EA033399B1

EA033399B1 - Аналоги глюкагона с повышенной растворимостью и/или стабильностью и их применение

Info

Publication number: EA033399B1
Application number: EA201590058A
Authority: EA
Inventors: Дитте Рибер; Лизе Гием
Original assignee: Зилэнд Фарма А/С
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2019-10-31
Also published as: ES2620111T3; FR24C1043I2; PH12015500115A1; EA201590058A1; HK1210787A1; AU2013295035A1; CA2878991A1; US11795204B2; FR24C1043I1; US20200207825A1; IN2015DN00544A; BR112015001451B1; PL2875043T3; JP2022023029A; IL236554A0; EP2875043A1; BR112015001451A2; TW201404785A; SG11201500375PA; PH12015500115B1

Abstract

Изобретение относится к аналогам глюкагона с повышенной растворимостью и/или стабильностью; нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность заявленного аналога глюкагона; вектору, содержащему заявленную нуклеиновую кислоту; клетке-хозяину, содержащей заявленные нуклеиновую кислоту и вектор; фармацевтической композиции, содержащей заявленный аналог глюкагона; применению заявленного аналога глюкагона для лечения, в частности, гипогликемии, а также соответствующим способам лечения.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагона и к их применению в медицине, например, для лечения гипогликемии. В частности, настоящее изобретение относится к стабильным аналогам глюкагона, пригодным для применения в виде жидкой лекарственной формы.

Уровень техники

Препроглюкагон человека представляет собой полипептид-предшественник из 158 аминокислот, который избирательно преобразовывается в тканях с образованием получаемых из проглюкагона пептидов близкой структуры, включая глюкагон (Glu или GCG), глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) и оксинтомодулин (ОХМ). Указанные модели участвуют в широком спектре физиологических функций, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и рост кишечника, а также регуляцию потребления пищи.

Нативный глюкагон представляет собой пептид из 29 аминокислот, которые соответствуют аминокислотам 53-81 препроглюкагона. Глюкагон способствует поддержанию уровня глюкозы в крови, связываясь с рецепторами глюкагона на поверхности гепатоцитов, стимулируя выделение из печени глюкозы, запасенной в форме гликогена, посредством гликогенолиза. По мере того, как указанные запасы истощаются, глюкагон также стимулирует синтез дополнительной глюкозы в печени посредством глюконеогенеза. Такая глюкоза выделяется в кровяное русло, что препятствует развитию гипогликемии.

Вследствие относительно низкой физической и химической стабильности, присущей нативному глюкагону, препараты глюкагона, которые в настоящее время существуют в продаже и которые предназначены преимущественно для применения в неотложных ситуациях для облегчения острой гипогликемии у субъектов с диабетом, получивших излишне высокую дозу инсулина, поставляются в форме лиофилизированных твердых препаратов, предусматривающих их восстановление в соответствующей жидкой среде перед применением. Субъекты с гипогликемией могут, среди прочего, испытывать головокружение и/или спутанность сознания, и в некоторых случаях могут терять сознание или находиться в полубессознательном состоянии, что не позволяет им произвести или закончить необходимое начальное восстановление препарата в жидкой среде и последующую инъекцию рассматриваемого препарата глюкагона. Как следствие, может потребоваться выполнения такого восстановления и инъекции другим человеком, который не имеет опыта работы с препаратом в ограниченный период времени, после которого возникает избыточная агрегация глюкагона. Хотя стабилизированные аналоги нативного глюкагона в жидком растворе востребованы, в продаже нет ни одной стабильной жидкой лекарственной формы какого-либо из указанных аналога глюкагона.

Исходя из этого очевидно, что имеется большая потребность в аналогах глюкагона, которые наряду с удовлетворительно высокой активностью в отношении рецептора глюкагона были бы в достаточной степени растворимы (особенно, при физиологическом pH, при котором нативный глюкагон нерастворим) и стабильны (физически и химически) в водной жидкой среде. Указанные аналоги (i) могут предпочтительно быть предложены в форме готовой к употреблению жидкой лекарственной формы, адаптированной для незамедлительного введения, и (ii) могут обладать способностью к хранению (включая хранение рассматриваемым субъектом или пациентом при комнатной температуре) в течение удовлетворительно длительного периода времени перед применением.

Краткое описание изобретения

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечено соединение, которое представляет собой аналог глюкагона и имеет формулу I

Ri-Z-R² (I) или фармацевтически приемлемая соль или сольват указанного соединения;

где

R¹ представляет собой водород, С₁-С4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

R² представляет собой ОН или NH2; и

Z представляет собой последовательность аминокислот, полученную из последовательности, которая имеет формулу Ia

HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT (la) и дополнительно содержащую по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции, которые присутствуют только в положениях последовательности аминокислот (обозначаемые как X), выбранных из положений 2, 3, 4, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, следующим образом:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His, Pro, Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на Val, Leu, N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, DVal, Phe,

His, Arg, Pro, DPro, N-Me-Ser или N-Me-DSer;

- 1 033399

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser, Glu, или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован;

при условии, что Z не является последовательностью аминокислот HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST; или

HSQGTFTSD YSKYLESRRAKEFVEWLES Т.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено соединение, которое имеет формулу I

Rj-Z-R² (I) или фармацевтически приемлемая соль или сольват указанного соединения;

где

R¹ представляет собой водород, С₁-С₄ алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

R² представляет собой OH или NH2; и

Z представляет собой последовательность аминокислот, полученную из последовательности, соответствующей формуле Ia

HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT (la) и дополнительно содержащую по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции, которые присутствуют только в положениях последовательности аминокислот, выбранных из положений 2, 3, 9, 10, 15, 16, 17, 20, 21, 24, 28 и 29, следующим образом:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, DVal, Phe, His, Arg, Pro, DPro, N-Me-Ser или N-Me-DSer;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован;

HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции, присутствующие в положениях последовательности аминокислот (обозначаемые как X), которые выбраны из положений 2, 3, 4, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, в соединении, соответствующем формуле I, являются следующими:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro, Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на Val, Leu, N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, Phe, His или Arg;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции присутствуют в положениях последовательности аминокислот (обозначаемые как X), которые выбраны из положений 2, 3, 4, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, в соединении, соответствующем формуле I, и являются следующими:

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

Y10 заменен на Leu или Val;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu или Val;

Q20 заменен на Glu или Lys;

- 2 033399

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо делетирован.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции присутствуют в положениях последовательности аминокислот (обозначаемые как X), которые выбраны из положений 2, 3, 4, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, в соединении, соответствующем формуле I, и являются следующими:

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac), Dap(Ac), Gln(Me) или His;

G4 заменен на DAla;

D16 заменен на Aib, Lys или Glu;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо делетирован.

Следует понимать, что любая конкретная молекула содержит по меньшей мере 3 отличия от последовательности, соответствующей формуле Ia, которые могут представлять собой сочетание по меньшей мере из 3 замен и делеций, допустимых в рамках данных выше определений.

Последовательность пептида Z может содержать максимально 3 замены и делеций (взятые в сочетании), максимально 5 замен и делеций, максимально 6 замен и делеций, максимально 7 замен и делеций, максимально 8 замен и делеций, максимально 9 замен и делеций, максимально 10 замен и делеций, максимально 11 замен и делеций, максимально 12 замен и делеций или максимально 13 замен и делеций по сравнению с последовательностью аминокислот, соответствующей формуле 1а.

Например, указанные соединения могут содержать от 3 до 11 замен и делеций, от 6 до 11 замен и делеций, от 3 до 9 замен и делеций или от 6 до 9 замен и делеций.

Соединения согласно настоящему изобретению обладают активностью агонистов глюкагона.

Соединения согласно настоящему изобретению обладают улучшенной растворимостью и/или стабильностью по сравнению с нативным глюкагоном человека.

Улучшенная растворимость может включать или представлять собой улучшенную растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при pH 4 (например, в 100 мМ ацетатного буфера при pH 4), pH 5 (например, в 100 мМ ацетатного буфера при pH 5), pH 6 (например, в 100 мМ фосфатного буфера при pH 6), pH 7 (например, в 100 мМ фосфатного буфера при pH 7) и/или pH 7,5 (например, в 100 мМ фосфатного буфера при pH 7,5). Определение можно проводить при условиях, указанных в примере 4. Желаемой может быть растворимость >1 мг/мл.

Улучшенная стабильность может включать или представлять собой улучшенную физическую стабильность и/или улучшенную химическую стабильность по сравнению со стабильностью нативного глюкагона человека.

Улучшенная физическая стабильность может включать или состоять в сниженной склонности к образованию агрегатов, например к образованию растворимых или нерастворимых агрегатов, например фибрилл. Агрегацию (например, образование фибрилл) можно определить, например, при начальной концентрации растворенного пептида 1 мг/мл при pH 7,5 и температуре 40°С. Можно применять любой подходящий период времени, например 24, 48 или 96 ч. Агрегацию можно определить при условиях, указанных в примере 5, при взбалтывании или без него.

Улучшенная химическая стабильность может включать или состоять в сниженной склонности пептида к расщеплению или распаду в водном буфере, как правило, в отсутствие протеазной или пептидазной активности примесей. Стабильность можно определять, например, при начальной концентрации растворенного пептида 1 мг/мл при pH 4,0 или 7,5 и температуре 40°С. Такая оценка может включать определение интактного пептида, оставшегося после инкубации в течение подходящего периода времени.

Оценка может включать определение чистоты интактного пептида, как описано в примере 6. Инкубацию можно проводить в течение любого подходящего периода времени, например 1 день, 7 дней или 14 дней. Стабильность можно определять при условиях, описанных в примере 6.

Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения включают без ограничений соединение или фармацевтически приемлемую соль или сольват соединения согласно настоящему изобретению для применения в терапии (например, при лечении острой или хронической гипогликемии);

фармацевтическую композицию, содержащую соединение или фармацевтически приемлемую соль или сольват соединения согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель;

способ лечения заболевания или патологического состояния у субъекта, нуждающегося в таком лечении, способ, включающий введение эффективного количества аналога глюкагона, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата аналога глюкагона согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции указанному субъекту;

- 3 033399 применение соединения или фармацевтически приемлемой соли или сольвата аналога глюкагона согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению при производстве лекарственного препарата для применения в терапии (например, при лечении острой или хронической гипогликемии);

нуклеотидную конструкцию (например, конструкция ДНК или РНК), кодирующую соединение (пептид) или пептид Z согласно настоящему изобретению;

вектор экспрессии, содержащий такую нуклеотидную конструкцию согласно настоящему изобретению; и клетку-хозяин, содержащую такую нуклеотидную конструкцию или вектор экспрессии согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации заболевание или патологическое состояние, которое лечат с использованием соединения или способа согласно настоящему изобретению, выбрано из гипогликемии, острой гипогликемии, хронической гипогликемии, диабета 2 типа, нарушения переносимости глюкозы, диабета 1 типа, ожирения, ишемической болезни сердца, атеросклероза, гипертензии, дислипидемии, жирового гепатоза, отравления β-блокаторами, инсулиномы и болезни Гирке. Согласно конкретным вариантам реализации указанным заболеванием или патологическим состоянием является гипогликемия. Согласно определенным вариантам реализации гипогликемия выбрана из диабетической гипогликемии, острой вызванной инсулином гипогликемии, недиабетической гипогликемии, реактивной гипогликемии, голодной гипогликемии, лекарственной гипогликемии, вызванной алкоголем гипогликемии, гипогликемии вследствие обходного желудочного анастомоза и гипогликемии, возникающей во время беременности.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение охватывает соединение или фармацевтически приемлемые соль или сольват соединения для лечения гипогликемии.

