиций в противоопухолевых схе

- 41 048431 мах, которые могут необязательно включать доставку одного или более других противоопухолевых или других активных агентов.

Композиция может содержать один тип вектора AAVhu68, как описано в данном документе, который содержит экспрессионную кассету для доставки конструкции противоопухолевого иммуноглобулина in vivo. Альтернативно, композиция может содержать два или более различных векторов AAV, каждый из которых имеет различные упакованные в нем экспрессионные кассеты. Например, два или более различных AAV могут иметь различные экспрессионные кассеты, которые экспрессируют иммуноглобулиновые полипептиды, которые собираются in vivo с образованием единой функциональной конструкции иммуноглобулина. В другом примере два или более AAV могут иметь различные экспрессионные кассеты, которые экспрессируют иммуноглобулиновые полипептиды для различных мишеней, например, две кассеты предусмотрены для двух функциональных иммуноглобулиновых конструкций (например, иммуноглобулиновая конструкция против Her2 и вторая противоопухолевая иммуноглобулиновая конструкция). В еще одном альтернативный варианте, два или более различных AAV могут экспрессировать иммуноглобулиновые конструкции, направленные на одну и ту же мишень, причем одна из иммуноглобулиновых конструкций была модифицирована для абляции связывания FcRn, а вторая иммуноглобулиновая конструкция сохраняет свою способность или имеет повышенную способность связываться с FcRn. Такая композиция может быть пригодной, чтобы одновременно обеспечивать антитела с повышенным удержанием в области головного мозга и антитела для системной доставки иммуноглобулиновой конструкции.

Необязательно, одна или обе из этих иммуноглобулиновых конструкций, описанных в данном документе, обладает повышенной АЗКЦ активностью. Схема, как описано в данном документе, может содержать, в дополнение к одной или более из комбинаций, описанных в данном документе, дополнительную комбинацию с одним или более из противоопухолевого биологического лекарственного средства, противоопухолевого низкомолекулярного лекарственного средства, химиотерапевтического агента, иммунных усилителей, применения радиации, хирургии и тому подобного. Биологический препарат, как описано в данном документе, основан на пептиде, полипептиде, белке, ферменте, молекуле нуклеиновой кислоты, векторе (включая вирусные векторы), или тому подобном.

Соответственно, композиции, описанные в данном документе, содержат противоопухолевое эффективное количество одного или более AAVhu68, суспендированных в фармацевтически подходящем носителе, предназначенных для доставки субъекту посредством инъекции, осмотического насоса, интратекального катетера или для доставки другим устройством или путем. В одном примере композиция составлена для интратекальной доставки. Как используется в данном описании, интратекальная доставка охватывает инъекцию в спинномозговой канал, более конкретно в субарахноидальное пространство. Однако, могут быть выбраны другие способы доставки и фармацевтически приемлемые носители для композиций AAV включая, например, внутричерепную, интраназальную, интрацистернальную, интрацереброспинальную доставку жидкости, в том числе другие подходящие прямые или системные пути, т.е. резервуар Оммайя.

Композиции могут быть приготовлены в виде дозированных единиц, чтобы содержать количество AAV, которое находится в диапазоне от около 1х10⁹ копий генома (GC) до около 5х10¹³ GC (для лечения среднего субъекта массой тела 70 кг). В одном варианте осуществления изобретения выполняется спинномозговая пункция, при которой от около 15 мл (или менее) до около 40 мл СМЖ удаляется, и при которой вектор смешивают со СМЖ и/или суспендируют в совместимом носителе и доставляют субъекту. В одном примере концентрация вектора составляет около 3х10¹³ GC, но возможны другие количества, такие как около 1х 10⁹ GC, около 5х10⁹ GC, около 1х 10¹⁰ GC, около 5х10¹⁰ GC, около 1х 10¹¹ GC, около 5х 10¹¹ GC, около 1 х 10¹² GC, около 5х10¹² GC или около 1,0х10¹³ GC.

В одном варианте осуществления изобретения композиции, описанные в данном документе, используют в способе для замедления роста опухоли. В еще одном варианте осуществления изобретения композиции, описанные в данном документе, пригодны для уменьшения размера опухоли у субъекта. В другом варианте осуществления изобретения композиции, описанные в данном документе, пригодны для сокращения числа раковых клеток в несолидной злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления изобретения композицию, как это предусмотрено в данном документе, используют в способе повышения у пациента общей выживаемости и/или выживаемости без прогрессирования. Противоопухолевые иммуноглобулиновые конструкции выбраны с учетом новообразования, подлежащего лечению. Например, для лечения метастатического рака молочной железы в головном мозге, можно сконструировать экспрессионную кассету для антитела против HER в рекомбинантном AAV, как описано в данном документе. Необязательно, композиции AAV, как описано в данном описании, вводят в отсутствие дополнительного привнесенного фармакологического или химического агента или другого физического разрушения гематоэнцефалического барьера. В комбинированной терапии, AAV-доставляемую иммуноглобулиновую конструкцию, описанную в данном документе, вводят до, во время или после начала терапии с другим агентом, а также любой их комбинацией, т.е. до и во время, до и после, во время и после, или перед, во время и после начала противоопухолевой терапии. Например, AAV можно вводить между 1 до

- 42 048431 днями, предпочтительно от 3 до 20 дней, более предпочтительно между 5 до 12 днями до начала лучевой терапии. В другом варианте осуществления изобретения химиотерапию вводят одновременно с или, более предпочтительно, после AAV-опосредованной терапии иммуноглобулином (антителом). В других вариантах осуществления изобретения композиции по данному изобретению могут быть объединены с другими биологическими препаратами, например рекомбинантными моноклональными препаратами антител, конъюгатами антитело-лекарственное средство или тому подобными. Кроме того, в таких схемах могут быть использованы комбинации различных AAV-доставленных иммуноглобулиновых конструкций, такие, как описаны выше. Любой подходящий способ или путь может быть использован для введения AAV1hu68.anti-HER2-содержащей композиции, как описано в данном документе, и необязательно с совместным введением противоопухолевых агентов и/или антагонистов других рецепторов. Схемы для противоопухолевого агента, используемые в соответствии с данным изобретением, включают в себя любую схему, которая полагаемо является оптимально подходящей для лечения неопластического состояния пациента. Различные злокачественные опухоли могут потребовать использования специфических противоопухолевых антител и специфических противораковых агентов, которые будут определены для пациента на основе его состояния. Пути введения включают, например, системное, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антагониста зависит от многих факторов, в том числе, например, типа антагонистов, типа опухоли и тяжести опухоли, подлежащей лечению, и пути введения антагонистов.

Следует отметить, что термины в форме единственного числа включают ссылки на одно или более. Следовательно, термины в форме единственного числа, а также выражения один или более и по меньшей мере один взаимозаменяемо используются в настоящем документе.

Слова содержат, содержит и содержащий должны интерпретироваться включительно, а не исключительно. Слова состоят, состоящий и их варианты должны интерпретироваться исключительно, а не включительно. Хотя различные варианты осуществления изобретения в описании представлены с использованием выражений содержащий, при других обстоятельствах связанный вариант осуществления изобретения также предназначен для интерпретации и описания с использованием выражений состоящий из или состоящий по существу из.

Как используется в настоящем документе термин около означает вариабельность на 10% (± 10%) от заданной эталонной величины, если не указано иное.

Как используется в данном документе, заболевание, расстройство и состояние используются взаимозаменяемо для обозначения аномального состояния у субъекта.

Если в настоящем описании не указано иное, технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в данной области техники, и используются со ссылкой на опубликованные тексты, которые обеспечивают специалиста в данной области техники общим руководством по многим из терминов, используемых в настоящем изобретении.

Термин экспрессия используется в данном документе в его самом широком значении и включает в себя продуцирование РНК или РНК и белка. Что касается РНК, термин экспрессия или трансляция относится, в частности, к продукции пептидов или белков. Экспрессия может быть временной или может быть стабильной.

Как использовано в данном описании, термин титр нАт является показателем того, сколько продуцируется нейтрализующих антител (например, анти-AAV нАт), которые нейтрализуют физиологический эффект его целевого эпитопа (например, AAV). Титры антител нАт против AAV могут быть измерены, как описано, например, Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199 (3): p. 381-390, который включен в данное описание путем ссылки.

