[go: up one dir, main page]

EA025786B1 - Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью - Google Patents

Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью Download PDF

Info

Publication number
EA025786B1
EA025786B1 EA201391400A EA201391400A EA025786B1 EA 025786 B1 EA025786 B1 EA 025786B1 EA 201391400 A EA201391400 A EA 201391400A EA 201391400 A EA201391400 A EA 201391400A EA 025786 B1 EA025786 B1 EA 025786B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cell
antibody
cytotoxic agent
approximately
antibodies
Prior art date
Application number
EA201391400A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391400A1 (ru
Inventor
Шэнцзинь Цзинь
Original Assignee
Иммуноджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Иммуноджен, Инк. filed Critical Иммуноджен, Инк.
Priority claimed from PCT/US2012/031253 external-priority patent/WO2012135522A2/en
Publication of EA201391400A1 publication Critical patent/EA201391400A1/ru
Publication of EA025786B1 publication Critical patent/EA025786B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агент-цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, и такие способы включают проведение реакции модификации при пониженной температуре. Способы по изобретению включают контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту и получения смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами.

Description

Изобретение описывает способ получения связывающего клетку агента с присоединенным к нему линкером, и такой способ включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера со связывающим клетку агентом с получением смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами.
В одном варианте воплощения изобретения описывается способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) подвергание первой смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов с получением очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, (в) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в очищенной первой смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе, имеющим рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (ί) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент, и (ίίί) побочные продукты реакции, и (г) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
Другой вариант воплощения изобретения описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами и цитотоксического агента в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (ί) связывающий
- 1 025786 клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент, и (ίίί) побочные продукты реакции, и (в) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
Данное изобретение также включает конъюгат, включающий связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, полученный в соответствии с описанными в данном документе способами.
Описание изобретения
Специалисту в данной области будет очевидно, что конъюгаты, включающие связывающий клетку агент, такой как антитело, химически связанный с цитотоксическим агентом (конъюгаты антителоцитотоксический агент), обычно получают модификацией антитела бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при комнатной температуре (т.е. приблизительно 20°С или выше), очисткой антитела с присоединенными к нему линкерами, конъюгацией цитотоксического агента с антителом с присоединенными к нему линкерами и очисткой конъюгата антитело-цитотоксический агент. Изобретение улучшает такие способы путем оптимизации стадии модификации в целях максимизации реакции линкера со связывающим клетку агентом и сведения к минимуму нежелательных побочных реакций. В частности, неожиданно было обнаружено, что проведение реакции модификации (реакции связывающего клетку агента с линкером) при пониженной температуре (например, приблизительно 15°С или менее) расширяет интервал максимизации уровня требуемых видов связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами до образования значительных уровней нежелательных побочных продуктов реакции, что обеспечивает соответствие способа широкомасштабному производству. В соответствии с этим, изобретение описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агента - цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре.
Изобретение описывает способ получения связывающего клетку агента с присоединенным к нему линкером, и такой способ включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера со связывающим клетку агентом с получением смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами. Например, способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С, приблизительно 14°С, приблизительно 13°С, приблизительно 12°С, приблизительно 11°С, приблизительно 10°С, приблизительно 9°С, приблизительно 8°С, приблизительно 7°С, приблизительно 6°С, приблизительно 5°С, приблизительно 4°С, приблизительно 3°С, приблизительно 2°С, приблизительно 1°С или приблизительно 0°С, приблизительно -1°С, приблизительно 2°С, приблизительно -3°С, приблизительно -4°С, приблизительно -5°С, приблизительно -6°С, приблизительно -7°С, приблизительно -8°С, приблизительно -9°С или приблизительно -10°С, при условии, что раствор защищен от замораживания, например, присутствием органического растворителя(-ей), используемого для растворения бифункционального реагента, образующего перекрестные связи. В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре от приблизительно 10°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 10°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 10°С до приблизительно 15°С или от приблизительно 5°С до приблизительно 10°С. В другом варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 10°С (например, при температуре от 8 до 12°С или при температуре от 9 до 11°С).
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,5 или выше. Например, способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9, приблизительно 8,0, приблизительно 8,1, приблизительно 8,2, приблизительно 8,3, приблизительно 8,4, приблизительно 8,5, приблизительно 8,6, приблизительно 8,7, приблизительно 8,8, приблизительно 8,9 или приблизительно 9,0. В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0 или от приблизительно 8,5 до приблизительно 9,0. В другом варианте воплощения изобре- 2 025786 тения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,8 (например, рН от 7,6 до 8,0 или рН от 7,7 до 7,9). Может использоваться любой подходящий буферный агент. Подходящие буферные агенты включают, например, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер. В предпочтительном варианте воплощения изобретения буферный агент выбирают из группы, состоящей из ΗΕΡΡδΟ (М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-гидроксипропансульфоновая кислоты)), ΡΟΡδΟ (пиперазин-1,4-бис-(2-гидрокси-пропансульфоновая кислота) дегидрата), ΗΕΡΕδ (4-(2гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислоты), ΗΕΡΡδ (ΕΡΡδ) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1пропансульфоновая кислоты), ΤΕδ (Ы-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислоты) и их комбинаций.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем высокий рН (например, приблизительно 7,5 или выше), при низкой температуре (например, приблизительно 15°С или менее). В предпочтительном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,8, при температуре приблизительно 10°С. В другом варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 8,5, при температуре приблизительно 0°С.
В соответствии со способом по изобретению, контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, приводит к образованию первой смеси, включающей связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами, а также реагенты и другие побочные продукты реакции. В некоторых вариантах воплощения изобретения первая смесь включает связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами стабильным и нестабильным способом, а также реагенты и другие побочные продукты реакции. Линкер стабильно присоединен к связывающему клетку агенту, когда ковалентная связь между линкером и связывающим клетку агентом по существу не ослабляется или не разрывается при обычных условиях хранения в течение периода времени, который может варьироваться от нескольких месяцев до нескольких лет. В отличие от этого, линкер нестабильно присоединен к связывающему клетку агенту, когда ковалентная связь между линкером и связывающим клетку агентом по существу ослабляется или разрывается при обычных условиях хранения в течение периода времени, который может варьироваться от нескольких месяцев до нескольких лет.
В одном варианте воплощения изобретения очистка модифицированного связывающего клетку агента от реагентов и побочных продуктов реакции проводится подверганием первой смеси способу очистки. В этом отношении первая смесь может быть очищена посредством фильтрации тангенциальными потоками (ФТП), например, способом фильтрации тангенциальными потоками на основе мембраны, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или избирательной преципитации или любым другим подходящим способом очистки, а также их комбинациями. Такая первая стадия очистки обеспечивает очищенную первую смесь, т.е. повышенную концентрацию связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами и сниженное количество несвязанного бифункционального реагента, образующего перекрестные связи, в сравнении с первой смесью до очистки согласно способам по изобретению. Первую смесь предпочтительно очищают посредством фильтрации тангенциальными потоками.
После очистки первой смеси для получения очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, цитотоксический агент конъюгируют со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в первой очищенной смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9, при этом полученная вторая смесь включает (ί) связывающий клетку агент, химически связанный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент, и (ίίί) побочные продукты реакции.
В некоторых случаях очистку модифицированного связывающего клетку агента можно не проводить. Таким образом, в одном варианте воплощения изобретения первую смесь, включающую связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами, а также реагенты и другие побочные продукты реакции, не подвергают способу очистки. В такой ситуации цитотоксический агент может быть добавлен одновременно с реагентом, образующим перекрестные связи, или несколько позже, например, спустя 1, 2 или 3 ч после добавления реагента, образующего перекрестные связи, к связывающему клетку агенту. Модифицированный связывающий клетку агент конъюгируют с цитотоксическим агентом(например, майтансиноидом) путем реакции модифицированного связывающего клетку агента с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9, при этом стадия конъюгации приводит к образованию смеси стабильных конъюгатов связывающего клетку агента цитотоксического агента, нестабильных конъюгатов связывающего клетку агента - цитотоксического агента, нестабильного цитотоксического агента (т.е. несвязанного цитотоксического агента), реагентов и побочных продуктов.
- 3 025786
Реакцию конъюгации предпочтительно проводят при рН от приблизительно 4 до приблизительно рН 9 (например, рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5 до приблизительно 8, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6,0 до приблизительно 7). В некоторых вариантах воплощения изобретения реакцию конъюгации проводят при рН от приблизительно 6 до приблизительно 6,5 (например, рН от 5,5 до 7, рН от 5,7 до 6,8, рН от 5,8 до 6,7, рН от 5,9 до 6,6 или рН от 6 до 6,5), рН приблизительно 6 или ниже (например, рН от приблизительно 4 до 6, от приблизительно 4 до приблизительно 5,5, от приблизительно 5 до 6) или при рН приблизительно 6,5 или выше (например, рН от 6,5 до приблизительно 9, от приблизительно 7 до приблизительно 9, от приблизительно 7,5 до приблизительно 9 или от 6,5 до приблизительно 8). В одном варианте воплощения изобретения реакцию конъюгации проводят при рН от приблизительно 4 рН менее 6 или при рН больше чем от 6,5 до 9. Если стадию конъюгации проводят при рН приблизительно 6,5 или выше, некоторые цитотоксические агенты, содержащие сульфгидрильные группы, могут димеризировать с образованием дисульфидных связей. В одном варианте воплощения изобретения для эффективной реакции в подобной ситуации может потребоваться удаление из реакционной смеси следовых металлов и/или кислорода, а также в некоторых случаях добавление антиоксидантов или использование линкеров с более реакционными замещаемыми группами, или добавление цитотоксического агента в количестве более одной аликвоты.
Способ по изобретению в некоторых случаях может включать добавление сахарозы на стадии конъюгации, используемом в способе по изобретению, для увеличения растворимости и восстановления конъюгатов связывающего клетку агента цитотоксического агента. Желательно добавление сахарозы в концентрации от приблизительно 0,1% (в/о) до приблизительно 20% (в/о) (например, приблизительно 0,1% (в/о), 1% (в/о), 5% (в/о), 10% (в/о), 15% (в/о) или 20% (в/о)). Предпочтительно сахарозу добавляют в концентрации от приблизительно 1% (в/о) до приблизительно 10% (в/о) (например, приблизительно 0,5% (в/о), приблизительно 1% (в/о), приблизительно 1,5% (в/о), приблизительно 2% (в/о), приблизительно 3% (в/о), приблизительно 4% (в/о), приблизительно 5% (в/о), приблизительно 6% (в/о), приблизительно 7% (в/о), приблизительно 8% (в/о), приблизительно 9% (в/о), приблизительно 10% (в/о) или приблизительно 11% (в/о)). Кроме того, реакция конъюгации также может включать добавление буферного агента. Может использоваться любой подходящий буферный агент, известный в науке. Подходящие буферные агенты включают, например, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер. В предпочтительном варианте воплощения изобретения буферный агент выбирают из группы, состоящей из ΗΕΡΡδΟ (П-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), ΡΟΡδΟ (пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрат), ΗΕΡΕδ (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), ΗΕΡΡδ (ΕΡΡδ) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), ΤΕδ (П-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинаций.
После стадии конъюгации конъюгат подвергают стадии очистки. В этом отношении смесь конъюгатов может быть очищена посредством фильтрации тангенциальными потоками (ФТП), например, способом фильтрации тангенциальными потоками на основе мембраны, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или избирательной преципитации или любым другим подходящим способом очистки, а также их комбинациями. Специалисту в данной области станет очевидно, что очистка после стадии конъюгации позволяет выделить стабильный конъюгат, включающий связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом.
В одном варианте воплощения изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает первую стадию очистки после стадии модификации и вторую стадию очистки после стадии конъюгации. Например, изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) подвергание первой смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов с получением очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, (в) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в очищенной первой смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (ί) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент, и (ίίί) побочные продукты реакции, и (г) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
- 4 025786
В одном варианте воплощения изобретения в стадиях очистки используют фильтрацию тангенциальными потоками (ФТП, также известна как фильтрация перекрестными потоками, ультрафильтрация и диафильтрация) и/или адсорбционную хроматографию на смолах. Например, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством ФТП после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством ФТП после стадии конъюгации. С другой стороны, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии конъюгации. Также способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством ФТП после стадии конъюгации или первую стадию очистки посредством ФТП после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии конъюгации.
В одном варианте воплощения изобретения в качестве стадии очистки используют неадсорбционную хроматографию. Например, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством неадсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством неадсорбционной хроматографии после стадии конъюгации.
В другом варианте воплощения изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает одну стадию очистки после стадии конъюгации. Например, способ по изобретению может включать способ получения конъюгата, при этом смесь не подвергают очистке после стадии модификации. В этом отношении изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами и цитотоксического агента в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (ί) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент, и (ίίί) побочные продукты реакции, и (в) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает две отдельных стадии очистки после стадии конъюгации.
Для очистки могут использоваться любые подходящие системы ФТП, включая систему по типу Ре1Нсоп (Мййроге, ВШепса, МА), кассетную систему §айосоп (Зайогшз АО, Ейде^оой, ΝΥ) и систему по типу СеШгакеРе (Ра11 Согр., Еа® НИН, ΝΥ).