Краткое описание чертежа

На фигуре представлен график, демонстрирующий эффект однократного подкожного введения носителя (ФСБ (фосфатно-солевой буфер), pH 7,4), глюкагона человека (20 нмоль/кг массы тела) или соединения 14 согласно настоящему изобретению (20 и 60 нмоль/кг массы тела человека) соответственно, на уровень глюкозы в крови в течение 120 мин у анестезированных самцов крыс Спраг-Доули, голодающих в течение 5 ч и эугликемичных. Данные представлены как средние значения с SEM (стандартная ошибка среднего) (п=6/группу).

Подробное описание изобретения

Если в настоящей заявке не указано другого, научные и технические термины, применяемые в настоящей заявке, должны иметь те значения, которые обычно под ними подразумеваются специалистами в данной области техники. Как правило, номенклатура, употребляемая применительно к химии, молекулярной биологии, клеточной биологии и биологии рака, иммунологии, микробиологии, фармакологии, а также химии белков и нуклеиновых кислот, описываемым в настоящей заявке, хорошо известна и широко применяется в данной области техники.

Все публикации, патенты и опубликованные заявки на патенты, на которые даны ссылки в данной заявке, специфически включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая данные специфические определения, имеет преимущественную силу.

Каждый вариант реализации изобретения, описанный в настоящей заявке, может быть взят отдельно или в сочетании с одним или более другими вариантами реализации настоящего изобретения.

Определения.

Если не указано другое, для специфических терминов, которые применяются в приведенном выше описании, применимы следующие определения.

Во всем описании под словом содержать или его разновидностями, такими как содержит или содержащий, будет подразумеваться включение заданного целого числа (или компонентов) или группы целых чисел (или компонентов), но не исключение любого другого целого числа (или компонентов) или группы целых чисел (или компонентов).

Формы единственного числа включают формы множественного числа, если из контекста явно не следует другое.

Термин включая применяется для обозначения включая, но не ограничиваясь. Включая и включая, но не ограничиваясь применяются взаимозаменяемо.

Термины пациент, субъект и индивидуум могут применяться взаимозаменяемо и относятся к человеку или животному, отличному от человека. Указанные термины включают млекопитающих, таких как человек, приматы, сельскохозяйственные животные (например, коровы, свиньи), домашние животные (например, кони, кошки) и грызуны (например, мыши и крысы).

Наряду с объяснением значения определенных терминов или выражений, применяемых в настоящем описании, которые приведены выше, также применимы следующие определения/объяснения:

Термин фармацевтически приемлемый носитель включает любые стандартные фармацевтические носители или растворители, такие как носители или растворители, применяемые в составе композиций или лекарственных форм, пригодных для перорального, легочного, ректального, назального, местного,

- 4 033399 подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутрикожного, чрескожного или вагинального введения. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтике и, например, раскрываются в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). В жидких композициях в качестве носителей часто применяют водные растворы без буфера или с буфером. Например, можно применять стерильный физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер (ФСБ) при слегка кислом или физиологическом pH. Подходящие агенты для поддержания постоянного pH (некоторые из которых уже упоминались выше в связи с фармацевтическими композициями) включают фосфат, цитрат, ацетат, трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), №трис(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин (который часто является предпочтительным буфером), аргинин и лизин, а также их смеси. Указанный термин также охватывает любые агенты, перечисленные в Фармакопее США, для применения у животных или человека.

Термин фармацевтически приемлемая соль в контексте настоящего изобретения относится к соли, которая не вредна для пациента или субъекта, которого требуется лечить такой солью. Такие соли, как правило, представляют собой кислотно-аддитивные соли или основные соли. Примеры кислотноаддитивных солей включают соли неорганических кислот и соли органических кислот. Неограничивающие примеры подходящих кислотно-аддитивных солей включают гидрохлориды, фосфаты, форматы, ацетаты, трифторацетаты и цитраты. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочноземельных металлов, таких как кальций, а также замещенных ионов аммония, например типа +NR(R')3⁺, где R и R' независимо обозначают необязательно замещенный алкил C_1-6, необязательно замещенный алкенил С_2-6, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, P.A., U.S.A., 1985 и более поздних изданиях и в Энциклопедии фармацевтической технологии (Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology).

Термин сольват в контексте настоящего изобретения относится к комплексу определенной стехиометрии, образуемому между растворенным веществом (в данном случае соединением, или фармацевтически приемлемой солью соединения, согласно настоящему изобретению) и растворителем. Подходящие растворители (в частности, в случае фармацевтически приемлемых сольватов) включают воду, этанол и уксусную кислоту, но не ограничиваясь ими. Сольваты, в которых растворителем является вода, обычно называют гидратами.

Термин терапевтически эффективное количество и терапевтически эффективная доза в контексте настоящего изобретения (а именно в контексте соединения согласно настоящему изобретению) относится к количеству или дозе, достаточным для излечения, облегчения, частичного прекращения или другого способствования в лечении конкретного патологического состояния (расстройства, заболевания) или травмы и предпочтительно осложнений, возникающих вследствие такого патологического состояния или травмы.

Количество или доза, эффективные для конкретных целей, будут зависеть от тяжести патологического состояния или травмы, а также от массы тела и общего состояния субъекта или пациента, которого требуется лечить. Определение количества или дозы, которые будут адекватны, находится в компетенции опытного врача (или ветеринара) - специалиста в данной области.

Термин лечение (а также другие его грамматические формы) в контексте настоящего изобретения относится к способу получения благоприятных или желаемых клинических результатов. В целях настоящего изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают без ограничений облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие усугубления) стадии заболевания, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление стадии заболевания и ремиссию (частичную или полную), определимые или неопределимые. Термин лечение может также относиться к увеличению срока выживания по сравнению со сроком выживания, ожидаемым в отсутствие лечения. Лечение представляет собой вмешательство, проводимое с целью предупреждения развития или модификации патогенеза расстройства. Следовательно, термин лечение относится как к терапевтическим, так и к профилактическим или превентивным мерам. В контексте профилактических или превентивных мер соединение не обязательно должно полностью предотвращать развитие указанного заболевания или расстройства. Индивидуумы, нуждающиеся в лечении, включают индивидуумов, страдающих расстройством, а также индивидуумов, у которых следует предупредить развитие указанного расстройства. Также термин лечение относится к подавлению или уменьшению усиления симптомов патологии (например, увеличения веса или гипогликемии) по сравнению с отсутствием лечения, и это не обязательно подразумевает полное прекращение соответствующего патологического состояния.

Термин агонист в контексте настоящего изобретения относится к веществу (лиганду), которое активирует рецептор рассматриваемого типа.

Во всем описании настоящего изобретения применены традиционные однобуквенные и трехбуквенные коды для природных аминокислот. Если не указано другое, в настоящей заявке описаны L- 5 033399 изомерные формы аминокислот.

Dab(Ac) - 4-№-ацетил-2,4-димаминомаслянная кислота, (28)-4-(ацетиламино)-2-аминобутановая кислота или 4-(ацетиламино)-2-аминобутановая кислота (L-форма).

Dap(Ac) - 3-№-ацетил-2,3-диаминопропионовая кислота или 3-(ацетиламино)-2-аминопропионовая кислота (L-форма).

Gln(Me) - К-5-метил^-глутамин.

N-Me-Tyr - тирозин, который метилирован по α-атому азота.

N-Me-Dtyr - D-тирозин, который метилирован по α-атому азота.

N-Me-Ser - серин, который метилирован по α-атому азота.

N-Me-Dser - D-серин, который метилирован по α-атому азота.

Aib - α-аминоизомасляная кислота.

Термин нативный глюкагон относится к нативному глюкагону человека, обладающему последовательностью

Hy-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-SerArg-Arg-Ala-Gin-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (SEQ ID NO: 1).

Среди последовательностей, раскрываемых в настоящей заявке, есть последовательности, включающие группу Hy на N-конце последовательности, и ОН-группу или NI 1₂-группу на С-конце последовательности. В таких случаях, и если не указано другое, группа Hy на N-конце рассматриваемой последовательности показывает атом водорода [т.е. R¹ - водород=Ну в формулах I и Ia; что соответствует наличию свободной первичной или вторичной аминогруппы на N-конце], а ОН или NI 1₂-группа на Сконце последовательности указывает на гидроксильную группу [например, R²=OH в формулах I и Ia; что соответствует наличию карбоксильной (СООН) группы на С-конце] или аминогруппу [например, R²=NH2 в формулах I и Ia; что соответствует наличию амидной группы (CONH2) на С-конце] соответственно. В каждой последовательности согласно настоящему изобретению -ОН-группа на С-конце может быть замещена на -NH2 группу на С-конце, и наоборот.

Некоторые варианты реализации согласно настоящему изобретению относятся к соединениям, которые имеют формулу I

Rj-Z-R² (I) или к фармацевтически приемлемой соли или сольвату указанного соединения;

где

R¹ представляет собой водород, С1-С4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

R² представляет собой -ОН или -NH₂; и

Z представляет собой последовательность аминокислот, полученную из последовательности, соответствующей Ia

HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT (la) и дополнительно содержащую по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции, которые присутствуют только в положениях последовательности (обозначаемые X), выбранных из положений 2, 3, 4, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, следующим образом:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His, Pro, Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на Val, Leu N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, DVal, Phe, His, Arg, Pro, DPro, N-Me-Ser или N-MeDSer;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

X25 заменен на Arg, Lys, His, He, Leu, Ala, Met, Cys, Asn, Val, Ser, Glu, Asp, Gln, Thr или (p)Tyr;

N28 заменен на Ser, Lys или Glu либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован; при условии, что Z не является последовательностью аминокислот

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST; или HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST.

Некоторые варианты реализации согласно настоящему изобретению относятся к соединениям, соответствующим формуле I

R-Z-R² (I) или к фармацевтически приемлемой соли или сольвату указанного соединения;

где

- 6 033399

R² представляет собой -ОН or -NH₂; и

HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT (la) и дополнительно содержащую по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции, которые присутствуют только в положениях последовательности (обозначаемые X), выбранные из положений 2, 3, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, следующим образом:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован;

HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции в положениях последовательности (обозначаемые X), выбранные из положений 2, 3, 4, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29 соединения, соответствующего формуле I, включают следующие замены или делеции:

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro, Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на Val, Leu, N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, Phe, His или Arg;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции присутствуют в положениях последовательности (обозначаемые X), выбранных из положений 2, 3, 4, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29 соединения, соответствующего формуле I, и включают следующие замены или делеции:

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

Y10 заменен на Leu или Val;

D15 заменен на Glu;

D16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu или Val;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо делетирован.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные по меньшей мере три аминокислотных замены или делеции присутствуют в положениях последовательности (обозначаемые X), выбранных из положений 2, 3, 4, 16, 20, 21, 24, 28 и 29 соединения, соответствующего формуле I, и включают следующие замены или делеции:

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac), Dap(Ac), Gln(Me) или His;

G4 заменен на DAla;

- 7 033399

D16 заменен на Aib, Lys или Glu;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо делегирован.

Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 25 заменен на Arg, His или Lys. Согласно некоторым вариантам реализации соединения согласно настоящему изобретению могут содержать замены в положении 25, как например, в соединениях, описанных в заявке WO 2011/117417, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Однако такие замены в положении 25 согласно настоящему изобретению не являются обязательными для достижения улучшенной физической стабильности указанных аналогов глюкагона.

Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 27 заменен на Ser, Lys, Glu или Asp. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 27 заменен на Glu или Asp. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 27 представляет собой Glu.

Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 28 и/или остаток в положении 29 могут представлять собой остатки аминокислот, отличные от раскрываемых выше. Согласно некоторым вариантам реализации указанной заменой может быть гидрофильная замена (например, Arg, Lys, Asn, His, Gln, Asp, Ser или Glu). Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 28 и/или остаток в положении 29 можно выбрать из Glu, Asp, Lys, Arg, Ser, Leu, Ala и Gly. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 28 заменен на Glu или Asp. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 29 заменен на Glu или Asp. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 28 заменен на Glu, а остаток в положении 29 заменен на Glu.

Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 17 представляет собой Ala, а остаток в положении 27 представляет собой Glu. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 20 представляет собой Glu, а остаток в положении 27 представляет собой Glu. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 17 представляет собой Ala, остаток в положении 20 представляет собой Glu, а остаток в положении 27 представляет собой Glu. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 16 представляет собой Aib, а остаток в положении 27 представляет собой Glu. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 16 представляет собой Aib, остаток в положении 21 представляет собой Ser, а остаток в положении 27 представляет собой Glu. Согласно некоторым вариантам реализации остаток в положении 16 представляет собой Aib, остаток в положении 21 представляет собой Ser, остаток в положении 27 представляет собой Glu, а остаток в положении 28 представляет собой Ser.

Помимо возможности замены остатка аминокислоты в положении 3 (Q3) в формуле Ia на остаток аминокислоты, выбранный из His, Pro, Dab(Ac) и Gln(Me), также в положении 3 может быть замена на аналог глутамина, который, как правило, представляет собой неприродную аминокислоту (т.е. аминокислоту, не встречающуюся в природе в белках млекопитающих), такой как Dap(Ac) [т.е. остаток в положении 3=Dap(Ac)]. Тем не менее, во всех определениях, которые даны в настоящей заявке, изобретение дополнительно охватывает соединения, определяемые теми же общими формулами, но в которых не допускается Dap(Ac) в положении 3.

Согласно некоторым вариантам реализации соединения согласно настоящему изобретению Z выбран из группы, состоящей из

- 8 033399

HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEET

HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST

HSQGTFTSDYSRYLESARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST

HSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES

HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDKRRAEDFVSWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST

HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST

HSQ-DAla-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST HSQGTFTSDVSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-RRAESFVKWLEST

HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT

HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST HSQGTFTSDYSKYLD-Aib- ARAKS FVEWLEKT HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST

HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET

HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST

HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST

HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 2) (SEQ ID №: 3) (SEQ ID №: 4) (SEQ ID №: 5) (SEQ ID №: 6) (SEQ ID №: 7) (SEQ ID №: 8) (SEQ ID №: 9) (SEQ ID №: 10) (SEQ ID №: 11) (SEQ ID №: 12) (SEQ ID №: 13) (SEQ ID №: 14) (SEQ ID №: 15) (SEQ ID №: 16) (SEQ ID №: 17) (SEQ ID №: 18) (SEQ ID №: 19) (SEQ ID №: 20) (SEQ ID №: 21) (SEQ ID №: 22) (SEQ ID №: 23) (SEQ ID №: 24) (SEQ ID №: 25) (SEQ ID №: 26) (SEQ ID №: 27) (SEQ ID №: 28) (SEQ ID №: 29) (SEQ ID №: 30) (SEQ ID №: 31) (SEQ ID №: 32) (SEQ ID №: 33) (SEQ ID №: 34) (SEQ ID №: 35) (SEQ ID №: 36) (SEQ ID №: 37) (SEQ ID №: 38) (SEQ ID №: 39) (SEQ ID №: 40) (SEQ ID №: 41).

HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST

Конкретные соединения согласно настоящему изобретению включают

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEET-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSRYLESARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDLARAEDFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKRRAEDFVSWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST-OH

Hy-HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Соединение 1;

Соединение 2;

Соединение 3;

Соединение 4;

Соединение 5;

Соединение 6;

Соединение 7;

Соединение 8;

Соединение 9;

Соединение 10;

Соединение 11;

Соединение 12;

Соединение 13;

Соединение 14;

Соединение 15;

Соединение 16;

Соединение 17;

Соединение 18;

Соединение 19;

Соединение 20;

- 9 033399

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH

Hy-HSQ-DAla-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDVSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH₂

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-RRAESFVKWLEST-OH

Hy-HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAKSFVEWLEKT-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH₂

Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH

Hy-HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂

Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH

Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂

Hy-HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂

Соединение 21;

Соединение 22;

Соединение 23;

Соединение 24;

Соединение 25;

Соединение 26;

Соединение 27;

Соединение 28;

Соединение 29;

Соединение 30;

Соединение 31;

Соединение 32;

Соединение 33;

Соединение 34;

Соединение 35;

Соединение 36;

Соединение 37;

Соединение 38;

Соединение 39;

Соединение 40;

Соединение 41;

и фармацевтически приемлемые соли и сольваты указанных соединений.

Каждое из последних конкретных соединений (пептидов) и фармацевтически приемлемых солей и сольватов соединений согласно настоящему изобретению дополнительно представляет собой отдельный вариант реализации изобретения. Таким образом, согласно одному варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVXWLEET-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT-он или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSRYLESARAEDFVKWLEST-он или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-FISQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST-OFt или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-ElSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST-OEt или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представля- 10 033399 ет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES-OH _или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-он или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDLARAEDFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKRRAEDFVSWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQ-DAla-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDVSKYFD-Aib-ARAESFVKWFEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH₂ или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-RRAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Ну-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAKSFVEWLEKT-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NEE или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому вариант реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представля- 11 033399 ет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно еще одному варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂ или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂ или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению представляет собой Hy-HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂ или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения.

Соединения согласно настоящему изобретению могут содержать в пептидной последовательности один или более внутримолекулярных мостиков. Каждый такой мостик образуется между боковыми цепями двух аминокислотных остатков в последовательности, которые, как правило, разделены тремя другими аминокислотными остатками (т.е. между боковой цепью аминокислоты А и боковой цепью аминокислоты А+4).

Например, такой мостик может образоваться между боковыми цепями пар аминокислотных остатков 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28. Две рассматриваемых боковых цепи могут быть связаны друг с другом ионными взаимодействиями или ковалентными связями. Таким образом, такие пары аминокислотных остатков могут, например, содержать противоположно заряженные боковые цепи, способные к образованию солевого мостика или к вступлению в ионное взаимодействие. В таких случаях один из рассматриваемых аминокислотных остатков, например, может быть Glu или Asp, а второй может быть, например, Lys или Arg. Образование пар Lys и Glu или Lys и Asp также может приводить к образованию лактамного кольца.

Фармацевтические композиции.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение (или фармацевтически приемлемую соль или сольват указанного соединения) согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции можно получить традиционными способами, которые описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 19 edition, 1995.

Определенные варианты реализации жидких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению могут содержать соединение согласно настоящему изобретению в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 25 мг/мл, например приблизительно от 1 до приблизительно 10 мг/мл, например от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция обладает pH от 2,0 до 10,0. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать систему буферов, консервант(ы), агент(ы) для создания изотоничности, хелатирующий стабилизатор(ы) и/или поверхностно-активное вещество(а). Особую ценность имеют варианты реализации жидких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, которые представляют собой водные композиции, т.е. композиции, содержащие воду. Такие композиции могут быть в форме водного раствора или водной суспензии. Предпочтительными вариантами реализации водных фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению являются водные растворы. В контексте настоящего изобретения термин водная композиция, как правило, будет относиться к композиции, содержащей по меньшей мере 50 мас.% воды. Аналогично, термин водный раствор, как правило, будет относиться к раствору, содержащему по меньшей мере 50 мас.% воды, а термин водная суспензия - к суспензии, содержащей по меньшей мере 50 мас.% воды.

Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему

- 12 033399 изобретению содержит водный раствор соединения (или фармацевтически приемлемой соли или сольвата указанного соединения) согласно настоящему изобретению, которое присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл или выше, вместе с буфером, а pH указанной композиции составляет от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, например от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,5, например от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5, например от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,5 или от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,0.

Согласно другому варианту реализации фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению pH композиции равен pH, выбираемому из перечня, включающего

2,0, 2,1,2,2,

2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5,

4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,8, 9,9 и 10,0.

pH указанной композиции может по меньшей мере на 1 единицу pH отклоняться (например, в большую или меньшую сторону) от изоэлектрической точки составного соединения согласно настоящему изобретению, например по меньшей мере на 2 единицы pH отклоняться (например, в большую или меньшую сторону) от изоэлектрической точки аналога глюкагона согласно настоящему изобретению.

Согласно дополнительным вариантам реализации содержащих буфер фармацевтических композиций буфер или буферное вещество выбрано из группы, состоящей из ацетатных буферов (например, ацетат натрия), карбоната натрия, цитратов (например, цитрата натрия), глицил-глицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, фосфатов (например, выбранных из однозамещенного фосфорнокислого натрия, двузамещенного фосфорнокислого натрия и трехзамещенного фосфата натрия), TRIS (т.е. трис/(гидроксиметил)аминометана), HEPES (т.е. 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновая кислота), BICINE (т.е. Н,Н-бис-(2-гидроксиэтил)глицин) и TRICINE (т.е. Н-[трис(гидроксиметил)метил]глицин), а также буферов на основе сукцината, малата, малеата, фумарата, тартрата и аспартата, и их смесей.

Согласно дополнительным вариантам реализации фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению указанная композиция содержит фармацевтически приемлемый консервант. Подходящие консерванты включают консерванты, выбранные из группы, состоящей из фенола, о-крезола, pкрезола, m-крезола, метилф-гидроксибензоата, этил- p-гидроксибензоата, пропилф-гидроксибензоата, бутилф-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, этанола, хлорбутанола, тиомерозала, бронопола, бензойной кислоты, имидмочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, хлоркрезола, бензетония хлорида, хлорфенезина [т.е. 3-(p-хлорфенокси)пропан-1,2-диол] и их смесей. Консервант может присутствовать в концентрации от 0,1 до 30 мг/мл, например от 0.1 до 20 мг/мл (например, от 0,1 до 5 мг/мл, или от 5 до 10 мг/мл, или от 10 до 20 мг/мл) в готовой жидкой композиции. Применение консерванта в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники. В этой связи можно дать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 19 edition, 1995.

Согласно дополнительным вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит агент для поддержания изотоничности (т.е. фармацевтически приемлемый агент, который включают в композицию с целью придания композиции изотоничности). Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят субъекту путем инъекции. Подходящие агенты для поддержания изотоничности включают агенты, которые выбраны из группы, состоящей из солей (например, хлорид натрия), сахаров или сахарных спиртов, аминокислот (включая глицин, аргинин, лизин, изолейцин, аспарагиновую кислоту, триптофан и треонин), альдитов (включая глицерин, пропилен гликоль (т.е. 1,2-пропандиол), 1,3-пропандиол и 1,3-бутандиол), полиэтиленгликолей (включая PEG400) и их смесей. Подходящие сахара включают моно-, ди- и полисахариды и водорастворимые гликаны, такие как фруктоза, глюкоза, манноза, сорбоза, ксилоза, мальтоза, сахароза, трегалоза, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы. Согласно некоторым вариантам реализации можно применять сахарозу. Подходящие сахарные спирты включают гидроксилированные C4-C8 углеводороды, включая маннитол, сорбитол, инозитол, галактитол, дульцит, ксилитол и арабитол. Согласно некоторым вариантам реализации можно применять маннитол. Сахара или сахарные спирты, перечисленные выше, можно применять по отдельности или в сочетании. Фиксированных пределов количества агента для поддержания изотоничности нет до тех пор, пока он растворим в жидкой лекарственной форме, устанавливает изотоничность и не оказывает неблагоприятного действия на стабильность композиции. Концентрация агента для поддержания изотоничности (например, сахара или сахарного спирта) в готовой жидкой композиции может быть, например, от приблизительно 1 до приблизительно 150 мг/мл, например от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации концентрация может составлять от 1 до 7 мг/мл, или от 8 до 24 мг/мл, или от 25 до 50 мг/мл. Применение агента для поддержания изотоничности в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники. В этой свя

- 13 033399 зи можно дать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.