Как используется в данном документе, экспрессионная кассета относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит кодирующую последовательность, промотор, и может включать в себя другие регуляторные последовательности для экспрессии. В определенных вариантах осуществления изобретения векторный геном может содержать две или более экспрессионных кассет. В других вариантах осуществления изобретения термин трансген можно использовать взаимозаменяемо с термином экспрессионная кассета. Как правило, такая экспрессионная кассета для создания вирусного вектора содержит кодирующую последовательность для генного продукта, описанного в данном документе, фланкированную сигналами упаковки вирусного генома и другими регулирующими экспрессию последовательностями, такими как описанные в данном документе.

Аббревиатура sc (self-complementary) в данном контексте относится к самокомплементарному. Термин самокомплементарный AAV относится к конструкции, в которой кодирующий участок, переносимый нуклеотидной последовательностью рекомбинантного AAV, был разработан для образования внутримолекулярной матрицы двухцепочечных ДНК. При инфицировании вместо того, чтобы ожидать клеточноопосредованного синтеза второй цепи, две комплементарные половины scAAV будут связываться с образованием одной единицы двухцепочечной ДНК (дцДНК), которая готова к немедленной репликации и транскрипции. См., например, D M McCarty et al, Self-complementary recombinant adeno

- 43 048431 associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254. Самокомплементарные AAV описаны, например, в патентах США № 6596535; 7125717 и 7456683, полное описание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Как используется в данном документе, термин функционально связанные относится как к регулирующим экспрессию последовательностям, которые являются смежными с представляющим интерес геном, так и регулирующим экспрессию последовательностям, которые действуют в транс-положении или дистанционно для контроля представляющего интерес гена.

Термин гетерологичный при использовании со ссылкой на белок или нуклеиновую кислоту указывает на то, что этот белок или нуклеиновая кислота содержит две или более последовательностей или подпоследовательностей, которые не встречаются в таком же отношении друг к другу в природе. Например, нуклеиновая кислота, обычно производимая рекомбинантно, имеет две или более последовательностей из неродственных генов, расположенных так, чтобы создать новую функциональную нуклеиновую кислоту. Например, в одном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота имеет промотор из одного гена, расположенный с возможностью направлять экспрессию кодирующей последовательности из другого гена. Таким образом, в отношении кодирующей последовательности промотор является гетерологичным.

Дефектный по репликации вирус или вирусный вектор относится к синтетической или искусственной вирусной частице, в которой экспрессионная кассета, содержащая представляющий интерес ген, упакована в вирусном капсиде или оболочке, причем любые вирусные геномные последовательности, также упакованные в этом вирусном капсиде или оболочке, являются дефицитными по репликации, т.е. они не могут создавать потомство вирионов, но сохраняют способность инфицировать клетки-мишени. В одном варианте осуществления геном вирусного вектора не содержит гены, кодирующие ферменты, необходимые для репликации (геном может быть искусственно создан выпотрошенным - содержащим только представляющий интерес ген, фланкированный сигналами, необходимыми для амплификации и упаковки искусственного генома), однако эти гены могут поставляться в ходе продуцирования. Таким образом, он считается безопасным для использования в генной терапии, поскольку репликация потомства вирионов и инфицирование ими не могут происходить иным образом, кроме как в присутствии вирусного фермента, необходимого для репликации.

Во многих случаях частицы rAAV упоминаются как устойчивые к ДНКазе. Тем не менее, в дополнение к этой эндонуклеазе (ДНКаза), другие эндо- и экзо-нуклеазы могут быть также использованы на этапах очистки, описанных в данном документе, для удаления загрязняющих нуклеиновых кислот. Такие нуклеазы могут быть выбраны для разрушения одноцепочечной ДНК и/или двухцепочечной ДНК и РНК. Такие этапы могут заключать в себе одну нуклеазу или смеси нуклеаз, направленных на разные мишени, и могут быть эндонуклеазами или экзонуклеазами.

Термин устойчивый к нуклеазе указывает, что капсид AAV полностью собран вокруг экспрессионной кассеты, которая предназначена для доставки гена в клетку-хозяина, и защищает эти упакованные геномные последовательности от деградации (расщепления) во время этапов инкубации нуклеазы, предназначенных для удаления загрязняющих нуклеиновых кислот, которые могут присутствовать в процессе производства.

Как использовано в данном описании, термин эффективное количество относится к количеству композиции rAAV, которая доставляет и экспрессирует в клетках-мишенях некоторое количество генного продукта из векторного генома. Эффективное количество может быть определено на основе животной модели, но не пациента-человека. Примеры подходящей мышиной модели описаны в данном документе.

В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV или композиция, как представлено в данном документе, исключает антитела против гриппа или иммуноглобулиновые конструкции. В определенных вариантах осуществления изобретения rAAV или композиции, как представлено в данном документе, исключает ген спинальной мышечной атрофии (SMA) или последовательность, кодирующую SMN.

Термин трансляция, в контексте данного изобретения, относится к процессу в рибосоме, при котором цепь мРНК контролирует сборку аминокислотной последовательности с образованием белка или пептида.

Как использовано в данном описании и формуле изобретения, термины включающий, содержащий, включающий в себя и их варианты охватывают другие компоненты, элементы, целые числа, этапы и тому подобное. С другой стороны, термин состоящий и его варианты являются исключающими в отношении других компонентов, элементов, целых чисел, этапов и тому подобного.

Следует отметить, что термины в форме единственного числа включают ссылки на одно или более, например, энхансер, понимается для представления одного или более энхансеров. Следовательно, термины в форме единственного числа, выражения один или более и по меньшей мере один взаимозаменяемо используются в настоящем документе.

Как описано выше, термин около, когда используется для изменения числового значения означает изменение ±10%, если не указано иное.

Следующие примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения данного изобретения.

- 44 048431

Примеры

В определенных вариантах осуществления изобретения отмечено, что капсид AAVhu68 имеет лучший выход, чем AAV9, который также находится в кладе F. Одно или оба изменения аминокислот: глутаминовой кислоты (Glu) в положении 67 и валина (Val) в положении 157, может создавать этот повышенный выход. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы, имеющие капсиды AAVhu68, обеспечивают по меньшей мере 15% увеличение выхода упакованного вектора по сравнению с векторами на основе AAV9. При сравнении между AAVhu68 и AAVrh10 было обнаружено, что AAVhu68 обеспечивает лучшую эффективность трансдукции, чем AAVrh10 при низкой дозе (например, около 1 х10⁹) после интрацеребровентрикулярного введения.

Пример 1А. Определение AAVHU68.

Извлекали ДНК тканей из образцов тканей человека в виде матрицы для ПЦР с помощью колонок QIAamp (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя со следующими модификациями. ДНК-полимераза Q5 (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix, NEB) была выбрана за ее необычайно высокую точность и надежную эффективность для восстановления полноразмерного гена VP1 потенциальных AAV в образцах, как описано Gao et al [Proc Natl Acad Sci USA, 2002 Sep 3, 99(18): 11854-11859 (Epub 21 августа 2002)] с набором праймеров, модифицированных следующим образом: были использованы вместо AV1NS, праймер GCTGCGYCAACTGGACCAATGAGAAC, prm504 [SEQ ID NO: 7], и вместо обратного праймера AV2CAS, prm505:CGCAGAGACCAAGTTCAACTGAAACGA [SEQ ID NO: 8]. Условия ПЦР были изменены следующим образом:

Программа ПЦР:

	Время (секунды)	Цикл(-ы)
98	30	1
98	10	50
59	10
72	93
72	120	1

Полосы ~3 т.о. после ПЦР вырезали из геля; ДНК экстрагировали с помощью набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen) и клонировали в наборе для клонирования Zero Blunt® TOPO® PCR (Thermo Fisher Scientific). Плазмиды секвенировали для получения полной длины гена AAV VP1. Для большинства образцов по меньшей мере три плазмиды были полностью секвенированы, и консенсусные последовательности были взяты в качестве готовой последовательности AAV для этого образца.

Приобретенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок vp1 AAVhu68 представлена в SEQ ID NO: 1. См., также фиг. 2А-2С. Аминокислотная последовательность vp1 AAVhu68 представлена на фиг. 1 и SEQ ID NO: 2. По сравнению с AAV9, AAVhu31 и AAVhu32, были идентифицированы как критические две мутации (А67Е и A157V) в AAVhu68 (обведены кружочком на фиг. 1).