Для очистки может использоваться любая подходящая адсорбционная хроматографическая смола. Предпочтительные адсорбционные хроматографические смолы включают гидроксиаппатитовую хроматографию, гидрофобную хроматографию с индукционным зарядом (НС1С), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (ШС), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию с комбинированным режимом, аффинную хроматографию с иммобилизированным металлом (1МАС), лигандную хроматографию с красителем, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенными фазами и их комбинации. Примеры подходящих гидроксиаппатитовых смол включают керамический гидроксиаппатит (СНТ тип I и тип II, Вю-Рай ЬаЪогаФпек, Негси1е8, СА), гидроксиаппатит НА иИгоде1 (Ра11 Согр., Еа® Ηί11δ, ΝΥ) и керамический фтораппатит (СРТ тип I и тип II, Вю-Рай ЬаЪогаФпек, Негси1е8, СА). Примером подходящей смолы НОС является смола МЕР Нурегсе1 (Ра11 Согр., Еа® НИН, ΝΥ). Примеры подходящих смол ШС включают смолы бутил-сефароза, гексил-сефароза, фенил-сефароза и октил-сефароза (все производства ОЕ НеаНксаге, Р15са1а\уау, Νΐ), а также смолы Масго-ргер метил и Масго-Ргер ΐ-бутил (Вюгай ЬаЪога1ог1е8, Негси1е8, СА). Примеры подходящих ионообменных смол включают смолы §РЗерЬагоке, СМ-§ерЬаго8е и Ц-Зерйагоке (все производства ОЕ НеаНксаге, Р15са1а\уау, Νΐ) и смолу Ипокркеге δ (Вю-Рай ЬаЪогаФпек, Негси1е8, СА). Примеры подходящих ионообменных смол смешанного режима включают смолу ВакегЪопй АВх (ЙТ Вакег, РЫШркЪигд Νΐ). Примеры подходящих смол [МАС включают хелатную сефарозную смолу (ОЕ НеаНксаге, Р|5са1а^ау, Νΐ) и смолу РгойпНу [МАС (Вю-Рай ЬаЪога1ог1е8, Негси1е8, СА). Примеры подходящих лигандных смол с красителем включают голубую сефарозную смолу (ОЕ НеаНксаге, Р18са1атау, Νΐ) и смолу АГП-де! В1ие (Вю-Рай ЬаЪогаФпек, Негси1е8, СА). Примеры подходящих аффинных смол включают смолу сефарозы и белка А (например, МаЪδе1есΐ, ОЕ НеаНксаге, Р18са1атеау, ΝΙ), при этом связывающий клетку агент является антителом, и лектинаффинные смолы, например, лектин-сефарозная смола ЬепН1 (ОЕ НеаНксаге, Р18са1атау, Νΐ), при этом связывающий клетку агент содержит соответствующие сайты связывания лектина. С другой стороны
- 5 025786 может использоваться антитело, специфическое к связывающему клетку агенту. Такое антитело может быть иммобилизировано, например, смолой 8ерЬагоке 4 Рак! Р1оте (ОЕ НеаИЬсаге, РЬса1а\уау. N1). Примеры подходящих смол с обращенными фазами включают смолы С4, С8 и С18 (Огасе Уубас, Некрепа, СА).
Для очистки может использоваться любая подходящая неадсорбционная хроматографическая смола. Примеры подходящих неадсорбционных хроматографических смол включают, но не ограничиваются, смолы 8ΕΡΗΑΌΕΧ™ О-25, О-50, О-100, ЗЕРНАСКУЬ™ (например, 8-200 и 8-300), смолы δυΡΕΚΌΕΧ™ (например, δυΡΕΚΌΕΧ™ 75 и δυΡΕΚΌΕΧ™ 200), смолы БЮ-ОЕЬ® (например, Р-6, Р-10, Р-30, Р-60 и Р-100), и другие, известные специалисту в данной области.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению дополнительно включает стадию выдержки для высвобождения нестабильно связанных линкеров от связывающих клетку агентов. Стадия выдержки включает удерживание смеси после модификации связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, после конъюгации цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами, и/или после стадии очистки.
Стадия выдержки включает выдерживание раствора при подходящей температуре (например, от приблизительно 2°С до приблизительно 37°С) в течение подходящего периода времени (например, от приблизительно 1 часа до приблизительно 1 недели) для высвобождения нестабильно связанных линкеров от связывающего клетку агента, при этом стабильно связанные линкеры по существу не высвобождаются от связывающих клетку агентов. В одном варианте воплощения изобретения стадия выдержки включает выдерживание раствора при низкой температуре (например, от приблизительно 2°С до приблизительно 10°С или приблизительно 4°С), при комнатной температуре (например, от приблизительно 20°С до приблизительно 30°С или от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С) или при повышенной температуре (например, от приблизительно 30°С до приблизительно 37°С).
Длительность стадии выдержки зависит от температуры, при которой проводят стадию выдержки. Например, длительность стадии выдержки может быть по существу снижена проведением стадии выдержки при повышенной температуре, при этом максимальная температура ограничена стабильностью конъюгата связывающего клетку агент-цитотоксического агента. Стадия выдержки может включать выдерживание раствора в течение от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 дня (например, приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 5 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 7 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 9 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 22 ч или приблизительно 24 ч), от приблизительно 5 ч до приблизительно 1 недели, от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели (например, приблизительно 12 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней или приблизительно 7 дней), в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели (например, приблизительно 12 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней или приблизительно 7 дней), или приблизительно от 1 дня до приблизительно 1 недели.
В одном варианте воплощения изобретения стадия выдержки включает выдерживание раствора при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 8°С в течение периода по меньшей мере от приблизительно 12 ч до 1 дня.
Значение рН для стадии выдержки предпочтительно составляет от приблизительно 4 до приблизительно 10. В одном варианте воплощения изобретения значение рН для стадии выдержки составляет приблизительно 4 или более, но не менее 6 (например, от 4 до 5,9), или приблизительно 5 или более, но не менее 6 (например, от 5 до 5,9). В другом варианте воплощения изобретения значения рН для стадии выдержки варьируется от приблизительно 6 до приблизительно 10 (например, от приблизительно 6,5 до приблизительно 9, от приблизительно 6 до приблизительно 8). Например, значения рН для стадии выдержки могут составлять приблизительно 6, приблизительно 6,5, приблизительно 7, приблизительно 7,5, приблизительно 8, приблизительно 8,5, приблизительно 9, приблизительно 9,5 или приблизительно 10.
Стадия выдержки может проводиться до или после конъюгации связывающего клетку агента с цитотоксическим агентом. В одном варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят непосредственно после модификации связывающего клетку агента бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи. Например, способ по изобретению включает стадию выдержки после модификации связывающего клетку агента бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, и перед конъюгацией. После модификации связывающего клетку агента, стадия очистки может проводиться до стадии выдержки и/или после стадии выдержки, но перед стадией конъюгации. В другом варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят непосредственно после конъюгации цитотоксического агента со связывающим клетку агентом с присоединенными к нему линкерами и перед стадией очистки. В другом варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят после стадий конъю- 6 025786 гации и очистки и после дополнительной стадии очистки.
В специфических вариантах воплощения изобретения стадия выдержки может включать инкубацию смеси при 4°С и рН приблизительно 6-7,5 в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели, инкубацию смеси при 25°С и рН приблизительно 6-7,5 в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели, инкубацию смеси при 4°С и рН приблизительно 4,5-5,9 в течение от приблизительно 5 ч до приблизительно 5 дней, или инкубацию смеси при 25°С и рН приблизительно 4,5-5,9 в течение от приблизительно 5 ч до приблизительно 1 дня.
Изобретение описывает способ получения композиций стабильных конъюгатов, включающих связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, при этом композиции по существу не содержат нестабильных конъюгатов. В этом отношении изобретение описывает способ получения конъюгата связывающего клетку агент - цитотоксический агент по существу с высокой чистотой и стабильностью. Такие композиции могут использоваться для лечения заболеваний по причине высокой чистоты и стабильности конъюгатов. Композиции, включающие связывающий клетку агент, такой как антитело, химически соединены с цитотоксическим агентом, таким как майтансиноид, описаны, например, в патенте США Νο. 7374762. В одном аспекте изобретения конъюгат связывающий клетку агент цитотоксический агент, по существу, высокой чистоты обладает одной или несколькими следующим характеристиками: (а) более чем приблизительно 90% (например, более чем или равно приблизительно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%), предпочтительно более чем приблизительно 95% видов конъюгата являются мономерными, (б) уровень неконъюгированного линкера в композиции конъюгата составляет менее чем приблизительно 10% (например, менее чем или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%) (относительно общего содержания линкера), (в) менее чем 10% видов конъюгата связаны перекрестными связями (например, менее чем или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%), (г) уровень несвязанного цитотоксического агента в композиции конъюгата составляет менее чем приблизительно 2% (например, менее чем или равно приблизительно 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или 0%) (относительно общего содержания цитотоксического агента), и/или (д) отсутствие по существу повышения уровня несвязанного цитотоксического агента при хранении (например, спустя приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 3 месяца, приблизительно 4 месяца, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 1 год, приблизительно 2 года или приблизительно 5 лет). По существу повышение уровня несвязанного цитотоксического агента обозначает, что после определенного времени хранения повышение уровня несвязанного цитотоксического агента менее чем приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9%, приблизительно 1,0%, приблизительно 1,1%, приблизительно 1,2%, приблизительно 1,3%, приблизительно 1,4%, приблизительно 1,5%, приблизительно 1,6%, приблизительно 1,7%, приблизительно 1,8%, приблизительно 1,9%, приблизительно 2,0%, приблизительно 2,2%, приблизительно 2,5%, приблизительно 2,7%, приблизительно 3,0%, приблизительно 3,2%, приблизительно 3,5%, приблизительно 3,7% или приблизительно 4,0%.
В контексте данного изобретения термин неконъюгированный линкер обозначает связывающий клетку агент, который ковалентно присоединен к бифункциональному реагенту, образующему перекрестные связи, при этом связывающий клетку агент нековалентно присоединен к цитотоксическому агенту посредству линкера бифункционального реагента, образующего перекрестные связи (т.е. неконъюгированный линкер может быть представлен СВА-Ь, при этом СВА является связывающим клетку агентом, а Ь является бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи. В отличие от этого, конъюгат связывающий клетку агент -цитотоксический агент может быть представлен как СВА-Ь-Ό, где Ό является цитотоксическим агентом).
В одном варианте воплощения изобретения среднее молярное соотношение цитотоксического агента и связывающего клетку агента в конъюгате связывающий клетку агент - цитотоксический агент составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 2 до приблизительно 7, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 2,5 до приблизительно 4,5 (например, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5), от приблизительно 3,0 до приблизительно 4,0, от приблизительно 3,2 до приблизительно 4,2, от приблизительно 4,5 до 5,5 (например, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5).
Связывающий клетку агент может быть любым подходящим агентом, который связывается с клеткой, обычно и предпочтительно животной клеткой (например, клеткой человека). Связывающий клетку агент предпочтительно является пептидом или полипептидом или гликотопом. Подходящие связывающие клетки агенты включают, например, антитела (например, моноклональные антитела и их фрагмен- 7 025786 ты), интерфероны (например, α, бета, гамма), лимфокины (например. 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-6), гормоны (например, инсулин, ТРГ (тиреотропин-рилизинг гормон), МСГ (меланоцит-стимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены), факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как ΕΟΡ, ΤΟΡ-α, ФФР, УБОР, К-КСФ, МС8Р и ОМ-С8Р (Вигдезз, 1ттипо1оду Торбау 5:155-158 (1984), питательные транспортные молекулы (например, трансферрин), витамины (например, фолат) и любые другие агенты или молекулы, которые специфически связываются с молекулой-мишенью на поверхности клетки.