Согласно дополнительным вариантам реализации фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению указанная композиция содержит хелатирующий агент. Подходящие хелатирующие агенты включают соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), лимонной или аспарагиновой кислоты и их смеси. Указанный хелатирующий агент соответственно может присутствовать в готовой жидкой композиции в концентрации от 0,1 до 5 мг/мл, например от 0,1 до 2 мг/мл или от 2 до 5 мг/мл. Применение хелатирующего агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники. В этой связи можно дать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.

Согласно дополнительным вариантам реализации фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению указанная композиция содержит стабилизатор. Применение стабилизатора в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники, и в этой связи можно дать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995. Наиболее применимы фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые представляют собой стабилизированные жидкие композиции с терапевтически активными компонентами, которые включают соединение согласно настоящему изобретению (например, пептид согласно настоящему изобретению), которые в противном случае могут проявлять склонность к образованию агрегатов в ходе хранения в жидкой среде. В данном контексте термин образование агрегатов относится к физическим взаимодействиям между молекулами пептида, которые приводят к образованию более крупных группировок, которые подвергаются в некоторой степени видимому осаждению из раствора. В настоящей заявке фраза в ходе хранения в жидкой среде относится к хранению жидкой композиции, которая, будучи приготовленной, не обязательно сразу же вводится субъекту. Напротив, после приготовления композиция может быть упакована для хранения в жидкой форме, в замороженном состоянии или в высушенной форме для последующего восстановления в жидкую форму или другую форму, подходящую для введения субъекту. В настоящей заявке термин высушенная форма относится к изначально жидкой композиции или лекарственной форме, которую высушили путем замораживания-сушки (т.е. лиофилизации), путем сушки распылением или сушки воздухом. Следовательно, образование агрегатов пептидом в ходе хранения жидкой фармацевтической композиции может неблагоприятно влиять на биологическую активность рассматриваемого пептида, что ведет к потере терапевтической эффективности указанной фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может приводить к другим проблемам, таким как блокировка систем для инфузионного введения, мембран или насосов, если такую содержащую пептид фармацевтическую композицию вводят при помощи системы для инфузий. Таким образом, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть эффективны в преодолении таких проблем.

Примеры стабилизаторов, подходящих для включения в фармацевтические композиции, согласно настоящему изобретению без ограничений включают аминокислоты в форме свободного основания или соли, например аминокислоты, содержащие заряженную боковую цепь, такие как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, или аминокислоты, такие как глицин или метионин (поскольку включение метионина может дополнительно ингибировать окисление остатков метионина в пептидах, содержащих по меньшей мере один остаток метионина, доступный для такого окисления); определенные полимеры (например, полиэтиленгликоли (такие как PEG 3350), поливиниловые спирты (PVA), поливинилпирролидон (PVP) и карбокси-/гидроксицеллюлоза и их производные); циклодекстрины; серосодержащие вещества (такие как монотиоглицерин, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол); и поверхностно-активные вещества (такие как неионные поверхностно-активные вещества, включая неионные поверхностно-активные вещества типа Полоксамер или Полисорбат (Tween). Применение поверхностно-активного вещества в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники. В этой связи можно дать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 19 edition, 1995.

В фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению могут также присутствовать дополнительные типы компонентов. Неограничивающие примеры классов таких компонентов включают смачивающие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, маслянистые носители и белки (например, сывороточный альбумин человека или желатин).

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в разные участки, например введение в участки, которые исключают всасывание, например в артерию, или вену, или в сердце, и в участки, которые подразумевают всасывание, такие как кожа, под кожу, в мышцу или в брюшную полость. В более общем смысле можно вводить фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению разными путями, например парентерально, в эпидермис, в кожу или чрескожным путем. Согласно некоторым вариантам реализации могут быть применимы другие пути введения, такие как лингвальный, сублингвальный, буккальный, пероральный, вагинальный или ректальный.

Композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в разных лекарственных формах, например растворы, суспензии или эмульсии, и применимы такие лекарственные формы, как формы с контролируемым, длительным, отложенным, замедленным или медленным высвобождением лекарства.

- 14 033399

Более конкретно, но не исключительно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению применимы в связи с системами для парентерального контролируемого и отложенного высвобождения, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. В этой связи можно дать общую ссылку на Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed., Marcel Dekker, New York, 2000) и Drugs and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed., Marcel Dekker, New York, 2000).

Парентеральное введение (жидкой фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению) можно проводить, например, путем подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекции при помощи шприца, например удобного шприца в форме ручки. В качестве альтернативы парентеральное введение проводят при помощи инфузионного насоса, например, в форме устройства или системы, которые носит с собой субъект или пациент, и содержащего резервуар с жидкой композицией согласно настоящему изобретению, и инфузионного насоса для доставки/введения композиции указанному субъекту или пациенту, или в форме соответствующего устройства миниатюрных размеров, подходящего для имплантации в организм указанного субъекта или пациента.

Термин стабилизированная композиция в настоящей заявке относится к композиции, обладающей увеличенной физической стабильностью; увеличенной химической стабильностью или увеличенной физической и химической стабильностью. Термин физическая стабильность в настоящей заявке относится к мере склонности пептида (например, соединения согласно настоящему изобретению) к образованию растворимых или нерастворимых агрегатов указанного пептида, например, вследствие воздействия на пептид стресс-факторов и/или взаимодействия с поверхностями, которые дестабилизируют его, такие как гидрофобные поверхности и границы раздела. Физическую стабильность водной композиции пептида можно оценивать визуально или путем измерения мутности после воздействия на композицию, налитую в подходящие емкости (например, картриджи или флаконы), механических/физических факторов (например, взбалтывания) при разных температурах и в течение разных периодов времени. Композицию можно классифицировать как физически нестабильную в отношении образования агрегатов пептида, если она проявляет визуальную мутность. В качестве альтернативы мутность композиции можно оценить посредством простых измерений мутности, хорошо известных специалистам в данной области техники. Физическую стабильность водной композиции пептида можно также оценить при помощи агента, который выступает в качестве спектроскопического зонда для оценки конформационного статуса пептида. Такой зонд предпочтительно является малой молекулой, которая предпочтительно связывается с ненативным конформационным изомером пептида. Одним примером такого спектроскопического зонда на основе малой молекулы является Тиофлавин Т, который представляет собой флуоресцентный краситель, который широко применялся для детекции амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл, и, вероятно, также других конфигураций пептида, Тиофлавин Т обусловливает новый максимум возбуждения приблизительно на 450 нм и усиливает испускание приблизительно на 482 нм, когда связывается с фебрильной формой пептида. Несвязанный Тиофлавин Т, по существу, не флуоресцирует на рассматриваемых длинах волн.

В настоящей заявке термин химическая стабильность относится к стабильности пептида в отношении ковалентных химических изменений в структуре пептида, которые приводят к образованию продуктов химического распада с потенциально более низкой биологической активностью и/или потенциально увеличенной иммуногенностью по сравнению с пептидом нативной структуры. Могут образовываться разные продукты химического распада в зависимости от типа и детальной природы нативного пептида и окружения, в котором находится пептид. На практике полностью избежать химического распада композиций пептидов, как правило, невозможно, и образование увеличенных количеств продуктов химического распада часто наблюдается во время хранения и применения таких композиций, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Многие пептиды склонны к процессам распада, при которых гидролизуется амидная группа боковых цепей остатков глутаминила и аспарагинила с образованием свободной карбоновой кислоты. Другие пути распада включают образование высокомолекулярных продуктов трансформации, в которых две или более молекул пептидов ковалентно связываются друг с другом путем переамидирования и/или дисульфидных взаимодействий, что ведет к образованию ковалентно связанных продуктов распада - олигомеров и полимеров (см, например, Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. and Manning M.C., Plenum Press, New York 1992).

Другой формой химического распада пептидов является окисление (например, остатков метионина). Химическую стабильность композиции пептида можно оценить путем измерения количества продуктов химического распада в разные моменты времени после воздействия разных условий внешней среды (например, образование продуктов распада часто может ускоряться при увеличенной температуре). Количество каждого индивидуального продукта распада можно определять путем разделения продуктов распада в зависимости от размера молекулы и/или заряда с применением разных хроматографических способов (например, эксклюзионная ВЭЖХ, ВЭЖХ в режиме с обращенной фазой).

Химическая нестабильность глюкагона как таковая при низком pH связана главным образом с изомеризацией и отщеплением остатков аспарагиновой кислоты, дезаминированием остатков глутамина и окислением метионина. В общем дезаминирование Asn и Gln возникает при высоком pH, и значимый

- 15 033399 процент его происходит при физиологическом pH около 7,4 через промежуточный продукт с циклическим имидным кольцом, которое может разрываться с образованием L-Asp и L-isoAsp или L-Glu и LisoGlu соответственно. Указанный промежуточный продукт с циклическим имидным кольцом также может приводить к образованию небольших количеств соответствующих D-изомеров, которые указывают на медленную рацемизацию циклического имида.

При значениях pH ниже физиологических скорость дезаминирования Asn и Gln уменьшается, но скорость образования циклического имида из Asp и Glu, и, следовательно, изомеризации при снижении pH увеличивается. Образование циклического имида максимально при pH от 4 до 6. Образование промежуточного продукта циклического имида также может приводить к расщеплению пептидной последовательности.

Как было описано выше, термин стабилизированная композиция может, таким образом, относиться к композиции с увеличенной физической стабильностью, или увеличенной химической стабильностью, или увеличенной физической и химической стабильностью. Как правило, композиция должна быть стабильна во время применения и хранения (в соответствии с рекомендуемыми условиями применения и хранения), по меньшей мере, до истечения указанного срока годности.

Согласно определенным вариантам реализации фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению (например, жидких композиций) композиция стабильна по меньшей мере в течение 2 недель применения и по меньшей мере в течение 6 месяцев хранения. Согласно дополнительным вариантам реализации указанная композиция стабильна по меньшей мере в течение 2 недель применения и по меньшей мере в течение года хранения. Согласно дополнительным вариантам реализации указанная композиция стабильна по меньшей мере в течение 2 недель применения и по меньшей мере в течение двух лет хранения. Согласно другим вариантам реализации указанная композиция стабильна по меньшей мере в течение 4 недель применения и по меньшей мере в течение 2 лет хранения или даже по меньшей мере в течение 4 недель применения и более 3 лет хранения.

Особую ценность представляют те варианты реализации таких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, которые стабильны по меньшей мере в течение 6 недель применения и по меньшей мере в течение 3 лет хранения. В этом отношении термин применение в целях настоящего абзаца относится к изъятию фармацевтической композиции из условий хранения для применения указанной композиции в терапевтических целях, и, как следствие, к воздействию на нее разных условий окружающей среды (условия освещенности, темнота, температура, взбалтывание и т.д.), тогда как термин хранение в целях настоящего абзаца относится к хранению при условиях без взбалтывания в холодильнике или морозильнике при температуре не выше 5°С. Опытный работник должен понимать обычный диапазон условий применения и хранения, которым могут подвергаться указанные фармацевтические композиции.

Нуклеиновые кислоты, векторы экспрессии и клетки-хозяева.