Этот метод амплификации, также обеспечивает спейсерную последовательность между кодирующей vp1 последовательностью и кодирующей rep последовательностью. Эта последовательность кодирования: atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. Кодирующую последовательность для rep52 из AAVhu68 воспроизведена в SEQ ID NO: 3. Последовательность белка rep52 также воспроизведена в SEQ ID NO: 4.

Транс-плазмиду pAAV2/hu68 затем получали путем введения гена VP1 hu68 в остов pAAV2/9 вместо гена VP1 AAV9 для оценки эффективности упаковки, выхода и свойств трансдукции. Плазмида pAAV2/9 содержит 5' и 3' ITR AAV2, фланкирующие ген капсида, и доступна от Perm Vector Core [Университет Пенсильвании, г. Фила, штат Пенсильвания, США, pennvectorcore.med.upenn.edu].

В. Характеристика AAVHU68.

Хотя это явление не было ранее отмечено или описано у аденоассоциированных вирусных капсидов, было обнаружено, что другие белки и пептиды восприимчивы, как in vivo, так и in vitro, к различным химическим модификациям. Одной из наиболее частых модификаций является дезамидирование аспарагина, спонтанная неферментативная реакция. В общем, полупериоды аспарагинильного дезамидирования в физиологических условиях (рН 7,4, 37°С) варьируются между около 1 до 1000 дней. Подобная последовательность реакций происходит в глутамине до глутаматных остатков, но эти реакции гораздо

- 45 048431 медленнее, чем у их аналога аспарагина.

У коротких пептидов образование циклических промежуточных продуктов контролируется первичной последовательностью, в то время как в белках дополнительный эффект дают вторичные, третичные и четвертичные структуры. Таким образом, скорость дезамидирования каждого белка амида определяется уникальным образом. Масс-спектрометрическая идентификация дезамидированных пептидов относительно проста, поскольку дезамидирование увеличивает массу интактной молекулы на +0,984 Да (разница масс между группами -ОН и -NH2). Так как дезамидирование является стабильной модификацией в газовой фазе, МС/МС спектры могут выявить положение дезамидирования даже при наличии нескольких потенциальных сайтов дезамидирования.

Четыре вектора AAVhu68 были получены с использованием одного из четырех векторных геномов, которые не имеют отношения к этому исследованию, каждый из которых продуцируется с использованием обычных способов тройной трансфекции в клетках 293. Для общего описания этих способов см., например, Bell CL, et al., The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice., J Clin Invest. 2011;121:2427-2435. Вкратце, плазмида, кодирующая последовательность, подлежащую упаковке (генный продукт, экспрессируемый из куриного промотора β-актина, интрона, а также поли-А гормона роста), фланкированная с помощью инвертированных концевых повторов AAV2, была упакована тройной трансфекцией клеток НЕК293 плазмидами, кодирующими ген rep AAV2 и ген cap AAVhu68, и аденовирусной вспомогательной плазмидой (pAdΔF6). Полученные вирусные частицы AAV могут быть очищены с использованием центрифугирования в градиенте CsCl,, концентрированы и заморожены для последующего использования.

Денатурация и алкилирование: к 100 мкг оттаявшего вирусного препарата (белкового раствора) добавляют 2 мкл 1 М дитиотреитола (DTT) и 2 мкл 8 М гидрохлорида гуанидина (GndHCl) и инкубируют при 90 °С в течение 10 мин. Дают раствору остыть до комнатной температуры, затем добавляют 5 мкл свежеприготовленного 1 М йодацетамида (IAM) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Через 30 мин гасят реакцию алкилирования путем добавления 1 мкл 1 М DTT.

Расщепление: к денатурированному белковому раствору добавляют 20 мМ бикарбоната аммония, рН 7,5-8 в объеме, который разбавляет конечную концентрацию GndHCl до 800 мМ. Добавляют раствор протеазы (трипсин или химотрипсин) для соотношения 1:20 протеазы к белку и инкубируют при 37°С в течение ночи. После расщепления добавляют TFA до конечной концентрации 0,5% для гашения реакции расщепления.

Масс-спектрометрия: приблизительно 1 микрограмм смеси комбинированного расщепления анализировали с помощью UHPLC-MC/MC. LC выполняется на системе RSLCnano ULTIMATE 3000 (Thermo Scientific). Подвижная фаза А представляет собой воду Milli-Q с 0,1% муравьиной кислоты. Подвижная фаза В представляет собой ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты. Градиент ЖХ изменяется с 4% В до 6% В на протяжении 15 мин, затем до 10% В на протяжении 25 мин (всего 40 мин), а затем до 30% В на протяжении 46 мин (всего 86 минут). Образцы загружают непосредственно в колонку. Размер колонки составляет 75 см х 15 мкм I.D., и она упакована 2-микронной средой С18 (Acclaim РерМар). ЖХ сопряжена с квадрупольной-Orbitrap масс-спектрометрией (Q-Exactive HF, Thermo Scientific) с ионизацией электрораспылением нанофлекс с использованием источника. Колонку нагревают до 35°С и применяется электрораспыление под напряжением 2,2 кВ. Масс-спектрометр запрограммирован для получения тандемных масс-спектров от основных 20 ионов. Полное разрешение МС устанавливается на 120000 и МС/МС разрешение - на 30000. Нормализованная энергия соударения устанавливается на 30, автоматическая регулировка усиления - на 1е5, максимум заполнения - на 100 мс, максимум заполнения МС/МС на 50 мс.

Обработка данных: RAW файлы необработанных данных масс-спектрометрии были проанализированы с помощью BioPharma Finder 1.0 (Thermo Scientific). Если коротко, то все поиски требуют допуска по массе предшественника 10 ppm, допуска по массе фрагмента 5 ppm, триптическое расщепление, до 1 пропущенного расщепления, фиксированная модификация алкилирования цистеина, переменная модификация окисления метионина/триптофана, дезамидирование аспарагина/глутамина, фосфорилирование, метилирование, и амидирование.

В следующей таблице Т относится к трипсину и С относится к химиотрипсину.

- 46 048431

Модифи- кация
фермента	Т	Т	Т	Т	С	С	С	С	Т	Т	Т
% Покры- тия	93,6	92	93, 1	92,5	90, 2	89, 7	91, 1	88, 9	98,9	97	94, 6	92, 4
+ Дезамидирование (Дезамид)
-N35
N57+ Дез амид	87,6	95, 5	89, 3	88,2	90, 5	96, 3	86, 4	84, 8	100, 0	100, 0	99, 0	92, 7
N66+ Дез амид	4,7
N94+ Дез амид	11,3	ю, 9	и, 0	5,3	и, 6	ю, 4	ю, 8	5,6	5,0	ИД	5,4	16, 0
N113+ Дез амид			1,8
-N253+ Дез амид	17,7	22, 0	21, 1	15,0	17, 0	22, 6	20, 5	15, 6	4,2	5,5
Q259+ Дез амид	35,2	25, 6	21, 0		35, 4	26, 3	20, 9	9,2
-N270+ Дез амид	16,4	25, 1	23, 2	16,6	15, 9	24, 9	23, 5	16, 1	0,2
-N304+ Дез амид	2,6	2,9	2,8	1,3	2,5	2,8	2,9	1,3	16,6	10,3
-N314+Дезамид									6,5
N319+ Дез амид	0,3	2,8	2,8	0,2		2,9	2,8	0,2
N329+ Дез амид	72,7	85, 6	89, 1	86,8	71, 0	87, 2	88, 7	84, 7	85,5	79,4	78, 9	91, 8
N336+ Дез амид		30, 8	9,3	100, 0		31, 0	9,2	95, 7
-N409+ Дез амид	21,3	22, 9	23, 9	24,0	22, 0	23, 4	24, 7	24, 2
N452+	98,8	99,	99,	100,	98,	97,	98,	95,	98,2	68,7	67,	49,