Если связывающий клетку агент является антителом, он связывается с антигеном, представленным полипептидом, и может быть трансмембранной молекулой (например, рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Типичные антигены включают молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратгормон; тироидстимулирующий гормон; липопротеины; α-1-антитрипсин; инсулина А-цепь; инсулина В-цепь; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор уте, фактор IX, тканевой фактор (ТР) и фактор фон-Виллебранда; факторы антикоагуляции, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легкого; активатор плазминогена, такой как урокиназа или мочевина человека или активатор плазминогена тканевого типа (ΐ-РА); бомбезин; тромбин; гематопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли -альфа и -бета; энкефалиназа; ΚΑΝΤΕδ (фактор регуляции активации здоровой экспрессии и секреции Т-клеток); воспалительный белок макрофагов человека (М1Р-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; релаксина А-цепь; релаксина Вцепь; прорелаксин; мышиный гонадотропин - связанный пептид; микробный белок, такой как беталактамаза; ДНКаза; 1дЕ; цитотоксический Т-лимфоцитарный связанный антиген (СТБА), такой как СТБА-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (УБОР); рецепторы к гормонам или факторам роста; белок А или Ό; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор, полученный из кости (ΒΌΝΡ), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (ΝΤ-3, ΝΤ4, ΝΤ-5 или ΝΤ-6) или ростовой фактор нервов, такой как ΝΟΡ-β; тромбоцитарный фактор роста (РБОР); фактор роста фибробластов, такой как аРОР и ЬРОР; эпидермальный фактор роста (ЕОР); трансформирующий фактор роста (ТФР), такой как ТФР-α и ТФР-бета, включая ТФР-фР ТФР-(12. ТФР-(13. ТФР-(/4 или ТФР-(/5; инсулиноподобный фактор роста-1 и -II (ЮР-Ι и ЮР-ΙΙ); дез(1-3)-1ОР-1 (мозговой 1ОР-1), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста, ЕрСАМ, ОБ3, ΗΓ-Τ.!, ΡδΜΑ, РδСΑ, МИС1, МИС16, δΤΕΑΡ, СЕА, ΤΕΝΒ2, ЕрЬА рецепторы, ЕрЬВ рецепторы, фолатный рецептор, РОБК1, мезотелин, крипто, ανβ6, интегрины, УЕОР, УЕОРК, ЕОРК, рецептор трансферрина, ΙΚΤΑ1, ΙΚΤΑ2, ΙΚΤΑ3, ΙΚΤΑ4, ΙΚΤΑ5; СБ белки, такие как СБ2, СБ3, СБ4, СБ5, СБ6, СБ8, СБ11, СБ14, СБ19, СБ20, СБ21, СБ22, СБ25, СБ26, СБ28, СБ30, СБ33, СБ36, СБ37, СБ38, СБ40, СБ44, СБ52, СБ55, СБ56, СБ59, СБ70, СБ79, СБ80, СБ81, СБ103, СБ105, СБ134, СБ137, СБ138, СБ152 или антитело, которое связывается с одним или несколькими опухолеассоциированными антигенами или рецепторами клеточных поверхностей, описанных в публикации заявки на патент США № 2008/0171040 или публикации заявки на патент США № 2008/0305044, которые включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины;
морфогенетический белок кости (ВМР); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как, ΜСδΡ, ΟΜ-СδΡ и Ο-СδΡ; интерлейкины (ΙΗ), например, от ΙΗ-1 до ΙΗ-10; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, фрагмент капсида ВИЧ; транспортные белки; хоминг-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как СБ11а, СБ11Ь, СБ11с, СБ18, ЮАМ, УБА-4 и УСАМ; опухолеассоциированный белок, такой как НЕК2, НЕК3 или НЕК4 рецептор; эндоглин, с-Мей ЮР1К, простат-антигены, такие как РСА3, ΡδΑ, ΡδΟΚ, ΝΟΕΡ, ΡδΜΑ, ΡδСΑ, ΤΜΕΡΡ2 и δΤΕΑΡ1; БОК5, В7Н4 и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
Кроме того, ΟΜ-СδΡ, который связывается с миелоидными клетками, может использоваться в качестве связывающего клетку агента относительно клеток, пораженных острым миелоидным лейкозом. Ш-2, который связывается с активированными Т-клетками, может использоваться для профилактики отторжения трансплантата, для лечения и предотвращения заболевания трансплантат против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. ΜδН, который связывается с меланоцитами, может использоваться для лечения меланомы, как и антитела к меланомам. Фолиевая кислота может использоваться для связывания фолатного рецептора, экспрессированного на опухолях яичников и других опухолях. Эпидермальный фактор роста может использоваться для связывания с клетками плоскоклеточных видов рака, таких как рак легких, головы и шеи. Соматостатин может использоваться при нейробластомах и опухолях других типов.
Рак грудной железы и яичек может с успехом пролечиваться эстрогеном (или аналогами эстрогена) или андрогеном (или аналогами андрогена), соответственно, в виде связывающих клетку агентов.
Термин антитело в контексте данного изобретения обозначает любой иммуноглобулин, любой
- 8 025786 фрагмент иммуноглобулина, такой как РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, й8Ру, 8Ρν, минитела, диатела, тритела, тетратела (Рагйаш, 1. 1ттипо1. 131: 2895-2902 (1983); 8ргт§ е1 а1. 1. 1ттипо1. 113: 470-478 (1974); Νίδοηοίί е1 а1. Лгсй. Вюсйет. Вюрйу8. 89: 230-244 (1960), Ктт е1 а1., Мо1, Сапсег Тйег., 7: 2486-2497 (2008), Сайег, Νη1иге Кеу8., 6: 343-357 (2006)), или химеры иммуноглобулинов, которые могут связываться с антигеном на поверхности клеток (например, которые содержат определяющий комплементарность участок (СОК)). В качестве связывающего клетку агента может использоваться любое подходящее антитело. Специалисту в данной области станет очевидно, что выбор соответствующего антитела будет зависеть от популяции клеток-мишеней. В этом отношении тип и количество молекул на поверхности клетки (т.е. антигенов), которые избирательно экспрессируются отдельной популяцией клеток (обычно и предпочтительно популяцией больных клеток), будут направлять выбор соответствующего антитела для использования в композиции по изобретению. Профили экспрессии клеточной поверхностью известны для целого ряда типов клеток, включая типы опухолевых клеток, или, если не известны, они могут быть определены посредством стандартных способов молекулярной биологии и гистохимии.
Антитело может быть поликлональным или моноклональным, однако предпочтительно оно является моноклональным антителом. В контексте данного изобретения поликлональные антитела обозначают гетерогенные популяции молекул антител, обычно содержащихся в сыворотке иммунизированных животных.
Моноклональное антитело обозначает гомогенные популяции молекул антител, специфических к отдельному антигену. Моноклональные антитела обычно вырабатываются отдельным клоном Влимфоцитов (В-клеток). Моноклональные антитела могут быть получены посредством целого ряда способов, известных специалисту в данной области, включая стандартный способ гибридомы (см., например, КбЫег апй МЙ81еш, Еиг. 1. 1ттипо1., 5: 511-519 (1976), Наг1оу апй Ьапе (ей8.), ЛпОЬоШез: А ЬаЬога1огу Мапиа1, С8Н Рге88 (1988), и С.А. 1апе\уау е1 а1. (ей8.), 1ттипоЬю1оду, 5‘ь Ей., Саг1апй РиЬНзЫпд, Уогк, ΝΥ (2001)). Краткое описание: способа гибридомы для получения моноклональных антител обычно включает инъецирование любому подходящему животному, обычно и предпочтительно мыши, антигена (т.е. иммуногена). Животное впоследствии умерщвляют, и В-клетки, выделенные из его селезенки, сливают с клетками миеломы человека. Получают гибридную клетку (т.е. гибридому), которая пролиферирует неограниченно долго и непрерывно секретирует высокие титры антитела с требуемой специфичностью ш уйго. Любой соответствующий способ, известный в науке, может использоваться для идентификации клеток гибридомы, вырабатывающих антитело с требуемой специфичностью. Такие способы включают, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), вестернблоттинг и радиоиммуноанализ. Популяцию клеток гибридомы подвергают скринингу для выделения отдельных клонов, каждый из которых секретирует отдельные виды антител к антигену. Принимая во внимание, что каждая гибридома является клоном, полученным при слиянии отдельной В-клетки, все молекулы антител, которые она вырабатывают, являются идентичными по структуре, включая их антигенсвязующий участок и изотип. Моноклональные антитела также могут быть получены посредством других подходящих способов, включая способ ЕВУ-гибридомы (см., например, На8кагй апй Агсйег, 1. 1ттипо1. Ме1йой8, 74(2): 361-67 (1984) и Койег е1 а1., Ме1йой8 Еп/уток, 121: 140-67 (1986)), системы экспрессии вектора бактериофага (см., например, Ни8е е1 а1., Баепсе, 246: 1275-81 (1989)) или библиотеки фаговых дисплеев, включающие фрагменты антител, такие как РаЬ и 8сРу (одноцепочечный вариабельный участок) (см., например, патенты США №№ 5885793 и 5969108, и публикации заявок на международные патенты \УО 92/01047 и \УО 99/06587).
Моноклональное антитело может быть выделено из или выработано в любом подходящем животном, но предпочтительно оно вырабатывается в млекопитающем, более предпочтительно, мыши или человеке, и более предпочтительно, человеке. Способы получения антитела у мышей известны специалисту в данной области и описаны в тексте данной заявки. Относительно антител человека, специалисту в данной области станет очевидно, что поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки субъектов-людей, вакцинированных или иммунизированных соответствующим антигеном. С другой стороны, антитела человека могут быть получены путем адаптации известных способов для получения антител человека у видов животных, за исключением человека (см., например, патенты США №№ 5545806, 5569825 и 5714352, и публикацию заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Будучи идеальным выбором для терапевтического применения у человека, антитела человека, в частности, моноклональные антитела человека, обычно более трудно получить, чем моноклональные антитела мыши. Мышиные моноклональные антитела, однако, индуцируют быстрый ответ хозяина на антитело при введении человеку, что может снизить терапевтический или диагностический потенциал конъюгата антитело-цитотоксического агента. Чтобы обойти такие осложнения, моноклональное антитело предпочтительно не распознается в качестве инородного иммунной системой человека.
Для этого для получения антитела может использоваться фаговая библиотека. В этом отношении, фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязующие вариабельные домены (V) антител, могут быть получены посредством стандартных способов молекулярной биологии и рекомбинации ДНК (см., например, 8атЬгоок е1 а1. (ей8.),Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 3гй Еййюп, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, №у Υο^к (2001)). Фаг, кодирующий вариабельный участок с требуемой специфичностью,
- 9 025786 выбирают на предмет специфического связывания с требуемым антигеном, и собирают полное антитело человека, включающее выбранный вариабельный домен. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих восстановленное антитело, вводят в подходящую линию клеток, такую как клетки миеломы, используемые для выработки антитела, такие как антитела человека, имеющие характеристики моноклональных антител, секретируемых клеткой (см., например, 1апе\уау е! а1., выш, Нике е! а1., выше, и патент США № 6265150). С другой стороны, моноклональные антитела могут быть получены у мышей, являющихся трансгенными относительно специфических генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека. Такие способы известны в науке и описаны, например, в патентах США №№ 5545806 и 5569825 и 1апе\уау е! а1., выше.
Более предпочтительно, антитело является гуманизированным антителом. В контексте данного изобретения гуманизированное антитело является антителом, в котором определяющие комплементарность участки (СОК) мышиного моноклонального антитела, образующие антигенсвязующие петли антитела, привиты на каркасном участке молекулы антитела человека. Благодаря сходству каркасных участков антител мыши и человека, в науке общепринято, что такой способ позволяет получить моноклональное антитело, являющееся антигенно-идентичным антителу человека, которое связывается с одним и тем же антигеном, что и моноклональное антитело, из которого получены последовательности СОК. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны в науке и подробно описаны, например, в 1апе\\ау е! а1., выше, патентах США №№ 5225539, 5585089 и 5693761, европейском патенте № 0239400 В1 и патенте Великобритании № 2188638. Гуманизированные антитела также могут быть получены посредством способа изменения поверхности антитела, описанного в патенте США № 5639641 и Ребегкеп е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ., 235: 959-973 (1994). В то время как антитело, участвующее в конъюгате композиции по изобретению, более предпочтительно является гуманизированным моноклональным антителом, моноклональное антитело человека и моноклональное антитело мыши, как это описано выше, также могут охватываться данным изобретением.
Фрагменты антитела, имеющие, по меньшей мере, один антигенсвязующий сайт, и, следовательно, распознающие и связывающие по меньшей мере один антиген или рецептор, присутствуют на поверхности клетки-мишени, и также включены в объем данного изобретения. В этом отношении протеолитическое расщепление интактной молекулы антитела может привести к образованию целого ряда фрагментов антитела, которые сохраняют способность распознавать и связывать антигены. Например, ограниченное расщепление молекулы антитела протеазой папаином обычно приводит к образованию трех фрагментов, два из которых являются идентичными и обозначаются как фрагменты РаЬ, поскольку они сохраняют антигенсвязующую активность молекулы исходного антитела. Расщепление молекулы антитела ферментом пепсин обычно приводит к образованию двух фрагментов антитела, один из которых сохраняет антигенсвязующие участки молекулы антитела и, следовательно, обозначается как фрагмент Р(аЬ')2. Восстановление фрагмента Р(аЬ')2 дитиотреитолом или меркаптоэтиламином приводит к образованию фрагмента, обозначаемого фрагментом РаЬ'. Одноцепочечный фрагмент вариабельного участка (κΡν) антитела, который состоит из разветвленного фрагмента РаЬ, включающего вариабельный домен антитела (V) тяжелой цепи, присоединенный к домену V легкой цепи антитела посредством синтетического пептида, может быть получен посредством стандартных способов рекомбинации ДНК (см., например, 1апе\уау е! а1., выше). Подобным образом, фрагменты вариабельных участков, стабилизированных дисульфидными связями (6κΡν), могут быть получены посредством способов рекомбинации ДНК (см., например, РеЬет е! а1., Рто!ет Епдшеегшд, 7:697-704 (1994)). Однако в контексте изобретения фрагменты антитела не ограничены данными типичными образцами фрагментов антител. Может использоваться любой подходящий фрагмент антитела, который распознает и связывает требуемый рецептор клеточной поверхности или антиген. Фрагменты антитела дополнительно описаны, например, в РагЬат, 1. 1ттипо1., 131: 2895-2902 (1983), 8рппд е! а1., 1. 1ттипо1., 113: 470-478 (1974), и ΝίκοηοίΐΓ е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук., 89: 230-244 (1960). Связывание антитело-антиген может оцениваться посредством любого подходящего способа, известного в науке, такого как, например, радиоиммуноанализ (РИА), ИФА, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и анализы конкурентного связывания (см., например, 1апе\уау е! а1., выше, и публикацию заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Кроме того, антитело может быть химерным или его антигенсвязующим фрагментом. Под химерным понимают антитело, которое включает по меньшей мере два иммуноглобулина или фрагмента, полученных или выработанных, по меньшей мере, двумя отдельными видами (например, два разных иммуноглобулина, таких как константный участок иммуноглобулина человека, скомбинированный с вариабельным участком иммуноглобулина мыши). Антитело также может быть доменным антителом (бАЬ) или его антигенсвязующим фрагментом, таким как, например, антитело верблюдовых (см., например, Иектукт е! а1., №!ите 3!тис!.Вю1., 3: 752, (1996)), или антителом акульих, таким как, например, новый рецептор антигена (Ι^ΝΑΡ) (см., например, СгеепЬегд е! а1., №!ите, 374: 168 (1995), и 31апйе1б е! а1., Зсбепсе, 305: 1770-1773 (2004)).