Согласно настоящему изобретению предложена молекула нуклеиновой кислоты (например, изолированная молекула нуклеиновой кислоты), кодирующая соединение согласно настоящему изобретению, или последовательность пептида Z соединения согласно настоящему изобретению.

Следует понимать, что соединение согласно настоящему изобретению или последовательность пептида Z, как правило, может кодироваться последовательностью нуклеотидов только тогда, когда последовательность пептида Z содержит только встречающиеся в природе аминокислоты, т.е.20 аминокислот, которые встречаются в природе в белках млекопитающих.

Как обсуждалось выше, настоящее изобретение относится, помимо прочего, к вектору экспрессии, содержащему последовательность нуклеотидной конструкции согласно настоящему изобретению, необязательно в сочетании с одной или более последовательностями для управления ее экспрессией, и к клетке-хозяину, содержащей вектор экспрессии согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанная клетка-хозяин способна экспрессировать и секретировать соединение согласно настоящему изобретению или соединение, обладающее последовательностью пептида Z соединения согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения соединения согласно настоящему изобретению, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина согласно настоящему изобретению при условиях, подходящих для экспрессии соединения и очистки соединения, получаемого таким путем. В качестве альтернативы указанный способ может включать экспрессию соединения, обладающего последовательностью пептида Z соединения согласно настоящему изобретению, и последующую модификацию N- или С-конца с получением соединения согласно настоящему изобретению. Согласно изобретению дополнительно предложены (i) нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению, (ii) вектор экспрессии согласно настоящему изобретению и (iii) клетка-хозяин, способная экспрессировать и необязательно секретировать соединение согласно настоящему изобретению, для применения в способе медикаментозного лечения. Указанные нуклеиновую кислоту, вектор экспрессии и клетку-хозяин можно применять для лечения любого из расстройств, описываемых в настоящей заявке, которые можно лечить при помощи самого соединения согласно настоящему изобретению. Ссылки на фармацевтическую композицию, содержащую соединение согласно настоящему изобретению, введение соединения согласно настоящему изобретению или любое

- 16 033399 их терапевтическое применение, следовательно, должны рассматриваться как включающие эквивалентное применение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, за исключением случаев, где контекст требует иного.

Синтез пептидов.

Пептиды согласно настоящему изобретению можно получать при помощи способов стандартного химического синтеза, или при помощи систем рекомбинантной экспрессии, или при помощи любого другого современного способа. Таким образом, аналоги глюкагона можно синтезировать несколькими способами, включая, помимо прочих, способы, включающие:

(a) синтез пептида посредством твердофазного или жидкофазного способа, поэтапного или посредством сборки фрагментов, и выделение и очистка готового пептидного продукта; или (b) экспрессия нуклеотидной конструкции, кодирующей указанный пептид, в клетке-хозяине, и восстановление продукта экспрессии из культуры клеток-хозяев; или (c) осуществление экспрессии нуклеотидной конструкции, кодирующей указанный пептид, в бесклеточной системе экспрессии белков в условиях in vitro и восстановление продукта экспрессии;

или применение любого сочетания способов (а), (b) и (с) с целью получения фрагментов пептида, последующего соединения (например, лигирования) указанных фрагментов с получением пептида, и восстановления указанного пептида.

Может быть предпочтительно синтезировать соединения согласно настоящему изобретению посредством твердофазного или жидкофазного синтеза пептидов - способами, которые хорошо известны специалистам в области синтеза пептидов. В этой связи может быть дана ссылка, например, на WO 98/11125 and Fields, G.B. et al., 2002, Principles and practice of solid-phase peptide synthesis. B: Synthetic Peptides (2nd Edition), и примеры, приведенные в настоящей заявке.

Для рекомбинантной экспрессии нуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению можно вводить в соответствующие векторы с образованием векторов для клонирования или векторов для экспрессии, содержащих нуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению (такие векторы также представляют собой аспекты настоящего изобретения). Указанные векторы в зависимости от цели и типа практического применения могут быть в форме плазмид, фагов, космид, мини-хромосом или вирусов, депротеинизированная ДНК, которая экспрессируется только временно в определенных клетках, может быть предпочтительной формой вектора. Предпочтительные векторы для клонирования и векторы экспрессии (векторы на основе плазмид) согласно настоящему изобретению способны к репликации, в результате чего их применение позволяет получить большое количество копий в целях высокоэффективной экспрессии или высокоэффективной репликации для последующего клонирования.

Как правило, вектор экспрессии может содержать в направлении от 5-' к 3'-концу следующие элементы, находящиеся в функциональной связи: промотор, запускающий экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, способствующий секреции (во внеклеточную фазу или, если применимо, в периплазму), фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид согласно настоящему изобретению, и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. Вектор экспрессии также может содержать дополнительные компоненты, такие как произвольные маркеры или точки начала репликации. При работе с векторами для экспрессии в штаммах-продуцентах или линиях клеток может быть предпочтительно, чтобы вектор после введения в клетку-хозяина мог быть интегрирован в геном клетки-хозяина. Специалистам в данной области техники должны быть известны подходящие векторы, и указанные специалисты должны быть способны сконструировать вектор, отвечающий специфическим требованиям.

Векторы согласно настоящему изобретению можно применять для трансформации клеток-хозяев для наработки соединения согласно настоящему изобретению. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или линиями клеток, применяемыми для воспроизведения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно настоящему изобретению или применяемыми для рекомбинантной продукции пептидов согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации трансформированными клетками согласно настоящему изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (например, бактерии из рода Escherichia (например, Е. coli), Bacillus (например, Bacillus subtilis), Salmonella или микобактерии (предпочтительно не патогенные, например, М. bovis BCG)), дрожжи (такие как Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris) или простейшие. В качестве альтернативы трансформированными клетками могут быть клетки многоклеточных организмов, например клетки грибов, клетки водорослей, клетки насекомых, клетки растений или клетки животных, такие как клетки млекопитающих. В целях клонирования и/или оптимизации экспрессии трансформированные клетки могут быть способны к репликации нуклеотидной конструкции согласно настоящему изобретению. Клетки, экспрессирующие нуклеотидные конструкции, являются полезным вариантом реализации настоящего изобретения, и их можно применять для маломасштабного или крупномасштабного получения пептидов согласно настоящему изобретению.

При продукции пептида согласно настоящему изобретению с использованием трансформированных

- 17 033399 клеток целесообразно, хотя и не абсолютно необходимо, чтобы указанный продукт экспрессии секретировался в питательную среду.

Эффективность.

Связывание соответствующих соединений с рецептором глюкагона (Glu или GCG) можно применять в качестве показателя активности агониста. Согласно альтернативным вариантам реализации можно также применить биологический анализ, который позволяет измерить внутриклеточную передачу сигнала, вызванную связыванием соединения с указанным рецептором. Например, активация рецептора глюкагона агонистом рецептора глюкагона будет стимулировать образование внутриклеточного циклического АМФ (цАМФ). Таким образом, для отслеживания активности рецептора можно использовать продукцию цАМФ в соответствующих клетках, экспрессирующих указанный рецептор.

Специалист в данной области техники должен иметь представление о подходящих форматах анализа, и их примеры приведены ниже. В качестве примера в анализе может быть задействован рецептор глюкагона человека (GCG-R) с основным номером доступа GL4503947 (NP_000151.1) или с основным номером доступа Р47871. Опытный работник должен понимать в данной связи, что когда упоминаются последовательности белков-предшественников, в анализе может быть задействован зрелый белок, не содержащий сигнальной последовательности.

Подходящими клетками, как правило, являются клетки млекопитающих, например клетки грызунов или приматов, например клетки крыс, мышей или хомяков, или клетки человека, такие как клетки HEK29. Они могут экспрессировать свой эндогенный рецептор глюкагона или могут быть сконструированы так, чтобы экспрессировать рецептор глюкагона (например, содержат последовательность рецептора человека, описанную выше). Указанный анализ можно проводить с применением материалов и при условиях, которые описаны в примере 3.

В качестве численной оценки активности агониста в отношении конкретного рецептора можно применять значения EC₅₀, которая является мерой концентрации соединения, которая необходима, чтобы достичь половины максимальной активности соединения в отношении рассматриваемого рецептора в конкретном анализе.

Применение в терапевтических целях.

Соединения (и фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанных соединений) согласно настоящему изобретению, как и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, могут быть полезны при лечении или профилактике целого ряда патологических состояний или расстройств. Необязательно, соединения (и фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанных соединений) можно применять в сочетании с одним или более терапевтически активными веществами. Таким образом, значимые способы терапевтического применения включают лечение или профилактику гипогликемии (острой и хронической), диабета 2 типа (включая прогрессирование заболевания при диабете 2 типа), нарушения переносимости глюкозы, диабета 1 типа, ожирения (включая заболевания или состояния, связанные с избыточным весом или ожирением), ишемической болезни сердца, атеросклероза, гипертензии, дислипидемии, жирового гепатоза, отравления β-блокаторами, инсулиномы и болезни Гирке; предупреждение появления избыточной массы тела у субъекта; снижение массы тела; снижение потребления пищи; повышение расходования энергии; замедление прогрессирования нарушения переносимости глюкозы (IGT) до диабета 2 типа; замедление прогрессирования диабета 2 типа в инсулинзависимый диабет; регулирование аппетита и индукцию насыщения (включая лечение булимии и лечение компульсивного переедания) и профилактику повторного набора массы тела после успешного ее снижения. Как правило, соединения (и фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанных соединений) согласно настоящему изобретению, как и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, могут быть полезны для контроля над уровнем глюкозы в крови.

Среди форм гипогликемии, которые поддаются лечению или профилактики согласно настоящему изобретению, можно назвать диабетическую гипогликемию (включая острую вызванную инсулином гипогликемию), недиабетическую гипогликемию, реактивную гипогликемию, гипогликемию, вызванную голоданием, гипогликемию, вызванную лекарствами, гипогликемию, вызванную алкоголем, гипогликемию вследствие обходного желудочного анастомоза и гипогликемию, возникающую во время беременности.

Дополнительные способы применения соединений (и фармацевтически приемлемых солей или сольватов указанных соединений) согласно настоящему изобретению и фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению включают применение в качестве миорелаксантов гладких мышц (спазмолитик) в связи с процедурами визуализации (например, рентгенография, компьютерная томография (КТ) или магнитно-резонансная томография (МРТ)), таких как визуализацию брюшной полости.

Комбинированная терапия.

Как уже указывалось выше, лечение соединением (или фармацевтически приемлемой солью или сольватом соединения) согласно настоящему изобретению можно проводить в сочетании с одним или более другими фармакологически активными веществами или агентами, например, выбираемыми из антидиабетических агентов, средств против ожирения, агентов, регулирующих аппетит, гипотензивных

- 18 033399 агентов, агентов для лечения и/или профилактики осложнений, возникающих вследствие или ассоциированных с диабетом, и агентов для лечения и/или профилактики осложнений и расстройств, возникающих вследствие ожирения или ассоциированных с ним. В данном контексте выражение антидиабетическое средство включает соединения для лечения и/или профилактики резистентности к инсулину и заболеваний, при которых резистентность к инсулину является механизмом патогенеза.