- 47 048431

Дезамид		7	2	0	9	3	1	2			4	4
N477+ Дезамид	4,4	4,3	4,3	2,6	4,5	4,4	4,3	2,6			0,8
N512+ Дезамид	97,5	97, 9	95, 3	95,7	92, 2	91, 8	99, 2	96, 1	99,7	98,2	87, 9	75, 7
-N515+ Дезамид	8,2	21, 0	16, 0		8,3	21, 0	16, 5	0,0	2,5	3,0		15, 1
-Q599+ Дезамид	4,0	15, 4	ю, 1	13,6	4,0	15, 5	ю, 0	13, 8	15,8
N628+ Дезамид	5,3		5,6		5,4	0,0	5,4	0,0
N651+ Дезамид	0,9	1,6	1,6						0,5
N663+ Дезамид	3,4		3,5	3,7	3,4	0,0	3,4	3,6
N709+ Дезамид	0,6	0,8	20, 2	0,6	0,6	0,8	19, 8	0,6	0,3	1,3	0,1	0,2
N735									25,0	42,7		21, 7
+ Ацетилирование (Ас):
К332+Ас				100, 0
~К693+Ас	13,0		13, 5
-Кббб+Ас				93,8
~К68+Ас		59, 2
+ Изомеризация (Изо):
И97+Изо	0,5	0,4	0,4	0,2	0,5		0,4	0,2
0107+Изо		0,3		0,3		0,3
И384+Изо	0,8				0,9
+ Фосфорилирование

- 48 048431

(Фос)
8149+Фос	5,8	5,7	5,2	9,8	5,7	5,9	5,2	9,9
-S499+ Фос				30,6
-Т569+ Фос	0,9
-S586+ Фос		3,6
+ Окисление
~W23+Okhc		4,7	5,5			4,8	5,5
W247+Okhc	1,5	0,4	0,7		1,4
W247+Okhc до кинуренина		0,1				0,1
W306+Okhc	0,7	0,9	1,6	1,8	0,7	1,0	1,6	1,8
W 3 О6+Окисление до кинуренина			0,3				0,3
М404+Окис	0,1		0,2		0,1		0,2
М436+Окис	4,9		ю, 2	23,0	4,8		ю, 2	22, 6
-М518+ Окис	29,9		1,5	10,6	29, 9		1,5	ю, 5
-М524+ Окис	18,8	31, 6	52, 7		18, 4	31, 1	52, 5	14, 2
М559+Окис	19,0	21, 6	19, 6	20,9	19, 6	21, 3	20, 1	20, 9
-М605+ Окис	12,2	15, 2			12, 8	14, 8
W619+Okhc	1,0		0,6	1,5	1,0		0,6	1,5
W619+Окисление			20, 3
-М640+ Окис	23,5	64, 2	24, 6		22, 4	21, 1	25, 6
W695+Okhc	0,3		0,4	0,4	0,3		0,4	0,4

тельные остатки аспарагина (N94, N253, N270, N304, N409, N477 и Q599) также показывают уровни дезамидирования до ~20% по различным партиям. Уровни дезамидирования первоначально были идентифицированы с использованием расщепления трипсином и проверены с помощью расщепления химотрипсином.

- 49 048431

Пример 2. Выход векторов AAVHU68.

Были созданы и оценены векторы AAVhu68 и AAV9, несущие различные метки, такие как GFP и LacZ. Каждый из векторов создавали с использованием метода тройной трансфекции в клетках 293, как описано Gao et al. [Gao, Guang-Ping et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 11854-11859.]

A. Получение транс-плазмиды PAAVHU68.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок vp1 представлена в SEQ ID NO: 1.

Транс-плазмиду pAAV2/hu68 получали путем введения гена VP1 hu68 в остов pAAV2/9 вместо гена VP1 AAV9 для оценки эффективности упаковки, выхода и свойств трансдукции. Плазмида pAAV2/9 содержит 5' и 3' ITR AAV2, фланкирующие ген капсида, и доступна от Penn Vector Core [Университет Пенсильвании, г. Фила, штат Пенсильвания, США, pennvectorcore.med.upenn.edu].

B. Выход векторов AAVHU68.

Клетки 293 культивировали и поддерживали в DMEM, 1X (модификация Дульбекко минимальной эссенциальной среды Игла) с 4,5 г/л глюкозы, L-глутамина и пирувата натрия с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в атмосфере с 5% СО₂при 37°С. Трансфекции выполняли, как описано Gao et al. [Gao, Guang-Ping et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 11854-11859.] с векторной плазмидой, замененной на pAAV2/hu68 или pAAV2/9. В качестве трансгена (экспрессионной кассеты) использовали CB7.CI.ffLuciferase.RBG. Трансфицированные клетки затем культивировали в 6-луночных планшетах. Общий лизат клеток, а также супернатант, собирали для количественного определения вируса с помощью анализа TaqMan (Applied Biosystems) с использованием зондов и праймеров, нацеленных на полиА-участок бета-глобина кролика трансгена (экспрессионной кассеты), как описано в Gao et al. [Gao, Guangping, et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Human gene therapy 11.15 (2000): 2079-2091]. Выходы шести плазмид pAAV2/9 и шести плазмид pAAV2/hu.68 сравнивали в 6-луночном планшете, сравнивая друг с другом, с точки зрения как титра супернатанта, так и общего титра лизата. Каждая плазмида была получена из отдельной бактериальной колонии.

Выход AAVhu68 оказался аналогичным выходу AAV9 с точки зрения общего лизата (Фиг. 3А, n=6, р=0,42). Однако в супернатанте выход AAVhu68 был значительно выше, чем выход AAV9 (Фиг. 3В, n=6, р=0,0003). Таким образом, AAVhu68 был продемонстрирован как лучший вектор по сравнению с AAV9 с точки зрения производства, так как супернатант собирают при культивировании в масштабе флаконов cell-stack и продукции вируса.

Пример 3. In vivo трансдукция AAVHU68.LACZ.

AAVhu68.CB7.nLacZ (также упоминается как AAVhu68.LacZ) создавали путем вставки последовательности, кодирующей локализованную в ядре бактериальную β-галактозидазу (nLacZ), а затем, продуцировали, как описано в примере 2. Для оценки эффективности упаковки, выхода, свойств трансдукции, эффективности трансдукции и тропизма AAVhu68 in vivo, мышам инъецировали 5x1ο¹¹ копий генома вектора AAVhu68.LacZ с помощью различных способов введения, таких как внутривенное, внутримышечное и интраназальное введение. Мышцы, легкие, печень и сердце собирали после умерщвления мышей через две недели после введения вектора. Замороженные срезы каждого органа готовили, обрабатывали и анализировали в соответствии с традиционным протоколом, детектирующим экспрессию гена LacZ [Bell, Peter, et al. An optimized protocol for detection of E. coli β-galactosidase in lung tissue following gene transfer. Histochemistry and cell biology 124.1 (2005): 77-85]. Положительное окрашивание на LacZ, показанное синим цветом (Фиг. 4А-4С), указывает на успешную трансдукцию AAVhu68.

Как показано на фиг. 4А, после того, как векторы вводят мышам внутривенной инъекцией (в/в), все протестированные органы (сердце, печень, легкие и мышцы) продемонстрировали трансдукцию AAVhu68, в то же время наблюдался тропизм в пользу сердца и печени, чем легкого и мышцы. После введения векторов мышам посредством внутримышечной инъекции (в/м), сердце, печень и мышцы продемонстрировали высокую скорость трансдукции AAVhu68, в то время как не было обнаружено никакой выявляемой трансдукции в легких. Если было выполнено интраназальное введение, рассеянная трансдукция наблюдалась в сердце, печени, мышцах и легких.

Эти результаты показали, что AAVhu68 продемонстрировал высокую эффективность трансдукции и широкий тропизм к тканям/органам.

Пример 4. In vivo трансдукция AAVHU68.GFP по сравнению С AAV9.GFP.

AAVhu68.GFP и AAV9.GFP были созданы путем вставки гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), в качестве генов, которые затем получают, как описано в примере 2. Для оценки эффективности упаковки, выхода, свойств трансдукции, эффективности трансдукции и тропизма AAVhu68 и AAV9 in vivo, мышам вводили AAVhu68.GFP или AAV9.GFP в дозах 1х 10¹⁰ GC или 1x1011 GC. Мозг, мышцы, легкие, печень и сердце собирали после умерщвления мышей через две недели после введения вектора. Замороженные срезы каждого органа были подготовлены и обработаны для визуали

- 50 048431 зации экспрессии GFP, как описано Wang et al [Wang L, et al., Hum Gene Ther. 2011 Nov; 22(11):1389-401; Wang L, et al., Mol Ther. 2010 Jan; 18(l):126-34]. Положительное окрашивание на GFP, показанное зеленым цветом (фиг. 5А-5С и фиг. 6A-6D), указывает на успешную трансдукцию тестируемых векторов.