В контексте изобретения может использоваться любое подходящее антитело. Например, моноклональное антитело 15 является мышиным антителом 1дС2а, специфичным к общему антигену острого лимфобластного лейкоза (САИБА) (Ρί!ζ е! а1., №Циге. 283: 583-585 (1980)), и может использоваться для
- 10 025786 связывания клеток, экспрессирующих СЛЬЬЛ (например, клетки острого лимфобластного лейкоза). Моноклональное антитело ΜΥ9 является мышиным антителом 1дО1, которое специфически связывается с антигеном СП33 (ОпГПп е! а1., Ьеикеш1а Кек., 8: 521 (1984)), и может использоваться для связывания клеток, экспрессирующих СП33 (например, клетки острого миелогенного лейкоза (ОМЛ)).
Подобным образом, моноклональное антитело к В4 (также обозначается как В4) является мышиным антителом 1дО1, которое связывается с антигеном С.П19 на В-клетках (Ыай1ег е! а1., 1. 1ттипо1., 131: 244-250 (1983)), и может использоваться для связывания В-клеток, экспрессирующих С.П19 (например, клетки неходжкинской лимфомы и клетки хронического лимфобластного лейкоза). N901 является мышиным моноклональным антителом, которое связывается с антигеном СП56 (адгезионная молекула нейронных клеток), находящимся на клетках нейроэндокринного происхождения, включая мелкоклеточную опухоль легкого, и такое антитело может использоваться в конъюгате для доставки препаратов к клеткам нейроэндокринного происхождения. У антител 15, ΜΥ9 и В4 предпочтительно изменяют поверхность или перед использованием как части конъюгата их гуманизируют. Изменение поверхности или гуманизация антител описаны, например, в Кодикка е! а1., Ргос. ΝαΙΙ. Асай. δει . υδΑ, 91: 969-73 (1994).
Кроме того, моноклональное антитело С242 связывается с антигеном СапАд (см., например, патент США № 5552293) и может использоваться для доставки конъюгата к опухолям, экспрессирующим СапАд, таким как колоректальный рак, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого и рак желудка. НиС242 является гуманизированной формой моноклонального антитела С242 (см., например, патент США Νο. 5552293). Гибридома, из которой производят НиС242, находится в ЕСАСС под идентификационным номером 90012601. НиС242 может быть получено посредством способа прививания СИК (см., например, патенты США №№ 5585089, 5693761 и 5693762) или способа изменения поверхности (см., например, патент США №. 5639641). НиС242 может использоваться для доставки конъюгата к опухолевым клеткам, экспрессирующим антиген СапАд, таким как, например, клетки колоректального рака, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легкого и рака желудка.
Для связи с клетками рака яичников и рака предстательной железы в конъюгате может использоваться антитело к МиС1 в качестве связывающего клетку агента. Антитела к МиС1 включают, например, антитело к НМРС-2 (см., например, Тау1ог-Рарай1тйгюи е! а1., Ιη!. 1. Сапсег, 28: 17-21 (1981)), ЙСТМ01 (см., например, уап Но! е! а1. , Сапсег Кек., 56: 5179-5185 (1996)) и Όδ6. Клетки рака предстательной железы также могут быть связаны конъюгатом посредством антитела к простатспецифическому антигену (ΡδΜΑ) в качестве связывающего клетку агента, такого как 1591 (см., например, Ьш е! а1., Сапсег Кек., 57: 3629-3634 (1997)). Кроме того, раковые клетки, экспрессирующие антиген Нег2, такие как клетки рака молочной железы, предстательной железы и яичников, могут быть связаны конъюгатом посредством антител к НЕК2, например, трастузумаба, в качестве связывающего клетку агента. Клетки, которые экспрессируют рецептор эпидермального фактора роста (ЕОРК) и его варианты, такие как мутант с делецией по типу III, ЕОРКуШ, могут быть связаны конъюгатом посредством антител к ЕОРК. Антитела к ЕОРК описаны в публикациях международных патентов №№ ΡΕΤ/υδ11/058385 и ΡΕΤ/υδ11/058378. Антитела к ЕОРКуШ описаны в патентах США №№ 7736644 и 7628986, и публикациях заявок на патенты США 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 и 2009/0155282. Антитела к 1ОР-1К, связывающиеся с рецептором инсулиноподобного фактора роста, такие как антитела, описанные в патенте США № 7982024, также могут использоваться в конъюгате. Антитела, связывающиеся с СИ27Ь, СпрЮ. СИ138, СП38. ЕрйА2, интегринами, СП37. фолатом, СП20. ΡδΟΡ. NОЕΡ, ΡδСΑ, ТМЕРР2, δΤЕΑΡ1, эндоглином и Нег3, также могут использоваться в конъюгате.
В одном варианте воплощения изобретения антитело выбирают из группы, состоящей из 1η.ιΝ901, ЬиМу9-6, йиВ4, йиС242, антитела к НЕК2 (например, трастузумаб), биватузумаба, сибротузумаба, ритуксимаба, 1ηιΌδ6. антител к мезотелину, описанных в публикациях заявки на международный патент νθ 2010/124797 (такое как МР-Т), антител к крипто, описанных в публикации заявки на патент США 2010/0093980 (такое как 1иВ3Р6), антител к СИ138, описанных в публикации заявки на патент США 2007/0183971 (такое как йиВ-В4), антител к ЕОРК, описанных в заявках на международный патент № ΡΟ’Τ/υδ11/058385 и ΡΟ’Τ/υδ11/058378 (такое как ЕОРК-7), антител к ЕОРКуШ, описанных в патентах США №№ 7736644 и 7628986 и публикациях заявки на патент США 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 и 2009/0155282, гуманизированных антител Ер1А2, описанных в публикациях заявок на международный патент νθ 2011/039721 и νθ 2011/039724 (такое как 2Н11К35К74); антител к СИ38, описанных в публикации заявки на международный патент νθ 2008/047242 (такое как Ьи38δВ19), антител к фолату, описанных в публикации заявки на международный патент νθ 2 011/10 6528 и публикации заявки на патент США 2012/0009181 (например, ЬиМоу19); антител к 1ОР1К, описанных в патентах США №№ 5958872, 6596743 и 7982024; антител к СП37. описанных в публикации заявки на патент США 2011/0256153 (например, йиСО37-3); антител к интегрину ανβ6, описанных в публикации заявки на патент США 2006/0127407 (например, ΕΝΤΘ95); и антител к Нег3, описанных в публикации заявки на международный патент νθ 2012/019024.
В частности, предпочтительные антитела являются описанными в данном документе гуманизированными моноклональными антителами. Примеры включают, но не ограничиваются, 1η.ιΝ901, 1иМу9-6, йиВ4, 1иС242, гуманизированное моноклональное антитело к Нег2 (например, трастузумаб), биватузу- 11 025786 маб, сибротузумаб, ΟΝΤΘ95, ЬиЭ86 и ритуксимаб (см., например, патенты США №№ 5639641 и 5665357, временную заявку на патент США № 60/424332 (которая относится к патенту США № 7557189), публикацию заявки на международный патент (РСТ) № АО 02/16401, Ребегкеп с1 а1., выше, Кодикка е1 а1., выше, Ыи е1 а1., выше, №-1б1ег е1 а1., выше, Со1отег е1 а1., Сапсег 1пуек!., 19: 49-56 (2001), Не1бег е! а1., Еиг. 1. Сапсег, 31А: 2385-2391 (1995), Ае1! е! а1., 1. С1ш. Опсо1., 12: 1193-1203 (1994), и Ма1опеу е! а1., В1ооб, 90: 2188-2195 (1997)). В науке известны и другие гуманизированные моноклональные антитела, которые могут использоваться в связи с изобретением.
В одном варианте воплощения изобретения связывающий клетку агент является гуманизированным антифолатным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, который специфически связывается с рецептором фолата человека 1, при этом антитело включает: (а) СЭК1 тяжелой цепи, включающий ΟΥΕΜΝ; СЭК2 тяжелой цепи, включающий К1НРУВОПТР'тарХаа1рХаа2Хааз; и СЭК3 тяжелой цепи, включающий ΥΌΟ8ΡΑΜΌΥ; и (б) СЭК1 легкой цепи, включающий КА§р§У8РАСТ§ЕМН; СЭК2 легкой цепи, включающий ΚΑδΝΣΕΑ; и СЭК3 легкой цепи, включающий ΟΟδΚΕΥΡΥΤ; при этом Хаа; выбирают из К, Ц, Н и К; Хаа2 выбирают из Ц, Н, N и К; а Хаа3 выбирают из С, Е, Т, 8, А и V. Предпочтительно последовательность СЭК2 тяжелой цепи включает КIНРΥ^С^ΤЕΥN^КЕ^С.
В другом варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, который специфически связываются с рецептором фолата человека 1 и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью
0ν0Βν03ΚΑΕννΚΡΟΑ3\ΓΚΙ3ΟΚΑ3ΕΥΤΡΤΕΥΕΜΝίίνΚ03ΡΞ03ΕΕΜΙΞΚΙΗΡΥηΞηΤΓΥΝ0Κ ΕΌΟΚΑΤΕΤνηΚ££ΝΤΑΗΜΕΕΕ3ΕΤ3ΕΟΡΑνΥΥΟΤΕΥΟΰ5ΕΑΜΟΥΜΰαΰΤΤντν33Α3ΤΚΰΡ3ν ΓΡΕΑΡ33Κ3Τ333ΤΑΑΕΟ<3ΕνΚηΥΡΡΕΡνΤν5»Ν5ΞΑΕΤ3ΞνΗΤΕΡΑνΕι255ΞΕΥ5Ε55ννΤν РЗЗЗЬСТОТУРСЫУЫНКРЗЫТКУПККУЕРКЗСЭКТНТСРРСРАРЕЬЬССРгУЕЬЕРРКРКПТЬ ΜΙ3ΚΤΡΕνΤθνννθν3ΗΕΟΡΕνΚΡΝ№Υνθ(3νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝ3ΤΥΚνν3νΕΤνΕΗΟϋ&ίΕ Ν3ΚΕΥΚ0Κν3ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑΚΰ0ΡΕΕΡ0νΥΤΕΡΡ3ΕΟΕΕΤΚΝ0ν3ΕΤ0ΕνΚ3ΕΥΡ3Μ ΑνΕΜΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ3ηΕ3ГГЬУЗКЪТУОКЗКИООЗМУРЗСЗУМНЕАЪНЫНУТОКЗ
ЬЗЬЗРСК.
В другом варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, кодируемым плазмидной ДНК, включенной в АТСС 7 апреля 2010 г. под номерами АТСС №№ РТА-10772 и РТА-10773 или 10774.
В одном варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, включающим вариабельный домен тяжелой цепи, который, по меньшей мере, на 90, 95, 99 или 100% идентичен
0ν0Σν030ΑΕννΚΡ0Α3νΚΙ3σΚΑ30ΥΤΡΤ(5ΥΕΜΝΒνΚ03Ρ(3'23ΕΕΒΙβΕΙΗΡΥΟ(5ηΤΓΥΝ0Κ ГОеКАТЬТУЕКЗЗИТАНМЕЬЬЗЫЗЕСГАУУУСТНУССЗКАМЕУИбОСТТУТУЗЗ, и вариабельный домен легкой цепи, который, по меньшей мере, на 90%, 95%, 99% или 100% идентичен
Е1УЪТ08РЬ81ЛУ5ЪС0РА115СКА5£5У5ГАСТ5ШНИУН0КРС00РК1.Ъ1УВА5Ы1.ЕАСУР СРГ5С363КТОГТЬЫ13РУЕАЕСААТУУС0аЗРЕУРУТГСССТКЬЕ1КК; ИЛИ
ШУЪТОЗРЬЗГАУЗЪООРАИЗСКАЗ^ЗУЗГАСТЗЪМНМУНОКРСООРКЬЪТУРАЗМЪЕАетР ГАГЗСЗСЗКТОГТЬТ13РУЕАЕГААТУУС005ЕЕУРУТГСССТКЬЕ1КК.