Примеры таких фармакологически активных веществ включают инсулин и аналоги инсулина, агонисты GLP-1, производные сульфонилмочевины (например, толбутамид, глибенкламид, глипизид и гликлазид), бигуаниды (например, метформин), меглитиниды, ингибиторы глюкозидазы (например, акарбоза), антагонисты глюкагона, ингибиторы дипептидилпептидазы IV (DPP-IV), ингибиторы ферментов печени, участвующих в стимуляции глюконеогенеза и/или гликогенолиза, модуляторы захвата глюкозы, тиазолидоны, такие как троглитазон и циглитазон, соединения, модифицирующие обмен липидов, такие как гиполипидемические средства (например, ингибиторы ГМГ-КоА (статины)), соединения, снижающие потребление пищи, агонисты ретиноидного X рецептора и агенты, действующие на АТФзависимые калиевые каналы β-клеток, например глибенкламид, глипизид, гликлазид и репаглинид; холестирамин, холестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол, декстротироксин, нетеглинид, репаглинид; β-блокаторы, такие как алпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторы АПФ (ангиотензин-превращающего фермента), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, хинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедепин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, и α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин; агонисты CART (регулируемого кокаином и амфетамином транскрипта), антагонисты NPY (нейропептида Y), агонисты МС4 (меланокортина 4), антагонисты орексина, агонисты ФНО (фактора некроза опухолей), агонисты CRF (кортикотропин-релизинг фактора), антагонисты CRF ВР (кортикотропин-релизинг факторсвязывающего белка), агонисты урокортина, агонисты β3, агонисты MSH (меланоцитостимулирующего гормона), агонисты ССК (холецистокинина), ингибиторы обратного захвата серотонина, ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанные серотонинергические и норадренергические соединения, агонисты 5НТ (серотонина), агонисты бомбезина, антагонисты галанина, гормон роста, релизинг -соединения гормона роста, агонисты TRH (тиротропин-релизинг гормона), модуляторы UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонисты лептина, агонисты дофамина (например, бромокриптин, допрексин), ингибиторы липазы/амилазы, модуляторы RXR (ретиноидного X рецептора), агонисты TR β и антагонисты гистаминовых рецепторов H3.

Любые подходящие сочетания соединения или соединений согласно настоящему изобретению с одним или более из перечисленных выше соединений, и необязательно с одним или более дополнительными фармакологически активными веществами, включены в область настоящего изобретения.

Экспериментальные способы

Применяемые сокращение имеют следующие значения:

COMU: 1-[(1-(циано-2-этокси-2-оксиэтилиденаминоокси)-диметиламиноморфолинометилен)]метанаммоний гексафторфосфат

DCM: дихлорметан

DMF: Ν,Ν-диметилформамид

DIPEA: диизопропилэтиламин

EtOH: этанол

Et₂O: диэтиловый эфир

HATU: М-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазол[4,5-Ь]пиридин-1-илметилен]-М- метилметанаммоний гексафторфосфат N-оксид

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

IBMX: 3-изобутил-1-метилксантин

MeCN: ацетонитрил

МС: масс-спектрометрия

ФСБ: фосфатно-солевой буфер

ОФ: обращенная фаза

TFA: трифторуксусная кислота

TIS: триизопропилсилан

Общие принципы синтеза аналогов глюкагона.

Твердофазный синтез пептидов (ТФСП) проводили на синтезаторе пептидов с микроволновым сопровождением с применением стандартной стратегии Fmoc в DMF на полистирольной смоле (Tentagel S Ram или Tentagel S PHB-Thr(tBu)). В качестве реагента для соединения применяли HATU или COMU, а в качестве основы - DIPEA. Для снятия защитных групп применяли пиперидин (20% в DMF). Псевдопро- 19 033399 лины: когда применимо, использовали Fmoc-Phe-Thr(v Me, Me pro)-OH, Fmoc-Asp-Ser(v, Me, Me pro)OH и Fmoc-Glu-Ser((|/. Me, Me pro)-OH (приобретенные у компании NovaBiochem). Глюкагон человека аналогично синтезировали и очищали посредством способа синтеза и способов очистки, описанных в настоящей заявке.

Отщепление.

Неочищенный пептид отщепляли от смолы путем обработки смесью TFA/TIS/вода 95/2,5/2,5 об.% при комнатной температуре в течение 2 ч. Большую часть TFA удаляли при пониженном давлении, и неочищенный пептид осаждали и промывали диэтиловым эфиром и высушивали при комнатной температуре.

Очищение неочищенного пептида посредством ВЭЖХ.

Неочищенный пептид очищали посредством ВЭЖХ ОФ с градиентом буфера А (0,1% TFA в воде) и буфера В (водный раствор, содержащий 0,1% TFA и 90% MeCN). Фракции анализировали посредством аналитической ВЭЖХ и МС, и значимые фракции объединяли и лиофилизировали.

Пептид впоследствии очищали посредством препаративной ВЭЖХ ОФ с градиентом буфера А' (0,1%-ный водный раствор муравьиной кислоты) и буфера В' (водный раствор, содержащий 0,1% муравьиной кислоты и 90% MeCN).

Перед лиофилизацией к отобранным фракциям добавляли TFA. Конечный продукт охарактеризовывали посредством аналитической ВЭЖХ и МС.

Аналитический способ ВЭЖХ.

Пептид анализировали посредством аналитической ВЭЖХ с применением градиента буфера А' (см. выше) и буфера В' (см. выше).

Пример 1. Синтез соединения 7.

Соединение 7 (SEQ ID №: 8) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty с применением смолы TentaGel PHB-Thr(tBu) (1,13 г; 0,24 ммоль/г), COMU в качестве связующего агента, NMP в качестве растворителя и химии Fmoc, как было описано выше. В последовательности были применены псевдопролины Fmoc-Phe-Thr((|/F Me, Me pro)-OH (в положении 6/7) и Fmoc-Glu-Ser(v, Me, Me pro)-OH (в положении 15/16). Пептид отщепляли от смолы, как было описано выше, и очистку проводили на колонке Gemini-NX (5 см, С18, 10 мкм) со скоростью потока 35 мл/мин для буфера А (см. выше) и буфера В (см. выше). Продукт десорбировали в линейном градиенте 20-50% буфера В в течение 47 мин, и соответствующие фракции анализировали посредством аналитической ВЭЖХ и МС. Объединенные фракции лиофилизировали и повторно растворяли в воде перед дальнейшей очисткой на колонке Gemini-NX (2,12x25 см, С18 (110А); 10 мкм) со скоростью потока 10 мл/мин для смеси буфера А' (см. выше) и буфера В' (см. выше). Продукт десорбировали в линейном градиенте 20-50% буфера В в течение 47 мин, и соответствующие фракции анализировали посредством аналитической ВЭЖХ и МС. К объединенным фракциям добавляли TFA, и их лиофилизировали с получением на выходе 112 мг продукта. Его чистота составляла 99%, что определяли посредством аналитической ВЭЖХ (см. выше), а моноизотопная масса составляла 3409,55 Да, что определяли посредством МС (расчетная 3409,58 Да).

Пример 2. Создание линии клеток, экспрессирующих рецептор глюкагона человека.

кДНК, кодирующую рецептор глюкагона человека (глюкагон-R) (основной номер доступа Р47871), клонировали из кДНК клона ВС104854 (MGC:132514/IMAGE:8143857). ДНК, кодирующую глюкагон-R, амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, кодирующих концевые сайты рестрикции для субклонирования. Праймеры для 5'-конца дополнительно кодировали близкую консенсусную последовательность Козак, чтобы гарантировать эффективную трансляцию. Отсутствие ошибок, возникших при клонировании, в последовательности ДНК, кодирующей глюкагон-R, подтверждали путем секвенирования ДНК. Продукты ПЦР, кодирующие глюкагон-R, субклонировали в экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, содержащий маркер устойчивости к неомицину (G418). Экспрессионные вектора для клеток млекопитающих, кодирующие глюкагон-R, трансфецировали в клетки линии HEK293 при помощи стандартного способа трансфекции с применением фосфата кальция. Через 48 ч после трансфекции клетки высевали для клонирования в ограниченном разведении, и проводили селекцию на питательной среде, содержащей 1 мг/мл G418. Через три недели 12 выживших колоний клеток, экспрессирующих рецептор глюкагон-R, отбирали, размножали и исследовали путем анализа на эффективность в отношении рецептора глюкагон-R, как описано ниже. Для оценки профиля соединения отобрали один клон, экспрессирующий глюкагон-R.

Пример 3. Анализ рецепторов на глюкагон.

Клетки HEK293, экспрессирующие глюкагон-R человека, рассевали с плотностью 60000 клеток на лунку в микропланшетах на 96 лунок, покрытых 0,01%-ным полиЖ-лизином, и давали им расти в течение 1 дня в культуре в 100 мкл ростовой среды. Для анализа индукции цАМФ рецептором глюкагон-R применяли анализ на цАМФ с использованием AlphaScreen® от компании Perkin Elmer в соответствии с инструкциями производителя. В день анализа питательную среду отбирали, и клетки однократно промывали 200 мл включенного в набор буфера для анализа с IBMX. Клетки инкубировали в 100 мл буфера для анализа/IBMX, содержащего увеличенную концентрацию тестируемых пептидов, в течение 15 мин

- 20 033399 при 37°С. Затем пептиды/буфер для анализа удаляли, и клетки подвергали лизису путем добавления 80 мл лизирующего буфера на лунку и инкубации с ним по меньшей мере в течение 10 мин при комнатной температуре. Из каждой лунки 10 мл лизата переносили в планшет OptiPlate на 384 лунки, смешивали с гранулами донора и акцептора и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Содержание цАМФ измеряли на планшетном ридере Envision. ЕС₅₀ и относительные показатели эффективности в сравнении с показателями для эталонного соединения (глюкагона) оценивали посредством компьютерного подбора кривых.

Пример 4. Оценка растворимости.

Готовили стоковый раствор тестируемого пептида (2 мг/мл; определяемый путем измерения поглощения раствора на длине волны 280 нм и путем применения коэффициента теоретического расширения на основании содержания триптофана и тирозина в пептиде) в деминерализованной воде с pH, скорректированным до 2,5 соляной кислотой, и его аликвоты разводили в соотношении 1:1 в 100 мМ ацетатном буфере (pH 4,0) и 100 нМ фосфатного буфера (pH 7,5) соответственно, и загружали в стандартный микротитрационный УФ нестерильный планшет на 96 лунок с плоским дном. Поглощение проб (одиночные пробы, n=1) на длине волны 280 и 325 нм измеряли в планшетном ридере для измерения поглощения, который предварительно нагревали до комнатной температуры. Критерием поглощения - мутности для растворимости пептида >1 мг/мл было поглощение на длине волны 325 нм <0,02 единиц поглощения (что в 5-6 раз превышает стандартное отклонение 8 проб буфера в планшете).

Многие соединения согласно настоящему изобретению проявляют растворимость >1 мг/мл в диапазоне pH от 4 до 7,5, более конкретно при pH 4 и pH 5 (например, в ацетатном буфере) и при pH 6, pH 7 и pH 7,5 (например, в фосфатном буфере).

Пример 5. Оценка физической стабильности.

Агрегацию в форме образования фибрилл определяли при помощи амилоидспецифического красителя Тиофлавина Т (ThT), который часто применяют, чтобы продемонстрировать присутствие фибрилл в растворе (см, например, Groenning, M., J. Chem. Biol. 3(1) (2010), pp. 1-18; Groenning et al., J. Struct. Biol. 158 (2007) pp. 358-369; and Levine, H, III, Protein Sci. 2 (1993) pp. 404-410). Все тестируемые пептиды растворяли в деминерализованной воде с pH, скорректированным до 2,5 соляной кислотой, при комнатной температуре. Раствор, содержащий 1 мг/мл пептида, 40 мкл ThT и 50 мМ фосфатного буфера, pH 7,5, загружали в черный флуоресцентный планшет на 96 лунок (прозрачное дно) в трех повторностях. Данные регистрировали с фиксированными интервалами по 10 мин, перед каждой регистрацией происходило автоматическое смешивание в течение 300 с (взбалтывание), в течение 96 ч при 40°С. Весь эксперимент повторили, но без взбалтывания. Физическую стабильность, выраженную как период задержки образования фибрилл (в часах), определяли как пересечение двух линейных регрессий, соответствующих начальной стабильной фазе и фазе роста.