Были исследованы срезы из различных областей головного мозга (гиппокампа, моторной коры и мозжечка) мышей с интрацеребровентрикулярным введением векторов. Трансдукция векторов AAV наблюдалась во всех протестированных образцах гиппокампа, кроме одной из мышей, которой вводили 1 х 10¹⁰ GC AAV9.GFP. Лучшая трансдукция AAVhu68.GFP по сравнению с AAV9 наблюдалась в моторной коре. Более того, наблюдалась трансдукция AAVhu68.GFP в мозжечке, когда мышам вводили только 1х 10¹¹ GC вектора. Таким образом, AAVhu68 продемонстрировал более высокую эффективность трансдукции, а также более широкий тропизм, в головном мозге по сравнению с AAV9.

В следующем эксперименте извлекали у мышей, которым вводили AAVhu68.GFP внутривенно, различные органы, такие как печень, почка, сердце и поджелудочная железа, органы подготавливали и обрабатывали, как описано Wang et al. [Wang L, Calcedo R, Bell P, Lin J, Grant RL, Siegel DL, Wilson JM, Hum Gene Ther. 2011 Nov; 22(11):1389-401; Wang L, Calcedo R, Wang H, Bell P, Grant R, Vandenberghe LH, Sanmiguel J, Morizono H, Batshaw ML, Wilson JM, Mol Ther. 2010 Jan; 18(1):126-34]. Положительный сигнал от GFP, показанный зеленым цветом, указывает на успешную трансдукцию указанных векторов AAV. Яркие изображения поля, показанные в черно-белом цвете, были сделаны для определения морфологии органа, в то время как соответствующий красный флуоресцентный канал был выполнен в качестве отрицательного контроля.

Сильный положительный сигнал, показанный зеленым цветом, наблюдался в печени, при этом почка, сердце и поджелудочная железа также демонстрировали трансдукцию указанного вектора, что указывает на широкий тропизм вектора AAVhu68 в тканях/органах.

Пример 5. Выход и in vivo трансдукция векторов AAV С А67Е и A157V мутациями.

Для повышения выхода и/или эффективности упаковки вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного (rAAV) вируса сконструирован ген капсида AAV для экспрессии белка vp1 с Glu в аминокислотном положении 67 и/или Val в аминокислотном положении 157 векторов AAV, таких как AAV9, AAVhu31 и AAVhu32, причем нумерация аминокислотных остатков основана на AAVhu68 [SEQ ID NO: 5].

Получают указанные векторы AAV и оценивают выход каждого вектора в соответствии с примером 2. In vivo эффективность трансдукции и тропизм к ткани/органу/участку дополнительно оценивали с помощью таких обычных способов, как проиллюстрированые в примере 3.

Пример 6. Интратекальный AAVHU68.CMV.PI.HTRASTUZUMAB.SV40 для профилактики метастазов HER2+ рака молочной железы человека в головном мозге.

- 51 048431

AAV9	Аденоассоциированный вирус 9
AAV9. trastuzumab	AAV9.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAV9, несущий экспрессионную кассету трастузумаба)
ВСА	Анализ с бицинхониновой кислотой
ВСВМ	Метастазы рака молочной железы в головном мозге
CI	Химерный интрон
CMV (промотор)	Немедленный ранний энхансер цитомегаловируса/промотор куриного бета-актина
СМЖ	Спинномозговая жидкость
кцПЦР	Капельная цифровая полимеразная цепная реакция
ДНК	Дезоксирибонуклеиновая кислота
GC	Копии генома
GLP (Good Laboratory Practices)	Надлежащая лабораторная практика
GTP (Gene Therapy Program)	Программа генной терапии
HER2	Рецептор 2 человеческого эпидермального фактора роста
AAVhu68	Аденоассоциированный вирус серотипа hu68
AAVhu68.trastuzumab	hu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAVhu68, несущий экспрессионную кассету трастузумаба)
ICV	Интрацеребровентрикулярный
ID	Идентификационный номер
IT	Интратекальный
мАт	Моноклональное антитело
MED	Минимальная необходимая доза
n	Количество животных
PBS	Фосфатно-солевой буфер
кПЦР	Количественная полимеразная цепная реакция
RAGl-/“	Нокаут активирующего рекомбинацию гена 1
RAG1	Активирующий рекомбинацию ген 1
rBG	Последовательность поли-А β-глобина кролика
RPM	Оборотов в минуту
SD	Стандартное отклонение
SOP	Стандартная операционная процедура
SV40 (сигнал поли-А)	Сигнал полиаденилирования обезьяньего вируса 40

А. Краткое изложение.

Цель данного исследования заключалась в проверке терапевтической эффективности AAVhu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAVhu68.trastuzumab), рекомбинантный аденоассоциированный вирус серотипа AAVhu68, содержащий экспрессионную кассету трастузумаба для профилактики метастазов в головном мозге HER2+ рака молочной железы человека в модели ксенотрансплантата мыши. Трастузумаб (Herceptin®, Roche) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (мАт), направленное против HER2, которое увеличивает выживаемость пациентов при использовании внутривенно с химиотерапией для лечения системного HER2+ заболевания. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер исключает прохождение Herceptin®, который вводят внутривенно, в центральную нервную систему, что приводит к невозможности эффективного лечения метастазов HER2+ рака молочной железы в головном мозге. Несколько клинических случаев показывают, что интратекально введенный Her

- 52 048431 ceptin® может увеличивать выживаемость пациентов с HER2+ лептоменингиальным заболеванием или останавливать прогрессирование HER2+ фокальных метастазов [J. С. Bendell, et al, Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97, 29722977 (2003); D. J. Slamon, et al., Use of Chemotherapy plus a Monoclonal Antibody against HER2 for Metastatic Breast Cancer That Overexpresses HER2. N. Engl. J. Med. 344, 783-792 (2001), M. A. Cobleigh, et al, Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J. Clin. Oncol. 17, 2639-2648 (1999), Zagouri F, et al, (2013). Intrathecal administration of trastuzumab for the treatment of meningeal carcinomatosis in HER2-positive metastatic breast cancer: a systematic review and pooled analysis. Breast Cancer Res Treat, 139(1): 13-22., Bousquet G, et al. (2016). Intrathecal Trastuzumab Halts Progression of CNS Metastases in Breast Cancer. J Clin Oncol. 34(16 ):e151-155]. Однако, СМЖ обновляется быстро, вероятно, нарушая терапевтический эффект IT Herceptin® вследствие изменяющегося в широких пределах фармакокинетического профиля СМЖ. Целью лечения AAVhu68.trastuzumab является предотвращение возникновения, замедление роста, улучшение выживаемости или увеличение клинического качества показателей жизни, связанных с HER2+ ВСВМ (breast cancer brain metastases - метастазы в мозг рака молочной железы), обеспечивая локализованную, долгосрочную экспрессию AAVhu68.trastuzumab в самих паренхимах головного мозга.

AAVhu68.trastuzumab вводили в четырех различных дозах (1,00x101°, 3,00х10¹⁰, 1,00x10 и 3,00x10 GC/животное) путем интракраниавентрикулярной инъекции (ICV) RAG1^-/- мышам 6-9-недельного возраста. Клетки BT474.M1.ffluc, полученные из линии HER2+ клеток дуктальной карциномы человека, были имплантированы по меньшей мере на 21 день позже. Мышей ежедневно наблюдали и умерщвляли в конечной точке исследования. Ткань головного мозга собирали при аутопсии для измерения объема опухоли. Был сделан вывод, что профилактическое ICV введение AAVhu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 в модели RAG1^-/- ксенотрансплантата с HER2+ метастазами рака молочной железы в головном мозге приводило в этом эксперименте к значимому уменьшению объема опухоли во всех тестовых дозах. В целом, эти результаты показали потенциальную терапевтическую эффективность AAVhu68.trastuzumab для улучшения выживаемости пациентов с HER2+ ВСВМ.

В. Целью данного исследования было изучение минимальной необходимой дозы (MED) AAVhu68.trastuzumab для профилактики опухолей в модели RAG1-/-ксенотрансплантата с HER2+ ВСВМ путем изучения объема опухоли. Вектор представляет собой AAVhu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 или AAVhu68.trastuzumab.

Титр по цкПЦР: 7,38x1013 GC/мл.

Эндотоксин: <2,0 ЕЭ/мл.

Чистота: 100%.

Фосфатно-солевой буфер (PBS) (контроль без лечения).

Способность AAVhu68.trastuzumab обеспечивать профилактику опухоли оценивали с помощью мышиной модели RAG1-/- ксенотрансплантата HER2+ ВСВМ. Модель иммунодефицитной мыши обеспечивает рост ортотопических опухолей человеческого происхождения у мыши без отторжения иммунной системой мыши. Кроме того, RAG1-/- мышь не обладает собственным IgG, что обеспечивает количественное определение трастузумаба с помощью ИФА с белком А.

Дизайн исследования

№ групп ы	Лечение	Доза (GC/мыши)		Г енотип (η)	Объем дозы (мкл)	RO A	Опухолевые клетки Имплантаци я
1	AAVhu68.trastuzu mab	ι,οχιο10		RAGl-/“ (10)	5	ICV	21 сутки после лечения
2	AAVhu68.trastuzu mab	3,OX1O10		RAGl“/_ (10)	5	ICV
3	AAVhu68.trastuzu mab	ι,οχιο11		RAGl-/“ (10)	5	ICV
4	AAVhu68.trastuzu mab	3,0Χ10π		RAGl-/“ (10)	5	ICV

- 53 048431

5

PBS

Без лечения

RAGl-/“ (Ю)

5

ICV

Исследуемый препарат и отрицательный контроль разводили стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) до соответствующей концентрации. Вектор вводили ICV в левый боковой желудочек.

Интратекальная доставка AAV может быть выполнена с использованием различных путей для доступа к ЦСЖ. Путь ICV был выбран потому, что является минимально инвазивным и не требует хирургической процедуры у мышей (по сравнению с путем введения в мостомозжечковую цистерну, который требует надреза кожи и мышц шеи). В нашей лаборатории и другими исследователями ранее было показано, что однократное введение AAV9 вектора в цереброспинальную жидкость (ICV или мостомозжечковую цистерну) как у мышей, так и у крупных животных затрагивает нейроны во всем головном мозге [Dirren at al. (2014). Intracerebroventricular Injection Of Adeno-Associated Virus 6 And 9 Vectors For Cell Type-Specific Transgene Expression In The Spinal Cord. Hum. Gene. Therapy 25, 109-120, Snyder et al. (2011). Comparison Of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes For Spinal Cord And Motor Neuron Gene Delivery. Hum. Gene Ther 22, 1129-1135, Bucher et al. (2014). Intracisternal Delivery Of AAV9 Results In Oligodendrocyte And Motor Neuron Transduction In The Whole Central Nervous System Of Cats. Gene Therapy 21, 522-528, Hinderer et al. (2014). Intrathecal Gene Therapy Corrects CNS Pathology In A Feline Model Of Mucopolysaccharidosis I. Mol Ther: 22, 2018-2027].

С. Имплантация клеток опухоли RAG1-/- мышам.

Для создания мышиной модели ксенотрансплантата для HER2+ ВСВМ, были использованы клетки клеточной линии HER2+ дуктальной карциномы человека, трансдуцированные люциферазой светлячка, ВТ474-M1.ffluc. Для процедуры инъекции мышам давали наркоз кетамином/ксилазином. Состригали мех на волосистой части головы и шеи. Имплантировали гранулы с IV-β эстрадиола с замедленным высвобождением (1,7 мг, 90-дневное высвобождение, Innovative Research of America) подкожно в тыльную часть шеи и повторно вводили их каждые 90 дней в течение исследования. Мышей закрепляли в стереотаксическом аппарате. Подвергаемая воздействию кожа была очищена с повидон-йодом и 70% этанолом. Делали передне-задний надрез размером 1 см над верхней частью черепа. Идентифицирована брегма. Пневматическую дрель, расположенную на темени, затем перемещали на 0,8 мм назад и на 2,2 мм левее от брегмы, где в черепе было просверлено трепанационное отверстие. Шприц Гамильтона на 25 мкл заполняли 5 мкл суспензии опухолевых клеток (всего 100000 клеток в соотношении 50:50 MatriGel®:PBS). Иглу доводили до брегмы и смещали к координатам, указанным выше, перед проникновением на 4,0 мм в паренхиму головного мозга. Иглу затем поднимали обратно вверх на 1,0 мм по траектории иглы, чтобы создать карман, в который впрыскивали опухолевые клетки. Иглу оставляли на месте в течение 5 мин. Затем вводили 5 мкл клеточной суспензии в течение 10 мин с использованием моторизованного устройства впрыска. Иглу, оставленную на месте в течение 5 мин после окончания инъекции, затем медленно удаляли. Разрез на скальпе зашивали викрилом 4.0, а мыши получали подкожно 15 мг/кг энрофлоксацина (Bayer) в стерильном PBS вместе с 0,3 мг/кг бупренорфина в стерильном PBS.

Мышей контролировали ежедневно. По достижению агонии мышей умерщвляли с помощью передозировки СО₂ с последующим смещением шейных позвонков. При аутопсии выделяли и разрезали головной мозг коронально через след от инъекционной иглы в опухоли.

Объем опухоли: измерение диаметра опухоли на день 35 проводили цифровыми штангенциркулями Vernier (Thermo-Fisher). Головной мозг забирали во время аутопсии. Отслаивание по следу от инъекционной иглы в опухоли использовали для отделения опухоли от окружающей ткани мозга. Диаметр опухоли затем измеряли в 3-х измерениях (х, у и z), а объем опухоли рассчитывали как объем эллипсоида, 4/3 * π * х/2 * у/2 * z/2. Правое полушарие головного мозга, полушарие контралатеральное к месту инъекции вектора и имплантации опухоли, сохраняли в формалине. Препарированные опухоли объединяли по когорте дозы и сохраняли в формалине. Сравнения объема опухоли проводили с использованием теста Манна-Уитни в GraphPad Prism 7.

D. Результаты.

Объем опухоли: для того, чтобы определить, замедляет ли IT профилактика опухоли с AAVhu68.trastuzumab рост опухоли, авторы измеряли диаметр опухоли через 35 дней после имплантации. Медианный объем опухолей из группы, которая получила самую высокую дозу AAVhu68.trastuzumab для профилактики опухоли (0,4 мм³, n=10), был значительно меньше, чем у мышей, которые не получали никакого лечения (26,1 мм³, n=9). Все мыши, которые получали более низкие дозы AAVhu68.trastuzumab имели значительно меньшие опухоли по сравнению с отсутствием лечения. Медианный объем опухоли у мышей, получавших 1,00х10¹⁰ GC/мышь рассчитывали так чтобы он был статистически таким же, как медианный объем опухоли у мышей, получавших 3,00х10¹⁰ GC/мышь (р=0,6029). Следует отметить, что две мыши в группе 1, одна мышь в группе 2, три мыши в группе 3 и три мыши в группе 4 не имели макроскопически заметной опухоли при вскрытии.

- 54 048431

Группа	Доза (GC/мышь)	Количество мышей	Медианный объем опухоли (мм3)	Значение р по сравнению с отсутствием лечения
1	ι,οοχιο10	9*	6,4	0,0375
2	3,00X10w	10	8,1	0,0053
3	ι,οοχιο11	9*	1,3	0,0026
4	3,00Χ10η	10	0,4	< 0,0001

* Одно животное в каждой из этих групп было умерщвлено до запланированной даты аутопсии и, следовательно, не было включено в анализ

При всех дозах IT-введение AAVhu68.trastuzumab привело к значимо меньшему медианному объему опухоли на Д35 после имплантации опухоли при профилактическом введении у RAG1 мышиной модели ксенотрансплантата HER2+ ВСВМ, которая использует HER2+ ВТ474.М1 клеточную линию дуктальной карциномы человека. MED AAVhu68.trastuzumab, измеренная в данном исследовании, составляла 1,00х10¹⁰ GC/мышь.

Пример 7. Выход и чистота продукции векторов AAVHU68.

Для сравнения выхода и/или чистоты продукции вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного (rAAV) вируса, имеющего различные капсиды, были созданы и подготовлены два различных набора векторов, имеющих разные капсиды, в том числе AAVhu68, AAV8triple, AAV8 и AAV9.

Кратко, один набор векторов, имеющих указанный капсид и векторный геном, содержащий промотор цитомегаловируса (CMV), кодирующую последовательность люциферазы светлячка и поли-А SV40 (CMV.ffLuciferase.SV40), был получен и оценен по выходу каждого вектора в малом масштабе. Результаты показывают, что векторы AAV9 представлены с наибольшим выходом, в то время как вектор AAVhu68 находится на втором месте (фиг. 8А). Тройные векторы AAV8 и AAV8 также обеспечили выход выше 4х10¹³ GC (фиг. 8A).

Другой набор векторов, имеющих указанный капсид и векторный геном, содержащий промотор CMV, интрон, кодирующую последовательность иммуноадгезина (201Ig IA) и поли-А SV40 (CMV.PI.201Ig IA.SV40), был получен и оценен по выходу и чистоте каждого вектора в мега-масштабе в соответствии с обычными способами. Результаты показаны на фиг. 8В и 9.

По аналогии с выходами препаратов в малом масштабе, векторы AAV9 представлены с наибольшим выходом около 5,7х10¹⁴ GC, в то время как вектор AAVhu68 находится на втором месте - около 3,8х10¹⁴ GC (Фиг. 8В). Векторы AAV8 обеспечили выход около 3,6х10¹⁴ GC и AAV8tirple - около 1,8х10¹⁴ GC (Фиг. 8В). Чистота протестированных препаратов сопоставима, находится в диапазоне от около 97,4% до около 98,6%.

Пример 8. Векторы RAAV у самцов мышей RAG KO.

Экспрессию гена тестировали in vivo с использованием векторов rAAV, имеющих различные капсиды, в том числе AAVhu68, AAV8triple, AAV8 и AAV9, и экспрессирующих секретируемый трансгенный продукт, 201Ig IA.

Самцам мышей RAG KO в возрасте 6-8 недель (п=5/группу) вводили внутримышечно в икроножную мышцу либо 3х 10¹¹ GC/мышь, либо 3х10¹⁰ GC/мышь тестируемого вектора с помощью шприца Гамильтона. Еженедельно собирали сыворотку у мышей, которым вводили векторы, экспрессирующие секретируемые белки, с помощью подчелюстного отбора крови в пробирки для сбора сыворотки. Уровни экспрессии трансгена были измерены в сыворотке крови с помощью ИФА, как описано в Greig et al., Intramuscular Injection of AAV8 in Mice and Macaques Is Associated with Substantial Hepatic Targeting and Transgene Expression, PLoS One. 2014 Nov 13;9(11):e112268. doi: 10.1371/journal.pone.0112268. eCollection 2014.

Как показано на фиг. 10А и 10В, векторы AAVhu68, AAV8 и AAV9 экспрессировали трансген на сходном уровне, а вектор AAV8triple, после в/м инъекции у мышей, экспрессировался лучше. При более низкой протестированной дозе (т. е. 3х10¹⁰ GC/мышь), разница в экспрессии AAV8triple является существенной.

Пример 9. Экспрессия трансгена векторов RAAV у самцов мышей C57BL/6J.

Экспрессию в печени и мышцах тестировали in vivo с использованием векторов rAAV, имеющих различные капсиды, в том числе AAVhu68, AAV8triple, AAV8 и AAV9, и экспрессирующих в качестве трансгена люциферазу светлячка (ffLuc).

Самцам мышей C57BL/6J в возрасте 6-8 недель (п=5/группу) вводили внутримышечно в икроножную мышцу 3х1011 GC/мышь тестируемого вектора с помощью шприца Гамильтона. Экспрессию ffLuc визуализировали с помощью еженедельной биолюминесцентной визуализации всего тела, как описано

- 55 048431 ранее (Greig et al., PLoS One 2014, приведено выше).

Как показано на фиг. 11А и 11В, векторы AAVhu68, AAV8 и AAV9 экспрессировались на сходном уровне как в мышцах, так и печени, а вектор AAV8triple имел пониженную экспрессию в печени и повышенную экспрессию в мышцах.

Пример 10. Векторы RAAV у самцов и самок макак CYNOMOLGUS.

Экспрессию трансгена тестировали у макак Cynomolgus с использованием векторов rAAV, имеющих различные капсиды, в том числе AAVhu68, AAV8triple, AAV8 и AAV9, и экспрессирующих секретируемый трансген, 201Ig IA.

Для исследования биораспределения вектора самцам и самкам макак Cynomolgus, имеющим в начале исследований титры нАт к инъецируемому вектору <1:5, вводили в дозе 10 GC/кг массы тела вектор, экспрессирующий 201Ig IA с одним из четырех векторных капсидов (AAV8triple, AAVhu68, AAV9 или AAV8), внутримышечно в латеральную широкую мышцу бедра правой и левой ноги в виде инъекций 1 мл на кг массы тела (концентрация вектора 10¹³ GC/мл). Образцы крови брали до исследования и еженедельно в ходе исследования с помощью венопункции бедренной вены. Уровни экспрессии трансгена измеряли в сыворотке крови с помощью ИФА, как описано ранее (Greig et al., PLoS One 2014, приведено выше).

Как показано на фиг. 12, после в/м инъекции векторы AAVhu68 и AAV8triple лучше экспрессируются по сравнению с AAV9 и AAV8.

Все документы, процитированные в этом описании, включены в данный документ в качестве ссылки, как и предварительная патентная заявка США № 62/614,002, поданная 5 января 2018, предварительная патентная заявка США № 62/591,001, поданная 27 ноября 2017 года, и предварительная патентная заявка США № 62/464,748, поданная 28 февраля 2017. Перечень последовательностей, поданный с этим документом, названный 17-7986 Seq Listing_ST25.txt, а также последовательности и текст с ними включены в данный документ посредством ссылки. Данное изобретение было описано со ссылками на конкретные варианты его осуществления, однако следует понимать, что могут быть выполнены модификации без отступления от сути настоящего изобретения. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Произвольный текст перечня последовательностей.

Следующая информация предлагается для последовательностей, содержащих произвольный текст под числовым идентификатором <223>.

- 56 048431

SEQ ГО NO: (содержит произвольный текст)	Произвольный текст под <223>
2	<223> Синтетическая конструкция
3	<223> Ген rep AAVhu68 происхождения Homo Sapiens
4	<223> Синтетическая конструкция
5	<223> Капсид VP1 AAV9 происхождения Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2208) <223> Капсид VP1 AAV9
6	<223> Синтетическая конструкция
7	<223> Праймер prm504
8	<223> Праймер prm505
9	<223> Спейсерная последовательность AAVhu68
10	<223> Капсидный белок vpl AAVhu31
11	<223> Капсидный белок vpl AAVhu32
12	<223> Кодирующая последовательность vpl AAVhu31
13	<223> Кодирующая последовательность vpl AAVhu32
14	<223> модифицированный hu68vpl <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (23)..(23) <223> Хаа может представлять собой W (Тгр, триптофан) или

- 57 048431

окисленный W. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (35)..(35) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (57)..(57) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (66)..(66) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (94)..(94) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (97)..(97) <223> Хаа может представлять собой D (asp, аспарагиновая кислота) или изомеризованную D. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (107)..(107) <223> Хаа может представлять собой D (asp, аспарагиновая кислота) или изомеризованную D. <220> <221> прочийпризнак <222> (113)..(113) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту

- 58 048431

природного происхождения <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (149)..(149) <223> Хаа может представлять собой S (Ser, серин) или фосфорилированный S <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (149)..(149) <223> Хаа может представлять собой S (Ser, серин) или фосфорилированный S <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (247)..(247) <223> Хаа может представлять собой W (Тгр, триптофан) или окисленный W (например, кинуренин). <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (253)..(253) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (259)..(259) <223> Хаа представляет собой Q, или Q, дезамидированный до глутаминовой кислоты (альфа-глутаминовая кислота), гамма-глутаминовой кислоты (Glu) или смеси альфа- и гамма-глутаминовых кислот <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (270)..(270) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220>

- 59 048431

<221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (297)..(297) <223> Хаа представляет собой D (Asp, аспарагиновую кислоту) или быть амидированной D до N (Asn, аспарагин) <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (304)..(304) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (306)..(306) <223> Хаа может представлять собой W (Тгр, триптофан) или окисленный W (например, кинуренин). <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (314)..(314) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (319)..(319) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (329)..(329) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (332)..(332) <223> Хаа может представлять собой К (lys, лизин) или ацетилированный К

- 60 048431

<220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (336)..(336) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (384)..(384) <223> Хаа может представлять собой D (asp, аспарагиновая кислота) или изомеризованную D. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (404)..(404) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (409)..(409) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (436)..(436) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (452)..(452) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (477)..(477) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp

- 61 048431

<220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (499)..(499) <223> Хаа может представлять собой S (Ser, серин) или фосфорилированный S <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (512)..(512) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (515)..(515) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (518)..(518) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (524)..(524) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (559)..(559) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (569)..(569) <223> Хаа может представлять собой Т (Thr, треонин) или фосфорилированный Т

- 62 048431

<220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (586)..(586) <223> Хаа может представлять собой S (Ser, серин) или фосфорилированный S <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (599)..(599) <223> Хаа представляет собой Q, или Q, дезамидированный до глутаминовой кислоты (альфа-глутаминовая кислота), гаммаглутаминовой кислоты (Glu) или смеси альфа- и гаммаглутаминовых кислот <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (605)..(605) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (619)..(619) <223> Хаа может представлять собой W (Тгр, триптофан) или окисленный W (например, кинуренин). <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (628)..(628) <223> Хаа может представлять собой Asn или быть дезамидированным до Asp, isoAsp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (640)..(640) <223> Хаа может представлять собой М (Met, метионин) или окисленный М. <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (651)..(651)

- 63 048431

<223> Хаа может представлять собой	Asn	или	быть
дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (663)..(663)
<223> Хаа может представлять собой дезамидированным до Asp, iso Asp или Asp/isoAsp <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (666)..(666)	Asn	или	быть
<223> Хаа может представлять собой К ацетилированный К <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (689)..(689)	(lys,	лизин)	или
<223> Хаа может представлять собой К ацетилированный К <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (693)..(693)	(lys,	лизин)	или
<223> Хаа может представлять собой К ацетилированный К <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (695)..(695)	(lys,	лизин)	или

<223> Хаа может представлять собой W (Тгр, триптофан) или окисленный W.

<220>

<221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (709)..(709)

	<223> Хаа может представлять дезамидированным до Asp, iso Asp или <220> <221> ПРОЧИЙПРИЗНАК <222> (735)..(735)	собой Asp/isoAsp	Asn	или	быть
	<223> Хаа может представлять дезамидированным до Asp, iso Asp или	собой Asp/isoAsp	Asn	или	быть

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), который содержит векторный геном в капсиде AAVhu68, причем (A) векторный геном содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) AAV и между ITR - последовательность нуклеиновой кислоты не-AAV, кодирующую продукт, функционально связанный с последовательностями, которые направляют экспрессию этого продукта в клетке-мишени млекопитающего; и (B) капсид AAVhu68 содержит белки AAVhu68 vp1, белки AAVhu68 vp2 и белки AAVhu68 vp3, полученные из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем белки vp1 AAVhu68 содержат глутаминовую кислоту в положении 67 и валин в положении 157, и белки vp2 AAVhu68 содержат валин в положении 157 на основании нумерации SEQ ID NO: 2.
2. 2. rAAV по п.1, где AAVhu68 содержит субпопуляции белков AAVhu68 vp1, AAVhu68 vp2 и AAVhu68 vp3, причем субпопуляции белков AAVhu68 vp1, AAVhu68 vp2 и AAV hu68 vp3 содержат по меньшей мере от 50 до 100% дезамидированных аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин в каждом из положений 57, 329, 452 и 512 по отношению к аминокислотам в SEQ ID NO: 2, причем дезамидированные аспарагины дезамидируют до аспарагиновой кислоты, изоаспарагиновой кислоты, пары взаимопревращающихся аспарагиновой кислоты/изоаспарагиновой кислоты или их комбинаций, как определено с помощью масс-спектрометрии.
3. 3. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), который содержит капсид AAVhu68 и векторный геном в капсиде AAVhu68, где:

   (А) векторный геном содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности инвертированных концевых повторов AAV (ITR), и между ITR последовательность нуклеиновой кислоты, отличную от AAV, кодирующую продукт, функционально связанный с последовательностями, которые направляют экспрессию продукта в клетке-мишени млекопитающего; и (В) капсид AAVhu68 содержит гетерогенные популяции белков AAVhu68 vp1, AAVhu68 vp2 и AAVhu68 vp3, где белки vp1 AAVhu68 представляют собой аминокислоты с 1 по 736 SEQ ID NO: 2 (vpl), которые содержат глутаминовую кислоту в положении 67 и валин в положении 157 и дополнительно содержат субпопуляции белков vp1, содержащие модифицированные аминокислоты на основе положений аминокислот в SEQ ID NO: 2, где белки vp2 AAVhu68 представляют собой аминокислоты с 138 по 736 SEQ ID NO: 2 (vp2), которые содержат валин в положении 157 и дополнительно содержат субпопуляции белков vp2, содержащие модифицированные аминокислоты на основе положений аминокислот в SEQ ID NO: 2, и где белки vp3 AAVhu68 представляют собой аминокислоты с 203 по 736 SEQ ID NO: 2 (vp3), которые содержат субпопуляции белков vp3, содержащие модифицированные аминокислоты на основе положений аминокислот в SEQ ID NO: 2, причем субпопуляции белков AAVhu68 vp1, AAVhu68 vp2 и AAV hu68 vp3 содержат по меньшей мере от 50 до 100% дезамидированных аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин в каждом из положений 57, 329, 452 и 512 относительно аминокислот в SEQ ID NO: 2, где дезамидированные аспарагины дезаминированы до аспарагиновой кислоты, изоаспарагиновой кислоты, пары взаимопревращающихся аспарагиновой кислоты/изоаспарагиновой кислоты или их комбинаций, как определено с помощью массспектрометрии.
4. 4. rAAV по п.2 или 3, где субпопуляции белков vp1, vp2 и vp3 AAVhu68 дополнительно содержат (i) одну или более дополнительных модификаций, выбранных из ацетилированного лизина, фосфорилированного серина и/или треонина, изомеризованной аспарагиновой кислоты, дезамидированных глутаминов, окисленного триптофана и/или метионина или амидированной аминокислоты, как определено с помощью масс-спектрометрии; и/или (ii) от 1 до 40% дезамидирования аспарагинов в одном или более положений N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709 или их комбинации, исходя из нумерации SEQ ID NO: 2, определенной с помощью масс-спектрометрии.
5. 5. rAAV по любому из пп.2-4, в котором субпопуляции капсида AAVhu68 капсидных белков AAVhu68 vp1, vp2 и vp3 дополнительно содержат (a) по меньшей мере 65% аспарагинов (N) в парах аспарагин-глицин, расположенных в положениях 57 белков vp1, дезамидированы, как определено с помощью масс-спектрометрии, на основе нумерации SEQ ID NO: 2; и/или (b) по меньшей мере 75% N в парах аспарагин-глицин в положении 329 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, как определено с помощью масс-спектрометрии, на основе нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и/или

   - 65 048431 (c) по меньшей мере 50% N в парах аспарагин-глицин в положении 452 белков vp1, v2 и vp3 дезамидированы, как определено с помощью масс-спектрометрии, на основе нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и/или (d) по меньшей мере 75% N в парах аспарагин-глицин в положении 512 белков vp1, vp2 и vp3 дезамидированы, как определено с помощью масс-спектрометрии, на основе нумерации остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
6. 6. rAAV по любому из пп.1-5, в котором капсид AAVhu68 содержит:

   (a) субпопуляцию белков vp1, в которой от 75 до 100% N в положении 57 белков vp1 дезамидировано, как определено с помощью масс-спектрометрии; и/или (b) субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75 до 100% N в положении 329 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано, как определено с использованием массспектрометрии; и/или (c) субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75 до 100% N в положении 452 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано, как определено с использованием массспектрометрии; и/или (d) субпопуляцию белков vp1, белков vp2 и/или белков vp3, в которых от 75 до 100% N в положении 512 на основе нумерации SEQ ID NO: 2 дезамидировано, как определено с использованием массспектрометрии.
7. 7. rAAV по любому из пп.1-6, в котором последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белки, является SEQ ID NO: 1, или последовательность от по меньшей мере на 80% до по меньшей мере на 99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; причем необязательно последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80-97% идентична SEQ ID NO: 1.
8. 8. Композиция для доставки желаемого генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, содержащая смешанную популяцию рекомбинантного аденоассоциированного вируса hu68 (rAAVhu68), причем каждый из rAAVhu68 независимо выбран из rAAV по любому из пп.1-7.
9. 9. rAAV по любому из пп.1-7 или композиция по п.8, в которой последовательности ITR AAV представляют собой 5' ITR и 3' ITR из AAV2.
10. 10. Композиция по п.8 или 9, где композиция составлена для (i) интратекальной доставки, и векторный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукт для доставки в центральную нервную систему;

    (ii) внутривенной доставки; или (iii) интраназальной или внутримышечной доставки.