В то время как связывающий клетку агент предпочтительно является антителом, связывающий клетку агент также может быть молекулой, не являющейся антителом. Такие подходящие молекулы, не являющиеся антителом, включают, например, интерфероны (например, альфа, бета или гамма интерферон), лимфокины (например, интерлейкин 2 (1Ь-2), 1Ь-3, 1Ь-4 или 1Ь-6), гормоны (например, инсулин), факторы роста (например, ЕСЕ, ТСЕ-α, ФФР или VΕСΡ), колониестимулирующие факторы (например, С-С8Е, МС8Е и СМ-С8Е (см., например, Вигдекк, 1ттипо1оду Тобау, 5: 155-158 (1984)), соматостатин и трансферрин (см., например, О'Кееке е! а1., 1. Вю1. СЬет., 260: 932-937 (1985)). Например, СМ-С8Е, который связывается с миелоидными клетками, может использоваться в качестве связывающего клетку агента для связывания клеток, пораженных острым миелоидным лейкозом. Кроме того, 1Ь-2, который связывается с активированными Т-клетками, может использоваться для профилактики отторжения трансплантата, для лечения и предотвращения заболевания трансплантат против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. Эпидермальный фактор роста (ЕСЕ) может использоваться для связывания с плоскоклеточными видами рака, такими как рак легких, рак головы и шеи. Соматостатин может использоваться для связывания клеток нейробластомы и клеток опухолей других типов. Конъюгат может включать любой подходящий цитотоксический агент. В контексте данного изобретения цитотоксический агент обозначает любое соединение, которое приводит к смерти клетку, индуцирует смерть клетки или снижает жизнеспособность клетки. Подходящие цитотоксические агенты включают, например, майтансиноиды и конъюгируемые ансамитоцины (см., например, РСТ/И811/059131 от 3 ноября 2011 г.), таксоиды, аналоги СС-1065 и СС-1065, а также доластатин и аналоги доластатина. В предпочтительном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент является майтансиноидом, включая майтансинол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды являются соединениями, ингибирующими образование
- 12 025786 микротрубочек и являющимися чрезвычайно токсичными для клеток млекопитающих. Примеры подходящих аналогов майтансинолов включают соединения, имеющие модифицированное ароматическое кольцо, и соединения, имеющие модификации в других положениях. Такие майтансиноиды описаны, например, в патентах США №№ 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4424219, 4371533, 4450254, 5475092, 5585499, 5846545 и 6333410.
Примеры аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом включают: (1) С19-дехлор (патент США № 4256746) (получен восстановлением ЬЛН ансамитоцина Р2), (2) С-20гидрокси (или С-20-деметил) +/-С-19-дехлор (патенты США №№4361650 и 4307016) (получены путем деметилирования посредством 81гер1ошуеез или Лейпошуеез или дехлоринацией посредством ЬЛН) и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОК), +/-дехлор (патент США Νο. 4294757) (получен путем ацилирования посредством ацилхлоридов).
Примеры аналогов майтансинола, имеющих модификации в положениях, отличных от ароматического кольца, включают: (1) С-9-8Н (патент США № 4424219) (получены путем реакции майтансинола с Η2δ или Ρ2δ5), (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОК) (патент США №. 4331598), (3) С-14гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (патент США № 4450254) (получен из Νοααΐ'Ла), (4) С-15-гидрокси/ацилокси (патент США № 4364866) (получен конверсией майтансинола 81гер1ошуеез), (5) С-15-метокси (патенты США №№. 4313946 и 4315929) (выделен из Тге^Ёа пибШога) , (6) С18-^деметил (патенты США №№. 4362663 и 4322348) (получен деметилированием майтансинола 81герЕошуеез) и (7) 4,5-дезокси (патент США № 4371533) (получен восстановлением трихлорида титана/ЬЛН майтансинола).
В предпочтительном варианте воплощения изобретения конъюгат в качестве цитотоксического агента использует тиолсодержащий майтансиноид ΏΜ1, также известный как ^-деацетил-^-(3меркапто-1-оксопропил)-майтансин. Структура ΟΜ1 представлена формулой (I)
В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения конъюгат в качестве цитотоксического агента использует тиолсодержащий майтансиноид ΏΜ4, также известный как ^-деацетил-^-(4метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин. Структура ΏΜ4 представлена формулой (II)
Другие майтансиноиды могут использоваться в контексте изобретения, включая, например, тиол- и дисульфид-содержащие майтансиноиды, несущие моно- или диалкильные замены на атоме углерода, несущем атом серы. В частности, предпочтительным является майтансиноид, имеющий в С-3 положении (а) С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 десметил функциональность, и (б) ацилированную аминокислотную боковую цепь с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, при этом атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональность, имеет одну или две замены, и указанные замены представлены СН3, С2Н5, линейным или разветвленным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и, кроме того, одна из замен может быть представлена Н, и при этом ацильная группа имеет длину линейной цепи, по меньшей мере, три атома углерода между карбонилом и атомом серы.
Дополнительные майтансиноиды для использования в контексте изобретения включают соединения, представленные формулой (III)
при этом
- 13 025786
Υ' является (СК7К8)1(СК9=СК1о)р(С^С)чА0(СК5К6)тПи(СК11=СК12)г(С^С)8В1(СКзК4)пСК1К2§2, при этом К1 и К2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фениломили гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом К2 также может быть Н, при этом А, В, Ό являются циклоалкилом или циклоалкенилом, имеющем 3-10 атомов углерода, простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом К3, К4, К5, К6, К7, К8, К9, К.10, К-11 и К.12 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом 1, т, п, о, р, ς, г, 8 и 1 каждый независимым образом является нулем или целым числом от 1 до 5, при условии, что, по меньшей мере, два 1, т, п, о, р, ς, г, 8 и 1 не являются нулем в любой момент времени, и при этом Ζ является Н, 8К или СОК, при этом К является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (III) включают соединения по формуле (III), при этом (а) К1 является Н, К2 является метилом и Ζ является Н, (б) К1 и К2 являются метилом и Ζ является Н, (в) К1 является Н, К2 является метилом и Ζ является -8СН3, и (г) К1 и К2 являются метилом и Ζ является -8СН3.
Такие дополнительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (ТУ-Ь), (ΤΥ-ϋ) или (ТУ-ЦЬ):
(ΐν-Ь) (ΐν-Ο) (ТУ-П.Т) при этом Υ является (СК7К8)1(СК5К6)т(СК3К4)ηСК1К28Ζ, при этом К1 и К2 каждый независимым образом являются СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом К2 также может являться Н, при этом К3, К4, К5, К6, К7 и К8 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом 1, т и п каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, п может быть нулем, при этом Ζ является Н, 8К или СОК, при этом К является линейным или разветвленным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом Мау является майтансиноидом, несущим боковую цепь в положении С-3, С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 десметил.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формулам ЦУ-Ь), (ΓΥ-Ό) и (ΊΥ-ϋ,Ε) включают соединения по формулам ΟΥ-Е), (ΊΥ-Ό) и (ΣΥ-ϋ,Ε), при этом (а) К1 является Н, К2 является метилом, К5, К6, К7 и К8 каждый является Н, 1 и т каждый является 1, п является 0, и Ζ является Н, (б) К1 и К2 являются метилом, К5, К6, К7, К8 каждый является Н, 1 и т являются 1, п является 0, и Ζ является Н, (в) К1 является Н, К2 является метилом, К5, К6, К7 и К8 каждый является Н, 1 и т каждый является 1, п является 0, и Ζ является -8СН3, или (г) К1 и К2 являются метилом, К5, К6, К7, К8 каждый является Н, 1 и т являются 1, п является 0, и Ζ является -8СН3.
Предпочтительно, цитотоксический агент представлен формулой 0Υ-Ε).
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (Υ):
при этом Υ является (СК7К8)1(СК5К6)т(СК3К4)ηСК1К28Ζ, при этом К1 и К2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом,
- 14 025786 замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом К2 также может являться Н, при этом К3, К4, К5, К6, К7 и К8 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом 1, т и η каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, η может быть нулем, и при этом Ζ является Н, 8К или СОК, при этом К является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (V) включают соединения по формуле (V), при этом (а) К1 является Н, К2 является метилом, К5, К6, К7 и К8 каждый является Н; 1 и т каждый является 1; η является 0; и Ζ является Н, (б) К1 и К2 являются метилом; К5, К6, К7, К8 каждый является Н, 1 и т являются 1; η является 0; и Ζ является Н, (в) К1 является Н, К2 является метилом, К5, К6, К7 и К8 каждый является Н, 1 и т каждый являются 1, η является 0, и Ζ является -8СН3, или (г) К1 и К2 являются метилом, К5, К6, К7, К8 каждый является Н, 1 и т являются 1, η является 0, и Ζ является -8СН3.
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (ΥΊ-1,). (VI-!)) или (νΐ-ΟΑ):
(νι-ь) (νι-ϋ) < νι-и, Ь), при этом Υ2 является (ΟΚ7Κ8)1(ΟΚ.5Κ6)^ΟΚ3Κ4)η£ΚιΚ28Ζ2, при этом К1 и К2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом К2 также может являться Н, при этом К3, К4, К5, К6, К7 и К8 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом 1, т и η каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, η может быть нулем, и при этом Ζ2 является 8К или СОК, при этом К является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом Мау является макроциклической кольцевой структурой майтансиноида.
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды включают соединения, представленные формулой (VII):
при этом Υ2' является (Ск7К8)1(СЯ9=СК1о)р(С=С)чА0(СЕ.5Е.б)1ПОи(СК11=СК.12)ХС=С)5В,(СК.3РС))пСК.1К.2822, при этом К1 и К2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным разветвленным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом К2 может быть Н, при этом А, В и Ό каждый независимым образом является циклоалкилом или циклоалкенилом, имеющем 3-10 атомов углерода, простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом К3, К4, К5, К6, К7, К8, К9, К10, К11 и К12 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом 1, т, η, о, р, ц, г, з и 1 каждый независимым образом является нулем или целым числом от 1 до 5, при условии, что по меньшей мере два 1, т, η, о, р, ц, г, з и 1 не являются нулем в любой момент времени, и при этом Ζ2
- 15 025786 является δΚ или -СОК, при этом К является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (VII) включают соединения по формуле (VII), при этом К1 является Н и К2 является метилом.
Кроме майтансиноидов, цитотоксический агент, используемый в конъюгате, может быть таксаном или его производным. Таксаны являются семейством соединений, которые включают паклитаксел (Таксол®), цитотоксический натуральный продукт, и доцетаксел (Таксотер®), полусинтетическое производное, оба из которых используют в лечении рака. Таксаны являются ингибиторами митотического веретена и ингибируют деполимеризацию тубулина, что приводит к смерти клетки. В то время как доцетаксел и паклитаксел используют в лечении рака, их противоопухолевая активность ограниченна по причине их неспецифической токсичности относительно здоровых клеток. Кроме того, соединения, подобные паклитакселю и доцетакселю, сами по себе не достаточно сильные для использования в конъюгатах связывающих клетку агентов.
Предпочтительный таксан для использования в получении цитотоксического конъюгата является таксаном по формуле (VIII):
Способы синтеза таксанов, которые могут использоваться в контексте изобретения, вместе со способами конъюгации таксанов со связывающими клетку агентами, такими как антитела, подробно описаны в патентах США №№ 5416064, 5475092, 6340701, 6372738, 6436931, 6596757, 6706708, 6716821 и 7390898.
Цитотоксический агент также может быть представлен СС-1065 или его производным. СС-1065 является сильным противоопухолевым антибиотиком, выделенным из культуральной жидкости 81гер!ошусез 7е1епз18. СС-1065 приблизительно в 1000 раз сильнее ίη νίίτο, чем обычно используемые противораковые препараты, такие как доксорубицин, метотрексат и винкристин (Бйиуап е! а1., Сапсег Кез., 42: 35323537 (1982)). СС-1065 и его аналоги описаны в патентах США №№ 5585499, 5846545, 6340701 и 6372738. Цитотоксическая активность СС-1065 коррелировала с его алкилирующей активностью, а также активностью в связывании ДНК и интеркаляции ДНК. Эти два свойства присущи двум отдельным частям молекулы. В этом отношении алкилирующая активность присуща единице циклопропапирролоиндолу (СИ), и активность связывания ДНК присуща двум единицам пирролоиндола СС-10 65.
В науке известно несколько аналогов СС-1065, которые также могут использоваться в качестве цитотоксического агента в конъюгате (см., например, ^агреЬозб е! а1., I. Мей. СЬет., 31: 590-603 (1988)). Была разработана целая серия аналогов СС-1065, в которых молекула СΡI замещена молекулой циклопропабензиндола (СШ) (Водег е! а1., I. Огд. СЬет., 55: 5823-5833 (1990), и Водег е! а1., Вюогд. Мей. СЬет. Ье!!., 1: 115-120 (1991)). Такие аналоги СС-1065 поддерживают высокую активность ίη νίίΐΌ исходного препарата без выявления замедленной токсичности у мышей. Подобно СС-1065, такие соединения являются алкилирующими агентами, которые ковалентно связываются с малой бороздкой ДНК для вызова смерти клетки.