Пример 6. Оценка химической стабильности.

Готовили стоковый раствор тестируемого пептида (1 мг/мл; определяемый путем измерения поглощения раствора на длине волны 280 нм и путем применения коэффициента теоретического расширения на основании содержания триптофана и тирозина в пептиде) в 50 мМ ацетатного буфера (pH 4,0) и в 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,5) соответственно. Пробы помещали в стеклянные флаконы и инкубировали при 40°С. Пробы анализировали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке С18 с десорбцией в градиенте концентраций с применением системы растворителей ацетонитрил/трифторуксусная кислота/вода. Процент площади главного пика (площадь-%) после времени инкубации Т= (относительно времени Т=0) определяли посредством УФ-спектрометрии на длине волны 220 нм.

Чистоту сначала определяли следующим образом:

Чистота (площадь-%)=(площадь главного пика/суммарная площадь всех пиков)х100.

Затем чистоту нормировали между моментами времени, положив, что чистота в момент времени 0 (Т=0) - 100 для каждого значения pH для конкретного пептида равна

Нормированная площадь-% в момент t (Т=0=[площадь-% (ТМ)/площадь-% (Т=0)]х100.

Результаты оценки активности in vitro (выраженные как значения EC50) и результаты оценки растворимости обобщены в табл. 1 (ниже), а результаты оценки физической и химической стабильности обобщены в табл. 2 (ниже).

Нормированные значения чистоты, представленные в табл. 2, были определены после инкубации в течение 14 дней.

Пример 7. Острое высвобождение глюкозы.

Изучали действие соединения 14 согласно настоящему изобретению (дозы 20 и 60 нмоль/кг массы тела соответственно) на острое высвобождение глюкозы у эугликемических самцов крыс линии СпрагДоули (Taconic, Лилль Скенсвед, Дания, 9-10 недель) в сравнении с действием нативного глюкагона человека (доза 20 нмоль/кг). Крысы голодали в течение 5 ч перед введением препаратов. Животным (1'1=6/группу) инъецировали тестируемое вещество или глюкагон однократно подкожно (п/к) с носителем (ФСБ, pH 7,4). Пробы крови отбирали из хвостовой вены перед введением препарата (t=0) и каждые 15

- 21 033399 мин в течение 2 ч в 5 мкл капиллярные пробирки. Во время эксперимента животных подвергали анестезии (стандартной смесью гипнорма/дормикума), чтобы гарантировать стабильный исходный уровень глюкозы в крови. Концентрацию глюкозы в крови определяли при помощи анализатора глюкозы Biosen (EKF-diagnostic GmbH, Германия). Данные обобщены на фигуре.

Пример 8. Фармакокинетика.

Была проведена сравнительная оценка фармакокинетики нативного глюкагона человека и репрезентативного соединения согласно настоящему изобретению у мышей, крыс и собак. Два указанных соединения проявляли сходные фармакокинетические характеристики, например, в отношении периода полувыведения(Ц_/2) и объема распределения.

Таблица 1

EC₅₀ и данные о растворимости соединений согласно настоящему изобретению

№ соединения	ID № последовательности
Глюкагон	1
1	2
2	3
3	4
4	5
5	6
6	7
7	8
8	9
9	10
10	И
И	12
12	13
13	14
14	15
15	16
16	17
17	18
18	19
19	20
20	21
21	22
22	23
23	24
24	25
25	26
26	27
27	28
28	29
29	30
30	31
31	32
32	33
33	34
34	35
35	36
36	37
37	38
38	39
39	40
40	40
41	41

GCG-REC50 in vitro [нМ]#	Растворимость pH 7,5
0,013	< 1 мг/мл
0,064	> 1 мг/мл
0,18	> 1 мг/мл
0,030	> 1 мг/мл
0,34	> 1 мг/мл
0,17	> 1 мг/мл
1,0	> 1 мг/мл
0,93	> 1 мг/мл
0,38	> 1 мг/мл
0,030	> 1 мг/мл
0,32	> 1 мг/мл
о,и	> 1 мг/мл
0,030	> 1 мг/мл
0,070	> 1 мг/мл
0,15	> 1 мг/мл
0,030	> 1 мг/мл
0,39	> 1 мг/мл
0,029	> 1 мг/мл
0,026	> 1 мг/мл
0,054	> 1 мг/мл
0,24	> 1 мг/мл
0,0095	> 1 мг/мл
0,024	> 1 мг/мл
0,16	> 1 мг/мл
0,0078	> 1 мг/мл
0,0066	> 1 мг/мл
0,0069	> 1 мг/мл
0,063	> 1 мг/мл
0,035	> 1 мг/мл
0,023	> 1 мг/мл
0,016	> 1 мг/мл
0,0072	> 1 мг/мл
0,0093	> 1 мг/мл
0,044	> 1 мг/мл
0,028	> 1 мг/мл
0,014	> 1 мг/мл
0,010	> 1 мг/мл
0,094	> 1 мг/мл
0,0047	> 1 мг/мл
0,0044	> 1 мг/мл
0,0035	> 1 мг/мл
0,0038	> 1 мг/мл

# - все значения приведены на двух соответствующих фигурах.

- 22 033399

Таблица 2

Данные о физической и химической стабильности соединений согласно настоящему изобретению

№ соединения	ID № последовательности	Нормированная чистота pH 4,0 через 14 дней [%]	Нормированная чистота pH 7,5 через 14 дней [%]	Физическая стабильность при pH 7.5 [часы: мин] (без взбалтывания)	Физическая стабильность при pH 7.5 [часы: мин] (с взбалтыванием)
1	2	Нет данных	Нет данных	05:18 + 00:23	01:49 + 00:10
2	3	83.5	86.2	ФНО	ФНО
3	4	85.0	86.5	ФНО	72:50 + 06:16
4	5	80.5	84.6	ФНО	ФНО
5	6	91.8	89.6	ФНО	ФНО
8	9	Не проводили	Не проводили	85	57:02 + 0:43
9	10	Не проводили	Не проводили	Возникновение	53:20 + 05:46
10	И	Не проводили	Не проводили	ФНО	ФНО
И	12	78,6	89,9	ФНО	ФНО
12	13	86,8	90,8	ФНО	ФНО
13	14	84,6	88,8	ФНО	80:10 + 14:54
14	15	89,5	92,4	ФНО	ФНО
15	16	89,1	95,1	ФНО	ФНО
16	17	89,1	Не проводили	12:57 + 00:02	Не проводили
17	18	89,9	88,3	62 + 4	41:33 + 04:18
18	19	Не проводили	Не проводили	15:04 + 00:41	03:48 + 00:06
19	20	Не проводили	Не проводили	Возникновение	Не проводили
20	21	Не проводили	Не проводили	ФНО	ФНО
21	22	89,8	93,5	ФНО	ФНО
22	23	91,1	95,3	ФНО	ФНО
23	24	Не проводили	Не проводили	ФНО	ФНО
24	25	92,8	94,4	ФНО	ФНО
25	26	93,8	89,8	ФНО	ФНО
26	27	90	93,9	ФНО	ФНО
27	28	Не проводили	Не проводили	46:20 ± 04:43	18:00 + 04:00
28	29	Не проводили	Не проводили	08:33 + 00:05	02:20 + 00:17
29	30	91	91,6	ФНО	ФНО
30	31	88,6	91,4	ФНО	ФНО
31	32	93,1	91,7	ФНО	ФНО
32	33	91,2	96,3	ФНО	ФНО
33	34	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО
34	35	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО
35	36	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО
36	37	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО
37	38	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО
38	39	Не проводили	Не проводили	Не проводили	ФНО

*ФНО - образование фибрилл не обнаруживали.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЗИЛЭНД ФАРМА А/С

Рибер, Дитте

Гием, Лизе <120> АНАЛОГИ ГЛЮКАГОНА С ПОВЫШЕННОЙ РАСТВОРИМОСТЬЮ И/ИЛИ СТАБИЛЬНОСТЬЮ И

ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> SJK/FP6907661 <140> PCT/EP2013/065519 <141> 2013-07-23 <150> US 61/674,706 <151> 2012-07-23 <150> US 61/785,611 <151> 2013-03-14 <150> DK PA201300360 <151> 2013-06-14 <160> 43 <170> PatentIn version 3.3

- 23 033399 <210>1 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

5 1015

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

<210> <211> <212> <213>	2 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	2
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

2025

<210> <211> <212> <213>	3 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	3
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Glu Thr

2025

<210> <211> <212> <213>	4 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	4
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Lys
1	5		10	15

- 24 033399

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210> 5 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 5

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys

5 10

Tyr Leu Asp Ser

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Ala Trp Leu Glu Ser Thr

<210> <211> <212> <213>	6 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	6
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Glu
1	5		10	15

Ala Arg Ala Lys Asp Phe Val Glu Trp Leu Glu Lys Thr

<210> <211> <212> <213>	7 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	7
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Glu Trp Leu Glu Ser Thr
	20	25
<210>	8
<211>	29
<212>	БЕЛОК

- 25 033399 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 8

His Ser Gln Gly

Thr Phe Thr Ser

Asp Tyr Ser Arg

Tyr Leu Glu Ser

Ala Arg Ala Glu

Asp Phe Val Lys

Trp Leu Glu Ser

Thr

<210> <211> <212> <213>	9 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	9
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Glu Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

25

<210> <211> <212> <213>	10 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	10
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

25

<210> <211> <212> <213>	11 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	11
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

- 26 033399

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Ser Trp Leu Glu Ser Thr <210> 12 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 12

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys

5 10

Tyr Leu Asp Ser

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

<210>	13
<211>	29
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(16)..(16)
<223>	Aib
<400>	13
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

<210> <211> <212> <213>	14 28 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<400>	14
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ser
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser

25

- 27 033399 <210> 15 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400>15

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

5 1015

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210>16 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Aib <400>16

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala

5 1015

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210>17 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 17

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser

5 10 15

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210> 18

- 28 033399 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 18

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp

5

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp

25 <210> 19 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 19

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp

5

Arg Arg Ala Glu Asp Phe Val Ser Trp

25 <210> 20 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 20

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp

5

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp

25 <210> 21 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

Ser Lys Tyr Leu Asp Leu

Glu Ser Thr

Ser Lys Tyr Leu Asp Lys

Glu Ser Thr

Ser Lys Tyr Leu Asp Val

Glu Ser Thr

- 29 033399

<222> <223>	(16)..(16) Aib
<400>	21

Gly

His Ala Gln

Thr Phe Thr Ser Asp Tyr

10

Ser

Lys

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala Arg Ala

Glu

Ser Phe Val Lys Trp Leu

Glu

Ser

Thr <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Искусственная последовательность <220>

<223>

Синтетическое соединение <220>

<221>

<222>

<223>

MOD_RES (16)..(16)

Aib <400>

His Ser Gln

Gly

Thr Phe Thr Ser

Asp

Tyr

Ser

Lys

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala Arg Ala

Glu

Glu Phe Val Lys

Trp

Leu

Glu

Ser

Thr <210> 23 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> SITE <222> (4)..(4) <223> Xaa представляет собой DAla <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16)

<223> Aib
<400> 23
His Ser Gln Xaa	Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1	5	10	15

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

25

- 30 033399 <210> 24 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Aib <400> 24