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть по существу улучшена изменением распределения ίη у1уо посредством целенаправленной доставки к месту опухоли, что приводит к сниженной токсичности для других тканей и, следовательно, пониженной системной токсичности. Вследствие этого были получены конъюгаты аналогов и производных СС-1065 со связывающими клетку агентами, которые специфически направлены на опухолевые клетки (см., например, патенты США №№ 5475092, 5585499 и 5846545). Эти конъюгаты обычно обладают высокой мишень-специфической цитотоксичностью ίη νίίΐΌ и противоопухолевой активностью в моделях опухолевых ксенотрансплантатов у мышей (см., например, СЬап е! а1., Са^ег Кез., 55: 4079-4084 (1995)).
Способы синтеза аналогов СС-1065 описаны подробно в патентах США №№ 5475092, 5585499, 5846545, 6534660, 6586618, 6756397 и 7329760.
Такие препараты, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, калихеамицин, тубулизин и аналоги тубулизина, дуокармицин и аналоги дуокармицина, доластатин и аналоги доластатина также могут использоваться в качестве цитотоксических агентов по изобретению. Доксарубицин и соединения даунорубицина (см., например, патент США Ыо. 6630579) также могут использоваться в качестве цитотоксических агентов.
Конъюгаты связывающего клетку агента и цитотоксического агента могут быть получены способами ίη уйго. Для присоединения цитотоксического агента к антителу используют соединительную группу.
- 16 025786
Подходящие соединительные группы хорошо известны в науке и включают дисульфидные группы, кислотонеустойчивые группы, фотонеустойчивые группы, пептидазонеустойчивые группы и эстеразонеустойчивые группы, а также нерасщепляемые соединительные группы.
Согласно изобретению, связывающий клетку агент модифицируют реакцией бифункционального реагента, образующего перекрестные связи со связывающим клетку агентом, что приводит к ковалентному присоединению молекулы линкера к связывающему клетку агенту. В контексте данного изобретения термин бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи обозначает реагент, которые обладает двумя реакционными группами, одна из которых способна реагировать со связывающим клетку агентом, в то время как другая способна реагировать с цитотоксическим агентом для связи связывающего клетку агента с цитотоксическим агентом, образуя тем самым конъюгат.
Для использования в изобретении может использоваться любой подходящий бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, при условии, что реагент линкера обеспечивает сохранение терапевтических, например, цитотоксичности, и связующих характеристик цитотоксическому агенту и связывающему клетку агенту, соответственно, при сохранении приемлемого профиля токсичности. Предпочтительно, молекула линкера соединяет цитотоксический агент со связывающим клетку агентом посредством химических связей (как это описано выше), таким образом, цитотоксический агент и связывающий клетку агент являются химически соединенными (например, ковалентно соединенными) друг с другом.
В одном варианте воплощения изобретения бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает нерасщепляемые линкеры. Нерасщепляемый линкер является любой химической молекулой, которая способна связывать цитотоксический агент, такой как майтансиноид, таксан или аналог СС-1065, со связывающим клетку агентом стабильным, ковалентным способом. Таким образом, нерасщепляемые линкеры по существу устойчивы к кислотному расщеплению, расщеплению, индуцированному светом, расщеплению, индуцированному пептидазой, расщеплению, индуцированному эстеразой, и расщеплению дисульфидной связи в условиях, при которых цитотоксический агент или связывающий клетку агент остаются активными.
Подходящие реагенты, образующие перекрестные связи и нерасщепляемые линкеры между цитотоксическим агентом и связывающим клетку агентом, хорошо известны в науке. В одном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент присоединен к связывающему клетку агенту посредством тиоэфирной связи. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, имеющие молекулы на основе малеимида или галоацетила для реакции с цитотоксическим агентом. Такие бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи, хорошо известны в науке (см. публикации заявок на патенты США №№ 2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 2005/0169933 и Иегсе Вю1есЬпо1оду 1пс. Р.О. Вох 117, Коск1апД 1Ь 61105, И8А) и включают, но не ограничиваются, Ν-сукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (8МСС), Жсукцинимидил-4-(Жмалеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6амидокапроат), который является длинноцепочечным аналогом 8МСС (ЬС-8МСС), κ-малеимидоундеканоевой кислоты Ν-сукцинимидиловый эфир (КМИА), γ-малеимидомасляной кислоты Ν-сукцинимидиловый эфир (СМВ8), ε-малеимидокапроевой кислоты Ν-гидроксисукцинимидный эфир (ЕМС8), тмалеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидный эфир (МВ8), Ж(а-малеимидоацетокси)-сукцинимидный эфир (АМА8), сукцинимидил-6-(в-малеимидопропионамидо) гексаноат (8МРН), Ν-сукцинимидил 4-(рмалеимидофенил)-бутират (8МРВ) и Ж(р-малеимидофенил)изоцианат (РМР1). Реагенты, образующие перекрестные связи и включающие молекулу галоацетила, включают Жсукцинимидил-4-(йодоацетил)аминобензоат (81АВ), Ν-сукцинимидил йодоацетат (81А), Ν-сукцинимидил бромацетат (8ВА) и Νсукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (8ВАР), бис-малеидополиэтиленгликоль (ВМРЕО), ВМ(РЕО)2,ВМ(РЕО)3, Жф-малеимидопропилоксиХукцинимидный эфир (ВМР8), 5-малеимидовалериановой кислоты ΝΗ8, НВУ8, 4-(4-И-малеимидофенил)-масляной кислоты гидразид-НС1 (МРВН), сукцинимидил-(4-винилсульфонил)бензоат (8У8В), дитиобис-малеимидоэтан (ЭТМЕ), 1,4-бисмалеимидобутан (ВМВ), 1,4 бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (ВМОВ), бис-малеимидогексан (ВМН), бис-малеимидоэтан (ВМОЕ), сульфосукцинимидил 4-(Жмалеимидометил)циклогексан-1карбоксилат (сульфо-8МСС), сульфосукцинимидил(4-йодоацетил)аминобензоат (сульфо-81АВ), тмалеимидобензоил-И-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-МВ8), ЖЦ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-СМВ8), Жф-малеимидокапроилоксЩсульфосукцинимидный эфир (сульфо-ЕМС8), N-(κ-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-КМИ8) и сульфосукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (сульфо-8МРВ) СХ1-1, сульфо-Ма1 и РЕСп-Ма1. Предпочтительно бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, является 8МСС.
- 17 025786
В одном варианте воплощения изобретения соединяющий реагент является расщепляемым линкером. Примеры подходящих расщепляемых линкеров включают дисульфидные линкеры, кислотонеустойчивые линкеры, светонеустойчивые линкеры, пептидазонеустойчивые линкеры и эстеразонеустойчивые линкеры. Содержащие дисульфид линкеры являются линкерами, расщепляемыми посредством дисульфидного обмена, который может возникать при физиологических условиях. Кислотонеустойчивые линкеры являются линкерами, расщепляемыми при кислом рН. Например, определенные внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют кислый рН (рН 4-5) и обеспечивают условия, подходящие для расщепления кислотонеустойчивых линкеров. Светонеустойчивые клинкеры используют на поверхности тела и в большинстве полостей, доступных для света. Кроме того, инфракрасный свет может проникать через ткань. Пептидазонеустойчивые линкеры также могут использоваться для расщепления определенных пептидов внутри или снаружи клеток (см., например, Тгоие! с1 а1., Ργοο. Ν;·ι11. Асаб. δοϊ. υδΑ, 79: 626-629 (1982), и итетоЮ е1 а1., Ιηΐ. I. Сапсег, 43: 677-684 (1989)). В одном варианте воплощения изобретения расщепляемый линкер расщепляется при умеренных условиях, т.е. условиях в клетке, при которых активность цитотоксического агента сохранена.
В одном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент присоединен к связывающему клетку агенту посредством дисульфидной связи. Молекула линкера включает реакционную химическую группу, которая реагирует со связывающим клетку агентом. Предпочтительными реакционными химическими группами для реакции со связывающим клетку агентом, являются Ν-сукцинимидиловые эфиры и Ν-сульфосукцинимидиловые эфиры. Кроме того, линкерная молекула включает реакционную химическую группу, предпочтительно дитиопиридиловую группу, которая может реагировать с цитотоксическим агентом с образованием дисульфидной связи. Бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи и способные связывать связывающий клетку агент с цитотоксическим агентом посредством дисульфидных связей, известны науке и включают, например, Ν-сукцинимидил 3-(2пиридилдитио)пропионат (δΡΌΡ) (см., например, Саг188оп е1 а1., ВюсНет. I., 173: 723-737 (1978)), Νсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (δΡΌΒ) (см., например, патент США № 4563304), Νсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат (δΡΡ) (см., например, СΑδ регистрационный номер 34149808-6) и ^сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)2-сульфобутаноат (сульфо-δΡΌΒ) (см., например, публикацию заявки на патент США № 2009/0274713). Другие бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи, которые могут использоваться для введения дисульфидных групп, известны науке и описаны в патентах США №№ 6913748, 6716821 и публикациях заявок на патенты США 2009/0274713 и 2010/0129314, все из которых включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
В способе по изобретению также могут использоваться и другие реагенты, образующие перекрестные связи, при отсутствии атома серы, который образует нерасщепляемые линкеры. Такие линкеры могут быть получены из молекул на основе дикарбоновой кислоты. Подходящие молекулы на основе дикарбоновой кислоты включают, но не ограничиваются, α,ω-дикарбоновые кислоты по общей формуле (IX) ιιοοε-Χι-γ,,-ζ,χΌοιι (IX), при этом X является линейной или разветвленной алкильной, алкенильной или алкинильной группой, имеющей от 2 до 20 атомов углерода, Υ является циклоалкильной или циклоалкенильной группой, несущей от 3 до 10 атомов углерода, Ζ является замещенной или незамещенной ароматической группой, несущей от 6 до 10 атомов углерода, или замещенной или незамещенной гетероциклической группой, при этом гетероатом выбирают из Ν, О или δ, и при этом 1, т и η каждый является 0 или 1, при условии, что 1, т и η не являются нулем в одно и то же время.
Большое количество описанных в данном документе нерасщепляемых линкеров подробно описано в публикации заявки на патент США № 2005/0169933 А1.
Представленные ниже примеры дополнительно демонстрируют изобретение, но, конечно же, не должны никоим образом ограничивать объем изобретения.
- 18 025786
Пример 1.
Данный пример описывает способы производства конъюгатов связывающий клетку агентцитотоксический агент с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре.
Гуманизированное антитело СЭ37-3 (1ιιιί'Ό37-3) было подвергнуто реакции с гетеробифункциональным реагентом 8МСС (Шсукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат), образующим перекрестные связи, и майтансиноидом ΌΜ1 посредством описанного ранее способа, а также улучшенного способа, описанного в тексте данной заявки.
Для описанного ранее способа, в способе А (см., например, СЬап е! а1., патент США Νο. 5208020), 1ηιί'Ό37-3 (15 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с 8МСС (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в ΌΜΑ, диметилацетамиде) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 20°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 6,7), содержащем 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в 10% ΌΜΑ в течение 180 мин. Реакция была погашена 1 М ацетата для коррекции рН до 4,5, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом ΌΜ1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в ΌΜΑ) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20° С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% ΌΜΑ в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Для способа В (включающего стадию модификации при высоком рН и комнатной температуре), 1ηιί'Ό37-3 (15 мг/мл) вначале прореагировало с δΜСС (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в ΌΜΑ) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 20°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 7,5), содержащем 2 мМ ЭДТА в 10% ΌΜΑ в течение 50 мин. Реакция была погашена 1 М уксусной кислоты для коррекции рН до 4,5, а модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом ΌΜ1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в ΌΜΑ) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20°С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% ΌΜΑ в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Для способа по изобретению, в Способе С (включающего стадию модификации при высоком рН и низкой температуре), 1ηιί'Ό37-3 (15 мг/мл) вначале прореагировало с δΜСС (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в ΌΜΑ) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 10°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 7,5), содержащем 2 мМ ЭДТА в 10% ΌΜΑ в течение 50 мин. Реакция была погашена 1 М уксусной кислоты для коррекции рН до 4,5, а модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом ΌΜ1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в ΌΜΑ) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20° С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% ΌΜΑ в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой 8ерЬабех О-25Р с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Конъюгат, полученный тремя способами, был анализирован следующим образом: УФ спектроскопия для определения соотношения концентрации конъюгата и майтансиноида к антителу (ΜΑΚ); несвязанного майтансиноида двухколоночной хроматографией с обращенными фазами; масс-спектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера; восстановительного электрофореза δΌδ ΡΑΟΕ для определения уровня невосстанавливаемых видов; невосстанавливающего электрофореза δΌδ ΡΑΟΕ для определения уровня фрагментов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата.
Соотношение концентрации и майтансиноида к антителу было определено измерением поглощаемости конъюгата при проведении спектроскопии при УФ и видимом спектре при 252 и 280 нм и использовании коэффициентов молярной экстинкции ΌΜ1 и антитела при двух длинах волн для расчета молярных концентраций антитела и ΌΜ1.
Уровень неконъюгированного линкера для конъюгатов был проанализирован масс-спектрометрией: площади пиков отдельных видов конъюгатов (включая конъюгаты с или без неконъюгированных линке- 19 025786 ров) были измерены; уровень неконъюгированного линкера был рассчитан по соотношению суммы площадей, содержащих неконъюгированные линкеры (взвешено по количеству линкеров) к сумме площадей всех конъюгированных видов (также взвешены по количеству линкеров).
Уровень невосстанавливаемых видов конъюгатов был проанализирован восстановительным гельэлектрофорезом δΌδ: площади пиков отдельного восстановленного вида конъюгата (включая восстановленную легкую цепь, восстановленную тяжелую цепь, легкие цепи, сшитые поперечными связями, легкие и тяжелые цепи, сшитые поперечными связями и т.д.) были измерены; уровень невосстанавливаемых видов был рассчитан по соотношению сумм площадей невосстанавливаемых видов к сумме площадей всех видов.
Уровень мономеров конъюгатов был проанализирован эксклюзионной ВЭЖХ: площади пиков мономеров, димеров, агрегатов и низкомолекулярных видов были измерены посредством детектора поглощения, установленного на длину волны 252 нм или 280 нм; уровень мономеров был рассчитан по соотношению площади мономеров к общей площади.
Количество несвязанного майтансиноида, присутствующего в конъюгате, было проанализировано двухколоночной ВЭЖХ (колонки НРЗер и С18): площади пиков общих несвязанных видов майтансиноидов (элюированных в градиенте и идентифицированных сравнением времени элюирования с известными стандартами) были измерены посредством детектора поглощения, установленного на длину волны 2 52 нм; количество несвязанного майтансиноида было рассчитано посредством стандартной кривой, полученной по площади пиков известного количества стандартов.
Как это показано в табл. 1 ниже, конъюгат, полученный посредством способа по изобретению (способ С), превосходил конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа, способа А, относительно неконъюгированного линкера, невосстанавливаемых видов и мономера, а также способа В, включающего проведение стадии модификации при высоком рН и комнатной температуре.
Таблица 1. Сравнение основных свойств конъюгата, полученного посредством способа по изобретению, в сравнении с другими способами
Способ А Модификация при рН 6,7, 20°С Способ В Модификация при рН 7,5, 2 0°С Способ С Модификация при рН 7,5, Ю^С
Концентрация (мг/мл) 3, 2 3, 1 3,2
МА? 3, 7 3, 8 3, 6
Мономер (эксклюзионная ВЭЖХ) 95, 2% 94,8% 97,8%
Невосстанавливаемые виды (восстановленный Се1 СЫр) 11, 4- 10, 9% 4,4%
Неконъюгированный линкер (ΜϋΡ) 14% 16% 7%
Несвязанный майтансиноид 0, 5% 0, 4% 0,4%
Фрагментация (невосстановленный Се1 СЫр) 3, 6% 3, 0% 3, 6%
Результаты экспериментов, описанных в данном примере, показывают, что проведение стадии модификации при низкой температуре (например, 10°С), позволяет получить конъюгат, превосходящий конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа. Кроме того, результаты экспериментов, описанных в данном примере, показывают, что проведение стадии модификации при высоком рН (например, 7,5), позволяет получить конъюгат лучшего качества только в том случае, если стадию модификации проводят при низкой температуре (например, 10°С).
Пример 2.
Данный пример описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агентцитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре и повышенном рН.
Гуманизированное антитело реагировало с гетеробифункциональным реагентом §МСС, образующим перекрестные связи, и майтансиноидом ΌΜ1 с получением конъюгата с МАК (соотношение майтансиноида к антителу, также известно как соотношение препарата к антителу) приблизительно 3,5.
Реакцию проводили посредством описанного ранее способа (см., например, публикации заявок на патенты США 2011/0166319 и 2006/0182750), а также способа по изобретению, включающего проведение реакции модификации при повышенном рН и пониженной температуре.
Посредством описанного ранее способа, гуманизированное антитело (15 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с 8МСС (7,5-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 21°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 6,7), содержащем 2 мМ ЭДТА в 5% ΌΜΑ в течение 120 мин. Реакция была погашена 0,5М цитрата для корректирования рН до 5,0, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки §ерйабех С25Р. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) про- 20 025786 реагировало с майтансиноидом ΌΜ1 (5,4-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела; 1,3-кратный молярный избыток в сравнении с измеренным количеством линкера на антителе) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре в 20 мМ цитратного буфера (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% ΌΜΆ в течение приблизительно 17 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой ЗерБабех О25Р с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
В способе по изобретению гуманизированное антитело (3 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с 8МСС (6,0-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 0°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 8,2), содержащем 2 мМ ЭДТА в 5% ΌΜΆ в течение 117 минут. Реакция была погашена 0,5М цитрата для корректирования рН до 5,0, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки §ерБабех О25Р. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 2,5 мг/мл) прореагировало с майтансиноидом ΌΜ1 (5,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела; 1,3кратный молярный избыток в сравнении с измеренным количеством линкера на антителе) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре в 20 мМ цитратного буфера (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% ΌΜΆ в течение приблизительно 20 часов. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой ЗерБабех О25Р с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Конъюгат, полученный в ходе двух способов, был анализирован следующим образом: массспектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера;
восстановительным электрофорезом δΌδ РАСЕ для определения уровня невосстанавливаемых видов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата.
Как это показано ниже в табл. 2, конъюгат, полученный посредством способа по изобретению, превосходил конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа относительно неконъюгированного линкера и невосстанавливаемых видов.
Таблица 2. Сравнение основных свойств конъюгата, полученного посредством способа по изобретению, в сравнении с описанным ранее способом
Описанный ранее способ Модификация при рН 6,7, комнатная температура Способ по изобретению Модификация при рН 8,2, 0°С
МАЕ 3, 6 3,1
Мономер % (эксклюзионная ВЭЖХ) 96, 8¾ 97,5%
^восстанавливаемые виды (восстановленный 3е1 СЫр) 12,9% 6, 8Ϊ
Неконъюгированный линкер % (ΜϋΡ) 12,3% 7,6¾
Общее количество несвязанного майтансиноида % 0,2% 0, 1%
Результаты экспериментов, описанных в данном примере, указывают, что проведение стадии модификации при комнатной температуре (например, 0°С) и высоком рН (например, рН 8,2) позволяет получить конъюгат, превосходящий конъюгат, полученный посредством описанного раннего способа, при котором стадию модификации проводят при комнатной температуре и пониженном рН (например, рН 6,7).
Пример 3.
Данный пример демонстрирует широкомасштабный способ производства конъюгатов связывающего клетку агент-цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, включающий проведение реакции модификации при пониженной температуре и повышенном рН.
Гуманизированное антитело подвергают реакции с гетеробифункциональным реагентом §МСС, образующим перекрестные связи, с майтансиноидом ΌΜ1 для получения стабильного конъюгата гуманизированное антитело-ЗМСС-ЭМЕ
В частности, посредством описанного в данном документе способа по изобретению, гуманизированное антитело реагирует с 8МСС с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводят в течение 4 0 минут посредством молярного избытка 8МСС в сравнении с антителом, равном 5,7, при температуре приблизительно 10°С в буфере, имеющем рН приблизительно 7,8 в 50 мМ на- 21 025786 трия фосфата, 2 мМ ЭДТА с 7% (о/о) ОМА. После модификации, рН реакционной смеси корректируют до 4,5 посредством 1М уксусной кислоты, и модифицированное антитело очищают посредством ФТП. После очистки, модифицированное антитело реагирует с майтансиноидом ЭМ1 (приблизительно 1,2кратный молярный избыток в сравнении со связанным линкером) с образованием конъюгированного антитела. Реакция конъюгации проводится в течение 16 часов при комнатной температуре при рН приблизительно 5,0 в 20 мМ натрия ацетата, 2,0 мМ ЭДТА с 5,0% (о/о) ОМА. Затем реакционную смесь очищают посредством ФТП.
Анализ конъюгата может быть проведен следующим образом: масс-спектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера; восстановительным электрофорезом δΌδ РАОЕ для определения уровня невосстанавливаемых видов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата. Результаты анализа показывают, что конъюгат, полученный способом по изобретению, превосходит конъюгат, полученный посредством описанных ранее способов (см., например, публикации заявок на патенты США 2011/0166319 и 2006/0182750).
Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, процитированные в тексте данной заявки, включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была представлена отдельным и специальным образом с указанием путем ссылки и в полном своем объеме.
Использование единственного числа и подобных понятий, используемых в контексте данного изобретения (особенно в контексте представленной ниже формулы изобретения), включают единственное и множественное число, если четко не указано иное или если это четко не следует из контекста. Термины включать, иметь, включая и содержать обозначают неограничивающие термины (т.е. обозначают включая, но не ограничиваясь), если не указано иное. Указание диапазонов значений в тексте данной заявки служит только в качестве способа сокращения обозначения ссылки на каждое отдельное значение, включенное в диапазон, если не указано иное, и каждое отдельное значение включено в текст, как если бы оно было указано отдельно. Все описанные в данном документе способы могут проводиться в любом подходящем порядке, если не указано иное, или если иное четко не следует из контекста. Использование любого и всех примеров или типичных терминов (например, такой как) в тексте данной заявки предназначено только для демонстрации изобретения и не должно ограничивать объем изобретения, если не указано иное. Ни один термин в тексте заявки не должен рассматриваться как указывающий на любой незаявленный элемент, необходимый для практического использования изобретения.
В данном документе описаны предпочтительные варианты воплощения данного изобретения, включая наиболее известный способ осуществления изобретения, известный исследователям. Специалисту в данной области после прочтения представленного выше описания станут очевидными вариации предпочтительных вариантов воплощения изобретения. Исследователи ожидают, что специалисты в данной области будут использовать данные вариации соответствующим образом, кроме того, исследователи предполагают, что изобретение может быть использовано иным способом, чем это описано в данной заявке. В соответствии с этим, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты сущности изобретения, представленной в прилагаемой формуле изобретения в соответствии с действующим законодательством. Более того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариациях охватывается данным изобретением, если иное не будет указано отдельно или если это четко не следует из контекста.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> 1ттипоСеп, 1пс.