His 1

Ser Gln

Gly

Thr 5

Phe

Thr

Ser

Asp

Val 10

Ser

Lys

Tyr

Leu Asp Ala 15

Ala

Arg

Ala

Glu

Ser

Phe

Val

Lys

Trp

Leu

Glu

Ser

Thr

20

25

<210> 25 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> SITE <222> (3)..(3) <223> Xaa представляет собой Dab(Ac) <220>

<221> MOD_RES

<222>	(16).	..(16)
<223>	Aib
<400>	25
His Ser Xaa	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

25

<210>	26
<211>	29
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение

<220>

<221> MOD_RES

- 31 033399 <222> (16)..(16) <223> Aib <400>26

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala

Arg Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

2025 <210>27 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> SITE <222> (3)..(3) <223> Gln(Me), N-delta-methyl-L-glutamine <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Aib <400>27

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala

5 1015

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210>28 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 28

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

5 10 15

Ala Arg Ala Lys Ser Phe Val Glu Trp Leu Glu Lys Thr <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Искусственная последовательность

- 32 033399

Tyr Leu Asp Glu <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 29

His Ser Gln Gly

Thr Phe Thr Ser

Asp Tyr Ser Lys

Ala Arg Ala Lys

Ser Phe Val Glu

Trp Leu Glu Ser

Thr <210> 30 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

<222>	(16).	..(16)
<223>	Aib
<400>	30
His Ser Gln	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Lys Ser Phe Val Glu Trp Leu Glu Lys Thr

25

<210> <211> <212> <213>	31 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(16)..(16)
<223>	Aib
<400>	31
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala
1	5	10 15
Ala Arg Ala Glu Ser	Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Ala
	20	25

<210> 32 <211> 29 <212> БЕЛОК

- 33 033399

<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(16)..(16)
<223>	Aib
<400>	32
His Ser Gln Gly Thr	Phe Thr Ser Asp	Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1	5		10	15

Ala Arg Ala Glu Ser Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

2025 <210>33 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

<222>	(16).	..(16)
<223>	Aib
<400>	33
His Ser Xaa	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala

Glu

Ser Phe

Val Lys Trp Leu

Glu

Ser

Thr <210> 34 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Aib <400> 34

- 34 033399

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys

510

Tyr Leu Asp Ala

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Ser Trp Leu Glu Lys Thr

2025 <210>35 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

<222>	(16).	..(16)
<223>	Aib
<400>	35
His Ser Gln	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Glu Lys Phe Val Glu Trp Leu Glu Ser Thr

2025 <210>36 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

<222> <223>	(16). Aib	..(16)
<400>	36
His Ser Gln	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Ser Thr

25

<210>	37
<211>	29
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220> <223>	Синтетическое	соединение
<220>

- 35 033399

<221> <222> <223>	MOD_RES (16)..(16) Aib
<400>	37

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala

5 1015

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Lys Trp Leu Glu Glu Thr <210>38 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES

<222>	(16).	..(16)
<223>	Aib
<400>	38
His Ser Gln	Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Glu Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

25

<210> <211> <212> <213>	39 29 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(16)..(16)
<223>	Aib
<400>	39
His Ser His Gly Thr	Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala
1	5	10 15
Ala Arg Ala Glu Glu	Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr
	20	25

<210> 40 <211> 29 <212> БЕЛОК

- 36 033399

<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Синтетическое соединение
<220>
<221>	SITE
<222>	(3).	.(3)
<223>	Xaa	представляет	собой Dab(Ac)
<220>
<221>	MOD_	RES
<222>	(16)	..(16)
<223>	Aib
<400>	40
His Ser Xaa	Gly Thr Phe	Thr Ser Asp Tyr Ser Lys	Tyr Leu Asp Ala
1		5	10	15

Ala Arg Ala Glu Glu Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr

2025 <210>41 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Dap(Ac) <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16)

<223> Aib
<400> 41
His Ser Ser 1	Gly	Thr 5	Phe	Thr	Ser	Asp	Tyr 10	Ser	Lys	Tyr	Leu Asp Ala 15
Ala Arg Ala	Glu 20	Glu	Phe	Val	Lys	Trp 25	Leu	Glu	Ser	Thr

<210>	42
<211>	29
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическое	соединение

<400> 42

- 37 033399

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

5 1015

Ala Arg Ala Glu Asp Phe Val Lys Trp Leu Glu Ser Thr <210>43 <211>29 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическое соединение <400> 43

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr

5 10

Arg

Arg Ala

Lys

Glu Phe Val Glu

Trp

Leu

Glu

Ser

Thr

Leu Glu Ser

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Аналог глюкагона, который имеет формулу

R¹-Z-R², где

R¹ представляет собой водород (Ну), С₁-С₄ алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

R² представляет собой OH или NH₂ и

Z представляет собой последовательность аминокислот, которая отличается от последовательности HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT изменениями по меньшей мере в трех положениях, выбранных только из 2, 3, 4, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, причем

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His, Pro, Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на Val, Leu, N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

S16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, DVal, Phe, His, Arg, Pro, DPro, N-Me-Ser или N-Me-DSer;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser, Lys или Glu либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован, при условии, что Z не является последовательностью аминокислот

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST или HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST;

при этом указанный аналог глюкагона обладает активностью агониста по отношению к рецептору глюкагона и повышенной растворимостью и/или стабильностью по сравнению с нативным глюкагоном человека;

или фармацевтически приемлемая соль или сольват указанного аналога глюкагона.
2. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по п.1, при этом указанный аналог имеет формулу

R¹-Z-R², где

R¹ представляет собой водород (Ну), С₁-С₄ алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

R² представляет собой OH или NH2; и

Z представляет собой последовательность аминокислот, которая отличается от последовательности

- 38 033399

HSQGTFTSDYSKYLDSARAQDFVQWLENT изменениями по меньшей мере в трех положениях, выбранных только из 2, 3, 9, 10, 15, 16, 20, 21, 24, 28 и 29, причем

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

S16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, DVal, Phe, His, Arg, Pro, DPro, N-Me-Ser или N-Me-DSer;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован, при условии, что Z не является последовательностью аминокислот

HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST или HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST, при этом указанный аналог глюкагона обладает активностью агониста по отношению к рецептору глюкагона и повышенной растворимостью и/или стабильностью по сравнению с нативным глюкагоном человека.
3. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по п.1, где

S2 заменен на Aib или Ala;

Q3 заменен на His или Pro;

G4 заменен на DAla;

D9 заменен на Glu;

Y10 заменен на N-Me-Tyr или N-Me-DTyr;

D15 заменен на Glu;

S16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu, Val, Phe, His или Arg;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu, Lys или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser, Glu или Ala;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys либо делетирован;

T29 заменен на Ser или Ala либо делетирован.
4. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по п.1, где

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac), Dap(Ac) или Gln(Me);

G4 заменен на DAla;

Y10 заменен на Leu или Val;

D15 заменен на Glu;

S16 заменен на Aib, Lys, Glu, Leu или Val;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо делетирован.
5. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по п.1, где

S2 заменен на Ala;

Q3 заменен на Dab(Ac), Dap(Ac), Gln(Me) или His;

G4 заменен на DAla;

S16 заменен на Aib, Lys или Glu;

Q20 заменен на Glu или Lys;

D21 заменен на Glu или Ser;

Q24 заменен на Lys, Ser или Glu;

N28 заменен на Ser, Glu или Lys;

Т29 заменен на Ala либо отсутствует.

6. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп.1-5, при этом Z представляет собой последовательность аминокислот, выбранную из следующих:

- 39 033399

HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 2) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEET (SEQ ID №: 3) HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 4) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST (SEQ ID №: 5) HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT (SEQ ID №: 6) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST (SEQ ID №: 7) HSQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 9) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 10) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST (SEQ ID №: 11) HSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 12) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 13) HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES (SEQ ID №: 14) HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 15) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 16) HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 17) HSQGTFTSDYSKYLDLARAEDFVKWLEST (SEQ ID №: 18) HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 20) HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 21) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 22) HSQ-DAIa-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST HSQGTFTSDVSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 23) (SEQ ID №: 24) HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 25) HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 27) HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT (SEQ ID №: 28) HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST (SEQ ID №: 29) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAKSFVEWLEKT (SEQ ID №: 30) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA (SEQ ID №: 31) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 32) HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST (SEQ ID №: 33) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT (SEQ ID №: 34) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST (SEQ ID №: 35) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST (SEQ ID №: 36) HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET (SEQ ID №: 37) HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 38) HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 39) HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 40) И HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID №: 41).

7. Аналог глюкагона, фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп.1-5, при этом указанный аналог глюкагона имеет последовательность аминокислот, выбранную из следующих: Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEET-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST-OH

- 40 033399

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDLARAEDFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST-OH Hy-HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH Hy-HSQ-DAIa-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDVSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH₂

Hy-HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH

Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAKSFVEWLEKT-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH₂Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET-OH Hy-HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH Hy-HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂Hy-HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH₂.
8. Аналог глюкагона, который имеет формулу

Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
9. Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность аминокислот Z, раскрытую в любом из пп.1-6, при этом указанная последовательность аминокислот полностью состоит из встречающихся в природе аминокислот.
10. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.9.
11. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9 или вектор по п.10.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая аналог глюкагона, фармацевтически приемлемую соль или сольват по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или состояния, выбранного из гипогликемии, острой гипогликемии, хронической гипогликемии, диабета 2 типа, нарушения переносимости глюкозы, диабета 1 типа, ожирения, ишемической болезни сердца, атеросклероза, гипертензии, дислипидемии, жирового гепатоза, отравления β-блокаторами, инсулиномы и болезни Гирке.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что указанное заболевание или состояние представляет собой гипогликемию.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что указанная гипогликемия выбрана из диабетической гипогликемии, острой, вызванной инсулином гипогликемии, недиабетической гипогликемии, реактивной гипогликемии, вызванной голоданием гипогликемии, вызванной лекарствами гипогликемии, вызванной алкоголем гипогликемии, гипогликемии вследствие обходного желудочного анастомоза и гипогликемии, возникающей во время беременности.
15. Способ лечения заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества аналога глюкагона, фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-8 или фармацевтической композиции по любому из пп.1214 указанному субъекту, причем указанное заболевание или состояние выбрано из гипогликемии, острой гипогликемии, хронической гипогликемии, диабета 2 типа, нарушения переносимости глюкозы, диабета 1 типа, ожирения, ишемической болезни сердца, атеросклероза, гипертензии, дислипидемии, жирового гепатоза, отравления β-блокаторами, инсулиномы и болезни Гирке.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанное заболевание или состояние представляет собой гипогликемию.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная гипогликемия выбрана из диабетической гипогликемии, острой, вызванной инсулином гипогликемии, недиабетической гипогликемии, реактивной гипогликемии, вызванной голоданием гипогликемии, вызванной лекарствами гипогликемии, вызванной алкоголем гипогликемии, гипогликемии вследствие обходного желудочного анастомоза и гипогликемии,

- 41 033399 возникающей во время беременности.
18. Применение аналога глюкагона, фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-8 для лечения гипогликемии, острой гипогликемии, хронической гипогликемии, диабета 2 типа, нарушения переносимости глюкозы, диабета 1 типа, ожирения, ишемической болезни сердца, атеросклероза, гипертензии, дислипидемии, жирового гепатоза, отравления β-блокаторами, инсулиномы и болезни Гирке.
19. Применение по п.18, отличающееся тем, что указанная гипогликемия выбрана из диабетической гипогликемии, острой, вызванной инсулином гипогликемии, недиабетической гипогликемии, реактивной гипогликемии, вызванной голоданием гипогликемии, вызванной лекарствами гипогликемии, вызванной алкоголем гипогликемии, гипогликемии вследствие обходного желудочного анастомоза и гипогликемии, возникающей во время беременности.