<120> СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГАТОВ С УЛУЧШЕННОЙ ГОМОГЕННОСТЬЮ
<130> 710090
<140> РСТ/и312/31253
<141> 2012-03-29
<150> из 61/468,981
<151> 2011-03-29
<160> 11
<170> РаГепПп уегзГоп 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> РЕТ
- 22 025786 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь СЬЕ1 <400> 1
С1у Туг РИе МеЕ Азп 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь СРЕ2
<220>
<221> М1ЗС _ЕЕАТЬЕЕ
<222> (14) ..(14)
<223> Хаа представляет собой
<220>
<221> М1ЗС _ЕЕАТЬЕЕ
<222> (16) ..(16)
<223> Хаа представляет собой
<220>
<221> М1ЗС _ЕЕАТиЕЕ
<222> (17) . . (17)
<223> Хаа представляет собой
<400> 2
Ьуз, С1п, НТз, или Агд
С1п, НТз, Азп, или Агд
С1у, Θ1υ, ТИг, Зег, А1а, или УаТ
Агд 11е НТз Рго Туг Азр С1у Азр ТИг РИе Туг Азп С1п Хаа РИе Хаа 1 5 10 15
Хаа <210> 3 <211> 9 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь СРЕЗ <400> 3
Туг Азр С1у Зег Агд А1а МеЕ Азр Туг 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность
- 23 025786 <220>
<223> Легкая цепь СЬЕ1 <400> 4
Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег РЬе А1а С1у ТЬг Зег Ьеи МеЕ Н1з 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь СЬЕ2 <400> 5
Агд А1а Зег Азп Ьеи С1и А1а
5 <210> 6 <211> 9 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь СРЕЗ <400> 6
С1п С1п Зег Агд С1и Туг Рго Туг ТЬг 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь СЬЕ2 <400> 7
Агд 11е Н1з Рго Туг Азр С1у Азр ТЬг РЬе Туг Азп С1п Ьуз РЬе С1п 1 5 10 15
С1у <210> 8 <211> 448 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь
- 24 025786 <400> 8
С1п 1 ναι С1п Ьеи Уа1 5 С1п Зег С1у А1а С1и 10 Уа1 Уа1 Ьуз Рго С1у 15 А1а
Зег ναι Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Тбг Рбе Тбг С1у Туг
20 25 30
Рбе Меб Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег Рго С1у С1п Зег Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у Агд 11е Н1з Рго Туг Азр С1у Азр Тбг Рбе Туг Азп С1п Ьуз Рбе
50 55 60
С1п С1у Ьуз А1а Тбг Ьеи Тбг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Азп Тбг А1а Н1з
65 70 75 80
Меб С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи Тбг Зег С1и Азр Рбе А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
Тбг Агд Туг Азр С1у Зег Агд А1а Меб Азр Туг Тгр С1у С1п С1у Тбг
100 105 110
Тбг Уа1 Тбг Уа1 Зег Зег А1а Зег Тбг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 Рбе Рго
115 120 125
Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег Тбг Зег С1у С1у Тбг А1а А1а Ьеи С1у
130 135 140
Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг Рбе Рго С1и Рго Уа1 Тбг Уа1 Зег Тгр Азп
145 150 155 160
Зег С1у А1а Ьеи Тбг Зег С1у Уа1 Н1з Тбг Рбе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п
165 170 175
Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 Тбг Уа1 Рго Зег Зег
180 185 190
Зег Ьеи С1у Тбг С1п Тбг Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Н1з Ьуз Рго Зег
195 200 205
Азп Тбг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз Тбг
210 215 220
Н1з Тбг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег
225 230 235 240
- 25 025786
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 245 Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 250 ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег 255 Агд
ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Н1з С1и Азр Рго
260 265 270
61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1
290 295 300
Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг
325 330 335
11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег
370 375 380
Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Н1з С1и А1а
420 425 430
Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
435 440 445 <210> 9 <211> 117 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь УагТаЫе ЬотаТп <400> 9
С1п ναΐ С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Уа1 Ьуз Рго С1у А1а
- 26 025786
1 5 10 15
Зег ναΐ Ьуз 11е Зег Ьуз А1а 20 Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 25 С1у Туг РЬе 30
Мек Азп Тгр 35 Уа1 Ьуз С1п Зег Рго С1у С1п Зег Ьеи С1и 40 45 Тгр 11е С1у
Агд 11е Н1з 50 Рго Туг Азр С1у 55 Азр ТЬг РЬе Туг Азп С1п 60 Ьуз РЬе С1п
С1у Ьуз А1а 65 ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 70 Азр Ьуз Зег Зег Азп ТЬг 75 А1а Н1з Мек 80
С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи ТЬг Зег 85 С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг 90 Туг Суз ТЬг 95
Агд Туг Азр С1у Зег Агд А1а Мек Азр Туг Тгр С1у С1п 100 105 Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 10 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220> <223> Легкая цепь УагТаЫе ЬотаТп <400> 10 С1у ТЬг ТЬг 110
Азр 11е Уа1 1 Ьеи ТЬг С1п Зег 5 Рго Ьеи Зег Ьеи А1а Уа1 10 Зег Ьеи С1у 15
С1п Рго А1а 11е 11е Зег Суз 20 Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 25 Зег РЬе А1а 30
С1у ТЬг Зег 35 Ьеи Мек Н1з Тгр Туг Н1з С1п Ьуз Рго С1у 40 45 С1п С1п Рго
Агд Ьеи Ьеи 50 11е Туг Агд А1а 55 Зег Азп Ьеи С1и А1а С1у 60 Уа1 Рго Азр
Агд РЬе Зег 65 С1у Зег С1у Зег 70 Ьуз ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи 75 Азп 11е Зег 80
Рго Уа1 С1и А1а С1и Азр А1а 85 А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п 90 С1п Зег Агд 95
- 27 025786
С1и Туг Рго Туг ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь Уаг1аЬ1е Ьоша1п <400> 11
Азр 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго Ьеи Зег 10 Ьеи А1а Уа1 Зег Ьеи 15 С1у
С1п Рго А1а 11е 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег РЬе А1а
20 25 30
С1у ТЬг Зег Ьеи МеЬ Н1з Тгр Туг Н1з С1п Ьуз Рго С1у С1п С1п Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд А1а Зег Азп Ьеи С1и А1а С1у Уа1 Рго Азр
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег Ьуз ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег
65 70 75 80
Рго Уа1 С1и А1а С1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Агд
85 90 95
С1и Туг Рго Туг ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд
100 105 110

Claims (21)

1. Способ получения связывающего клетку полипептида с присоединенным к нему линкером, включающий приведение связывающего клетку полипептида с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, содержащим группу Ν-сукцинимидилового эфира, группу Νсульфосукцинимидилового эфира, часть на основе малеимида или часть на основе галоацетила, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку полипептиду с получением тем самым смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами.
2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает конъюгирование цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами путем осуществления реакции связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе с рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 с получением смеси, включающей (ί) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, и подвергание указанной смеси, включающей (ί) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ίί) несвязанный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хрома- 28 025786 тографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для очистки связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов смеси с получением тем самым очищенной смеси связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
3. Способ по п.2, где способ дополнительно включает подвергание смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для приготовления очищенной смеси связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами до конъюгирования цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами в указанной очищенной смеси.
4. Способ по п.2 или 3, где цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из майтансиноидов, таксанов, СС1065 и аналогов перечисленных веществ.
5. Способ по п.4, где цитотоксический агент представляет собой майтансиноид.
6. Способ по п.5, где майтансиноид включает тиоловую группу.
7. Способ по п.6, где майтансиноид представляет собой ΌΜ1 или ΌΜ4.
8. Способ по любому из пп.1-7, где приведение в контакт на стадии (а) происходит в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9.
9. Способ по п.8, где рН составляет приблизительно 7,8.
10. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из цитратного буфера, ацетатного буфера, сукцинатного буфера и фосфатного буфера.
11. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из группы, состоящей из НЕРР8О (М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), РОР8О (пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрата), НЕРЕ8 (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин1-этансульфоновая кислота), НЕРР8 (ЕРР8) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), ТЕ8 (М-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинации.
12. Способ по любому из пп.1-11, где указанное приведение в контакт происходит при температуре от приблизительно -10°С до приблизительно 15°С.
13. Способ по п.12, где температура составляет приблизительно 10°С.
14. Способ по любому из пп.1-13, где связывающий клетку полипептид выбирают из группы, состоящей из антител, интерферонов, интерлейкина 2 (!Р-2). интерлейкина 3 (!Р-3). интерлейкина 4 (!Р-4). интерлейкина 6 (!к-6), инсулина, ЕСР, ТОР-α, РОЕ, С-С8Р, УЕСР, МС8Р, ОМ-С8Р и трансферрина.
15. Способ по п.14, где связывающий клетку полипептид представляет собой антитело.
16. Способ по п.15, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
17. Способ по п.16, где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
18. Способ по любому из пп.15-17, где антитело выбирают из группы, состоящей из 1πΝ901, ЬиМу9-6, йиВ4, йиС242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, СЫТО95, 1шО86, ритуксимаба, антитела к СП27Ь, антитела к Нег2, антитела к ЕОРК, антитела к ЕОРКуШ, Спр1о, антитела к СЭ138, антитела к СЭ38, антитела к Ер1А2, интегрин-связующего антитела, антитела к СЭ37, антитела к фолату, антитела к Нег3 и антитела к ЮИК.
19. Способ по п.1, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает часть на основе малеимида.
20. Способ по п.19, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, выбирают из группы, состоящей из Ν-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (8МСС), Νсукцинимидил-4-(М-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроата) (ЬС-8МСС), κ-малеимидоундеканоевой кислоты Ν-сукцинимидилового эфира (КМИА), γ-малеимидобутирата Ν-сукцинимидилового эфира (ОМВ8), β-малеимидопропилокси-сукцинимидилового эфира (ВМР8), ε-малеимидокапроновой кислоты Ν-гидроксисукцинимидного эфира (ЕМС8), т-малеимидобензоил-Н-гидроксисукцинимидного эфира (МВ8), N-(α-малеимидоацетокси)сукцинимидного эфира (АМА8), сукцинимидил-6-(в-малеимидопропионамидо)гексаноата (8МРН), Ν-сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутирата (8МРВ) и N-(р-малеимидофенил)изоцианата (РМРЦ, сульфо-Ма1, РЕО4-Ма1 и СХ1-1.
21. Способ по п.20, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, представляет собой N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (8МСС).
EA201391400A 2011-03-29 2012-03-29 Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью EA025786B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161468997P 2011-03-29 2011-03-29
US201161468981P 2011-03-29 2011-03-29
PCT/US2012/031253 WO2012135522A2 (en) 2011-03-29 2012-03-29 Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391400A1 EA201391400A1 (ru) 2014-02-28
EA025786B1 true EA025786B1 (ru) 2017-01-30

Family

ID=46966586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391400A EA025786B1 (ru) 2011-03-29 2012-03-29 Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20120259100A1 (ru)
EP (1) EP2691117A2 (ru)
JP (1) JP2014510757A (ru)
KR (1) KR20140019415A (ru)
CN (1) CN103619357A (ru)
AU (1) AU2012236403B2 (ru)
BR (1) BR112013025228A2 (ru)
CA (1) CA2831562A1 (ru)
EA (1) EA025786B1 (ru)
IL (1) IL228565A0 (ru)
MX (1) MX2013011201A (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1789391B1 (en) 2004-07-23 2017-06-28 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
EP2399609B1 (en) 2005-08-24 2015-03-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
CN101678124A (zh) 2007-03-14 2010-03-24 恩多塞特公司 结合配体连接的微管溶素递药缀合物
EP3569251A1 (en) 2007-06-25 2019-11-20 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
IL300840A (en) 2009-06-03 2023-04-01 Immunogen Inc coupling methods
CN103037900B (zh) 2010-02-24 2016-04-06 伊缪诺金公司 叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途
SI2691155T1 (sl) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen, Inc. Priprava majtanzinoidnih konjugatov protiteles v postopku z enim korakom
CA2831426C (en) * 2011-04-01 2023-02-21 Immunogen, Inc. Methods for increasing efficacy of folr1 cancer therapy
WO2013126797A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Purdue Research Foundation Cholecystokinin b receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
CN104755498B (zh) 2012-08-31 2019-06-18 伊缪诺金公司 用于检测叶酸受体1的诊断测定和试剂盒
MX359599B (es) 2012-10-04 2018-09-12 Immunogen Inc Uso de una membrana de pvdf para purificar conjugados de agentes de unión celular y agentes citotóxicos.
KR20150070318A (ko) 2012-10-16 2015-06-24 엔도사이트, 인코포레이티드 비천연 아미노산을 함유하는 약물 전달 컨쥬게이트 및 사용 방법
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MX366978B (es) 2013-03-15 2019-08-01 Novartis Ag Conjugados de anticuerpo - farmaco.
US9637547B2 (en) 2013-08-30 2017-05-02 Immunogen, Inc. Monoclonal antibodies for detection of folate receptor 1
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
CA2954934C (en) 2014-06-30 2023-09-26 Glykos Finland Oy Drug derivative and conjugates
KR20170040249A (ko) 2014-08-12 2017-04-12 노파르티스 아게 항-cdh6 항체 약물 접합체
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
EP3310813A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 Novartis AG Antibody drug conjugates
IL257531B2 (en) 2015-09-17 2023-04-01 Immunogen Inc Medicinal compositions containing anti-folr1 immunoconjugates
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
EP3431168A1 (en) * 2017-07-19 2019-01-23 Bayer Aktiengesellschaft Élimination de médicament non lié après couplage conjugué anticorps-médicament
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
EP3574915A1 (en) 2018-05-29 2019-12-04 Neovacs Immunogenic product comprising il-4 and/or il-13 for treating disorders associated with aberrant il-4 and/or il 13 expression or activity
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
KR20230125129A (ko) 2022-02-17 2023-08-29 주식회사 노벨티노빌리티 항체-약물 접합체
WO2025019790A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005037992A2 (en) * 2003-10-10 2005-04-28 Immunogen, Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US20050261232A1 (en) * 2004-04-13 2005-11-24 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
US20060193865A1 (en) * 2002-12-13 2006-08-31 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US20110064754A1 (en) * 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101531400B1 (ko) * 2003-06-27 2015-06-26 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
NO347360B1 (no) * 2003-10-10 2023-09-25 Immunogen Inc Cellebindingsmiddelmaytansinoid-konjugat med formel trastuzumab-SMCC-DM1 eller trastuzumab-SIABDM1, fremgangsmåte for fremstilling av disse og en in vitro fremgangsmåte for å styre maytansinoider til en valgt cellepopulasjon eller for å eliminere celler, samt anvendelse.
EP1853322B1 (en) * 2005-02-11 2014-06-25 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
EP2399609B1 (en) * 2005-08-24 2015-03-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060193865A1 (en) * 2002-12-13 2006-08-31 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
WO2005037992A2 (en) * 2003-10-10 2005-04-28 Immunogen, Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US20050261232A1 (en) * 2004-04-13 2005-11-24 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
US20110064754A1 (en) * 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
EA201391400A1 (ru) 2014-02-28
US20160101191A1 (en) 2016-04-14
AU2012236403A1 (en) 2013-10-31
JP2014510757A (ja) 2014-05-01
CA2831562A1 (en) 2012-10-04
IL228565A0 (en) 2013-12-31
BR112013025228A2 (pt) 2018-09-25
KR20140019415A (ko) 2014-02-14
EP2691117A2 (en) 2014-02-05
MX2013011201A (es) 2013-12-16
US20120259100A1 (en) 2012-10-11
CN103619357A (zh) 2014-03-05
AU2012236403B2 (en) 2016-08-04
NZ616516A (en) 2016-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025786B1 (ru) Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью
AU2020217301B2 (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
AU2006283726C1 (en) Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
RU2661083C2 (ru) Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
JP2009506032A5 (ru)
SG193997A1 (en) Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
JP2015504869A (ja) 複合体安定性を改善するためのｎ−ヒドロキシスクシンイミドの使用
NZ616509B2 (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
HK1120407B (en) Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
NZ712414B2 (en) Preparation of antibody maytansinoid conjugates
NZ616516B2 (en) Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU