[go: up one dir, main page]

EA009026B1 - Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях - Google Patents

Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях Download PDF

Info

Publication number
EA009026B1
EA009026B1 EA200501505A EA200501505A EA009026B1 EA 009026 B1 EA009026 B1 EA 009026B1 EA 200501505 A EA200501505 A EA 200501505A EA 200501505 A EA200501505 A EA 200501505A EA 009026 B1 EA009026 B1 EA 009026B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
polypeptide
cells
disease
Prior art date
Application number
EA200501505A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501505A1 (ru
Inventor
Вэньфэн Сюй
Уэйн Киндсвогель
Ясмин А. Чандрасекер
Стейси Р. Диллон
Джойс М. Ленер
Энтони У. Сиадак
Паллавур В. Сивакумар
Маргарет Д. Мур
Original Assignee
Займоджинетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33101289&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA009026(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Займоджинетикс, Инк. filed Critical Займоджинетикс, Инк.
Publication of EA200501505A1 publication Critical patent/EA200501505A1/ru
Publication of EA009026B1 publication Critical patent/EA009026B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к блокированию, ингибированию, снижению, подавлению или нейтрализации активности полипептидных молекул IL-22, IL-20 или IL-20 и IL-22. IL-20 и IL-22 являются цитокинами, которые участвуют в воспалительных процессах и в патогенезе заболевания человека. IL-22RA (zcytor11) является общим рецептором для IL-20 и IL-22. Настоящее изобретение относится к антителам против IL-22RA и к их партнерам по связыванию, а также к способам подавления IL-22 или IL-20 и IL-22 с использованием таких антител и партнеров по связыванию.

Description

Уровень техники
Цитокины представляют собой небольшие растворимые белки, которые опосредуют различные биологические эффекты, включая регуляцию роста и дифференциацию клеток многих типов (см., например, Ага1 е! а1., Аппи. Ксу. ВюсЬет. 59:783 (1990); Моктапп, Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 3:311 (1991); Раи1 & 8ебег, Се11 76:241 (1994)). Группу цитокинов составляют такие белки, как интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и другие регуляторные молекулы. Так, например, человеческий интерлейкин-17 представляет собой цитокин, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, внутриклеточной адгезивной молекулы 1, интерлекина-8, гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора и простагландина Е2 и участвует в преимущественном созревании гемопоэтических предшественников ί.Ό34+ в нейтрофилы (Уао е! а1., 1. 1ттипо1. 155:5483 (1995); Роккйе/ е! а1., 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).
Рецепторы, которые связываются с цитокинами, обычно состоят из одного или нескольких целых мембранных белков, которые связываются с цитокином с высокой аффинностью и передают сигнал события связывания с клеткой через цитоплазматические части некоторых рецепторных субъединиц. Цитокиновые рецепторы были разделены на несколько классов, исходя из сходства их внутриклеточных доменов, связывающихся с лигандом. Так, например, рецепторные цепи, ответственные за связывание и/или передачу интерферонового сигнала, являются членами семейства цитокиновых рецепторов класса II, на что указывает присутствие внутриклеточного домена 200, состоящего из 200 остатков.
Продемонстрированная т у1уо активность цитокинов и их рецепторов иллюстрирует клиническую эффективность и необходимость присутствия других цитокинов, рецепторов цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов. Так, например, продемонстрированная активность ш у1уо семейства провоспалительных цитокинов иллюстрирует высокую клиническую эффективность антагонистов провоспалительных молекул и необходимость их получения. Настоящее изобретение направлено на получение антагонистов провоспалительных цитокинов 1Б-20 и 1Б-22. Такими антагонистами настоящего изобретения, которые могут блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать активность 1Б-22 или 1Б-20, либо обоих 1Б-20 и 1Б-22, являются растворимые рецепторы 1Ь-22К.А и нейтрализующие антитела против 1Ь-22К.А. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию этих антагонистов для лечения воспалительного заболевания, а также к их композициям и способам получения.
Подробное описание изобретения
1. Обзор
По сравнению с другими изобретениями настоящее изобретение относится к новому применению растворимого рецептора, обозначаемого 2су!от11 или 1Г-22КА. и нейтрализующих антител против рецепторов цитокина 1Ь-22К.А. Настоящее изобретение также относится к фрагментам растворимого полипептида 1Б-22КА и к гибридным белкам, которые могут быть использованы для лечения человеческих воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Антитела против 1Б-22КА антитела и растворимые рецепторы 1Б-22К.А настоящего изобретения, включая нейтрализующие анти-1Е-22КА антитела, могут быть использованы для блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации активности 1Б-22 или 1Б-20, либо обоих 1Б-20 и 1Б-22, в целях лечения конкретных заболеваний человека, таких как псориаз, псориазный артрит, артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), колит и другие описанные здесь воспалительные состояния.
Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий 2су(ог11 (1Е-22ВА), представлена 8ΕΟ ΙΌ N0:1; а кодируемый полипептид представлен в 8ΕΟ ΙΌ N0:2. 1Б-22КА представляет собой субъединицу рецептора для 1Б-20 и 1Б-22. 2су1ог11 (1Г-22КА) описан в совместном патенте США № 5965704, в совместной публикации \У1Р0 \У0 02/12345, и в публикации \У1Р0 \У0 02/072607. Анализ человеческого кДНК-клона, кодирующего ΙΓ-22ΒΛ (8Ε0 ΙΌ N0:1), выявил открытую рамку считывания, кодирующую 574 аминокислоты (8Ε0 ΙΌ N0:2), и включающую внеклеточный лигандсвязывающий домен, состоящий примерно из 211 аминокислотных остатков (остатки 18-228 8Ε0 ΙΌ N0:2, 8Ε0 ΙΌ N0:3), трансмембранный домен, состоящий примерно из 23 аминокислотных остатков (остатки 229-251 8Ε0 ΙΌ N0:2), и внутриклеточный домен, состоящий примерно из 313 аминокислотных остатков (остатки 252-574 8Ε0 ΙΌ N0:2). Таким образом, молекулами настоящего изобретения являются полипептиды, включающие цитокинсвязывающий домен, содержащий аминокислотные остатки 18-228 8Ε0 ΙΌ N0:2, 8Ε0 ΙΌ N0:3. В одном из вариантов растворимого рецептора настоящего изобретения указанный растворимый ΙΕ-22Κ. присоединен к константной области тяжелой цепи (репрезентативный вариант представлен в 8Ε0 ΙΌ N0:4). Для каждого специалиста очевидно, что границы этих доменов являются приблизительными. Возможна также делеция остатков у концов этих доменов.
Как описано ниже, настоящее изобретение относится к отдельным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 90%, или более чем на 95%, например на 96, 97, 98%, или более чем на 99% или более идентична стандартной аминокислотной последовательности 18-228 8Ε0 ΙΌ N0:2, которая также представлена как 8Ε0 ΙΌ N0:3, где отдельный полипептид специфически связывается с антителом, которое, в свою очередь, специфически связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:3. Репрезентативными полипептидами являются полипептиды, содержащие либо
- 1 009026 аминокислотные остатки БЕЦ ΙΌ N0:2, либо аминокислотные остатки БЕЦ ΙΌ N0:3. Кроме того, настоящее изобретение также относится к отдельным полипептидами, описанным выше, которые связываются с 1Ь-22 (например, последовательность человеческого полипептида 1Ь-22 представлена в БЕЦ ΙΌ N0:6). Полинуклеотидная последовательность человеческого 1Ь-22 представлена в БЕЦ ΙΌ N0:5. Полинуклеотидная последовательность мышиного 1Ь-22 представлена в БЕЦ ΙΌ N0:10, а соответствующий полипептид представлен в БЕЦ ΙΌ N0:11. Настоящее изобретение также относится к отдельным описанным выше полипептидам, которые связываются с ΙΕ-20 (например, с последовательностью человеческого полипептида Ш-20, представленной в БЕЦ ΙΌ N0:8; публикация νΙΡ0 № \¥0 99/27103). Полинуклеотидная последовательность человеческого ΙΕ-20 представлена в БЕЦ ΙΌ N0:7.
Настоящее изобретение также относится к отдельным полипептидам и к эпитопам, содержащим по крайней мере 15 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3. Репрезентативными полипептидами являются полипептиды, которые либо содержат БЕЦ Ш N0:3, его антигенный эпитоп или функциональный фрагмент, связывающийся с ΙΕ-20 или ΙΕ-22, либо состоят из них. Кроме того, настоящее изобретение также относится к отдельным полипептидам, описанным выше, которые связываются с ΙΕ-22 или ΙΕ-20, либо блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность.
Настоящее изобретение также относится к вариантам полипептидов ΙΕ-22ΚΆ, где аминокислотная последовательность указанного варианта полипептида идентична аминокислотным остаткам последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3 по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 90%, или более чем на 95%, например на 96, 97, 98%, или более чем на 99% или более, и где любое различие между аминокислотной последовательностью варианта полипептида и соответствующей аминокислотной последовательностью БЕЦ ΙΌ N0:3 обусловлено одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами. Такие консервативные аминокислотные замены описаны ниже. Кроме того, настоящее изобретение также относится к отдельным полипептидам, описанным выше, которые связываются с ΙΕ-22 или ΙΕ-20, либо блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к антителам и к фрагментами антител, которые специфически связываются с указанными полипептидами. Примерами антител являются нейтрализующие антитела, поликлональные антитела, мышиные моноклональные антитела, гуманизованные антитела, происходящие от мышиных моноклональных антител, и человеческие моноклональные антитела. Иллюстративные фрагменты антител включают Е(аЬ')2, Е(аЬ)2, ЕаЬ', ЕаЬ, Εν, зсЕу и минимальные распознающие компоненты. Нейтрализующие антитела, предпочтительно, связываются с ΙΕ-22ΚΆ так, что это приводит к блокированию, ингибированию, снижению, подавлению или нейтрализации взаимодействия ΙΕ20 и ΙΕ-22 с ΙΕ-22ΚΆ, при этом, такие нейтрализующие антитела против ΙΕ-22ΚΆ, которые блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют связывание либо ΙΕ-20 или ΙΕ-22 с ΙΕ-22ΚΆ, также входят в объем настоящего изобретения. То есть нейтрализующие антитела против ΙΕ-22ΚΆ могут либо связываться с каждым из ΙΕ-20 или ΙΕ-22 по отдельности, либо блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать их действие, либо они могут связываться одновременно как с ΙΕ-20, так и ΙΕ-22, либо блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать их действие. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим носитель, пептид, полипептид или антитело, описанные в настоящем изобретении.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и по крайней мере один из таких экспрессирующих векторов, или рекомбинантный вирус, содержащий указанные экспрессирующие векторы. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и описанные здесь полипептид или антитело.
В настоящем изобретении также рассматриваются антиидиотипические антитела или фрагменты антиидиотипических антител, которые специфически связываются с антителом или с фрагментом антитела, которые, в свою очередь, специфически связываются с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ N0:3 или ее фрагмент. Репрезентативное антиидиотипическое антитело связывается с антителом, которое специфически связывается с полипептидом, состоящим из БЕЦ ΙΌ N0:3.
Настоящее изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим полипептид ΙΕ-22ΚΑ и иммуноглобулиновую часть. В таких гибридных белках иммуноглобулиновой частью может быть константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, такая как человеческий Ес-фрагмент. Настоящее изобретение также относится к отдельным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие гибридные белки.
Настоящее изобретение также относится к поликлональным и моноклональным антителам, которые связываются с полипептидами, содержащими внеклеточный домен ΙΕ-22Κ.Ά, такой как мономерный, гомодимерный, гетеродимерный и мультимерный рецепторы, включая растворимые рецепторы. Кроме того, такие антитела могут быть использованы для ингибирования связывания лигандов ΙΕ-22Κ.Ά, ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6) и Ш-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8), отдельно или вместе, с рецептором ΙΕ-22ΚΑ.
- 2 009026
Кроме того, сверхэкспрессия или позитивная регуляция 1Б-22 и 1Б-20 проиллюстрирована в образцах, взятых у человека из области поражения псориазом, и из области поражения кожным атопическим дерматитом, что дает основание предположить, что 1Б-22. подобно 1Б-20. играет определенную роль в патологическом процессе развития человеческого псориаза, атопического дерматита или других воспалительных заболеваний кожи и эпителиальных тканей. Кроме того, как описано ниже, сверхэкспрессия 1Б-20 или 1Б-22 у трансгенных мышей приводила к уплотнению эпидермальной ткани и вовлечению в патологический процесс иммунных клеток, что является признаком псориазного фенотипа, и кроме того, инъекция 1Б-22 нормальным мышам приводила к уплотнению эпидермальной ткани и вовлечению в патологический процесс иммунных клеток, что является признаком псориазного фенотипа, который был устранен под действием антагониста растворимого рецептора 1Ь-22КЛ2 (хсуЮг16: публикация \νΐΡΟ № \νϋ 01/40467). Эти ίη νίνο данные, кроме того, дают основание предположить, что провоспалительный 1Б-22 участвует в развитии псориаза, атопического дерматита или других воспалительных заболеваний кожи и эпителиальных тканей. Для терапевтического лечения воспалительных заболеваний могут быть использованы сами антагонисты активности 1Б-22 и 1Б-20. такие как растворимые рецепторы 1Ь-22КЛ и антитела против этих рецепторов, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против человеческого 1Б-22РА настоящего изобретения, а в частности, отдельные антагонисты к 1Б-22 и антагонисты к 1Б-20. и антагонисты как к 1Б-22. так и к 1Б-20. могут быть использованы для лечения псориаза. Кроме того, антагонисты активности 1Б-22. такие как растворимые рецепторы 1Ь-22КЛ и антитела против этих рецепторов, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против человеческого 1Ь-22КЛ настоящего изобретения, могут быть использованы для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, для связывания с 1Б-22 и с 1Б-20 (с одним из них, либо с тем и другим), а также для блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации их действия, для лечения атопического дерматита, ВЗК, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (РЗВ), септического шока, недостаточности многих органов, воспалительного заболевания легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита, и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения. Кроме того, различные работы, цитируемые ниже, во всей своей полноте приводятся в настоящее описание посредством ссылки.
2. Определения
Ниже приводится подробное описание различных терминов. Нижеследующие определения терминов приводятся для лучшего понимания настоящего изобретения.
Используемый здесь термин нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты означает полинуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотиды, фрагменты, генерируемые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагменты, генерируемые любым из таких способов, как лигирование, вырезание, обработка эндонуклеазой и обработка экзонуклеазой. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые представляют собой природные нуклеотиды (такие как ДНК и РНК), или аналоги природных нуклеотидов (например, α-энантиомерные формы природных нуклеотидов) или их комбинацию. Модифицированные нуклеотиды могут иметь альтерации в молекулах сахаров и/или в молекулах пиримидиновых или пуриновых оснований. Модификации в сахарах включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидогруппами, либо сахара могут быть функционализированы с образованием простых эфиров или сложных эфиров. Более того, вся сахарная группа может быть заменена стерически подобными и электронно-подобными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примерами модификаций оснований являются алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие основания с хорошо известными заменами гетероциклическими группами. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналогами фосфодиэфирных связей являются фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и т.п. Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает так называемые связанные с пептидом нуклеиновые кислоты, которые содержат природные или модифицированные основания нуклеиновых кислот, присоединенные к полиамидному основу. Нуклеиновые кислоты могут быть либо одноцепочечными, либо двухцепочечными.
Термин комплемент молекулы нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую, по сравнению со стандартной нуклеотидной последовательностью, комплементарную нуклеотидную последовательность и обратную ориентацию. Так, например, последовательность 5'АТОСАСООб 3' комплементарна 5'СССОТОСАТ 3'.
Термин вырожденная нуклеотидная последовательность означает последовательность нуклеотидов, которая, по сравнению со стандартной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включает один или несколько вырожденных кодонов. Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (то есть каждый из триплетов
- 3 009026
ОЛИ и ОАС кодирует Акр).
Термин структурный ген означает молекулу нуклеиновой кислоты, транскрибируемую в матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характерную для данного конкретного полипептида.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Так, например, молекула ДНК, кодирующая фактор роста, которая была отделена от геномной ДНК клетки, является изолированной молекулой ДНК. Другим примером изолированной (выделенной или отдельной) молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая была выделена из организма конкретного вида, имеет меньший размер, чем полноразмерная молекула ДНК хромосомы данного организма.
Термин конструкция молекулы нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, одноцепочечную или двухцепочечную, которая была модифицирована путем вмешательства человека, в результате чего она содержит объединенные и смежные сегменты нуклеиновой кислоты, расположенные в таком порядке, который не встречается в природе.
Термин линейная ДНК означает некольцевые молекулы ДНК, имеющие свободный 5'- и З'-концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмиды, путем ферментативного гидролиза или физического разделения.
Термин комплементарная ДНК (кДНК) означает одноцепочечную молекулу ДНК, которая образуется из мРНК-матрицы под действием фермента обратной транскриптазы. Обычно, праймер, комплементарный фрагментам мРНК, используется для инициации обратной транскрипции. Для каждого специалиста также очевидно, что термин кДНК означает двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из такой одноцепочечной молекулы ДНК и ее комплементарной ДНК-цепи. Термин кДНК также означает клон молекулы кДНК, синтезированный из РНК-матрицы.
Термин промотор означает нуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию структурного гена. Обычно, промотор локализован в 5'-некодируещей области гена, проксимальной к сайту инициации транскрипции структурного гена. Элементы последовательности внутри промоторов, которые функционируют как инициаторы транскрипции, часто характеризуются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Такими промоторными элементами являются сайты связывания с РНКполимеразой, последовательности ТАТА, последовательности СААТ, элементы, специфичные к дифференцировке (Ό8Ε; МсОеНее е! а1., Μοί. Епбоеппо1. 7:551 (1993)), элементы, индуцирующие ответный сигнал с образованием циклического АМР (СКЕ), элементы сывороточного ответа (8КЕ; Тгс1ктап. 8ет1пагк ίη Сапсег Βίοί. 1:47 (1990)), элементы, опосредующие глюкокортикоидный ответ (ОКЕ), и сайты связывания для других факторов транскрипции, таких как СКЕ/АТЕ (0'К.еШу е! а1., 1. Βίοί. СНет. 267:19938 (1992)), АР2 (Уе е! а1., 1. Βίοί. СНет. 269:25728 (1994)), 8Р1, белок, связывающейся с элементом, индуцирующий сАМР-ответ (СКЕВ; ^екеп, Оепе Ехрг. 3:253 (1993)) и октамерные факторы (в общих чертах, см. ка^п е! а1., ебк., Μοίесиίа^ Вюкду ο£ 1йе Оепе, 4(Н еб. (ТНе Вещатт/Ситттдк РиЬНкЫпд ^трапу, 1пс. 1987) и Бетащге & Кли^еаи, Вюсйет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор является индуцибельным промотором, то скорость транскрипции повышается в ответ на действие индуцирующего агента. В противоположность этому, скорость транскрипции не регулируется индуцирующим агентом в том случае, если данный промотор является конститутивным промотором. Известны также репрессируемые промоторы.
Коровый промотор содержит главные нуклеотидные последовательности, необходимые для функционирования промотора, включая ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции. В соответствии с этим, коровый промотор может обладать, а может и не обладать, детектируемой активностью в отсутствии специфических последовательностей, которые могут усиливать активность или сообщать ткани специфическую активность.
Термин регуляторный элемент представляет собой нуклеотидную последовательность, которая модулирует активность корового промотора. Так, например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с клеточными факторами, обеспечивающими транскрипцию исключительно или преимущественно в конкретных клетках, тканях или органеллах. Регуляторные элементы таких типов обычно ассоциируются с генами, которые экспрессируются по клеточно-специфическому, тканеспецифическому или органелло-специфическому механизму.
Энхансер представляет собой регуляторный элемент определенного типа, который может повышать эффективность транскрипции независимо от расстояния или ориентации данного энхансера по отношению к сайту инициации транскрипции.
Термин гетерологичная ДНК означает молекулу ДНК или популяцию молекул ДНК, которые обычно не присутствуют в данной клетке-хозяине. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к конкретной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, происходящую от клетки-хозяина определенного вида (то есть эндогенную ДНК), при условии, что ДНК хозяина присоединена к ДНК, не принадлежащей данному хозяину (то есть к экзогенной ДНК). Так, например, молекула ДНК, содержащая ДНК-сегмент, не принадлежащий данному хозяину и кодирующий полипептид, функционально присоединенный к
- 4 009026
ДНК-сегменту данного хозяина, содержащему транскрипционный промотор, рассматривается как гетерологичная молекула ДНК. И наоборот, гетерологичная молекула ДНК может содержать эндогенный ген, функционально присоединенный к экзогенному промотору. В качестве другого примера может служить молекула ДНК, содержащая ген, происходящий от клетки дикого типа, и такая молекула рассматривается как гетерологичная ДНК, если данная молекула ДНК вводится в мутантную клетку, в которой отсутствует ген дикого типа.
Полипептид представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, независимо от того, является ли он природным или синтетическим. Полипептиды, имеющие примерно менее чем 10 аминокислотных остатков, обычно называются пептидами.
Белок представляет собой макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть присоединены к белку клеткой, в которой этот белок продуцируется, и могут варьироваться в зависимости от типа клетки. В настоящем описании белки определяются по структуре их аминокислотного остова, при этом заместители, такие как углеводные группы, обычно не определяются, но тем не менее, они могут присутствовать.
Пептид или полипептид, кодируемый молекулой ДНК, не принадлежащей данному хозяину, представляет собой гетерологичный пептид или полипептид.
Термин клонирующий вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, космида или бактериофаг, которые способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине. Клонирующие векторы обычно содержат один или небольшое число сайтов распознавания рестриктирующей эндонуклеазой, которые позволяют осуществлять детектируемое встраивание молекулы нуклеиновой кислоты без потери основной биологической функции данного вектора, а также нуклеотидных последовательностей, кодирующих маркерный ген, подходящий для его использования в целях идентификации и отбора клеток, трансформированных клонирующим вектором. Маркерными генами обычно являются гены, которые сообщают резистентность к тетрациклину или резистентность к ампициллину.
Термин экспрессирующий вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Обычно экспрессирующий вектор содержит транскрипционный промотор, ген и терминатор транскрипции. Экспрессия гена обычно осуществляется под контролем промотора, и такой ген называют функционально присоединенным к этому промотору. Аналогичным образом, регуляторный элемент и коровый промотор считаются функционально присоединенными друг к другу в том случае, если регуляторный элемент модулирует активность корового промотора.
Термин рекомбинантный хозяин означает клетку, которая содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как клонирующий вектор или экспрессирующий вектор. В контексте настоящего изобретения, примером рекомбинантного хозяина является клетка, продуцирующая 1Ь-22КА. из экспрессирующего вектора. В противоположность этому, 1Ь-22КА. может продуцироваться клеткой, которая является природным источником 1Ь-22КА. и которая не содержит экспрессирующего вектора.
Интегрирующиеся трансформанты представляют собой рекомбинантные клетки-хозяева, в которых гетерологичная ДНК интегрирована в геномную ДНК клеток.
Гибридный белок представляет собой гибридный белок, экспрессируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности по крайней мере двух генов. Так, например, гибридный белок может содержать по крайней мере часть полипептида 1Ь-22КА, присоединенного к полипептиду, который связывается с аффинной матрицей. Такой гибридный белок служит средством для выделения больших количеств 1Ь-22КА. с использованием аффинной хроматографии.
Термин рецептор означает клеточно-ассоциированный белок, который связывается с биологически активной молекулой, называемой лигандом. Это взаимодействие опосредует воздействие лиганда на клетку. Рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреотропного гормона, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, рецептор тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡ), рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3, рецептор ОМ-С8Р, рецептор О-С8Р, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Мембраносвязанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в передаче сигнала. В некоторых мембраносвязанных рецепторах внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в отдельных полипептидах, которые содержат полноразмерный функциональный рецептор.
В общих чертах, связывание лиганда с рецептором вызывает конформационное изменение в рецепторе, которое приводит к взаимодействию между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке, что, в свою очередь, приводит к изменению метаболизма клетки. События метаболизма, которые часто бывают связаны со взаимодействиями рецептор-лиганд, включают транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продуцирования циклического АМР, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозита липидов и гидролиз фосфолипидов.
Растворимый рецептор представляет собой рецепторный полипептид, который не связан с кле
- 5 009026 точной мембраной. Растворимые рецепторы, главным образом, представляют собой связывающиеся с лигандом рецепторные полипептиды, которые не содержат трансмембранных и цитоплазматических доменов, и другое вещество, связывающееся с клеточной мембраной, такое как гликофосфоинозит (§ρί). Растворимые рецепторы могут содержать и другие аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, облегчающие очистку полипептида или вводящие сайты присоединения полипептидов к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют природные растворимые аналоги, продуцируемые посредством протеолиза или транслируемые из альтернативно сплайсированных мРНК. Растворимые рецепторы могут быть мономерными, гомодимерными, гетеродимерными или мультимерными, причем мультимерные рецепторы обычно содержат не более чем 9 субъединиц, предпочтительно не более чем 6 субъединиц, а наиболее предпочтительно не более чем 3 субъединиц. Считается, что рецепторные полипептиды, в основном, не содержат трансмембранных и внутриклеточных полипептидных сегментов, если у них отсутствует достаточная часть этих сегментов, которые обеспечивали бы мембранное заякоривание или передачу сигналов, соответственно. Растворимые рецепторы цитокинов класса I и класса II обычно содержат внеклеточный цитокинсвязывающий домен, не содержащий трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Так, например, репрезентативными растворимыми рецепторами являются растворимые рецепторы для СВЕ2-4 (также известный как 1Ь-10ВБ) (СеиЬаик, регистрационный номер Ζ17227), представленные в 8ЕО ГО N0:44 и 8Е0 ГО N0:45; растворимый рецептор для ГО-10КА (СеиЬаик, рег. номера И00672 и ΝΜ_001558), представленный в 8Е0 ГО N0:46; растворимый рецептор для ρΌΙΚ.81 (также известный как ГО-20ВВ) (СепЬапк, регистрационный номер ΑΥ358305), представленный в 8Е0 ГО N0:47, и растворимый рецептор для ГО-22КА. (патент США № 5965704), представленный в 8Е0 ГО N0:3. Каждый специалист может легко определить, какие последовательности из известных последовательностей цитокинов класса I или класса II включают внеклеточный цитокинсвязывающий домен, не содержащий трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Кроме того, с использованием генетического кода, каждый специалист может легко определить полинуклеотиды, кодирующие такие растворимые рецепторные полипептиды.
Термин секреторная сигнальная последовательность означает ДНК-последовательность, кодирующую пептид (секреторный пептид), который, будучи компонентом более крупного полипептида, направляет этот более крупный полипептид по секреторному пути внутри клетки, в которой он синтезируется. Во время транспорта по такому секреторному пути более крупный полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида.
Выделенный полипептид представляет собой полипептид, который, в основном, не содержит примесных клеточных компонентов, таких как углевод, липид или другие белковые примеси, ассоциированные в природе с данным полипептидов. Обычно, препарат выделенного полипептида содержит полипептид в высокоочищенной форме, т.е. полипептид, имеющий по крайней мере примерно 80% чистоту, по крайней мере примерно 90% чистоту, по крайней мере примерно 95% чистоту, более чем 95% чистоту, например 96, 97 или 98% чистоту или выше, либо более чем 99% чистоту. Одним из показателей того, что данный белковый препарат содержит отдельный полипептид, является появление одиночной полосы после проведения электрофореза данного белкового препарата в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) и окрашивания геля кумасси бриллиантовым голубым. Однако термин отдельный'' (или выделенный) не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизированные формы.
Используемые здесь термины амино-концевой и карбокси-концевой означают положения в полипептидах. Эти термины, если они встречаются в контексте настоящего описания, используются по отношению к конкретной последовательности или части полипептида для указания ближайшего или относительного положения. Так, например, определенная последовательность полипептида, расположенная у карбокси-конца по отношению к рассматриваемой последовательности, находится со стороны карбоксиконца рассматриваемой последовательности, но она необязательно должна находиться у карбокси-конца всего полипептида.
Термин экспрессия означает биосинтез генного продукта. Так, например, в случае структурного гена, экспрессия приводит к транскрипции этого структурного гена в мРНК и трансляции мРНК в один или несколько полипептидов.
Используемый здесь термин сплайсированный вариант означает альтернативные формы РНК, транскрибируемые из гена. Вариант сплайсинга обычно продуцируется посредством использования сайта альтернативного сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК, или реже, между отдельно транскрибируемыми молекулами РНК, и такой сплайсинг может приводить к образованию нескольких мРНК, транскрибируемых из того же самого гена. Сплайсированные варианты могут кодировать полипептиды, имеющие модифицированную аминокислотную последовательность. Используемый здесь термин сплайсированный вариант означает полипептид, кодируемый сплайсированным вариантом мРНК, транскрибируемой из гена.
Используемый здесь термин иммуномодулятор включает цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимулирующие молекулы, факторы гемопоэза и т. п., и синтетические аналоги этих молекул.
- 6 009026
Термин пара комплемент/антикомплемент означает неидентичные молекулы, которые образуют нековалентно связанную стабильную пару в соответствующих условиях. Так, например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другими примерами пар комплемент/антикомплемент являются пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смыслового/антисмыслового полинуклеотидов и т.п. Если желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, то предпочтительно, чтобы указанная пара комплемент/антикомплемент имела аффинность связывания менее чем 109 М-1.
Антиидиотипическое антитело представляет собой антитело, связывающееся с доменом вариабельной области иммуноглобулина. В контексте настоящего описания, антиидиотипическое антитело связывается с вариабельной областью анти-1Е-22ВА антитела, и таким образом, антиидиотипическое антитело имитирует эпитоп 1Ь-22ВА.
Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как Е(аЬ')2, Е(аЬ)2, ЕаЬ', ЕаЬ и т.п. Фрагмент антитела, независимо от его структуры, связывается с тем же самым антигеном, который распознается интактным антителом. Так, например, фрагмент моноклонального антитела против 1Ь-22ВА связывается с эпитопом 1Ь-22ВА.
Термин фрагмент антитела также включает синтетические или генетически сконструированные полипептиды, связывающиеся со специфическим антигеном, такие как полипептиды, состоящие из вариабельной области легкой цепи, Εν''-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны пептидным линкером (8сЕν-белки), и минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область.
Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, содержащий вариабельные домены и гипервариабельные области (области, определяющие комплементарность), происходящие от антитела грызуна, а остальная часть молекулы антитела происходит от антитела человека.
Гуманизованные антитела представляют собой рекомбинантные белки, в которых мышиные гипервариабельные области моноклонального антитела были перенесены из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельный домен человеческого антитела. Конструирование гуманизованных антител для их терапевтического применения для лечения человека, которые происходят от мышиных антител, таких как антитела, которые связываются с человеческим белком или нейтрализуют этот белок, может быть осуществлено любым специалистом.
Используемый здесь термин терапевтическое средство означает молекулу или атом, конъюгированные с молекулой антитела с получением конъюгата, который может быть использован для терапии. Примерами терапевтических средств являются лекарственные средства, токсины, иммуномодуляторы, хелатообразующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоактивные изотопы.
Детектируемая метка представляет собой молекулу или атом, которые могут быть конъюгированы с молекулой антитела с получением молекулы, которая может быть использована для диагностики. Примерами детектируемых меток являются хелатообразующие агенты, фотоактивные агенты, радиоактивные изотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы или другие маркерные молекулы.
Используемый здесь термин аффинная метка означает полипептидный сегмент, который может быть присоединен ко второму полипептиду для облегчения очистки или детекции второго полипептида или для введения сайтов связывания второго полипептида с субстратом. В принципе, в качестве аффинной метки может быть использован любой пептид или белок, для которого являются доступными антитело или другой специфически связывающийся агент является доступным. Аффинными метками являются агенты полигистидинового пути, белок А (ΝίΠδοη с1 а1., ЕМВО 1. 4:1075 (1985); Νίΐδδοη с1 а1., Ме111οάδ Еп7ушо1. 198:3 (1991)), глутатион-8-трансфераза (διηίΐΐι & ΙοΗηκοη, Пепе 67:31 (1988)), аффинная метка С1и-С1и (Сги^епшеуег е1 а1., Ргос. №Е1. Асаб. δει. И8А 82:7952 (1985)), вещество Р, пептид ЕЬАС (Ηορρ е1 а1., В^οΐесйηο1οду 6:1204 (1988)), пептид, связывающийся со стрептавидином, или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См. в общих чертах, работу Εοτά е1 а1., Рго1ет Ехртеккюп апб Рипйса1юп 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, являются коммерчески доступными (например, Рйатшаша Вю1еск РПсаХатау, N1).
Оголенное антитело, в отличие от фрагмента антитела, представляет собой целое антитело, не конъюгированное с терапевтическим средством. Оголенными антителами являются как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также некоторые рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизованные антитела.
Используемый здесь термин компонент антитела включает как целое антитело, так и его фрагмент.
Иммуноконъюгат представляет собой конъюгат компонента антитела с терапевтическим средством или с детектируемой меткой.
Используемый здесь термин гибридный белок антитела означает рекомбинантную молекулу, содержащую компонент антитела и полипептидный компонент 1Ь-22ВА. Примером гибридного белка антитела является белок, содержащий внеклеточный домен 1Ь-22ВА, и либо Ес-домен, либо антигенсвязы
- 7 009026 вающую область.
Полипептид-мишень или пептид-мишень представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит по крайней мере один эпитоп, и которая экспрессируется на клетке-мишени, такой как опухолевая клетка, или клетка, которая несет антиген инфекционного агента. Т-клетки распознают пептидные эпитопы, презентируемые молекулой главного комплекса гистосовместимости полипептиду-мишени или пептиду-мишени, и обычно, обеспечивают лизис клетки-мишень или рекрутинг других иммунных клеток в область клетки-мишени, что приводит к цитолизу клетки-мишени.
Антигенный пептид представляет собой пептид, который связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости и образует комплекс ГКГ-пептид, который распознается Т-клеткой, индуцируя тем самым цитотоксический лимфоцитарный ответ после его презентации Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с соответствующей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать цитотоксический Т-клеточный ответ, такой как лизис клетки или специфическое высвобождение цитокина, по отношению к клетке-мишени, которая связывается с антигеном или экспрессирует этот антиген. Антигенный пептид может связываться в присутствии молекулы главного комплекса гистосовместимости класса I или класса II, на антиген-презентирующей клетке или на клетке-мишени.
В эукариотах, РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена с продуцированием мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована так, что она будет содержать матрицу РНК-полимеразы II, в которой РНК-транскрипт имеет последовательность, комплементарную последовательности специфической мРНК. РНК-транскрипт называется антисмысловой РНК, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антисмысловую РНК, называется антисмысловым геном. Антисмысловые молекулы РНК способны связываться с молекулами мРНК, что приводит к ингибированию трансляции мРНК.
Антисмысловой олигонуклеотид, специфичный к [Е-22ЯА. или антисмысловой олигонуклеотид ГО^КА представляет собой олигонуклеотид, имеющий последовательность (а) способную образовывать стабильный триплекс с фрагментом гена Ш-22КА или (Ь) способную образовывать стабильный дуплекс с фрагментом мРНК-транскрипта гена [^-22КА.
Рибозим представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую каталитический центр. Этот термин включает РНК-ферменты, самосплайсирующиеся РНК, саморасщепляющиеся РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, которые осуществляют эти каталитические функции. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рибозим, называется геном рибозима.
Внешняя вспомогательная последовательность представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая направляет эндогенный рибозим, РНКазу Р, к внутриклеточной мРНК конкретного организма, что приводит к расщеплению мРНК под действием РНКазы Р. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует внешнюю вспомогательную последовательность, называется геном внешней вспомогательной последовательности.
Термин вариант гена [^-22КА означает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая представляет собой модификацию 8ЕО ГО N0:3. Такими вариантами являются природный полиморфизм генов ГО-22К.А, а также синтетические гены, кодирующие аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:3, содержащую консервативные аминокислотные замены. Другие варианты генов ГО-22КА представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие описанные здесь нуклеотидные последовательности с инсерциями или делециями. Вариант гена ГО-22КА может быть идентифицирован, например, путем установления гибридизации данного гена с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1, или с ее комплементом, в жестких условиях.
Альтернативно, вариант гена ГО-22КА может быть идентифицирован путем сравнения последовательностей. Считается, что две аминокислотных последовательности имеют 100% идентичность, если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при их сопоставлении на максимальное соответствие путем выравнивания. Аналогичным образом, две нуклеотидные последовательности имеют 100% идентичность, если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при их сопоставлении на максимальное соответствие путем выравнивания. Сравнение последовательностей может быть осуществлено с использованием стандартных компьютерных программ, таких как программы, входящие в пакет программ для обработки данных по биоинформатике, ЬА8ЕК.0Е№, которые были разработаны 0НА8ТАК (Майкоп, ХУкеопмп). Другие методы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем их оптимального выравнивания хорошо известны специалистам (см., например, Регикк! & Реги8к1, ТНе Шете! апй (Не №\ν Вю1оду: Тоок Гог Оепотк апй Мо1еси1аг КекеагсН (А8М Ргекк, Ье. 1997), \Уи е! а1. (ейк.), Шогтабоп 8ирегЫдйтау апй Сотри!ег ЭтаЬакек оГ ΝιιοΕίο Ас1йк апй Рго!еш8, Ме(Нойк ш Оепе Вю!есйпо1оду, радек 123-151 (СКС Ргекк, Ечс. 1997) и Вкйор (ей.), Ошйе (о Нитап Оепоте Сотри!тд, 2пй Еййюп (Асайетю Ргекк, Ечс. 1998)). Конкретные методы определения идентичности последовательностей описаны ниже.
Независимо от конкретно используемого метода идентификации варианта гена ГО-22КА или вари
- 8 009026 анта полипептида 1Б-22КА, вариант гена или полипептид, кодируемый вариантом гена, может быть функционально охарактеризован на способность специфически связываться с анти-1Б-22КА антителом. Вариант гена 1Б-22КА или вариант полипептида 1Б-22КА может быть также функционально охарактеризован на способность связываться с его лигандом 1Б-22 с использованием описанного здесь биологического или биохимического анализа.
Используемый здесь термин аллельный вариант означает любую из двух или более альтернативных форм гена, находящегося в том же самом локусе хромосомы. Аллельный вариант обычно продуцируется посредством мутации и может приводить к фенотипическому полиморфизму в данных популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (не вносить изменений в кодируемый полипептид), либо они могут кодировать полипептиды, имеющие модифицированную аминокислотную последовательность. Используемый здесь термин аллельный вариант также означает белок, кодируемый аллельным вариантом гена.
Термин ортолог означает полипептид или белок, полученный от одного вида, который является функциональным аналогом полипептида или белка, происходящего от другого вида. Различия в последовательностях ортологов являются результатом образования новых видов.
Паралоги представляют собой различные, но структурно родственные белки, продуцируемые организмом. Очевидно, что паралоги образуются в результате дупликации генов. Так, например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами по отношению друг к другу.
Настоящее изобретение включает функциональные фрагменты генов 1Б-22КА. В контексте настоящего изобретения, термин функциональный фрагмент гена 1Б-22КА означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида 1Б-22КА, и которая представляет собой описанный здесь домен или которая, по крайней мере, специфически связывается с анти-1Ь-22КА антителом.
Из-за неточности стандартных аналитических методов очевидно, что молекулярные массы и длины полимеров имеют приблизительные величины. Если такие величины выражены как примерно X или приблизительно X, то следует учесть, что эта величина X указана с точностью ±10%.
3. Продуцирование полинуклеотидов или генов 1Б-22КА
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческий ген 1Б-22КА, могут быть получены путем скрининга человеческой ДНК или геномной библиотеки с использованием полинуклеотидных зондов на основе 8ΕΟ ΙΌ N0:1. Эти методы являются стандартными и хорошо известными и могут быть осуществлены с использованием наборов для клонирования, закупаемых у поставщиков. См., например, АикиЬе1 е! а1. (ебк.), 8йой Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. 3гб Εάίίίοη, Ιοίιη ХУбеу & 8оик 1995; \Уи е! а1., Мебюбк ίη Оеие В1о1есйио1о§у, СЕС Ргекк, 1ис. 1997; Ау1у & Бебег, Ргос. Να1'1 Асаб. 8с1. И8А 69:1408 (1972); Ηιινηΐι е! а1., Соп51гис11П8 аиб 8сгссп1П8 с^NА Б1Ьгаг1ек ίη λ§!10 и λ§111, ΩΝΛ С1ошид: А Ргасбса1 Арргоасб Уо1. I, О1оуег (еб.), радек 49 (1КБ Ргекк, 1985); \Уи (1997), радек 47-52.
Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют человеческий ген 1Б-22КА, могут быть также получены посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, полученные на основе нуклеотидных последовательностей гена или кДНК 1Б-22КА. Общие методы скрининга библиотек с помощью ПЦР описаны например, в работе Уи е! а1., Ике о£ Не Ро1утегаке Сбаш Кеасбои !о 8сгсси РНаде БЛгапек, Ме!Нобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1к: Сштеи! Ме!Нобк аиб Аррбсабоик, ^ббе (еб.), Нитаиа Ргекк, 1ис., 1993. Кроме того, методы применения ПЦР для выделения родственных генов описаны, например, в работе Ргек1ои, Ике о£ Веденские 011доиис1еоббе Рптегк аиб !Не Ро1утегаке Сбаш Кеасбои !о С1оие Оеие Еатйу МетЬегк, МеИобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1к: Сштеи! Ме!Нобк аиб Аррбсабоик, \У1Ше (еб.), Нитаиа Ргекк, 1ис. 1993. В качестве альтернативы, ген 1Б-22КА может быть получен методом синтеза молекул нуклеиновой кислоты путем взаимного праймирования длинных олигонуклеотидов и описанных здесь нуклеотидных последовательностей (см., например, АикиЬе1 (1995)). Хорошо известные методы с применением полимеразной цепной реакции позволяют синтезировать молекулы ДНК, имеющие длину по крайней мере в две тысячи нуклеотидов (Абаид е! а1., Р1аи! Мо1ес. Вю1. 21:1131 (1993), ВатЬо! е! а1., РСК Ме!1обк аиб Аррбсабоик 2:266 (1993), ЭШои е! а1., Ике о£ !1е Ро1утегаке Сбаш Кеасбои £ог !Не Кар1б Соикбисбои о£ 8уи1бебс Оеиек, МеИобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго!осо1к: Сиггеи! МеИобк аиб Аррбсабоик, ^Ы!е (еб.), радек 263-268, (Нитаиа Ргекк, 1ис. 1993) аиб Но1о\уас1шк е! а1., РСК Ме!Нобк Арр1. 4:299 (1995)). Описание синтеза полинуклеотидов см., например, в работе Ойск & Рак!егиак, Мо1еси1аг В^οιесНпο1οду. Ргшс1р1ек аиб Аррбсабоик о£ КесотЬшаи! ^NА (А8М Ргекк 1994), 1!акига е! а1., Аиии. Кеу. Вюсбет. 53:323 (1984) и С11Ш1е е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8ск И8А 87:633 (1990).
4. Продуцирование вариантов гена 1Б-22КА
Настоящее изобретение относится к различным молекулам нуклеиновой кислоты, включая молекулы ДНК и РНК, которые кодируют описанные здесь полипептиды 1Б-22КА. Каждый специалист, исходя из вырожденности генетического кода, может легко установить, что эти полинуклеотидные последовательности могут значительно варьироваться. Кроме того, настоящее изобретение также относится к отдельным растворимым, мономерным, гомодимерным, гетеродимерным или мультимерным рецепторным полипептидам, содержащим по крайней мере одну субъединицу рецептора 1Б-22КА, которая является, в
- 9 009026 основном, гомологичной рецепторному полипептиду 8Ε^ II) N0:3. Таким образом, в настоящем изобретении рассматриваются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид ΙΕ-22ΚΆ и содержащие вырожденные нуклеотиды 8Ε^ II) N0:1 и их РНК-эквиваленты.
В табл. 1 представлены однобуквенные коды, принятые для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. В столбце разрешение представлены нуклеотиды, обозначенные буквенным кодом. В столбце комплемент указаны коды для комплементарного(ых) нуклеотида(ов). Так, например, код Υ означает либо С, либо Т, а его комплемент К означает А или О, где А комплементарен Т, а О комплементарен С.
Таблица 1
Нуклеотид Разрешение
А А
С С
С С
Т Т
К А|С
У С | т
М А|С
К С 1 т
3 С|С
и А|Т
н А | С | Т
в С | С | Т
V А | С | С3
ϋ А | С | Т
N А|С|С|Т
Комплемент Разрешение
Т Т
0 0
С С
А А
Υ С | т
В А|С
К С|Т
И А|С
3 С | С
И А|Т
ϋ А|С|Т
V А | С | С
В С | С | Т
н А| С | Т
N А | С | С | Т
Вырожденные кодоны, охватывающие все возможные кодоны для данной аминокислоты, представлены в табл. 2.
Таблица 2
Аминокислота Однобуквенный код Кодоны Вырожденный кодон
Суз С ТСС ТСТ ТСУ
Зег 3 АСС АСТ ТСА ТСС ТСС ТСТ Ν3Ν
ТНг Т АСА АСС АСС АСТ АСИ
Рго Р ССА ССС ССС ССТ ссы
А1а А ССА ССС ССС ССТ ССЫ
С1у 0 ССА ССС ССС ССТ ссы
Азп N ААС ААТ ΑΑΥ
Азр ϋ САС САТ САУ
С1и Е САА САС САВ
С1п 0 САА САС САВ
ΗΪ3 Н САС САТ САУ
Агд В АСА АСС ССА ССС ССС ССТ Μ0Ν
Ьуз К ААА ААС ААВ
Мер м АТС АТС
Не I АТА АТС АТТ АТН
Ьеи ь СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС ΥΤΝ
Уа1 V СТА СТС СТС СТТ ΟΤΝ
РНе г ТТС ттт ΤΤΥ
Туг Υ ТАС ТАТ ΤΑΥ
Тгр и ТСС ТСС
Тег • ТАА ТАС ТСА ТВВ
Азп|Азр в ΒΑΥ
С1и|С1п Ζ ЗАВ
Ап у X ΝΝΝ
Для каждого специалиста очевидно, что в определении вырожденного кодона вводится некоторая
- 10 009026 неопределенность, характерная для всех возможных кодонов, кодирующих аминокислоту. Так, например, вырожденный кодон для серина (У8Ы), в некоторых случаях, может кодировать аргинин (АСЕ), а вырожденный кодон для аргининина (ΜΌΝ), в некоторых случаях, может кодировать серин (АСУ). Аналогичная взаимосвязь имеется между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать варианты аминокислотных последовательностей, но каждый специалист может легко идентифицировать такие варианты последовательностей путем сравнения с аминокислотными последовательностями 8ЕО ΙΌ N0:3. Варианты последовательностей могут быть легко протестированы на их функциональность, как описано ниже.
Различные виды организмов могут иметь преимущественно используемый кодон. В общих чертах, см. Сгап(Нат е! а1., №с1. Асйк. Кек. 8:1893 (1980), Наак е! а1., Сигг. ΒίοΙ. 6:315 (1996), \ν;·ιίηНоЬкоп е! а1., Сепе 13:355 (1981), Сгок)еап & Нетк, Сепе 18:199 (1982), Но1т, Мс. Асйк. Кек. 14:3075 (1986), 1кетига 1. Μο1. Βίο1. 158:573 (1982), 8Нагр & Ма!акк1, Сигг. Орт. Сепе!. Эеу. 4:851 (1994), Капе, Сигг. Орт. Вю(есНпо1. 6:494 (1995) и Макпбек, М1сгоЬю1. Кеу. 60:512 (1996). Применяемый здесь термин преимущественно используемый кодон или предпочитаемые кодоны обычно употребляется по отношению к тем транслируемым в белок кодонам, которые наиболее часто используются в клетках определенного вида, т.е. в этих клетках, из всех возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту, преимущественно используются один или несколько репрезентативных кодонов (см. табл. 2). Так, например, аминокислота треонин (Т1п) может кодироваться кодонами АСА, АСС, АСС или АСТ, но в клетках млекопитающих наиболее часто используемым кодоном является АСС; а в организмах других видов, например, в клетках насекомых, в дрожжах, вирусах или в бактериях, могут оказаться предпочтительными другие кодоны, кодирующие ТНг. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды настоящего изобретения различными известными методами. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, повышать продуцирование белка путем обеспечения более эффективной трансляции белка в конкретных клетках или организмах. Поэтому, описанные здесь последовательности вырожденных кодонов служат в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных клетках и организмах, обычно используемых специалистами и описанных в настоящем изобретении. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть протестированы и оптимизированы на экспрессию в организмах различных видов и проанализированы на функциональность, как описано в настоящем изобретении.
кДНК, кодирующая 1Ь-22КА, может быть выделена различными методами, такими как зондирование полноразмерной или неполной человеческой кДНК одной или несколькими сериями вырожденных зондов, сконструированных на основе описанных последовательностей. кДНК может быть также клонирована с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, сконструированных из описанных здесь репрезентативных последовательностей человеческого 1Ь-22КА. Кроме того, кДНКбиблиотека может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, а экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована с помощью антитела против полипептида 1Ь22КА.
Каждому специалисту известно, что последовательность, описанная в 8ЕО ΙΌ N0:1, представляет собой одну аллель человеческого 1Ь-22КА, но, при этом, предполагается, что имеется аллельное разнообразие и может происходить альтернативный сплайсинг. Аллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы путем зондирования кДНК или геномных библиотек различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Аллельные варианты описанных здесь нуклеотидных последовательностей, включая последовательности, содержащие молчащие мутации, и последовательности, в которых такие мутации приводят к изменениям в аминокислотной последовательности, входят в объем настоящего изобретения, поскольку они представляют собой белки, которые являются аллельными вариантами описанных здесь аминокислотных последовательностей. Молекулы кДНК, генерируемые из альтернативно сплайсированных мРНК и сохраняющие свойства полипептида 1Ь-22КА, входят в объем настоящего изобретения, поскольку они представляют собой полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и варианты сплайсинга этих последовательностей могут быть клонированы путем зондирования кДНК или геномных библиотек различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам.
С применением обсуждаемых выше методов каждый специалист может получить различные полипептиды, которые содержат субъединицу растворимого рецептора 1Ь-22КА, которая является, в основном, гомологичной 8Е0 ΙΌ N0:1, или которая кодирует аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0:3 или их аллельные варианты, и которые сохраняют лигандсвязывающие свойства рецептора 1Ь-22КА дикого типа. Такие полипептиды могут также включать дополнительные полипептидные сегменты, описанные в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими описанные здесь нуклеотидные последовательности. Так, например, такие молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотид
- 11 009026 ную последовательность 8Еф ГО N0:1, или с молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотидную последовательность, комплементарную 8Е0 ГО N0:1, или с их фрагментами.
В общих чертах, жесткие условия выбирают так, чтобы температура для конкретной последовательности при определенной ионной силе и при определенном рН была примерно на 5°С ниже температуры плавления (Тт). Тт представляет собой температуру (при определенной ионной силе и при определенном рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с точно соответствующим зондом. После гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты могут быть промыты для удаления негибридизованных молекул нуклеиновой кислоты в жестких условиях или в условиях высокой жесткости. См., например, 8атЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А 1аЬога1оту тапиа1, 8есопб Εάίίίοη (Со1б 8ртшд НагЬот Рте88 1989); Аи8иЬе1 е! а1., (еб§.) Ситтеп! Рто!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (Зойп \УПеу & 8оп§, 1пс. 1987); Вегдег & К1тте1 (еб§.), Ошбе !о Мо1еси1аг С1ошпд Тес11пк|ие5 (Асабетю Рге55. 1пс. 1987) и \Уе1тиг. Сгй. Неу. Вюсйет. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Компьютерные программы для анализа последовательностей, такие как 0ЬЮ0 6,0 (Ь8й; Ьопд Ьаке, МЦ) и Рптег Ргет1ет 4,0 (Ртет1ег Вюкой 1п!етпа1юпа1; Ра1о А1!о, СА), а также сайты в Интернете, являются доступными средствами для анализа данной последовательности и вычисления Тт исходя из критериев, определяемых пользователем. Это позволяет специалистам адаптировать условия гибридизации и промывки для их использования с конкретным полинуклеотидным гибридом.
Настоящее изобретение также относится к выделенным полипептидам ГО-22КА, которые имеют, в основном, аналогичную последовательность, идентичную полипептидам 8Е0 ГО N0:3 или их ортологам. Используемый здесь термин идентичность, в основном, аналогичных последовательностей относится к полипептидам, имеющим последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95%, например на 96, 97, 98%, или более чем на 95% идентична последовательностям, представленным в 8Е0 ГО N0:3 или их ортологам. Так, например, варианты и ортологи рецепторов ГО-22КА могут быть использованы для генерирования иммунного ответа и продуцирования перекрестно реагирующих антител против человеческого ГО-22КА. Такие антитела могут быть гуманизованы и модифицированы как описано ниже, и могут быть использованы для терапевтического лечения псориаза, псориазного артрита, ВЗК, колита, эндотоксемии, а также в других описанных здесь терапевтических целях.
В настоящем изобретении также рассматриваются варианты молекул нуклеиновой кислоты 1Ь22НА, которые могут быть идентифицированы с использованием двух критериев путем определения сходства между кодируемым полипептидом и аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:3 и путем гибридизационного анализа. Такими вариантами ГО-22КА являются молекулы нуклеиновой кислоты, которые (1) гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1 (или с ее комплементом) в жестких условиях промывки, где жесткую промывку осуществляют при следующих условиях: 0,5х-2х88С с 0,1% ДСН при 55-65°С, и (2) кодируют полипептид, имеющий последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, например на 96, 97, 98 или 99%, идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3. Альтернативно, варианты ГО-22КА могут быть охарактеризованы как молекулы нуклеиновой кислоты, которые (1) гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1 (или с ее комплементом) в условиях очень жесткой промывки, где жесткую промывку осуществляют при следующих условиях: 0,1х-0,2х88С с 0,1% ДСН при 50-65°С, и (2) кодируют полипептид, имеющий последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, например на 96, 97, 98 или 99% или более, идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3.
Процентную идентичность последовательностей определяют стандартными методами. См., например, А118сйи1 е! а1., Ви11. Ма!й. Вю. 48:603 (1986) и Непкой & Неткой, Ргос. №1'1. Асаб. 8ск И8А, 89:10915 (1992). Вкратце, две аминокислотных последовательности выравнивают для оптимизации оценок выравнивания с использованием штрафа за пробел-пропуск=10, штрафа за пробел-удлинение=1 и оценочных матриц ВЬ08иМ62 НешкоГГ & НешкоГГ (см. ниже), представленных в табл. 3 (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами). Затем процент идентичности вычисляют по формуле: ([Общее число идентичных соответствий]/[длина более длинной последовательности+число пробелов, вводимых в более длинную последовательность для выравнивания двух последовательностей]х100).
- 12 009026
Таблица 3
А К N О С Ω Е О Н т ь К М Р Р 3 Т М Υ V
А 4
Н -1 5
N -2 0 б
ϋ -2 -2 1 6
С 0 -3 -3 -3 9
Ω -1 1 0 0 -3 5
Е -1 0 0 2 -4 2 5
е о -2 0 -1 -3 -2 -2 б
н -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
ь -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
к -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
м -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
г -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
Р -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
3 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 —2 -1 4
т 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
м -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Υ -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 —2 -2 0 -3 -1 4
Каждому специалисту известно, что для выравнивания двух аминокислотных последовательностей разработано множество алгоритмов. Алгоритм ЕА8ТА Реагзоп и Ыршап, разработанный для поиска сходства последовательностей, представляет собой подходящий метод выравнивания белков для оценки уровней идентичности описанной здесь аминокислотной последовательности и аминокислотной последовательности предполагаемого варианта 1Ь-22КА. Алгоритм ЕА8ТА описан Реагзоп и Ыршап, Ргос. Ыа1'1. Асаб. 8ст И8А, 85:2444 (1988) и Реагзоп, Ме111. Еп/ушо!. 183:63 (1990). Вкратце, алгоритм ЕА8ТА предусматривает сначала оценку сходства последовательностей путем идентификации совпадающих областей запрашиваемой последовательности (например, ВЕС) ΙΌ N0:2 или ВЕР ΙΌ N0:3) и тестируемой последовательности, которые имеют самую высокую плотность идентичности (если параметр кЩр=1) или пары идентичностей (если к!ир=2), без учета консервативных аминокислотных замен, инсерций или делеций. Затем десять областей с самой высокой плотностью идентичности снова оценивают путем сравнения сходства всех пар аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, и концы этих областей подравнивают так, чтобы эти области включали только те остатки, которые обеспечивают самую высокую оценку. Если имеется несколько областей с оценками, превышающими величину отсечки (вычисленную по формуле, предварительно выведенной исходя из длины последовательности и величины к!ир), то оценивают усеченные исходные области для того, чтобы определить, можно ли эти области объединить так, чтобы достичь приблизительного выравнивания с пробелами. И наконец, области двух аминокислотных последовательностей с наивысшей оценкой выравнивают с использованием модифицированного алгоритма Нидлмана-Вунша-Селлерса (№еб1ешап & Жшзс11, I. Мо1. Вю1. 48:444 (1970); Ве11егз, В1АМ I. Арр1. МаШ. 26:787 (1974)), который учитывает аминокислотные инсерции и делеции. Репрезентативными параметрами для анализа ЕАВТА являются: к!ир=1, штраф за пробелпропуск=10, штраф за пробел-удлинение=1 и матрица замен=ВЕ0ВПМ 62. Эти параметры могут быть введены в программу ЕАВТА путем модификации файла оценочной матрицы (ВМАТР1Х), как описано в приложении 2 работы Реагзоп, Ме111. Еп/ушо!. 183:63 (1990).
ЕАВТА может быть также использована для определения идентичности последовательностей молекул нуклеиновой кислоты с использованием отношения, описанного выше. Для сравнения нуклеотидных последовательностей величина кЩр может составлять в пределах от 1 до 6, предпочтительно от 3 до 6 и наиболее предпочтительно 3, а другие параметры являются такими, как они были определены выше.
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид, который, по сравнению с описанной здесь аминокислотной последовательностью, имеет консервативную аминокислотную замену. Так, например, могут быть получены варианты, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен в ВЕС) ΙΌ N0:3, где в аминокислотной последовательности 1Е-22РА алкиламинокислота заменена другой алкиламинокислотой, ароматическая аминокислота заменена другой ароматической аминокислотой, серосодержащая аминокислота заменена другой серосодержащей аминокислотой, гидроксисодержащая аминокислота заменена другой гидроксисодержащей аминокислотой, кислотная аминокислота заменена другой кислотной аминокислотой, основная аминокислота заменена другой основной аминокислотой или двухосновная монокарбоновая аминокислота заменена другой моносновной монокарбоновой аминокислотой. Так, например, для часто встречающихся аминокислот замена консервативной аминокислотой может быть осуществлена между аминокислотами следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин, триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. Таблица
- 13 009026
ВЕО8ЕА162 представляет собой матрицу аминокислотных замен, созданную исходя примерно из 2000 локальных множественных выравниваний сегментов последовательностей белка, представляющих собой высококонсервативные области, принадлежащие более чем 500 группам родственных белков (Нешко!Т & Неи1ко££, Ргос. Νη1'1 Асаб. 8с1. И8А, 89:10915 (1992)). В соответствии с этим частота замен в ВЬО8ИМ62 может быть использована для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть внесены в аминокислотные последовательности настоящего изобретения. Хотя можно создать аминокислотные замены только на основе химических свойств аминокислот (как обсуждалось выше), однако, термин замена консервативных аминокислот предпочтительно означает замену, представленную в ВЬО8ИМ62 величиной более чем -1. Так, например, аминокислотная замена является консервативной в том случае, если такая замена охарактеризована в ВЬО8иМ62 величиной 0, 1, 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены охарактеризованы в ВЬО8ИМ62 величиной, равной по крайней мере 1 (например, 1, 2 или 3), а более предпочтительные консервативные аминокислотные замены охарактеризованы в ВТО8ИМ62 величиной, равной по крайней мере 2 (например, 2 или 3). Конкретные варианты 1Ь-22КА охарактеризованы как варианты, имеющие последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, например на 96, 97, 98, 99% или более, идентична соответствующей аминокислотной последовательности (например, 8ЕЦ Ш NО:3), где модификации в аминокислотной последовательности обусловлены одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами.
Консервативные аминокислотные замены в гене 1Ь-22КА могут быть внесены, например, путем замены нуклеотидов в последовательности 8ЕЦ Ш NО:1 другими нуклеотидами. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза, линкерсканирующего мутагенеза, мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. АикиЬе1 (1995) и МсРНегкоп (еб.), ОНесЮб Ми1адеиек1к: А РтасНса1 АрргоасН (1ВЬ Ргекк 1991)). Вариант полипептида 1Ь-22КА может быть идентифицирован по его способности специфически связываться с антителами против 1Ь-22КА.
Белки настоящего изобретения могут также содержать неприродные аминокислотные остатки. Неприродными аминокислотами являются, но не ограничиваются ими, транс-3-метилпролин, 2,4метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, Ν-метилглицин, алло-треонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновая кислота, тиазолидинкарбоновая кислота, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3-диметилпролин, третлейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. Специалистам хорошо известны несколько методов включения неприродных аминокислотных остатков в белки. Так, например, может быть использована ίη νίΙΐΌ система, в которой нонсенс-мутации подавляются химически аминоацилированными тРНК-супрессорами. Методы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК хорошо известны специалистам. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, обычно осуществляют в бесклеточной системе, содержащей экстракт 830 Е.соН а также коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, ВоЬейкоп е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос. 113:2722 (1991), Е11тап е! а1., Ме!Нобк Епхуто1. 202:301 (1991), СНипд е! а1., 8с1епсе 259:806 (1993) и СНипд е! а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 90:10145 (1993).
Во втором способе трансляцию осуществляют в ооцитах Хепорик путем микроинжекции мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Титсай е! а1., 1. Вю1. СНет. 271:19991 (1996)). В третьем способе клетки Е.соН культивируют в отсутствии природной аминокислоты, которая является замененной (например, фенилаланина) и в присутствии нужной(ых) неприродной(ых) аминокислоты(от) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4фторфенилаланина). Неприродную аминокислоту включают в белок вместо ее природного аналога. См. Ко1бе е! а1., ВюсНет. 33:7470 (1994). Природные аминокислотные остатки могут быть превращены в неприродные аминокислоты путем химической ш ν Иго модификации. Для дополнительного расширения диапазона замен, химическая модификация может быть объединена с сайт-направленным мутагенезом (^упп & КтсНатбк, Рто!еш 8ск 2:395 (1993)).
Аминокислотные остатки 1Ь-22КА могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот; аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом; аминокислотами, не встречающимися в природе; и синтезированными аминокислотами.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах настоящего изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (СипшпдНат & ^е11к, 8с1епсе 244:1081 (1989), Вакк е! а1., Ргос. №Г1 Асаб. 8с1. И8А 88:4498 (1991), СоотЬк & Согеу, 8йе-0Нес!еб Ми1адепек1к апб Рго!ет Епдшеегтд, Рго!ешк: Апа1ук1к апб Оеадп, Апде1е!б (еб.), радек 259-311 (Асабетю Ргекк, 1пс. 1998)). В последнем методе одиночные аланиновые мутации вносят в каждый остаток данной молекулы и полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность для идентификации аминокислотных остатков, которые играют решающую роль в активности молекулы. См. также Н11!оп е! а1., 1. Вю1. СНет. 271:4699 (1996).
Хотя анализ последовательностей может быть проведен для дополнительного определения лиган
- 14 009026 дсвязывающей области 1Ь-22КЛ, однако, аминокислоты, которые играют определенную роль в активности связывания с 1Ь-22КЛ (например, связывания 1Ь-22КЛ с лигандом 1Ь-22 или с анти-1Ь-22КЛ антителом), могут быть также определены путем физического анализа структуры, определенной такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение в комбинации с мутацией аминокислот в предполагаемом сайте контактирования. См., например, бе Уоз е! а1., 8с1еисе 255:306 (1992), 8шйй е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 224:899 (1992) и \У1обаусг е! а1., ЕЕВ8 Ье!!. 309:59 (1992).
Множественные аминокислотные замены могут быть созданы и протестированы известными методами мутагенеза и скрининга, например, методами, описанными К.е1бйаат-О1зои и 8аиет (8с1еисе 241:53 (1988)) или Во\\1е & 8аиет (Ргос. N31'1 Асаб. 8с1. И8А 86:2152 (1989)). Вкратце, эти авторы описывают методы одновременной рандомизации двух или нескольких положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид, а затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другими методами, которые могут быть использованы, являются фаговое представление (например, Ьо\утап е! а1., Вюсйет. 30:10832 (1991), Ьабиет е! а1., патент США № 5223409, Низе, международная публикация XVО 92/06204 и область-направленный мутагенез (ИегЬузЫге е! а1., Сеие 46:145 (1986) и №т е! а1., ΌΝΑ 7:127 (1988)). Кроме того, 1Ь-22КА, меченный биотином или ФИТЦ, может быть использован для экспрессионного клонирования путем экспрессии лигандов 1Ь-22КА.
Варианты описанных нуклеотидных и полипептидных последовательностей 1Ь-22ВА могут быть также генерированы путем перестановки ДНК, как описано у 8!еттет, №11иге 370:389 (1994), 8!еттет, Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 91:10747 (1994) и в международной публикации νθ 97/20078. Вкратце, варианты молекулы ДНК генерируют ίη νίΙΐΌ путем гомологичной рекомбинации посредством рандомизированной фрагментации родительской ДНК с последующей повторной сборкой посредством ПЦР с получением произвольно внесенных точковых мутаций. Для внесения в этот процесс дополнительной изменчивости этот метод может быть модифицирован с использованием семейства родительских молекул ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК, происходящие от организмов различных видов. Отбор или скрининг на нужную активность с последующими дополнительными повторениями процесса мутагенеза и анализа обеспечивают быструю эволюцию последовательностей путем выбора нужных мутаций при одновременном отборе для исключения нежелательных замен.
Описанные здесь методы мутагенеза могут быть объединены с высокоэффективными автоматизированными методами скрининга для детекции активности клонированных и мутагенизированных полипептидов в клетках-хозяевах. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие биологически активные полипептиды или полипептиды, связывающиеся с анти-1Ь-22ВА антителами, могут быть выделены из клеток-хозяев и быстро секвенированы на современном оборудовании. Эти методы позволяют быстро определить роль отдельных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде, и могут быть применены для полипептидов с неизвестной структурой.
Настоящее изобретение также включает функциональные фрагменты полипептидов ГО-22КА и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих такие функциональные фрагменты. Для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 1Ь-22ВА, могут быть осуществлены рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНКмолекулы, имеющие нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО N0:1, могут быть гидролизованы нуклеазой Ва131 с получением серии гнездовых делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в соответствующей рамки считывания, и экспрессированные полипептиды выделяют и тестируют на их способность связываться с анти-1Ь-22ВА антителами. Одной из альтернатив расщеплению экзонуклеазой является олигонуклеотид-направленный мутагенез, осуществляемый для введения делеций или стоп-кодонов в целях детекции продуцирования нужного фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена 1Ь-22ВА могут быть синтезированы с помощью полимеразной цепной реакции.
Этот общий метод был проиллюстрирован путем исследования усечения на одном из концов или на обоих концах последовательностей интерферонов и систематизирован НопзЬетдет & И1Магсо, Рйаттас. Тйег. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные методы функционального анализа белков описаны, например, у Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Сеи. Сеие!. 240:113 (1993), Сои!еи! е! а1. Ехртеззюи аиб ртеНтшату бе1е!юи аиа1уз1з оГ 1йе 42 кИа 2-5А зуи!йе1азе шбисеб Ьу йитаи ш!егГетои, Вю1одка1 1и!егГегои 8уз!етз, Ргосеебшдз оГ Ι8ΙΡ-ΤΝΟ Меейид ои 1и!егГегои 8уз!етз, Саи!е11 (еб.), радез 65-72 (N^^ΗοΓΓ 1987), Негзсйтаи, Тйе ЕСЕ К.есер!от, Сои!го1 оГ Ашта1 Се11 Рто11Гега!юи, Уо1. 1, Воуи!ои е! а1., (ебз.) радез 169-199 (Асабетк Ргезз 1985), СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. Сйет. 270:29270 (1995); Еикииада е! а1., 1. Вю1. Сйет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., Вюсйет. Рйагтасо1. 50:1295 (1995) и у Ме1зе1 е! а1., Р1аи! Мо1ес. Вю1. 30:1 (1996).
Анализ описанных здесь конкретных последовательностей позволяет выявить серию репрезентативных функциональных фрагментов, представленных в табл. 4. Нуклеотиды, кодирующие дополнительные функциональные варианты доменов человеческого ГО-22КА, описанные ниже и не представленные в табл. 4, могут быть оценены по сравнению с 8ЕО ГО N0:1. Такими функциональными фрагментами являются, например, нижеследующие нуклеотидные последовательности 8ЕО ГО N0:1: нуклеотиды 85-381, 206-717 и 85-717 8ЕО ГО N0:1 и соответствующие кодируемые ими аминокислотные последова
- 15 009026 тельности, представленные в 8ЕО ГО N0:2 и в 8ЕО ГО N0:3 соответственно.
Таблица 4
Признак ΙΣ-22ΚΑ Аминокислотные остатки (5Εζ) Ю N0:2) Нуклеотиды (8Е<2 Ю N0:1)
Первый домен 1д 18-116 85-381
Второй домен 1дС 125-228 206-717
Оба домена 1дС 18-228 85-717
В настоящем изобретении также рассматриваются функциональные фрагменты гена ГБ-22КА, которые, по сравнению с описанной здесь аминокислотной последовательностью, имеют аминокислотные замены. Вариант гена ГБ-22КА может быть идентифицирован исходя из его структуры путем определения уровня ее идентичности с описанными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями, как уже обсуждалось выше. Альтернативным методом для идентификации варианта гена исходя из его структуры является установление способности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей возможный вариант гена ГБ-22КА, гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, такую как 8ЕО ГО N0:1.
Настоящее изобретение также включает использование функциональных фрагментов полипептидов ГБ-22КА, антигенных эпитопов, эпитоп-несущих фрагментов полипептидов ГБ-22КА, и молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих такие функциональные фрагменты, антигенные эпитопы и эпитоп-несущие фрагменты полипептидов ГБ-22КА. Указанные фрагменты используются для генерирования полипептидов для их использования в целях продуцирования антител и партнеров по связыванию, которые связываются с ГБ-22 или с обоими ГБ-20 и ГБ-22, либо блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность. Функциональный полипептид ГБ-22КА или его фрагмент, определенные в настоящем описании, характеризуются их способностью блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать воспалительную, пролиферативную или дифференцирующую активность ГБ-20 или ГБ-22, а также их способностью индуцировать или ингибировать специализированные функции клеток или их способностью специфически связываться с анти-ГБ-22КА антителом, с клеткой, с ГБ-20 или ГБ-22. Как было описано ранее, ГБ-22КА имеет структуру и домены цитокинового рецептора класса И, описанные в настоящем изобретении. Таким образом, в настоящем изобретении также рассматривается использование гибридных белков, включающих (а) полипептидные молекулы, содержащие один или несколько описанных выше доменов; и (Ь) функциональные фрагменты, содержащие один или несколько таких доменов. В другую полипептидную часть гибридного белка может быть введен другой цитокиновый рецептор класса П, такой как ГБ-10К, ГБ-13К, ГБ-20КА, ГБ-20КБ, ГБ-10КБ (СКБ2-4), ГБ-22КА2, либо неприродный и/или неродственный секреторный сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию данного гибридного белка.
Настоящее изобретение также относится к полипептидным фрагментам или к пептидам, содержащим описанный здесь эпитоп-несущий фрагмент полипептида ГБ-22КА. Такие фрагменты или пептиды могут содержать иммуногенный эпитоп, который является частью белка, индуцирующего гуморальный ответ в том случае, если в качестве иммуногена используется весь белок. Иммуногенные эпитоп-несущие пептиды могут быть идентифицированы стандартными методами (см., например, Оеузеп е! а1., Ргос. ΝαΙ'Ι. Асаб. 8сБ, И8А, 81:3998 (1983)).
В противоположность этому, полипептидные фрагменты или пептиды могут содержать антигенный эпитоп, являющийся областью белковой молекулы, с которой может специфически связываться антитело. Некоторые эпитопы состоят из линейных или непрерывных аминокислотных фрагментов, и антигенность такого эпитопа не нарушается денатурирующими агентами. Хорошо известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые могут имитировать эпитопы белка, могут быть использованы для стимуляции продуцирования антител против данного белка (см., например, 8и1сБйе е! а1., 8с1епсе 219:660 (1983)). В соответствии с этим антигенные эпитоп-несущие пептиды, антигенные пептиды, эпитопы и полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для выработки антител, связывающихся с описанными здесь полипептидами, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против ГБ-22КА, которые обладают нейтрализующим действием, и которые могут связываться с ГБ-22 и ГБ-20 (с одним из них или с обоими) или блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать их активность. Такие нейтрализующие моноклональные антитела настоящего изобретения могут связываться с антигенным эпитопом ГБ-22КА. Для определения областей в 8ЕС) ГО N0:3, которые имеют наибольший антигенный потенциал, могут быть использованы профили гидрофильности Хоппа/Вуда (Норр е! а1., Ргос. №1'1. Асаб. 8сГ 78:3824-3828, 1981; Норр Б Гттип. Ме111. 88:118, 1986 и Тпцшег е! а1., Рго1ет Епдтеегтд 11:153-169, 1998). Этот профиль характеризуется скользящим окном из шести остатков. Скрытые остатки О, 8 и Т и открытые остатки Н, Υ и А не учитывались. В ГО22КА эти области могут быть определены любым специалистом. Кроме того, антигенные эпитопы ГО22КА в 8ЕС) ГО N0:3, предсказанные по кривой Джеймсона-Вольфа, например, с использованием программы 1ЖА8ТА1< Рго1еап (1ЖА8ТА1<, Гпс., МабНоп, АГ), являются предпочтительными антигенными
- 16 009026 эпитопами и могут быть получены любым специалистом. Такие антигенные эпитопы включают:
(1) аминокислотные остатки 1 (Рго) - 6 (Ακρ) 8ЕО ГО N0:3;
(2) аминокислотные остатки 26 (8ег) - 32 (Рго) 8Е0 ГО N0:3;
(3) аминокислотные остатки 41 (Бук) - 47 (Ακρ) 8Е0 ГО N0:3;
(4) аминокислотные остатки 49 (Уа1) - 62 (Сук) 8Е0 ГО N0:3;
(5) аминокислотные остатки 41 (Ьук) - 62 (Сук) 8Е0 ГО N0:3;
(6) аминокислотные остатки 84 (А1а) - 97 (8ег) 8Е0 ГО N0:3;
(7) аминокислотные остатки 103 (ТЬг) - 108 (Ακρ) 8Е0 ГО N0:3;
(8) аминокислотные остатки 130 (Αγ§) - 135 (Ηίκ) 8Е0 ГО N0:3;
(9) аминокислотные остатки 164 (С1у) - 166 (Ьук) 8Е0 ГО N0:3;
(10) аминокислотные остатки 175 (Туг) - 179 (С1и) 8Е0 ГО N0:3;
(11) аминокислотные остатки 193 (Ьук) - 196 (Α1α) 8Е0 ГО N0:3;
(12) аминокислотные остатки 203 (Ьук) - 209 (ТЬг) 8Е0 ГО N0:3.
Другими эпитопами являются нижеследующие пептиды, которые потенциально продуцируются из невосстановленного полноразмерного человеческого ΓΕ-22ΒΑ, расщепленного СпВг: пептид 6 (8Е0 ГО N0:56), пептид 7 (8ЕО ГО N0:57), пептид 8 (8ЕО ГО N0:58), пептид 9 (8ЕО ГО N0:59), пептид 10 (8ЕО ГО N0:60) и пептид 11 (8Е0 ГО N0:61). Цистеины связаны дисульфидными связями, что приводит к образованию возможной связи между пептидами 7 (8Е0 ГО N0:57) и 10 (8Е0 ГО N0:60). В частности, 8Е0 ГО N0:56 соответствует аминокислотным остаткам 1 (Рго) - 92 (Ме!) 8Е0 ГО N0:3; 8Е0 ГО N0:57 соответствует аминокислотным остаткам 93 (ТЬг) - 120 (Ме!) 8Е0 ГО N0:3; 8Е0 ГО N0:58 соответствует аминокислотным остаткам 121 (Не) - 160 (Ме!) 8Е0 ГО N0:3; 8Е0 ГО N0:59 соответствует аминокислотным остаткам 161 (Н1к) - 185 (Ме!) 8Е0 ГО N0:3; 8Е0 ГО N0:60 соответствует аминокислотным остаткам 186 (Не) - 199 (Ме!) 8Е0 ГО N0:3, а 8Е0 ГО N0:61 соответствует аминокислотным остаткам 200 (Сук) - 211 (ТЬг) 8Е0 ГО N0:3. Кроме того, остатками 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8Е0 ГО N0:3), которые играют важную роль в связывании лиганд-рецептор, являются Туг-60, РЬе-164, Туг-93, Αγ§-112, Ьук-210 и С1и-211 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующими остатками 8Е0 ГО N0:3). Кроме того, первичными остатками 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующими остатками 8Е0 ГО N0:3), которые играют важную роль в регуляции связывания лиганд-рецептор, являются Туг-60 и РЬе-164 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8Е0 ГО N0:3), а вторичными остатками являются остатки Туг-93, Αγ§-112, Ьук210 и С1и-211 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8Е0 ГО N0:3). В предпочтительных вариантах изобретения антигенные эпитопы, с которыми связываются нейтрализующие антитела настоящего изобретения, содержат остатки 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8Е0 ГО N0:3), играющие важную роль в связывании лиганд-рецептор, например, с ΓΕ-22ΚΑ и с ГЕ-20 или ГЕ-22 (с одним из них или с обоими).
Антигенные эпитоп-несущие пептиды и полипептиды могут содержать по крайней мере от 4 до 10 аминокислот, по крайней мере от 10 до 15 аминокислот или примерно от 15 до 30 аминокислот описанной здесь аминокислотной последовательности. Такие эпитоп-несущие пептиды и полипептиды могут быть продуцированы путем фрагментации полипептида [Ε-22ΕΑ или химическими методами пептидного синтеза, описанными ниже. Кроме того, эпитопы могут быть отобраны путем фагового представления библиотек рандомизированных пептидов (см., например, Бапе & 81е]э11еп. Сигг. 0ρίη. Iттиηо1. 5:268 (1993) и Сог!еке е! а1., Сигг. 0ρίη. Вю!есЬпо1. 7:616 (1996)). Стандартные методы идентификации эпитопов и продуцирования антител из небольших пептидов, содержащих эпитоп, описаны, например, Мо1е Еρ^!оρе Μаρρ^ηд, Ме!Ьобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Мапкоп (еб.), цадек 105-116 (ТЬе Нитапа Ргекк, Нс. 1992), Рпсе, РгобисНоп апб С11агас1епха1юп оГ 8уп!Небс Реρ!^бе-^е^^νеб Αη!^Ьоб^еκ, Мопос1опа1 ΑπΙίЬоб1ек: РгобисНоп, Епдтееппд апб СНшса1 Αρρ1^са!^оη, ННГег & Бабутап (ебк.), ρадеκ 60-84 (СатЬпбде Ишуегкйу Ргекк 1995) и СоНдап е! а1. (ебк.), Сиггеп! Рго!осо1к т Iттиηо1оду, ρадеκ 9.3.1-9.3.5 апб ρадеκ 9.4.1-9.4.11 (боНп №Неу & 8опк, 1997).
Для любого полипептида I^-22ΚΑ, включая его варианты и гибридные белки, каждый специалист может легко получить полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный вариант, с использованием информации, имеющейся выше в табл. 1 и 2. Кроме того, каждый специалист может использовать стандартную компьютерную программу для выявления вариантов ГО22ΒΑ, исходя из описанных здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
5. Продуцирование полипептидов I^-22ΚΑ
Полипептиды настоящего изобретения, включая полноразмерные полипептиды; растворимые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы; полноразмерные рецепторы; фрагменты рецепторов (например, лигандсвязывающие фрагменты и антигенные эпитопы), функциональные фрагменты и гибридные белки могут быть продуцированы в рекомбинантных клетках-хозяевах стандартными методами. Для экспрессии гена Г^-22ΚΑ, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть функционально присоединена к регуляторным последовательностям, которые регулируют транскрипционную экспрессию в экспрессирующем векторе, а затем она должна быть введена в клетку-хозяина. Помимо последовательностей регуляции транскрипции, таких как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут включать последовательности регуляции трансляции и
- 17 009026 маркерный ген, который является подходящим для отбора клеток, несущих этот экспрессирующий вектор.
Экспрессирующие векторы, которые могут быть использованы для продуцирования чужеродного белка в эукариотических клетках, обычно содержат: (1) прокариотические ДНК-элементы, кодирующие бактериальный сайт инициации репликации, и маркер резистентности к антибиотикам, обеспечивающие рост и отбор экспрессирующего вектора в бактериальном хозяине; (2) эукариотические ДНК-элементы, регулирующие инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) ДНК-элементы, регулирующие процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования. Как обсуждалось выше, экспрессирующие векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Так, например, экспрессирующий вектор ΙΕ-22ΚΆ может содержать ген ΙΕ-22ΚΆ и секреторную последовательность, происходящую от любого секретированного гена.
Белки ΙΕ-22ΚΆ настоящего изобретения могут экспрессироваться в клетках млекопитающих. Примерами подходящих клеток-хозяев млекопитающих являются клетки почки Африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СКЬ 1587), клетки почки человеческого эмбриона (293-НЕК; АТСС СКЬ 1573), клетки почки детеныша хомячка (ВНК-21, ВНК-570, АТСС СКЬ 8544, АТСС СКЬ 10314), клетки почки собак (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССБ61; СНО ΌΟ44 (Сйакш е1 а1., Бот. Се11. Мо1ес. Оеие1. 12:555, 1986)), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССБ82), клетки НеЬа Б3 (АТСС ССБ2.2), клетки крысиной гепатомы (Н-4-П-Е; АТСС СКЬ 1548), БУ40трансформированные клетки почки обезьяны (С0Б-1; АТСС СКЬ 1650) и клетки мышиного эмбриона (МН-3Т3; АТСС СКЬ 1658).
Что касается млекопитающего-хозяина, то следует отметить, что сигналы регуляции транскрипции и трансляции могут происходить от вирусных источников млекопитающего, например, аденовируса, вируса коровьей папиломы, обезьяньего вируса или т.п., в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, имеющим высокий уровень экспрессии. Подходящие последовательности регуляции транскрипции и трансляции могут быть также получены из генов млекопитающих, например, из генов актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Последовательности регуляции транскрипции включают промоторную область, достаточную для обеспечения регуляции инициации синтеза РНК. Подходящими эукариотическими промоторами являются промотор гена металлотионеина Ι (Натег е1 а1., 1. Мо1ес. Арр1. Оеие1. 1:273 (1982)), промоторы ТК вируса герпеса (МсКшдй!, Се11 31:355 (1982)), ранний промотор Бу40 (Веио1к! е! а1., №1иге 290:304 (1981)), промотор вируса саркомы Рауса (Оогтаи е! а1., Ргос. №!'1. Асай. Бс1. ИБА 79:6777 (1982)), промотор цитомегаловируса (Еоескшд е! а1., Оепе 45:101 (1980)) и промотор вируса опухоли молочной железы мышей (в общих чертах, см. Е!сйеνе^^у Ехргеккюи о£ Еидтеегей Рго!етк ίη Маттайаи Се11 Си1!иге, Рго!ет Еидтеегтд: Рг1пс1р1ез апй Ргасйсе, С1е1аий е! а1., (ейк.), радек 163-181 (1ойи νίΕν & Боик, Бчс. 1996)).
Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т3, может быть использован для регуляции экспрессии гена ΣΕ-ΣΣΕΛ в клетках млекопитающего в том случае, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (Уйон е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529 (1990) аий КаиТтаи е! а1., №с1. Аайк. Кек. 19:4485 (1991)).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, ДНК-последовательность, кодирующая полипептид растворимого рецептора Ш^КА или фрагмент полипептида Ш^КА, функционально присоединена к другим генетическим элементам, необходимым для ее экспрессии, обычно, к промотору и терминатору транскрипции в экспрессирующем векторе. Такой вектор также обычно содержит один или несколько селективных маркеров и один или несколько сайтов инициации репликации, хотя для каждого специалиста очевидно, что в некоторых системах, селективные маркеры могут находиться в отдельных векторах, а репликация экзогенной ДНК может обеспечиваться интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селективных маркеров, векторов и других элементов может быть осуществлен любым специалистом путем рутинного экспериментирования. Многие из таких элементов описаны в литературе и являются коммерчески доступными. Множество компонентов комплекса растворимого рецептора могут быть котрансфицированы на отдельных экспрессирующих векторах, либо они могут находиться в одном экспрессирующем векторе. Такие методы экспрессии множества компонентов белковых комплексов хорошо известны специалистам.
Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева различными стандартными методами, включая трансфекцию с использованием фосфата кальция, трансфекцию с помощью липосом, доставку путем микроинжекции, электропорацию и т.п.
Трансфицированные клетки могут быть отобраны и размножены с получением рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих экспрессирующий вектор, стабильно интегрированный в геном клеткихозяина. Методы встраивания векторов в эукариотические клетки и методы отбора таких стабильных трансформантов с использованием доминантного селективного маркера описаны АикиЬе1 (1995) & Миггау (ей.), Оеие ТгаикГег аий Ехргеккюи Рго!осо1к (Нитаиа Ргекк, 1991).
Так, например, одним из подходящих селективных маркеров является ген, сообщающий резистентность к антибиотику неомицину. В этом случае, отбор осуществляют в присутствии лекарственного
- 18 009026 средства типа неомицина, такого как 0418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, т. е. для осуществления процесса, называемого амплификацией. Амплификацию осуществляют путем культивирования трансфектантов в присутствии небольшого количества селективного агента с последующим увеличением количества этого селективного агента для отбора клеток, продуцирующих высокие уровни продуктов встроенных генов. Подходящим амплифицируемым селективным маркером является ген дигидрофолатредуктазы (ОНЕВ), сообщающий резистентность к метотрексату. Могут быть также использованы и другие гены резистентности к лекарственным средствам (например, ген резистентности к гигромицину, ген резистентности ко многим лекарственным средствам и ген резистентности к пуромицинацетилтрансферазе). Альтернативно, маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра, или белки клеточной поверхности, такие как 004, СЭ8, ГКГ класса I, и щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для отделения трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими методами, как сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (ЕАС8) или разделение с использованием магнитных сфер.
Полипептиды 1Ь-22ВА могут быть также получены путем культивирования клеток млекопитающих с использованием системы доставки вирусов. Репрезентативными вирусами, подходящими для этой цели, являются аденовирус, ретровирусы, герпесвирус, вирус коровьей оспы и адено-ассоциированный вирус (ААУ). Аденовирус, т.е. вирус на основе двухцепочечной ДНК, в настоящее время является наиболее изученным вектором для переноса генов, используемым в целях доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в общих чертах, см. Вескег е! а1., Ме111. Се11. ΒίοΙ. 43:161 (1994) и Ооид1ак & Сипе1, 8с1епсе & Мейюте, 4:44 (1997)). Преимуществами такой аденовирусной системы является возможность встраивать относительно крупные ДНК-вставки, способность реплицироваться до высоких титров, способность инфицировать клетки млекопитающих широкого ряда и гибкость, которая позволяет использовать эту систему с большим числом доступных векторов, содержащих различные промоторы.
В результате делеции частей аденовирусного генома, в него могут быть встроены более крупные вставки (до 7 т.п.н.) гетерологичной ДНК. Эти вставки могут быть встроены в вирусную ДНК путем прямого лигирования или путем гомологичной рекомбинации с котрансфицированной плазмидой. Одним из возможных вариантов является делеция главного гена Е1 из вирусного вектора, которая приводит к неспособности этого вектора к репликации, если только ген Е1 не будет поставляться клеткойхозяином. Т-клетка, например, человеческие клетки 293, инфицированные аденовирусным вектором (АТСС. № СВЬ-1573, 45504, 45505), могут быть выращены в виде адгезивных клеток или в виде суспензионной культуры при относительно высокой клеточной плотности с продуцированием значительного количества белка (см. Оагшег е! а1., СуЮ1есНпо1. 15:145 (1994)).
1Ь-22ВА может быть также экспрессирован в других высших эукариотических клетках, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, дрожжей или растений. Для введения клонированных генов 1Ь-22ВА в клетки насекомых, эффективной является бакуловирусная система. Подходящие экспрессирующие векторы были получены на основе вируса множественного ядерного полиэдроза Аи1одгарйа саНГогшса (АсМ№У) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка теплового шока (Нкр) 70 дрозофилы, промотор предраннего гена вируса ядерного полиэдроза АшодгарНа саНГогшса (1е-1), промотор задержанного раннего гена 39К, промотор бакуловируса р10 и промотор металлотионеина дрозофилы. Второй метод получения рекомбинантного бакуловируса предусматривает использование системы на основе транспозонов, описанной Ьискоте (Ьискоте е1 а1., 1. У1го1. 67:4566 (1993)). Эта система, в которой используются векторы для переноса, поставляется в наборе ВАС-Ю-ВАС (ЫГе ТесНпо1од1ек, Вос^Ше, ΜΌ). В этой системе используется вектор для переноса РЕА8ТВАС (ЬгГе ТесНпо1од1ек), содержащий транспозон Тп7 и применяемый для переноса ДНК, кодирующей полипептид 1Ь-22ВА в бакуловирусный геном, интегрированный в Е.сой в виде крупной плазмиды, называемый бакмидой. См. НШ-Регктк & Рокке, 1. Оеп. У1го1. 71:971 (1990), Вопшпд е! а1., 1. Оеп. У1го1. 75:1551 (1994) и СНахепЬа1к & ВаророП, 1. Вю1. СНет. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы для переноса могут включать ДНК, лигированную с сохранением рамки считывания и кодирующую эпитопную метку у С- или Ν-конца экспрессируемого полипептида Ш-22ВА, например, эпитопную метку 61и-61и (Огиккептеуег е! а1. Ргос. N1'1. Асай. 8сг 82:7952 (1985)). С применением известной техники, вектор для переноса, содержащий ген 1Ь-22ВА, трансформируют в Е.соИ и скринируют на бакмиды, которые содержат прерываемый ген 1ас2, указывающий на присутствие рекомбинантного бакуловируса. Затем бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный бакуловирусный геном, выделяют стандартными методами.
Репрезентативный вектор РЕА8ТВАС может быть в значительной степени модифицирован. Так, например, полиэдриновый промотор может быть удален, и вместо него может быть встроен промотор основного белка бакуловируса (известный также как промотор Рсог, р6.9 или промотор МР), экспрессия которого является более ранней при бакуловирусной инфекции, при этом, было показано, что он является предпочтительным для экспрессии секретируемых белков (см., например, НШ-Регкшк & Роккее, 1. Оеп. У1го1. 71:971 (1990), Вопшпд е! а1., 1. Оеп. У1го1. 75:1551 (1994) и СНахепЬа1к & Варорог!, 1. Вю1. СНет. 270:1543 (1995)). В таких конструкциях вектора для переноса может быть использован короткий или длинный вариант промотора основного белка. Более того, могут быть сконструированы векторы для пе
- 19 009026 реноса, в которых секреторные сигнальные последовательности нативного 1Б-22КА заменены секреторными сигнальными последовательностями, происходящими от белков насекомых. Так, например, в данных конструкциях, вместо секреторной сигнальной последовательности нативного 1Б-22КА может быть использована секреторная сигнальная последовательность, происходящая от экдистероидглюкозилтрансферазы (ЕОТ), меллитина пчел (1пуйгодеп ^Γροι^ίο^ СагкЬаб, СА) или др67 бакуловируса (РНагМшдеп: 8ап Охе^, СА).
Для трансфекции клеток-хозяев используют рекомбинантный вирус или бакмиду. Подходящими клетками-хозяевами насекомых являются клеточные линии, происходящие от 1РБВ-8Г-21, яичниковая клеточная линия куколки δροάορ^ιπ Ггцд1ребга, такая как 8Г9 (АТСС СКЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Γ2Ι (1пуйгодеп Сο^ρο^а!^οη; 8ап Охе^, СА), а также клетки 8сНпе1бег-2 Ото^рЬПа и клеточная линия Н1ОН Е1УЕ0 (1пуйгодеп), происходящая от Тпс1торй.1к1а ш (патент США № 5300435). Коммерчески доступные бессывороточные среды могут быть использованы для выращивания и поддержания жизнеспособности клеток. Подходящими средами для клеток 8Г9 являются среды 8Г900 II™ (ЫГе ТесНмЫдхек) или Е8Б 921™ (Ехргеккюп 8ук!етк), а для клеток Т.ш - среды Ех-се11О405™ (1КН ВюкЫепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк ИуеО™ (Ь1Ге Тесйηο1οд^ек). При использовании рекомбинантного вируса, клетки обычно культивируют, начиная с плотности инокуляции приблизительно 2-5х105 клеток и до плотности 1-2х106 клеток, и на этом этапе добавляют исходный рекомбинантный вирус при множественности заражения (тюл.) 0,1-10, а обычно примерно более 3.
Хорошо известные методы получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах описаны Вабеу е! а1. МаЫрц1а!юп οΓ Васикуйик УесЮгк, Мебюбк ш ΜοΚ^Ει· ВюЫду, νο1. 7: Оепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рюк^к, Миггау (еб.), радек 147-168 (ТНе Нитапа Ргекк, 1пс. 1991), Ра!е1 е! а1., ТНе Ьаси1ονΪΓΠ8 ехргеккюп кук!ет, ΌΝΛ СЫЫпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Ебйюп, ОЫуег е! а1. (ебк.), радек 205244 (Ох&гб ИЫуегкйу Ргекк 1995), АикиЬе1 (1995), радек 16-37-16-57, К^сНа^бкοη (еб.), Васикупик Ехргеккюп Ргокток (ТНе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995) и Бискгю\\· 1пкес! Се11 Ехргеккюп ТесНηοкду, Рго!ет Епд1пееппд: Рппар1е апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.) радек 183-218 (кНп кбеу & Еюпк, 1пс. 1996).
Для экспрессии описанных здесь генов могут быть также использованы клетки грибов, включая дрожжевые клетки. Дрожжами, представляющими особый интерес для этой цели, являются 8ассНаготусек сегеуШае, РюЫа раккгк и РюЫа те1Нагю11са. Подходящими промоторами для экспрессии в дрожжах являются промоторы, происходящие от ОАЬ1 (галактозы), РОК (фосфоглицераткиназы), АЭН (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), Н184 (гистидинол-дегидрогеназы) и т.п. Было сконструировано множество векторов для клонирования в дрожжах, и эти векторы являются легко доступными. Такими векторами являются векторы на основе У1р, такие как У1р5; векторы УКр, такие как УКр17; векторы УЕр, такие как УЕр13; и векторы УСр, такие как УСр19. Методы трансформации клеток 8. сегетЫае экзогенной ДНК и получения из этих клеток рекомбинантных полипептидов описаны, например, Ка\\'акак1, патент США № 4599311, Ка\\'акак| е! а1., патент США № 4931373, Вгаке, патент США № 4870008, ке1сН е! а1., патент США № 5037743 и Миггау е! а1., патент США № 4845075. Трансформированные клетки отбирают по их фенотипу, определяемому селективным маркером, в основном, по резистентности к лекарственному средству или по способности расти в отсутствии конкретного питательного вещества (например, лейцина). Подходящей системой векторов для использования в 8ассНаготусек сегеуШае является система векторов РОТ1, описанная Ка\\'акак| е! а1. (патент США № 4931373), позволяющая проводить отбор трансформированных клеток по их способности расти в среде, содержащей глюкозу. Другими промоторами и терминаторами, подходящими для их использования в дрожжах, являются промоторы и терминаторы, происходящие от генов гликолитических ферментов (см., например, Ка^акак1, патент США № 4599311, Ктдктап е! а1., патент США № 4615974 и В1йег, патент США № 4977092) и гены алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США № 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.
Системы трансформации для других дрожжей, включая Напкепи1а ρο1утο^ρНа, 8сЫζοкассНа^οтусек ροтЬе, КЫууеготусек 1ас!к, КЫууеготусек ГгадШк, υ^ίΕ^ο таубк, РюЫа раккгк, РюЫа теФа^Ша, РюЫа ди^11е^тοηб^^ и Сапб1ба та1кка, известны специалистам. См., например, О1еегоп е! а1., I. Оеп. ΜίсгоЬю1. 132:3459 (1986) и Сгедд, патент США № 4882279. Клетки АкрегдШик могут быть использованы в соответствии с методами, описанными МсКЫдЫ е! а1. в патенте США № 4935349. Методы трансформации Асгеи-юшит сНгугодепит описаны 8ит^ηο е! а1. в патенте США № 5162228. Методы трансформации ^ΐ-σοφοη описаны Ε;·ιιιιόο\νίΙζ в патенте США № 4486533.
Так, например, использование РюЫа те1Нагю11са в качестве хозяина для продуцирования рекомбинантных белков описано Каутοηб, в патенте США № 5716808; Каутοηб, в патенте США № 5736383, Каутοηб е! а1., Уеак! 14:11-23 (1998) и в международных публикациях № кО 97/17450, кО 97/17451, кО 98/02536 и кО 98/02565. Молекулы ДНК, используемые для трансформации Р. теФа^Ша, обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые перед трансформацией предпочтительно линеаризуют. Для продуцирования полипептидов в Р. теИа^Иса, промотором и терминатором в такой плазмиде могут быть промоторы и терминаторы гена Р. теИа^Иса, такого как ген утилизации спирта Р. теИа^Иса (АИО1 или АИО2). Другими подходящими промоторами являются промоторы, происходящие от генов дигидроксиацетонсинтазы (ОНА8), формиатдегидрогеназы (БМЭ) и каталазы (САТ). Для
- 20 009026 облегчения интеграции ДНК в хромосому хозяина, предпочтительно, чтобы весь экспрессионный сегмент плазмиды был фланкирован по обоим концам ДНК-последовательностями хозяина. Подходящим селективным маркером для использования в Р1сЫа теШапоРса является ген ΆΌΕ2 Р. теШапоРса, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (А1КС; ЕС 4.1.1.21) и позволяет абе2содержащим клеткам-хозяевам расти в отсутствии аденина. Для крупномасштабного промышленного культивирования, при котором желательно минимизировать использование метанола, могут быть использованы клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола (АИС1 и АИС2). Для продуцирования секретированных белков, клетки-хозяева могут быть дефицитными по гену вакуолярной протеазы (РЕР4 и РКВ1). Для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. те1РапоРса, используется электропорация. Клетки Р. те!Рапо11са могут быть трансформированы путем электропорации с использованием экспоненциально затухающего импульсного электрического поля, где напряженность поля составляет от 2,5 до 4,5 кВ/см, а предпочтительно примерно 3,75 кВ/см, и где постоянная времени (ΐ) составляет от 1-40 мс, а наиболее предпочтительно примерно 20 мс.
Экспрессирующие векторы могут быть также введены в протопласты растения, в интактные ткани растений или в отдельные клетки растений. Методами введения экспрессирующих векторов в ткань растения являются прямое инфицирование ткани растения бактерией АдгоЬас1егшт 1итеГас1епк или совместное культивирование ткани растения с этой бактерией; доставка путем микроинжекции; инъекция ДНК; электропорация и т.п. См., например, НогксР е! а1., 8с1епсе 227:1229 (1985), К1еш е! а1., Вю1есРпо1оду 10:268 (1992) и М1к1 е! а1., Ргосебигек Гог Нгобистд Еоге1дп ΩΝΛ про Р1ап!к, Ме!Робк ίη Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду апб В1о1есРпо1оду, ОРск е! а1. (ебк.), радек 67-88 (СКС Ргекк 1993).
Альтернативно, гены 1Б-22ВА могут быть экспрессированы в прокариотических клетках-хозяевах. Подходящие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов 1Б-22ВА в прокариотических хозяевах, хорошо известны специалистам, и такими промоторами являются промоторы, способные распознавать полимеразы Т4, Т3, 8р6 и Т7; промоторы РК и Ръ бактериофага лямбда, промоторы Рр, гесА, промоторы белков теплового шока, промоторы 1асИУ5, !ас, 1рр-1ас8рг, рРоА и 1ас2 Е.со11, промоторы В. киЬРРк, промоторы бактериофагов Вас111ик, промоторы 81гер1отусек, промотор ίηΐ бактериофага лямбда, промотор Ь1а рВК322 и промотор САТ гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы описаны О11бе, ΐ. 1пб. МюгоЬю1. 1:277 (1987), ХУа1коп е! а1., Мо1еси1аг В1о1оду оГ Не Оепе, 4!Р Еб. (Вещатю Ситттк 1987) и АикиЬе1 е! а1. (1995).
Подходящими прокариотическими хозяевами являются Е.со11 и ВасШик киЬРРк. Подходящими штаммами Е.соР являются ВЬ21(ПЕ3), ВЕ21(ПЕ3)рЬук8, ВЕ21(ПЕ3)рЬукЕ, ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ΌΗ5ΙΕ, 1)1151\1С‘1< РН10В, ОН10В/р3, ΌΗ118, С600, НВ101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, КР1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ЕК1451 и ЕК1647 (см., например, Вго\\'п (еб.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬГах (Асабетю Ргекк 1991)). Подходящими штаммами Вас111ик киЬРбк являются ВК151, ΥВ886, М1119, М1120 и В170 (см., например, Нагбу, ВасШик С1ошпд Ме!Робк, ^NА С1ошпд: А РгасРса1 АрргоасР, О1оуег (еб.) (ШЬ Ргекк 1985)).
При экспрессии полипептида 1Б-22ВА в бактериях, таких как Е.со11, указанный полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, либо он может направляться в периплазматическое пространство секреторной бактериальной последовательностью. В первом случае, клетки лизируют, а гранулы выделяют и денатурируют с использованием, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть подвергнут рефолдингу и димеризации путем разведения денатуратом, например, путем диализа против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона, и последующего диализа против забуференного физиологического раствора. В последнем случае, полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, путем обработки ультразвуком или воздействия осмотическим шоком) с высвобождением содержимого периплазматического пространства и выделением белка, не прибегая к денатурации и рефолдингу.
Методы экспрессии белков в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам (см., например, ХУПбатк е! а1., Ехргеккюп оГ Гоге1дп ргоШпк ίη Е. со11 иктд р1акт1б уесЮгк апб рипйсаРоп оГ кресШс ро1ус1опа1 ап11Ьоб1ек, ^NА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук1етк, 2пб Еб1Роп, С1оуег е! а1. (ебк.), раде 15 (ОхГогб ИшуегкРу Ргекк 1995), ХУагб е! а1., ОепеРс Матри1аРоп апб Ехргеккюп оГ АпРЬоб1ек, Мопос1опа1 АпРЬоб1ек: Ргтс1р1ек апб АррРсаРопк, раде 137 (Убеу-Шк, 1пс. 1995) и Оеогдюи, Ехргеккюп оГ Рго!етк т Вас1епа, Рго1е1п Епдтеегтд: Ргтар1ек апб РгасРсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), раде 101 (1оРп ХУИеу & 8опк, 1пс. 1996)).
Стандартные методы введения экспрессирующих векторов в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений описаны, например, АикиЬе1 (1995).
Общие методы экспрессии и выделения чужеродного белка, продуцируемого клеточной системой млекопитающего, описаны в литературе, например, ЕкРеуеггу, Ехргеккюп оГ Епдтеегеб РгоШпк т МаттаРап Се11 СиРиге, Рго1е1п Епдтееппд: Ргтар1ек апб РгасРсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), радек 163 (ХУбеуЬ1кк, 1пс. 1996). Стандартные методы выделения белка, продуцируемого бактериальной системой, описаны, например, ОРккРаттег е! а1., РипйсаРоп оГ оуег-ргобисеб рго!етк Ггот Е.соР се11к, ^NА С1ошпд 2:
- 21 009026
Ехргеккюп Зук!етк, 2пб Ебйюп, С1оуег е! а1. (ебк.), радек 59-92 (0х£огб Ишуегкйу Ргекк 1995). Разработанные методы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны К1сНагбкоп (еб.), Васи1оу1гик Ехргеккюп Рго!осо1к (ТНе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995).
В качестве альтернативы, полипептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы методами полного твердофазного синтеза, частичного твердофазного синтеза, конденсации фрагмента или классического синтеза в растворе. Такие методы синтеза хорошо известны специалистам (см., например, МеггШе1б 1. Ат. СНет. Зос. 85:2149 (1963), Зге^ай е! а1. Зо11б РНаке РерНбе ЗуЩНекк (2пб Ебйюп), (Р1егсе СНетка1 Со., 1984), Вауег & Карр, СНет. Рер!. Рго!. 3:3 (1986), А(йейоп е! а1., 8оНб РНаке РерНбе 8уп111екк: А РгасНса1 АрргоасН (ШЬ Ргекк, 1989), Е1е1бк & Со1о^юк, 8о11б-РНаке РерНбе ЗупШеяк, Ме!Нобк 1п Епгуто1оду, Уо1. 289 (Асабетк Ргекк 1997) и Ыоуб^ПНатк е! а1., СНетка1 АрргоасНек !о 1Не Зуп!Нек1к о£ Рерйбек апб Рго!етк (СКС Ргекк, 1пс. 1997)). Изменения, вносимые в общие стратегии химического синтеза, такие как природное химическое лигирование и лигирование экспрессированного белка, также являются стандартными (см., например, Эа\\'коп е! а1., 8с1епсе 266:776 (1994), Наскепд е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. δα. И8А 94:7845 (1997), Иа^коп, Ме(йобк ЕпхушоН 287:34 (1994), Мшг е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. Зсй И8А 95:6705 (1998) и 8е\еппо\ & Мшг, 1. Вю1. СНет. 273:16205 (1998)).
Пептиды и полипептиды настоящего изобретения включают по крайней мере 6, по крайней мере 9 или по крайней мере 15 смежных аминокислотных остатков 8ЕО ΙΌ N0:3. В качестве иллюстрации могут служить полипептиды, которые могут содержать по крайней мере 6, по крайней мере 9 или по крайней мере 15 смежных аминокислотных остатков 8Е0 ΙΌ N0:3. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды содержат 20, 30, 40, 50, 100 или более смежных остатков данных аминокислотных последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие пептиды и полипептиды, могут быть использованы в качестве праймеров и зондов для полимеразной цепной реакции.
Кроме того, полипептиды ГЕ-22КА и их фрагменты могут экспрессироваться в высших эукариотических клетках в виде мономеров, гомодимеров, гетеродимеров или мультимеров. Такие клетки могут быть использованы для продуцирования мономерных, гомодимерных, гетеродимерных и мультимерных полипептидов рецептора ГЕ-22КА, которые содержат по крайней мере 1 полипептид ГЕ-22КА (ΙΕ-22Ρ.Λсодержащие рецепторы или полипептиды Ш^КА-содержащих рецепторов), либо они могут быть использованы в качестве аналитических клеток в системах скрининга. В одном из аспектов настоящего изобретения полипептид настоящего изобретения, содержащий внеклеточный домен ГЕ-22КА, продуцируется культивируемой клеткой, и эту клетку используют для скрининга на лиганды для рецептора, включая природный лиганд, ΙΕ-22, а также агонисты и антагонисты природного лиганда. Для систематизации этого подхода, кДНК или ген, кодирующие рецептор, объединяют с другими генетическими элементами, необходимыми для их экспрессии (например, с транскрипционным промотором), и полученный экспрессирующий вектор встраивают в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в различных системах скрининга. Каждый компонент комплекса мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецептора может быть экспрессирован в той же самой клетке. Кроме того, компоненты комплекса мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецептора могут быть также присоединены к трансмембранному домену или к другой мембраносвязанной молекуле, что позволяет осуществлять сборку комплекса и проводить скрининг трансфектантов, описанных выше.
В анализе полипептидов-антагонистов ΙΕ-20 и ΙΕ-22 и антител против ΙΕ-20 и ΙΕ-22 настоящего изобретения, клетками млекопитающих, подходящими для экспрессии ГЕ-22КА-содержащих рецепторов или других рецепторов, которые, как известно, связываются с ΙΕ-20 или ΙΕ-22 (например, клетки, экспрессирующие Ш^КА/СКЕ^Д и Ш^КА, ΙΕ-20ΗΒ, I^-22КА/I^-20КΒ или I^-22КА/I^-20КΒ) и для передачи опосредуемого рецептором сигнала, являются клетки, экспрессирующие другие субъединицы рецептора, которые могут образовывать функциональный комплекс с ГЕ-22КА (или ГЕ-20КА). Эти субъединицы могут включать субъединицы семейства рецепторов интерферонов или рецепторов других цитокинов класса ΙΙ или класса Ι, например, СКЕ2-4 (СепЬапк, рег. № Ζ17227), ГЬ-10К (СепЬапк, рег.№ И00672 и NΜ_001558), Ш^КА (совместный патент США № 5965704), хсу(ог7 (Ш-20КА) (совместный патент США № 5945511), I^-20КА/I^-20КΒ (публикация №Ш0 № А0 01/46232) и Ш-9К. Также предпочтительно использовать клетку, происходящую от организма того вида, в котором экспрессируется данный рецептор. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная клетка зависит от экзогенно вводимого гемопоэтического фактора роста для ее пролиферации. Предпочтительными клеточными линиями этого типа являются человеческая клеточная линия ТЕ-1 (АТСС, № СКЬ-2003) и клеточная линия АМЕ-193 (АТСС, № СКЬ-9589), которые представляют собой СМ-СЗЕ-зависимые клеточные линии человеческого лейкоза и клетки ВаЕ3 (Ра1асюк & З^птеМ Се11 41:727-734, (1985)), которые представляют собой ΙΕ-3-зависимую мышиную пре-В-клеточную линию. Другими клеточными линиями являются клетки ВНК, С0З-1 и СНО. Подходящие клетки-хозяева могут быть сконструированы для продуцирования необходимых субъединиц рецептора и другого клеточного компонента, необходимого для вырабатывания нужного клеточного ответа. Этот подход является предпочтительным, поскольку клеточные линии могут быть сконструированы так, чтобы они экспрессировали субъединицы рецептора, происходящего от организма любого вида, что тем самым позволяет устранить возможные ограничения,
- 22 009026 обусловленные видовой специфичностью. Ортологи кДНК человеческого рецептора, происходящие от организма определенного вида, такого как мышиная кДНК в клеточной линии ВаЕ3, могут быть клонированы и использованы в клеточных линиях, происходящих от организма того же вида. Клеточные линии, зависящие от одного гемопоэтического фактора роста, такого как 6М-С8Е или ΙΣ-3, могут быть сконструированы так, чтобы они зависели от другого цитокина, действие которого опосредуется рецептором 1Ь-22КА, таким как ΙΣ-22.
Клетки, экспрессирующие функциональный рецептор, используются в скрининг-анализах. Ряд подходящих анализов известен специалистам. Эти анализы основаны на детекции биологического ответа в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ на пролиферацию клеток. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствии тестируемого соединения, а клеточную пролиферацию детектируют, например, путем измерения уровня включения меченного тритием тимидина или путем проведения колориметрического анализа на основе метаболического расщепления бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (Μο8таη 1. Iттиηο1. Ме111. 65:55-63, (1983)). Альтернативный анализ предусматривает использование клеток, которые затем конструируют так, чтобы они экспрессировали репортерный ген. Такой репортерный ген присоединяют к промоторному элементу, чувствительному к ассоциированному с данным рецептором пути, и этот анализ позволяет детектировать активацию транскрипции репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом, предназначенным для этой цели, является элемент сывороточного ответа или 8КЕ. См., например, 81ι;·ι\ν е1 а1., Се11 56:563-572 (1989). Предпочтительным репортерным геном является ген люциферазы (бе Ае1 е1 а1., Μο1. Се11. Βίο1. 7:725 (1987)). Экспрессию гена люциферазы детектируют посредством хемилюминисценции методами, известными специалистам (например, Ваитдайпег е1 а1., 1. Βίο1. СНет. 269:29094-29101 (1994); δ^ώοΐΉ & 6ο^ίйη, Рготеда №1ех 41:11, 1993). Наборы для анализа на люциферазную активность являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмой Рготеда Согр., МабХгоп, ΑΙ. Клеточные линии-мишени такого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химических веществ, кондиционированных клетками культуральных сред, грибных бульонов, образцов почвы, проб воды и т.п. Так, например, банк образцов кондиционированных клетками сред может быть проанализирован на клетке-мишени для идентификации клеток, продуцирующих лиганд. Затем позитивные клетки используют для продуцирования библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе млекопитающего, которую разделяют на пулы, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Затем образцы среды трансфицированных клеток анализируют, после чего позитивные клетки разделяют на пулы, и подвергают повторной трансфекции, субкультивированию и повторному анализу для выделения клонированной кДНК, кодирующей лиганд.
Несколько клеточных линий, чувствительных к ΙΣ-20, известны специалистам или они могут быть сконструированы, и такими линиями являются, например, клеточная линия Βаί3/^IΚ81/су!οΚ11 (публикация АГРО № АО 02/072607). Кроме того, известны несколько клеточных линий, чувствительных к Гй22 (^итοиΐ^е^ е! а1., 1. ^ти^Г 164:1814-1819, 2000; Οιιιηοιι^Γ е! а1., Ь. Ргос. №!'1. Асаб. 8сЕ 97:1014410149, 2000; Х1е Μ.Η. е! а1., !Вю1.СЬет 275:31335-31339, 2000; Κο^ώω 8.У. е! а1., 1. Вго1.Сйет. 276:2725-2732, 2001), а также клеточные линии, которые экспрессируют субъединицу ГЙ-22КА рецептора ΙΣ-22. Так, например, клетками, восприимчивыми к ΙΣ-22, являются: ТК-10 (Х1е М.Н. е! а1., см.выше) (человеческая почечная карцинома); 8А480 (АТСС № ССЬ-228) (человеческая аденокарцинома толстой кишки); Нер62 (АТСС № НВ-8065) (человеческая гепатома); РС12 (АТСС № СКЬ-1721) (мышиная модель нервных клеток; крысиная феохромоцитома) и МЕ813 (АТСС № СРЬ-1927) (мышиная почечная мезангиальная клеточная линия). Кроме того, кандидатами на клеточные линии, чувствительные к ΙΣ-22, также являются некоторые клеточные линии, экспрессирующие ГЙ-22КА (рецептор ΙΣ-22): А549 (АТСС № ССЬ-185) (человеческая карцинома легких); 6-361 (АТСС № СРЬ-1424) (человеческая меланома) и Сак1-1 (АТСС № НТВ-46) (человеческая почечная карцинома). Кроме того, могут быть сконструированы клеточные линии, чувствительные к ΙΣ-22, например, описанная здесь клеточная линия Вай/суФКИ/СКЕДЧ (публикация АШО № АО 02/12345). Эти клетки могут быть использованы в анализах на функционирование ГЙ-22КА в качестве антагониста ΙΣ-20 или ΙΣ-22 или противовоспалительного фактора.
Другой метод скрининга, рассматриваемый в настоящем изобретении, предусматривает использование гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды подразделяются на два класса. К первому классу относится полипептид, в котором внутриклеточный домен ГЙ-22КА присоединен к лигандсвязывающему домену второго рецептора. Гибридные рецепторные полипептиды второго класса включают внеклеточный (лигандсвязывающий домен) ГЙ-22КА (8Е6 ΙΌ NО:3), соединенный с внутриклеточным доменом второго рецептора, предпочтительно, гемапоэтического цитокинового рецептора, и трансмембранный домен. Мономеры, гомодимеры, гетеродимеры и мультимеры гибридных рецепторов ГЙ-22КА настоящего изобретения, принадлежащих ко второму классу, экспрессируются в клетках, которые, как известно, восприимчивы к сигналам, передаваемым вторым рецептором. В целом, эти два класса гибридных рецепторов обеспечивают идентификацию восприимчивой клетки и могут быть использованы в целях разработки анализа для детекции ΙΣ-22 или ΙΣ-20. Кроме того, такие клетки могут быть использованы в присутствии ГЙ-22 или ГЙ-20 для обнаружения антагонистов растворимого рецептора на- 23 009026 стоящего изобретения в анализе на конкурентное связывание. В таком анализе снижение степени пролиферации или активности передачи сигнала ГБ-22 или ГБ-20 в присутствии растворимого рецептора настоящего изобретения иллюстрирует антагонистическую активность. Кроме того, анализы на связывание растворимого рецептора кБ^КА., т.е. клеточные анализы, могут быть также использованы для детекции связывания с ΙΕ-22 или ΙΕ-20 или блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации активности ΙΕ-22 или ΙΕ-20.
6. Получение гибридных белков и конъюгатов I^-22КА
Один из основных классов аналогов I^-22КА включает варианты, имеющие аминокислотную последовательность, которая содержит мутацию в описанной здесь аминокислотной последовательности. Другой основной класс аналогов I^-22КА включает антиидиотипические антитела и их фрагменты, описанные ниже. Кроме того, рекомбинантные антитела, содержащие антиидиотипические вариабельные домены, могут быть использованы в качестве аналогов (см., например, МопГагбш1 е! а1., Ргос. Аккос. Ат. Рйукк1ап 108:420 (1996)). Поскольку вариабельные домены антиидиотипических антител против Е22КА имитируют I^-22КА, то эти домены могут обладать I^-22КА-связывающей активностью. Методы продуцирования антиидиотипических каталитических антител известны специалистам (см., например, кгоп е! а1., Апп. КУ. Асаб. 8ск 672:216 (1992), РпЬои1е! е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есЬпо1. 47:229 (1994) и Ауа11е е! а1., Апп. КУ. Асаб. 8οΐ. 864:118 (1998)).
Другим способом идентификации аналогов I^-22КА является использование комбинаторных библиотек. Методы создания и скрининга фагового представления описаны, например, Кау е! а1., РЬаде Όίκр1ау оГ Рерббек апб Рто!етк (Асабетк Ргекк, 1996), Уегбте, патент США № 5783384, Кау е! а1., патент США № 5747334 и КаиГГтап е! а1., патент США № 5723323.
Полипептиды I^-22КА используются как ш у1уо, так и т νίΙΐΌ. Так, например, растворимая форма может быть добавлена в культуральную клеточную среду для ингибирования действия лиганда I^-22КΛ. продуцируемого культивируемыми клетками.
Гибридные белки I^-22КА могут быть использованы для экспрессии I^-22КА в рекомбинантном хозяине и для выделения продуцированного I^-22КА. Как описано ниже, конкретные гибридные белки I^-22КА также используются в диагностике и в терапии. Гибридный белок одного типа содержит пептид, который высвобождает полипептид I^-22КА из рекомбинантной клетки-хозяина. Для направления полипептида I^-22КА по секреторному пути эукариотической клетки-хозяина, в I^-22КАэкспрессирующем векторе присутствует секреторная сигнальная последовательность (также известная как сигнальный пептид, лидерная последовательность, препропоследовательность или препоследовательность). Эта секреторная сигнальная последовательность может происходить от I^-22КА, однако, подходящая сигнальная последовательность может также происходить и от другого секретируемого белка или белка, синтезированного бе поуо. Секреторную сигнальную последовательность функционально присоединяют к I^-22КА-кодирующей последовательности так, чтобы две эти последовательности были соединены с сохранением рамки считывания и были расположены так, чтобы они направляли только что синтезированный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены со стороны 5'-конца по отношению к нуклеотидной последовательно сти, кодирующей нужный полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности могут быть расположены в другом участке представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, \Уе1с11 е! а1., патент США № 5037743; Но11апб е! а1., патент США № 5143830).
Хотя секреторная сигнальная последовательность I^-22КА или другой белок, продуцируемый клетками млекопитающих (например, сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена, описанная, например, в патенте США № 5641655), могут быть использованы для экспрессии I^-22КΛ в рекомбинантных млекопитающих-хозяевах, однако, для экспрессии в дрожжевых клетках предпочтительной является дрожжевая сигнальная последовательность. Примерами подходящих сигнальных последовательностей дрожжей являются последовательности, происходящие от дрожжевого α-фактора феромона, стимулирующего созревание дрожжей (кодируемого геном МРа1), инвертазы (кодируемой геном 8ИС2) или кислотной фосфотазы (кодируемой геном РН05). См., например, Котапок е! а1., Ехртеккюп оГ С1опеб Сепек т Уеак!, ЭХА С1ошпд 2: А Ргас!ка1 АрргоасЬ, 2пб Ебйюп, С1оует апб Натек (ебк.), радек 123-167 (0хГогб Ишуегкйу Ргекк, 1995).
Растворимые рецепторные полинуклеотиды I^-22КА могут быть получены путем экспрессии усеченной ДНК, кодирующей внеклеточный домен, например, полипептид, который содержит 8ЕО ΙΌ N0:3, или соответствующую область нечеловеческого рецептора. При этом предпочтительно, чтобы полипептид этого внеклеточного домена был получен в форме, в основном, не содержащей трансмембранных и внутриклеточных полипептидных сегментов. Для направления экспорта этого рецепторного домена из клетки-хозяина, ДНК рецептора присоединяют ко второму сегменту ДНК, кодирующему секреторный белок, такой как секреторный пептид !-РА. Для облегчения очистки секретированного рецепторного домена может быть осуществлено удлинение С-конца, например, к рецепторному полипептиду могут быть присоединены полигистидиновая метка, вещество Р, пептид Р1ад™ (Норр е! а1., Вю!есйпо1оду 6: 1204-1210 (1988), поставляемый фирмой Еак!тап Кобак Со., №\ν Науеп, СТ), либо другой полипептид
- 24 009026 или белок, который является доступным для антитела или другого специфически связывающегося агента. Кроме того, антигенные эпитопы ГЬ-22КА могут быть получены из внеклеточных цитокинсвязывающих доменов как описано выше.
В альтернативном способе, внеклеточный домен рецептора ГЬ-22КА или другой компонент рецептора цитокина класса I или II может быть экспрессирован в виде гибрида с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно с Рс-фрагментом, который содержит два домена константной области и шарнирную область, но не содержит вариабельной области (см. 81ей/1е\\'8к| А.2. е! а1., патенты США № 6018026 и 5750375). Такими гибридами являются растворимые полипептиды ГЬ-22КА настоящего изобретения. Один из таких гибридов представлен в 8ЕЦ ГО N0:4. Указанные гибриды обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Рс-фрагменты связаны друг с другом дисульфидными связями, а два рецепторных полипептида расположены в непосредственной близости друг от друга. Гибриды этого типа могут быть использованы для аффинной очистки когнатного лиганда из раствора в качестве средства для ш ν 11го анализа, в целях блокирования, ингибирования или уменьшения сигнала ш νίΙΐΌ путем специфического титрования лиганда, и в качестве антагонистов ш νί\Ό путем их парентерального введения для связывания циркулирующего лиганда и его выведения из кровотока. Для очистки лиганда, химеру ГО^КАЧд добавляют в образец, содержащий лиганд (например, в кондиционированную клетками культуральную среду или в экстракты тканей) в условиях, стимулирующих связывание рецептор-лиганд (обычно при температуре, рН и ионной силе, близких к физиологическим параметрам). Затем комплекс химера-лиганд разделяют с помощью смеси с использованием белка А, который иммобилизуют на твердом носителе (например, на нерастворимых полимерных сферах). После этого, лиганд элюируют стандартными химическими методами, например, в солевом или рН-градиенте. Альтернативно, сама химера может быть связана с твердым носителем, при этом, связывание и элюирование осуществляют как описано выше. Эти химеры могут быть использованы ш νί\Ό для регуляции воспалительных ответов, включая ответы острой фазы, такие как продуцирование сывороточного амилоида А (8АА), Среактивного белка (СКР) и т.п. Химеры с высокой аффинностью связывания вводят парентерально (например, внутримышечно, подкожно или внутривенно). Циркулирующие молекулы связываются с лигандом и выводятся из кровотока в соответствии с нормальным физиологическим процессом. Для применения в анализах эти химеры связывают с носителем посредством Рс-области и используют в анализе формата ЕЫ8А.
Для облегчения выделения анти-ГО^КА антитела и связывающих партнеров настоящего изобретения может быть преимущественно применен анализ, в котором используется лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один из членов пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступное биосенсорное устройство (Высоте, Рйагтааа Вюкепког, Р18са!а^ау, N1). Такой рецептор, антитело, компонент пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного чипа. Применение этого устройства описано Кагккоп, I. Iттипо1. Мейюйк 145:229-40, 1991 и Сипшпдйат & ^е11к, I. Мо1. Вю1. 234:554-63, 1993. Рецептор, антитело, компонент или фрагмент ковалентно связывают с использованием амина или сульфгидрила с декстрановыми волокнами, которые присоединяют к золотой пленке в проточной кювете. Затем через эту кювету пропускают тестируемый образец. Если лиганд, эпитоп или компонент-партнер пары комплемент/антикомплемент присутствуют в образце, то они будут связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или партнером, соответственно, что будет приводить к изменению индекса преломления среды, который детектируется по изменению поверхностного плазмонного резонанса золотой пленки. Эта система позволяет определить константу ассоциации и диссоциации, исходя из которой может быть вычислена аффинность связывания. Альтернативно, связывание лиганд/рецептор может быть проанализировано методом ЗЕЬПЦТМ) (С1рйегдеп, Бчс. Ра1о А1!о, СА). Кроме того, для того, чтобы определить, связываются ли различные моноклональные антитела с одними и теми же или с различными эпитопами на полипептиде ГО22КА, в экспериментах на конкурентное связывание может быть использована программа ВIАС0КЕ, описанная выше, и такая программа применяется для облегчения картирования эпитопов нейтрализующих антител настоящего изобретения, которые связываются с одним ГО-22 или с обоими ГО-20 и ГО-22, или блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность.
Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других аналитических системах, известных специалистам. Такими системами являются анализ Скэтчарда для определения аффинности связывания (см. 8са!сйагй, Апп. NΥ Асай. 8ск 51:660-72, 1949) и калориметрические анализы (Сипшпдйат е! а1., 8аепсе 253:545-48, 1991; Сипшпдйат е! а1., 8аепсе 245:821-25, 1991).
Настоящее изобретение также относится к различным другим полипептидным гибридам и к родственным мультимерным белкам, содержащим один или несколько полипептидных гибридов. Так, например, растворимый рецептор ГО-22КА может быть получен в виде гибрида с димеризующим белком, как описано в патентах США № 5155027 и 5567584. Для этих целей предпочтительными димеризующими белками являются домены константной области иммуноглобулина, например, ^Ογ1, и легкой к-цепи иммуноглобулина человека. Гибриды иммуноглобулин - растворимый ГЕ-22КА может быть экспрессирован в генетически сконструированных клетках для продуцирования различных мультимерных аналогов рецептора ГО-22КА.. К растворимому рецептору ГО-22КА могут быть присоединены вспомогательные
- 25 009026 домены для их нацеливания на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген или клетки, экспрессирующие 1Ь-22КА-лиганды, Ι6-22 или Ι6-20). Полипептид 1Й-22КА может быть присоединен к двум или более молекулам, таким как аффинная метка для очистки и нацеливающий домен. Полипептидные гибриды могут также содержать один или несколько рестрикционных сайтов, в частности, сайтов, расположенных между доменами. См. Тиап е! а1., Соппесбуе Т1ккие Кекеагсб 34:1-9, 1996.
В бактериальных клетках часто бывает желательным экспрессировать гетерологичный белок в качестве гибридного белка для снижения токсичности, повышения стабильности и увеличения выхода экспремированного белка. Так, например, 1Й-22КА может экспрессироваться в виде гибридного белка, содержащего полипептид глутатион-8-трансферазы. Гибридные белки глутатион-8-трансферазы обычно являются растворимыми и легко удаляются из лизатов Е.сой на колонках с иммобилизованным глутатионом. В аналогичных методах, гибридный белок 1Ь-22КА, содержащий полипептид белка, связывающегося с мальтозой, может быть выделен на колонке с амилозной смолой, а гибридный белок, содержащий С-конец усеченного белка А, может быть выделен с использованием 1дС-сефарозы. Разработанные методы экспрессии гетерологичного полипептида, используемого в бактериальной клетке в качестве гибридного белка, описаны, например, №ббатк е! а1., Ехргеккюп оГ Рогещп Рго!ешк т Е.сой Икшд Р1акт1б Уес!огк апб Ршгйсабоп оГ 8рес1йс Ро1ус1опа1 АпбЬоб1ек, ЭХА С1ошпд 2: А Ргасбса1 Арргоасб, 2пб Ебйюп, С1оуег & Натек (Ебк.), раде к 15-58 (0хГогб ищуегкйу Ргекк, 1995). Кроме того, могут быть использованы коммерчески доступные экспрессионные системы. Так, например, система очистки белка Ха, РЮТ0ЮТ (Рготеда Согрогабоп; Маб1коп, XVI) позволяет осуществлять выделение гибридного белка, содержащего полипептид, который в процессе экспрессии становится биотинилированным смолой, содержащей авидин.
Пептидными метками, которые могут быть использованы для выделения гетерологичных полипептидов, экспрессированных либо прокариотическими, либо эукариотическими клетками, являются полигистидиновые метки (которые обладают аффинностью к смоле, образующей хелатные комплексы с никелем), метки с-тус, белок, связывающийся с кальмодулином (выделенный с помощью аффинной хроматографии на кальмодулине), вещество Р, метка ΚΥΙΚ8 (которая связывается с антителами против ΚΥΙΚ8), метка С1и-С1и и метка РЬАС (которая связывается с антителами против РЬАС). См., например, Ьио е! а1., Агсй Вюсбет. Вюрбук. 329:215 (1996), Могдапб е! а1., Вю!есбпо1. Арр1. Вюсбет. 23:67 (1996) и 2Непд е! а1., Сепе 186:55 (1997). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие пептидные метки, поставляются, например, фирмой 81дта-А1бпсб Согрогабоп (8!. Ьошк, МО).
Другая форма гибридного белка содержит полипептид 1Й-22КА и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Рс-фрагмент, который содержит два или три домена константной области и шарнирную область, но не содержит вариабельной области. В качестве иллюстрации можно указать на патент США № 5723125, Сбапд е! а1., где описан гибридный белок, содержащий человеческий интерферон и Рс-фрагмент человеческого иммуноглобулина. С-конец интерферона присоединен к №концу Рсфрагмента пептидным линкером. Примером пептидного линкера является пептид, содержащий, главным образом, Т-клеточную последовательность, которая является иммунологически инертной. Репрезентативный пептидный линкер имеет следующую аминокислотную последовательность: СС8СС 8СССС 8СССС 8 (8Е0 ГО N0:9). В этом гибридном белке репрезентативным Рс-фрагментом является у4-цепь человеческого иммуноглобулина, которая остается стабильной в растворе и имеет незначительную комплемент-активирующую активность или вообще не имеет такой активности. В соответствии с этим в настоящем изобретении рассматривается гибридный белок 1Ь-22КА, содержащий молекулу 1Й-22КА и человеческий Рс-фрагмент, где С-конец данной молекулы 1Й-22КА присоединены к №концу Рс-фрагмента пептидным линкером, таким как пептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0:4. 1Ь-22КА-часть может представлять собой молекулу 1Й-22КА или ее фрагмент. Так, например, гибридный белок может содержать аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0:3 и Рс-фрагмент (например, Рс-фрагмент человеческого иммуноглобулина) (8Еф ГО N0:4).
В другом варианте изобретения гибридный белок 1Й-22КА содержит последовательность 1дС; молекулу 1Й-22КА, ковалентно связанную с амино-концом последовательности 1дС; и сигнальный пептид, ковалентно связанный с амино-концом 1Ь-22КА-части, где последовательность 1дС состоит из следующих элементов в указанном порядке: шарнирной области, СН2-домена и СН3-домена. В соответствии с этим последовательность 1дС не содержит СН1-домена. 16-226А-часть обнаруживает описанную здесь активность 1Ь-22КА, например, способность связываться с лигандом 1Й-22КА. Этот общий метод продуцирования гибридных белков, содержащих антитело и части, не принадлежащие антителу, описан ЬаКосбе11е е! а1., ЕР 742830 (№0 95/21258).
Гибридные белки, содержащие 1Ь-22КА-часть и Рс-фрагмент, могут быть использованы, например, как средство для ш У1бо-анализа. Так, например, присутствие лиганда 1Й-22КА в биологическом образце может быть детектировано с использованием гибридного белка 1Ь-22КА-иммуноглобулин, в котором 1Ь-22КА-часть используются для связывания с лигандом, а макромолекула, такая как белок А или антиРс антитело, используется для связывания гибридного белка с твердым носителем. Такие системы могут быть использованы для идентификации агонистов и антагонистов, которые препятствуют связыванию
- 26 009026 лигандов 1Ь-22КА, например, 1Ь-22 или оба 1Ь-20 и 1Ь-22 с их рецептором.
Другими примерами гибридных белков антител являются полипептиды, содержащие антигенсвязывающий домен и фрагмент 1Ь-22КА, содержащий внеклеточный домен 1Ь-22КА. Такие молекулы могут быть использованы для доставки в конкретные ткани в целях создания благоприятных условий реализации 1Ь-22КА.-связывающей активности.
Настоящее изобретение также относится к различным другим полипептидным гибридам. Так, например, часть домена или весь домен, сообщающий биологическую функцию и находящийся в 1Г-22КА настоящего изобретения, может быть заменен функционально эквивалентным(и) доменом(ами), взятого(ых) от другого члена семейства цитокиновых рецепторов. Полипептидные гибриды могут экспрессироваться в рекомбинантных клетках-хозяевах с продуцированием ряда гибридных аналогов 1Ь-22КА. Полипептид 1Г-22КА может быть соединен с двумя или более молекулами или доменами, такими как аффинная метка для очистки и домен, обеспечивающий доставку. Полипептидные гибриды могут также содержать один или несколько рестрикционных сайтов, а в частности, сайтов, расположенных между доменами. См., например, Тиап е1 а1., Соппесйуе Т1ззие Кезеагсй 34:1 (1996).
Гибридные белки могут быть получены методами известными специалистам, путем продуцирования каждого компонента гибридного белка или их химического конъюгирования. Альтернативно, полипептид, кодирующий оба компонента гибридного белка в соответствующей рамке считывания, может быть продуцирован известными методами и экспрессирован описанными здесь методами. Общие методы ферментативного и химического расщепления гибридных белков описаны, например, АизиЬе1 (1995), радез 16-19-16-25.
1Ь-22КА.-связывающие домены могут быть дополнительно охарактеризованы путем физического анализа структуры, определенной такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение в комбинации с мутацией аминокислот агонистов лиганда 1Ь-22КА в предполагаемом сайте контактирования. См., например, бе Уоз е1 а1., 8аепсе 255:306 (1992), 811111Ι1 е1 а1., I Мо1. Вю1. 224:899 (1992) и \\'1ос1а\ег е1 а1., ГЕВ8 Ьей. 309:59 (1992).
В настоящем изобретении также рассматриваются химически модифицированные композиции 1Ь22КА, в которых полипептид 1Ь-22КА связан с полимером. Репрезентативными полипептидами 1Ь-22КА. являются растворимые полипептиды, не содержащие функциональный трансмембранный домен, такие как полипептид, состоящий из аминокислотных остатков 8Еф ГО N0:3. Обычно, полимер является водорастворимым, так что конъюгат 1Ь-22КА не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером подходящего полимера является полимер, который был модифицирован так, чтобы он содержал одну реакционноспособную группу, такую как активированный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования. Таким образом, степень полимеризации может регулироваться. Примером реакционноспособного альдегида является пропиональдегид полиэтиленгликоля или его моно(С1С10)алкокси-, или арилокси-производные (см., например, Натз е1 а1., патент США № 5252714). Такой полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Кроме того, смесь полимеров может быть использована для получения конъюгатов 1Ь-22КА..
Конъюгаты 1Ь-22КА, используемые в терапии, могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные группы. Подходящими водорастворимыми полимерами являются полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно(С1-С10)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, полиЩвинилпирролидон)ПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, ПЭГ-пропиональдегид, бис-сукцинимидилкарбонатПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлоза или другие полимеры на основе углеводов. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу в пределах примерно от 600 до 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат 1Ь-22КА. может также содержать смесь указанных водорастворимых полимеров.
Один из примеров конъюгата 1Ь-22КА. содержит 1Г-22КА-часть и полиалкилоксидную часть, присоединенную к Оконцу молекулы 1Ь-22КА. Одним из подходящих полиалкилоксидов является ПЭГ. Репрезентативным примером является 1Ь-22КА, который может быть модифицирован методом присоединения ПЭГ, известным как ПЭГилирование. ПЭГилирование 1Г-22КА может быть осуществлено проведением любой из реакций ПЭГилирования, известных специалистам (см., например, ЕР 0154316, Эе1дабо е1 а1., Спйса1 Кеу1е^з ш Тйегареийс Эгид Сатег 8уз1ешз 9:249 (1992), Эппсам & 8ргеайсо, С1т. РйагтасоктеГ 27:290 (1994) и Ггапаз е1 а1., 1п1. 1. НетаЮ1. 68:1 (1998)). Так, например, ПЭГилирование может быть осуществлено проведением реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. В альтернативном методе, конъюгаты 1Ь-22КА получают путем конденсации активированного ПЭГ, в котором концевая гидрокси- или аминогруппа ПЭГ заменена активированным линкером (см., например, 1<агаз1е\\'1сх е1 а1., патент США № 5382657).
Для осуществления ПЭГилирования путем ацилирования необходимо проведение реакции активированного эфирного производного ПЭГ с полипептидом 1Г-22КА. Примером активированного сложного эфира ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный №гидроксисукцинимидом. Используемый здесь термин ацилирование включает взаимодействие между 1Ь-22КА и водорастворимым полимером посредством амидного, карбаматного, уретанового связывания и т.п. Методы получения ПЭГилированного 1Г-22КА
- 27 009026 путем ацилирования обычно включают стадии (а) реакции взаимодействия полипептида 1Б-22КА с ПЭГ (таким как реакционноспособный эфир альдегидного производного ПЭГ) в условиях, при которых одна или несколько групп ПЭГ присоединяется к 1Б-22КА, и (Ь) получения реакционного(ых) продукта(ов). В общих чертах, оптимальные реакционные условия, необходимые для проведения реакций ацилирования, могут быть определены исходя из известных параметров и нужных результатов. Так, например, чем больше отношение ПЭГ :1Ь-22КА, тем больше процент поли-ПЭГилированного продукта Ш-22КА.
Продукт ПЭГилирования, осуществляемого путем ацилирования, обычно представляет собой полиПЭГилированный продукт Ш-22КА, где ε-аминогруппы лизина ПЭГилированы посредством ацильной линкерной группы. Примером такой связывающей группы является амид. Обычно, полученный Ш-22КА является по крайней мере на 95% моно-, ди- или три-ПЭГилированным, хотя, в зависимости от реакционных условий, могут быть получены некоторые молекулы, имеющие более высокую степень ПЭГилирования. ПЭГилированные молекулы могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов 1Ь22КА стандартными методами очистки, такими как диализ, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.п.
ПЭГилирование, проводимое посредством алкилирования, обычно предусматривает осуществление реакции концевого альдегидного производного ПЭГ с Ш-22КА в присутствии восстановителя. Группы ПЭГ могут быть присоединены к полипептиду посредством группы -СЩ-ΝΗ.
Кроме того, антитела против 1Б-22КА настоящего изобретения или их фрагменты могут быть ПЭГилированы методами, известными специалистам, и методами, описанными здесь.
Для дериватизации, проводимой посредством восстановительного алкилирования с получением моноПЭГилированного продукта, необходимо присутствие различных типов первичных аминогрупп, подходящих для дериватизации и обладающих различной реакционной способностью. Обычно, такую реакцию проводят при рН, который позволяет использовать разность между рКа ε-аминогрупп лизиновых остатков и α-аминогрупп Ν-концевого остатка данного белка. Посредством такой селективной дериватизации можно регулировать присоединение водорастворимого полимера, содержащего реакционноспособную группу, такую как альдегид, к белку. Конъюгирование с полимером происходит преимущественно у Ν-конца белка без какой-либо значительной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. Настоящее изобретение относится к получению, в основном, гомогенного препарата монополимерных конъюгатов Ш-22КА.
Восстановительное алкилирование для продуцирования, в основном, гомогенной популяции молекул конъюгата монополимерного 1Б-22КА может включать стадии: (а) взаимодействия полипептида 1Ь22КА с реакционноспособным ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, подходящем для селективной модификации α-аминогруппы у амино-конца Ш-22КА, и (Ь) получения реакционного(ых) продукта(ов). Восстановитель, используемый для восстановительного алкилирования, должен быть стабильным в водном растворе и должен обладать способностью к восстановлению Шиффова основания, образующегося только в начальном процессе восстановительного алкилирования. Репрезентативными восстановителями являются борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламиноборан, триметиламиноборан и пиридинборан.
Для, в основном, гомогенной популяции монополимерных конъюгатов Ш-22КА, условиями реакции восстановительного алкилирования являются условия, позволяющие осуществлять селективное присоединение водорастворимой полимерной части к Ν-концу Ш-22КА. Такие реакционные условия, в основном, предусматривают использование разности между рКа ε-аминогрупп лизина и α-аминогруппы у Ν-конца. рН также влияет на отношение полимер: белок. В основном, при более низком рН желательно использовать большее количество полимера по отношению к белку, поскольку чем меньше реакционная способность Ν-концевой α-группы, то большее количество полимера требуется для достижения оптимальных условий. При более высоком рН не требуется большого отношения полимер:Ш-22КА, поскольку, в этом случае, имеется большее число реакционноспособных групп. Обычно рН находится в пределах от 3 до 9 или от 3 до 6. Этот метод может быть использован для получения Ш-22КА-содержащих конъюгатов гомодимерного, гетеродимерного или мультимерного растворимого рецептора.
Другим фактором, необходимым для рассмотрения, является молекулярная масса водорастворимого полимера. В общих чертах, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньшее число полимерных молекул могут быть присоединены к белку. Для проведения реакций ПЭГилирования типичная молекулярная масса составляет в пределах примерно от 2 до 100 кДа, примерно от 5 до 50 кДа, или примерно от 12 до 25 кДа. Молярное отношение водорастворимый полимер:1Ь-22КА обычно составляет в пределах от 1:1 до 100:1. Обычно, для полиПЭГилирования, молярное отношение водорастворимый полимер:Ш22КА составляет от 1:1 до 20:1, а для полиПЭГилирования оно составляет от 1:1 до 5:1.
Общие методы продуцирования конъюгатов, содержащих полипептид и водорастворимые полимерные части, известны специалистам. См., например, 1<агак1е\\'1сх е! а1., патент США № 5382657, 6гееита1б е! а1., патент США № 5738846, №еГог111 е! а1., С1т. Рйагтасо1. ТНег. 59:636 (1996), МоикагкН е! а1., Аиа1. ВюсНет. 247:434 (1997)). Этот метод может быть использован для получения Ш-22КАсодержащих конъюгатов гомодимерного, гетеродимерного или мультимерного растворимого рецептора.
- 28 009026
В настоящем изобретении рассматриваются композиции, содержащие пептид и полипептид, такие как описанные здесь растворимый рецептор или антитело. Эти композиции могут также содержать носитель. Таким носителем может быть стандартный органический или неорганический носитель. Примерами таких носителей являются вода, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло и т.п.
7. Выделение полипептидов 1Ь-22КА
Полипептиды настоящего изобретения могут быть очищены от загрязняющих макромолекул, а в частности, от других белков и нуклеиновых кислот и от инфекционных и пирогенных агентов до уровня чистоты, составляющего примерно по крайней мере 80%, примерно по крайней мере 90%, примерно по крайней мере 95% или более чем 95%, например 96, 97, 98% или более чем 99%. Полипептиды настоящего изобретения могут быть также очищены до фармацевтической чистоты, составляющей более чем 99,9%. В некоторых препаратах очищенный полипептид, в основном, не содержит других полипептидов, а в частности, других полипептидов животного происхождения.
Для получения препаратов 1Ь-22КА, выделенных из природных источников (например, из ткани человека), синтетических полипептидов 1Ь-22КА, рекомбинантных полипептидов 1Ь-22КА и гибридных полипептидов 1Ь-22КА, выделенных из рекомбинантных клеток-хозяев, могут быть применены методы фракционирования и/или стандартной очистки. В общих чертах, для фракционирования образцов может быть использована преципитация сульфатом аммония и экстракция кислотой или хаотропом. Репрезентативными стадиями очистки могут быть хроматография на гидроксиапатитах, эксклюзионная хроматография, жидкостная экспресс-хроматография белков (ЖЭХБ) и обращенно-фазовая жидкостная высокоэффективная хроматография. Подходящими хроматографическими средами являются дериватизированные декстраны, агароза, целлюлоза, полиакриламид, двуокись кремния для специального применения и т.п. Подходящими также являются РЕ1-, ΌΕΆΕ-, ЦАЕ- и Ц-производные. Репрезентативными хроматографическими средами являются среды, дериватизированные фенильными, бутильными или октильными группами, такие как фенил-сефароза ЕЕ (РНагтааа), Тоуореаг1Ьи1у1 650 (Токо, Наак, Моп!дотегууН1е, РА), октилсефароза (РНагтааа) и т.п., или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсНгот СС 71 (Токо Наак) и т.п. Подходящими твердыми носителями являются стеклянные сферы, смолы на основе двуокиси кремния, целлюлозные смолы, агарозные сферы, перекрестно-сшитые агарозные сферы, полистироловые сферы, перекрестно-сшитые полиакриламидные смолы и т. п., которые являются нерастворимыми в используемых условиях. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, которые позволяют присоединять белки посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных групп.
Примерами химического связывания являются активация бромцианом, активация Νгидроксисукцинимидом, активация эпоксидом, активация сульфгидрилом, активация гидразидом и использование карбоксильных и амино-производных для карбодиимидного связывания. Эти и другие твердые среды хорошо известны, широко используются специалистами и являются коммерчески доступными. Выбор конкретного метода выделения и очистки полипептидов может быть осуществлен путем рутинного экспериментирования и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например, АГПп11у СНгота!одгарНу: Ргтар1ек & Ме!Нобк (РНагтааа ЬКВ Вю!есНпо1оду 1988) и Эоопап, Рго!ет Риг1НсаНоп Рго!осо1к (ТНе Нитапа Ргекк, 1996).
Любой специалист может самостоятельно разработать другие различные способы выделения и очистки 1Ь-22КА. Так, например, анти-1Ь-22КА антитела, полученные как описано ниже, могут быть использованы для выделения больших количеств белка методом иммуноаффинной очистки.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть также выделены исходя из их конкретных свойств. Так, например, для очистки богатых гистидином белков, включая белки, содержащие полигистидиновые метки, может быть использована адсорбционная хроматография с иммобилизованным ионом металла (1МАС). Вкратце, на гель сначала загружают ионы двухвалентного металла и получают хелатный комплекс (8и1ко\\'ккг Тгепбк ш ВюсНет. 3:1 (1985)). Богатые гистидином белки адсорбируются на этой матрице с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и элюируются путем конкурентного элюирования, снижения рН или использования сильных хелатообразующих агентов. Другими методами очистки являются очистка гликозилированных белков путем проведения аффинной хроматографии на лектине и ионообменной хроматографии (М. ЭеШксНег (еб.), Ме!Н. ЕпхушоН 182:529 (1990)). В других вариантах осуществления изобретения, для облегчения очистки может быть сконструирован гибрид представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, белка, связывающегося с мальтозой, домена иммуноглобулина).
Кроме того, лигандсвязывающие свойства внеклеточного домена 1Ь-22КА могут быть использованы для очистки, например, 1Ь-22КА-содержащих растворимых рецепторов, например, путем проведения аффинной хроматографии, где лиганд 1Ь-22 связывают с колонкой, с которым впоследствии связывается 1Ь-22КА-содержащий рецептор, а затем этот рецептор элюируют стандартными хроматографическими методами.
Полипептиды 1Ь-22КА или их фрагменты могут быть также получены методами химического синтеза, как описано выше. Полипептиды 1Ь-22КА могут быть мономерными или мультимерными, гликози
- 29 009026 лированными или негликозилированными; ПЭГилированными или неПЭГилированными, и могут включать, а могут и не включать, исходный метиониновый аминокислотный остаток.
8. Получение антител против белков Ш^КА
Антитела против Ш^КА могут быть получены, например, с использованием продукта ГЕ^КАэкспрессирующего вектора или Ш^КА, выделенного из природного источника в качестве антигена. В частности, используемые антитела против Ш^КА специфически связываются с Ш^КА. Считается, что антитела специфически связываются в том случае, если они обладают по крайней мере одним из нижеследующих двух свойств: (1) способностью связываться с Ш^КА с пороговым уровнем связывающей активности и (2) неспособностью к значительному перекрестному взаимодействию с полипептидами, родственными полипептиду I^-22КА.
Что касается первого свойства, то считается, что антитела специфически связываются в том случае, если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом с аффинностью связывания (Ка)
106 М-1 или более, предпочтительно 107 М-1 или более; более предпочтительно 108 М-1 или более; а наиболее предпочтительно 109 М-1 или более. Аффинность связывания антитела может быть легко определена любым специалистом, например, путем анализа Скэтчарда (Бса!сйагй, Аии. NΥ Асай. Бсг 51:660, 1949). Что касается второго свойства, то считается, что антитела неспособны к значительному перекрестному взаимодействию с родственными полипептидными молекулами, если, например, в стандартном Вестерн-блот-анализе, эти антитела позволяют обнаруживать полипептид I^-22КА, но не позволяют обнаруживать известные полипептиды. Примерами известных родственных полипептидов являются известные цитокиновые рецепторы.
Анти-I^-22КΛ антитела могут быть получены с использованием антигенных пептидов и полипептидов, несущих эпитоп I^-22КΛ. Антигенные пептиды и полипептиды настоящего изобретения, несущие антигенный эпитоп, содержат последовательность, состоящую по крайней мере из 9 или из примерно 1530 аминокислот, находящихся в БЕЦ ΙΌ N0:3 или в другой описанной здесь аминокислотной последовательности. Однако для индуцирования антител, которые связываются с I^-22КΛ, могут быть использованы пептиды или полипептиды, содержащие более крупную часть аминокислотной последовательности настоящего изобретения, состоящую из 30-50 аминокислот, или последовательность любой длины, включая полноразмерную аминокислотную последовательность полипептида настоящего изобретения. При этом, желательно, чтобы аминокислотная последовательность эпитоп-несущего пептида была выбрана так, чтобы он, в основном, растворялся в водных растворителях (т. е. эта последовательность должна включать относительно гидрофильные остатки, а гидрофобные остатки должны, в основном, отсутствовать). Кроме того, для продуцирования антитела может также оказаться желательным, чтобы аминокислотные последовательности содержали пролиновые остатки.
В качестве примера можно отметить, что возможные антигенные сайты в I^-22КΛ были идентифицированы методом Джеймсона-Вольфа (1атекои & Vо1Г, САВЮБ 4:181 (1988)), осуществляемым с помощью программы РК0ТЕАN (тегкюи 3.14) ЬАБЕКСЕХЕ (^NАБТΛК; Май1кои, νΙ). В этом анализе были использованы параметры по умолчанию.
Метод Джеймсона-Вольфа позволяет предсказать потенциальные антигенные детерминанты путем комбинирования шести главных подпрограмм для структурного предсказания белков. Вкратце, для идентификации аминокислотных последовательностей, представляющих области с наибольшей локальной гидрофильностью (параметр: семь усредненных остатков), сначала был использован метод Хоппа-Вудса (Норр е! а1., Ргос. №!'1. Асай. Бсг ИБА 78:3824 (1981)). Во второй стадии был использован метод Эмини (Ет1ш е! а1., 1. У1го1оду 55:836 (1985)) для подсчета поверхностной вероятности (параметр: порог поверхностного разрешения (0,6)=1). В третьей стадии был использован метод Карплуса-Шульца (Кагр1ик & Бс1и.111х. №!игтккеиксйаГ!еи 72:212 (1985)) для предсказания гибкости цепи остова (параметр: порог гибкости (0,2)=1). В четвертой и пятой стадиях анализа предсказания вторичной структуры были применены к указанным данным с использованием методов Чу-Фасмана (С1ои Ргейю!юи оГ Рго!ет Б!гис!ига1 С1аккек Ггот Атто Ас1й Сотрокйюи, Ргейю!юи оГ Рго!ет Б!гис!иге аий !1е Рпис1р1ек оГ Рго!ет СоиГогтайои, Еактаи (ей.), радек 549-586 (Р1еиит Ргекк 1990) и Гарнье-Робсона (Сагшег е! а1., 1. Мо1. Вю1. 120:97 (1978)) (параметры Чу-Фасмана: конформационная таблица=64 белка, порог а-области=103; порог βобласти=105; параметры Гарнье-Робсона: константы разрешения α и β=0). В шестой подпрограмме, параметры гибкости и факторы гидрофобности и гидрофильности/доступности растворителя были объединены для определения показателя контура поверхности, называемого индексом антигенности. И наконец, к индексу антигенности была применена функция расширения пика, что позволяет расширять главные поверхности пики путем добавления 20, 40, 60 или 80% величины соответствующего пика для подсчета дополнительной свободной энергии, высвобождаемой в результате подвижности областей поверхности по отношению к внутренним областям. Однако эти вычисления не применимы ни к одному из главных пиков, которые присутствуют в спиральной области, поскольку спиральные области имеют тенденцию к меньшему сохранению гибкости.
Результаты этого анализа показали, что нижеследующие аминокислотные последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3 должны составлять подходящие антигенные пептиды и для определения тех областей в БЕЦ ΙΌ
- 30 009026
N0:3, которые имеют наибольший антигенный потенциал, могут быть использованы профили гидрофильности Хоппа/Вуда (Норр е! а1., Ргос. Асаб. 8а. 78:3824-3828, 1981; Норр 1. 1ттии. Ме!й. 88:118, 1986 и Тпс.|шег е! а1., Рго!еш Еидшеегшд 11:153-169, 1998). Этот профиль характеризуется скользящим окном из шести остатков. Скрытые остатки С, 8 и Т и открытые остатки Н, Υ и V не учитывались. Кроме того, антигенные эпитопы 1Ь-22КА в 8Е0 ΙΌ N0:3, предсказанные по кривой Джеймсона-Вольфа, например, с использованием программы ^NΑ8ТΑК Рго!еаи (^NΑ8ТΑК, 1ис., Маб1зои, VI), являются предпочтительными антигенными эпитопами и могут быть определены любым специалистом. Такие антигенные эпитопы включают:
(1) аминокислотные остатки 1 (Рго) - 6 (Азр) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(2) аминокислотные остатки 26 (8ег) - 32 (Рго) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(3) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) - 47 (Азр) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(4) аминокислотные остатки 49 (Уа1) - 62 (Суз) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(5) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) - 62 (Суз) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(6) аминокислотные остатки 84 (А1а) - 97 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(7) аминокислотные остатки 103 (Тйг) - 108 (Азр) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(8) аминокислотные остатки 130 (Агд) - 135 (Н1з) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(9) аминокислотные остатки 164 (С1у) - 166 (Ьуз) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(10) аминокислотные остатки 175 (Туг) - 179 (С1и) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(11) аминокислотные остатки 193 (Ьуз) - 196 (А1а) 8Е0 ΙΌ N0:3;
(12) аминокислотные остатки 203 (Ьуз) - 209 (Тйг) 8Е0 ΙΌ N0:3.
В настоящем изобретении рассматривается использование любого из антигенных пептидов 1-12 для продуцирования антител против ГЬ-22КА или в качестве средства для скрининга или идентификации нейтрализующих моноклональных антител настоящего изобретения. В настоящем изобретении также рассматриваются полипептиды, содержащие по крайней мере один из антигенных пептидов 1-10. В настоящем изобретении рассматривается использование любого из описанных здесь антигенных пептидов или эпитопов для продуцирования антител против ГБ-22КА, а также для идентификации и скрининга анти-ГЬ^КА моноклональных антител, которые являются нейтрализующими и которые могут связываться с Ш-22 и Ι№-20 (с одним из них или с обоими), или блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать их активность.
Кроме того, подходящими антигенами также являются полипептиды ГО^КА, содержащие сайт связывания ГО^КА с цитокином или описанный выше внеклеточный домен в комбинации с другим внеклеточным доменом цитокина класса Ι или ΙΙ, таким как домен, который образует растворимые гетеродимерные или мультимерные полипептиды Ш^КА, такие как растворимый ^-22)^^0^2-4, №22КА/хсу1ог11. Ш^КА/хсуЮ!·? и т.п.
Поликлональные антитела против рекомбинантного белка ГО^КА или против ЕБ^КА, выделенного из природных источников, могут быть получены методами, хорошо известными специалистам. См., например, Сгееи е! а1., Ргобисйои оГ Ро1ус1оиа1 Аийзега, Iттиηοсйет^са1 Рго!осо1з (Маизои, еб.), радез 1-5 (Нитаиа Ргезз 1992) и νίΠίππ^ е! а1. Ехргеззюи оГ Гоге1ди рго!ешз ш Е.сой изшд р1азт1б уес!огз аиб рипДса!юи оГ зресШс ро1ус1оиа1 аи!1Ьоб1ез, ^NΑ С1ошид 2: Ехргеззюи 8уз!етз, 2иб Ебйюи, С1оуег е! а1. (ебз.), раде 15 (0хГогб Ьшуегзйу Ргезз 1995). Иммуногенность полипептида №-22^ может быть увеличена с использованием адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептидами, подходящими для иммунизации, также являются гибридные полипептиды, такие как гибриды ЕБ-22КА или их части с полипептидом иммуноглобулина или с белком, связывающимся с мальтозой. Полипептидным иммуногеном может быть полноразмерная молекула или ее часть. Если полипептидная часть является гаптеноподобной, то такая часть может быть предпочтительно присоединена к макромолекулярному носителю (такому как гемоцианин лимфы улитки (КЬН), альбумин бычьей сыворотки (В8А) или токсоид столбняка) или связана с ним в целях иммунизации.
Хотя поликлональные антитела обычно вырабатываются у животных, таких как лошади, коровы, собаки, куры, крысы, мыши, кролики, морские свинки, козы или овцы, однако, анти-I^-22КΑ антитело настоящего изобретения может также происходить от антитела человекообразной обезьяны. Описание общих методов продуцирования диагностически и терапевтически ценных антител у павианов можно найти, например, в международной патентной публикации ν0 91/11465, Со1беиЬегд е! а1., и Ьозтаи е! а1. №!. 1. Саисег 46:310 (1990).
Альтернативно, могут быть продуцированы моноклональные анти-ЕЬ-22КА антитела. Моноклональные антитела против специфических антигенов у грызунов могут быть получены известными методами (см., например, КоЫег е! а1., №1Шге 256:495 (1975), Сойдаи е! а1., (ебз.), Сиггеи! Рго!осо1з ш Iттиио1оду, Уо1. 1, радез 2.5.1-2.6.7 (1ойи νίΕν & 8оиз 1991)[Со11даи], Рюкз1еу е! а1., Ргобис!юи оГ тоиос1оиа1 аийЬоб1ез адашз! рго!ешз ехргеззеб ш Е.соН ^NΑ С1ошид 2: Ехргеззюи 8уз!етз, 2иб Ебйюи, С1оуег е! а1., (ебз.), раде 93 (0хГогб Ишуегзйу Ргезз, 1995)).
Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам композиции, содержащей генный продукт ЕБ-22КА; подтверждения продуцирования антитела путем взятия пробы сыворотки; удаления селезенки для получения В-лимфоцитов; слияния этих В-лимфоцитов с миеломными
- 31 009026 клетками для получения гибридом; клонирования этих гибридом; отбора позитивных клонов, продуцирующих антитела против данного антигена; культивирования клонов, продуцирующих антитела против данного антигена; и выделения антител из гибридомных культур.
Кроме того, анти-ГЬ-22ВА антитело настоящего изобретения может происходить от человеческого моноклонального антитела. Человеческие моноклональные антитела получали от трансгенных мышей, которые были выведены так, чтобы они продуцировали специфические человеческие антитела в ответ на антигенную стимуляцию. В этом методе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина вводят мышам соответствующих линий, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые дизрупции эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. Такие трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфические к человеческим антигенам, и эти мыши могут быть использованы для продуцирования гибридом, секретирующих человеческие антитела. Методы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны, например, Огееп е! а1., №11иге Оепе!. 7:13 (1994), ЬопЬегд е! а1. №11иге 368:856 (1994) и Тау1ог е! а1., Гп!. Гттип. 6:579 (1994).
Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур различными методами, хорошо известными специалистам. Такими методами выделения являются аффинная хроматография на сефарозе с белком А, эксклюзионная хроматография и ионообменная хроматография (см., например, Сойдап, радек 2.7.1-2.7.12 апб радек 2.9.1-2.9.3; Батек е! а1., РипйсаИоп оГ Гттипод1оЬи1т О (ГдО), Ме!йобк т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (ТНе Нитапа Ргекк, Гпс. 1992)).
Для конкретного применения может оказаться желательным получение фрагментов анти-ГЬ-22КА антител. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, посредством протеолитического гидролиза антитела. Фрагменты антител могут быть получены посредством пепсинового или папаинового гидролиза целых антител стандартными методами. Примерами могут служить фрагменты антител, которые могут быть продуцированы путем ферментативного расщепления антител пепсином с получением фрагмента 58, обозначаемого Р(аЬ')2. Этот фрагмент может быть затем расщеплен с использованием тиолового восстанановителя с получением одновалентных РаЬ'-фрагментов 3,58. Реакция расщепления может быть проведена, но необязательно, с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые образуются в результате расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление пепсином продуцирует непосредственно два одновалентных РаЬфрагмента и Рс-фрагмент. Эти методы описаны, например, Оо1бепЬегд, патент США № 4331647, МкопоГГ е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 89:230 (1960), Ройег, Вюсйет 1. 73:119 (1959), Ебе1тап е! а1., Ме1йобк т Епхуто1оду. Уо1. 1, раде 422 (Асабетю Ргекк 1967) и Сойдап, радек 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4.
Могут быть также применены и другие методы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием одновалентных фрагментов легкой-тяжелой цепи иммуноглобулина, дополнительное расщепление фрагментов, или другие ферментативные, химические или генетические методы, при условии, что полученные фрагменты связываются с антигеном, распознаваемым интактным антителом.
Так, например, Ρν-фрагменты содержат комплекс УН- и Уъ-цепей. Такой комплекс может быть образован нековалентными связями, как описано ГпЬаг е! а1., Ргос. №1'1. Асаб. 8сг И8А, 69:2659 (1972). Альтернативно, вариабельные цепи могут быть соединены межмолекулярной дисульфидной связью или сшиты посредством химических линкеров, таких как глутаральдегид (см., например, 8апбйи, Сгй. Вег. Вю!есй. 12:437 (1992)).
Ρν-фрагменты могут содержать УН- и Уъ-цепи иммуноглобулина, связанные пептидным линкером. Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки (ксРу) получают путем конструирования структурного гена, содержащего ДНК-последовательности, кодирующие УН- и Уъ-домены, связанные олигонуклеотидом. Этот структурный ген встраивают в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клеткухозяина, такую как Е.сой. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с пептидным линкером, связанным мостиковой связью с двумя У-доменами. Методы продуцирования ксРу описаны, например, АйИ1оте е! а1., Ме!йобк: А Сотрашоп !о Ме!йобк т Епхуто1оду 2:97 (1991) (см. также В1гб е! а1., 8с1епсе 242:423 (1988), Ьабпег е! а1., патент США № 4946778, Раск е! а1., Вю/Тесйпо1оду 11:1271 (1993) и 8апбйи, см. выше).
В качестве иллюстрации можно отметить, что ксРу может быть получен путем обработки лимфоцитов полипептидом ГЬ-22КА. ш уйго. и отбора библиотек антител, представленных в фаге или в аналогичных векторах (например, с использованием иммобилизованного или меченного белка или пептида ГЬ22КА). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие предполагаемые домены, связывающиеся с полипептидом ГЬ-22ВА, могут быть получены путем скрининга рандомизированных пептидных библиотек, представленных в фаге (фаговое представление) или в бактериях, таких как Е.сой. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные полипептиды, могут быть получены различными методами, такими как неспецифический мутагенез и синтез рандомизированных полинуклеотидов. Такие пептидные библиотеки для рандомизированного представления могут быть использованы для скрининга пептидов, взаимодействующих с известной мишенью, которой может быть белок или полипептид, такой как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, или органические или неорганические вещества. Методы создания и скрининга таких пептидного библиотек для рандомизированного пред
- 32 009026 ставления известны специалистам (Ьайпег е! а1., патент США № 5223409, Ьайпег е! а1., патент США № 4946778, Ьайпег е! а1., патент США № 5403484, Ьайпег е! а1., патент США № 5571698 и Кау е! а1., РНаде Ь1кр1ау оГ Рерййек апй Рго!ешк (Асайетю Ргекк, 1пс. 1996)), а пептидные библиотеки для рандомизированного представления и наборы для скрининга этих библиотек являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмой СЬОКГЕСН ЬаЬога!опек, 1пс. (Ра1о А1!о, СА), ИкПгодеп 1пс. (8ап Ь|едо СА), №\ν Епд1апй Вю1аЬк 1пс. (Βеνе^1у МА) и РНагтааа ЬКВ В1о!есНпо1оду 1пс. (Р1кса!а^ау, N1). Пептидные библиотеки для рандомизированного представления могут быть скринированы с использованием описанных здесь последовательностей 1Ь-22ВА для идентификации белков, связывающихся с Ш-22ВА.
Другой формой фрагмента антитела является пептид с одной гипервариабельной областью (СОВ области, определяющие комплементарность). Пептиды СОВ (минимальные распознающие компоненты) могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих СОВ нужного антитела. Такие гены получают, например, с помощью полимеразной цепной реакции, необходимой для синтеза вариабельной области, из РНК антитело-продуцирующих клеток (см., например, Ьаглск е! а1., Ме!1ойк: А Сотрашоп !о МеФойк т Епхуто1оду 2:106 (1991), Соипепау-Ьиск, Оепейс Машри1а1юп оГ Мопос1опа1 АпйЬой1ек, Мопос1опа1 АпйЬоФек: Ргойис!юп, Епдтееппд апй С1шюа1 Арр1юа!юп, Вй1ег е! а1., (ейк.), раде 166 (СатЬпйде ЬпАегкЦу Ргекк 1995) апй ^агй е! а1. Оепейс Матри1а!юп апй Ехргеккюп оГ АпйЬоФек, Мопос1опа1 Ап!1Ьой1ек: Рппар1ек апй Арр1юа!юпк, Вйс11 е! а1., (ейк.), раде 137 (^Иеу-Ыкк, 1пс. 1995)).
Альтернативно, анти-1Ь-22ВА антитело может происходить от гуманизованного моноклонального антитела. Гуманизованные моноклональные антитела получают путем переноса мышиных гипервариабельных областей из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельную область человеческого иммуноглобулина. Затем типичные остатки человеческих антител в каркасных областях заменяют мышиными аналогами с сохранением рамки считывания. Использование компонентов антитела, происходящих от гуманизованных моноклональных антител, позволяет избежать возможных проблем, связанных с иммуногенностью константных областей мышиного иммуноглобулина. Общие методы клонирования вариабельных доменов мышиного иммуноглобулина описаны, например, Ог1апй1 е! а1., Ргос. Асай. 8сг И8А 86:3833 (1989). Методы продуцирования гуманизованных моноклональных антител описаны, например, 1опек е! а1., №1Шге 321:522 (1986), Сайег е! а1., Ргос. Ν!'1. Асай. 8οΐ. И8А 89:4285 (1992), 8апййи, Сп!. Веν. Вю!есН. 12:437 (1992), 8шдег е! а1., 1. 1ттип. 150:2844 (1993), 8ийЫг (ей.), АпйЬойу Епдтееппд Рго!осо1к (Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), Ке11еу, Епдтееппд ТНегареийс АпйЬоФек, Рго!ет Епдтееппд: Рппар1ек апй Ргасйсе, С1е1апй е! а1. (ейк.), радек 399-434 (ЧоНп \νίΕν & 8опк, 1пс. 1996) и Оиееп е! а1., патент США № 5693762 (1997).
Кроме того, анти-1Ь-22ВА антитела или фрагменты антитела настоящего изобретения могут быть ПЭГилированы известными методами и методами, описанными в настоящем изобретении.
Поликлональные антиидиотипические антитела могут быть получены путем иммунизации животных анти-1Ь-22ВА антителом или их фрагментами в соответствии со стандартным методом. См. также Огееп е! а1., Ргойисйоп оГ Ро1ус1опа1 Апйкега, МеФойк 1п Мо1еси1аг Вю1оду: 1ттипосНет1са1 Рго!осо1к, Мапкоп (ей.), радек 1-12 (Нитапа Ргекк, 1992). См. также работу СоНдап, стр. 2.4.1-2.4.7. Альтернативно, моноклональные антиидиотипические антитела могут быть получены вышеописанными методами с использованием анти-1Ь-22ВА антител или их фрагментов в качестве иммуногенов. В другом альтернативном методе, гуманизованные антиидиотипические антитела или антиидиотипические антитела человекообразных обезьян могут быть получены в соответствии с вышеописанными процедурами. Методы продуцирования антиидиотипических антител описаны, например, Еле, патент США № 5208146, Огеепе е! а1., патент США № 5637677 и Уаг111ака\з & МтосНа, 1. Оеп. У1го1. 77:1875 (1996).
Анти-1Ь-22ВА антитело может быть конъюгировано с детектируемой меткой с образованием антиЕБ-22ВА иммуноконъюгата. Подходящими детектируемыми метками являются, например, радиоизотоп, флуоресцентная метка, хемилюминесцентная метка, ферментная метка, биолюминесцентная метка или коллоидное золото. Методы получения и детекции таких детектируемых меченных иммуноконъюгатов хорошо известны специалистам и более подробно описаны ниже.
Детектируемой меткой может быть радиоизотоп, детектируемый авторадиографией. Изотопами, которые являются особенно подходящими для осуществления настоящего изобретения, являются 3Н, 1251, 131Ι, 35δ и 14С.
Анти-1Ь-22ВА иммуноконъюгаты могут быть также помечены флуоресцентным соединением. Присутствие флуоресцентно-меченного антитела определяют путем облучения иммуноконъюгата светом с соответствующей длиной волны и детекции излучаемой флуоресценции. Флуоресцентными соединениями, используемыми для мечения, являются флуоресцеин-изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталальдегид и флуорескамин.
Альтернативно, анти-1Ь-22ВА иммуноконъюгаты могут быть детектируемо помечены путем связывания компонента антитела с хемилюминисцентным соединением. Присутствие иммуноконъюгата, меченного хемилюминесцентным соединением, определяют путем детекции люминисценции, появляющейся в процессе химической реакции. Примерами хемилюминесцентных соединений, используемых для мечения, являются люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.
- 33 009026
Аналогичным образом, для мечения ημήΠΕ^ΒΑ иммуноконъюгатов настоящего изобретения может быть использовано биолюминисцентное соединение. Биолюминесценция представляет собой хемилюминесценцию определенного типа, обнаруживаемую в биологических системах, в которых каталитический белок повышает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем детекции наличия люминесценции. Биолюминесцентными соединениями, которые могут быть использованы для мечения, являются люциферин, люцифераза и экворин.
Альтернативно, анти-I^-22ΒΑ иммуноконъюгаты могут быть детектируемо помечены путем связывания компонента анти-I^-22ΒΑ антитела с ферментом. При инкубировании конъюгата анти-I^-22ΒΑ антитело - фермент в присутствии соответствующего субстрата, молекула фермента реагирует с субстратом, в результате чего образуется химическое вещество, которое может быть детектировано, например, спектрофотометрическими, флуориметрическими или визуальными методами. Примерами ферментов, которые могут быть использованы для детектируемого мечения полиспецифических иммуноконъюгатов, являются β-галактозидаза, глюкозооксидаза, пероксидаза и щелочная фосфатаза.
Каждому специалисту известны и другие подходящие метки, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Связывание маркерных молекул с анти-I^-22ΒΑ антителами может быть осуществлено стандартными методами, известными специалистам. Типичный метод, применяемый в этих целях, описан Кеппебу е! а1., С1ш. СЫт. Αθπ 70:1 (1976), 8сЬигк е! а1., С1т. СЫт. Αθπ, 81:1 (1977), 8Ы11 е! а1., ШН I. Сапсег 46:1101 (1990), 8!ет е! а1., Сапсег Век. 50:1330 (1990) и СоБдап, см. выше.
Кроме того, еще большей простоты и разнообразия методов иммунохимической детекции можно добиться с использованием анти-I^-22ВΑ антител, которые были конъюгированы с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, ХУПсйек е! а1. (ебк.) Αν^б^η-В^о!^η ТесЬпо1оду МеЫобк ш Епхуто1оду, Уо1. 184 Асабетк Ргекк, 1990) и Вауег е! а1., Iттиηосйет^са1 Αρρ1^са!^оηκ оГ Αν^б^η-В^оΐ^η ТесЬпо1оду, Ме!Ьобк т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Мапкоп (еб.), ρадеκ 149-162 (ТЬе Нитапа Ргекк, Ыс. 1992)).
Методы осуществления иммуноанализов хорошо известны специалистам. См., например, Соок & 8е1Г, Мопос1опа1 Αη!^Ьоб^еκ ш П1адпок!к ^тима^ук, Мопос1опа1 Αηί^Ьоб^еκ: РгобисНоп, Епдшеегшд апб Сйшса1 Αρρ1^са!^оη, Вй!ег & Бабутап (ебк.); ρадеκ 180-208 (СатЬпбде Итуегкйу Ргекк, 1995), Репу ТЬе Во1е оГ Мопос1опа1 Αη!^Ьоб^еκ т !Ье Αбνаηсетеη! оГ Iттиηоаκκау ТесЬпо1оду, Мопос1опа1 Αη!^Ьоб1ек: Р^^ηс^ρ1еκ апб Αρρ1^са!^оηκ, ВисЬ & Беппох (ебк.), ρадеκ 107-120 (У11еу-Б1кк, Ыс. 1995) апб П1атапб1к, ^тима^у (Асабетк Ргекк, Ыс. 1996).
В настоящем изобретении также рассматриваются наборы для проведения иммунологического диагностического анализа на экспрессию гена ΣΕ-22ΒΑ. Такие наборы включают по крайней мере один сосуд, содержащий анти-I^-22ΒΑ антитело или его фрагмент. Набор может также включать второй сосуд, содержащий один или несколько реагентов, способных обнаруживать присутствие антител против ^22ΒΑ или их фрагментов. Примерами таких реагентов-индикаторов являются детектируемые метки, такие как радиоактивная метка, флуоресцентная метка, хемилюминесцентная метка, ферментная метка, биолюминесцентная метка, коллоидное золото и т.п. Набор может также содержать информацию для потребителя по использованию антител против ΣΕ-22ΒΑ или их фрагментов для детекции белка ^-22ΒΑ. Так, например, в тексте инструкции может быть указано, что включенное в набор антитело или ее фрагмент используется для детекции ΣΕ-22ΒΑ. Текстовой материал может быть нанесен либо непосредственно на упаковку, либо он может быть вложен в эту упаковку в виде вкладыша.
9. Использование анти-I^-22ΒΑ антител для ингибирования связывания ^^ΒΑ с ^-22 или с ^-20 и ^-22.
Альтернативные методы продуцирования или выбора антител, подходящих для использования в настоящем изобретении, предусматривают ш ν 11го обработку лимфоцитов полипептидами растворимых рецепторов ΣΕ-22ΒΑ или их фрагментами, такими как антигенные эпитопы, и отбор библиотек антител для их представления в фаге или в аналогичных векторах (например, с использованием иммобилизованных или меченных полипептидов растворимого рецептора ^-22ΒΑ или их фрагментов, таких как антигенные эпитопы). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие предполагаемые связывающие домены, такие как полипептиды растворимого рецептора ^-22ΒΑ или их фрагменты, такие как антигенные эпитопы, могут быть получены путем скрининга рандомизированных пептидных библиотек, представленных в фаге (фагового представления) или в бактериях, таких как Е.соБ. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные полипептиды, могут быть получены различными методами, такими как неспецифический мутагенез и синтез рандомизированных полинуклеотидов. Такие пептидные библиотеки для рандомизированного представления могут быть использованы для скрининга пептидов, взаимодействующих с известной мишенью, которой может быть белок или полипептид, такой как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, или органические или неорганические вещества. Методы создания и скрининга таких пептидных библиотек для рандомизированного представления известны специалистам (Бабпег е! а1., патент США № 5223409, Бабпег е! а1., патент США № 4946778, Бабпег е! а1., патент США № 5403484, и Бабпег е! а1., патент США № 5571698), и такие пептидных библиотеки для рандомизированного представления и наборы для скрининга этих библиотек являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмой С1оп!есЬ (Ра1о Α1Φ, СА), Iην^ΐ^одеη Ыс. (8ап
- 34 009026
Э|едо СА), №\ν Епд1апй Вю1аЬк Бчс. (Веуег1у МА) и РНагтааа БКВ Вю!есйпо1оду Бчс. (Р18са!а^ау, N1). Пептидные библиотеки для рандомизированного представления могут быть скринированы с использованием полипептидов растворимых рецепторов ГЬ-22КА или их фрагментов, таких как описанные здесь полипептидные последовательности антигенного эпитопа для идентификации белков, связывающихся с полипептидами ГО-22КА-содержащего рецептора. Эти связывающие полипептиды, которые взаимодействуют с полипептидами ББ-22КА-содержащего растворимого рецептора, могут быть использованы для мечения клеток и для выделения гомологичных полипептидов путем аффинной очистки; при этом они могут быть непосредственно или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т. п. Эти связывающие полипептиды могут быть также использованы в аналитических методах, таких как методы скрининга экспрессионных библиотек и методы скрининга на нейтрализующую активность, например, на связывание лиганда ББ-22 с рецептором, или блокирование, ингибирование, ослабление, подавление или нейтрализацию такого связывания или связывания вируса с рецептором. Связывающие полипептиды могут быть также использованы в диагностических анализах для определения уровней полипептидов растворимого ББ-22КА-содержащего рецептора; и для детекции или определения количества растворимых или нерастворимых I^-22КА-содержащих рецепторов, используемых в качестве маркеров имеющейся патологии или заболевания. Эти связывающие полипептиды могут также действовать как антагонисты, которые блокируют или ингибируют растворимый или мембраносвязанный мономерный рецептор [^-22КА или гомодимерный, гетеродимерный или мультимерный полипептид, связывающийся с ББ-22КА (например, с лигандом) и обеспечивают передачу сигнала ш у11го и ш νί\Ό. И в этом случае, эти связывающие полипептиды служат в качестве антитела против мономерного рецептора ББ-22КА или антител против гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных полипептидов ББ-22КА, и могут быть использованы для ингибирования активности одного ББ-22 или обоих ГО-20 и ГО-22, а также активности рецептора или связывания с белком. Антитела, вырабатываемые против природны рецепторных комплексов настоящего изобретения, и антитела, связывающиеся с ГО22КА-эпитопом, а также нейтрализующие моноклональные антитела против ГО^КА могут представлять собой предпочтительные варианты изобретения, поскольку они могут действовать более специфически против I^-22КА и могут ингибировать ГО-22 или оба ГО-20 и ГО-22. Кроме того, антагонистическая и связывающая активности антител настоящего изобретения могут быть проанализированы в анализах на пролиферацию ^-20 или ГО-22, в анализах на детекцию сигнала, в люциферазных анализах или в анализах на связывание в присутствии ^-20 или ГО-22, соответственно, и I^-22КА-содержащих растворимых рецепторов, а также в других описанных здесь биологических или биохимических анализах.
Антитела против полипептидов растворимого рецептора I^-22КА (например, антитела к 8ЕЦ ГО N0:3) или их фрагменты, такие как антигенные эпитопы, могут быть использованы для ингибирования воспалительных эффектов ш угуо, опосредуемых ГО-20, ГО-22 или обоими ГО-20 и ГО-22; для использования в терапии против псориаза, атопического дерматита, воспалительных заболеваний кожи, эндотоксемии, артрита, астмы, ВЗК, колита, псориазного артрита, ревматоидного артрита или других ГО-20- и ГО22-индуцируемых воспалительных состояний; для мечения клеток, экспрессирующих рецепторы ГО22КА; для выделения полипептидов растворимого ГО-22КА-содержащего рецептора путем аффинной очистки; в диагностических анализах для определения уровней полипептидов растворимого ГО-22КАсодержащего рецептора в кровотоке; для детекции или определения уровня растворимых I^-22КАсодержащих рецепторов, используемых в качестве маркера имеющейся патологии или заболевания; для использования в аналитических методах с помощью РАС8; для скрининга экспрессионных библиотек; для продуцирования антиидиотипических антител, которые могут действовать как агонисты ГО-20 и ГО22 связывания ГО-22КА и как нейтрализующие антитела или антагонисты, которые связываются с ГО22КА или блокируют, ингибируют, ослабляют или подавляют функцию рецептора ГО-22КА, либо связываются с ГО-22 и/или ГО-20 или блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют активность ГО-22 и/или ГО-20 (одного или обоих) ш У11го и ш νί\Ό. Подходящими прямыми метками или маркерами являются радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, биотин, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т. п.; при этом в качестве промежуточных соединений могут быть использованы непрямые метки или маркеры, например, биотин-авидин или другие пары комплемент/антикомплемент. Описанные здесь антитела могут быть также непосредственно или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п. и эти конъюгаты могут быть использованы для ш νί\Ό диагностики или терапии. Кроме того, антитела против полипептидов растворимого ГО-22КА-содержащего рецептора или их фрагментов могут быть использованы ш У11го для детекции денатурированных или неденатурированных полипептидов ГО-22КАсодержащего рецептора или их фрагменты, например, в таких анализах, как Вестерн-блот-анализ, или в других анализах, известных специалистам.
Антитела против растворимого рецептора ГО-22КА или гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных полипептидов растворимого рецептора ГО-22КА могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих соответствующие рецепторы, и для анализа уровней их экспрессии; для аффинной очистки; в диагностических анализах для определения уровней полипептидов рецепторов в кровотоке и в аналитических методах с использованием сортинга клеток по интенсивности флуоресценции. Кроме то
- 35 009026 го, двухвалентные антитела и антиидиотипические антитела могут быть использованы в качестве агонистов для имитации действия лиганда ГЙ-22КА, ΙΣ-22 или ΙΣ-20.
Описанные здесь антитела могут быть также непосредственно или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты используются ш νίνο в диагностических или в терапевтических целях. Так, например, антитела или связывающие полипептиды, которые распознают растворимый рецептор ГЙ-22КА или гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные полипептиды растворимого рецептора ГЙ-22КА, могут быть использованы для идентификации или обработки тканей или органов, экспрессирующих соответствующую антикомплементарную молекулу (т.е. ГЙ-22КА-содержащий растворимый или мембраносвязанный рецептор). Более конкретно, антитела против полипептидов растворимого ГЙ^КА-содержащего рецептора или их биологически активные фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или с цитотоксическими молекулами и доставлены млекопитающему, имеющему клетки, ткани или органы, которые экспрессируют [Й-22КАсодержащий рецептор, такие как Ш^КА-экспрессирующие раковые клетки, ткани или органы.
Подходящие детектируемые молекулы могут быть непосредственно или опосредовано присоединены к полипептидам, которые связываются с полипептидами Ш^КА-содержащего рецептора, таким как связывающие полипептиды (включая описанные выше связывающие пептиды), антитела или их биологически активные фрагменты или части. Подходящими детектируемыми молекулами являются радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть непосредственно или опосредовано присоединены к полипептиду или антителу, и такими молекулами являются бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Р8еибοтοηа8, рицин, абрин и т.п.), а также терапевтические радионуклиды, такие как иод-131, рений-188 или иттрий90 (либо непосредственно присоединенные к полипептиду или антителу, либо присоединенные посредством, например, хелатообразующей молекулы). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами, такими как адриамицин. Для опосредуемого присоединения детектируемой или цитотоксической молекулы такая детектируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, где другой член этой пары связан с частью связывающего полипептида или антитела. Репрезентативной парой комплемент/антикомплемент, используемой для этих целей, является биотин/стрептавидин.
В другом варианте осуществления изобретения гибридные белки связывающий полипептидтоксин или гибридные белки антитело-токсин могут быть использованы для ингибирования или разрушения клеток или тканей, на которые они направлены (например, для удаления раковых клеток или тканей). Альтернативно, если связывающий полипептид имеет множество функциональных доменов (т.е. активирующий домен или лигандсвязывающий домен плюс нацеливающий домен), то гибридный белок, включающий только нацеливающий домен, может быть использован для направления детектируемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы в представляющую интерес клетку или ткань. В тех случаях, когда гибридным белком, включающим только один домен, является комплементарная молекула, то антикомплементарная молекула может быть конъюгирована с детектируемой или цитотоксической молекулой. Такие гибридные белки домен - комплементарная молекула представляют собой общий нацеливающий носитель для клетко/тканеспецифической доставки конъюгатов антикомплементарная детектируемая молекула определенного вида/цитотоксическая молекула.
В другом варианте осуществления изобретения гибридные белки I^-22КА-связывающий полипептид - цитокин или антитело - цитокин могут быть использованы для усиления ш νίνο лизиса тканеймишеней (например, тканей рака селезенки, поджелудочной железы, крови, лимфоидной ткани, толстой кишки и костного мозга), если конъюгат связывающий полипептид - цитокин или антитело против рецептора ХЙ-22КА нацелены на гиперпролиферирующуюся клетку (в общих чертах см. ΗογπΣ1< е! а1., В^б 89:4437-47, 1997). Описанные гибридные белки способны доставлять цитокин в нужный участок его действия, что приводит к увеличению локальной концентрации цитокина. Подходящие мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные антитела против Ш-22КА обеспечивают доставку нужных молекул в нежелательную клетку или ткань (т.е. в опухоль или в ткань, пораженную лейкозом), а цитокиновая часть гибрида опосредует ускоренный лизис клеток-мишеней под действием эффекторных клеток. Подходящими цитокинами, используемыми для этих целей, являются, например, интерлейкин-2 и гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Б).
Альтернативно, описанные здесь полипептиды, связывающиеся с рецептором Ш-22КА, или гибридные белки антител могут быть использованы для усиления ш νίνο лизиса тканей-мишеней посредством прямой стимуляции модулируемого рецептором Ш-22КА апоптотического пути, приводящего к гибели гиперпролиферирующих клеток, экспрессирующих Ш^КА-содержащие рецепторы.
10. Терапевтическое применение полипептидов, обладающих активностью Ш-22 К А или антител против ΙΣ-ΣΣΕΛ
Аминокислотные последовательности, обладающие активностью растворимого I^-22КА, могут быть использованы для модуляции иммунной системы посредством связывания лигандов I^-22КА, ΙΣ-20 и ΙΣ-22 (одного или обоих), и тем самым, для предупреждения связывания лиганда I^-22КА с эндоген
- 36 009026 ным рецептором Ш-22КА.
Антагонисты I^-22КΛ. такие как анти-I^-22КА антитела, могут быть также использованы для модуляции иммунной системы посредством ингибирования связывания лиганда ЕБ-22КА с эндогенным рецептором ЕБ-22КА. В соответствии с этим настоящее изобретение включает использование белков, полипептидов или пептидов, обладающих I^-22КА-активностью (таких как растворимые полипептиды ЕБ-22КА, фрагменты полипептидов Ш-22КА, аналоги Ш-22КА (например, антиидиотипические антитела против ЕБ-22КА) и гибридные белки Ш-22КА), для введения индивидууму, у которого отсутствует адекватное количество этого полипептида, или у которого продуцируется избыток лиганда ЕБ-22КА. Антагонисты ЕБ-22КА (например, анти-Ш-22КА антитела) могут быть также использованы для лечения индивидуума, у которого продуцируется избыток либо лиганда ЕБ-22КА, либо Ш-22КА. Подходящими индивидуумами являются млекопитающие, такие как человек. Так, например, указанные полипептиды ΙΕ22КА и анти-I^-22КА антитела могут быть использованы для связывания с ΙΕ-20 и ΙΕ-22 (с одним или с обоими) или для блокирования, ингибирования, ослабления, подавления или нейтрализации их активности в целях лечения псориаза, атопического дерматита, воспалительных заболеваний кожи, псориазного артрита, артрита, эндотоксемии, астмы, воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), колита и других описанных здесь воспалительных состояний.
Кроме того, авторами настоящего изобретения было показано, что рецептор ЕБ-22КА связывается с лигандом, называемым Т-клеточным индуцибельным фактором (ΙΕ-22) (8Е0 ΙΌ N0:6; ОитоиЕег Б. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8с1. 97:10144-10149, 2000; последовательность мышиного Ш-22 представлена в работе Оитоийег е! а1., 1. Iттиηо1. 164:1814-1819, 2000). Кроме того, хсуЮг11 (I^-22КА) (совместный патент США № 5965704) и рецептор СКБ2-4 также связываются с Ш-22 в виде гетеродимера (см. публикацию \УШ0 \У0 00/24758; ОитоиЕег е! а1., 1. ^типок 164:1814-1819, 2000; 8репсег 8.Ό. е! а1., 1. Ехр. Меб. 187:571-578, 1998; С1ЬЬк, УС апб Рептса Сепе 186:97-101, 1997 (СКБ2-4 сПт); Х1е, М.Н. е! а1., 1. Вю1. СЬет. 275:31335-31339, 2000 апб Ко!епко 8.У. е! а1., 1. Вю1. СЬет. 276:2725-2732, 2001). Кроме того, в качестве рецептора для Ш-22 может быть использован рецептор ΙΕ-10β, который, очевидно, является синонимом СКБ2-4 (ОитоиБег Б. е! а1., Ргос. №!!. Асаб. 8ск 97:10144-10149, 2000; Бш Υ. е! а1., 1. Ιιηιηιιпо1. 152: 1821-1829, 1994 (кДНК Ш-10К)). Кроме того, авторами настоящего изобретения было показано, что рецептор Ш-22КА связывается с лигандом, обозначаемым Ш-20 (8ЕО ΙΌ N0:8; публикация \УШ0 № XV 0 99/27103). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения растворимый рецептор Ш22КА (8ЕО ΙΌ N0:3) может быть представлен в форме мономера, гомодимера, гетеродимера или мультимера, который связывается с Ш-22 и Ш-20 ш у1уо, или блокирует, ингибирует, снижает, подавляет или нейтрализует их активность. Антитела против указанных мономеров, гомодимеров, гетеродимеров или мультимеров Ш-22КА и связывающиеся с ними полипептиды могут также служить антагонистами активности Ш-22КА и антагонистами Ш-20 и Ш-22 (одного или обоих), описанными в настоящем изобретении.
Кроме того, в анализах на клеточную нейтрализацию авторами настоящего изобретения было описано и продемонстрировано, что поликлональные и моноклональные нейтрализующие антитела против Ш-22 связываются с Ш-22 и с Ш-20 и блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность.
Было показано, что Ш-22 индуцируется в присутствии Ш-9, и предполагается, что он участвует в стимуляции иммунных ответов ТЬ1-типа и в воспалительных реакциях. Ш-9 стимулирует пролиферацию, активацию, дифференциацию и/или индуцирование иммунной функции в соответствии с различными механизмами, и способствует развитию астмы, легочного мастоцитоза и других заболеваний, а также активирует пути 8ТАТ. Антагонисты функции Ш-22 и/или Ш-9 могут оказывать благоприятное воздействие при лечении указанных заболеваний у человека. Настоящее изобретение относится к таким новым антагонистам Ш-22.
Было показано, что Ш-22 участвует в стимуляции продуцирования реагентов острой фазы, таких как сывороточный амилоид А (8АА), а1-антихимосотрипсин и гаптоглобин, и экспрессия Ш-22 усиливается после инъекции липополисахарида (ЛПС) ш у1уо, что позволяет предположить, что Ш-22 участвует в воспалительном ответе (ОитоиБег Б. е! а1., Ргос. №!!. Асаб. 8сЕ 97:10144-10149, 2000). Считается, что продуцирование белков острой фазы, таких как 8АА, представляет собой кратковременный механизм выживания, где воспаление является благоприятным фактором, однако, поддержание белков острой фазы в течение более длительных периодов времени приводит к хроническому воспалению и может оказывать негативное воздействие на здоровье человека. См. ИЫат, С.М. & ^ЬйеЬеаб, А.8., Еиг. 1. ВюсЬет. 265:501-523, 1999, и Ваитапп Н. & Саи1б1е 1. ЕптипоАду Тобау 15:74-80, 1994. Кроме того, белок острой фазы 8АА участвует в патогенезе нескольких хронических воспалительных заболеваний, в развитии атеросклероза и ревматоидного артрита, и является предшественником амилоидного белка А, отлагающегося при амилоидозе (ИЫат С.М. & ^ЬйеЬеаб, см. выше). Таким образом, поскольку Ш-22 действует как провоспалительная молекула и индуцирует продуцирование 8АА, то его антагонисты могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания и других заболеваний, ассоциированных с действием белков реакции острой фазы, индуцируемой Ш-22. Такие антагонисты входят в объем настоящего
- 37 009026 изобретения. Так, например, метод ослабления ΙΕ-22-индуцированного или ΙΕ-9-индуцированного воспаления предусматривает введение млекопитающему, страдающему таким воспалением, количества композиции растворимого ГЕ-22КА-содержащего рецептора, достаточного для ослабления воспаления. Кроме того, метод подавления воспалительного ответа у млекопитающего, страдающего воспалением, может предусматривать: (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке; (2) введение композиции, содержащей описанный здесь полипептид растворимого рецептора цитокина ГЕ-22КА в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после его введения; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А в стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А в стадии (3), где отсутствие повышения или снижения уровня сывороточного амилоидного белка А указывает на подавление воспалительной реакции. Описанные здесь экспериментальные данные показали, что антагонисты ΙΕ-22, такие как растворимые рецепторы и антитела, действительно снижают уровни ЗАА в ш у1уо моделях воспалительных заболеваний, что указывает на то, что связывание, блокирование, ингибирование, ослабление, подавление или нейтрализация ΙΕ-22 оказывает противовоспалительное действие.
Имеются данные, указывающие на то, что ΙΕ-20 и его рецепторы играют определенную роль в развитии псориаза. Такое мультигенное кожное заболевание характеризуется увеличением пролиферации кератиноцитов, изменением дифференцировки кератиноцитов и инфильтрацией иммунных клеток в кожу. Главным свидетельством роли Ш-20 в развитии псориаза является наблюдаемый гиперкератоз и утолщенный эпидермис у трансгенных мышей, которые напоминают псориазные поражения у человека. Пониженное число тонофиламентов, очевидно связанное с недостаточной кератинизацией, является явным отличительным признаком псориаза человека. Интрамитохондриальные включения были обнаружены у мышей, имеющих как химически индуцированные, так и природные гиперпластические поражения кожи. Причины образования таких включений и их влияние на митохондриальную функцию, если они имеются, пока неясны. У ΙΕ-20-трансгенных мышей обнаруживается множество признаков, наблюдаемых при псориазе человека.
Кроме того, уровень мРНК рецептора Ш-20 (мРНК Ш-20КА и ΙΕ-20&Β) заметно увеличивается при псориазном поражении кожи человека по сравнению с нормальной кожей, что позволяет также предположить определенную роль ΙΕ-20 в развитии псориаза. Субъединицы обоих рецепторов ΙΕ-20 экспрессируются в кератиноцитах по всему эпидермису, и также экспрессируются в субсерии иммунных и эндотелиальных клеток. Авторы настоящего изобретения предполагают, что увеличение экспрессии активированного рецептора ΙΕ-20 может изменить характер взаимодействия между эндотелиальными клетками, иммунными клетками и кератиноцитами, что будет приводить к нарушению регуляции пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Кроме того, описанные здесь данные, относящиеся к мышам, дефицитным по рецептору ГЕ-22КА, показали, что ГЕ-22КА является необходимым для продуцирования Ш20-индуцированного воспалительного эффекта на коже трансгенных животных. Эти результаты показали, что эффективное блокирование активности ГЕ-22КА, например, путем удаления гена ГЕ-22КА или, аналогичным образом, путем нейтрализации моноклонального антитела против ГЕ-22КА настоящего изобретения, будет также ослаблять ΙΕ-22-индуцированные кожные эффекты, а также ΙΕ-20индуцированные кожные эффекты, например, при псориазе, ВЗК, колите или при других воспалительных заболеваниях, индуцированных ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22, включая ВЗК, артрит, астму, псориазный артрит, колит, воспалительные кожные заболевания и атопический дерматит.
Кроме того, ΙΕ-20 стимулирует передачу сигнала в клеточной линии человеческих кератиноцитов НаСаТ, что подтверждает прямое действие этого нового лиганда на кожу. Кроме того, известно, что белки ЕС-1 β, ЕСЕ и ТМ-а являются активными в кератиноцитах и участвуют в передаче пролиферативного и провоспалительного сигналов в коже, а также усиливают ответную реакцию на ΙΕ-20. В клетках НаСаТ и ВНК, экспрессирующих рецептор ΙΕ-20, ΙΕ-20-сигналы передаются посредством ЗТАТ3.
Как обсуждалось выше и как указывается в нижеследующих примерах, ΙΕ-20 участвует в патогенезе псориаза. Настоящее изобретение, в частности, относится к способу лечения псориаза путем введения агентов, связывающихся с ΙΕ-20 или блокирующих, ингибирующих, ослабляющих, подавляющих или нейтрализующих его активность. Антагонистами ΙΕ-20 могут быть либо растворимый рецептор, связывающийся с ΙΕ-20, такой как растворимый ГЕ-22КА, либо антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты антител, связывающихся либо с ΙΕ-20, либо с рецептором ΙΕ-20, например, антитела против Ш22КА. Таким образом, эти антагонисты будут предупреждать активацию рецептора ΙΕ-20. Кроме того, поскольку ΙΕ-20 и ΙΕ-22 имеют общий рецептор ГЕ-22КА, то их антагонисты, такие как растворимый Ш22КА или антитела, одноцепочечные антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором Ш22КА, могут быть использованы для конкурентного связывания с ΙΕ-22 или с ΙΕ-20 и ΙΕ-22, или для блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации их активности ΙΕ-20 и ΙΕ-22.
Псориаз является одним из наиболее распространенных кожных болезней, которой страдает до 12% населения во всем мире. Псориаз представляет собой хроническое воспалительное кожное заболевание, характеризующееся эритематозными, четко ограниченными папулами и бляшками округлых очертаний, покрытыми серебристыми пластинчатыми чешуйками. Иногда, при поражении кожи псориазом, пациенты ощущают зуд. В большинстве случаев, псориаз развивается на травмированных участках.
- 38 009026
Кроме того, обострение псориаза часто могут вызывать и другие внешние факторы, включая инфекции, стресс и лекарственные средства, например литий, бета-блокаторы и средства против малярии.
Наиболее часто встречающейся формой псориаза является псориаз бляшкового типа. У пациентов с псориазом бляшкового типа наблюдаются стабильные, медленно развивающиеся бляшки, которые остаются, в основном, неизменными в течение длительного периода времени. Областями, наиболее часто поражаемыми бляшковым псориазом, являются коленные суставы, задний проход и волосистая часть кожи головы. Поражения обычно бывают симметричными. Инверсный псориаз поражает интертригинозные области, включая подмышечные ямки, пах, область, находящуюся под молочной железой, и пупок, а также может поражать волосистую часть головы, ладони и подошвы стопы. Отдельные поражения представляют собой четко ограниченные бляшки, но, в зависимости от их локализации, эти бляшки могут быть мокнущими. Бляшковый псориаз обычно развивается медленно и протекает безболезненно. В редких случаях наблюдается спонтанная ремиссия.
Эруптивный псориаз (каплевидный псориаз) наиболее распространен у детей и подростков. У индивидуумов, не страдающих псориазом, или у индивидуумов, страдающих хроническим бляшковым псориазом, наблюдается острое развитие. В данном случае, у пациентов наблюдается множество небольших, эриматозных, чешуйчатых папул, часто возникающих после инфицирования верхних дыхательных путей бета-гемолитическими стрептококками. У пациентов с псориазом могут также развиваться постулярные поражения. Такие поражения могут быть локализованы на ладонях и подошвах стопы, либо они могут быть генерализованными и сопровождаться высокой температурой, недомоганием, диареей и артралгией.
Примерно у половины всех пациентов, страдающих псориазом, наблюдается повреждение ногтей пальцев, проявляющееся точечными углублениями, утолщением ногтей или подногтевым гиперкератозом. Примерно у 5-10% пациентов с псориазом наблюдается поражение суставов и эти поражения часто встречаются у пациентов с повреждением ногтей пальцев. Хотя некоторые из этих пациентов страдают также классическим ревматоидным артритом, однако, у многих из них наблюдаются такие заболевания суставов, которые могут быть подпадать под определение пяти типов поражений, ассоциированных с псориазом: (1) поражение, ограниченное одним или несколькими мелкими суставами (70% всех случаев); (2) серонегативное заболевание, подобное ревматоидному артриту; (3) поражение дистальных межфаланговых суставов; (4) тяжелый диструктивный артрит с развитием калечащего артрита и (5) заболевание, ограниченное позвоночником.
Лечение псориаза может быть осуществлено путем введения агентов, которые связываются с 1Ь-22 или с 1Ь-20 и 1Ь-22, или блокируют, ингибируют, ослабляют, подавляют или нейтрализуют их активность. Предпочтительные антагонисты представляют собой либо растворимый рецептор для 1Ь-20 и 1Ь22, такие как 1Ь-22КА (8Е0 ГО NО:3) или антитела, фрагменты антител или одноцепочечные антитела, которые связываются с рецептором 1Ь-22КА, такие как нейтрализующие антитела настоящего изобретения. Такие антагонисты могут быть введены отдельно или в комбинации с другими известными терапевтическими средствами, такими как лубриканты, кератолитические средства, кортикостероиды, предназначенные для местного применения, производные витамина Ό для местного применения, антралин, антиметаболиты для системного применения, такие как метотрексат, псорален в сочетании с ультрафиолетовым излучением (РИУА), этретинат, изотретиноин, циклоспорин и кальципотриольное производное витамина Ό3 для местного применения. Кроме того, такие антагонисты могут быть введены индивидууму подкожно, внутривенно или чрескожно в виде крема или с помощью чрескожного пластыря, содержащего указанный антагонист. При подкожном введении этот антагонист может быть инъецирован в одну или несколько псориазных бляшек. При чрескожном введении такие антагонисты могут быть нанесены непосредственно на бляшки с использованием крема, мази, жидкой мази или раствора, содержащего антагонист.
Антагонисты к 1Ь-20 и 1Ь-22 могут быть введены пациенту, страдающему астмой, бронхитом, или кистозным фиброзом, или другими воспалительными заболеваниями легких, для лечения этих заболеваний. Эти антагонисты могут быть введены любым подходящим методом, включая внутривенное введение, подкожное введение, бронхиальный лаваж и ингаляцию с использованием аэрозоля, содержащего антагонист.
Анализ распределения в ткани мРНК, соответствующей кДНК 1Ь-22КА, показал, что наиболее высокий уровень мРНК наблюдается в плаценте и селезенке, а лиганд, с которым связывается 1Ь-22КА (1Ь22) участвует в индуцировании воспалительного ответа, включая индуцирование ответа острой фазы (Питоибег Ь. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8ст 97:10144-10149, 2000). Таким образом, в своих конкретных вариантах, настоящее изобретение относится к использованию растворимых 1Ь-22КА и анти-1Ь-22КА антител в качестве антагонистов для лечения воспалительных или иммунных заболеваний или состояний, таких как псориаз, псориазный артрит, атопический дерматит, воспалительные заболевания кожи, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, дивертикулез, астма, панкреатит, диабет типа I (ИЗСД), рак поджелудочной железы, болезнь Грейвса, рак толстой и тонкой кишки, аутоиммунное заболевание, сепсис, отторжение трансплантата органа или костного мозга; воспаление, вызванное эндотоксемией, травмой, хирургическим вмешательством или инфекцией; амилоидоз;
- 39 009026 спленомегалия; реакция трансплантат против хозяина, и заболевания, при которых необходимо ингибирование воспаления, подавление иммунитета, снижение уровня пролиферации гемапоэтических, иммунных, воспалительных или лимфоидных клеток, макрофагов, Т-клеток (включая ТН1- и Тп2-клетки), супрессия иммунного ответа на действие патогена или антигена, а также другие случаи, где желательно ингибирование цитокинов 16-22 и ГБ-20.
Кроме того, антитела или связывающие полипептиды, которые связываются с описанными здесь полипептидами 1Б-22КА, и сами полипептиды 1Б-22КА могут быть использованы для:
1) блокирования, ингибирования, ослабления, подавления или нейтрализации передачи сигнала, опосредуемой рецепторами ГБ-20 и ГБ-22 для лечения острого воспаления, воспаления, вызванного травмой, повреждением ткани, хирургической операцией или инфекцией, и хронических воспалительных заболеваний, таких как астма, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), хронический колит, спленомегалия, ревматоидный артрит, рецидивирующий период острого воспаления (например, туберкулез); и лечения атеросклероза, болезни Каслмана, астмы и других заболеваний, ассоциированных с индуцированием ответа острой фазы;
2) блокирования, ингибирования, ослабления, подавления или нейтрализации передачи сигнала, опосредуемой рецепторами ГБ-20 и ГБ-22, для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД (инсулинозависимый сахарный диабет), рассеянный склероз (РС), системная красная волчанка (СКВ), тяжелая миостения, ревматоидный артрит и ВЗК и для предупреждения или ингибирования 1Б-22КАопосредованной передачи сигнала в иммунных клетках (например, в лимфоцитах, моноцитах, лейкоцитах) (НидНек С. е! а1., 1. 1шшиио1. 153:3319-3325, 1994). Альтернативно, антитела, такие как моноклональные антитела (МАЬ) против 1Б-22КА-содержащих рецепторов, могут быть также использованы в качестве антагонистов в целях удаления нежелательных иммунных клеток для лечения аутоиммунного заболевания. Астма, аллергия и другие атопические заболевания могут быть подвергнуты лечению с использованием МАЬ, направленных, например, против растворимых рецепторов растворимого 1Б-22КА, в целях ингибирования иммунного ответа или удаления аллергенных клеток. Блокирование, ингибирование, ослабление, подавление 1Б-22КА-опосредуемой передачи сигнала с использованием полипептидов и антител настоящего изобретения может также давать положительный эффект при лечении заболеваний поджелудочной железы, почек, щитовидной железы и нервной системы. Такой положительный эффект может наблюдаться при лечении ИЗСД, ИНЗСД, панкреатита и карциномы поджелудочной железы. 1Б22КА может служить в качестве мишени для МАЬ-терапии рака, где МАЬ-антагонисты ингибируют рост раковых клеток и обеспечивают направленный иммуноопосредованный цитолиз (НоШдег Р. & НоодеиЬоот, Н. №!иге Вю!есН. 16:1015-1016, 1998). МАЬ против растворимого 1Б-22КА могут быть также использованы для лечения нефропатии, такой как гломерулосклероз, мембранозная нефропатия, амилоидоз (который помимо других тканей поражает также почки), почечный артериосклероз, гломерулонефрит различного происхождения, фибропролиферативные заболевания почек, а также нарушение функции почек, ассоциированное с СКВ, ИЗСД, диабетом типа II (ИНЗСД), опухолями почек и другими заболеваниями;
3) стимуляции, усиления, ускорения или инициации передачи сигнала, опосредованной рецепторами ГБ-20 и ГБ-22, для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД, РС, СКВ, тяжелая миастения, ревматоидный артрит и ВЗК. Нейтрализующие и моноклональные антитела против 1Б-22КА могут передавать лимфоцитам или другим иммунным клеткам сигнал дифференцировки, изменения пролиферации или изменения продуцирования цитокинов или белков клеточной поверхности, что способствует ослаблению аутоиммунного ответа. В частности, модуляция Т-хелперного клеточного ответа на алтернативный механизм секреции цитокинов может способствовать предотвращению развития иммунного ответа и приводить к ослаблению симптомов заболевания (8шйЪ БА. е! а1., 1. 1шшиио1. 160:4841-4849, 1988). Аналогичным образом, антитела-агонисты против растворимого 1Б-22КА, комплексы антитело против растворимого ГБ^КА/гетеродимеры СКЕ2-4 и мультимерные моноклональные антитела могут быть использованы для передачи сигнала, истощения и удаления иммунных клеток, участвующих в развитии астмы, аллергии и атопического заболевания. 1Б-22КА-опосредованная передача сигнала может также оказывать благоприятный эффект при заболеваниях поджелудочной железы, почек, гипофиза и нервной ткани. Может также наблюдаться благоприятный эффект при таких заболеваниях, как ИЗСД, ИНЗСД, панкреатит или карцинома поджелудочной железы. 1Б-22КА может служить в качестве мишени для МАЬ-терапии рака поджелудочной железы, где передача МАЬ-сигнала ингибирует рост раковых клеток и обеспечивают направленный иммуноопосредованный цитолиз (Тий А.Б. е! а1., 1. 1шшиио1. 161:3175-3185, 1988). Аналогичным образом, карцинома клеток почек может быть подвергнута лечению моноклональными антителами против 1Б-22КА-содержащих растворимых рецепторов настоящего изобретения.
Описанные здесь растворимые полипептиды ГБ-22КА могут быть использованы для связывания с одним из ГБ-22 или ГБ-20, или с обоими, либо для блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации их активности, в целях лечения аутоиммунного заболевания, атопического заболевания, ИНЗСД, панкреатита и нарушения функции почек, описанные выше. Растворимая форма ГБ-22КА может быть использована для стимуляции гуморального ответа, опосредуемого ТН-клетками и/или для
- 40 009026 стимуляции продуцирования 1Ь-4 или других цитокинов лимфоцитами или другими иммунными клетками.
Растворимые 1Ь-22КА-содержащие рецепторы настоящего изобретения могут быть использованы в качестве антагонистов цитокинов 1Ь-20 и 1Ь-22. Такие антагонистические эффекты могут быть достигнуты путем прямой нейтрализации или связывания 1Ь-20 или 1Ь-22. Растворимые рецепторы настоящего изобретения, помимо их действия в качестве антагонистов, могут связываться с 1Ь-22 и функционировать как белки-носители для цитокинов 1Ь-20 или 1Ь-22, что будет приводить к транспорту лиганда в различные ткани, органы и клетки организма. Сами по себе, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть лигированы или связаны с молекулами, полипептидами или химическими группами, которые направляют комплекс растворимый рецептор-лиганд в специфический участок, такой как ткань, специфическая иммунная клетка или опухоль. Так, например, при острой инфекции или при некоторых видах рака, благоприятный эффект может быть достигнут в результате индуцирования белков воспаления и белков, продуцирующихся в ответ на локальное воспаление острой фазы под действием 1Ь22. Таким образом, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть использованы для специфического направления действия 1Ь-20 или 1Ь-22. См., например, Соктап Ό. Су!окте 5:95-106, 1993 и Ретапбех-Вобап, К. Ехр. 0рт. 1пуек!. Огидк 9:497-513, 2000.
Кроме того, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть использованы для стабилизации 1Ь-20 или 1Ь-22 в целях увеличения биологической доступности, продолжительности терапевтического действия и/или эффективности лиганда путем стабилизации лиганда от деградации или клиренса или путем доставки лиганда в область его действия в организме. Так, например, природный комплекс 1Ь-6/растворимого 1Ь-6 стабилизирует 1Ь-6 и может передавать сигнал посредством рецептора др130. См. выше Соктап Ό. и Регпапбех-Во1гап К. Кроме того, 1Ь-22КА может быть объединен с когнатным лигандом, таким как 1Ь-22, так, чтобы он содержал комплекс лиганд/растворимый рецептор. Такие комплексы могут быть использованы для стимуляции ответов клеток, презентирующих субъединицу рецепторапартнера, такую как рО1К81 (1Ь-20ВВ) или СКР2-4 (1Ь-10ВВ). Клеточная специфичность комплексов 1Ь22КА/лиганд может отличаться от специфичности, наблюдаемой при введении одного лиганда. Кроме того, такие комплексы могут иметь характерные фармакокинетические свойства, такие как влияние на время полужизни, дозу/ответ и специфичность к органу или ткани. Таким образом, комплексы 1Ь22КА/1Ь-22 или 1Ь-22КА/1Ь-20 могут обладать агонистической активностью, что приводит к усилению иммунного ответа или к стимуляции мезангиальных клеток, или к стимуляции клеток печени. Альтернативно, лишь ткани, экспрессирующие субъединицу, передающую сигнал димеризации с комплексом, могут подвергаться воздействию аналогично ответу на действие комплекса 1Ь-6/1Ь-6К (Н1го!а Н. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8сг 92:4862-4866, 1995; Нпапо Т., Тботакоп А. (Еб.) Тбе Су!окте НапбЬоок, 3гб Еб., р.208-209). Комплексы растворимый рецептор/цитокин для 1Ь-12 и СКТР обнаруживают аналогичную активность.
Кроме того, воспаление представляет собой защитную реакцию организма в ответ на действие поражающего агента. Воспаление представляет собой каскад реакций, в которых участвует множество клеточных и гуморальных медиаторов. С одной стороны, супрессия воспалительных ответов может приводить к нарушению иммунологической реактивности хозяина, однако, если эта воспалительная реакция является нерегулируемой, то воспаление может приводить к серьезным осложнениям, включая хронические воспалительные заболевания (например, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника и т.п.), септический шок и недостаточности многих органов. Важно отметить, что эти различные патологические состояния опосредуются общими медиаторами воспаления. Эта совокупность заболеваний, которые характеризуется воспалением, дает высокий процент заболеваемости и смертности. Поэтому совершенно очевидно, что противовоспалительные белки, такие как 1Ь-22КА и анти-1Ь-22КА антитела, могут обладать значительным терапевтическим потенциалом для лечения огромного числа заболеваний человека и животных, от астмы и аллергии до аутоиммунных заболеваний и септического шока.
1. Артрит
Артрит, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артритные суставы, образующиеся в результате повреждений, и т.п., являются наиболее распространенными воспалительными заболеваниями, которые могут быть подвергнуты терапевтическому лечению с использованием противовоспалительных белков, таких как полипептиды 1Ь-22КА настоящего изобретения. Так, например, ревматоидный артрит (РА) является системным заболеванием, которое оказывает негативное влияние на состояние всего организма и является одним из самых распространенных форм артрита. Такой артрит характеризуется воспалением мембраны, выстилающей сустав, что приводит к возникновению боли, тугоподвижности суставов, высокой температуре, покраснению и опуханию. Воспалительные клетки высвобождают ферменты, которые могут расщеплять кость и хрящ. В результате ревматоидного артрита воспаленная выстилка суставов, т.е. синовиальный слой, может распространяться и на другие органы, и может поражать кость и хрящ, что приводит к повреждению суставов и, наряду с другими физиологическими эффектами, к возникновению сильных болей. Пораженный сустав может терять свою форму и положение, что приводит к возникновению болей и потери подвижности.
- 41 009026
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой иммуноопосредованное заболевание, в частности, характеризующееся воспалением и последующим повреждением ткани, что приводит к значительной потере трудоспособности и увеличивает процент летальных исходов. В определенных участках суставов, пораженных ревматоидным артритом, продуцируются различные цитокины. Различные исследования продемонстрировали, что ГБ-1 и ΊΝΕ-альфа, два прототипа провоспалительных цитокинов, играют важную роль в механизмах, приводящих к воспалению синовиального слоя и к прогрессирующей деструкции суставов. Действительно, введение ингибиторов Т№-альфа и ГБ-1 пациентам с РА приводит к резкому снижению клинических и биологических признаков воспаления и к снижению радиологических признаков эрозии кости и деструкции хряща. Однако несмотря на эти многообещающие результаты, следует отметить, что у значительного числа пациентов не наблюдалось ответной реакции на эти средства, что дает основание предполагать, что в патофизиологии артрита могут также участвовать и другие медиаторы (ОаЬау, Ехрей. Орт. Вю1. ТНег. 2(2):135-149, 2002). Одним из таких медиаторов могут быть ГО20 или ГО-22, а также молекула, которая связывается с ГО-22 или с ГО-20, или ингибирует их активность, такая как полипептиды 1Ь-22КА или анти-1Ь-22КА антитела или их партнеры по связыванию, может служить ценным терапевтическим средством для подавления воспаления при ревматоидном артрите и при других артритных заболеваниях.
Существует несколько животных-моделей с ревматоидным артритом, известных специалистам. Так, например, у моделей с коллаген-индуцированным артритом (С1А), у мышей развивается хронический воспалительный артрит, течение которого очень напоминает ревматоидный артрит у человека. Поскольку С1А имеет общие иммунологические и патологические признаки с РА, то эта модель является идеальной для поиска противовоспалительных соединений, являющихся эффективными для человека. Модель С1А представляет собой хорошо известную мышиную модель ревматоидного артрита, развитие которого зависит как от иммунного ответа, так и от воспалительного ответа. Иммунный ответ заключается во взаимодействии В-клеток и СЭ4'-Т-клеток в ответ на присутствие коллагена, который действует как антиген, и приводит к продуцированию антител против коллагена. Воспалительная фаза является результатом тканевого ответа, опосредуемого медиаторами воспаления и продуцируемого некоторыми из указанных антител, перекрестно реагирующих с мышиным нативным коллагеном и активирующих каскад реакций комплемента. Преимущество использования модели С1А заключается в том, что основные механизмы его патогенеза являются известными. Соответствующие Т-клеточные и В-клеточные эпитопы на коллагене типа II были идентифицированы, и различные иммунологические параметры (например, гиперчувствительность замедленного типа и антитела против коллагена) и воспалительные параметры (например, цитокины, хемокины и матрикс-разрушающие ферменты) иммуноопосредованного артрита были определены, а поэтому они могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых соединений в модели СЧА ^οο^, Сигг. Орт. КНеит. 3:407-20, 1999; кййатк е! а1., Iттиηο1. 89:9784-788, 1992; Муегк е! а1., ЫГе 8сг 61:1861-78, 1997 и капд е! а1., Iттиηο1. 92:8955-959, 1995).
Полипептиды, содержащие растворимый [^-22ВΛ Цсукг16), такой как ζсу!ο^16-Ρс4 или другой растворимый ГО-22КА, и гибридные белки вводили мышам с моделью СЧА для оценки возможности применения ГО-22КА в качестве антагониста к ГО-22 в целях ослабления симптомов и улучшения течения заболевания. Кроме того, результаты, указывающие на ингибирование ГО-22 под действием [^-22ВΛ. подтверждают высказанное предположение, что для ослабления симптомов и улучшения течения заболевания могут быть использованы и другие антагонисты ГО-22, такие как ГО^КА или антитело против ГО-22КА. Поскольку лиганд для ГО^КА, ГО-22, индуцирует продуцирование 8АА, который участвует в патогенезе ревматоидного артрита, и поскольку было продемонстрировано, что ГО-22КА способен ингибировать активность ГО-22 и 8АА ш уйго и ш уйю, то системное или локальное введение ГО^КАсодержащих полипептидов, таких как ζсу!ο^16-Ρс4 или других растворимых рецепторов ГО-22 (например, ГО-22КА; 8ЕО ГО NО:3) и анти-ГО^КА антител, а также гибридных белков может потенциально приводить к подавлению воспалительного ответа при РА. Инъекции 10 мкг ζсу!ο^16-Ρс (три раза в неделю в течение 4 недель) приводили к значительному снижению тяжести заболевания (оцениваемого соответствующими баллами) (по состоянию лап, появлению признаков воспаления или заболевания). Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды ГО^КА, анти-[^-22ВΛ антитела, антиГО-22 антитела или связывающиеся партнеры и т.п.
Одной группой исследователей было показано, что антимышиное антитело против ГО-22 может ослаблять симптомы заболевания в СЧА-модели по сравнению с контрольными мышами, что указывает на то, что теоретически полипептиды растворимого ГО-22КА и нейтрализующие антитела против ГО^КА могут давать положительный эффект при лечения заболеваний у человека. Профилактическое введение одного крысиного моноклонального антитела, специфичного к мышиному ГО-22 (Р3/1), или его введение после развития ОА-индуцированного артрита у данной модели приводило к ослаблению симптомов артрита у животных (публикация кГРО 02/068476, опубликованная 9 сентября, 2002). Поэтому, растворимые полипептиды ГО-22КА и анти-ГО^КА антитела настоящего изобретения, включая нейтрализующие антитела против человеческого ГО-22КА настоящего изобретения, могут быть использованы для нейтрализации ГО-22 и ГО-20 при лечении конкретных заболеваний человека, таких как псориаз, псориазный артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), колит, и других описанных здесь
- 42 009026 воспалительных состояний.
2. Эндотоксемия
Эндотоксемия представляет собой тяжелое состояние, которое, в основном, вызывается инфекционными агентами, такими как бактерии и другие инфекционные патогены, или развивается на фоне сепсиса, синдрома токсического шока, или у пациентов с ослабленной иммунной системой, подвергавшихся условно-патогенным инфекциям, и т.п. Терапевтическое применение противовоспалительных белков, таких как полипептиды I^-22КΛ и антитела настоящего изобретения, может способствовать предупреждению или лечению эндотоксемии у человека и животных. Полипептид I^-22КА, анти-I^-22КА антитела, анти-I^-22 антитела или связывающие партнеры могут служить в качестве терапевтических средств для ослабления симптомов воспаления и патологических эффектов при эндотоксемии.
В развитии эндотоксемии, индуцированной липополисахаридами (ЛПС), участвует множество провоспалительных медиаторов, которые продуцируют патологические эффекты при инфекционных заболеваниях, а поэтому ЛПС-индуцированная эндотоксемия грызунов широко используется как подходящая модель для исследований фармакологических эффектов предполагаемых провоспалительных или иммуномодулирующих агентов. ЛПС, продуцируемый у грамположительных бактерий, является главным этиологическим фактором в патогенезе септического шока (С1аикиег е! а1., Ьаисе! 338:732, 1991). Действительно, состояние, подобное шоку, может быть индуцировано экспериментально путем одной инъекции ЛПС животным. Молекулы, продуцируемые клетками, отвечающими на ЛПС, могут быть нацелены на патогены прямо или опосредованно. Хотя эти биологические ответы служат защитой хозяина от поражающих его патогенов, однако они могут также оказывать негативное действие. Так, например, интенсивная стимуляция природного иммунитета, осуществляемая в результате тяжелой инфекции, вызываемой грамотрицательными бактериями, приводит к избыточному продуцированию цитокинов и других молекул, и к развитию летального синдрома, синдрома септического шока, который характеризуется повышением температуры, гипотензией, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови и недостаточностью многих органов (Битйти е! а1., Се11 103:1071-1083, 2000).
Такое токсическое действие ЛПС, главным образом, связано с активацией макрофагов, приводящей к высвобождению множества медиаторов воспаления. Один из этих медиаторов, а именно Т№, очевидно играет наиболее важную роль, на что указывает предупреждение ЛПС-токсичности путем введения нейтрализующих антител против ЮТ (Веи!1ег е! а1., Бс1еисе 229:869, 1985). Было точно установлено, что инъекция 1 мкг ЛПС Е.сой мышам С57ВЬ/61 приводит к значительному увеличению уровней ΙΕ-6, ТНЕальфа, ΙΠ-1 и белков острой фазы (например, БАА) приблизительно через 2 ч после инъекции. Токсичность ЛПС, очевидно, опосредуется этими цитокинами, поскольку пассивная иммунизация против этих медиаторов может приводить к снижению смертности (Веи!1ег е! а1., Бс1еисе 229:869, 1985). Возможной стратегией воздействия на иммунную систему в целях предупреждения и/или лечения септического шока является использование анти-Т№ тАЬ, антагониста рецептора ΙΕ-1, ЫЕ, ΙΗ-10 и С-СБЕ.
Введение растворимых I^-22КА-содержащих полипептидов, таких как хсу1ог16-Ес4 или другой растворимый I^-22КА, и гибридных белков указанным моделям с ЛПС-индуцированным заболеванием осуществляют в целях оценки возможности использования ЕЕ^КА для ослабления симптомов или улучшения течения ЛПС-индуцированного заболевания. Кроме того, результаты, указывающие на ингибирование ΙΕ-22 под действием I^-22КА, подтверждают высказанное предположение, что для ослабления симптомов и улучшения течения ЛПС-индуцированной модели заболевания могут быть использованы и другие антагонисты ΙΕ-22, такие как I^-22КА или антитело против I^-22КА. На этой модели было показано, что инъекция ЛПС приводит к индуцированию ΙΕ-22 и к возможности лечения заболевания с использованием полипептидов I^-22КΛ. Поскольку ЛПС индуцирует продуцирование провоспалительного ΙΕ-22, БАА и других провоспалительных факторов, которые возможно участвуют в развитии патологий при эндотоксемии, то нейтрализация активности ΙΕ-22, БАА и других провоспалительных факторов может быть применима к подавлению симптомов эндотоксемии, таких как симптомы, наблюдаемые при эндотоксическом шоке. Другими потенциальными терапевтическими средствами являются полипептиды I^-22КΛ, анти-I^-22КА антитела, ημη-ΙΕ-22 антитела или связывающиеся партнеры и т.п.
3. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)
В Соединенных Штатах примерно 500000 человек страдает воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), которые могут поражать либо толстую и прямую кишку (язвенный колит), либо и ту, и другую, а также тонкий и толстый кишечник (болезнь Крона). Этиология этих заболеваний пока неясна, однако, известно, что эти заболевания характеризуются хроническим воспалением пораженных тканей. Полипептиды I^-22КА, анти-I^-22КΛ антитела или ημή-ΙΕ^ антитела и связывающие агенты могут служить в качестве ценных терапевтических средств для ослабления воспаления и патологических эффектов при ВЗК и родственных заболеваниях.
Язвенный колит (ЯК) представляет собой воспалительное заболевание толстого кишечника, обычно называемого толстой кишкой, характеризующееся воспалением и изъявлением слизистой оболочки и/или глубокого слоя выстилки толстой кишки. Это воспаление вызывает частое опорожнение толстой кишки, приводящее к диарее. Его симптомами являются частый жидкий стул и ассоциированные с ним спазмы брюшной полости, повышение температуры и снижение массы тела. Хотя точная причина развития ЯК
- 43 009026 неясна, однако, недавние исследования позволяют предположить, что она является следствием действия природных защитных сил организма против белков, присутствующих в данном организме, которые этот организм воспринимает как чужеродные (аутоиммунная реакция). Вероятно, вследствие того, что эти белки напоминают бактериальные белки, присутствующие в кишечнике, они могут либо провоцировать, либо стимулировать воспалительный процесс, который начинается с повреждения выстилки толстой кишки. При поражении выстилки толстой кишки образуются язвы с выделением слизи, гноя и крови. Это заболевание обычно начинается в ректальной области и может постепенно распространяться на весь толстый кишечник. Рецидивы воспаления приводят к утолщению стенок тонкого кишечника и прямой кишки с образованием рубцовой ткани. Некроз ткани толстой кишки или сепсис могут приводить к тяжелым последствиям. Симптомы язвенного колита варьируются по своей тяжести и их появление может быть постепенным или внезапным. Приступы могут быть спровоцированы многими факторами, включая респираторные инфекции или стресс.
В настоящее время нет доступных средств для лечения ЯК, и современная терапия направлена на подавление патологического воспалительного процесса в выстилке толстой кишки. Эта терапия предусматривает использование кортикостероидных иммунодепрессантов (например, азатиоприна, меркаптопурина и метотрексата) и аминосалициталов, которые обычно применяются для лечения данного заболевания. Однако длительное использование иммунодепрессантов, таких как кортикостероиды и азатиоприн, может приводить к тяжелым побочным эффектам, включая истончения костей, катаракту, инфекции и негативное воздействие на печень и костный мозг. Пациентам, лечение которых современными терапевтическими средствами не дало удовлетворительных результатов, показана хирургическая операция. Хирургическая операция предусматривает удаление всей толстой и прямой кишки.
Существует несколько животных с моделью заболевания, имитирующего язвенный колит. Наиболее широко используемой моделью является модель колита, индуцированного 2,4,6тринитробенсульфоновой кислотой/этанолом (ТХВ8), которые вызывают хроническое воспаление и изъявление толстой кишки. При введении ТХВ8 в толстую кишку восприимчивой мыши посредством интраректальной инстилляции, эти соединения индуцируют Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ в слизистой толстой кишки, что приводит к генерализованному воспалению слизистой, характеризующемуся плотной инфильтрацией Т-клеток и макрофагов по всей стенке толстого кишечника. Кроме того, такая гистопатологическая картина сопровождается клинической картиной прогрессирующего снижения массы тела (истощения), геморрагической диареи, выпадения прямой кишки и утолщения стенки толстого кишечника (№игаШ е1 а1. 1п1егп. Кеу. 1ттипо1. 19:51-62, 2000).
В других моделях колита используется натриевая соль сульфата декстрана (Ό88), которые индуцирует острый колит, проявляющийся геморрагической диареей, снижением массы тела, укорочением толстой кишки и изъявлением слизистой, сопровождающейся нейтрофильной инфильтрацией. Гистологически, Όδδ-индуцированный колит характеризуется инфильтрацией воспалительных клеток в собственную пластинку слизистой с развитием лимфоидной гиперплазии, повреждений локальных криптов и эпителиальных язв. Эти изменения очевидно обусловлены токсическим действием Όδδ на эпителий, фагоцитозом клеток собственной пластинки слизистой и продуцирование Т№-альфа и ШЫ-гамма. Несмотря на широкое применение этого соединения, некоторые проблемы, связанные с механизмами действия Όδδ и возможностью их применения в исследовании заболеваний человека, остаются нерешенными. Ό88 рассматривается как Т-клеточно-независимая модель, поскольку его действие наблюдается у мышей с Тклеточным дефицитом, таких как мыши 8СГО.
Введение растворимых 1Ь-22КА-содержащих полипептидов, таких как хсу1ог16-Ес4 или другой растворимый 1Ь-22КА, и гибридных белков ТХВ8- или Όδδ-моделям осуществляют в целях оценки возможности использования 1Ь-22КА для ослабления симптомов или улучшения течения заболевания желудочно-кишечного тракта. Кроме того, результаты, указывающие на ингибирование ΙΌ-22 под действием 1Ь-22КА, подтверждают высказанное предположение, что для ослабления симптомов у животных с моделью колита/ВЗК и улучшение течения заболевания могут быть использованы и другие антагонисты 1Ь22, такие как 1Ь-22КА или антитело против 1Ь-22КА. Авторы настоящего изобретения наблюдали увеличение экспрессии ΙΌ-22 в тканях толстой кишки у Όδδ-мышей при ОТ-ПЦР и синергическую активность ΙΌ-22 и ΙΚ-1 β по отношению к клеточным линиям кишечника. Это наблюдение указывает на то, что ΙΌ-22 может играть определенную роль в воспалительном ответе при колите, и нейтрализация ΙΌ-22активности путем введения полипептидов 1Ь-22КА является потенциальным терапевтическим способом лечения ВЗК. Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды 1Ь-22КА, анти1Ь-22КА антитела, анти-1Ь-22 антитела или связывающиеся партнеры и т.п.
4. Псориаз
Псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, которым страдает более 7 млн американцев. Псориаз возникает при аномальном росте новых клеток кожи, что приводит к воспалению и отеку кожи и образованию чешуйчатых бляшек в местах, где старая кожа не слущивается достаточно быстро. Наиболее часто встречающейся формой псориаза является бляшковый псориаз, характеризующийся образующимися на коже воспалительными бляшками (поражениями), покрытые серебристо-белыми чешуйками. Псориаз может ограничиваться несколькими бляшками, либо он может
- 44 009026 охватывать умеренные или обширные поверхности кожи, при которых, главным образом, поражаются волосистая часть головы, колени, локти и туловище. Несмотря на явно видимые поражения, псориаз не является контагиозным заболеванием. Патогенез этого заболевания обусловлен хроническим воспалением пораженных тканей. Полипептиды ГЛ-22КА, анти-ГЬ-22КА антитела, анти-ГЬ-22 антитела и анти-ГЬ-20 антитела или связывающие партнеры могут быть использованы в качестве ценных терапевтических средств для ослабления симптомов воспаления и патологических эффектов при псориазе, а также других воспалительных кожных болезней, аллергических реакций кожи и слизистой, и родственных заболеваний.
Псориаз представляет собой Т-клеточно-опосредованное воспалительное заболевание кожи, которое может вызывать у пациента значительный дискомфорт. Это заболевание не поддается лечению и поражает людей всех возрастов. Псориазом страдает приблизительно 2% населения Европы и Северной Америки. Индивидуумы с легким течением псориаза часто могут самостоятельно лечиться от этого заболевания с использованием средств для местного применения; однако, более 1 млн пациентов во всем мире нуждаются в терапии путем облучения ультрафиолетом или в системной терапии с использованием иммунодепрессантов. К сожалению, неудобства и риск, связанные с применением ультрафиолетового облучения, а также токсичность многих терапевтических средств, ограничивают продолжительность их использования. Более того, обычно у пациентов наблюдаются рецидивы псориаза, а в некоторых случаях, такие рецидивы появляется через непродолжительный промежуток времени после прекращения иммуносупрессорной терапии.
ГЬ-20 представляет собой новый гомолог ГЬ-10, который, как было показано, ответственен за смертность новорожденных от патологий кожи, включая аберратную эпидермальную дифференциацию у ГЬ20-трансгенных мышей (В1итЬегд Н. е! а1., Се11 104:9-19, 2001). При псориазе кожи активация рецептора ГЬ-20 резко усиливается. Поскольку ГЬ-22 и ГЬ-20 имеют общую рецепторную субъединицу (хсу1ог11). и поскольку ГЕ-22-трансгенные мыши обнаруживают аналогичный фенотип, то возможно, что ГЬ-22 также участвует в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Введение полипептида ГЬ22КА или антагонистов, таких как анти-ГЬ-22КА антитела, подкожно или местно может приводить к ослаблению воспаления и его симптомов. Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды ГЛ-22КА, полипептиды растворимый хсу1ог11/рецептор СКР2-4, анти-ГЬ-22 антитела или связывающиеся партнеры и т. п.
Кроме того, при псориазных поражениях у человека наблюдается сверхэкспрессия ГЬ-22 и ГЬ-20, что позволяет предположить, что ГЬ-22, подобно ГЬ-20, также участвует в развитии псориаза у человека. Более того, как описано в настоящем изобретении, при сверхэкспрессии ГЬ-22 или ГЬ-20 у трансгенных мышей наблюдается утолщение эпидермиса и вовлечение в патологический процесс иммунных клеток, характерных для псориазного фетотипа; и, кроме того, при инъекции ГЬ-22 нормальным мышам наблюдалось утолщение эпидермиса и вовлечение в патологический процесс иммунных клеток, характерных для псориазного фенотипа, которые удалялись под действием антагониста растворимого рецептора ГЬ22КА (хсу1ог16; публикация АГР0 № \¥0 01/40467). Кроме того, данные ш νίνυ позволяют предположить, что провоспалительный цитокин ГЬ-22 участвует в развитии псориаза. Таким образом, антагонисты активности ГЬ-22 и ГЬ-20, такие как растворимые рецепторы ГЛ-22КА и антитела против ГЛ-22КА, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против человеческого ГЛ-22КА настоящего изобретения, могут быть использованы, в частности, в качестве антагонистов ГЬ-20 и ГЬ-22, взятых отдельно или вместе, для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, а особенно для лечения псориаза. Более того, антагонисты активности ГЬ-22 и ГЬ-20, такие как растворимые рецепторы ГЛ-22КА и антитела против ГЛ-22КА, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против человеческого ГЛ-22КА настоящего изобретения, могут быть использованы для лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве агентов, которые связываются с ГЬ-22 или с ГЬ-20 и ГЬ-22, или блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность, и которые могут быть использованы, в частности, для лечения атопического дерматита, ВЗК, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита, псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (РЗВ), септического шока, недостаточности многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Кроме того, анти-ГЬ-22КА антитела и растворимые рецепторы ГЛ-22КА настоящего изобретения могут быть использованы для предупреждения и прекращение снижения массы тела, ассоциированной с рядом описанных здесь воспалительных заболеваний, а также с раком (например, при химиотерапии и кахексии) и инфекционными заболеваниями. Так, например, значительное снижение массы тела является важным показателем, ассоциированным с моделями септицемии, РС, РА и опухолей. Кроме того, снижение массы тела является ключевым параметром для многих заболеваний человека, включая рак, инфекционные болезни и воспалительные болезни. Снижение массы тела наблюдалось у мышей, инфицированных ГЬ-22-А-аденовирусом, описанным в настоящем изобретении. Анти-ГЬ-22КА антитела и антагонисты ГЬ-22, такие как растворимые рецепторы ГЛ-22КА и антитела против ГЛ-22КА настоящего изобретения, а также рецепторы хсу1ог16 (ГЛ-22КА2) могут быть протестированы на их способность предот
- 45 009026 вращать или прекращать снижение массы тела у мышей, инфицированных ΙΣ-22-аденовирусом, описанным в настоящем изобретении. Методы составления профилактических или терапевтических схем введения таких антагонистов Ш-22 известны специалистам, и могут быть разработаны на основе описанных здесь методов.
Полипептиды растворимого рецептора Ш^КА и антитела против Ш^КА могут быть также использованы в диагностических системах для определения уровней лиганда Ш-22 или Ш-22 в кровотоке и для детекции Ш-22, ассоциированного с воспалительным ответом острой фазы. В родственных вариантах осуществления изобретения, антитела и другие агенты, которые специфически связываются с растворимыми рецепторами Ш^КА настоящего изобретения, могут быть использованы для определения уровней полипептидов рецепторов в кровотоке; и наоборот, сами растворимые рецепторы Ш-22 К А могут быть использованы для определения уровней локально действующих полипептидов Ш-22 и Ш-20 в кровотоке. Увеличение или снижение уровней лиганда или полипептидов рецептора могут служить показателями патологических состояний, включая воспаление или рак. Известно, что Ш-22 индуцирует воспалительный ответ, ассоциированный с острой фазой. Кроме того, детекция белков или молекул острой фазы, таких как Ш-20 или Ш-22, может служить показателем хронического воспалительного состояния при некоторых патологиях (например, при псориазе, ревматоидном артрите, колите, ВЗК). Детекция таких состояний помогает установить диагноз заболевания, а также позволяет врачу назначить требующееся лечение.
Ш и!его (внутриматочное) введение нейтрализующих антител против Ш-22 и Ш-20 может быть применено для того, чтобы убедиться в эффективности ш νίνο моделей заболевания, показателем которой является ослабление или элиминация кожного фенотипа, наблюдаемых у ΙΕ-22-трансгенных детенышей со сверхэкспрессией Ш-22, или Ш-20-трансгенных детенышей со сверхэкспрессией Ш-20. Случаи проведения ш и!его обработки нейтрализующими моноклональными антителами (тАЬ) были ранее известны специалистам. В одном случае, на развитие В-клеток субсерии В-1 оказывала значительное воздействие обработка беременных самок мышей тАЬ против В-клетко-специфичной молекулы, 0Ό19 (например, Кгор Ι. е! а1., Еиг. 1 Iттиηο1. 26 (1) : 238-42, 1996). Кгор Ι. и др. в определенное время внутрибрюшинно инъецировали 500 мкг крысиного тАЬ против мышиных СО 19 (или контрольное крысиное АЬ соответствующего изотипа), в РВ8, начиная с 9 дня беременности, а затем через день вплоть до родов. Детенышам в возрасте 10 дней также сразу инъецировали 500 мкг указанных антител. В другом случае, Тапака Т. и др. обнаружили, что ш и!его обработка моноклональными антителами против бета-цепи рецептора Ш-2 приводила к полному прекращению роста дендритных эпидермальных клеток ТНу-1+. Две отдельные субъединицы рецептора Ш-2, т.е. альфа-цепь (Ш-2К-альфа) и бета-цепь (Ш-2К-бета) экспрессируются по почти взаимоисключающему механизму в процессе всего онтогенеза фетального тимуса. Блокирование Ш-2-бета, сигнал-передающего компонента Ш-2Е путем введения нейтрализующего тАЬ против Ш-2К-бета приводит к полному и к селективному исчезновению ТЬу-1+ дендритных эпидермальных клеток кожи. Но этот факт не влияет на развитие каких-либо других субсерий Т-клеток. Это указывает на то, что Ш-2 играет решающую роль в развитии фетальных У-гамма 5+-клеток и их предшественников (см. Тапака Т. е! а1., Ш!. Iттиηο1. 4(4):487-9, 1992). Кроме того, 8ска!!етапп С.С. и др. показали, что для нормального развития сердечно-сосудистой системы у мышей необходимо присутствие РЭСЕ-А в т и!его-системе. Некоторые имеющиеся данные позволяют предположить, что для нормального развития сердечно-сосудистой системы эмбриона необходимо наличие цепи А тромбоцитарного фактора роста А (РЭСЕ-А). Введение нейтрализующих антител против РЭСЕ-А мышам в отпадающую оболочку матки приводит к селективному нарушению взаимодействия лиганд РЭСЕ-А - рецептор ш νίνο в течение 18-24 ч и позволяет определить, является ли РЭСЕ-А необходимым для развития сердечнососудистой системы и является ли он вообще необходимым (см. 8сйайетапп С. С. е! а1., Эех. Вю1. 176(1):133-42, 1996). Эти результаты, а также другие известные данные указывают на то, что нейтрализующие тАЬ могут давать сильный эффект при их введении ш и!его. Аналогичным образом, могут быть представлены данные, указывающие на то, что нейтрализация Ш-20 или ΙΣ-22 моноклональными антителами 1п νίνο у животных с моделью заболевания приводит к эффективному ослаблению или элиминации кожного фенотипа, обнаруживаемого у Ш-20 и ΙΕ-22-трансгенных детенышей, у которых наблюдается сверхэкспрессия Ш-20 и Ш-22, соответственно. Эти трансгенные мыши рождаются с блестящей кожей, что обусловлено, по крайней мере частично, утолщением эпидермиса как описано в настоящем изобретении. Могут также рождаться трансгенные (ТС) ΙΣ-20-детеныши, у которых присутствуют очень низкие уровни трансгенных цитокинов, и эти детеныши доживают до половозрелового возраста, а трансгенные Ш-22-детеныши умирают вскоре после рождения, и обычно не доживают и до 5-дневного возраста.
Так, например, нейтрализующими антителами против Ш-20 являются такие антитела, как нейтрализующие моноклональные антитела, которые могут связываться с антигенными эпитопами Ш-20 и нейтрализовать активность Ш-20. В соответствии с этим, антигенные эпитоп-несущие пептиды и полипептид Ш-20 могут быть использованы для вырабатывания антител, которые связываются с описанными здесь полипептидами ΙΣ-20, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против Ш-20, которые являются нейтрализующими, и которые могут связываться с ΙΣ-20 или блокировать, ингибировать, снижать, подавлять или нейтрализовать активность Ш-22. Такие нейтрализующие монокло
- 46 009026 нальные антитела настоящего изобретения могут связываться с антигенным эпитопом 1Ь-20. Эти эпитопы в 8Е0 ΙΌ N0:8, предсказанные по кривой Джеймсона-Вольфа, например с использованием программы □ХАЗТАЯ Рго!еап (^NА8ТΛΒ, 1пс., Маб1коп, XVI), являются предпочтительными антигенными эпитопами и могут быть определены любым специалистом. Такие антигенные эпитопы включают аминокислотные остатки 42 (11е) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 42 (11е) - 60 (11е) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 42 (11е) - 69 (О1и) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 42 (11е) - 81 (Сук) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 42 (11е) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 42 (11е) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 60 (11е) - 69 (О1и) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 60 (11е) - 81 (Сук) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 60 (11е) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 60 (11е) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 69 (О1и) - 81 (Сук) 8Е0 ΙΌ N0:8; аминокислотные остатки 69 (О1и) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΌ N0:8, аминокислотные остатки 69 (О1и) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8, аминокислотные остатки 81 (Сук) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΌ N0:8, аминокислотные остатки 81 (Сук) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8 и аминокислотные остатки 96 (Ьук) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:8.
Помимо других описанных здесь моделей заболевания, активность анти-1Ь-22КА антител по отношению к воспалительной ткани, взятой из области псориазных поражений у человека, может быть измерена ш у1уо с использованием мышей с моделью тяжелого комбинированного иммунодефицита (8СШ). Было получено несколько мышей с моделью заболевания, и этим мышам с иммунодефицитом были имплантированы человеческие клетки (которые имеют общее название модели с ксенотрансплантатом), см., например, Сайап А.К., Ооид1ак Е. Ьеик. Кек. 18:513-22, 1994 и Р1ауе11, Ό.Ι Нета!о1од1са1 0псо1оду 14:67-82, 1996. Для получения т у1уо модели с ксенотрансплантатом для имитации псориаза человека, мышам 8СШ с моделью заболевания, имплантировали ткани человеческой кожи, пораженной псориазом, и этих мышей подвергали антигенной стимуляции соответствующим антагонистом. Кроме того, для оценки антагонистов 1Ь-20 и 1Ь-22 могут быть использованы другие животные с моделью псориаза, для этого, например, мыши АОК129, которым имплантируют человеческую кожу, пораженную псориазом с моделью заболевания, и подвергают антигенной стимуляции соответствующим антагонистом (см., например, Воутап, О. е! а1., 1. Ехр. Меб., публикация 0пРпе #20031482, 2004, которая вводится в настоящее изобретение посредством ссылки). Предпочтительными антагонистами являются анти-1Ь-22КА антитела, которые связываются с 1Ь-22 или с 1Ь-20 и 1Ь-22 или блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность, однако, в этой модели могут быть использованы анти-1Ь-20 антитела или анти-1Ь-22 антитела (отдельно или в комбинации), растворимый 1Б-22КА, а также другие антагонисты 1Ь-20 и 1Ь-22. Аналогичным образом, ткани или клетки, взятые из органа человека, пораженного колитом, ВЗК, артритом или другим воспалительным заболеванием могут быть использованы в 8СШмодели для определения противовоспалительных свойств антагонистов 1Ь-20 и 1Ь-22, описанных в настоящем изобретении.
Терапевтические средства для устранения, замедления или ослабления воспаления, полученные с использованием анти-1Ь-22КА антител или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов, могут быть протестированы путем введения анти-1Ь-22КА антител или растворимых соединений 1Б-22КА мышам 8СШ, несущим человеческую воспалительную ткань (например, псориазные поражения и т.п.) или другим описанным здесь животным с моделью заболевания. Эффективность такой обработки определяют и статистически оценивают по увеличению противовоспалительного эффекта у обработанной популяции в течение определенного периода времени методами, хорошо известными специалистам. Некоторыми репрезентативными методами являются, но не ограничиваются ими, измерение, например, в модели с псориазом, толщины эпидермиса, числа воспалительных клеток в верхнем слое дермы и степень паракератоза. Эти методы известны и описаны в настоящем изобретении. Например, см. 2е1д1ег М. е! а1., ЬаЬ. 1пуек!. 81:1253, 2001; 2о11пег Т.М. е! а1., 1. С1ш. 1пуек!. 109:671, 2002; Υатаηака N. е! а1., М1сгоЬю1. 1ттипо1. 45:507, 2001; КаусРаибРил 8.Р. е! а1., Вг. 1. Ьегта1о1. 144:931, 2001; ВоеРпске ХУ.Н. е! а1., АгсР. Ьегта1о1. Кек. 291:104, 1999; ВоеРпске ХУ.Н. е! а1., 1. 1пуек!. Ьегта1о1. 116:596, 2001; №ско1оГГ ВЛ. е! а1., Ат. 1. Ра!Ро1. 146:580, 1995; ВоеРпске ХУ.Н. е! а1., 1. Си!ап. Ра!Ро1. 24:1, 1997; 8ида1 ЬМ. е! а1., 1. Ьегта!о1. 8сг 17:85, 1998 и УШабкеп Ь.8. е! а1., 1. СРп. 1пуек!. 112:1571, 2003. Мониторинг течения воспалительного процесса в течение определенного периода времени может быть проведен хорошо известными методами, такими как проточная цитометрия (или ПЦР) для определения числа воспалительных или пораженных клеток, присутствующих в образце, для оценки состояния при ВЗК (снижение массы тела, диарея, ректальное кровотечение, длина толстой кишки), оценки патологии лап и оценки воспаления в моделях С1А и РА. Так, например, терапевтические стратегии, подходящие для тестирования таких моделей, предусматривают непосредственную обработку анти-1Ь-22КА антителами, другими антагонистами 1Ь-20 и 1Ь-22 (одним или обоими) или родственными конъюгатами или антагонистами, и эти стратегии основаны на устранении взаимодействия анти-1Ь-22КА антител с их лигандами 1Ь-20 и 1Ь-22, либо, для клеточной терапии, эти стратегии предусматривают использование анти-1Ь-22КА антител или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов.
Кроме того, псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, которое ассоциируется с присутствием гиперпластических эпидермальных кератиноцитов и инфильтрирующих мононуклеарных клеток, включая СЬ4'-Т-клетки памяти, нейтрофилы и макрофаги (СРпк!орРегк, 1п!.
- 47 009026
АгсН. А11егду Тттипо1. 110:199, 1996). В настоящее время считается, что присутствующие в окружающей среде антигены играют значительную роль в инициации и в развитии патологий данного заболевания. Однако это выражается в утрате толерантности к аутоантигенам, которые, очевидно, являются медиаторами патологии псориаза. Дендритные клетки и СИ4+-Т-клетки, очевидно, играют важную роль в презентации и распознавании антигена, который опосредует иммунный ответ, что приводит к развитию патологии. Авторами настоящего изобретения была недавно разработана модель псориаза, основанная на модели переноса 004+0045^6 (Иауепрой е! а1., БЛета!. ИптипорНагтасоО 2:653-672). Мышам вводят антитела против ΙΕ-20, антитела против ΙΕ-22 или антитела против Ι0-20Β и/или Г0-22К, такие как анти!Е-22КА антитела настоящего изобретения или растворимый Г0-22КА. Ингибирование патологических признаков (поражение кожи, воспалительные цитокины) указывает на эффективность антагонистов ΙΕ-20 и ΙΕ-22 при псориазе, например, антиЧЕ^КА антител, или растворимых рецепторов Ш^КА, или других антагонистов, таких как антитела против ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22 или их рецепторов.
Атопический дерматит
ΙΕ-20 и ΙΕ-22 активируются в образцах, взятых у пациентов с атопическим дерматитом (АД). АД представляет собой широко распространенное хроническое воспалительное заболевание, которое характеризуется присутствием гиперактивированных цитокинов Т-клеток-хелперов субсерии 2 (ТН2). Хотя этиология АД точно неизвестна, однако, считается, что в патогенезе АД участвует множество факторов, включая гиперактивные иммунные ТН2-ответы, аутоиммунные реакции, инфекции, аллергены и генетическая предрасположенность. Ключевыми признаками такого заболевания являются ксероз (сухость кожи), зуд (чесотка кожи), конъюнктивит, воспалительные поражения кожи, инфекции, вызываемые З!арНу1ососсик аигеик, повышенные уровни эозинофилов в крови, повышенные уровни ЦЕ и ^С1 в сыворотке и хронический дерматит с инфильтрацией Т-клеток, тучных клеток, макрофагов и эозинофилов. Известно, колонизация или инфицирование З. аигеик приводит к обострению АД и переводу этого кожного заболевания в статус хронического заболевания.
АД часто наблюдается у пациентов с астмой и аллергическим ринитом и нередко является начальным проявлением аллергического заболевания. Такими аллергическими заболеваниями страдает примерно 20% населения Западных стран, и, по неизвестным причинам, заболеваемость АД в развитых странах продолжает расти. АД обычно начинается в детском возрасте и может часто сохраняться в юношеском возрасте вплоть совершеннолетия. Современное лечение АД предусматривает использование кортикостероидов для местного применения, циклоспорина А, вводимого перорально, некортикостероидных иммунодепрессантов, таких как такролимус (ЕК506 в виде мази) и интерферона-гамма. Несмотря на разнообразие методов лечения АД, у многих пациентов не наблюдается улучшения, либо у них развиваются побочные реакции на лекарственные средства, а поэтому требуется получение других более эффективных терапевтических средств. Растворимые полипептиды £Е-22КА и антиЧЕ^КА антитела настоящего изобретения, включая нейтрализующие антитела против человеческого !Е-22КА настоящего изобретения, могут быть использованы для нейтрализации ΙΕ-22 и ΙΕ-20 в целях проведения лечения конкретных заболеваний человека, таких как атопический дерматит, воспалительные кожные болезни и другие описанные здесь воспалительные заболевания.
Для фармацевтического применения растворимый £Е-22КА или антиЧЕ^КА антитела настоящего изобретения получают в виде композиции для парентерального, а в частности, внутривенного или подкожного введения стандартными методами. Внутривенное введение может быть осуществлено путем инъекции ударной дозы, путем регулируемого высвобождения лекарственного средства, например, с использованием мини-насосов или другой соответствующей техники или путем вливания в течение определенного периода времени, обычно, от одного до нескольких часов. В основном, фармацевтические композиции включают гемопоэтический белок в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, 5% декстроза в воде или т.п. Композиции могут также включать один или несколько наполнителей, консервантов, солюбилизаторов, забуферивающих агентов, альбумина для предупреждения потери белка на поверхности сосуда и т. п. При применении такой комбинированной терапии, цитокины могут быть объединены в одну композицию, либо они могут быть введены в отдельных композициях. Методы получения композиции хорошо известны специалистам и описаны, например, в руководстве Кетюд!оп'к РНагтасеиНса1к Заепсек, Сеппаго, еб., Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп РА, 1990, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки. Терапевтические дозы обычно составляют в пределах от 0,1 до 100 мг/кг массы тела пациента в день, а предпочтительно 0,5-20 мг/кг в день, при этом, точная доза определяется врачом-клиницистом в соответствии с принятыми стандартами, такими как природа и тяжесть состояния, подвергаемого лечению, индивидуальные особенности пациента и т.п. Определение дозы может быть осуществлено любым специалистом. Белки обычно вводят в течение периода времени до 28 дней после проведения химиотерапии или трансплантации костного мозга, либо до тех пор, пока количество тромбоцитов не будет достигать >20000/мм3, а предпочтительно >50000/мм3. В большинстве случаев, белки вводят в течение одной недели или менее, а обычно в течение периода времени от одного до трех дней. В общих чертах, терапевтически эффективным количеством растворимого Ш^КА или антиЧЕ^КА антител настоящего изобретения является количество, достаточное для продуцирования клинически значимого увеличения
- 48 009026 пролиферации и/или дифференцировки лимфоидных или миелоидных клеток-предшественников, на что будет указывать увеличение уровней зрелых клеток (например, тромбоцитов или нейтрофилов) в кровотоке. Лечение тромбоцитарных расстройств может продолжаться до достижения числа тромбоцитов по крайней мере 20000/мм3, а предпочтительно 50000/мм3. Растворимый I^-22КΑ и анти-I^-22КΑ антитела настоящего изобретения могут быть также введены в комбинации с другими цитокинами, такими как Ш3, -6 и -11; фактор стволовых клеток; эритропоэтин; С-С8Е и СМ-С8Е. В соответствии со схемой проведения комбинированной терапии, суточные дозы других цитокинов обычно составляют: ЕРО 150 ед/кг; СМ-С8Е 5-15 мкг/кг; Ш-3 1-5 мкг/кг и С-С8Е 1-25 мкг/кг. Комбинированная терапия с ЕРО показана, например, для пациентов с анемией, выражающейся низким уровнем ЕРО.
В общих чертах, доза вводимого растворимого Ш-22КА (или аналога Ш-22КА или Ш-22КАсодержащего гибридного белка) или анти-I^-22КΑ антител может варьироваться в зависимости от таких факторов, как возраст, масса, рост, пол, общее состояние здоровья и история болезни пациента. Обычно реципиенту желательно вводить дозу растворимого Ш-22КА или анти-I^-22КΑ антител, которая составляет примерно в пределах от 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество лекарственного средства/масса тела пациента), хотя в определенных случаях может быть введена более низкая или более высокая доза.
Введение растворимого Ш-22КА или анти-I^-22КΑ антител индивидууму может быть осуществлено внутривенно, внутрисуставно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраплеврально, интрантекально, путем вливания через регионально установленный катетер или путем прямой инъекции в пораженный участок. При введении терапевтических белков путем инъекции, такое введение может быть осуществлено путем непрерывного вливания или путем введения разовой или многократной ударной дозы.
Другими способами введения являются пероральное введение, введение через слизистую оболочку, введение в легкие и чрескожное введение. При использовании полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер, протеиноидных микросфер, полицианоакрилатных микросфер и систем на основе липидов, подходящей является пероральная доставка лекарственного средства (см., например, ИЖазе & Могге1, 0га1 ОеШ'егу оГ М1сгоеисарзи1а!еб Рго!ешз, Рго!еш ОеШ'егу: Рйуз1са1 8уз!етз, 8аибегз аиб Неибгеи (ебз.), радез 255-288 (Р1еиит Ргезз, 1997)). Примером возможной интраназальной доставки является введение инсулина (см., например, НтсйсйГГе & Шит, Абу. Игид. Эейу. Кеу. 35:199 (1999)). Могут быть получены сухие или жидкие частицы, содержащие I^-22КΑ, и эти частицы могут быть введены путем ингаляции с помощью инсуффляторов, жидкостных аэрозольных генераторов или распылителей (например, Ре!й! & СотЬоШ ТШТЕСН 16:343 (1998); Ра!!ои е! а1., Абу. Эейу. Кеу. 35:235 (1999)). Например, этот способ был проиллюстрирован и использован в схеме АЕКХ лечения диабета, где применяется ручной электронный ингалятор, который обеспечивает доставку распыленного инсулина в легкие. Исследования показали, что белки размером не более 48000 кДа могут быть введены через кожу в терапевтических концентрациях с помощью низкочастотного ультразвукового аппарата, что свидетельствует о возможности их чрескожного введения (Мйгадойт е! а1., 8с1еисе 269:850 (1995)). Другим способом введения молекулы, обладающей Ш-22КА-связывающей активностью, является чрескожная доставка методом электропорации (Ройз е! а1., Рйагт. Вю!есйио1. 10:213 (1997)).
Фармацевтическая композиция, содержащая растворимый Ш-22КА или анти-I^-22КΑ антитело, может быть приготовлена известными методами, применяемыми для получения фармацевтических композиций, где терапевтические белки смешивают в смесь с фармацевтически приемлемым носителем. Соединение называется фармацевтически приемлемым носителем, если его введение может хорошо переноситься пациентом-реципиентом. Одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя является стерильный забуференный фосфатом физиологический раствор. Другие подходящие носители хорошо известны специалистам. См., например, Сеииаго (еб.), Кеттд!ои'з Рйагтасеи!юа1 8с1еисез, 19!й Еб1Дои (Маск РиЬИзЫид Сотраиу, 1995).
В терапевтических целях, молекулу растворимого Ш-22КА или анти-I^-22КΑ антитела и фармацевтически приемлемый носитель вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве. Считается, что комбинация терапевтической молекулы настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого носителя вводится в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество является физиологически значимым. Лекарственное средство является физиологически значимым, если его присутствие приводит к детектируемому изменению физиологии пациента-реципиента. Так, например, лекарственное средство, используемое для лечения воспаления, является физиологически значимым, если его присутствие приводит к ослаблению воспалительной реакции.
Фармацевтическая композиция, содержащая Ш-22КА (или аналог Ш-22КА или Ш-22КАсодержащий гибридный белок) или нейтрализующее анти-Ш-22КА антитело, может быть получена в жидкой форме, в форме аэрозоля или в твердой форме. Примерами жидких форм являются растворы для инъекций и суспензии для перорального введения. Примерами твердых форм являются капсулы, таблетки и формы для пролонгированного высвобождения. Примером последней формы является миниосмотические наносы и имплантаты (Вгетег е! а1., Рйагт. Вю!есйио1. 10:239 (1997); Каиабе 'Ттркий ш Игид Пейуегу, Игид ИеНуегу 8уз!етз, Каиабе & НоШидег (ебз.), радез 95-123 (СКС Ргезз 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет ИеДуегу тейй ПЛизю!·! Ритрз, Рго!еш Оейуегу: Рйузюа! 8уз!етз, 8аибегз & Неибгеи (ебз.),
- 49 009026 радек 239-254 (Р1епит Ргекк 1997); Уе\геу е! а1., ОеНуегу оГ Рго!етк Ггот а Соп!го11ей Ке1еаке Iп^есΐаЬ1е Iтр1ап!, Рго!ет ОеНуегу: РНук1са1 8ук!етк, 8апйегк & Непйгеп (ейк.), радек 93-117 (Р1епит Ргекк, 1997)).
Одним из средств для доставки терапевтических полипептидов индивидууму являются липосомы, которые могут быть введены внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутримышечно, подкожно, перорально, путем ингаляции или интраназально. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, состоящие из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (в общих чертах, см. Ваккег-^оийепЬегд е! а1., Еиг. Σ. С1т. М1сгоЫо1. Мес!. Όίκ. 12 (8ирр1. 1):861 (1993), К1т, Эгидк 46:618 (1993) и Капайе 8йе-8ресШс Эгид ЭеПуегу Иктд Ырокотек ак Сатегк, Эгид ЭеЫ'егу 8ук!етк, Капайе & НоШпдег (ейк.), радек 3-24 (СКС Ргекк 1995)). В композиции липосомы подобны клеточным мембранам, а поэтому липосомы являются безопасными и биоразлагаемыми. В зависимости от метода приготовления липосомы могут быть однослойными или многослойными, и их диаметр может варьироваться в пределах от 0,02 мкм до более чем 10 мкм. В липосомы могут быть инкапсулированы различные агенты: гидрофобные агенты распределяются в бислоях, а гидрофильные агенты распределяются во внутреннем водном пространстве (см., например, МасНу е! а1., Ырокотек Ы Се11 Вю1оду Апй РНагтасо1оду (ЫНп ЫЬЬегу 1987) и 0к!го е! а1., Атепсап Σ. Нокр. РНагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, можно регулировать терапевтическую доступность инкапсулированного агента путем изменения размера липосомы, числа бислоев, липидного состава, а также заряда и поверхностных свойств липосом.
Липосомы могут адсорбироваться, фактически, на клетках любого типа, с последующим медленным высвобождением инкапсулированного агента. Альтернативно, абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу фагоцитарными клетками. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомной деградацией липосомных липидов и высвобождением инкапсулированных агентов (8сНегрНоГ е! а1., Апп. КУ. Асай. 8с1. 446:368 (1985)). После внутривенного введения небольшие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы и локализуются, главным образом, в печени и в селезенке, тогда как липосомы размером более 3,0 мкг осаждаются в легких. Такое преимущественное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы используется для доставки химиотерапевтических средств в макрофаги и в опухоли печени.
Ретикулоэндотелиальную систему можно обмануть несколькими методами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц или селективную инактивацию макрофагов фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., ВюсНет. ВюрНук. Ас!а 808:428 (1984)). Кроме того, было показано, что введение фосфолипидов, дериватизированных гликолипидом или полиэтиленгликолем, в липосомные мембраны приводит к значительному снижению поглощения ретикулоэндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а. 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Липосомы могут быть также получены в целях доставки в конкретные клетки или органы путем изменения фосфолипидного состава или путем введения рецепторов или лигандов в липосомы. Так, например, липосомы, полученные с высоким содержанием неионогенного поверхностно-активного вещества, могут быть использованы для доставки в печень (Науакага е! а1., патент Японии 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 16:960 (1993)). Эти композиции были приготовлены путем смешивания фосфотидилхолина сои, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, с последующим концентрированием смеси в вакууме и разведением указанной смеси водой. Было показано, что липосомная композиция, состоящая из дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) со смесью выделенного из сои стерилглюкозида (80) и холестерина (Ср), также используется для доставки в печень (8Нтихи е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, с поверхностью липосомы могут быть связаны различные нацеливающие лиганды, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Так, например, липосомы могут быть модифицированы галактозиллипидными производными с разветвленной цепью для доставки асиалогликопротеиновых (галактозных) рецепторов, которые экспрессируются исключительно на поверхности клеток печени (Ка!о & 8ид1уата, СгН. Кеу. ТНег. Огид. Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигаНакН1 е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Аналогичным образом, XVи е! а1., Нера!о1оду 27:772 (1998) показали, что мечение липосом асиалофетуином приводит к укорочению времени полужизни липосомы в плазме и к значительному увеличению поглощения меченных асиалофетуином липосом гепатоцитами. С другой стороны, накопление в печени липосом, содержащих галактозиллипидные производные с разветвленной цепью, может ингибироваться путем предварительной инъекции асиалофетуина (МигаНакЫ е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Другим методом доставки липосом в клетки печени является доставка липосом, полученных на основе полиакотинилированного альбумина человеческой сыворотки (Катрк е! а1., Ргос. №!'1. Асай. 8сг И8А 94:11681 (1997)). Кроме того, ОеНо и др., патент США № 4603044, были описаны опосредуемая гепатоцитами система доставки липосомных везикул, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, ассоциированным со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем методе доставки в ткани, клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными к лиганду, экспрессируемому такой клеткой-мишенью (Нагакут е! а1., Айу. Огид. ЭеНу. Кеу. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободных антител, вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. В другом методе, нацеливающие антитела присоединяют непо
- 50 009026 средственно к липосомам (Нагакут е! а1., Абу. Эгид. ЭеНу. Кеу. 32:99 (1998)).
Полипептиды и антитела могут быть инкапсулированы в липосомы стандартными методами микроинкапсулирования белков (см., например, Апбегкоп е! а1., 1пГес!. 1ттип. 31:1099 (1981), Апбегкоп е! а1., Сапсег Кек. 50:1853 (1990) и СоНеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1063:95 (1991), АМпд е! а1., Ргерагабоп апб Ике оГ Ырокотек т 1ттипо1од1са1 8йб1ек, Ырокоте ТесНпо1оду, 2пб ЕбШоп, Уо1. III, Сгедопаб1к (еб.), раде 317 (СКС Ргекк 1993), УаккеГ е! а1., Мей Епхуто1. 149:124 (1987)). Как указывалось выше, терапевтически эффективные липосомы могут содержать различные компоненты. Так, например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Для поддержания высоких уровней терапевтических белков в системе были сконструированы разлагаемые полимерные микросферы.
Микросферы получают из разлагаемых полимеров, таких как сополимер лактида и гликолида (РЬС), полиангидриды, полиортоэфиры и биологически неразлагаемые полимеры этилвинилацетата, на которых иммобилизуются белки. (СотЬой & Рей!, Вюсои)ида!е СНет. 6:332 (1995); Капабе Ко1е оГ Ро1утегк ш Эгид ОеНуегу, Эгид ОеНуегу 8ук!етк, Капабе & НоШпдег (ебк.), радек 51-93 (СКС Ргекк 1995); Коккок & Макк1е\\'1сх ЭедгабаЫе Соп1го11еб Ке1еаке 8ук!етк ИкеЕЫ Гог Рго!ет ОеНуегу, Рго!ет ОеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк & Непбгеп (ебк.), радек 45-92 (Р1епит Ргекк 1997); Вагйк е! а1., 8с1епсе 281:1161 (1998); Ри!пеу & Вигке, №йге Вю!есНпо1оду 16:153 (1998); Ри!пеу, Сигг. Орт. СНет. Вю1. 2:548 (1998)). Покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ) наносферы могут быть также использованы в качестве носителей для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., Рйагт. Вю!есНпо1. 10:167 (1997)).
В настоящем изобретении также рассматриваются химически модифицированные полипептиды, обладающие Гк-22КА-связывающей активностью, такие как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные растворимые рецепторы Гк-22КА и антагонисты Гк-22КА, например анти-Гк22КА антитела или связывающие полипептиды, или нейтрализующие анти-ЕЕ-22КА антитела, в которых полипептид связан с полимером, как обсуждалось выше.
Другие лекарственные формы могут быть получены любым специалистом, как описано, например, Апке1 & Ророуюй, РйагтасеиНса1 Эокаде Еогтк апб Эгид ОеНуегу 8ук!етк, 5(Н Ебйоп (Ьеа & Еейдег 1990), Сеппаго (еб.), Кеттд!оп'к Рйагтасеи!1са1 8с1епсек, 19(Н Ебйоп (Маск РиЬНкЫпд Сотрапу 1995) и Капабе & НоШпдег, Эгид ОеНуегу 8ук!етк (СКС Ргекк 1996).
Репрезентативные фармацевтические композиции могут поставляться в виде набора, в котором находится флакон, содержащий полипептид с внеклеточным доменом рецептора ГО^КА, например, мономерного, гомодимерного, гетеродимерного или мультимерного растворимого рецептора [к-22КА или антагониста ЕЕ-22КА (например, антитело или фрагмент антитела, которые связываются с полипептидом ГО^КА, или нейтрализующее анти-Ш^КА антитело). Терапевтические полипептиды могут быть получены в виде раствора для инъекций разовой или многократной дозами или в виде стерильного порошка, разводимого перед введением инъекции. Альтернативно, в такой набор может входить инсуффлятор, жидкостный аэрозольный генератор или распылитель для введения терапевтического полипептида. В такой набор может также входить текст инструкции по показаниям и использованию данной фармацевтической композиции. Кроме того, в данной инструкции может сообщаться о том, что композиция Κ22КА противопоказана пациентам с гиперчувствительностью к ЕЕ-22КА.
Фармацевтическая композиция, содержащая анти-ЕЕ-22КА антитела или партнеры по связыванию (или фрагменты антител против Й^КА, гибриды антител, гуманизованные антитела и т.п.) или растворимый рецептор Й^КА, может быть получена в жидкой форме, в форме аэрозоля или в твердой форме. Примерами жидких форм являются растворы для инъекций, аэрозоли, капли, топологические растворы и суспензии для перорального введения. Примерами твердых форм являются капсулы, таблетки и формы для пролонгированного высвобождения. Примерами последней формы являются мини-осмотические наносы и имплантаты (Вгетег е! а1., РНагт. Вю!есНпо1. 10:239 (1997); Капабе 'ТтрЫШк ш Эгид ОеНуегу, Огид ОеНуегу 8ук!етк, Капабе & НоШпдег (ебк.), радек 95-123 (СКС Ргекк 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет ОеНуегу \νί11ι Шикюп Ритрк, Рго!ет ОеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк & Непбгеп (ебк.), радек 239-254 (Р1епит Ргекк 1997); Уе\геу е! а1., ОеНуегу оГ Рго!етк Ггот а Соп!го11еб Ке1еаке ЩестЫе Iтр1аη!, Рго!ет ОеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк & Непбгеп (ебк.), радек 93-117 (Р1епит Ргекк, 1997)). Другими твердыми формами являются кремы, пасты, другие топологические средства и т. п.
Липосомы являются одним из средств доставки терапевтических полипептидов индивидууму, могут быть введены внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутримышечно, подкожно, перорально, путем ингаляции или интраназально. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, состоящие из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (в общих чертах, см. Ваккег-УоибепЬегд е! а1., Еиг. 1. С1ш. МюгоЬю1. ШГес!. Э1к. 12 (8ирр1. 1):861 (1993), К1т, Этдк 46:618 (1993) апб Капабе 8йе-8ресШс Эгид ОеНуегу Иктд Ырокотек ак Сатегк, Эгид ОеНуегу 8ук!етк, Капабе & НоШпдег (ебк.), радек 3-24 (СКС Ргекк 1995)). В композиции липосомы подобны клеточным мембранам, а поэтому липосомы являются безопасными и биоразлагаемыми. В зависимости от метода приготовления липосомы могут быть однослойными или многослойными, и их диаметр может
- 51 009026 варьироваться в пределах от 0,02 мкм до более чем 10 мкм. В липосомы могут быть инкапсулированы различные агенты: гидрофобные агенты распределяются в бислоях, а гидрофильные агенты распределяются во внутреннем водном пространстве (см., например, Маску е! а1., Ы]эокотек Ы Се11 Вю1оду Απ6 РЬагтасо1оду Лойн ЫЬЬеу 1987) и 0к!го е! а1., ΑιικΜιη I. Но^г РЬагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, можно регулировать терапевтическую доступность инкапсулированного агента путем изменения размера липосомы, числа бислоев, липидного состава, а также заряда и поверхностных свойств липосом.
Липосомы могут адсорбироваться, фактически, на клетках любого типа, с последующим медленным высвобождением инкапсулированного агента. Альтернативно, абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу фагоцитарными клетками. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомной деградацией липосомных липидов и высвобождением инкапсулированных агентов (8сйе1рйоГ е! а1., Αηη. ΚΥ. Αсаб. δα. 446:368 (1985)). После внутривенного введения небольшие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы и локализуются, главным образом, в печени и в селезенке, тогда как липосомы размером более 3,0 мкг осаждаются в легких. Такое преимущественное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы используется для доставки химиотерапевтических средств в макрофаги и в опухоли печени.
Ретикулоэндотелиальную систему можно обмануть несколькими методами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц или селективную инактивацию макрофагов фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., Вюсйет. В^зНук. Αα3 808:428 (1984)). Кроме того, было показано, что введение фосфолипидов, дериватизированных гликолипидом или полиэтиленгликолем, в липосомные мембраны приводит к значительному снижению поглощения ретикулоэндотелиальной системой (Α1Βη е! а1., ВюсЫт. В^^ук. Αα3. 1068:133 (1991); Α1Εη е! а1., ВюсЫт. В^^ук. Αα3 1150:9 (1993)).
Липосомы могут быть также получены в целях доставки в конкретные клетки или органы путем изменения фосфолипидного состава или путем введения рецепторов или лигандов в липосомы. Так, например, липосомы, полученные с высоким содержанием неионогенного поверхностно-активного вещества, могут быть использованы для доставки в печень (Науакага е! а1., патент Японии 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 16:960 (1993)). Эти композиции были приготовлены путем смешивания фосфотидилхолина сои, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, с последующим концентрированием смеси в вакууме и разведением указанной смеси водой. Было показано, что липосомная композиция, состоящая из дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) со смесью выделенного из сои стерилглюкозида (8С) и холестерина (Ср) также используется для доставки в печень (δΐιίιηίζιι е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, с поверхностью липосомы могут быть связаны различные нацеливающие лиганды, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Так, например, липосомы могут быть модифицированы галактозиллипидными производными с разветвленной цепью для доставки асиалогликопротеиновых (галактозных) рецепторов, которые экспрессируются исключительно на поверхности клеток печени (Ка!о & 8ид1уата, Сп!. Βеν. ТЬег. Отд. Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигаЬакЫ е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:259 (1997)). Аналогичным образом, XVи е! а1., Ηеρа!о1оду 27:772 (1998) показали, что мечение липосом асиалофетуином приводит к укорочению времени полужизни липосомы в плазме и к значительному увеличению поглощения меченных асиалофетуином липосом гепатоцитами. С другой стороны, накопление в печени липосом, содержащих галактозиллипидные производные с разветвленной цепью, может ингибироваться путем предварительной инъекции асиалофетуина (МигайакЫ е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:259 (1997)). Другим методом доставки липосом в клетки печени является доставка липосом, полученных на основе полиаконитилированного альбумина человеческой сыворотки (Катρκ е! а1., Ргос. №!'1. Αсаб. δα. υδΑ 94:11681 (1997)). Кроме того, СеЬо и др., патент США № 4603044, была описана опосредуемая гепатоцитами система доставки липосомных везикул, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, ассоциированным со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем методе доставки в ткани, клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными к лиганду, экспрессируемому такой клеткой-мишенью (Нагакут е! а1., Αбν. Эгид. ЭеЫ'. Βеν. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободных антител вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. В другом методе, нацеливающие антитела присоединяют непосредственно к липосомам (Нагакут е! а1., Αбν. Эгид. ЭеЫ'. Βеν. 32:99 (1998)).
Нейтрализующие антитела против ^^ΒΑ и партнеры по связыванию с ^-22 или партнеры, обладающие I^-20-связывающей активностью, или растворимый рецептор ^^ΒΑ, могут быть инкапсулированы в липосомы стандартными методами микроинкапсулирования белков (см., например, Αηбе^κоη е! а1., Мес!. Мшит 31:1099 (1981), Αηбе^κоη е! а1., Сапсег Βеκ. 50:1853 (1990) и СоЬеп е! а1., ВюсЫт. Вюρ^. Αα3 1063:95 (1991), Α1νίι^ е! а1., Р^еρа^а!^оη апб ике оГ к^окотек ίη Iттиηо1од^са1 8!иб1ек, ^^ρокоте ТесЬпо1оду, 2пб Еб1!1оп, Уо1. III, Сгедопаб1к (еб.), ρаде 317 (СΒС Ргекк 1993), УаккеГ е! а1., Ме111. Епхуто1. 149:124 (1987)). Как указывалось выше, терапевтически эффективные липосомы могут содержать различные компоненты. Так, например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля (Α1Εη е! а1., ВюсЫт. В^^ук. Αα3 1150:9 (1993)).
Для поддержания высоких уровней терапевтических белков в системе были сконструированы раз
- 52 009026 лагаемые полимерные микросферы. Микросферы получают из разлагаемых полимеров, таких как сополимер лактида и гликолида (РЬС), полиангидриды, полиортоэфиры, и биологически неразлагаемые полимеры этилвинилацетата, на которых иммобилизуются белки. (СошЬо1х & Ре!б!, В1осои)ида!е СНет. 6:332 (1995); Каиабе Ко1е оГ Ро1утегк ίη Эгид Оебуегу, Эгид Оебуегу 8ук!етк, Каиабе & НоШидег (ебк.), радек 51-93 (СКС Ргекк 1995); Коккок & Макк1е\\'1сх 'ГОедгабаЫе Сои!го11еб Ке1еаке 8ук!етк ИкеГи1 Гог Рго!ет Оебуегу, Рго!ет БеШ'егу: Рбукюа1 8ук!етк, 8аибегк & Неибгеи (ебк.), радек 45-92 (Р1еиит Ргекк 1997); Вайик е! а1., 8с1еисе 281:1161 (1998); РиГиеу & Вигке, №!иге В1о!есНио1оду 16:153 (1998); РиГиеу, Сигг. 0рш. СНет. Вю1. 2:548 (1998)). Покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ) наносферы могут быть также использованы в качестве носителей для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, ОгеГ е! а1., РЬагт. В1о!есНио1. 10:167 (1997)).
В настоящем изобретении также рассматриваются химически модифицированное анти-1Ь-22КА антитело или его партнер по связыванию, например, анти-1Ь-22КА антитела или растворимый рецептор 1Ь22КА, связанные с полимером, как обсуждалось выше.
Другие лекарственные формы могут быть получены любым специалистом, как описано, например, Аике1 & Ророуюб, Рбагшасеибса1 Эокаде Еогшк аиб Эгид Оебуегу 8ук!етк, 5Ш ЕбШои (Беа & ЕеШдег 1990), Сеииаго (еб.), Кеш1ид!ои'к Рбагтасеибса1 8с1еисек, 19Ш ЕбШои (Маск РиЬбкЫид Сотраиу 1995) и Каиабе & НоШидег, Эгид Оебуегу 8ук!етк (СКС Ргекк 1996)
В настоящем изобретении также рассматриваются композиции анти-1Б-22 антител, содержащих описанные здесь антитела, пептиды или полипептиды, методы их получения и терапевтическое применение таких композиций. Указанные композиции могут также содержать носитель. Носителем может быть стандартный органический или неорганический носитель. Примерами таких носителей являются вода, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло и т. п.
11. Получение трансгенных мышей
Сверхэкспрессия ГБ-20 и ГБ-22 наблюдалась на участках поражения псориазом у человека, что позволяет предположить, что оба ГБ-20 и ГБ-22 участвуют в развитии псориаза у человека. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, при сверхэкспрессии ГБ-20 и ГБ-22 у трансгенных мышей обнаруживалось утолщение эпидермиса и вовлечение в патологический процесс иммунных клеток, что указывало на фенотип псориаза, и кроме того, инъекция ГБ-22 нормальным мышам приводила к утолщению эпидермиса и к вовлечению в процесс иммунных клеток, характерных для псориазного фенотипа, который был устранен благодаря введению антагониста растворимого рецептора хсу1ог16 (ГБ-22КА). Кроме того, указанные данные ίη у1уо позволяют предположить, что провоспалительный цитокин ГБ-22 участвует в развитии псориаза. Таким образом, антагонисты активности ГБ-22, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против человеческого ГБ-22КА, а также растворимые рецепторы ГБ-22КА могут быть использованы для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, а в частности, в качестве антагонистов к ГБ-20 и ГБ-22 для лечения псориаза. Более того, агенты, которые связываются с ГБ-22 или с ГБ-20 и ГБ-22, или блокируют, ингибируют, снижают, подавляют или нейтрализуют их активность, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против человеческого ГБ-22КА настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы ГБ-22КА, могут быть использованы в качестве антагонистов к ГБ-22 или ГБ-20 и ГБ-22 для лечения других воспалительных заболеваний, например, для лечения атопического дерматита, ВЗК, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита, псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (РЗВ), септического шока, недостаточности многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу получения антитела против полипептида, предусматривающему инокуляцию животного полипептидом, выбранном из группы, состоящей из (а) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Акр); (Ь) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго); (с) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Бук) до аминокислоты 47 (Акр); (б) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:2, простирающейся от аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Сук); (е) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Бук) до аминокислоты 62 (Сук); (Г) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (8ег); (д) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 103 (ТНг) до аминокислоты 108 (Акр); (Н) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1к); (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 164 (О1у) до аминокислоты 166 (Бук); (|) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3, простирающейся от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и); (к) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ν0:3,
- 53 009026 простирающейся от аминокислоты 193 (Ьук) до аминокислоты 196 (А1а); (1) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 203 (Ьук) до аминокислоты 209 (ТЬг); (т) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:3, и (п) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:4, и где указанный полипептид вырабатывает иммунный ответ у животного посредством продуцирования антитела; и выделение антитела у указанного животного, где указанное антитело специфически связывается с полипептидом Ι6-226Λ (8Еф ΙΌ N0:2 или 8Еф ΙΌ N0:3) и снижает активность либо Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8), либо Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где антитело, продуцируемое таким методом, снижает провоспалительную активность либо Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8), либо Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6). В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанное антитело, продуцируемое таким способом, нейтрализует взаимодействие либо Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8), либо Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6) с Ш-22КА (8Еф ΙΌ N0:2). В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где нейтрализацию указанным антителом оценивают путем детекции нейтрализации либо Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8), либо Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6) в клеточном анализе нейтрализации ш уйго. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где антитело, продуцируемое указанным способом, снижает провоспалительную активность Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8) и Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6). В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где антитело, продуцируемое указанным способом, нейтрализует взаимодействие Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8) и Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6) с Ш-22КА (8Еф ΙΌ N0:2). В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где нейтрализацию указанным антителом определяют путем детекции нейтрализации Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8) и Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6) в клеточном анализе на нейтрализации ш уйго.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, продуцируемому описанным здесь способом, которое связывается с полипептидом 8Еф ΙΌ N0:2 или 8Еф ΙΌ N0:3. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанным антителом является (а) поликлональное антитело; (Ь) мышиное моноклональное антитело; (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь); (б) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, является ПЭГилированным. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанным антителом является (а) поликлональное антитело; (Ь) мышиное моноклональное антитело; (с) гуманизованное антитело; происходящее от антитела (Ь); (б) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, является ПЭГилированным.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу или к фрагменту антитела, которое связывается с полипептидом, содержащим последовательность аминокислотных остатков, представленную в 8Еф ΙΌ N0:3, и снижает провоспалительную активность либо Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8) или ГЬ22 (8Еф ΙΌ N0:6). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу или к фрагменту антитела, описанному выше, где указанное антитело или его фрагмент снижает провоспалительную активность Ш-20 (8Еф ΙΌ N0:8) и Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6). В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу или его фрагменту, где указанным антителом или его фрагментом является (а) поликлональное антитело; (Ь) мышиное моноклональное антитело; (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь); (б) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу или его фрагменту, где указанное антитело, кроме того, содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу или его фрагменту, где указанное антитело, кроме того, является ПЭГилированным. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу или его фрагменту, где указанным антителом или его фрагментом является (а) поликлональное антитело; (Ь) мышиное моноклональное антитело; (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь); (б) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу или его фрагменту, где указанное антитело, кроме того, содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме
- 54 009026 того, является ПЭГилированным.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления или ингибирования либо ΙΕ-22-индуцированной, либо ΙΕ-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, предусматривающему культивирование клеток костного мозга или клеток периферической крови с композицией, содержащей описанное здесь антитело в количестве, достаточном для снижения уровня пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивированными в отсутствии антитела. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где гемопоэтическими клетками и гемопоэтическими клетками-предшественниками являются лимфоидные клетки. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления ΙΕ-22индуцированного или ΙΕ-20-индуцированного воспаления, предусматривающему введение указанному млекопитающему, страдающему воспалительным заболеванием, композиции описанного здесь антитела в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления или ингибирования либо ΙΕ-22-индуцированной, либо ΙΕ-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, предусматривающему культивирование клеток костного мозга или клеток периферической крови с композицией, содержащей описанное здесь антитело в количестве, достаточном для снижения уровня пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивированными в отсутствии антитела. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где гемопоэтическими клетками и гемопоэтическими клетками-предшественниками являются лимфоидные клетки. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления ΙΕ-22индуцированного и ΙΕ-20-индуцированного воспаления, предусматривающему введение указанному млекопитающему, страдающему воспалением, композиции описанного здесь антитела в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления или ингибирования ΙΕ-22-индуцированной и ΙΕ-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, предусматривающему культивирование клеток костного мозга или клеток периферической крови с композицией, содержащей описанное здесь антитело в количестве, достаточном для снижения уровня пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивированными в отсутствии антитела. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где гемопоэтическими клетками и гемопоэтическими клетками-предшественниками являются лимфоидные клетки. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления ΙΕ-22индуцированного и ΙΕ-20-индуцированного воспаления, предусматривающему введение указанному млекопитающему, страдающему воспалением, композиции описанного здесь антитела или фрагмента антитела в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления или ингибирования ΙΕ-22-индуцированной и ΙΕ-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, предусматривающему культивирование клеток костного мозга или клеток периферической крови с композицией, содержащей описанное здесь антитело или фрагмент антитела в количестве, достаточном для снижения уровня пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивированными в отсутствии антитела. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где гемопоэтическими клетками и гемопоэтическими клетками-предшественниками являются лимфоидные клетки. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления ΙΕ-22индуцированного и ΙΕ-20-индуцированного воспаления, предусматривающему введение указанному млекопитающему, страдающему воспалительным заболеванием, композиции описанного здесь антитела или фрагмента антитела в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления воспалительного
- 55 009026 ответа у млекопитающего, страдающего воспалением, где указанный способ предусматривает:
(1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке, (2) введение композиции, содержащей описанное здесь антитело или фрагмент антитела в фармацевтически приемлемом носителе;
(3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения;
(4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке, полученного в стадии (1), с уровнем амилоидного белка А в сыворотке, полученным в стадии (3), где отсутствие увеличения или снижения уровня амилоидного белка А в сыворотке указывает на подавление воспалительного ответа.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играют 1Ь-22 и 1Ь-20, где указанный способ предусматривает введение этому млекопитающему антагониста 1Ь-22 или 1Ь-20 для ослабления воспаления у данного млекопитающего, где указанный антагонист содержит: (ί) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом или с фрагментом полипептида 1Ь-22ВА (8Е0 ΙΌ N0:3), или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида 1Ь-22ВА (8Е0 ΙΌ N0:3), и где воспалительная активность либо 1Ь-22 (8Е0 ΙΌ N0:6), либо 1Ь-20 (8Е0 ΙΌ N0:8) является ослабленной. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание, включая эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играют ГЬ-22 и ГЬ-20, где указанный способ предусматривает введение этому млекопитающему антагониста ГЬ-22 и ГЬ20 в целях ослабления воспаления у данного млекопитающего, где указанный антагонист содержит: (ί) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом Ш^ВА (8Е0 ΙΌ N0:3) или с его фрагментом, или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида Ш^ВА (8Е0 ΙΌ N0:3), и где воспалительная активность либо ΙΕ-22 (8Е0 ΙΌ N0:6), либо ΙΕ-20 (8Е0 ΙΌ N0:8) является ослабленной. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание, включая эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, а именно, к моноклональному антителу, которое специфически связывается с антигенным эпитопом человеческого Ш^ВА (8Е0 ΙΌ N0:3), выбранным из группы, состоящей из (а) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Акр); (Ь) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго); (с) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Ьук) до аминокислоты 47 (Акр); (й) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, простирающейся от аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Сук); (е) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Ьук) до аминокислоты 62 (Сук); (Г) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (8ег); (д) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 103 (ТНг) до аминокислоты 108 (Акр); (1) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0:3, простирающейся от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1к);
- 56 009026 (ΐ) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 164 (С1у) до аминокислоты 166 (Ьук); (|) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и); (к) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 193 (Ьук) до аминокислоты 196 (А1а); (1) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 203 (Ьук) до аминокислоты 209 (ТЬг); (т) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, и (и) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:4, и где указанное антитело снижает или нейтрализует активность либо человеческого Ш-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6), либо ΙΕ-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из (а) мышиного моноклонального антитела, (Ь) гуманизованного антитела, происходящего от антитела (а), (с) фрагмента антитела и (й) человеческого моноклонального антитела. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, является ПЭГилированным. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из (а) мышиного моноклонального антитела; (Ь) гуманизованного антитела, происходящего от антитела (а); (с) фрагмента антитела и (й) человеческого моноклонального антитела. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше антителу, где указанное антитело, кроме того, является ПЭГилированным.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния у индивидуума, ассоциированного с активностью I^-22КА, где указанный способ предусматривает введение указанному индивидууму описанного здесь антитела в количестве, эффективном для лечения указанного патологического состояния. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным патологическим состоянием является хроническое воспалительное состояние. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным хроническим воспалительным состоянием является воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным патологическим состоянием является острое воспалительное состояние. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным острым воспалительным состоянием является эндотоксемия, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играют I^-22КΛ, где указанный способ предусматривает введение этому млекопитающему антагониста I^-22КΛ для ослабления воспаления у данного млекопитающего, где указанный антагонист содержит антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом Ш22КА (БЕЦ ΙΌ N0:3) или с его фрагментом, и где воспалительная активность является ослабленной. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание, включая эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно содержат радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, кроме того, являются ПЭГилированными.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше способу ослабления воспаления, предусматривающему введение млекопитающему, страдающему воспалением, композиции описанного здесь антитела в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в нижеследующих неограничивающих примерах.
Пример 1. Выделение полипептида Ш^КАЗ-ЕЫ из трансфицированных клеток ВНК 570
Все процедуры проводили при 4°С, если это не оговорено особо. Нижеследующую процедуру проводили для очистки полипептида I^-22КА2 (зрелого полипептида растворимого рецептора, простирающегося от остатка 23 до остатка 231 БЕЦ ΙΌ N0:13; полинуклеотиды, указанные в БЕЦ ΙΌ N0:12), Сконец которого был присоединен к человеческому Ес4 (БЕЦ ΙΌ N0:14), и который был обозначен ΙΕ
- 57 009026
22ВА2-Рс4. Примерно 16500 мл кондиционированной среды от клеток ВНК 570, трансфицированных 1Ь22КА2-ЕС4, фильтровали через стерилизующий 0,2 мкм-фильтр, а затем добавляли раствор ингибиторов протеазы до конечных концентраций 0,001 мМ лейпептина (ВоеЬппдег МаппЬеш, 1пб1апаро11з, ГИ), 0,001 мМ пепстатина (ВоеЬппдег МаппНенп) и 0,4 мМ РеГаЫос (ВоеЬппдег МаппНенп). Затем колонку с белком А50 Рогоз (объем слоя: 20 мл, АррПеб Вюзуз1етз) упаковывали и промывали 400 мл РВ8 (С1Ьсо/ВВЬ). Дополненную кондиционированную среду пропускали через колонку со скоростью потока 15 мл/мин, а затем промывали 800 мл РВ8 (ВВЬ/С1Ьсо). 1Ь-22ВА2-Рс4 элюировали из колонки с 0,1М глицином, рН 3,0, и 5 мл-фракции собирали непосредственно в 0,5 мл 2М триса, рН 7,8, с доведением рН этих фракций до 7,4.
Элюированный из колонки продукт оценивали с помощью Вестерн-блот-анализа исходной среды в восстанавливающем ДСН-ПААГ-геле и анализа его прохождения через колонку. В Вестерн-блот-анализе использовали конъюгированное с ПХ (пероксидазой хрена) антитело против человеческого 1дС (АтегзНат), и этот анализ выявил присутствие в исходной среде иммунореактивного белка 60000 Да, при этом не обнаруживалось прохождения белка, что позволило предположить о его полной иммобилизации. Фракции элюированного белка А50 были охарактеризованы с помощью электрофореза в восстанавливающем ДСН-ПААГ-геле. Этот гель обнаруживал ярко кумасси-окрашенную полосу при 60000 Да во фракциях 3-11. Фракции 3-11 объединяли.
Пул элюированного белка А50 объемом 44 мл концентрировали до объема 4 мл с использованием центрифужного концентратора ИНгаГгее Вютах 30000 Да (объем: 15 мл, М1Шроге). Гельфильтрационную колонку с Сефакрилом 8-300 (объем слоя: 175 мл, РНагтааа) промывали 350 мл РВ8 (ВВЬ/С1Ьсо). Концентрированный пул вводили в колонку путем инжекции при скорости потока 1,5 мл/мин, а затем промывали 225 мл РВ8 (ВВЬ/С1Ьсо). Элюированные пики собирали в 2 мл-фракции.
Элюированные фракции оценивали путем проведения электрофореза в восстанавливающем и невосстанавливающем ДСН-ПААГ-геле с окрашиванием серебром (Сепо ТесНпо1оду). Электрофорез в восстанавливающем ДСН-ПААГ-геле с окрашиванием серебром показал ярко окрашенную полосу при 60000 Да во фракциях 14-31, а электрофорез в невосстанавливающем ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром показал ярко окрашенную полосу при 160000 Да во фракциях 14-31. Во фракциях 1-13 было обнаружено множество полос различного размера. Фракции 14-31 объединяли и концентрировали до объема 22 мл с использованием центрифужного концентратора ИИгаГгее Вютах 30000 Да (объем 15 мл, М11Ироге). Полученный концентрат фильтровали через стерилизующий 0,2 мкм-фильтр АсгоФзс (Ра11 Согрогабоп).
Концентрацию объединенных концентрированных фракций белка определяли с помощью анализа ВСА (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь) и полученный материал разделяли на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии со стандартными процедурами, предложенными авторами настоящего изобретения. Концентрация объединенных фракций составляла 1,50 мг/мл.
Пример 2. Конструирование клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4 (клеток ВаР3/СКР24) и клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4 и рецептор 1Ь-22КА (клеток ВаР3/СВР2-4/1Ь22КА)
Клетки ВаР3, экспрессирующие полноразмерный рецептор СКР2-4, конструировали с использованием 30 мкг экспрессирующего вектора СКР2-4, описанного ниже. Клетки ВаР3, экспрессирующие рецептор СКР2-4, обозначали ВаР3/СРК2-4. Эти клетки использовали в качестве контроля, а затем их трансфицировали полноразмерным рецептором 1Ь-22ВА (патент США № 5965704) и использовали для конструирования и скрининга на ГЬ-22-активность, как описано ниже.
А. Конструирование клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4
Полноразмерную кДНК-последовательность СКР2-4 (СепЬапк, рег.№ Ζ17227) выделяли из библиотеки кДНК клеточной линии Дауди, а затем клонировали в экспрессирующий вектор рΖР7Р.
Зависимую от интерлейкина-3 (1Ь-3) прелимфоидную клеточную линию ВаР3, полученную из мышиного костного мозга (Ра1асюз & 81еште1х. Се11 41:727-734, 1985; Ма1Неу-Ргеуо1 е1 а1., Мо1. Се11. Вю1. 6:4133-4135, 1986), поддерживали в полной среде (в среде КРМ1 (ГЕН Вюзаепсе 1пс., Ьепеха, К8), в которую были добавлены 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка, 2 нг/мл мышиного 1Ь-3 (тГЬ-3) (Β&Ό, МшпеароНз, МЩ, 2 мМ Ь-д1и1аМах-1™ (С1Ьсо ВВЬ), 1 мМ пирувата натрия (С1Ьсо ВВЬ) и антибиотики Р8N (С1ВС0 ВВЬ)). Перед электропорацией, СКΡ2-4/рΖР7Р получали и очищали с использованием набора ф1адеп Мах1 Ргер (ф1адеп) в соответствии с инструкциями производителей. Для проведения электропорации, клетки ВаР3 один раз промывали в бессывороточной среде КРМ1, а затем ресуспендировали в бессывороточной среде КРМ1 при клеточной плотности 107 клеток/мл. Один миллилитр ресуспендированных клеток ВаР3 смешивали с 30 мкг плазмидной ДНК СКΡ2-4/рΖР7Р и переносили в отдельные камеры для электропорации одноразового использования (С1ВС0 ВКВ). После 15минутного инкубирования при комнатной температуре клетки подвергали электрошоку в две стадии (800 МкФ/300 В; 1180 МкФ/300 В) с помощью аппарата для электропорации (СЕЬЬ-Р0ВАТ0В™; С1ВС0 ВКВ). После 5-минутного восстановления клетки, подвергнутые электропорации, переносили в 50 мл полной среды и помещали в инкубатор на 15-24 ч (37°С, 5% С02). Затем клетки центрифугировали и ре
- 58 009026 суспендировали в 50 мл полной среды, содержащей 2 мкг/мл пуромицина в колбе Т-162 для выделения пула, резистентного к пуромицину. Пулы трансфицированных клеток ВаР3, далее называемых клетками ВаЕ3/СКЕ2-4, анализировали на способность передавать сигнал, как описано ниже. Кроме того, эти клетки затем трансфицировали рецептором ГБ-22КА, как описано ниже.
В. Конструирование клеток ВаР3, экспрессирующих рецепторы СКЕ2-4 и ^-22^
Клетки ВаЕ3/СКЕ2-4, экспрессирующие полноразмерный рецептор ^-22^, конструировали как описано выше, с использованием 30 мкг экспрессирующего вектора После выделения, трансфектанты отбирали с использованием 200 мкг/мл зеоцина и 2 мкг/мл пуромицина. Клетки ВаЕ3/СКЕ2-4, экспрессирующие рецептор ^-22^, обозначали ΒаЕ3/СКΡ2-4/I^-22КΛ. Эти клетки использовали для скрининга на активность ГБ-22, а также на антагонистическую активность I^-22ВА2, как описано в настоящем изобретении.
Пример 3. Скрининг на антагонистическую активность ^-22 с использованием клеток ВаЕ3/СКЕ24/I^-22ВА в анализе на пролиферацию с окрашиванием аламаровым синим
А. Скрининг на активность ^-22 с использованием клеток ΒаР3/СКЕ2-4/I^-22ВА в анализе на пролиферацию с окрашиванием аламаровым синим
Очищенный Ш^-СЕЕ (пример 4) использовали для тестирования на пролиферативную активность, как описано ниже. Очищенный I^-22ВА-Рс4 (пример 1) использовали для подавления пролиферативного ГО^-ответа в данном анализе, описанном ниже.
Клетки ΒаР3/СКЕ2-4/I^-22КΛ центрифугировали и промывали в полной среде (в среде КРΜI (ГКН Вккскпсе ГОс., Бепеха, К8), в которую были добавлены 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка, 2 нг/мл мышиного Ш-3 (тШ-3) (Ρ&Ό, Μ^ηηеаρο1^к, МЦ), 2 мМ Б-д1и!аМах-1™ (Окто ВКБ), 1 мМ пирувата натрия (О1Ьто ВКБ) и антибиотики Р^ (ОГОСО ВКБ)), но которая не содержала тШ-3 (далее называемой средой без тШ-3). Затем клетки центрифугировали и три раза промывали для гарантии удаления тББ-3. После этого клетки подсчитывали в гемацитометре. Клетки высевали в 96луночный планшет при плотности 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием среды без тШ-3.
Пролиферацию клеток ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВА оценивали с использованием белка ГО-22-СЕЕ, разведенного в среде без тШ-3 до концентраций 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 нг/мл. Затем к клеткам ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВА добавляли 100 мкл разведенного белка. Полный объем для анализа составлял 200 мкл. Планшеты для анализа инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 3 дней, а затем добавляли аламаровый синий (Асситеб, СН^садο, Ш) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 24 ч. Аламаровый синий позволяет считывать флуориметрические данные исходя из числа живых клеток, и, таким образом, его использование позволяет непосредственно определить уровень пролиферации клеток по сравнению с негативным контролем. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 24 ч. Считывание планшетом проводили на планшет-ридере Ртах™ ^ο^υ^ Эеукек 8иппууа1е, СА) с использованием программы 8οйΜаx™ Рго, на длине волны 544 (возбуждение) и 590 (излучение). Полученные результаты подтвердили дозозависимую пролиферацию клеток
ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВА в ответ на Ш-22-СЕЕ. Этот ответ, как было определено, приблизительно в 15 раз превышал фоновый ответ при верхнем пределе концентрации 50 нг/мл, и его индуцирование снижалось в 2 раза при нижнем пределе концентрации 0,06 нг/мл. Клетки ВаР3 дикого типа и клетки ВаЕ3/СКЕ2-4 не обнаруживали пролиферации в ответ на Ш-22-СЕЕ, что указывало на то, что Ш-22 является специфичным к гетеродимерному рецептору СКЕГ^/Ш^КА. Для оценки способности I^-22КΛ2 подавлять активность Ш-22, вышеописанный анализ повторяли с использованием очищенного растворимого Ш22КА2/Рс4. При объединении Ш-22 с Ш^КА при 10 мкг/мл, ответ на Ш-22 при всех концентрациях снижался до фонового уровня. Таким образом, присутствие растворимого ББ-22КА2 устраняло пролиферативные эффекты Ш-22, что свидетельствовало о том, что он является эффективным антагонистом лиганда Ш-22. Этот анализ может быть использован для тестирования других описанных здесь антагонистов активности Ш-22, таких как антитела против Ш^КА.
Пример 4. Очистка Ш-22-СЕЕ от клеток ВНК 570
Если это не оговорено особо, все процедуры осуществляли при 4°С. Нижеследующая процедура была проведена для очистки полипептида ^-22, содержащего С-концевую метку О1иО1и (ЕЕ) (8Е0 ГО NО:15 или 8ЕЦ ГО NО:16). Кондиционированные среды от клеток ВНК, экспрессирующих Ш-22-СЕЕ, концентрировали с использованием спирального картриджа Ат1топ 810Υ3 на устройстве РгоР1их А30. К концентрированной кондиционированной среде добавляли раствор ингибитора протеазы до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕОТА, 81дта СНетЕа1 СЬ., 8!. Εοω^ МО), 0,003 мМ лейпептина (ΒοеН^^ηде^-Μаηηйе^т, Iηб^аηаρο1^к, ΣΝ), 0,001 мМ пепстатина (ΒοеН^^ηде^МаппНепи) и 0,4 мМ РеГаЬкс (ΒοеН^^ηде^-Μаηηйе^т). Образцы брали для анализа и весь объем замораживали при -80°С до начала проведения очистки. Концентрации общего белка-мишени в концентрированной кондиционированной среде определяли с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и Вестернблот-анализа с использованием ПХ-конъюгированного анти-ЕЕ антитела.
Все содержимое колонки, примерно 100 мл, с анти-ЕЕ антителом, конъюгированным с О
- 59 009026
Сефарозой (приготовленным как описано ниже), выливали в стеклянную колонку Аа!егк АР-5, 5 смх10 см. Колонку упаковывали непрерывным потоком и уравновешивали на ВюСаб 8ргт! (Рер8ер1|уе Вю8ук!етк, Ргаттдйат, МА) забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8), рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду оттаивали, фильтровали через стерильный фильтр 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, а затем загружали в колонку на ночь при скорости потока примерно 1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8, рН 7,4), а затем слой элюировали 200 мл РВ8 (рН 6,0), содержащим 0,5 мг/мл пептида ЕЕ (Апакрес, 8ап 1оке. СА), при скорости 5 мл/мин. Используемый пептид ЕЕ имеет последовательность ЕΥМΡМЕ (8ЕО ГО N0:15). Колонку промывали 10 колоночными объемами РВ8, а затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2М глицина, рН 3,0. рН элюированной глицином колонки доводили до 7,0 двумя колоночными объемами 5хРВ8, а затем уравновешивали РВ8 (рН 7,4). 5 мл-фракции собирали в процессе всего хроматографического элюирования, и проводили мониторинг оптической плотности при 280 и 215 нМ; при этом, прошедшие через колонку и промытые пулы также сохраняли и анализировали. ЕЕполипептидные фракции пика элюирования анализировали на белок-мишень с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и Вестерн-блот-анализа с использованием ПХ-конъюгированного анти-ЕЕ антитела. Представляющие интерес фракции полипептидного элюата собирали и концентрировали от 60 до 5,0 мл с использованием центрифужного концентратора, имеющего мембранный фильтр с отсечкой молекулярной массы 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА) в соответствии с инструкциями производителей.
Для отделения ГЬ-22-СЕЕ от других одновременно очищаемых белков, концентрированные объединенные фракции полипептидного элюата обрабатывали смолой Р0К08 НО-50 (сильной анионообменной смолой, поставляемой Рег8ер0уе Вю8ук!етк, Ргаттдйат, МА) при рН 8,0. Содержимое 1,0x6,0 смколонки выливали и загружали непрерывным потоком на ВюСаб 8ргт!. Затем в колонку загружали противоион и уравновешивали в 20 мМ Триса, рН 8,0 (Тпк) (гидроксиметиламинометан). Образец разводили 1:13 (для снижения ионной силы РВ8), а затем загружали в колонку Рогок НО при скорости 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами 20 мМ Триса, рН 8,0, а затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ триса/1М хлорида натрия (№1С1) при скорости 10 мл/мин. В течение всего периода проведения хроматографии собирали 1,5 мл-фракции и проводили мониторинг оптической плотности при 280 и 215 нМ. Фракции пика элюирования анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до объема 1,5-2 мл с использованием центрифужного концентратора, имеющего мембранный фильтр с отсечкой молекулярной массы 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА) в соответствии с инструкциями производителей.
Для отделения полипептида ГЬ-22-СЕЕ от свободного пептида ЕЕ и от любых одновременно очищаемых примесных белков, объединенные концентрированные фракции подвергали эксклюзионной хроматографии на уравновешенной 1,5x90 см-колонке с сефадексом 8200 (Рйагтата Р1кса!а^ау, N1) и загружали РВ8 при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием ВюСаб 8ргт!. В течение всего периода проведения хроматографии собирали 1,5 мл-фракции и проводили мониторинг оптической плотности при 280 и 215 нМ. Фракции пика анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только самые чистые фракции. Этот материал представлял собой очищенный полипептид ГЬ-22-СЕЕ.
И наконец, этот очищенный материал загружали в колонку с 4 мл АсОС1еап Е!ох (8!егодепе) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Образец четыре раза пропускали через РВ8-уравновешенную колонку с элюированием самотеком, а затем эту колонку один раз промывали РВ8 объемом 3 мл, и полученный образец объединяли с очищенным образцом. Затем этот материал фильтровали через стерильный фильтр 0,2 мкм и хранили при -80°С до разделения на аликвоты.
Полипептид ГЬ-22-СЕЕ представлял собой одну главную полосу, на что указывал Вестерн-блоттинг и электрофорез в ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси синим и серебром. Концентрацию белка в очищенном материале определяли с помощью анализа ВСА (Р1егсе, КоскГогб, ГЬ), после чего белок разделяли на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии со стандартными процедурами.
Для получения анти-ЕЕ антитела, конъюгированного с сефарозой, 100 мл объема О-белкасефарозного слоя (Рйагтата Р1кса!а^ау, N1) 3 раза промывали 100 мл РВ8, содержащего 0,02% азида натрия с использованием 0,45 микронного фильтра №11депе объемом 500 мл. Гель промывали 6,0 объемами 200 мМ триэтаноламина, рН 8,2 (ТЕА, 81дта, 8!. Ьошк, МО.) и добавляли равный объем раствора антитела против ЕЕ, содержащего 900 мг антитела. После инкубирования в течение ночи при 4°С, несвязанное антитело удаляли промывкой смолы 5 объемами 200 мМ ТЕА, как описано выше. Смолу ресуспендировали в 2 объемах ТЕА, переносили в подходящий сосуд и добавляли диметилпимилимидат-2НС1 (Р1егсе, КоскГогб, ГЬ), растворенный в ТЕА, до конечной концентрации 36 мг/мл О-белок-сефарозного геля. Затем гель встряхивали при комнатной температуре в течение 45 мин, и жидкость удаляли с использованием фильтра, описанного выше. После этого, неспецифические участки на геле блокировали путем инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре 5 объемами 20 мМ этаноламина в
- 60 009026
200 мМ ТЕА. Затем гель промывали 5 объемами РВ8, содержащего 0,02% азида натрия и хранили в этом растворе при 4°С.
Пример 5. Действие полипептида ΙΕ-22 т у1уо
Мышей (8-недельных самок С57ВЕ/6Н; СЬаг1ек Ктует БаЬ., Кшдк!оп, ΚΥ) разделяли на три группы. Аденовирус, экспрессирующий полипептид ΙΕ-22 (8ЕО ΙΌ N0:6), предварительно получали стандартными методами. На день 0 родительский или предварительно полученный аденовирус ΙΕ-22 вводили через хвостовую вену первой группе (п=8) и второй группе (п=8) мышей соответственно, при этом каждой мыши вводили дозу ~1х10п частиц в объеме ~0,1 мл. Третью группу (п=8) не обрабатывали. На 12-й день мышей взвешивали и брали кровь. Затем проводили полный клинический анализ крови (СВС) и химический анализ проб сыворотки. В пробах крови у групп мышей, которым вводили ΙΕ-22-аденовирус, детектировали статистические значимое увеличение числа нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с группой, обработанной родительским аденовирусом. Аналогичным образом, у групп мышей, которым вводили ΙΕ-22-аденовирус, число лимфоцитов и эритроцитов было значительно ниже, чем у группы мышей, обработанных родительским аденовирусом. Кроме того, у мышей, обработанных ΙΕ-22аденовирусом, наблюдалось снижение массы тела, тогда как у мышей, обработанных родительским аденовирусом, наблюдалось увеличение массы тела. При этом на 3-й день уровень ΙΕ-22 в сыворотке повышался, а уровень глюкозы снижался. В целом, у мышей, которым был введен ΙΕ-22-аденовирус, наблюдался ответ острой фазы, который может быть также инициирован другими провоспалительными цитокинами, такими как цитокины Т^Е-альфа, Ш-бета и др130. Ответ острой фазы представляет собой серию воспалительных реакций немедленного типа, инициируемых молекулами распознавания по определенному признаку. Белки острой фазы усиливают защиту от микроорганизмов и модифицируют воспалительные реакции путем воздействия на миграцию клеток и высвобождение медиатора. Так, например, 8АА обладает сильной функцией, активирующей лейкоциты, включая индуцирование хемотаксиса, повышения уровня адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам и усиление фагоцитоза. Выявление факторов, которые инициируют и изменяют уровень и продолжительность реакции острой фазы, является важной ступенью в разработке новых способов лечения инфекционных и воспалительных заболеваний.
Полученные результаты позволяют предположить, что ΙΕ-22 влияет на гемопоэз, т.е. на образование клеток крови ш у1уо. ΙΕ-22 сам может обладать биологической активностью, оказывающей влияние на различные стволовые клетки крови, что приводит к увеличению или снижению числа некоторых дифференцированных клеток крови в специфической линии дифференцировки. Так, например, ΙΕ-22, очевидно, снижает число лимфоцитов, что, вероятно, обусловлено ингибированием коммитированных клеток-предшественников, которые образуют лимфоидные клетки. ΙΕ-22 также снижает число эритроцитов, что подтверждает мнение о том, что ΙΕ-22 может играть определенную роль в развитии анемии, инфекций, воспаления и/или иммунных заболеваний посредством воздействия на клетки крови, участвующие в этих процессах. Антагонисты против ΙΕ-22, такие как антитела или его растворимый рецептор ΙΕ22КА2, могут быть использованы в качестве терапевтических средств для лечения этих заболеваний.
Кроме того, эти эксперименты, проведенные на мышах с использованием ΙΕ-22-аденовируса, позволяют предположить, что сверхэкспрессия ΙΕ-22 приводит к увеличению уровня нейтрофилов и тромбоцитов 1п у1уо. Очевидно, что имеются и другие факторы (такие как цитокины и гены-модификаторы), участвующие в ответах на ΙΕ-22 в системе всего организма животного. Тем не менее, эти данные со всей очевидностью подтверждают участие ΙΕ-22 в гемопоэзе. Таким образом, ΙΕ-22 и его рецепторы являются подходящими средствами/мишенями для диагностики и лечения различных расстройств, таких как воспаление, иммунные расстройства, инфекции, анемия, рак гемопоэтической системы и другие раковые заболевания и т. п.
Пример 6. Трансгенные мыши, экспрессирующие ΙΕ-22
А. Получение трансгенных мышей, экспрессирующих мышиный ΙΕ-22
ДНК-фрагменты, происходящие от трансгенного вектора, содержащего 5'- и 3'-фланкирующие последовательности лимфоид-специфического промотора ЕцБСК, мышиный ΙΕ-22 (8Е0 ΙΌ N0:10; полипептид, представленный в 8Е0 ΙΌ N0:11), интрон крысиного инсулина ΙΙ, кДНК ΙΕ-22 и ро1у-Апоследовательность человеческого гормона роста, получали стандартными методами и использовали для микроинъекции в оплодотворенные мышиные ооциты В6С3Г1 (Тасошс, Сеттап!о^п, ΗΥ) в соответствии со стандартным протоколом микроинъекций. См., Нодап В. е! а1., Машри1а!шд !Ье Мойке ЕшЬпо: А БаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НатЬот ЕаЬота!оту Ргекк, 1994.
Из 154 детенышей было идентифицировано 25 мышей, трансгенных по мышиному ΙΕ-22 с лимфоид-специфическим промотором ЕцБСК. 11 из этих трансгенных детенышей погибли в первые часы рождения, 9 трансгенных детенышей с блестящей кожей были подвергнуты аутопсии в первый день рождения, а 2 детеныша достигли зрелого возраста. Уровни экспрессии у одного взрослого животного были низкими. Затем из аутопсированных детенышей получали срезы тканей и эти ткани подвергали гистологическому анализу как описано ниже.
Блестящая кожа у новорожденных мышат, очевидно, ассоциируется с ее жесткостью, такой, как если бы она была высушена, что приводило к затруднению правильного выкармливания мышат. Все они,
- 61 009026 в основном, становились все более малоподвижными.
B. Анализ генотипа и экспрессии трансгенных мышей
На день 1 (день рождения), новорожденных животных, происходящих от мышиной ΙΕ-22трансгенной линии под контролем промотора ЕцЬСК, описанным выше, наблюдали на наличие патологий, а затем их умерщвляли для сбора тканей. Всем детенышам прикрепляли индивидуальные ушные бирки с номером, а тех мышей, которые на время умерщвления имели фенотип блестящей кожи, регистрировали. Из двенадцати детенышей шесть мышей имели фенотип блестящей кожи, причем два детеныша были идентифицированы как мыши с тяжелым фенотипом. Термин тяжелый фенотип относится к мелким мышатам с малой подвижностью, кожа которых была особенно блестящей и очень сухой. Кожу брали из левого бока каждого детеныша и замораживали в заливочной среде Т1ккие-Тек.
Генотипирование подтвердило, что блестящая кожа является хорошим индикатором трансгенного статуса, хотя никаких данных относительно экспрессии не было получено. Блоки замороженных тканей разрезали на 7-микронные срезы на криостате и окрашивали на присутствие С123, СО4, СО8, мышиных макрофагов, В-клеток, СБ80 и ГКГ класса ΙΙ. Протокол окрашивания предусматривал связывание коммерчески доступных антител с тканью, детекцию меченным пероксидазой вторым антителом и проведение реакции хромогена ВАК для визуализации окрашивания.
Было обнаружено, что трансгенные животные имели повышенные уровни ГКГ класса ΙΙ и СБ80, на что указывало окрашивание антиген-презентирующих клеток и дендритных клеток, соответственно. Маркер макрофагов также указывал, что у трансгенных мышей с тяжелым и нетяжелым фенотипом присутствовало большее количество этих клеток, чем у животных дикого типа, хотя распределение этих клеток было локализовано, в основном, в верхнем слое дермы. Животных классифицировали как животных с тяжелым фенотипом, если у них наблюдалось наиболее стойкое окрашивание всеми тремя маркерами, о чем свидетельствовало значительное увеличение интенсивности и числа клеток по сравнению с животными дикого типа. Такая вариабельность у этих трансгенных детенышей с пораженной кожей может быть обусловлена различием в уровнях экспрессии ΙΕ-22. Клетки, позитивные по ГКГ класса ΙΙ, были локализованы в нижней части дермы, в виде рыхлого рассеянного скопления клеток, а СБ80позитивные клетки локализовались преимущественно ниже дермы либо в пограничном слое мышца/жир, либо непосредственно над этим слоем. Эти две клеточные популяции не обнаруживали перекрывания. Все остальные маркеры давали эквивалентное окрашивание у всех животных. Окрашивание тучных клеток толуидиновым синим выявило лишь небольшое различие между животными дикого типа и трансгенными животными, либо вообще не выявило каких-либо различий.
C. Микроскопический анализ тканей трансгенных мышей: ΙΙ.-22-трансгенные животные с промотором ЕцИСК погибают сразу после рождения, на что указывал гистологический анализ
На первый день рождения детеныши от помета, содержащего ИИ-22-трансгены, подвергали гуманной эвтаназии и целиком фиксировали путем погружения в 10% забуференный формалин. Шесть трансгенных и два нетрансгенных детеныша подвергали дальнейшей обработке. Во время эвтаназии было обнаружено, что четыре из шести трансгенных животных имели блестящую кожу. Фиксированные ткани острожно разрезали на 5 секций (продольный срез головы и поперечные срезы верхнего и нижнего отделов грудной клетки и верхнего и нижнего отделов брюшины). Ткани заливали в парафин, подвергали рутинной обработке и получали 5 мкм-срезы (.1ипв 2065 Зирегси! т1сго!оте, Иечса М1сгокук!етк, Ше1/1аг, Сегтапу), которые затем окрашивали красителем Н&Е. Окрашенные ткани были исследованы под оптическим микроскопом (Мкоп ЕсИрке Е600, Мкоп Ыс., МеМ11е, N7) ветеринаром-патологом, который имел на это разрешение разрешающих органов (АСУР).
Исследования под микроскопом показали, что эпидермис двух из этих трансгенных детенышей был толще, чем эпидермис других шести мышей, включая контрольных мышей. При этом, каких-либо других патологий на коже и в других тканях всех этих мышей не наблюдалось. Репрезентативную область кожи, взятой из соответствующих областей грудной клетки и брюшины, наблюдали под объективом 40Х и с помощью цифровой камеры Соо1Зпар (Корег Зс1еп!1йс, Ыс., Зап В1едо, СА), подсоединенной к микроскопу. Затем, толщину эпидермиса определяли с помощью компьютерной программы, используемой для гистоморфометрического анализа (Зсюп Ипаве Юг Шнпбохе (МН Ипаве), Зсюп Согр., Ргебепск, МО, ν.Β4.0.2). Результаты приводятся ниже в табл. 5.
Таблица 5
Генотип/фенотип Средняя толщина кожи грудной клетки (мкм) Средняя толщина кожи брюшины (мкм)
Нетрансгенный/нормальный 5,2 5,4
Трансгенный/неблестящий 5,0 6,7
Трансгенный/блестящий 8,2 7,4
Трансгенный/все 7,1 7,1
- 62 009026
Хотя, для определения статистической значимости число имеющихся мышей было недостаточным, но тем не менее, у трансгенных мышей, а особенно, у мышей с блестящей кожей, наблюдались тенденции к утолщению эпидермиса, по сравнению с трансгенными мышами, не имеющими блестящей кожи, и с нетрансгенным контролем. У трансгенных мышей с блестящей кожей может наблюдаться более высокий уровень экспрессии Ш-22, чем у трансгенных мышей с неблестящей кожей, однако, уровни экспрессии для этих мышей не были определены. Эти данные дают основание предполагать, что Ш-22 играет определенную роль в развитии псориаза, псориазного артрита, либо других воспалительных состояний кожи или других воспалительных заболеваний.
Пример 7. Действие полипептида Ш-22 ш νί\Ό
А. У мышей, инфицированных Ш-22-аденовирусом, наблюдалось индуцирование 8АА
Мышей (8-недельных самок С57ВЬ/6Н; Сбаг1ек К1уег ЬаЬк., Ктдк!оп, ΗΥ) разделяли на три группы. Аденовирус, экспрессирующий полипептид Ш-22 (8Еф ΙΌ N0:6), предварительно получали стандартными методами. На день 0 родительский или Ш-22-аденовирус вводили первой группе (п=8) и второй группе (п=8) мышей, соответственно, через хвостовую вену, при этом каждой мыши вводили дозу ~1 х 1011 частиц в объеме ~0,1 мл. Третью группу (п=8) не обрабатывали. На 12-й день мышей взвешивали и брали кровь. На 20-й день исследования мышей умерщвляли, регистрировали массу тела и брали кровь и ткани для анализа.
Затем делали полный клинический анализ крови (СВС) всех проб крови и химический анализ сыворотки. На 12-й и 20-й день в пробах крови у групп мышей, которым вводили Ш-22-аденовирус, детектировали статистические значимое увеличение числа нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с группой, обработанной родительским аденовирусом. Кроме того, на день 12 число лимфоцитов у групп мышей, которым вводили Ш-22-аденовирус, было значительно ниже, чем у группы мышей, обработанных родительским аденовирусом, а на 20-й день наблюдался противоположный эффект. Кроме того, у мышей, обработанных Ш-22-аденовирусом, наблюдалось снижение массы тела, тогда как у мышей, обработанных родительским аденовирусом, масса тела увеличивалась. Кроме того, в эти периоды времени у групп мышей, которым вводили Ш-22-аденовирус, уровень глюкозы в пробах сыворотки значительно повышался, по сравнению с группой мышей, которым вводили родительский аденовирус. В этой период времени уровень альбумина в сыворотке также значительно снижался. На день 20 уровни азота мочевины в крови были значительно снижены. На этот период времени у групп мышей, которым вводили Ш-22аденовирус, уровни глобулина в сыворотке значительно повышались, по сравнению с группами мышей, которым вводили родительский аденовирус. Анализ под микроскопом показал, одним из наблюдаемых гистоморфологических изменений, приписываемых действию Ш-22, является регенерация почечных канальцев. При этом, у этой группы животных наблюдалось увеличение случаев заболевания и тяжести заболевания, хотя это не является таким уж редким для мышей. Нефропатия характеризуется многоочаговыми областями базофилии эпителиальных тубулярных клеток коры надпочечника.
Для подтверждения полученных результатов и сбора дополнительных проб был проведен еще один эксперимент, который по своему протоколу был идентичен эксперименту, описанному выше. В этом исследовании, массу тела регистрировали через каждые три дня, и через 3 дня после инъекции аденовируса брали пробы крови, а затем на 10-й день (п=4 на группу) и на 20-й день (п=4 на группу) мышей умерщвляли для сбора крови и ткани. И снова в пробах крови у групп мышей, которым вводили Ш-22аденовирус, детектировались повышенные уровни нейтрофилов и тромбоцитов, по сравнению с группой мышей, обработанной родительским аденовирусом. Для нейтрофилов этот эффект наблюдался на 3-й день, а число тромбоцитов значительно не изменялось вплоть до 10-го дня. Кроме того, на дни 3 и 10 у группы мышей, которым вводили Ш-22-аденовирус, число лимфоцитов значительно снижалось по сравнению с группой мышей, обработанных родительским аденовирусом, но оно не увеличивалось на 20-й день, как было установлено в предыдущем исследовании. И в этом случае, на протяжении всего исследования, у мышей, которым вводили Ш-22-аденовирус, наблюдалось снижение массы тела, тогда как у контрольных мышей, обработанных вирусом, и у необработанных мышей, масса тела увеличивалась. Параметры химического анализа сыворотки совпадали с параметрами предыдущих исследований. В этом исследовании были также подтверждены результаты гистологического анализа на регенерацию почечных канальцев, ассоциированную с обработкой Ш-22-аденовирусом. Эти данные совпадают с дополнительными результатами, указывающими на умеренную протеинурию у мышей, которым вводили Ш-22аденовирус (день 20).
Полученные результаты позволяют предположить, что Ш-22 влияет на гемопоэз, т.е. на образование клеток крови ш у1уо. Ш-22 сам может обладать биологической активностью, оказывающей влияние на различные стволовые клетки крови, что приводит к увеличению или снижению числа некоторых дифференцированных клеток крови в специфической линии дифференцировки. Так, например, Ш-22, очевидно, способствует снижению числа лимфоцитов, что, вероятно, обусловлено ингибированием коммитированных клеток-предшественников, которые образуют лимфоидные клетки, что подтверждает мнение о том, что Ш-22 может играть определенную роль в развитии анемии, инфекций, воспаления и/или иммунных заболеваний посредством воздействия на клетки крови, участвующие в этих процессах. Антагонисты Ш-22, такие как антитела или его растворимый рецептор Ш-22КА2, могут быть использо
- 63 009026 ваны в качестве терапевтических средств для лечения этих заболеваний.
Кроме того, эти эксперименты, проведенные на мышах с использованием ΙΣ-22-аденовируса, позволяют предположить, что сверхэкспрессия Ш-22 приводит к увеличению уровня нейтрофилов и тромбоцитов ш νίνο. Очевидно, что имеются и другие факторы (такие как цитокины и гены-модификаторы), участвующие в ответах на Ш-22 в системе всего организма животного. Тем не менее, эти данные со всей очевидностью подтверждают участие Ш-22 в гемопоэзе. Таким образом, Ш-22, анти-Ш-22 антитела, растворимые рецепторы Ш^КА (например, 8ЕЦ ΙΌ NО:3) и анти-I^-22КА антитела являются подходящими средствами/мишенями для диагностики и лечения различных расстройств, таких как воспаление, иммунные расстройства, инфекции, анемия, рак гемопоэтической системы и другие раковые заболевания и т.п.
Связь экспрессии Ш-22 со снижением массы тела, присутствием 8АА белка острой фазы и метаболическими нарушениями, на которую указывает снижение уровня глюкозы, альбумина и азота мочевины в сыворотке позволяет предположить, что Ш-22 является цитокином, который действует на раннем этапе развития некоторых воспалительных реакций. У мышей, которым был введен ΙΕ-22-аденовирус, может развиваться хроническое воспаление, такое как воспаление, наблюдаемое при ВЗК, язвенном колите, артрите, псориазе, псориазном артрите, астме и т.п. Некоторые негативные воспалительные процессы могут быть ослаблены благодаря использованию антагониста Ш-22, такого как анти-Ш^КА антитела и его рецепторов, таких как растворимые рецепторы Ш-22КА (например, 8ЕЦ ΙΌ NО:3) и анти-Ш^КА антитела и т. п.
B. Ш-22 представляет собой провоспалительный цитокин; уровень 8АА в сыворотке у мышей, инфицированных Ш-22-аденовирусом
Для определения уровня 8АА у мышей, инфицированных ΙΕ-22-аденовирусом, проводили ЕЫ8А с использованием набора и протокола для иммуноанализа на мышиный 8АА (Έίοδοιιπχ Iη!е^ηа!^οηа1, СаНЕэгша, И8А). Разведенные стандарты и неизвестный тестируемый материал вместе с ПХконъюгированными антителами против мышиного 8АА высевали на аналитические планшеты, предварительно сенсибилизированные антителом против мышиного 8АА. Эти планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем промывали в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Планшеты проявляли в течение 15 мин при комнатной температуре с использованием ТМВ и реакцию гасили добавлением 2М Н28О4. Оптическую плотность при 450 нм считывали на спектрометре 8рес!готах 190 ^οΠ^^ ^еν^се8, СаП^гта, И8А). Полученные данные анализировали с использованием программ 8οйтаx Рго ^ο^^Πτ ^еν^се8, СаН^та, И8А) и Ехсе1 (Мюгогой ^гр., АакЫпдФп, И8А).
У мышей, инфицированных ΙΕ-22-аденовирусом, наблюдалось 10-кратное увеличение уровней т8АА по сравнению с контрольными мышами, обработанными родительским аденовирусом.
C. Проточный цитометрический анализ мышей, инфицированных ΙΣ-22-аденовирусом
Для анализа влияния аденовируса на экспрессию Ш-22 ш νίνο, авторами настоящего изобретения были выделены периферическая кровь, селезенка и костный мозг у мышей С.'57ВЕ/6Ш инфицированных Ш-22-аденовирусом на 10-й и 20-й день после инфицирования. Приблизительно 100 мкл крови собирали в пробирки с гепарином, а затем эритроциты удаляли путем гипотонического лизиса (клетки подвергали лизису в 4,5 мл бН2О в течение ~5 с перед добавлением 1,5 мл 3,6% №10'1). Селезенки измельчали между двумя замороженными предметными стеклами, и выделенные клетки пропускали через мембрану Ж1ех (клеточный фильтр) и осаждали. Костный мозг получали путем измельчения одного бедра в ступке с пестиком и пропускания клеток через клеточный фильтр (Ра^п). Клетки ресуспендировали в промывочном ЕАС8-буфере (АВ=НВ88/1%В8А/10 мМ Нерек), подсчитывали в трипановом синем, и 1х106 жизнеспособных клеток каждого типа разделяли на аликвоты и помещали в полистироловые 5 млпробирки. Клетки промывали и осаждали, а затем инкубировали в течение 20 мин на льду со смесью флуоресцентно меченных (ФИТЦ, РЕ и СуСНготе) моноклональных антител (РйагМшдеп, 8ап ^^едο, СА), распознающих различные маркеры клеточной поверхности, используемые для идентификации конкретных субсерий иммунных клеток. Такими маркерами являются следующие молекулы (авторами были протестированы молекулы, перечисленные в группах из 3 молекул), например, молекулы для окрашивания крови: Для окрашивания крови: СЭ3, Сг1 и В220; для окрашивания селезенки: СП62Ь, СЭ44 и СЭ3; СО21, СЭ23 и В220; ЦО, ЦМ и В220; СО11Ь, Сг1 и СЭ8; для окрашивания костного мозга: СО11Ь, Сг1, СО3; ЦО, IдΜ и В220. Клетки промывали 1,5 мл АВ и осаждали, а затем ресуспендировали в 0,4 мл АВ и анализировали на ЕАС8сап с использованием программы СеНЦией (ВесЮп ^^ск^η5οη. Μοиηίа^η У1ете, СА).
Авторами было обнаружено, что в крови у мышей, обработанных ΙΣ-22-аденовирусом, наблюдалось 4-13-кратное увеличение фракции нейтрофилов на 10-й день и 2-3-кратное увеличение на 20-й день. На 10-й день это различие приводило к одновременному снижению фракции лимфоцитов и моноцитов в крови. Авторами было обнаружено, что в костном мозге общее число В-клеток снижалось в ~1,5 раз, тогда как процент зрелых рециркулирующих В-клеток увеличивался, а общее число незрелых В-клеток слегка снижалось на 10-й день. На 20-й день многие из этих различий явно не наблюдались, хотя авторами было обнаружено небольшое увеличение фракции зрелых рециркулирующих В-клеток. В селезенке общее число В-клеток слегка снижалось (в 1,5-2 раза) на оба дня тестирования, тогда как на 20-й день фракция В-клеток маргинальной зоны (СО21+СЭ23-В220+) увеличивалась в 2 раза, а число фолликуляр
- 64 009026 ных В-клеток (СБ21+СП23+В220+) снижалось в 2 раза. Считается, что В-клетки маргинальной зоны представляют собой первую линию защиты против патогенов, поскольку они являются более чувствительными к В-клеточным митогенам (например, ЛПС), чем более распространенные фолликулярные Вклетки, и при их взаимодействии с когнатным антигеном, то их дифференцировка в антителосекретирующие клетки осуществлялась очень быстро. Возможно, что ΙΕ-22 либо ускоряет превращение фолликулярных клеток в В-клетки маргинальной зоны, либо он способствует селективному истощению менее зрелых фолликулярных клеток. Изменение числа В-клеток, обнаруживаемых в костном мозге, может быть обусловлено ускоренной дифференцировкой пре/про- и/или незрелых В-клеток, или увеличением притока рециркулирующих В-клеток из крови/селезенки, и, вероятно, одновременным увеличением экспорта незрелых В-клеток в периферическую область. Фактическое число зрелых В-клеток костного мозга (ВМ) не увеличивалось, а поэтому ΙΕ-22, вероятно, не может усиливать их пролиферацию. Альтернативно, ΙΕ-22 может блокировать, подавлять или ингибировать дифференцировку незрелых В-клеток, и, тем самым, увеличивать уровень относительной репрезентации зрелых В-клеток.
Ό. ^-22^2^04 нейтрализует активность ΙΕ-22 1и νί\·Ό: БАА-ЕЫБА показал, что экспрессия БАА, индуцируемая ΙΕ-22, ингибируется инъекцией ^-22^^2^4
Для оценки способности ^-22^^2 ингибировать ΙΕ-22-индуцирование БАА, мышей (8-недельных самок мышей С3Н/НЕ1; Дасккои ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) разделяли на пять групп по три животных в каждой группе и этим мышам 1.р. инъецировали белки как указано в нижеследующей табл. 6.
Таблица 6
Группа # 1Ь-22 ΙΙ1-22ΚΑ
Группа 1: - -
Группа 2: - 100 мкг
Группа 3: 3 мкг -
Группа 4: 3 мкг 20 мкг
Группа 5: 3 мкг 100 мкг
0.-221^2 инъецировали за 15 мин до введения инъекции ΙΕ-22. Обе инъекции белка вводили внутрибрюшинно. У каждой мыши брали пробы крови до обработки, а затем через 2 и 6 ч после обработки. От каждой пробы получали сыворотку для измерения уровней БАА и ΙΕ-22.
Для определения уровня БАА у мышей, обработанных ΙΕ-22 и описанным здесь растворимым рецептором ΙΕ-22, I^-22КА2-Ρс4, проводили ЕЫБА-анализ как описано выше. У мышей, обработанных 3 мкг ΙΡ-22 в комбинации с ^-22^^2^4 в концентрациях 20-100 мкг, наблюдалось снижение уровня БАА, индуцированного одним ΙΡ-22, до фоновых уровней, что свидетельствует о том, что I^-22КА2 ингибирует БАА-индуцируемую активность ΙΡ-22 1и νί\·Ό.
Пример 8. Экспрессия ΙΡ-22 у мышей с моделью воспалительного заболевания кишечника
Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) представляет собой многофакторное заболевание, подразделяемое на два типа, язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК). Этиология этих заболеваний пока еще неясна и эти заболевания имеют разнообразные клинические симптомы. ЯК ограничивается толстой кишкой, и его симптомами являются геморрагическая диарея, снижение массы тела и боли в абдоминальной области. Макроскопическими признаками ЯК являются глубокие точечные язвы и укорочение толстой кишки. В противоположность этому, болезнь Крона может поражать также и другие области кишечника. Ее симптомами является диарея (которая имеет примеси крови, но реже чем при ЯК), небольшое повышение температуры и боли. Макроскопическими признаками БК является фиброзный и стенозный кишечник с его сужением, глубокими язвами, трещинами и фистулами.
Существует несколько животных-моделей, которые имитируют эти заболевания человека. Тремя моделями колита, обычно используемыми для поиска новых лекарственных средств, являются: крысиная модель заболевания, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТПВБ), мышиная модель переноса Т-клеток, или мышиная модель заболевания, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана или БББ-индуцированная мышиная модель. БББ-модель была получена на основе модели, предложенной Пг.Б.МигШу, с использованием системы оценки индекса активности заболевания (Б.Ы.Б. Миг!Ьу, Тгеа!теи! оГ Бех!гаи Би1Га!е БойштПийисей Мипие СоНбк Ьу ^Фасоктс Сус1окрогт, Όΐдек!гуе Бхкеакек аий Бс1еисек, Уо1. 38, № 9 (Бер!етЬег 1993), рр.1722-1734).
В настоящем исследовании острый колит индуцировали путем введения БББ в питьевую воду для мышей в течение 6 дней. У животных наблюдалось снижение массы тела и геморрагическая диарея, имитирующая состояние, обычно возникающее при ЯК у пациентов. Механизм БББ-индуцированного поражения точно неизвестен, однако, считается, что он индуцирует неспецифический воспалительный иммунный ответ и имитирует влияние условий окружающей среды на кишечник. Возможно, что в данном случае продуцируется Н2Б, который является токсичным для клеток. Кроме того, наблюдается изменение бактериальной флоры просвета кишки. В толстой кишке были обнаружены активированные моноциты, макрофаги и тучные клетки. Медиаторами для всех трех моделей заболевания у животных являются воспалительные простагландины, метаболиты лейкотриена и цитокины.
- 65 009026
A. Метод
Колит индуцировали путем введения Ό88 в корм для самок мышей 8\\азз VеЬз!е^, полученных из лаборатории Сйаг1ез Ктуег ЬаЬога!опез. В начале исследования мыши имели возраст 10 и 11 недель. Мышам давали 4% Ό88 в питьевой воде в течение 6 дней (обработанные мыши), либо им давали обычную питьевую воду (контрольные мыши). В анализе использовали клиническую оценку индекса активности заболевания (ИА^, которая представляет собой комбинацию измерений, включая качество стула, скрытую кровь и снижение массы тела. ^ΑI определяли ежедневно для каждой мыши, начиная с первого дня после начала 088-обработки. Через 6 дней Ό88 удаляли из питьевой воды для обработанных мышей. Затем проводили мониторинг всех мышей на клиническую оценку ЭАГ и на 2-й, 7-й или 10-й день после начала проведения исследований мышей умерщвляли, а на 2-й и 7-й дни умерщвляли четырех Ό88обработанных мышей и одну контрольную мышь. На 10-й день умерщвляли четырех О88-обработанных мышей и двух контрольных мышей. После умерщвления всех животных измеряли длину толстой кишки. Срезы толстой кишки фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине для проведения гистологического анализа, либо замораживали для экстракции мРНК.
B. Гистологический анализ и оценка индекса активности заболевания (ИАЦ
Гистологические оценки индекса активности заболевания получали методом, описанным в работе 1. В общих чертах, анализ срезов толстой кишки на состояние крипты, гиперплазию эпителия, деформацию крипты и воспаление был проведен патологом слепым методом.
Ежедневно каждую мышь оценивали по клиническим показателям, таким как снижение массы тела, консистенция стула и кишечные кровотечения. Более высокая оценка соответствовала увеличению потери массы, диареи и кровотечения. Ежедневная оценка для каждой мыши представляла собой среднее для трех результатов/наблюдений.
C. Результаты
На дни 7 и 10 длина толстой кишки у О88-обработанных мышей была несколько короче, чем у необработанных контрольных животных, однако, эти результаты не могут считаться значимыми (не подвергались статистическому анализу). Клинические оценки ^ΑI указывали на увеличение симптомов заболевания у 088-обработанных мышей, что соответствовало наблюдениям в предыдущих исследованиях с использованием этой модели. Оценка на скрытую кровь была наибольшей примерно на дни 4 и 5, при этом в дни 6 и 7 наблюдался, в основном, жидкий стул. Результаты гистопатологического анализа показали, что оценки заболевания отличались от оценок контрольных животных на все дни умерщвления, а в частности, дни 7 (пик) и 10.
Гистопатологический скриниг давал следующие оценки: контроль=0,5, день 2, 088-обработанные мыши=8,8, день 7, О88-обработанные мыши=21, день 10, 088-обработанные мыши=18. Клинические и гистопатологические оценки показали, что у 088-обработанных мышей наблюдалось значительное поражение толстой кишки по сравнению с необработанными контрольными животными. Замороженные образцы тканей использовали для последующего определения мРНК, как описано ниже.
Ό. Экспрессия РНК ΙΓ-22 в образцах ткани толстой кишки мышей с ВЗК оценивается с помощью ОТ-ПЦР
Для определения относительной экспрессии мышиной РНК Ш-22 (8ЕО ΙΌ N0:10; 8Е0 ΙΌ N0:11) в модели с воспалительным заболеванием кишечника, у О88-обработанных мышей брали дистальные отделы толстой кишки и быстро замораживали в жидком азоте. В этом эксперименте мышей обрабатывали 088 и на 2-й, 7-й и 10-й день после обработки брали образцы. Также брали образцы у нормальных необработанных мышей. Затем из этих образцов выделяли РНК с использованием стандартного набора КХеазу М1б1ргер™ (Р1адеи, Уа1еис1а, СА) в соответствии с инструкциями производителей.
В ОТ-ПЦР-реакциях использовали систему одностадийной ОТ-ПЦР 8ирегзспр! с платиновой меткой (ЫГе Тесйио1од1ез, СаййегзЬигд, МО). Каждые 25 мкл реакционной смеси состояли из следующих компонентов: 12,5 мкл 2хреакционного буфера, 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) 2С39289 (8Е0 ΙΌ N0:17), 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) 2С39290 (8Е0 ΙΌ N0:18), 0,4 мкл смеси ОТ/полимераза Тад, 10 мкл воды, не содержащей РНКазы, 1,0 мкл полноразмерной РНК (100 нг/мкл). Амплификацию осуществляли в следующем режиме: один цикл 50°С, 30 мин, затем 35 циклов - 94°С, 30 с; 58°С, 30 с; 72°С, 60 с, и наконец, удлинение при 72°С в течение 7 мин. 8-10 мкл реакционного ПЦР-продукта подвергали стандартному электрофорезу в 2% агарозном геле. Правильный размер предсказанного кДНК-фрагмента подтверждали следующим образом: в обоих образцах, взятых на 2-й день, наблюдалась слабая полоса. В двух из трех образцов, взятых на 7-й день, наблюдалась яркая полоса, а в третьем образце, взятом на 7-й день, наблюдалась очень яркая полоса. Во всех трех образцах, взятых на 10-й день, наблюдалась яркая полоса. И наконец, в двух образцах нормального контроля вообще не наблюдалось никаких полос. Эти результаты дают основание предполагать, что при некоторых типах воспалительных реакций в толстой кишке, включая реакции, ассоциированные с ВЗК, ЯК и БК, может происходить активация Ш-22. Эти данные систематизированы ниже в табл. 7, где относительную экспрессию оценивали следующим образом: 0=полоса отсутствует, 1=слабая полоса, 2=яркая полоса, 3=очень яркая полоса.
- 66 009026
Таблица 7
Ткань Относительная экспрессия (0-3)
Нормальная толстая кишка 0
Нормальная толстая кишка 0
День 2 после обработки 1
День 2 после обработки 1
День 7 после обработки 3
День 7 после обработки 2
День 7 после обработки 2
День 10 после обработки 2
День 10 после обработки 2
День 10 после обработки 2
Пример 9. !Е-22КА снижает уровни П.-6 и 8АА у мышей с моделью артрита, индуцированного коллагеном (ОА)
А. Мышиная модель артрита, индуцированного коллагеном (ОА)
Десятинедельных самцов мышей БВА/И (Дасккоп ЬаЬк) разделяли на три группы по 13 мышей на группу. На день -21, животным вводили подкожную инъекцию 50-100 мкл 1 мг/мл куриного коллагена типа II, приготовленного в полном адъюванте Фрейнда (поставляемого СНопйгех, Кейтопй, νΆ), и через три недели, на день 0, животным вводили инъекцию 100 мкл (25 мкг) ЛПС Е.сой 0111 :В4, полученного в виде 250 мкг/мл лиофилизованной аликвоты (81§та, 8!. Ьошк, МО). !Е-22КА2 вводили путем внутрибрюшинной инъекции 3 раза в неделю в течение 4 недель со дня 0 до дня 25. Первым двум группам вводили дозу либо 100, либо 10 мкг !Е-22КА2 для одного животного, а третьей контрольной группе вводили носитель, РВ8 (Ь1Ге ТесНпо1о§1ек, КоскуШе, МБ). После инъекции ЛПС у животных начинали появляться симптомы артрита, при этом у большинства животных воспаление развивалось в течение 2-3 недель. Степень заболевания оценивали для каждой лапы с помощью штангенциркуля для измерения толщины лапы, и каждую лапу оценивали по следующей шкале клинических оценок (0-3): 0=нормальная, 0,5=воспаление пальца(пальцев), 1=слабое воспаление лапы, 2=умеренное воспаление лапы и 3=тяжелое воспаление лапы, как подробно описано ниже.
Мониторинг заболевания
Проявление признаков воспаления лапы у животных могло начинаться вскоре после второй инъекции коллагена, а у некоторых животных признаки воспаления пальцев могли наблюдаться даже перед второй инъекцией коллагена. У большинства животных артрит развивался в течение 2-3 недель после бустер-инъекции, а у некоторых животных для развития заболевания мог потребоваться более длительный период времени. Заболеваемость в этой модели обычно составляла 95-100%, а в исследованиях, проводимых на 40 животных, обычно присутствовало 0-2 нереспондентов (как было определено после 6недельного наблюдения). При этом, следует отметить, что поскольку воспаление только начиналось, то могло наблюдаться незначительное кратковременное воспаление лап или пальцев. По этой причине, животное не рассматривалось как животное с развившимся заболеванием до тех пор, пока не наблюдалось заметное стойкое опухание лапы.
Всех животных ежедневно оценивали на статус заболевания по поражению их лап, и эту оценку проводили путем присваивания каждой лапе качественного клинического показателя. Каждый день по 4 лапы каждого животного оценивали в соответствии со статусом клинического заболевания. Для определения клинического показателя лапа может быть условно разделена на 3 зоны, а именно, пальцы, сама лапа (кисть или стопа) и сустав запястья или лодыжки. Оценка степени и тяжести воспаления этих зон предусматривала наблюдение всех пальцев на какое-либо опухание суставов, поражение ногтей или покраснение, выявление каких-либо признаков отека или покраснения любой из лап, и установление какойлибо четкой анатомической границы сухожилия или костей; оценку запястья или лодыжки на какие-либо отеки или покраснение и установление распространения воспаления на ближайшую конечность. Оценки лапы 1, 2 или 3 были даны, во-первых, исходя из общего наблюдения тяжести поражения, и во-вторых, исходя из количества зон, вовлеченных в воспаление. Система клинических оценок приводится ниже.
Клиническая оценка:
0=нормальная;
0,5=вовлечение в патологический процесс одного или нескольких пальцев, но только лишь их воспаление;
1=слабое воспаление лапы (1 зона) и такое воспаление может распространяться на один палец или на несколько пальцев;
2=умеренное воспаление лапы и это воспаление может распространяться на некоторые пальцы и/или на запястье/лодыжку (2 зоны);
- 67 009026
3=тяжелое воспаление лапы, запястья/лодыжки и некоторых пальцев или всех пальцев (3 зоны).
Развившееся заболевание определяли по качественной оценке воспаления лапы, соответствующей баллу 2 или более, которое продолжалось в течение ночи (два дня подряд). После того, как заболевание было установлено, регистрировали данные и эти данные интерпретировали как первый день с развившимся заболеванием животного.
Кровь брали в течение всего эксперимента для мониторинга уровней антител против коллагена в сыворотке. Затем животных подвергали эвтаназии на 21-й день, и брали пробы крови для получения сыворотки и для проведения полного клинического анализа крови (СВС). Одну пораженную лапу каждого животного помещали в 10% N66 для гистологического анализа, а одну лапу замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для анализа мРНК. Затем для анализа РНК брали 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 мезентриального лимфоузла, одну долю печени и левую почку, для гистологического анализа брали 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 мезентриального лимфоузла, а остальную часть печени и правую почку, и помещали в 10% N86. Сыворотку собирали и замораживали при -80°С для проведения анализов на иммуноглобулин и цитокины.
После анализа оценок состояния лап и результатов измерения, каких-либо статистических значимых различий между группами обнаружено не было, хотя имеется предположение, что у одной группы обработки, которой вводили 1Ь-22КА2, может замедляться начало развития и прогрессирования воспаления лапы. Каких-либо значимых различий, с точки зрения изменений массы тела, параметров СВС или уровней антител против коллагена у исследуемых групп не наблюдалось. Эти предварительные результаты показали, что 1Ь-22КА2 не оказывают негативного влияния на массу тела, уровни эритроцитов или лейкоцитов, или уровни продуцирования антитела, но могут снижать степень воспаления. Протокол дополнительных исследований доз, механизма действия и эффективности находятся в процессе разработки (пример 10).
B. Данные анализа ЕЫ8А на антитела против коллагена, проведенного на мышиной модели С1А
Пробы сыворотки брали в дни 0, 7, 14, 21 и 28 после антигенной стимуляции липополисахаридом (ЛПС) (день 0) у мышей с моделью индуцированного коллагеном артрита (см. выше пример 9 А). Эти пробы сыворотки скринировали с помощью ЕШ8А на титры антител против коллагена. Какого-либо статистически значимого влияния обработки групп мышей 100 мкг или 10 мкг 1Ь-22КА2 на уровни антител против коллагена по сравнению с РВ8-контролем не наблюдалось. Ниже приводится описание методов и материалов для проведения ЕЬ1§А-анализа на уровень антител против коллагена.
Реагентами, используемыми для ЕЬ1§А-анализа антител против коллагена, являются 96-луночные микротитрационные планшеты Мах1когр (NυNС, КосРек!ег, ΚΥ), куриный коллаген типа II (СРопбгех, Кебтопб, УА), 8ирег В1оск (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь), конъюгированное с пероксидазой хрена (ПХ) козье антитело против мышиного 1дО+А+М (Н+Ь) (2утеб, 8ои!Р 8ап Ргапаксо, СА) и субстрат, дигидрохлорид о-фенилендиамина (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь). Буферами, используемыми во всех анализах, являются ЕЫ8А-буфер В для разведения (РВ8+0,1% В8А+0,05% Твина (81§та, 8!. Ьошк, МО)), промывочный буфер С для ЕЫ8А (РВ8+0,05% Твина) и проявляющий буфер №уоО (0,063М цитрат натрия, 0,037М лимонная кислота), Н202 (81дта) и 1н. Н2804 (УУК, Тик^Ша, УА).
Приблизительно 100 мкл периферической крови брали из ретро-орбитальной области в пробиркисепараторы для сыворотки (Вес!оп Пюкшкоп). Сыворотку собирали путем центрифугирования (2-3 мин, 16000хд, 4-6°С) и хранили при -20°С до проведения анализа. Для определения уровней антитела 1д против коллагена, планшеты NυNС сенсибилизировали 10 мкг/мл куриного коллагена типа II (СРопбгех, Кебтопб УА) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали реагентом С для ЕЫ8А, блокировали (5 мин, при комнатной температуре) реагентом 8ирег В1оск (Р1егсе, КоскГогб, Ш) и промывали реагентом С для ЕШ8А. В ЕЫ8А-планшеты добавляли разведенные пробы сыворотки (5-кратно разведенные в реагенте В для ЕШ8А в отношении 1:5000-1:625000) с тремя повторениями, и планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубирования планшеты промывали реагентом С для ЕЫ8А и добавляли меченный пероксидазой Рс-фрагмент козьего антитела против мышиного Ц (2утеб, 1:2000 в реагенте В для ЕШ8А). Планшеты инкубировали (при комнатной температуре, 90 мин), снова промывали реагентом С для ЕЫ8А и ПХ-активность обнаруживали с использованием субстрата, дигидрохлорида о-фенилендиамина (10 мл №уоО+1 таблетка 0РЭ+10 мкл Н202, Р1егсе). Реакцию прекращали добавлением 1н. Н2804. Определение относительной оптической плотности проб сыворотки при разведении 1:25000 осуществляли при 490 нм с использованием устройства 8ресРа МАХ 190 и данные анализировали с помощью компьютерной программы 8оГ!Мах Рго (Мо1еси1аг □сисек СогрогаРоп, Ра1о А1!о, СА).
C. Анализ ГЬ-6 и 8АА у мышей с моделью СЧА
Пробы сыворотки брали на день 0 у мышей СЧА (см. выше пример 9А) через 4 ч после внутрибрюшинного введения 25 мкг ЛПС. Затем пробы скринировали на концентрации ГЬ-6 и сывороточного амилоида А (8АА) с использованием коммерчески доступных наборов для ЕЫ8А, поставляемых фирмой Вюкоигсе РйегпаРогиЧ (СатагШо, СА), в соответствии с инструкциями производителей.
У групп мышей, которым вводили 100 мкг I^-22КА2, 10 мкг Гк-22КА2, и у контрольной группы, обработанной РВ8, уровни Ш-6 составляли 9651±1563 пг/мл, 10865±1478 нг/мл и 15006±2099 пг/мл соответ
- 68 009026 ственно. Концентрация ЕБ-6 у групп мышей с СЧА, обработанных дозой 100 мкг ЕБ-22ВА2, была значительно ниже, чем у контрольных мышей, обработанных РВ8 с р=0,351. Статистическую значимость вычисляли с использованием РЬЖ Фишера с уровнем значимости 5% (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).
Кроме того, у групп мышей, которым вводили 100 мкг 1Б-22ВА2, 10 мкг 1Б-22ВА2, и у контрольной группы, обработанной РВ8, концентрации 8АА составляли 381±40, 348±37 и 490±50 мкг/мл соответственно. Концентрация 8АА у групп мышей с СЧА, обработанных дозой 10 мкг 1Б-22ВА2, была значительно ниже, чем у контрольных мышей, обработанных РВ8 с р=0,0257. Статистическую значимость вычисляли с использованием РЬ8О Фишера с уровнем значимости 5% (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).
Пример 10. Анти-1Б-22ВА тАЬ или анти-1Е-22 тАЬ ослабляют тяжесть заболевания у мышей с моделью ПА
Модель с коллаген-индуцированным артритом (СЧА) представляет собой мышиную модель с ревматоидным артритом, которая в высокой степени имитирует заболевание, наблюдаемое у человека. (Мооге, Ме1Нойк Мо1. Вю1. 225:175-179, 2003: ^акктап, 8сапй. Е Iттиηο1., 56:12-34, 2002). Мышей иммунизировали путем инъекции в основание хвоста 2 доз коллагена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Это приводило к опуханию лап, которое увеличивалось в течение определенного периода времени и могло быть визуально оценено и измерено с помощью штангенциркуля. Кроме того, наблюдалась четкая корреляция сывороточных уровней антител против коллагена с тяжестью заболевания. Исходя из данных, указывающих на то, что 1Б-20 и ΙΕ-22 индуцируют воспаление, группам иммунизованных коллагеном мышей вводили тАЬ против 1Б-22ВА и против ΙΕ-22, и оценивали их влияние на показатели данного заболевания. Снижение оценок поражения лап и толщины лап после введения анти1Б-22ВА тАЬ или анти-1Б-22 тАЬ позволяет предположить, что ΙΕ-20 и ΙΕ-22 непрерывно стимулируют вырабатывание иммунного ответа у моделей с аутоиммунным заболеванием, а блокирование, ингибирование, ослабление, подавление или нейтрализация их функций может подавлять аутоиммунные расстройства. Ингибирование сывороточных ТNЕ-α и антител против коллагена также позволяет предположить, что блокирование ЕБ-22ВА может оказаться эффективным для лечения аутоиммунного заболевания.
Таким образом, для оценки влияния анти-1Е-22ВА тАЬ или анти-1Е-22 тАЬ на аутоиммунный ответ, они были протестированы на мышах с моделью ревматоидного артрита, т. е. артрита индуцированного коллагеном (С1А). В частности, для индуцирования артрита, подобного ревматоидному артриту, мышам ЭВАН вводили инъекции коллагена. Инокуляцию на день 0 проводили путем подкожной инъекции гомогената, состоящего из полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) и коллагена типа II (50-100 мкл, 2 мг/мл коллагена). Инъекцию вводили в участок возле основания хвоста. На день 21 проводили вторую инокуляцию с тем лишь различием, что этот гомогенат получали с использованием вместо ПАФ неполного адъюванта Фрейнда (НАФ). Затем ежедневно оценивали поражение лап и их толщину. Группам мышей вводили РВ8, 20-200 мкг контрольного моноклонального антитела соответствующего изотипа, или 20200 мкг анти-1Е-22ВА тАЬ или анти-1Е-22 тАЬ 1.р. 2 или 3 раза в неделю в течение 1-4 недель, начиная со дня после введения второй инъекции коллагена. Затем проводили ежедневный мониторинг мышей до дня 30. На 30-й день мышей умерщвляли, брали сыворотку для проведения анализа на антитело против коллагена и анализа на уровни цитокинов в сыворотке СТ№а).
Снижение оценок поражения лап, толщины лап, уровней Т№-а и уровней антител против коллагена в сыворотке после введения анти-1Е-22ВА тАЬ или анти-1Б-22 тАЬ позволяет предположить, что блокирование 1Б-22ВА может приводить к связыванию, блокированию, ингибированию, снижению уровней, подавлению или нейтрализации ЕБ-22 и к ингибированию, снижению иммунного ответа у моделей с аутоиммунным заболеванием, а также может ослаблять симптомы аутоиммунных расстройств.
Пример 11. Экспрессия рецептора 1Б-22, 1Б-22ВА в мышиной Όδδ-модели
Количественную ОТ-ПЦР осуществляли для измерения уровней экспрессии мышиного 1Б-22ВА в толстой кишке мыши с Όδδ-индуцированым ВЗК (пример 8). На дни обработки 2, 7 и 10, из толстой кишки нормальной мыши и из дистального отдела толстой кишки Όδδ-обработанных мышей выделяли РНК. ОТ-ПЦР осуществляли с использованием устройства и протоколов ТацМап АррНей Вюкук!етк 7700. Вкратце, для конструирования праймеров к мышиной последовательности 1Б-22ВА (ΖΕ39776 (8ЕО ΙΌ N0:19) и ΖС39777 (8ЕС) ΙΌ N0:20)) и меченного зонда ТацМап ЕАМ/ТАМВА (Ζϋ38752 (8 ЕС) ΙΌ N0:21)) использовали программу Рптег Ехргекк в соответствии с руководством АррНей Вюкук!етк. В каждую реакцию добавляли 25 нг РНК вместе с РЕ/реагентами для ОТ-ПЦР АррНей Вюкук!етк ТацМап ЕΖ ВТ-РСВ Соге и вышеупомянутыми праймерами и зондом. Реакции ОТ-ПЦР осуществляли с двумя повторениями в следующем режиме: 50°С, 2 мин, 60°С, 30 мин, 95°С, 5 мин, 40 циклов - 94°С, 20 с и 60°С, 1 мин. Величины уровней экспрессии были сравнимы с величинами стандартной кривой, построенной по известному числу молекул РНК-транскрипта синтезированного мышиного ЕБ-22ВА, и эти уровни экспрессии принимали как абсолютное число молекул мышиного 1Б-22ВА на реакцию. Предварительные данные позволяют предположить, что в дистальном отделе толстой кишки мышей с Ό88индуцированным ВЗК, экспрессия мышиного 1Б-22ВА на 7-й день и на 10-й день может слегка ингибироваться по сравнению с уровнями экспрессии в толстой кишке нормальных мышей.
- 69 009026
Пример 12. ГБ-22 и провоспалительные индикаторы в модели слабой эндотоксемии: у мышей с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемии
A. Мыши с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемии: Оценка уровней провоспалительных цитокинов и температуры тела у мышей с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемии
Был разработан ίη угуо эксперимент для оценки эффекта ГБ-22КА2 (ГБ-22КА2) у мышей с моделью слабой ЛПС-индуцированной эндотоксемии. Для предварительной оценки этой модели, авторами настоящего изобретения были измерены уровни провоспалительных цитокинов и температура тела для сбора эталонных данных для этой модели.
Вкратце, шестимесячным самкам мышей Ва1Ь/с (СКБ) внутрибрюшинно (1.р.) инъецировали 25 мкг ЛПС (81дта) в стерильном РВ8. Через 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 и 72 ч у каждой мыши в группах из 8 мышей брали пробы сыворотки. Пробы сыворотки анализировали на уровни воспалительных цитокинов. Уровни ГБ-1Ь, ГБ-6, ΊΝΕ -α, ГБ-10 и амилоидного белка А (8АА) в сыворотке измеряли с использованием коммерчески доступных наборов для ЕБГ8А, поставляемых фирмой Вюкоигсе 1и!егиа!юиа1 (СатагШо, СА).
Через 1 ч после инъекции ЛПС уровни ΊΝΕα достигали максимально 4000 пг/мл, а уровни ГБ-10 составляли 341 пг/мл. Через 4 ч после инъекции ЛПС ГБ-6, ГБ-1Ь и ГБ-10 составляли 6100, 299 и 229 пг/мл соответственно. Через 4 ч после инъекции ЛПС уровни 8АА в сыворотке составляли 0,405 мг/мл. Концентрации 8АА в сыворотке через 24 ч после введения ЛПС продолжали увеличиваться до 3,9 мг/мл, однако, уровни 8АА в сыворотке, составляющие более чем 1-2 мг/мл, трудно поддаются точному измерению или воспроизведению с использованием существующих наборов для ЕЫ8А, что обусловлено взаимодействиями между 8АА и другими компонентами сыворотки. Эти результаты показали, что в данной модели, помимо ГБ-22 (пример 11В) действительно продуцировались провоспалительные цитокины. Таким образом, в качестве биологических маркеров для модели ЛПС-индуцированной слабой эндотоксемии были установлены следующие критерии: уровни Т№а в сыворотке через 1 ч после введения ЛПС, уровни ГБ-6 в сыворотке через 4 ч после введения ЛПС и уровни 8АА в сыворотке через 4 и 8 ч после введения ЛПС.
Был проведен мониторинг температуры тела у отдельных групп животных с помощью хирургически имплантированных телеметрических устройств в течение 72 ч эксперимента. Через 30 мин после инъекции ЛПС температура тела у мышей снижалась максимально на 2°С от 37,07°С до 34,98°С.
Инъекция 100 мкг гибридного белка ГБ-22КА2-Ес, вводимая за 30 мин до инъекции ЛПС, приводила к значительному снижению, примерно на 50%, уровня индуцирования 8АА через 4 и 8 ч, а инъекция 10 мкг ГБ-22КА2-Ес не давала значимого эффекта. При этом, какого-либо значимого изменения уровней Т№-альфа и ГБ-6 не наблюдалось. Через 1 ч по инъекции ГБ-22КА-Ес наблюдалось снижение количества нейтрофилов в кровотоке. Это указывало на то, что введение ГБ-22КА2-Ес может нейтрализовать активность ГБ-22, направленную на индуцирование 8АА.
B. Детекция активности ГБ-22 в сыворотке мышей с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемией с использованием ВаЕ3/СКЕ2-4/ГБ-22КА-клеток в анализе на пролиферацию с окрашиванием аламаровым синим
Описанные здесь клетки ВаЕ3/СКЕ2-4/ГБ-22КА два раза центрифугировали и промывали в РВ8 для гарантии удаления шГБ-3, а затем центрифугировали третий раз и ресуспендировали в полной среде (КРМГ 1640, 10% ЕВ8, 1% С^аМАХ, 1% пирувата натрия), но без шГБ-3 (далее называемой средой без шГБ-3). Затем клетки подсчитывали в гемоцитометре. Клетки культивировали в 96-луночном планшете при плотности 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием среды без шГБ-3.
Сыворотку мышей с ЛПС-индуцированной эндотоксемией, полученную в эксперименте, описанном выше в примере 11 А, разводили до 2% в среде без шГБ-3 в лунках верхнего ряда планшета, а затем серийно разводили 1:2 в лунках нижнего ряда, а каждая лунка в остальных 7 рядах 96-луночного планшета имела объем 100 мкл. Затем это разведение добавляли к 100 мкл клеток до конечных сывороточных концентраций 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, 0,031, 0,016 и 0,018% в полном аналитическом объеме 200 мкл. Затем аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 4 дней, и добавляли аламаровый синий (Асситеб, СНюадо, ГБ) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 16 ч. Аламаровый синий позволяет проводить флуориметрическое считывание исходя из числа живых клеток, и, таким образом, он служит средством для непосредственного измерения уровня пролиферации клеток по сравнению с негативным контролем. Планшеты считывали на счетчике \Уа11ас Ую!ог 2 1420 Ми1Г11аЬе1 Соии!ег (^а11ас, Тигки, Ешк-тб), работающем на длине волны 530 (возбуждение) и 590 (излучение).
Данные, полученные через 0, 1, 8 и 16 ч, не показали какой-либо пролиферации, значительно превышающей фоновый уровень. Через 4 ч пробы сыворотки показали, что уровень пролиферации был в 410 раз выше фонового уровня и т.д., что указывало на присутствие ГБ-22 в этих пробах.
C. Мыши с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемии: Эксперимент для анализа эффектов ГБ22КА2
Была оценена возможность путем ГБ-22КА2-обработки влиять на провоспалительные индикаторы, индуцированные 1.р. введением мышам одной дозы 25 мкг ЛПС. Все пробы анализировали на уровни 8АА, ГБ-22 и нейтрофилов в кровотоке. Субсерии от каждой группы анализировали на конкретные уров
- 70 009026 ни цитокинов (1-часовые пробы скринировали на ТШ-'-альфа, а 4-часовые пробы анализировали на Ш-6). Животных умерщвляли в указанное время, как показано ниже в табл. 8, и цельную кровь и сыворотку собирали и разделяли на аликвоты для анализа.
самкам мышей С57В^/6N ^ΒΕ) вводили ΐ.ρ. одну дозу I^-22ΒΑ2, как указано ниже в табл. 8. В качестве контроля использовали мышей С57В^/6N ^ΒΕ).
Через 30 мин мышам вводили ΐ.ρ. еще одну инъекцию 25 мкг ЛПС (81§та) в 100 мкл, для инициации каскада реакций эндотоксинов, вызывающих эндотоксемию. Мышей каждой группы умерщвляли в определенное время, как указано в табл. 8, и брали 50 мкл цельной крови для измерения общего числа нейтрофилов в кровотоке, а остальную часть крови центрифугировали для отделения сыворотки, и разделяли на аликвоты для проведения различных описанных здесь анализов.
Таблица 8
Групп а № Обработка ЛПС Время умерщвления Образцы
А 8 100 мкг 1Ъ-22КА2, ΐ.ρ. 25 мкг, ΐ.ρ., через 30 минут после обработки 1 час Аликвоты сыворотки крови для СВС
В 8 10 мкг 1Ь-22ВА2, ΐ.ρ. 25 мкг, ΐ.ρ., через 30 минут после обработки 1 час Аликвоты сыворотки крови для СВС
С 8 200 мкг РВ5, ΐ.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 1 час Аликвоты сыворотки крови для СВС
ϋ 8 100 мкг 1Й-22КА2, ΐ.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 4 часа Аликвоты сыворотки крови для СВС
Е 8 10 мкг 1Ь-22КА2, ΐ.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 4 часа Аликвоты сыворотки крови для СВС
Е 8 200 мкг РВ5, ΐ.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 4 часа Аликвоты сыворотки крови для СЗС
С 8 100 мкг 1Ь-22НА2, ΐ.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 8 часов Аликвоты сыворотки крови для СВС
Н 8 10 мкг 1Ь-22КА2, ί.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 8 часов Аликвоты сыворотки крови для СВС
Л 8 200 мкг РВ5, ί.ρ. 25 мкг, ί.ρ., через 30 минут после обработки 8 часов Аликвоты сыворотки крови для СВС
К 5 контроль отсутствует Перед введением ЛПС Аликвоты сыворотки крови для СВС
- 71 009026
Ό. ГЬ-22КА2-Рс4 нейтрализует индуцирование 8АА т ν;ί\·Ό: анализ ЕЬГ8А на 8АА показал, что экспрессия 8АА, индуцированная ЛПС у мышей с моделью ЛПС-индуцированной эндотоксемии, ингибируется путем инъекции ГЬ-22КА2-Рс4
Для оценки способности ГБ-22КА2 ингибировать индуцирование 8АА у мышей с моделью ЛПСиндуцированной эндотоксемии, мышам инъецировали ГБ-22КА2 за 30 мин до инъекции ЛПС, как показано выше в табл. 8 и как описано в примере 11С.
Для определения уровней 8АА в 4-часовых и 8-часовых пробах проводили ЕЬГ8А с использованием набора для иммуноанализа мышиного 8АА (Вю8оигсе Гп!ета!юпа1, СаЬГогта) в соответствии с инструкциями производителей. Через 4 ч у мышей, обработанных 100 мкг или 10 мкг ГБ-22КА2, было обнаружено дозозависимое статистически значимое снижение уровней 8АА по сравнению с мышами, которым был введен РВ8. Через 8 ч у мышей, обработанных 100 мкг ГБ-22КА2, наблюдалось постоянное статистически значимое снижение уровней 8АА по сравнению с мышами, которым был введен РВ8. Это указывает на то, что ГБ-22КА2 обладает способностью ингибировать ЛПС-индуцирование 8АА 1п νί\·Ό.
Пример 13. Гп νί\·Ό влияние полипептида ГЬ-22 на кожу
А. ГЬ-22-индуцированный акантоз
Мышей (8-недельных самок, С3Н/НЕ1, Дасккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) разделяли на четыре группы, из них три группы имели шесть животных и одна группа - четыре животных. Затем вводили человеческий ВНК-продуцированный ГЬ-22 путем непрерывного вливания через мини-осмотические насосы, что приводило к установлению локальных и устойчивых концентраций ГЬ-22 в сыворотке, пропорциональных концентрации ГЬ-22, содержащегося в насосе. В мини-осмотические насосы Аке! (модель 2002; Ака СогрогаНоп Ра1о АИо, СА) в стерильных условиях загружали белок ГЬ-22 (А601Р, 0,22 мл), разведенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,0) до концентрации в насосе 2 мг/мл для мышей группы 1, 0,2 мг/мл для мышей группы 2, 0,02 мг/мл для мышей группы 3 или 0 мг/мл (только разбавитель) для мышей группы 4. Насосы подкожно имплантировали мышам через 1 см-разрез в дорсальном участке кожи, и кожу закрывали стерильными повязками на рану. Эти насосы были сконструированы так, чтобы их содержимое доставлялось со скоростью 0,5 мкл/ч в течение 14 дней. При использовании такой номинальной скорости вливания, вычисленные дозы составляли 24 мкг/день, 2,4 мкг/день, 0,24 мкг/день и 0 мкг/день для групп 1-4 соответственно.
По окончании 14-дневного периода мышей подвергали эвтаназии и от каждой мыши брали образец кожи приблизительно 1 см2, окружающей участок введения насоса. Затем кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Фиксированные в формалине образцы кожи заливали в парафин, обрабатывали рутинным способом, рассекали на 5 мкм-срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани были оценены под микроскопом слепым методом ветеринаром-патологом, имеющим разрешение Регуляторных органов (АСУР). Были зарегистрированы гистологические изменения, а тяжесть акантоза (т.е. утолщение эпидермиса) оценивали субъективно по следующей балльной системе: 0=нормальная кожа, 1=минимальный акантоз, 2=слабый акантоз, 3=умеренный акантоз и 4=тяжелый акантоз. Кроме того, кожу мышей выбранных групп визуализировали с помощью цифровой камеры Соо18пар (Корег 8с1еп11йс, Гпс., 8ап Ь1едо, СА), а толщину эпидермиса измеряли с помощью компьютерной программы для гистоморфометрического анализа (8сюп Гтаде Гог Атс1о\у, ν.4.0.2, 8сюп Согр., Ргебепск, МЬ).
Введение ГЬ-22 в концентрации 2,4 и 24 мкг/день приводило к утолщению эпидермиса, на что указывала средняя оценка акантоза (см. выше), которая была заметно выше, чем оценка толщины эпидермиса для кожи контрольной группы. Кроме того, у ГЬ-22-обработанных животных также наблюдалась инфильтрация мононуклеарных клеток в эпидермис. Такие инфильтраты не наблюдались у контрольных животных, обработанных носителем.
Оценка толщины эпидермиса по акантозу и измерение толщины кожи (в общих единицах, пикселах) для групп, указанных ниже в табл. 9, дала следующие результаты.
Таблица 9
Группа п= Введение насосом Средняя оценка акантоза Измеренная толщина
1 6 24 мкг 1Ь-22/день 3,0 не измеряли
2 6 2,4 мкг 1Ь-22/день 2,4 67,5
3 6 0,24 мкг 1Ъ- 22/день 2,2 не измеряли
4 4 Вливание РВЗ 1,8 45, 6
В. Влияние ГБ-22КА2 на ГЬ-22-индуцированный акантоз
Мышей (8-недельных самок, С3Н/НЕ1, 1асккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) разделяли на восемь групп по восемь животных в каждой. ГЬ-22 вводили путем непрерывного вливания через мини-осмотические насосы, как описано в примере 12 А. В мини-осмотические насосы Аке! (модель 2002; Ака СогрогаНоп Ра1о АИо, СА) в стерильных условиях загружали белок ГЬ-22 (А#601Р, 0,22 мл), разведенный в забуференном
- 72 009026 фосфатом физиологическом растворе (рН 7,0) до концентрации в насосе 0,22 мг/мл для мышей групп 1-2, 0,45 мг/мл для мышей групп 3-4, 0,9 мг/мл для мышей групп 5-6 или 0 мг/мл (только разбавитель) для мышей групп 7-8. Эти насосы были сконструированы так, чтобы их содержимое доставлялось со скоростью 0,5 мкл/ч в течение 14 дней. При использовании такой номинальной скорости вливания, вычисленные дозы составляли 10 мкг/день для групп 1-2, 5 мкг/день для групп 3-4, 2,5 мкг/день для групп 5-6 и 0 мкг/день для групп 7-8. Из всех пар групп, которым вводили указанную дозу П.-22, одной группе внутрибрюшинно три раза вводили инъекцию (в дни 1, 3 и 5) 0,1 мг человеческого белка ^-22^2^ (как описано в настоящем изобретении). Другой группе аналогичным образом вводили носитель (РВ8).
На 8-й день исследования мышей подвергали эвтаназии и от каждой мыши брали образец кожи приблизительно 1 см2, окружающей участок введения насоса. Затем кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Фиксированные в формалине образцы кожи заливали в парафин, обрабатывали рутинным способом, рассекали на 5 мкм-срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани были оценены под микроскопом слепым методом ветеринаром-патологом, имеющим разрешение Регуляторных органов (АСУР). Способ проведения этого исследования отличался от способа, описанного в предыдущем примере. Сначала определяли число слоев в эпидермисе, от базального слоя до зернистого слоя. Исходя из полученных результатов, срезы оценивали по следующей балльной системе: 0=нормальная кожа (2-3 слоя), 1=слабое утолщение (3-4 слоя), 2=умеренное утолщение (4-6 слоев) и 3=значительное утолщение (>6 слоев).
Введение ΣΕ-22 в концентрации 2,5, 5 и 10 мкг/день приводило к утолщению эпидермиса (см. табл. 10). Кроме того, у ΣΕ-22-обработанных животных также наблюдалась инфильтрация мононуклеарных клеток в эпидермис. Такие инфильтраты не наблюдались у контрольных животных, обработанных носителем. Одновременное введение 100 мкг П.-221КА2 (3 инъекции) приводило к снижению толщины эпидермиса у мышей, обработанных 5 мкг П,-22 деть.
Оценка толщины эпидермиса по акантозу для групп, указанных ниже в табл. 10, дала следующие результаты.
Таблица 10
Группа # п= Введение насосом Инъекция Средняя степень акантоза
1 8 2,5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл носителя (3 инъекции) 1,1
2 8 2,5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл 1Ь-22КА2 (3 инъекции) 0,8
3 8 5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл носителя (3 инъекции) 2,0
4 8 5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл Ш-22КА2 (3 инъекции) 0,6
5 8 10 мкг Ιί-22/день 100 мкл носителя (3 инъекции) 2,0
6 8 10 мкг 1Ь-22/день 100 мкл Ш-22КА2 (3 инъекции) 1,9
7 8 носитель 100 мкл носителя (3 инъекции) 0,0
8 8 носитель 100 мкл Ш-22ВА2 (3 инъекции) 0,0
Утолщение эпидермиса и инфильтраты иммунных клеток также наблюдались на коже человека, страдающего псориазом. Фенотип кожи, наблюдаемый после подкожной инъекции П.-22, кроме того, указывал на возможную роль ΣΕ-22 в патогенезе псориаза. Тот факт, что ^-22^2^ может нейтрализовать П,-22-индуцировс111ный фенотип кожи, дает основание предположить о возможности использования других антагонистов П.-22, таких как нейтрализующее антитело против П.-22 или растворимый рецептор, для лечения псориаза и других ΣΕ-22-индуцированных воспалительных заболеваний.
С. Влияние растворимых рецепторов Ш^КА и анти-П.-221К.А антител на ΣΕ-22-индуцированный или ΖΕ-20-индуцированный акантоз
Активность растворимых рецепторов или анти-П .-221К.А антитела, направленная на ингибирование т у1уо активности П.-22 и П.-20, была оценена аналогичным образом с использованием ко
- 73 009026 нечных результатов гистологического анализа акантоза, вызываемого путем подкожного введения белка Ш-22 или Ш-20. В этом примере, указанным мышиным моделям С3Н/НЕ1 подкожно имплантировали мини-осмотические насосы, как описано выше в примерах 12(А) и 12(В). Во время введения Ш-22 или Ш-20 мышам инъецировали очищенное моноклональное антитело против Ш-22 или, аналогичным образом, носитель в качестве контроля. По окончании введения Ш-22 из участка имплантации насосов брали образцы кожи для гистологического анализа. Подобно растворимому рецептору Ш-22КА, антагонисту Ш-22, антагонисту Ш-22 или Ш-20, растворимые рецепторы Ш-22КА или анти-Ш-22КА антитела настоящего изобретения, как и предполагалось, способствуют снижению толщины эпидермиса и уровня инфильтрации иммунных клеток, вызываемых Ш-22 и Ш-20, а поэтому они могут быть использованы в качестве антагонистов Ш-22 для терапевтического лечения псориаза или другого Ш-22 или Ш-20индуцированного воспалительного заболевания.
Пример 14. Ш-22 стимулируется в образцах кожи человека, пораженной псориазом
Образцы РНК
Были получены образцы нормальной кожи, а также кожи, взятой от пациентов с псориазом. В последнем случае, брали кожу из участка, пораженного стабильным бляшковым псориазом, и из соседнего участка непораженной кожи. РНК выделяли из образцов человеческой кожи стандартными методами. Целостность и качество РНК-образцов тестировали на биоанализаторе Адйеп! 2100 ВюАпа1у/ег (АдПеп! ТесЬпо1од1ек, №а1бЬгопп Сегтапу).
Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР
Проведение количественной ОТ-ПЦР в оперативном режиме с использованием системы детекции последовательности АШ РШ8М 7700 (РЕ АррБеб Вюкук!етк, Шс., Рок!ег Сйу, СА) было описано ранее (см. Не1б С.А. е! а1., Сепоте Кекеагсб 6:986-994, 1996; С1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте Кекеагсб, 6:995-1001, 1996; 8ипбагекап 8. е! а1., Епбосгто1оду 139:4756-4764, 1998). Этот метод предусматривает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерный краситель и гаситель флуоресценции. Если зонд является интактным, то излучение репортерного красителя нейтрализуется, что обусловлено непосредственной близостью гасителя флуоресценции. В процессе ПЦР-удлинения с использованием дополнительных геноспецифических прямых и обратных праймеров, зонд расщепляется под действием 5'-3'нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ1Ь, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентного излучения.
Праймеры и зонды, используемые для проведения количественных ОТ-ПЦР-анализов на экспрессию Ш-22 в оперативном режиме, конструировали с помощью компьютерной программы для моделирования праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ АррБеб Вюкук!етк, Рок!ег Сйу, СА). Для элиминации амплификации геномной ДНК были сконструированы праймеры для человеческого Ш-22, охватывающие стык интрон-экзон. Прямой праймер, 2С42459 (8Еф ΙΌ N0:22) и обратный праймер 2С42458 (8Еф ΙΌ N0:23) использовали в ПЦР-реакции (ниже) при концентрации 800 нМ, в результате чего был синтезирован 72 п.н.-продукт. Соответствующий зонд Ш-22, ΖΟ42460 (8Еф ΙΌ N0:24) синтезировали и метили в лаборатории 2утоСепеБс. Ш-22-зонд метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6карбоксифлуоресцеином) (РАМ) (РЕ АррБеб Вюкук!етк), а по 3'-концу - гасителем флуоресценции (6карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ АррБеб Вюкук!етк).
С. Количественная ОТ-ПЦР в оперативном режиме
Относительные уровни мРНК Ш-22 определяли посредством анализа образцов полноразмерной РНК с использованием набора реагентов Тас.|Мап ΕΖ КТ-РСК Соге (РЕ, АррБеб Вюкук!етк). Отобранный Ш-22-транскрипт получали для построения стандартной кривой, используемой для количественной оценки. Кривую строили исходя из 10-кратных разведения в пределах примерно от 108 до 103 всех копий полноразмерного транскрипта для Ш-22, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали с тройной повторностью. Образцы полноразмерной РНК кожи также анализировали с тремя повторностями на уровни человеческого транскрипта Ш-22 и на уровни ЬСИ8, используемого в качестве эндогенного контроля. В полном объеме 25 мкл, каждый РНК-образец подвергали реакции ОТ-ПЦР ТацМап ΕΖ (РЕ АррБеб Вюкук!етк), содержащей приблизительно 25 нг полноразмерной РНК в ОЕРС-обработанной воде (не содержащей ДНКазы/РНКазы); соответствующие праймеры (приблизительно 800 нм ΖС42459 (8Еф ΙΌ N0:22) и ΖС42458 (8Еф ΙΌ N0:23)); соответствующий зонд (приблизительно 100 нм ΖС42460 (8Еф ΙΌ N0:24)); 1хбуфер ТацМап ΕΖ; 3 мМ ацетат марганца, 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР и б-СТР, и 600 мкМ б-ИТР; ДНК-полимеразу гТ!б (0,1 Ед/мкл) и АтрЕгаке υNС (0,01 Ед/мкл). Термоциклы ПЦР проводили в следующем режиме: начальная стадия обработки ЦИС - один цикл при 50°С, 2 мин, стадия обратной транскрипции (ОТ) - один цикл при 60°С, 30 мин, стадия дезактивации ЦНС - один цикл при 95°С, 5 мин, и 40 циклов амплификации при 94°С, 20 с и 60°С, 1 мин.
Относительные уровни РНК Ш-22 определяли с использованием стандартной кривой в соответствии с инструкциями производителей, РЕ Вюкук!етк (Икег ВцБеБп #2: АШ Рпкт 7700 8ес.|иепсе Пе!ес!юп 8ук!етк, Ке1а!1уе фиапШаБоп оГ Сепе Ехргеккюп, ЭесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровней Ш-22 проводили измерение уровней ЬСИ8. Данные приводятся ниже в табл. 11.
- 74 009026
Таблица 11
Образец кожи 1Ь-22
Нормальная 0
Непораженная 0
Пораженная 1149
мРНК ΙΕ-22 не детектировалась в образцах кожи здоровых индивидуумов или в образцах кожи, взятых из непораженных участков. В противоположность этому, в пораженной коже пациентов с псориазом наблюдалась резкая активация транскриптов Ш-22. Эти данные подтверждают тот факт, что тяжелое заболевание, такое как псориаз человека, ассоциируется с Ш-22.
Сверхэкспрессия Ш-22 была обнаружена в области поражения псориазом человека, что позволяет предположить, что Ш-22 участвует в патогенезе псориаза человека. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, сверхэкспрессия Ш-22 у трансгенных мышей приводит к утолщению эпидермиса, а присутствие в нем иммунных клеток является показателем псориазного фенотипа, и кроме того, инъекция Ш-22 нормальным мышам приводила к утолщению эпидермиса и к притоку иммунных клеток, что является показателем псориазного фенотипа, который был устранен под действием антагониста растворимого рецептора Ш-22КА2. Эти т у1уо данные, кроме того, позволяют предположить, что провоспалительный Ш-22 участвует в патогенезе псориаза. Сами антагонисты активности Ш-22, такие как моноклональные антитела против человеческого Ш-22 настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы и антитела против таких рецепторов, могут быть использованы в качестве антагонистов Ш-22 для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, а в частности, для лечения псориаза. Кроме того, антагонисты активности Ш-22, такие как моноклональные антитела против человеческого Ш-22 настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы и антитела против этих рецепторов, могут быть использованы в качестве антагонистов Ш-22 для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, для лечения атопического дерматита, ВЗК, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (РЗВ), септического шока, недостаточности множества органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Пример 15. Ш-22 стимулируется в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом
Были получены образцы нормальной кожи (п=4), а также кожи, взятой от пациентов с атопическим дерматитом. РНК выделяли из образцов человеческой кожи стандартными методами. Целостность и качество РНК-образцов тестировали на биоанализаторе Ад11еп! 2100 ВюАпа1у/ег (АдПеп! ТесЬпо1од1ек, ^аШЬгопп Сегтапу).
Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР
Проведение количественной ОТ-ПЦР в оперативном режиме с использованием системы детекции последовательности АВI РКШМ 7700 (РЕ АррПеб Вюкук!етк, Шс., Еок!ег СЕу, СА) было описано ранее (см. Не1б С.А. е! а1., Сепоте КекеагсЬ 6:986-994, 1996; С1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте КекеагсЬ, 6:995-1001, 1996; 8ипбагекап 8. е! а1., Епс1осппо1оду 139:4756-4764, 1998). Этот метод предусматривает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерный краситель и гаситель флуоресценции. Если зонд является интактным, то излучение репортерного красителя нейтрализуется, что обусловлено непосредственной близостью гасителя флуоресценции. В процессе ПЦР-удлинения с использованием дополнительных геноспецифических прямых и обратных праймеров, зонд расщепляется под действием 5'-3'нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ!Ь, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентного излучения.
Праймеры и зонды, используемые для проведения количественных ОТ-ПЦР-анализов на экспрессию Ш-22 в оперативном режиме, конструировали с помощью компьютерной программы для моделирования праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ АррПеб Вюкук!етк, Еок!ег СЕу, СА). Для элиминации амплификации геномной ДНК были сконструированы праймеры для человеческого Ш-22, охватывающие стык интрон-экзон. Прямой праймер, 2С42459 (8ЕР ΙΌ N0:22) и обратный праймер 2С42458 (8ЕР ΙΌ N0:23) использовали в ПЦР-реакции (ниже) при концентрации 800 нМ, в результате чего было синтезировано 72 п.н.-продукта. Соответствующий зонд Ш-22, 2С42460 (8ЕР ΙΌ N0:24) синтезировали и метили в лаборатории /утобе'пе'Рс. Ш-22-зонд метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6карбоксифлуоресцеином) (ЕАМ) (РЕ АррПеб Вюкук!етк), а по 3'-концу - гасителем флуоресценции (6карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ АррПеб Вюкук!етк).
С. Количественная ОТ-ПЦР в оперативном режиме
Относительные уровни мРНК Ш-22 определяли посредством анализа образцов полноразмерной РНК с использованием набора реагентов ТацМап Е/ КТ-РСК Соге (РЕ, АррПеб Вюкук!етк). Отобранный Ш-22-транскрипт получали для построения стандартной кривой, используемой для количественной оценки. Кривую строили исходя из 10-кратных разведения в пределах примерно от 108 до 103 всех копий полноразмерного транскрипта для Ш-22, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали с
- 75 009026 тройной повторностью. Образцы полноразмерной РНК кожи также анализировали с тремя повторностями на уровни человеческого транскрипта ^-22 и на уровни НСи8, используемого в качестве эндогенного контроля. В полном объеме 25 мкл, каждый РНК-образец подвергали реакции ОТ-ПЦР ТацМап ΕΖ (РЕ Аррйей В1окук!етк), содержащей приблизительно 25 нг полноразмерной РНК в ОЕРС-обработанной воде (не содержащей ДНКазы/РНКазы); соответствующие праймеры (приблизительно 800 нм ΖС42459 (8ЕЦ ГО N0:22) и ΖС42458 (8ЕЦ ГО N0:23)); соответствующий зонд (приблизительно 100 нм ΖС42460 (8ЕЦ ГО N0:24)); 1хбуфер ТацМап ΞΖ; 3 мМ ацетат марганца, 300 мкМ каждого из й-СТР, й-АТР и й-СТР, и 600 мкМ й-ИТР; ДНК-полимеразу гТ(Н (0,1 Ед/мкл) и АтрЕгаке υNС (0,01 Ед/мкл). Термоциклы ПЦР проводили в следующем режиме: начальная стадия обработки υNС - один цикл при 50°С, 2 мин, стадия обратной транскрипции (ОТ) - один цикл при 60°С, 30 мин, стадия дезактивации υNС - один цикл при 95°С, 5 мин, и 40 циклов амплификации при 94°С, 20 с и 60°С, 1 мин.
Относительные уровни РНК ГО-22 определяли с использованием стандартной кривой в соответствии с инструкциями производителей, РЕ Вюкук!етк (Икег Ви11ейп #2: АШ Рпкт 7700 8ес.|иепсе Ое!ес!юп 8ук!етк, Ке1а!гуе ОнапШаРоп оГ Сепе Ехргеккюп, ЭесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровней ГО-22 проводили измерение уровней НСи8.
мРНК ГО-22 не детектировалась в образцах кожи здоровых индивидуумов. В противоположность этому, в 3-х из 4-х образцов кожи пациентов с атопическим дерматитом (примерно 4 00-2300 копий) наблюдалась резкая активация транскриптов ГО-22. Эти данные подтверждают тот факт, что тяжелое заболевание, такое как человеческий атопический дерматит, ассоциируется с ГО-22.
Сверхэкспрессия ГО-22 была обнаружена на коже человека с атопическим дерматитом, что позволяет предположить, что ГО-22 участвует в патогенезе человеческого атопического дерматита. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, сверхэкспрессия ГО-22 у трансгенных мышей приводит к утолщению эпидермиса, а присутствие в нем иммунных клеток является показателем фенотипа атопического дерматита, и кроме того, инъекция ГО-22 нормальным мышам приводила к утолщению эпидермиса и к притоку иммунных клеток, что является показателем фенотипа атопического дерматита, который был устранен под действием антагониста растворимого рецептора ГО-22КА2. Эти ш νί\Ό данные, кроме того, позволяют предположить, что провоспалительный ГО-22 участвует в патогенезе атопического дерматита. Сами антагонисты активности ГО-22, такие как моноклональные антитела против человеческого ГО-22 настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы и антитела против таких рецепторов, могут быть использованы в качестве антагонистов ГО-22 для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, а в частности, для лечения атопического дерматита. Кроме того, антагонисты активности ГО-22, такие как моноклональные антитела против человеческого ГО-22 настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы и антитела против этих рецепторов, могут быть использованы в качестве антагонистов ГО-22 для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, для лечения атопического дерматита, ВЗК, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (РЗВ), септического шока, недостаточности множества органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, атопического дерматита, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Пример 16. Поликлональные антитела против человеческого ГО-22
Поликлональные антитела против ГО-22 получали путем иммунизации 2 самок новозеландских белых кроликов очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом человеческого ГО-22 (аминокислотные остатки 22 (А1а) - 167 (Не) (8ЕЦ ГО N0:6)), выделенным из клеток ВНК (ГО-22-ВНК). Каждому кролику сначала внутрибрюшинно (1.р.) инъецировали 200 мкг очищенного белка в полном адъюванте Фрейнда, а затем через каждые три недели 1.р. вводили бустер-инъекции 100 мкг пептида в неполном адъюванте Фрейнда. Через 7-10 дней после введения второй бустер-инъекции (всего 3 инъекции) у животных брали кровь и собирали сыворотку. Затем животным вводили бустер-инъекцию и через каждые три недели брали кровь.
Поликлональные антитела против человеческого ГО-22 подвергали аффинной очистке от иммунной сыворотки кролика с использованием колонки с белком 4В, конъюгированным с С'^Вг-Сефарозой (РНагшааа ЬКВ), которая была приготовлена с использованием 10 мг специфического антигена, а именно, очищенного рекомбинантного белка человеческих ГО-22-ВНК на один грамм С^Вг-сефарозьг с последующим проведением 20 х диализа в РВ8 в течение ночи. Антитела против человеческого ГО-22 характеризовали с помощью ЕЬКА с использованием 500 нг/мл очищенного рекомбинантного белка человеческих ГО-22-ВНК в качестве мишени для антитела. Нижний предел детекции (ЬЬП) аффинно очищенного кроличьего антитела против человеческого ГО-22 составляет 280 пг/мл по отношению к специфически очищенному рекомбинантному антигену, человеческому ГО-22-ВНК.
Кроме того, поликлональные антитела против человеческого ГО-22 оценивали на их способность блокировать клеточно-пролиферативную активность (анализ на нейтрализацию) очищенного рекомбинантного человеческого ГО-22-ВНК, направленную на клетки ВаР3/СКР2-4/I^-22КΆ (пример 2 и пример 3). 50-кратный молярный избыток поликлональных антител против человеческого ГО-22 оказался доста
- 76 009026 точным для ингибирования пролиферации клеток.
Пример 17. Моноклональные антитела против человеческого ΙΕ-22
Моноклональные антитела получали путем иммунизации 4 самок крыс Зргадие-ЭаМеу (СНаг1ек КШег БаЬога!ог1ек, ’№11тшд!оп, МА) очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом человеческого Ш-22 (аминокислотные остатки 22 (А1а) - 167 (Не) (ЗЕЦ ΙΌ N0:6)), выделенным из клеток ВНК (ΙΕ-22БНК). Каждой крысе сначала внутрибрюшинно (1.р.) инъецировали 100 мкг очищенного человеческого рекомбинантного белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, КоскТогб, Ш·), а затем через каждые две недели 1.р. вводили бустер-инъекции 50 мкг человеческого рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда. Через 7-10 дней после введения третьей бустер-инъекции у животных брали кровь и собирали сыворотку.
Образцы сыворотки крыс, содержащей антитела против человеческого ΙΕ-22, характеризовали посредством ЕЫЗА с использованием 500 нг/мл биотинилированного человеческого ΙΕ-22-ВНК и 500 нг/мл биотинилированного мышиного Ш-22, биотинилированного тиШ-22 Е.со11 (К+Ό Зук!етк, М1ппеаро11к, М^) в качестве мишеней для антител. Три пробы крысиной сыворотки титровали на специфическое антитело, направленное на биотинилированные человеческие Ш-22-БНК при разведении 1:105 и на специфическое антитело, направленное на биотинилированные человеческие тиШ-22 Е.со11 при разведении 1:104.
Спленоциты и клетки лимфоузлов брали у 2 крыс с высокими титрами и подвергали слиянию с миеломными клетками ЗР2/0 (мышиными) с использованием ПЭГ 1500 путем проведения двух отдельных процедур слияния (отношение спленоцитов к миеломным клеткам на одно слияние=4:1, Ап!1Ьоб1ек А БаЬога!огу Мапиа1, Е. Наг1о\\' апб ИШапе, Со1б Зрппд НагЬог Ргекк). Через 10 дней культивирования после начала слияния, гибридомные пулы, продуцирующие специфическое антитело, идентифицировали с помощью ЕЕША, с использованием биотинилированного рекомбинантного человеческого белка Ш-22БНК и биотинилированного рекомбинантного белка тиШ-22-Е.соН в качестве отдельных мишеней для антитела. Позитивные гибридомные пулы в обоих протоколах ЕБ-ША дополнительно анализировали на их способность блокировать или снижать клеточно-пролиферативную активность очищенных рекомбинантных тиШ-22-Е.соН (анализ на нейтрализацию), направленную на клетки ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22КА (пример 2 и пример 3).
Гибридомные пулы, которые давали положительные результаты только в анализе БЕША или в анализах БЕША и в анализах на нейтрализацию, клонировали по крайней мере два раза путем лимитирующего разведения.
Моноклональные антитела, выделенные из среды для культивирования тканей, были охарактеризованы в ЕБКА на возможность их использования для количественного определения уровней рекомбинантного и природного человеческого Ш-22 в образцах сыворотки мыши и человека. Два выбранных антитела позволяли проводить количественный анализ на уровень рекомбинантных НиШ-22-Е.со11 в 100% человеческой сыворотке с нижним пределом детекции приблизительно 1 нг/мл.
Моноклональные антитела, выделенные из среды для культивирования тканей, были охарактеризованы на их способность блокировать или снижать (анализ на нейтрализацию) клеточнопролиферативную активность очищенных рекомбинантных НиШ-22-Е.со11 или тцШ-22-Е.со11, направленную на клетки ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22КА (пример 2 и пример 3). В этом анализе было идентифицировано шесть нейтрализующих моноклональных антител. Гибридомы, экспрессирующие нейтрализующие моноклональные антитела против человеческого Ш-22, описанные выше, были депонированы в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур тканей (АТСС; Мапаккак УА) в качестве исходных депозитов в рамках Будапештского договора и этим депозитам были присвоены следующие регистрационные номера: АТСС, регистрационные №: клон 266.16.1.4.4.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-5035); клон 266.5.1.2.2.3 (АТСС номер патентного депозита РТА-5032); клон 267.17.1.1.4.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-5038); клон 267.4.1.1.4.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-5037); клон 266.12.6.1.3.2.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-5034); клон 266.19.1.10.5.2 (АТСС номер патентного депозита РТА-5036); и клон 267.9.1.1.4.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-5353).
Пример 18. Моноклональные антитела против человеческого Ш-22КА
Моноклональные антитела получали путем иммунизации 4 крыс Бе^1к (Коск1апб IттиηοсНет^са1к, С11Ьег£^Ше, РА) гидролизованным и очищенным рекомбинантным гибридным белком тцШ-22КА-Ес (ЗЕЦ ΙΌ N0:4). Каждой крысе сначала внутрибрюшинно (1.р.) инъецировали 100 мкг очищенного человеческого рекомбинантного гибридного белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, КоскТогб, Ш), а затем через каждые две недели в течение четырех недель 1.р. вводили бустер-инъекции 50 мкг очищенного рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда. Адъювант вводили через каждые две недели в течение четырех недель. По истечении первых четырех недель иммунизации, через каждые две недели в течение четырех недель 1.р. вводили бустер-инъекции 50 мкг гидролизованного очищенного рекомбинантного белка, связанного с белком-носителем, гемоцианином лимфы улитки (КЕН, Р1егсе, КоскТогб, Ш) в неполном адъюванте Фрейнда. Через 7-10 дней после введения четвертой бустер-инъекции, у животных брали кровь и собирали сыворотку.
- 77 009026
Образцы сыворотки крыс, содержащей антитела против тиШ^КА, характеризовали посредством Е1Л8А с использованием 500 нг/мл специфического очищенного рекомбинантного гибридного белка тиШ^КА-Ес в качестве мишени для специфического антитела и неродственного гибридного белка в качестве мишени для неспецифического антитела.
Спленоциты брали у одной крысы с высоким титром и подвергали слиянию с миеломными клетками 8Р2/0 (мышиными) в соответствии с оптимизированным протоколом ПЭГ-опосредованного слияния (Коск1аиб йптиносйепчсаЕ). Через 12 дней культивирования после начала слияния, гибридомные пулы, продуцирующие специфическое антитело, идентифицировали посредством ЕЫ8А с использованием 500 нг/мл каждого из очищенных рекомбинантных гибридных белков тиI^-22ВΑ-Ес-Βν в качестве специфического нацеливающего антитела и неродственного гибридного белка в качестве неспецифического нацеливающего антитела. Гибридомные пулы, позитивные лишь в отношении специфических нацеливающих антител, дополнительно анализировали на их способность блокировать или снижать (анализ на нейтрализацию) клеточно-пролиферативную активность очищенных рекомбинантных тиЕЕ-22-Е.со11, направленную на клетки ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВΑ (пример 2 и пример 3), и в ЕАС8-анализе, на их способность связываться с клетками ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВΑ (пример 2 и пример 3) в качестве нацеливающего антитела.
Гибридомные пулы, которые давали положительные результаты только в анализе ЕЫ8А или в анализах ЕЫ8А и анализах на нейтрализацию, клонировали по крайней мере два раза путем лимитирующего разведения.
Моноклональные антитела, выделенные из среды для культивирования тканей, были охарактеризованы на их способность блокировать или снижать пролиферацию клеток ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22ВΑ (пример 2 и пример 3), культивированных в присутствии очищенных рекомбинантных белков тиI^-22ВΑ-Ес или йиЕЕ-22-ВНК. При этом, было идентифицировано четырнадцать нейтрализующих антител и девять моноклональных антител были клонированы.
Гибридомы, экспрессирующие нейтрализующие моноклональные антитела против мышиного ЬБ22КА, описанные выше, были депонированы в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур тканей (АТСС; Маиаззаз УА) в качестве исходных депозитов в рамках Будапештского договора и этим депозитам были присвоены следующие регистрационные номера: АТСС, регистрационные №: клон К2.1.1С11.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6035); клон К2.1.5Е4.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6024); клон К2.1.5Н8.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6025); клон К2.1.12С7.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6036); клон К2.1.13С8.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6040); клон К2.1.15Е2.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6038); клон К2.1.16С11.1 (АТСС номер патентного депозита РТА-6039); и клон К2.1.18С8.2 (АТСС номер патентного депозита РТА-6111).
Пример 19. Связывающая активность двух крысиных МаЬ против М8-ЕБ-22КА
Козьи антитела против крысиного IдС-Ес-гамма (Ласкзои) были иммобилизованы на чипе СМ5 В1асоге. Этот анализ был оптимизирован по связыванию каждого тАЬ с поверхностью, иммобилизирующей антикрысиные антитела, а затем инъецировали серию концентраций тАЬ против I^-22ВΑ для определения констант ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб). После предварительного тестирования наблюдалось неспецифическое связывание между гибридным белком и иммобилизирующей последовательностью на чипе. Приготавливали сосуд с рецептором I^-22ВΑ, имеющим метку Ес4, отщепляемую тромбином, а затем его содержимое тестировали, и этот тест не обнаруживал каких-либо фоновых эффектов. После каждого эксперимента с поверхности удаляли антикрысиное антитело 2 инъекциями 20 мМ НС1. Данные получали для каждого МАЬ и анализировали кинетику связывания (-111111-^-221^ антитела с белком I^-22ВΑ с использованием программы анализа (В^ема^а^и зойхх'аге уегзюи 3.2, Рйагтас1а В^со^, Цррза1а, 8\ебеи) как показано ниже в табл. 12.
Таблица 12
Клон К2.1.5Г4.1** Клон К2.1.15Е2.1**
ка(М-13-1) 1,49Е+0б ка (М-13-1) 1,76Е+06
кд (з -1) 1,70Е-04 кс! (з-1) 2,55Е-04
КА (М-1) 8,76Е+09 КА (М-1) 6,66Е+09
КО (М) 1,14Е-10 КЭ (М) 1,504Е-10
СЕ12 2,08 СЫ2 1,5
** Показано равновесие констант скорости ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб) для каждого антиI^-22ВΑ МАВ и эти величины находятся в пределах возможностей компьютера. χ2 означает сумму квадрата разностей между наблюдаемыми величинами кривой связывания и ожидаемыми величинами эмпирических кривых. Чем ближе это значение к О, тем более достоверными являются данные.
Как показано в табл. 2, оба анти-I^-22ВΑ антител (МАЬ) связываются с белком ЕБ^КА с высокой степень аффинности, на что указывает их связывание в пикомолярной концентрации с ЕБ^КА (отщеп- 78 009026 ленная тромбином метка Ес4). Эти данные являются в высокой степени достоверности, о чем свидетельствуют низкие величины χ2, и указывают на то, что клон тАЬ К2.1.5Е4.1 обладает несколько более высокой аффинностью по отношению к рецептору I^-22КΛ.
Пример 20. Иммуногистохимический анализ экспрессии белка ΙΕ-22 1и νί\Ό в образцах тканей
A. Краткое описание
Иммуногистохимический (ИГХ) анализ экспрессии и локализации белка ΙΕ-22 осуществляли с использованием моноклонального антитела против человеческого ΙΕ-22 (анти-ЫЬ-22 антитела) (МаЬ 266.19.1.10.5.2) в следующих образцах тканей: в сетке с множеством нормальных человеческих тканей, в сетке с опухолевыми тканями; в человеческой ткани, пораженной панкреатитом; в образцах патологической ткани легких и почек; в образцах человеческой кожи, пораженной псориазом; в ТС Ι№-ΙΕ-22 (экспрессированного с промотора крысиного инсулина) и в мышиной поджелудочной железе дикого типа (νΓ); образцах мышиной кожи тиI^-22-Еи^СК ТС и νΓ; и БББ-образце мышиной толстой кишки БББ (νΓ и ΙΕ-22 КО). Кроме того, были проведены сравнения картины окрашивания моноклональным антиЫЬ-22 антителом МАВ 266.19.1.10.5.2 (пример 17) и поликлональным антителом (кроличьим анти-ЫЬ22 антителом) (пример 16).
Были протестированы крысиные моноклональные антитела, против человеческого ΙΕ-22, МАВ 266.16.1.4.4.1 и МаЬ 266.19.1.10.5.2 (пример 17), и было обнаружено окрашивание, главным образом, клеток ВНК/человеческий ΙΕ-22 (>50%), а также некоторых клеток ВНК/мышиный ΙΕ-22 (1-5%), и эти антитела использовали для исследования распределения и экспрессии ]Ь-22 в образцах тканей человека и животных с моделью заболевания, а затем их использовали для сравнения с картиной окрашивания поликлональным кроличьим антителом для подтверждения полученных результатов.
B. Материалы и методы
Фиксированные формалином и залитые в парафин клетки и ткани человека и мышей с моделью заболевания иссекали с получением срезов в 5 мкм. Эти клетки включали клетки ВНК, экспрессирующие либо человеческий, либо мышиный ]Ь-22, и клетки дикого типа в качестве позитивного и негативного контроля соответственно. Человеческие ткани приготавливали на контрольных предметных стеклах для множества тканей (№гта1Спй™, Вютейа, Еок!ег С11у, СА) с использованием 50 срезов нормальных человеческих тканей (например, головного мозга, гипофиза, надпочечника, молочной железы, почек, сердца, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, печени плода, печени, кожи, поджелудочной железы, легкого, миндалины, яичника, яичек, предстательной железы, матки, плаценты, щитовидной железы и селезенки); и на контрольных предметных стеклах для множества тканей (ТитогСпй™, Вютейа, Еок!ег С?11у, СА) с использованием 50 срезов различных опухолевых тканей человека (например, аденокарциномы легких, аденокарциномы печени, аденокарциномы почек, аденокарциномы толстой кишки, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы щитовидной железы, аденокарциномы желудка, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы яичника, лимфомы, меланомы, саркомы Юинга, саркомы эпителия, саркомы МЕН, рабдосаркомы, карциноида, недифференцированной карциномы, мезотелиомы, тератомы и семиномы); карциномы легких по СНТЫ (Соорега!юи Нитаи Т1ккие №1\\όγ1<, С^е1аий, 0Ыо); нормальной поджелудочной железы; поджелудочной железы с хроническим панкреатитом; легких с хроническим периваскулярным воспалением; почек с многоочаговым гломерулосклерозом, мезангиопролиферирующим гломерулонефритом или склеротическим гломерулярным интерстициальным фиброзом по МЭШ (№йоиа1 Б1кеаке КекеагсЬ Iи!е^сЬаηде, РЫ1айе1рЫа, РА) и кожи человека, страдающего псориазом. Мышиные ткани включали ткани толстой кишки, взятые у животного с моделью воспалительного кишечного заболевания (описанной здесь БББ-моделью, самок мышей Б\\зкк VеЬк!е^) и у ΙΕ-20-животных VТ и КО-животных с моделью колита (БББ-мыши дикого типа и самки мышей, дефицитных по ΙΕ-20 (ΙΕ-20)), которым вводили либо носитель, либо 4% БББ в питьевой воде в течение 7 дней; и образцы кожи от трансгенных (ТС) животных с моделью заболевания, включая тI^-22-Еи^СК ТС и тI^-22-INБ-контрольных и трансгенных животных. Один срез на блок/предметное стекло окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для проведения гистологического анализа, а затем этот срез подвергали иммуногистохимическому окрашиванию для определения уровня экспрессии и локализации белка ΙΕ-22.
Для проведения иммуногистохимического анализа, срезы клеток и тканей помещали на предметные стекла микроскопа СЬетМа!е™ СарШагу Сар Р1ик (ВюТек, V^иоокк^, Уегтои!), осушали в печи при 60°С в течение 60 мин и подвергали депарафинированию в стандартных условиях, 3x5 мин в ксилите, 4 мин в 100% Е!0Н, 3 мин в 100% Е!0Н и 2 мин в 95% Е!0Н. Затем срезы тканей в течение 20 мин подвергали индуцированному ферментом процессу восстановления эпитопа при 37°С с использованием пепсина (ЯеоМагкегк Егетои! СА) с последующим проведением стадии блокирования авидином/биотином в соответствии с инструкциями производителей (Уушей, Бои!Ь Баи Егаиаксо, СА). Окрашивание проводили с помощью автоматического устройства для иммунного окрашивания ТесЬМа!е 500™ в соответствии с протоколом иммугистохимического окрашивания иммунопероксидазой (Ι₽) с использованием системы детекции комплексом авидин-биотин (Уеи!аиа Вю!ек Бук!етк, Тискои, АУ). Устройство для иммунного окрашивания ТесЬМа!е 500™ функционирует по принципу капиллярного действия, а ΙΓ-протокол преду
- 79 009026 сматривает проведение иммунного окрашивания, называемого сэндвич-методом. Срезы предварительно блокировали 5% нормальной козьей сывороткой ^ескг, Вигйпдате СА) в РВ8 в течение 10 мин, а затем промывали 1хбуфером 1 (81дпе!, ОебНат, МА), после чего инкубировали с первым антителом против ^-22 (МАВ 266.19.1.10.5.2) (пример 17), РА8-очищенного при 2,04 мг/мл, разведенным 1:800, в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей промывкой 5хбуфером 1. Первое антитело разводили в буфере для разведения антител ТесНМа!е 500™ АегИапа). Биотинилированное козье антитело против крысиных ЦО АесГОг), разведенное 1:200+5% нормальную козью сыворотку и 2,5% обезжиренное сухое молоко в РВ8 использовали в качестве вторых связывающих антител в течение 25 мин при комнатной температуре, а затем промывали 1хбуфером 1 и 1хбуфером 2&3 (81дпе!). После этого срезы тканей обрабатывали 3х7 мин 3% блокирующим пероксидом водорода (НР), а затем промывали 3х буфером 2&3. Мечение иммунопероксидазой проводили с использованием набора ЭАВ с пероксидами (кегИапа) путем инкубирования с комплексом авидин-биотин (АВС) в течение 30 мин с последующей промывкой 5хбуфером 2&3 и диаминобензидином (ОАВ) 4 раза по 4 мин, а затем промывкой 2хбуфером 2&3 и 1хводой (81дпе!, Са!. № 2340). После этого ткани подвергали контрастному окрашиванию метиловым зеленым (Όηΐίο, Са!. № 81962) в течение 10 мин с последующей промывкой 2хбуфером 2&3 и 3х водой. Контроль включал неиммунную первичную сыворотку, где вместо первого антитела использовали крысиное первое контрольное антитело (2утеб).
Иммунологическое окрашивание наблюдали под микроскопом О1утрик ВН-2 и изображения фиксировали с помощью цифровой видеокамеры Сοο18NАР НО (Кюре!- 8с1епййс, Тисбюп, А2).
С. Результаты
Позитивные и негативные контрольные клеточные линии: МАВ 266.19.1.10.5.2, моноклональное антитело против ΗηΕΒ-22 продемонстрировало позитивное окрашивание клеток ВНК, экспрессирующих человеческий ^-22 (+++), и клеток ВНК, экспрессирующих мышиный ^-22 (+), и не окрашивало клетки ВНК дикого типа (-). Все позитивные и негативные клеточные линии ВНК, которые вместо первого антитела были окрашены крысиными антителами соответствующего изотипа, используемыми в качестве негативного контроля, не давали никакого окрашивания (-), что указывало на то, что данное антитело является специфичным к лиганду ^-22. Указанное антитело обладает перекрестной иммунореактивностью как с человеческим, так и с мышиным ^-22.
Человеческие ткани: Оценивали сетку с множеством нормальных человеческих тканей и сетку с опухолевыми тканями; образцы патологической ткани легких и почек; и образцы человеческой кожи, пораженной псориазом. Такими человеческими тканями являются: 1) ткани головного мозга, гипофиза, надпочечника, молочной железы, почек, сердца, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, печени плода, печени, кожи, поджелудочной железы, легкого, миндалины, яичника, матки, яичек, плаценты, щитовидной железы и селезенки на контрольных предметных стеклах для множества тканей (Νογта1Опб™/нормальные человеческие ткани); 2) ткани аденокарциномы легких, аденокарциномы печени, аденокарциномы почек, аденокарциномы щитовидной железы, аденокарциномы желудка, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы яичника, лимфомы, меланомы, саркомы Юинга, саркомы эпителия, саркомы МЕН, рабдосаркомы, карциноида, недифференцированной карциномы, мезотелиомы, тератомы и семиномы на контрольных предметных стеклах для множества тканей (Титο^О^^б™ Вютеба/патологические/опухолевые человеческие ткани); 3) ткани нормальной поджелудочной железы, поджелудочной железы с хроническим панкреатитом, легкого с хроническим периваскулярным воспалением, карциномы легких, почек с многоочаговым гломерулосклерозом, почек с мезангиопролиферирующим гломерулонефритом, почек со склеротическим гломерулярным интерстициальным фиброзом в соответствии с СНТХ и/или ΝΏΒ1.
Мышиные ткани: Оценивали ткани мышиной поджелудочной железы ΕΝ8 ^-22 ТО и кТ. Клетки, рассеянные по всем панкреатическим островкам в поджелудочной железе I^-22-IN8-трансгенных (ТО) мышей, продемонстрировали сильное позитивное окрашивание (+++) антителом МАВ 266.19.1.10.5.2, а клетки поджелудочной железы дикого типа (кТ) не обнаруживали окрашивания (-).
Сравнение поликлональных и моноклональных антител.
Было обнаружено, что поликлональное анти-[^-22ΒΛ антитело (пример 16) является неспецифическим, тогда как моноклональное антитело МАВ 266.19.1.10.5.2 является специфическим. Поликлональное антитело давало позитивное окрашивание клеток ВНК, экспрессирующих человеческий ^-22 (+++), клеток ВНК, экспрессирующих мышиный ^-22 (+), в различных образцах ткани человека и мыши (+) и в панкреатических островках трансгенных ΕΝ8 шП-22 мышей (+++). Более высокий процент позитивного окрашивания наблюдался в островках трансгенных животных (по сравнению с животными дикого типа). Окрашивание в островках трансгенных животных, в основном, распределялось по всему островку (+++), тогда как окрашивание островков дикого типа, в основном, ограничивалось периферическими участками (+). Однако это антитело также обнаруживало неспецифическое окрашивание негативных контрольных линий ВНК кТ (+).
МАВ 266.19.1.10.5.2 продемонстрировало позитивное окрашивание клеток ВНК, экспрессирующих человеческий ^-22 (+++), клеток ВНК, экспрессирующих мышиный ^-22 (+), и клеток в панкреатиче
- 80 009026 ских островках трансгенных Ш8 тГБ-22-мышей (+++). Окрашивание в трансгенных панкреатических островках, в основном, распределялось по всему островку (+++), тогда как панкреатические островки не обнаруживали какого-либо окрашивания (-).
Пример 21. II ,-20 позитивно регулируется в образцах кожи человека, пораженной псориазом
A. Образцы РНК
Были получены образцы нормальной кожи, а также кожи, взятой от пациентов с псориазом. В последнем случае, брали кожу из участка, пораженного стабильным бляшковым псориазом, и из соседнего участка непораженной кожи. РНК выделяли из образцов человеческой кожи стандартными методами. Целостность и качество РНК-образцов тестировали на биоанализаторе Адйеп! 2100 В^Апа^е!· (Адйеп! Тесйпо1од1ез, \а1бЬгопп Сегтапу).
B. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР
Проведение количественной ОТ-ПЦР в оперативном режиме с использованием системы детекции последовательности АВ1 РКГ8М 7700 (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз, Гпс., Боз1ег Сйу, СА) было описано ранее (см. Не1б С.А. е! а1., Сепоте КезеагсЪ 6:986-994, 1996; С1Ьзоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте КезеагсЪ, 6:995-1001, 1996; 8ипбагезап 8. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998). Этот метод предусматривает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерный краситель и гаситель флуоресценции. Если зонд является интактным, то излучение репортерного красителя нейтрализуется, что обусловлено непосредственной близостью гасителя флуоресценции. В процессе ПЦР-удлинения с использованием дополнительных геноспецифических прямых и обратных праймеров, зонд расщепляется под действием 5'-3'нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ!й, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентного излучения.
Праймеры и зонды, используемые для проведения количественных ОТ-ПЦР-анализов на экспрессию ГБ-20 в оперативном режиме, конструировали с помощью компьютерной программы для моделирования праймеров Рг1тег Ехргезз™ (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз, Боз!ег Сйу, СА). Прямой праймер, ΖС40541 (8Е0 ΙΌ N0:25) и обратный праймер ΖС40542 (8Е0 ΙΌ N0:236) использовали в ПЦР-реакции (ниже) при концентрации 800 нМ, в результате чего было синтезировано 71 п.н.-продукта. Соответствующий зонд ГБ-20 ТадМап®, ΖС40544 (8Е0 ΙΌ N0:27) синтезировали и метили красителем РЕ Аррйеб Вюзуз!етз. 1Б-20-зонд метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (БАМ) (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз), а по 3'-концу - гасителем флуоресценции (6-карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз).
C. Количественная ОТ-ПЦР в оперативном режиме
Относительные уровни мРНК ГБ-20 определяли посредством анализа образцов полноразмерной РНК с использованием набора реагентов Тас]\-1ап ЕΖ КТ-РСК Соге (РЕ, Аррйеб Вюзуз!етз). Отобранный ГБ-20-транскрипт получали для построения стандартной кривой, используемой для количественной оценки. Кривую строили исходя из 10-кратных разведений в пределах примерно от 108 до 103 всех копий полноразмерного транскрипта для ГБ-20, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали с тремя повторностями. Образцы полноразмерной РНК кожи также анализировали с тремя повторностями на уровни человеческого транскрипта ГБ-20 и на уровни 11СБ8 в качестве эндогенного контроля. В полном объеме 25 мкл, каждый РНК-образец подвергали реакции ОТ-ПЦР ТадМап ЕΖ (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз), содержащей приблизительно 25 нг полноразмерной РНК в ОЕРС-обработанной воде (не содержащей ДНКазы/РНКазы); соответствующие праймеры (приблизительно 800 нм ΖС40541 (8Е0 ГО N0:25) и ΖС40542 (8Е0 ГО N0:26)); соответствующий зонд (приблизительно 100 нм ΖС40544 (8Е0 ГО N0:27)); 1хбуфер ТадМап ЕΖ; 3 мМ ацетат марганца, 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ биТР; ДНК-полимеразу гТ!й (0,1 ед/мкл) и АтрЕгазе υNС (0,01 ед/мкл). Термоциклы ПЦР проводили в следующем режиме: начальная стадия обработки υNС - один цикл при 50°С, 2 мин, стадия обратной транскрипции (ОТ) - один цикл при 60°С, 30 мин, стадия дезактивации υNС - один цикл при 95°С, 5 мин, и 40 циклов амплификации при 94°С, 20 с и 60°С, 1 мин.
Относительные уровни РНК ГБ-20 определяли с использованием стандартной кривой в соответствии с инструкциями производителей, РЕ Вюзуз!етз (изег Ви11е!т #2: АВГ Рпзт 7700 8едиепсе 1)е1есиоп 8уз!етз, Ке1айуе ОиапШаПоп о Г Сепе Ехргеззюп, ОесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровней ГБ-20 проводили измерение уровней 116Б8. Данные приводятся ниже в табл. 13.
Таблица 13
Образец кожи 1Б-20
Нормальная 2903
Непораженная 7233
Пораженная 27695
Хотя мРНК ГБ-20 детектировалась в образцах кожи здоровых индивидуумов или в образцах кожи, взятых из непораженных участков, однако, на пораженной коже пациентов с псориазом наблюдалась активация транскрипта ГБ-20. Субъединицы рецептора ГБ-20, включая ГБ-20КА, ГБ-22КА (ГБ-22КА) и ГБ
- 81 009026
22Ββ, экспрессировались на здоровой и пораженной коже человека. Эти данные подтверждают тот факт, что тяжелое заболевание, такое как псориаз человека, ассоциируется с ^-20.
Сверхэкспрессия ^-20 обнаруживалась в области поражения псориазом человека, что позволяет предположить, что ^-20 участвует в патогенезе псориаза человека. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, сверхэкспрессия ГО-20 у трансгенных мышей приводит к утолщению эпидермиса, а присутствие в нем иммунных клеток является показателем псориазного фенотипа. Эти ίη νί\Ό данные, кроме того, позволяют предположить, что провоспалительный ^-20 участвует в патогенезе псориаза. Сами антагонисты активности ГО-20, такие как моноклональные антитела против человеческого ^^ΒΑ настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы и антитела против таких рецепторов, а также нейтрализующие и моноклональные антитела против ^-20 могут быть использованы в качестве антагонистов ^-20 для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, таких как псориаз, и других описанных здесь заболеваний.
Пример 22. ^-20 активируется в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом
С. Образцы РНК
Были получены образцы нормальной кожи, а также кожи, взятой от пациентов с атопическим дерматитом. РНК выделяли из образцов человеческой кожи стандартными методами. Целостность и качество РНК-образцов тестировали на биоанализаторе Αд^1еη! 2100 В^оΑηа1уζе^ ^дИеп! ТесЬпо1од1ек, Уа1бЬгопп Сегтапу).
Ό. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР
Проведение количественной ОТ-ПЦР в оперативном режиме с использованием системы детекции последовательности ΑΜ РЕЕМ 7700 (РЕ Α]3]3^6 Вюкук!етк, Нс., 1ок!ег Сйу, СΑ) было описано ранее (см. Не1б СА. е! а1., Сепоте Еекеагсй 6:986-994, 1996; С1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте Βеκеа^сй, 6:995-1001, 1996; Зипбагекап δ. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998). Этот метод предусматривает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерный краситель и гаситель флуоресценции. Если зонд является интактным, то излучение репортерного красителя нейтрализуется, что обусловлено непосредственной близостью гасителя флуоресценции. В процессе ПЦР-удлинения с использованием дополнительных геноспецифических прямых и обратных праймеров, зонд расщепляется под действием 5'-3'нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ(Ь, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентного излучения.
Праймеры и зонды, используемые для проведения количественных ОТ-ПЦР-анализов на экспрессию ^-22 в оперативном режиме, конструировали с помощью компьютерной программы для моделирования праймеров Рптег Ех]згекк|Л1 (РЕ Α]3]3^6 Вюкук!етк, 1ок!ег Сйу, СΑ). Прямой праймер, ΖС40541 (ЗЕО ГО N0:25) и обратный праймер ΖС40542 (ЗЕО ГО N0:236) использовали в ПЦР-реакции (ниже) при концентрации 800 нМ, в результате чего было синтезировано 71 п.н.-продукта. Соответствующий зонд ^-20 ТацМап®, ΖС40544 (ЗЕО ГО N0:27) синтезировали и метили красителем РЕ Α]3]3^6 В1окук!етк. I^-20-зонд метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбокси-флуоресцеином) (ΕΑΜ) (РЕ Αρρ^6 Вюкук!етк), а по 3'-концу - гасителем флуоресценции (6-карбокситетраметилродамином) (ТΑΜΒΑ) (РЕ Α]3]3^6 Вюкук!етк).
С. Количественная ОТ-ПЦР в оперативном режиме
Относительные уровни мРНК ^-20 определяли посредством анализа образцов полноразмерной РНК с использованием набора реагентов ТацМап ЕΖ ΒТ-РСΒ Соге (РЕ, Α]3]3^6 Вюкук!етк). Отобранный ^-20-3-)3340(14143- получали для построения стандартной кривой, используемой для количественной оценки. Кривую строили исходя из 10-кратных разведения в пределах примерно от 108 до 103 всех копий полноразмерного транскрипта для ^-20, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали с тремя повторностями. Образцы полноразмерной РНК кожи также анализировали с тремя повторностями на уровни человеческого транскрипта ^-20 и на уровни ΙιΟυδ в качестве эндогенного контроля. В полном объеме 25 мкл, каждый РНК-образец подвергали реакции ОТ-ПЦР ТацМап ЕΖ (РЕ Αρρ11еб Вюкук!етк), содержащей приблизительно 25 нг полноразмерной РНК в ОЕРС-обработанной воде (не содержащей ДНКазы/РНКазы); соответствующие праймеры (приблизительно 800 нм ΖС40541 (ЗЕО ГО N0:25) и ΖС40542 (ЗЕО ГО N0:26)); соответствующий зонд (приблизительно 100 нм ΖС40544 (ЗЕО ГО N0:27)); 1хбуфер ТацМап ΞΖ; 3 мМ ацетат марганца, 300 мкМ каждого из б-СТР, б-ΑΊΡ и б-СТР и 600 мкМ биТР; ДНК-полимеразу гТ!Ь (0,1 ед/мкл) и ΑтρЕ^аκе иNС (0,01 ед/мкл). Термоциклы ПЦР проводили в следующем режиме: начальная стадия обработки иNС - один цикл при 50°С, 2 мин, стадия обратной транскрипции (ОТ) - один цикл при 60°С, 30 мин, стадия дезактивации иNС - один цикл при 95°С, 5 мин, и 40 циклов амплификации при 94°С, 20 с и 60°С, 1 мин.
Относительные уровни РНК ^-20 определяли с использованием стандартной кривой в соответствии с инструкциями производителей, РЕ Вюкук!етк (икег Ви11е!1п #2: ΑΜ Рпкт 7700 Зесщепсе Ое!ес!юп Зук!етк, Βе1а!^νе ОиапШаОоп оГ Сепе Еxρ^еκκ^оη, ЭесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровней ^-20 проводили измерение уровней ЬСиЗ.
мРНК ^-20 детектировалась в образцах кожи на низком уровне (примерно 800 копий). В противоположность этому, в образцах кожи пациентов с атопическим дерматитом наблюдалась активация транс
- 82 009026 криптов Ш-20 (примерно 8600 копий). Субъединицы рецептора Ш-20, включая Ш-20КА, Ш-22КА и Ш22КВ, экспрессировались на здоровой и пораженной коже человека. Эти данные подтверждают тот факт, что тяжелое заболевание, такое как атопический дерматит человека, ассоциируется с Ш-20. Сверхэкспрессия Ш-20 обнаруживалась на коже человека с атопическим дерматитом, что позволяет предположить, что ГЬ-20 участвует в патогенезе человеческого атопического дерматита. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, сверхэкспрессия Ш-20 у трансгенных мышей приводит к утолщению эпидермиса, и к притоку иммунных клеток, являющихся показателем фенотипа атопического дерматита. Эти ш У1уо данные, кроме того, позволяют предположить, что Ш-20 участвует в патогенезе атопического дерматита. Сами антагонисты активности ГЬ-20, такие как моноклональные антитела против человеческого Ш-22КА настоящего изобретения, растворимые рецепторы и антитела против таких рецепторов, а также нейтрализующие и моноклональные антитела против Ш-20 могут быть использованы в качестве антагонистов ГЬ-20 для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, таких как атопический дерматит, а также других описанных здесь заболеваний.
Пример 23. Активация Ш-8 интерлейкином Ш-20
Нормальные неонатальные эпидермальные кератиноциты человека (ИНЕК) (С1опейск) засевали 2мя пассажами и культивировали до конфлюентности в 12-луночных планшетах для культивирования тканей. КОМ (среду для культивирования кератиноцитов) закупали у С1опе!1ск. После достижения клетками конфлюентности их промывали средой КОМ без факторов роста, обозначаемой КВМ (базальная среда для кератиноцитов). Клетки выдерживали в бессывороточной КВМ в течение 72 ч, а затем добавляли тестируемое соединение. В качестве позитивного контроля использовали тромбин при 1 МЕ/мл и трипсин при 25 нМ. При этом, добавляли 1 мл среды/лунку. КВМ использовали лишь в качестве негативного контроля.
Ш-20 приготавливали в среде КВМ и добавляли в различных концентрациях, составляющих от 2,5 мкг/мл до 618 нг/мл в первом эксперименте и от 2,5 мкг/мл до 3 нг/мл во втором эксперименте.
Клетки инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 48 ч. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С в течение нескольких дней, а затем анализировали на уровни Ш-8 и ОМ-С8Р. Набор для иммуноанализа человеческого Ш-8 #Ό8050 (КапбО 8ук!етк, Шс.) и набор для иммуноанализа человеческого ОМ-С8Р # Н8ОМ0 (КапбЭ 8ук!етк, бчс.) использовали для определения уровня продуцирования цитокинов в соответствии с инструкциями производителей.
Полученные результаты показали, что экспрессия Ш-8 и ОМ-С8Р индуцируется интерлейкином Ш20.
Пример 24. Активация воспалительных цитокинов интерлейкином Ш-20
Клеточную линию человеческих кератиноцитов, НаСаТ, культивировали в колбах для культивирования тканей Т-75 при 37°С в течение нескольких дней после достижения ими конфлюэнтности. После этого, брали нормальную культуральную среду (ЭМЕМ+10% РВ8) и заменяли бессывороточной средой. Затем клетки инкубировали в течение двух дней при 37°С. После этого, среду ЭМЕМ удаляли и четыре колбы с клетками на одну обработку помещали на 4 ч при 37°С в следующих концентрациях: рекомбинантный белок (гР) Ш-1-альфа при 5 нг/мл, гР Ш-1-альфа при 20 нг/мл, гР Ш-1-альфа при 5 нг/мл+Ш-20 при 1 мкг/мл, Ш-20 при 1 мкг/мл или гР ГЬ-10 при 10 нг/мл.
После обработки цитокинами среду удаляли и клетки подвергали лизису с использованием раствора тиоцианата гуанидиния. Полноразмерную РНК выделяли из клеточного лизата путем центрифугирования в течение ночи в градиенте хлорида цезия. На следующий день осажденную РНК ресуспендировали в растворе ТЕ/ДСН и осаждали этанолом. Затем проводили количественную оценку РНК на спектрофотометре с последующей обработкой ДНКазой, как описано в публикации: 8есРоп У.В. оГ С1оп!есР'к А!1ак™ сЭНА Ехргеккюп Аггаук Икег Мапиа1 (версия РТ3140-1/РК9Х390, опубликованная 11/5/99). Качество образцов РНК подтверждали путем определения степени чистоты исходя из данных спектрофотометрического анализа, и путем визуализации на агарозном геле. Контаминацию генома РНК-образцами исключали с помощью ПЦР-анализа гена бета-актина.
Осуществляли протоколы С1оп!есР'к для ро1уА+-обогащения синтеза зонда и гибридизации с массивами А!1ак™ (см. выше, а также публикацию р1ик А!1ак™ Риге То!а1 ^А ЬаЬеРпд 8ук!ет Икег Мапиа1, РТ3231-1/РК96157, опубликованную 6/22/99). Вкратце, ро1уА+РНК выделяли из 50 мг полноразмерной РНК с использованием покрытых стрептавидином магнитных сфер (С1оп!есР, Рао1о А1!о, СА) и сепаратора магнитных частиц. После этого, Ро1уА+-РНК метили альфа32Р-бАТР с помощью ОТ-ПЦР. В этой реакции использовали праймеры С1оп!есР СЭ8, специфичные к 268 генам в массиве человеческий цитокин/рецептор А!1ак™ (Са!.№ 7744-1). Меченный зонд выделяли с помощью колоночной хроматографии и оценивали в сцинтилляционной жидкости.
Матрицы А!1ак™ предварительно гибридизовали с С1оп!есР ЕхргеккНуЬ плюс 100 мг/мл термоденатурированной ДНК спермы лосося по крайней мере в течение 30 мин при 68°С, при непрерывном перемешивании. Затем мембраны гибридизовали с 1,9х106 СРМ/мл (всего 1,14х107 СРМ) в течение ночи при 68°С и при непрерывном перемешивании. На следующий день мембраны 4 раза промывали в течение 30 мин в 2х88С, 1% ДСН при 68°С, а затем один раз в течение 30 мин в 0,1х88С, 0,5% ДСН при 68°С, и
- 83 009026 наконец, один раз промывали в течение 5 мин в 2/88С при комнатной температуре. После этого, матричные мембраны помещали в пластиковые мешочки ^бак, герметично закрывали и экспонировали с фосфорным люминесцентным экраном в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день фосфоресцирующий экран сканировали на фосфорном визуализаторе и анализировали с использованием программного обеспечения СИПесй АбаПтаде™ 1.0.
Активация генов интерлейкином Ш-20
1. Фактор некроза опухоли (Т№) подвергали 1,9-2,4-кратной активации интерлейкином ΙΣ-20.
2. Плацентарные факторы роста 1&2 (РЬСЕ) подвергали 1,9-2,0-кратной активации интерлейкином Ш-20.
3. Рецептор фактора свертывания крови ΙΙ подвергали 2,0-2,5-кратной активации интерлейкином Ш20.
4. Рецептор кальцитонина подвергали 2,2-2,3-кратной активации интерлейкином Ш-20.
5. Т№-индуцибельный гиалуронатсвязывающий белок Т8С-6 подвергали 2,1-2,2-кратной ΙΣ-20активации.
6. Предшественник рецептора-1 васкулярного эндотелиального роста (УЕСЕ), рецептора тирозинпротеинкиназы (ЕЬТ-1) (8ЕЬТ), подвергали 2,1-2,7-кратной ΙΕ-20-активации.
7. МКР-8 (связывающийся с кальцием белка в МШ-ассоциированных макрофагах) подвергали 2,94,1-кратной ΙΕ-20-активации.
8. МКР-14 (связывающийся с кальцием белка в МШ-ассоциированных макрофагах) подвергали 3,03,8-кратной ΙΕ-20-активации.
9. Релаксин Н23 подвергали 14-кратной ΙΕ-20-активации.
10. Рецептор трансформирующего Фактор роста бета (ТСЕв) ΙΙΙ, 300 кДа подвергали 2,4-3,6кратной ΙΕ-20-активации.
Гены, указывающие на синергический эффект обработки ΙΕ-20+ΙΕ-1:
1. Белок морфогенеза кости 2а подвергали 1,8-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 2,5-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 8,2-кратной активации путем обработки ΙΣ-20 и ΙΣ1.
2. МКР-8 подвергали 2,9-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 10,7-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 18,0-кратной активации путем обработки ΙΣ-20 и ΙΣ-1.
3. Эритроидный белок дифференцировки (ЕЭЕ) подвергали 1,9-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 9,7-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 19,0-кратной активации путем обработки ΙΣ-20 и ΙΣ-1.
4. МКР-14 (связывающийся с кальцием белка в МШ-ассоциированных макрофагах) подвергали 3,0кратной активации путем обработки одним Ш-20, 12,2-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 20,3-кратной активации путем обработки Ш-20 и ΙΣ-1.
5. Гепаринсвязывающий ЕСЕ-подобный фактор роста подвергали 2,0-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 14-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 25,0-кратной активации путем обработки Ш-20 и ΙΣ-1.
6. Бета-тромбоглобин-подобный белок подвергали 1,5-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 15-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 27-кратной активации путем обработки ΙΣ-20 и Ш-1.
7. Нейтротропный фактор головного мозга φΌΝΗ) подвергали 1,7-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 25-кратной активации путем обработки одним Ш-1 и 48-кратной активации путем обработки Ш-20 и ΙΣ-1.
8. Моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор МСАЕ подвергали 1,3-кратной активации путем обработки одним Ш-20, 32-кратной активации путем обработки одним ΙΣ-1 и 56-кратной активации путем обработки Ш-20 и ΙΣ-1.
Пример 25. Фенотип трансгенного Ш-20
Человеческий и мышиный Ш-20 сверхэкспрессировали у трансгенных мышей с использованием различных промоторов. Сначала была предпринята попытка использования печень-специфического промотора мышиного альбумина, регулирующего экспрессию человеческого Ш-20, для достижения соответствующих уровней белка в кровотоке. Затем проводили исследования с использованием промотора кератина 14 (К14), который направляет экспрессию, главным образом, в эпидермис и в другие слои многослойного плоского эпителия; промотора мышиного металлотионеина-1, который дает широкий профиль экспрессии; и промотора ЕцЬСК, который регулирует экспрессию в клетках лимфоидной линии дифференцировки. Во всех четырех случаях были получены аналогичные результаты, что, возможно, обусловлено тем, что все эти промоторы способствуют увеличению уровни циркулирующих Ш-20.
Во всех случаях, трансгенные детеныши, у которых экспрессируется ΙΕ-20-трансген, были более мелкими, чем детеныши нетрансгенного помета, имели блестящую на вид жесткую и морщинистую кожу, которая отмирала в первые несколько дней после рождения. В желудках детенышей обнаруживалось молоко, что указывало на то, что они были способны сосать. Эти мыши имели опухшие конечности,
- 84 009026 хвост, ноздри и полость рта и были малоподвижными. Кроме того, эти мыши были слабыми, у них отсутствовала видимая жировая ткань и наблюдалось замедленное развитие ушей и пальцев. Низкие уровни экспрессии мРНК в печени (менее чем 100 мРНК/клетку) были достаточными для гибели новорожденных животных и развития патологий на коже. У трансгенных мышей без видимого фенотипа трансген либо не экспрессировался, либо он не экспрессировался на детектируемых уровнях и имел мозаичный характер.
Гистологический анализ кожи ГЬ-20-трансгенных мышей обнаруживал утолщенный эпидермис, гиперкератоз и компактный роговой слой по сравнению с кожей нетрансгенного помета. Иногда наблюдался сероклеточный струп (корки). Анализ кожи трансгенных мышей с помощью электронного микроскопа (ЭМ) выявил интрамитохондриальные липоидные включения, вкрапленные кератогуалиновые гранулы и относительно немного тонофиламентов, аналогичных тем, которые наблюдаются в коже человека, пораженной псориазом, и у мышей с моделью заболевания кожи. Кроме того, у многих из трансгенных мышей присутствовали апоптозные лимфоциты тимуса. Каких-либо других патологий гистопатологический анализ не выявил. Результаты этих гистологических и ЭМ-анализов подтвердили и дополнили наблюдаемые значительные изменения в коже.
Пример 26. Конструирование экспрессирующего вектора для экспрессии растворимого человеческого 1Ь-22КА-тиЕс
Получали гибрид растворимый рецептор человеческого 1Ь-22КА-тиЕс (обозначенный ГБ-22КАС(тС2а)), содержащий внеклеточный домен 1Б-22КА, присоединенный к Ес-области (тС2а) тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина гамма-2а. Экспрессионную плазмиду, содержащую ГБ-22КАС(тС2а), конструировали путем гомологичной рекомбинации с использованием двух отдельных ДНКфрагментов экспрессирующего вектора р2МР40. Фрагменты полинуклеотидной последовательности ГЬ22КА (8ЕО ΙΌ Ν0:1) и тС2а (8ЕО ΙΌ Ν0:39) генерировали путем ПЦР-амплификации с использованием следующих праймеров: (а) праймеров ГБ-22КА 2С 45593 (8ЕО ΙΌ Ν0:28) и 2С45592 (8ЕО ΙΌ Ν0:29) и (Ь) праймеров тС2а 2С45591 (81+) ΙΌ Ν0:30) и 2С45594 (8ЕО ΙΌ Ν0:31).
Первый фрагмент, содержащий область, кодирующую внеклеточный домен ГБ-22КА, был получен с использованием полинуклеотида ГБ-22КА (например, 8ЕО ΙΌ Ν0:1) в качестве матрицы. Первый фрагмент включал 5'-последовательность, перекрывающуюся с неполной последовательностью вектора р2МР40, сегмент ГБ-22КА и 3'-перекрывающуюся последовательность, содержащую линкерную последовательность и неполную последовательность тС2а. ПЦР проводили в следующем режиме: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, а затем 55°С, 2 мин, 72°С, 3 мин и 1 цикл, 72°С, 10 мин.
Второй фрагмент включал 5'-область, перекрывающуюся с линкерной последовательностью и с неполной последовательностью ГБ-22КА, сегмент тС2а и 3' перекрывающуюся последовательность, содержащую неполную последовательность вектора р2МР40. Ес-область тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина гамма 2а (тС2а) (8ЕО ΙΌ Ν0:39) генерировали из клона кДНК тяжелой цепи мышиного Гд гамма 2а. тС2а содержал шарнирную область, СН2- и СН3-домены константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина гамма 2а. ПЦР проводили в следующем режиме: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, а затем 55°С, 2 мин, 72°С, 3 мин и 1 цикл, 72°С, 10 мин.
Реакционные смеси для ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, и полосу, соответствующую размерам вставок, подвергали гель-экстракцией с использованием набора для гель-экстракции РГАдшск™ (О|адеи).
Плазмиду р2МР40, разрезанную ферментом Вд1П, использовали в трехстадийной процедуре рекомбинации, проводимой с использованием ПЦР-фрагментов вставок. Плазмида р2МР40 представляет собой экспрессирующий вектор млекопитающего, содержащий экспрессионный кластер, имеющий промотор МР8У и множественные рестрикционные сайты для инсерции кодирующих последовательностей; сайт инициации репликации Е.сой; селективный маркер экспрессии в млекопитающих, содержащий промотор 8У40, энхансер и ориджин репликации, ген ОНЕК и терминатор 8У40; и последовательности ИКА3 и СЕЖАКУ необходимые для отбора и репликации в 8. сегеуЩае. Плазмиду р2МР40 конструировали из р2МР21 (депонированной в Американской коллекция типовых культур, 10801 Цшуегкйу Вои1еуагб Маиаккак, УА 20110-2209 РТА-5266) путем добавления нескольких рестрикционных сайтов в полилинкер.
100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8. сегеуЩае) независимо объединяли с 10 мкл ДНКвставки и 100 нг гидролизованного вектора р2МР40, и эту смесь переносили в 0,2 см-кювету для электропорации. Смесь дрожжи/ДНК подвергали воздействию электрическими импульсами с использованием источника питания (ВюКаб ЬаЬога!опек, Негси1ек, СА) для осаждения 0,75 кВ (5 кВ/см), х> Ом, и 25 мкФ. Затем в кювету добавляли 600 мкл 1,2М сорбита, и дрожжевые клетки в виде 100 мкл- и 300 мкл-аликвот высевали в два планшета ИКА-Э и инкубировали при 30°С. Примерно через 72 ч Ига+трансформанты дрожжей из одной чашки ресуспендировали в 1 мл Н20, а затем быстро центрифугировали для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 0,5 мл буфера для лизиса (2% тритон Х-100, 1% ДСН, 100 мМ №С1, 100 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЕОТА). 500 мкл смеси для лизиса добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 250 мкл стеклянных сфер, промытых кислотой, и
- 85 009026
300 мкл фенола-хлороформа, встряхивали в течение 3 мин и центрифугировали в течение 5 мин в центрифуге Эппендорфа на максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола (Е!0Н) и 30 мкл 3М ацетата натрия, а затем центрифугировали в течение 30 мин на максимальной скорости. Пробирку декантировали, и осадок промывали 1 мл 70% этанола. Затем пробирку снова декантировали, и осадок ДНК ресуспендировали в 30 мкл ТЕ.
Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.сой (ОН128) проводили с использованием 5 мкл ДНК-препарата дрожжей и 50 мкл клеток. На клетки подавали электрические импульсы при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл 80С (2% Вас!о™ Тгур!опе (Ойсо, Пейой, М1), 0,5% дрожжевого экстракта (П1Гсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС12, 10 мМ Мд804, 20 мМ глюкозы), а затем клетки высевали в 50 мкл и 200 мкл аликвот на двух ЬВ-АМВ-планшетах (бульон ЬВ (Ьеппох), 1,8% агара Вас!о™ (Эйсо), 100 мг/л ампициллина).
Вставки трех клонов для получения конструкции подвергали секвенированию, и отбирали один клон для каждой конструкции, содержащей нужную последовательность. Более крупную плазмидную ДНК выделяли с использованием коммерчески доступного набора (^IАОЕN Р1акт1й Меда Кй, Р1адеп, Уа1епс1а, СА) в соответствии с инструкциями производителей.
Пример 27. Экспрессия и очистка человеческого растворимого полипептида 1Ь-22ВА-тиЕс
Три серии конструкций 1Ь-22ВА-С(тО2а), по 200 мкг каждая, (пример 22) гидролизовали 200 единицами РνиI при 37°С в течение 3 ч, а затем осаждали 1РА и центрифугировали в микроцентрифужной 1,5 мл-пробирке. Супернатант декантировали из осадка, и осадок промывали 1 мл 70% этанола и оставляли на 5 мин при комнатной температуре для инкубирования. Пробирку центрифугировали в микроцентрифуге при 14000 об/мин в течение 10 мин, и супернатант декантировали из осадка. Затем осадок ресуспендировали в 750 мкл среды РЕ-СН0 в стерильной среде, и оставляли на 30 мин при 60°С для инкубирования. Клетки 5Е6 АРЕЭХВ11 центрифугировали в каждой из трех пробирок и ресуспендировали с использованием раствора ДНК-среды. Смесь ДНК/клетки высевали в кювету с углублениями 0,4 см и подвергали электропорации с использованием следующих параметров: 950 мкФ, высокая емкость, и 300 В. Затем содержимое кюветы удаляли, объединяли, разводили до 25 мл средой РЕ-СН0 и помещали в 125 мл-шейкерную колбу. Эту колбу помещали в инкубатор на шейкере при 37°С, 6% С02 и встряхивали при 120 об/мин.
Клеточную линию подвергали отбору на среде с микроэлементами, с последующей стадией амплификации в условиях селекции на устойчивость к 100 нМ метотрексата (МТХ), затем к 500 нМ МТХ и, наконец, к 1 мкМ МТХ. После стадии амплификации проводили сортировку СЭ8-клеток. Сортировку СЭ8-клеток осуществляли путем получения стабильного 1 мкМ МТХ-амплифицированного пула и окрашивания примерно 5х106 клеток моноклональным ФИТЦ-конъюгированным антителом против СЭ8 (ВО РйагМшдеп, са!# 30324Х) с использованием концентраций, рекомендованных производителем. Окрашенные клетки обрабатывали и сортировали на проточном цитометре ЕАС8 Уап!аде (ВО). 5% клеток собирали и размножали. Экспрессию подтверждали Вестерн-блот-анализом, после чего эту клеточную линию размножали, а затем проводили очистку белка стандартными методами.
Пример 28. Нейтрализация йи1Ь-22ВА сывороткой мышей, иммунизованных йи1Ь-22ВА-шО2а
A. Анализ на клеточную нейтрализацию для теста на ингибирование 1Ь-20 и/или 1Ь-22
Зависимую от фактора пре-В-клеточную линию ВаЕ3, котрансфицированную 1Й-22ВА и 1Й-22РВ (рЭ1В81) (ВАЕ/1Ь-22ВА/1Ь-22ВВ-клетки; пример 38), использовали для анализа на нейтрализующую способность анти-1Ь-22ВА антител путем ингибирования связывания 1Ь-20 с рецептором 1Ь-22ВЛ/1Ь20ВВ.
Аналогичным образом, ВаЕ3, котрансфицированную 1Й-22ВА и 1Й-10РВ (СВЕ2-4) (ΒЛЕ/I^22ВЛ/СКΕ2-4-клетки; пример 2) использовали для анализа на нейтрализующую способность анти-ГЬ22ВА антител путем ингибирования связывания 1Ь-22 с рецептором ^-22^/^-20^. Пролиферацию соответствующей клеточной линии, экспрессирующей рецептор, в присутствии 1Ь-20 или ЕЙ-22, и ингибирование такой пролиферации в присутствии антител-антагонистов, оценивали с использованием анализа на окрашивание аламаровым синим, как описано в примере 3. В этом анализе, ингибирование пролиферации этих клеток указывает на нейтрализующую активность.
B. Сыворотка, содержащая анти-1Ь-22ВА антитела, нейтрализует как 1Ь-22, так и 1Ь-22 в анализе на клеточную нейтрализацию
В анализе, описанном в примере 28А, сыворотку, взятую от дефицитных по 1Й-22ВА мышей, иммунизованных йи1Ь-22ВА-тиО2а (пример 30(А) (1)), добавляли при серийном разведении 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 и 0%. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 4 дней, и добавляли аламаровый синий (Асситей, СЫсадо, 1Ь) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 16 ч. Аламаровый синий позволял проводить флуориметрическое считывание, исходя из числа живых клеток и его использование позволяет проводить непосредственное измерение уровня пролиферации клеток по сравнению с негативным контролем. Планшеты считывали на счетчике ^а11ас У1с!ог 2 1420 Ми1!11аЬе1 Соип!ег (^а11ас, Тигки, Е1п1апй), работающем на длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (излучение). Результаты показали, что сыворотка, взятая у всех семи иммунизованных
- 86 009026 животных, могла нейтрализовать передачу сигнала йиГЬ-22 и йиГЬ-20 посредством йиГЬ-22КА. Так, например, при концентрации 1%, сыворотка, взятая у пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527), полностью нейтрализовала йиГЬ-22-индуцированную пролиферацию, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации 1%, сыворотка, взятая у двух других животных (16471 и 16701), ингибировала йиГЬ-20-индуцированную пролиферацию примерно на 90%, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Аналогичным образом, при концентрациях 1% и 0,5%, сыворотка, взятая у пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527), полностью нейтрализовала йиГЬ-20индуцированную пролиферацию, при этом, ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации 1%, сыворотка, взятая у животного 16701, полностью нейтрализовала йиГЬ-20-индуцированную пролиферацию, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. При концентрации 1%, сыворотка, взятая у животного 16471, нейтрализовала йиГЬ-20-индуцированную пролиферацию примерно на 95%, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Таким образом, сыворотка, взятая у всех семи животных, обладала способностью к нейтрализации пролиферации, индуцированной либо ГЬ-20, либо ГЬ-22, посредством рецептора йиГЬ22КА. Эти результаты, кроме того, продемонстрировали, что антитела против ГЬ-22КА действительно могут подавлять активность провоспалительных лигандов, ГЬ-20 и ГЬ-22, при низких концентрациях.
Эти результаты также показали, что эффективное блокирование активности ГЬ-22КА путем связывания с ГЬ-20 или с ГЬ-22 (с одним из них или с обоими), или блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации их активности, например, посредством нейтрализующего моноклонального антитела против ГЬ-22КА настоящего изобретения, может оказаться предпочтительным для ослабления эффектов ГЬ-20 и ГЬ-22 (одного из них или обоих) 1п νί\Ό и может приводить к ослаблению ГЬ-20 и/или ГЬ-22-индуцированного воспаления, например, наблюдаемого при ГЬ-20-индуцированных кожных проявлениях, а также ГЬ-22-индуцированных кожных проявлениях, например, при псориазе, ВЗК, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцированных ГЬ-20 и/или ГЬ-22, включая ВЗК, артрит, астму, псориазный артрит, колит, воспалительные кожные состояния и атопический дерматит.
Пример 29. Генерирование Р815/ЫЬ-22КА-клеток и иммунизация мышей
А. Генерирование Р815/ЫЬ-22КА-клеток и их инъекция мышам для продуцирования анти-ЫЬ22КА антител
Клетки АТ Р815 (АТСС № ТГВ-64) трансфицировали плазмидным вектором, содержащим кДНКпоследовательность йиГЬ-22КА (8ЕО ГЬ N0:1) и селектируемый маркер резистентности к пуромицину, с использованием фугенового реагента в соответствии с протоколом производителя (Косйе, Гпб1апаро11к, ГЛ). Через 48 ч после трансфекции клетки высевали на селективную среду с пуромицином. Резистентные к пуромицину трансфектанты клонировали путем лимитирующего разведения, и скринировали на уровень экспрессии йиГЬ-22КА на их клеточной поверхности посредством проточной цитометрии с использованием биотинилированного человеческого ГЬ-22 (йиГЬ-22-биотин). Вкратце, клетки инкубировали с 5 мкг/мл йиГЬ-22-биотина в течение 30 мин на льду, а затем промывали. После этого, связывание йиГЬ22-биотина с клетками детектировали с использованием РЕ-меченного стрептавидина при 1:500. Клетки анализировали на проточном цитометре Расксап с использованием компьютерной программы Се11с.|иек1 (Вес!оп Ьккткоп, 8ап 1оке. СА).
Отобранный Р815/ГЬ-22КА-клеточный клон культивировали, а затем собирали для инъекции. Клетки собирали, три раза промывали РВ8, подсчитывали, ресуспендировали при 1 х 108 клеток на миллилитр, и облучали излучением в 10000 рад. Затем клеточную суспензию переносили в 1 мл-шприц, и внутрибрюшинно инъецировали мышам ЬВА/2. Через 3 недели мышам вводили идентичную бустер-инъекцию и сыворотку скринировали на связывание с клеточной линией йиГЬ-22КА-трансфектанта. Для этого, сыворотку разводили 1:100 в буфере Раск (НВ88, 2% В8А, 0,02% №N3), а затем инкубировали с Рсблокированными клетками почек человека 293, сверхэкспрессирующими йиГЬ-22КА. После этого, связывание анти-ГЬ-22КА антител с клетками детектировали с использованием конъюгированного с флуоресцеином козьего антитела против мышиных ГдО, разведенного 1:200 (8ои!йегп Вю!есй, В1гтшдйат, АЬ). Клетки анализировали, как описано выше. Мышам снова вводили бустер-инъекцию всего 3 раза, и сыворотку скринировали, как описано выше. Затем, исходя из сывороточного уровня их связывания с йиГЬ-22КА-трансфектантами, отбирали двух мышей для получения гибридомы стандартными методами, обычно используемыми для продуцирования моноклональных антител (пример 25).
Вышеописанный метод также применяется для генерирования клеток Р815, экспрессирующих гетеродимерные рецепторы ГЬ-22КА, такие как ГЬ-22КА/СКР2-4 (Р815/ГЬ-22КА/СКР2-4-клеток), ГЬ22КЛ/рОГК81 (Р815/ГЬ-22КА/рПГК81-клеток) или ГЬ-22КА/СКР2-4/рПГК81 (Р815/ГЬ-22КА/СКР24/рОГК81-клеток), например, в целях иммунизации мышей для генерирования моноклональных антител против ГЬ-22КА и ГЬ-22КА-содержащих гетеродимерных рецепторов.
Пример 30. Генерирование мышиных тАЬ против человеческого ГЬ-22КА
А. Иммунизация для генерирования анти-ГЬ-22КА антител (1) Использование растворимого ГЬ-22КА-тиРс
- 87 009026
6-12-недельных мышей, дефицитных по Ш-22КА (пример 26), иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции 25-50 мкг растворимого человеческого белка ^-22^^1111.1^0 (пример 23), смешанного 1:1 (об./об.) с адъювантом К1Ь1 (81дта), раз в две недели. Через 7-10 дней после третьей иммунизации брали пробы крови путем ретроорбитальной пункции, а затем сыворотку собирали и оценивали на ее способность ингибировать связывание й-22 или Ш-20 и Ш-22 с Ш-22КА в анализах на нейтрализацию (например, как описано в настоящем изобретении) и окрашивать I^-22КА-трансфицированные клетки по сравнению с нетрансфицированными клетками 293 в ЕАС8-анализе на окрашивание. Затем иммунизацию мышей продолжали и брали пробы крови, после чего их анализировали, как описано выше, до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. Затем, мышам с наибольшими титрами нейтрализующих антител внутрисосудисто инъецировали 25-50 мкг растворимого белка I^-22КА-Ес в РВ8. Через три дня селезенку и лимфоузлы, взятые у этих мышей, собирали и использовали для генерирования гибридомы, например, с использованием мышиных миеломных клеток (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или других соответствующих клеточных линий в соответствии со стандартной методикой, известной специалистам (например, см. Кеагпеу, ТЕ. е! а1., 1. ^типок 123:1548-50, 1979 & капе, К.О. 1. ^типок Мейобк. 81:2238, 1995).
(2) Использование трансфектантов Р815, экспрессирующих рецептор Ш-22КА
6-10-недельных самок мышей ЭВ2/2 иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции 1х105 живых трансфицированных клеток Р815, например Р815/Ш-22КА-клеток, Р815/I^-22КА/СΒЕ2-4-клеток, Р815/I^-22КΆ/р^IК81- или Р815/^-22^^0^^2-4/130^81 -клеток (пример 24) (например, 0,5 мл при плотности 2х105 клеток/мл). Перед инъекцией клетки поддерживали в экспоненциальной фазе роста. Для инъекции клетки собирали, три раза промывали РВ8, а затем ресуспендировали в РВ8 до плотности 2х105 клеток/мл. В этой модели у мышей в течение 2-3 недель развивалась асцитная опухоль, которая прогрессировала и через 4-6 недель приводила к гибели животных, если только не продуцировался иммунный ответ на трансфицированный антиген-мишень. Трехнедельных мышей, у которых не наблюдалось явного отека брюшной полости (указывающего на асцит), повторно иммунизировали как описано выше с интервалами в 2-3 недели. Через 7-10 дней после второй иммунизации брали пробы крови путем ретроорбитальной пункции, а затем сыворотку собирали и оценивали на ее способность ингибировать связывание Ш-22 или Ш-20 и Ш-22 с Ш-22КА в анализах на нейтрализацию (например, как описано в настоящем изобретении) и окрашивать I^-22КА-транферированные клетки по сравнению с нетрансфицированными клетками 293 в ЕАС8-анализе на окрашивание. Затем иммунизацию мышей продолжали, брали пробы крови, и эти пробы анализировали как описано выше до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. После этого мышам с наибольшими титрами нейтрализации внутрибрюшинно инъецировали 1х105 живых трансфицированных клеток Р815. Через четыре дня селезенку и лимфоузлы!, взятые у этих мышей, собирали и использовали для генерирования гибридомы, например, с использованием мышиных миеломных клеток (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или других соответствующих клеточных линий, в соответствии со стандартной методикой, известной специалистам (например, см. Кеагпеу, ТЕ. е! а1., см. выше и капе, К.О., см. выше).
В схеме, альтернативной вышеописанной схеме с использованием живых трансфицированных клеток Р815, вводили внутрибрюшинную инъекцию 1-5х106 облученных трансфицированных клеток каждые 2-3 недели. В этой схеме у животных не развивался асцит, и они не погибали. В этом случае, проводили мониторинг животных на нейтрализующую иммунную реакцию в ответ на Ш-22КА в их сыворотке, как описано выше, при этом брали кровь, начиная со второй иммунизации. После того как титры нейтрализующих антител достигали максимального уровня, мышам с наибольшими титрами, перед слиянием, внутрибрюшинно инъецировали 5х106 облученных клеток, и через четыре дня селезенку и лимфоузлы, взятые у этих мышей, собирали и использовали для генерирования гибридомы, например, с использованием мышиных миеломных клеток (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или других соответствующих клеточных линий в соответствии со стандартными методами, известными специалистам (например, см. Кеагпеу, ТЕ. е! а1., см. выше и капе, К.О., см. выше).
В. Скрининг гибридом на антитела, связывающиеся с £к-22КА и ингибирующие связывание Ш-22 с Ш-22КА
Две различных процедуры предварительного скрининга осуществляли на гибридомных супернатантах через 8-10 дней после слияния. Для проведения первого анализа антитела в супернатантах тестировали на их способность связываться с планшетом, связанным с растворимым человеческим белком Ш22КА-тиЕс, посредством ЕЫ8А с использованием легкой цепи ПХ-конъюгированного козьего антитела против каппа- и лямбда-цепи мышиного антитела, т.е. реагенов второй стадии, для идентификации связанных мышиных антител. Для подтверждения специфичности к Ш-22КА-части белка I^-22КА-тиЕс, позитивные супернатанты в предварительном анализе оценивали на нерелевантный белок, связанный с той же самой Ес-областью мышиного антитела (тС2а). Антитела в тех супернатантах, которые связывались с Ш-22КА-тиРс и не связывались с гибридным белком, содержащим нерелевантный тиЕс, рассматривались как специфичные по отношению к Ш-22КА. Во втором анализе антитела во всех гибридомных супернатантах оценивали посредством ЕЫ8А на их способность ингибировать связывание био
- 88 009026 тинилированного человеческого Ш-22 с планшетом, связанным с Ш-22КА-тиРс.
Все супернатанты, содержащие антитела, которые специфически связываются с Ш-22КА, независимо от того, ингибируют ли они связывание Ш-22 с Ш-22КА или нет в ЕЫ8А-анализе, тестировали на их способность ингибировать связывание (и одновременно пропролиферирующее действие) Ш-20 или Ш-22 с I^-22КΛ/I^-20КВ- и Ш-22КА/СКР2-4-трансфицированными клетками ВаР3, соответственно. Все супернатанты, которые были позитивными по нейтрализации либо в анализе на ингибирование Ш-22, либо в анализах на ингибирование обоих Ш-20 и Ш-22, затем оценивали на их способность окрашивать Ш-22КА-трансфицированные клетки ВаР3 по сравнению с нетрансфицированными клетками ВаР3 в РАС8-анализе. Этот анализ был разработан для подтверждения того, что ингибирование связывания Ш22 с Ш-22КА/СКВ2-4 или ингибирование связывания Ш-20 с I^-22КΛ/I^-02КВ, действительно осуществляется антителом, которое специфически связывается с рецептором Ш-22КА. Кроме того, поскольку РАС8-анализ был проведен с использованием реагента второй стадии, т.е. антитела против ΙβΠ то позитивные результаты специфического РАС8-анализа указывают на то, что нейтрализующее антитело, вероятно, относится к классу ΙβΟ. Таким образом, квалифицированным специалистом было с уверенностью идентифицировано, что связанный Ш-22КА в связанном ЕЬША-планшете, ингибировал связывание Ш-22 с Ш-22КА в ЕЫ8А-анализе на ингибирование, блокировал взаимодействие Ш-20 и Ш-22 с Ш22КΛ/I^-20КВ и I^-22КΛ/СКР2-4-трансфицированными клетками ВаР3 (пример 28), соответственно, и давал положительный результат с ярким окрашиванием обоих Ш-22КА/Ш-20КВ- и Ш^КА/СИРТМтрансфицированных клеток ВаР3 в присутствии реагентов второй стадии, т.е. антитела против мышиных Ι§0.
Ό. Клонирование специфического анти-Ш-22КА антитела, продуцирующего гибридомы
Гибридомы, продуцирующие анти-Ш-22КА тАЬ, которое перекрестно нейтрализуют связывание Ш-20 и Ш-22 с соответствующим образом трансфицированными клетками ВаР3, клонировали методом стандартного разведения низкой плотности (менее чем 1 клетка на лунку). Приблизительно через 5-7 дней после посева, клоны скринировали с помощью ЕЫ8А на планшете, связанным с Ш-22КА-тиРс, а затем повторно тестировали на позитивные лунки посредством ЕЫ8А на нерелевантный тиРссодержащий гибридный белок, описанный выше. Отобранные клоны, супернатанты которых были связаны с Ш-22КА-тиРс и не связаны с нерелевантным тиРс-содержащим гибридным белком, дополнительно подтверждали на специфическую активность антитела путем повторного проведения анализов на нейтрализацию, а также РАС8-анализа. Все отобранные клоны, позитивные на анти-Ш-22КА антитело, клонировали минимум два раза для гарантии клональности и для оценки стабильности продуцирования антител. Затем проводили дополнительные раунды клонирования и скрининга, как описано выше, до тех пор, пока предпочтительно по крайней мере 95% полученных клонов не были позитивными на продуцирование нейтрализующего анти-Ш-22КА антитела.
Е. Биохимическая характеризация молекулы, распознаваемой анти-Ш-22КА тАЬ
Биохимическое подтверждение того, что молекулой-мишенью Ш-22КА, распознаваемой предполагаемыми анти-Ш-22КА тАЬ, действительно являются Ш-22КА, осуществляли путем стандартной иммунопреципитации с последующим проведением электрофореза в ДСН-ПААГ или Вестерн-блот-анализа, где в обоих анализах использовали растворимые мембранные препараты, выделенные из Ш-22КАтрансфицированных клеток ВаР3 по сравнению с нетрансфицированными клетками ВаР3. Кроме того, растворимые мембранные препараты нетрансфицированных клеточных линий, экспрессирующих Ш22КА, показали, что тАЬ распознают цепь нативного рецептора, а также трансфицированного рецептора. Альтернативно, тАЬ тестировали на их способность к специфической иммунопреципитации или к Вестерн-блоттингу растворимого белка Ш-22КА-тиРс.
Пример 31. Нейтрализация биШ-22КА сывороткой мышей, которым были инъецированы клетки Р815, трансфицированные ЬиШ-22КА
В клеточном анализе на нейтрализацию, описанном в примере 28, добавляли сыворотку, взятую у мышей, которым инъецировали живые биШ-22КА-трансфицированные клетки Р815 (пример 30.А.2.), при серийном разведении 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 и 0%. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 4 дней, и добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, Ш) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 16 ч. Результаты показали, что сыворотка, взятая у четырех животных, могла нейтрализовать передачу сигнала биШ-22 и биШ-20 посредством ЬиШ-22КА.
Так, например, при концентрации 1%, сыворотка, взятая у шести животных (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 и 7117), на 50-80% нейтрализовала пролиферацию, индуцированную биШ-22, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации 1%, сыворотка, взятая у четырех животных (7125, 7127, 7118 и 7117), на 40-70% нейтрализовала пролиферацию, индуцированную биШ-22, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Эти результаты, кроме того, продемонстрировали, что антитела против Ш-22КА действительно могут подавлять активность провоспалительных лигандов, Ш-20 и Ш-22, при низких концентрациях.
- 89 009026
Эти результаты также показали, что эффективное блокирование активности ЕЕ-22КА путем связывания с ΙΕ-20 или с ΙΕ-22 (с одним из них или с обоими), или блокирования, ингибирования, ослабления, подавления или нейтрализации их активности, например, посредством нейтрализующего моноклонального антитела против ЕЕ-22КА настоящего изобретения, может оказаться предпочтительным для снижения эффектов ΙΕ-20 и ΙΕ-22 (одного из них или обоих) ш у1уо и может приводить к снижению ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22-индуцированного воспаления, например, наблюдаемого при ΙΕ-20-индуцированных кожных проявлениях, а также ΙΕ-22-индуцированных кожных проявлениях, например, при псориазе, ВЗК, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцированных ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22, включая ВЗК, артрит, астму, псориазный артрит, колит, воспалительные кожные состояния и атопический дерматит.
Пример 32. Фенотип мышей, дефицитных по ЕЕ-22КА
А. Генерирование мышей, несущих генетические модификации
1. Генерирование трансгенных мышей, экспрессирующих мышиный ΙΕ-20 и дающих потомство с блестящей кожей
a) Конструкция для экспрессии мышиного ΙΕ-20 с промотора К14
Для исследования биологической функции ΙΕ-20 ш у1уо получали трансгенную конструкцию, в которой мышиный ΙΕ-20 находился под контролем человеческого промотора К14 (см. также пример 21). Олигонуклеотиды были сконструированы для генерирования ПЦР-фрагмента, содержащего консенсусную последовательность Козака и область, кодирующую мышиный ΙΕ-20. Эти олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они содержали ЕкеЕсайт у 5'-конца и АксЕсайт у 3'-конца для облегчения клонирования в рК8К14, стандартный трансгенный вектор, содержащий человеческий кератиноцит, и эпителиальный клетко-специфический промотор.
ПЦР-реакции проводили с использованием примерно 200 нг матричного мышиного ΙΕ-20 (8ЕО ΙΌ N0:33), а олигонуклеотиды конструировали для амплификации полноразмерного ΙΕ-20 (8Е0 ΙΌ N0:34). Условия проведения ПЦР-реакции определяли методами, известными специалистам. ПЦР-продукты разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и очищали с использованием набора для гельэкстракции 01а0шск™ (01адеп). Выделенный ДНК-фрагмент нужного размера гидролизовали ферментами Ε^Ι и АкЛ (Воейппдег Маппйет), осаждали этанолом и лигировали в плазмиду рК8К14, предварительно гидролизованную Ε^Ι и АксЕ Плазмида рК8К 14, сконструированная для экспрессии представляющего интерес гена в кератиноцитах и в эпителии трансгенных мышей, содержала экспрессионный кластер, фланкированный человеческим кератин-специфическим промотором К14 размером примерно 3 т. п. н.
Примерно 1 мкл реакционной смеси для лигирования подвергали электропорации в компетентных клетках ЭН 10В Е1ес!гоМах™ (СШС0 ВКЕ, СаййегкЬигд, МО) в соответствии с инструкциями производителей и высевали на планшеты с БВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, а затем инкубировали в течение ночи. Колонии собирали и культивировали в среде БВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Мини-препарат ДНК получали из собранных клонов и скринировали на вставку мышиного ΙΕ-20 путем проведения объединенного гидролиза рестриктирующими ферментами Ε^Ι и АксЕ а затем электрофореза в агарозном геле. ТС-конструкция, содержащая правильные кДНК-вставки, была подтверждена с помощью анализа путем секвенирования. Были также получены макси-препараты конструкции правильная рК8К14-мышиный ΙΕ-20.
b) Генерирование и характеризация К14-ЕЕ-20-трансгенных мышей
Nо!I-фрагмент длиной примерно 4 т.п.н. выделяли из трансгенного (ТС) вектора, содержащего 5'- и 3'-фланкирующие последовательности кератин-специфического промотора К14; мышиный Ш-20 (8Е0 ΙΌ N0:33; полипептид, представленный в 8Е0 ΙΌ N0:34); интрон Согтоп, кДНК Ш-20 и последовательности ро1уА-сигнала человеческого гормона роста. Этот фрагмент был использован для микроинъекции в оплодотворенные мышиные ооциты В6С3Г1 (Тасошс, Сегтап!о^п, ΗΥ). Микроинъекцию и получение трансгенных мышей осуществляли как описано у Нодап В. е! а1., Машри1айпд 111е Мойке ЕтЬгуо, 2пб еб., Со1б 8рппд НагЬог БаЬога!огу Ргекк, ΚΥ, 1994.
Для количественной оценки экспрессии РНК у ТС-животных проводили ОТ-ПЦР-реакцию ТацМап™ с использованием ПЦР-праймеров, специфичных к части последовательности ро1уА-сигнала трансгенного человеческого гормона роста.
Для всех трансгенных (ТС) конструкций, экспрессирующих Ш-20, наблюдался высокий процент паранатальной смертности, а трансгенные детеныши при рождении обычно имели фенотип блестящей кожи. Блестящая кожа новорожденных животных, как наблюдалось, ассоциировалась с жесткостью кожи, такой как если бы она была высушена, что приводило к снижению качества их выкармливания. Их передвижение становилось более затруднительным. Гистопатологический анализ показал, что детеныши с блестящей кожей имели утолщенный эпидермис и плотный кератиновый слой. Большинство из этих детенышей с фенотипом блестящей кожи погибали в течение первых 5 дней, а выжившие детеныши и отъемыши, в основном, не экспрессировали этого трансгена (в соответствии с анализом транскрипта), либо они были химерными (в соответствии с низким уровнем передачи этого трансгена потомству).
Была получена одна линия, экспрессирующая мышиный Ш-20, находящийся под контролем промо
- 90 009026 тора К14. Уровень экспрессии ^-20 в коже и в тимусе был низким, и все новорожденные животные имели фенотип блестящей кожи. В основном, эта линия имела 20% трансгенного потомства, на что указывала гибель 50-60% трансгенных детенышей ш и!его (при гемизиготном скрещивании, 50% потомства должно быть трансгенным).
2. Получение мышей с дефицитом экспрессии ^-22^^ ГО^КА-дефицитные мыши
a) Получение конструкции, дефицитной по мышиному ГО-22КА (КО)
Для дополнительного исследования биологической функции I^-22КА ш угуо получали мышиный штамм, дефицитный по экспрессии I^-22КА (КО). Во-первых, для скрининга библиотеки геномных ВАС мышей 129/8уй использовали кДНК-зонды мышиного I^-22КА. Клоны, содержащие геномный локус ГО22КА, идентифицировали и охарактеризовывали. Мышиный полинуклеотид I^-22КА представлен в 8ЕЦ ГО N0:41, а его полипептид представлен в 8ЕЦ ГО N0:42.
Для создания конструкции, дефицитной по ГО-22КА, получали ГО-22КА-дефицитный вектор методом ЕТ-клонирования (УНапд е! а1., 1998, А №\ν 1од1с Гог ^NА епдшеегшд икшд гесотЫпайоп ш Е.сой. №!. Сепе!. Уо1. 20:123-8). Вкратце, КО-вектор содержал 1,8 т.п.н. 5'-плечо (короткое плечо), селективный маркер IКЕ8-^асΖ/МС1ηео и 10 т.п.н. 3'-плечо (длинное плечо) гена ГО-22КА. В КО-векторе экзоны 2, 3 и 4, а также интроны 2 и 3 геномной последовательности ГО-22КА были заменены селективным маркером IКЕ8-^асΖ/МС1ηео так, чтобы в результате гомологичной рекомбинации в клетках Е8 образовывалась делеция примерно в 4,4 т.п.н.
После линеаризации КО-вектора путем обработки рестриктирующим ферментом Рте! этот вектор подвергали электропорации в клетках 129/8у1Е8. Отбор событий гомологичной рекомбинации, а также идентификацию рекомбинантных клонов Е8 проводили как описано КоЬейкоп Ей. е! а1. Тега!осагсшотак апй ЕтЬгуошс 8!ет Се11к: А Ргас!1са1 Арргоасй, 2пй ей., IК^ Ргекк Ытйей, 0хГогй, 1987.
b) Получение и анализ мышей, дефицитных по экспрессии ГО-22КА
Позитивные клоны Е8, в которых имеется делеция экзонов 2-4 и интронов 2-3 геномного локуса ГО22КА, были размножены. Эти клоны инъецировали в бластоцисты мышей С57ВБ/61. После быстрого повторного размножения бластоцистов с инъецированными клонами, их вводили самкам с ложной беременностью для генерирования химер. Инъекцию бластоцистов, выведение химер и последующую передачу зародышевой линии с мутированным ГО-22КА осуществляли как описано КоЬеПкоп Ей. е! а1. Тега!осагстотак апй ЕтЬгуошс 8!ет Се11к: А Ргасйса1 Арргоасй, 2пй ей., IК^ Ргекк Ытйей, 0хГогй, 1987.
КО-мутантные мыши были идентифицированы с использованием ПЦР-стратегии генотипирования. В мультиплексной ПЦР-реакции использовали три ПЦР-праймера, ΖС22901 (8ЕЦ ГО N0:35), ΖС45039 (8ЕЦ ГО N0:36), ΖС28573 (8ЕЦ ГО N0:37), для детекции аллеля дикого типа и мутантного аллеля. Аллель дикого типа (νΕ) давала ДНК-фрагмент длиной 229 п.н., а мутантная аллель генерировала ДНКфрагмент длиной 371 п.н.
В результате спаривания гемизиготных мышей продуцировалось гомозиготное потомство (НОМ), гетерозиготное потомство (Не!) и потомство дикого типа (νψ) в нормальном соотношении, а также с нормальным соотношением полов. Осмотр мышей путем физиоскрининга (общая масса тела, масса ткани, полный клинический анализ крови (СВС), клинический биохимический анализ, макроскопическое исследование и гистопатологический анализ) не выявил заметных различий между НОМ-, Не!- и νΓживотными.
B. ГО-22КА необходим для ГО-22-индуцированного 8АА: ЕЫ8А-анализ на 8АА обнаружил, что ГО22-индуцированная экспрессия 8АА отсутствует у мышей, дефицитных по ГО-22КА
Для того чтобы определить, является ли ГО-22КА необходимым для индуцирования 8АА у мышей, которым инъецировали ГО-22, ГО^КА-дефицитным мышам инъецировали 5 мкг ГО-22 и у этих мышей через 6 ч брали кровь.
Для определения уровней 8АА в пробах сыворотки проводили ЕЫ8А с использованием набора для иммуноанализа 8АА у мышей (Вю8оигсе Iη!е^ηа!^оηа1, СайГогша) в соответствии с инструкциями производителей при разведении сыворотки 1:1000. У четырех из пяти мышей VТ наблюдалось увеличение уровней 8АА в ответ на инъекцию ГО-22, а у четырех из пяти дефицитных по ГО-22КА мышей НОМ обнаруживались базальные уровни 8АА. У протестированных дефицитных по ГО-22КА мышей Не! наблюдалось увеличение уровней 8АА, но это увеличение уровней 8АА было ниже, чем у мышей νΕ Это указывало на то, что ГО-22КА необходим для ГО-22-опосредуемого индуцирования 8АА.
Эти результаты подтвердили, что эффективное блокирование активности ГО-22КА, например, благодаря отсутствию гена ГО-22КА, или аналогичным образом, благодаря присутствию нейтрализующего моноклонального антитела против ГО-22КА настоящего изобретения, будет, аналогичным образом, приводить к снижению ГО-22-индуцированного воспаления, например, при псориазе, ВЗК, колите, эндотоксемии или при других воспалительных заболеваниях, индуцированных ГО-22.
C. ГО-22КА необходим для ГО-22-индуцированного утолщения эпителия: введение чистого белка ГО22 посредством осмотического мини-насоса, имплантированного подкожно, не приводит к утолщению эпидермиса у ГО^К-дефицитных мышей
Для того чтобы определить, является ли ГО-22КА необходимым для ГО^-индуцированного утолщения эпителия, ГО-22 подкожно вводили дефицитным по ГО-22КА НОМ- и VТ-мышам с помощью ос
- 91 009026 мотических мини-насосов. Эти насосы доставляли П ,-22 со скоростью 18,4 мкл в день в течение 7 дней. Четырем дефицитным по П ,-221^.2. мышам НОМ и шести дефицитным по П ,-221^.2. мышам кТ вводили белок !Б-22, а 3 мышам НОМ и 1 мыши кТ вводили РВ8.
Пробы сыворотки от !Б-22-обработанных мышей тестировали в анализе на пролиферацию ВаЕ3 для подтверждения присутствия П.-22. Для пролиферации клеткам ВаЕ3, трансфицированным IБ-22КА и СКЕ2-4, требовалось присутствие либо П.-22, либо мышиного П.-3. Эти клетки центрифугировали и промывали в полной среде без тБ^ (в среде КРМ! (1КН Вюкс1епсе Шс., Бепеха, К8)), в которую были добавлены 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка, 2 мМ Б-д1и!аМах-1 ™ (ΟίΙκο ВКБ), 1 мМ пирувата натрия (ΟίΙκο ВКБ) и антибиотики Р8N (ОШСО ВКБ) (далее называемой средой без ШЬ-3). Затем клетки центрифугировали и 3 раза промывали для гарантии удаления тП,-3. После этого клетки подсчитывали в гемацитометре и высевали в 96-луночный планшет при плотности 5000 клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл на лунку с использованием среды без тП^. Мышиная сыворотка присутствовала в лунках в концентрации 1, 0,5, 0,25 или 0,125%. Планшеты для анализа инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 3 дней, а затем добавляли аламаровый синий (Асситеб, СШса^, Ш) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 24 ч. Аламаровый синий позволяет считывать флуориметрические данные исходя из числа живых клеток, и, таким образом, его использование позволяет непосредственно определить уровень пролиферации клеток по сравнению с негативным контролем. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 24 ч. Планшеты считывали на счетчике ка11ас ХлсЮг 2 1420 Ми1!11аЬе1 ΓοιιιιΑτ (ка11ас, Тигки, Ет1апТ), работающем на длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (излучение). Результаты показали, что у всех животных, которым вводили РВ8, активность П ,-22 отсутствовала, а у 1 животного Не!, у 2 из 4 животных НОМ и 3 из 6 животных кТ наблюдалась детектируемая активность П.-22. Пролиферация, индуцированная этой сывороткой, блокировалась присутствием 1 мкг/мл !Б-22ВР, что подтверждало специфичность к П ,-22.
Образцы кожи, взятые у !Б-22-обработанных и у необработанных IБ-22 К/\-дефи1 ι,μτι 1ых мышей НОМ и Не!, и у контрольных мышей дикого типа, фиксировали путем погружения в 10%-ный забуференный формалин. Ткани подравнивали, заливали в парафин, подвергали рутинной обработке и приготавливали срезы по 5 мкм (.Ешь 2065 8ирегси! тКгоЮте, БеКа М1сгокук!етк, кеШаг, Оегтапу), а затем окрашивали реагентом Н&Е. Окрашенные ткани были оценены под оптическим микроскопом (ΝίΕοιι ЕсКрке Е600, ΝίΚοιι !пс., Ме1уШе, ΝΥ) ветеринаром-патологом, имеющим разрешение Регуляторных органов АСVР.
Каждый образец кожи оценивали по шкале оценок 0 (отсутствие поражения) - 4 (тяжелое поражение) на тяжесть воспаления в ткани, находящейся рядом с участком имплантации насоса в гиподермисе, по шкале оценок 0 (отсутствие поражения) - 3 (диффузное поражение) на степень утолщения эпидермиса (акантоз), и число эпителиальных слоев подсчитывали в самой плотной части эпидермиса. У мышей НОМ и у мышей кТ, которым вводили РВ8, каких-либо различий не наблюдалось. Результаты, полученные для двух этих групп, объединяли в одну РВ8-группу. Среднее и стандартное отклонение определяли для каждой группы обработки и полученные данные приводятся ниже в табл. 14.
Таблица 14
Обработка РВЗ-контроль НОМ-КО:1Ъ-22 ИТ:1Ь-22
Число мышей 4 4 6
Утолщение эпителия 3,5±1,0 3,2±0,5 5,9+2,3
Степень акантоза 0,5±1,0 0,2±0,5 1,9±1,3
Воспаление 1,5+1,0 1,2±1,0 2,0±1,0
Результаты показали, что у мышей кТ, обработанных !Б-22, наблюдалась тенденция к увеличению толщины эпителия и к развитию акантоза, тогда как у !Б-22КА-НОМ-мышей, обработанных !Б-22, наблюдалось снижение толщины эпителия и снижение степени акантоза.
Эти результаты подтвердили, что эффективное блокирование активности !Б-22КА, например, благодаря отсутствию гена I^-22КΛ, или, аналогичным образом, благодаря присутствию нейтрализующего моноклонального антитела против П .-ЗЗЕА настоящего изобретения, будет, аналогичным образом, приводить к снижению !Б-22-индуцированных кожных проявлений, например, при псориазе, ВЗК, колите или при других воспалительных заболеваниях, индуцированных !Б-22.
Ό. I^-22КΛ необходим для !Б-20-индуцированного фенотипа блестящей кожи у новорожденных
Перекрестное скрещивание трансгенных мышей, экспрессирующих мышиный !Б-20, с дефицитной по !Б-22КА мышью приводит к рождению трансгенного потомства, не имеющего фенотипа блестящей кожи
Для того чтобы определить, является ли П,-221^ необходимым для появления !Б-22индуцированного фенотипа блестящей кожи у новорожденных трансгенных мышей, К14-ти!Б-20трансгенных мышей скрещивали с дефицитной по !Б-22КА линии мышей, и новорожденных мышей исследовали на фенотип блестящей кожи.
- 92 009026 мышат рождались с менделевским отношением генотипов. Все трансгенные мыши по сравнению с КО-фенотипом Не! имели блестящую кожу, но не один из нетрансгенных и трансгенных мышат с КО-фенотипом НОМ не имели блестящей кожи.
Анализ на пролиферацию клеток ΒаЕ3, экспрессирующих ΙΙ,-201^.-3 и ΙΕ-20ΗΒ, с окрашиванием аламаровым синим, проводили для детекции присутствия ΙΕ-20 в мышиной сыворотке. Эти клетки пролиферируются в ответ на присутствие ΙΕ-20 или мышиного П,3. Данную процедуру проводили как описано выше в разделе С. Результаты этого анализа показали, что все трансгенные мыши имели сравнимую активность ΙΕ-20 и такой же уровень ΙΕ-20, как и у трансгенных мышей с фенотипом С57НИ 6\. Отсутствие у всех новорожденных мышей фенотипа блестящей кожи указывает на то, что такой фенотип зависит от присутствия Ш^КА. Анализ на пролиферацию показал, что все трансгенные мыши имеют сравнимую активность ΙΕ-20 и такой же уровень ΙΕ-20, как и у трансгенных мышей с фенотипом С57К1,6% Отсутствие у всех новорожденных мышей фенотипа блестящей кожи указывает на то, что такой фенотип зависит от присутствия Ш^КА.
На третий день после рождения (рок! раг!ит), мышата из помета, содержащего К14 шиI^-20-ТС с Ш^КА-КО-фенотипом, подвергали гуманной эвтаназии и все тело фиксировали путем погружения в 10%-ный забуференный формалин. Фиксированные ткани грудной клетки и брюшины осторожно иссекали для получения поперечных срезов, заливали в парафин, подвергали рутинной обработке и приготавливали срезы по 5 мкм (.Ищу 2065 Зирегси! ш1сго!оше, Ье1са М1сгокук!ешк, Vе!ζ1а^, Сегтапу), а затем окрашивали реагентом Н&Е. Окрашенные ткани были оценены слепым методом под оптическим микроскопом (Мкоп Есйрке Е600, Мкоп Шс., МеМ11е, NΥ) ветеринаром-патологом, имеющим разрешение Регуляторных органов АСУР. Затем выявляли патологии в тканях и подсчитывали число эпителиальных слоев в эпидермисе дорсальной тыльной стороны грудной клетки.
Ткани трех трансгенных ΙΕ-20-мышей с Ш^КА-КО-фенотипом НОМ (ТС ^-20/^-22^^0 НОМ) и трех нетрансгенных мышей с Ш^КА-КО-фенотипом НОМ (не-ТС/I^-22КА-КО-НОΜ) подвергали анализу под микроскопом, который не обнаруживал никаких патологий. Также оценивали ткани двух трансгенных ΙΕ-20-мышей с Ш^КА-КО-фенотипом Не! (ΙΕ-20 ТС/Ш^КА КО Не!). Число эпителиальных слоев в эпидермисе у всех животных было одинаковым. Однако эпидермис у двух мышей ΙΕ20 ТС/Ш^КА КО Не! содержал избыточное количество эозинофилов по сравнению с другими животными, и не имел гранулярности в зернистом слое. Каких-либо аномалий на коже или в других тканях всех этих мышей не наблюдалось.
Эти результаты показали, что эффективное блокирование активности Ш^КА, например, благодаря отсутствию гена Ш^КА, или аналогичным образом, благодаря присутствию нейтрализующего моноклонального антитела против ]Ь-22КА настоящего изобретения, будет, аналогичным образом, приводить к ослаблению ΙΕ-20-индуцированных кожных проявлений, а также ΙΕ-22-индуцированных кожных проявлений, например, при псориазе, ВЗК, колите или при других воспалительных заболеваниях, индуцированных ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22, включая ВЗК, артрит, астму, псориазный артрит, колит, воспалительные кожные состояния и атопический дерматит.
Пример 33. Гистоморфометрический визуализирующий анализ Ш^КА-дефицитных мышей
Была получена линия к14-I^-20ш-трангсенных (ТС) мышей и было обнаружено, что трансгенные новорожденные мыши имели фенотип блестящей кожи. Этот трансген экспрессируется под контролем промотора к14, который направляет экспрессию в кератин-продуцирующие клетки кожи. Также была получена линия дефицитных по Ш^КА (КО) мышей, при этом у мышей, не подвернутых антигенной стимуляции, каких-либо значимых изменений не наблюдалось. Эти две линии скрещивали, в результате чего рождались животные, имеющие нижеследующие четыре различных генотипа: (1) ТС/Н0М, экспрессирующий К144Е-20ш трансген с фенотипом, не экспрессирующим Ш^КА; (2) ТС/Не!, экспрессирующий К14-П.-20т трансген с фенотипом, экспрессирующим несколько Ιк-22КА из одной копии гена Ш^КА; (3) VТ/НОΜ, не экспрессирующий к144Е-20ш трансген с фенотипом, не экспрессирующим Ш^КА; и (4) VТ/Не!, не экспрессирующий к144Е-20ш трансген с фенотипом, экспрессирующим несколько Ш^КА из одной копии гена Ш^КА. Тридцать четыре новорожденных детеныша с указанными различными генотипами подвергали эвтаназии на день 3, приблизительно через 48 ч после рождения (табл. 15)
Таблица 15
ТС/-НОМ* (группа 1) ТС/-Неб* (группа 2) пт/ном* (группа 3) ИТ/Неб* (группа 4)
Всего п=1 п=10 п=9 п==5
ТС=трансгенные; VТ=дикого типа; Н0М=гомозиготные; Не!=гетерозиготные; п=число детенышей Тело каждого детеныша поперечно рассекали на три части (краниальный отдел грудной клетки, каудальный отдел грудной клетки и брюшина), а голову отбрасывали. Образцы тканей толщиной 4,0-5,0 мм фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, заливали в парафиновые блоки и окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для проведения рутинного гистологического анализа и визуа
- 93 009026 лизирующего гистоморфометрического анализа. Эпидермис дорсальной области спинного мозга в каждом образце ткани отбирали для визуализирующего гистоморфометрического анализа, проводимого с использованием микроскопа 01утриз ВН-2, видеокамеры (^аде-ΜΊI, М1сй1даи С1!у, Ш) и компьютерной программы Β^ο^иаи! Тгие Со1ог V^ибο\ 98 (К&М Вюте!псз, Ыс. ^з^Ше, ΊΝ 37209) со следующими данными: параметр: 10х увеличение, Ζ принимают равным 0; Массив: длина (мкм); измерение: в ручном и аддитивном режиме. Толщину эпидермиса (мкм) и рогового слоя или ороговевшего слоя от каждого образца кожи отдельно измеряли 10 раз с интервалом примерно 0,1 мм между каждым измерением, в каждом поле 10х микроскопа, а средняя величина, стандартное отклонение и ст.ош.средней были получены путем вычисления в Ехсе1. Все срезы были рандомизированы и измерены слепым методом. После измерений, срезы были оценены неслепым методом, и результаты соответствовали группе обработки. Конечные результаты для группы обработки разделяли на следующие классы: 1. Средняя толщина эпидермиса (мкм) в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине; а затем на подклассы: (а) средняя толщина эпидермиса в краниальном отделе грудной клетки; (Ь) средняя толщина эпидермиса в каудальном отделе грудной клетки; и (с) средняя толщина эпидермиса в брюшине 2. Средняя толщина рогового слоя (мкм) в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине, а затем на подклассы: (а) средняя толщина рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки; (Ь) средняя толщина рогового слоя в каудальном отделе грудной клетки; и (с) средняя толщина рогового слоя в брюшине. 3. Средняя толщина эпидермиса+рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине. Полученные данные анализировали с использованием компьютерной программы СгарйРаб Ιπ8ΗιΙ (РгарйРаб 8оГ!\аге, ^с., 8аи Бхедо, СА 92121). Для оценки статистической значимости различий средних величин для групп 1-4 проводили односторонний дисперсионный анализ (ΑNОVΑ). Для определения статистически значимости различий средних величин для двух групп (*Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001; ****Р<0,0001) использовали критерий множественного сравнения Тьюки-Крамера. Наблюдения р<0,05 рассматривались как статистически значимые.
(1) Результаты гистоморфометрического анализа (а) Средняя толщина эпидермиса (мкм) в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине.
Толщина эпидермиса значительно увеличивалась у ΙΕ-20-трансгенных детенышей, у которых отсутствовала одна копия гена П.^КА (ТС/-Не!), по сравнению с ΙΕ-20-трансгенными детенышами, у которых не экспрессировался ^-22^ (ТС/-Н0М, Р=0,001***) и по сравнению с контрольным пометом ^Т/Н0М, Р=0,001*** и VΊ/Не!, Р=0,001***) соответственно (табл. 16). У ТС/-Не!-детенышей толщина некератинизированного эпидермиса увеличивалась, что, вероятно, обусловлено гипертрофией кератиноцитов. Это увеличение может затрагивать все три некератизированных слоя (базальный, шиповидный и зернистый), но в большинстве случаев, это относится к шиповидному клеточному слою. Толщина эпидермиса ТС/-Не!-детенышей увеличивалась примерно на 25% и преобладающим становился шиповидный слой. Хотя эпидермис ТС/-НОМ-детенышей был слегка толще, чем эпидермис контроля (ν'Γ110М и VΊ/Не!), однако, никаких статистически значимых различий между этими группами не обнаруживалось (р>0,05). Также проводили сравнение толщины эпидермиса в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине. Обычно тонкий эпидермис брюшины был толще, чем эпидермис каудальной области грудной клетки, а каудальная область грудной клетки была толще, чем эпидермис краниальной области грудной клетки (табл. 16).
Таблица 16
ТС/-НОМ (N=28) ТС/-НеЬ (N=30) ИТ/НОМ (N=27) ИТ/НеЬ (N=15)
Среднее 32,58±1,25 41,05±2,04 31,31± 1,0 8 30,83±1,43
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; N число измеренных срезов.
Наблюдалось увеличение толщины плоского эпителия кожи в краниальном отделе грудной клетки ТС/-Не!-детенышей, которое сопровождалось значительным увеличением эпидермальных клеток (кератиноцитов), однако, никакого статистически значимого различия по сравнению с другими группами ТС/Н0М, VΊ/НОΜ и VΊ/Не! (Р=0,1565, табл. 17) не обнаруживалось. Очевидно это обусловлено либо гистологическим артефактом, например, вариабельностью срезов, природной архитектурой эпидермиса или полным отсутствием эффекта в тонкой коже в краниальном отделе грудной клетки. Примечание: процедура гистологического анализа или срезы ткани краниального отдела грудной клетки могут быть непригодными для оценки статистической значимости в гистоморфометрическом анализе.
- 94 009026
Таблица 17
ТС/-НОМ (N=10) ТС/-НеГ (N=10) ИТ/НОМ (N=9) ИТ/НеЬ (N=5)
Среднее 29,18±2,24 33,20±2,24 27,28±0,62 29,38±1,77
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; Ы=число измеренных срезов.
Фенотип Ш-20 (ТС/-) с одной копией гена Ш-22КА (Не!) обнаруживал более высокое среднее значение толщины эпидермиса по сравнению с фенотипом ТС/-Н0М (р<0,05*), VТ/Н0М (р<0,001***) и νΈ/Не! (р<0,01*) соответственно (табл. 18). Статистический анализ показал исключительно высокую значимость для этих групп (р<0,0001****). Толщина эпидермиса ТС/-Не! увеличивалась примерно на 29% по сравнению с νί/Не!. Фенотип Ш-20 (ТС/-)-детенышей, у которых отсутствовал Ш-22КА (НОМ) частично совпадал с фенотипом детенышей, у которых отсутствовала одна копия гена Ш-22КА (Не!), что ассоциировалось с более толстым эпидермисом, чем у контрольного помета ^Т/Н0М и ^№Т/Не!), однако, какой-либо статистической значимости по сравнению с контролем (р>0,05) не наблюдалось. Толщина эпидермиса ТС/-Н0М увеличивалась примерно на 14% по сравнению с ^№Т/Н0М. В отличие от (Ш-20ТС/-)-детенышей, у детенышей, дефицитных по рецептору Ш-22КАш (№Т/Н0М и ^№Т/Не!), наблюдалось относительное уменьшение толщины эпидермиса. Примечательно, что результат гистоморфометрического анализа на толщину эпидермиса в каудальном отделе грудной клетки четко коррелировал со средней толщиной эпидермиса в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине (табл. 15), что указывало на то, что качество проведения гистологической процедуры и получения срезов тканей из каудального отдела грудной клетки было в высокой степени достаточным для осуществления гистоморфометрического визуализирующего анализа.
Таблица 18
ТС/-НОМ (N=10) ТС/-НеЬ (N=10) ПТ/НОМ (N=9) ИТ/НеЬ (N=5)
Среднее 35,91±1,37 43,79±2,35 30,83±1,86 30,94+2,83
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; Ы=число измеренных срезов.
Результаты, полученные для средней толщины эпидермиса в брюшине (табл. 19), были аналогичны результатам, полученным для каудального отдела грудной клетки (табл. 18), за исключением того, что у ТС/-Н0М не наблюдалось каких-либо различий по сравнению с контрольным пометом (ШТН0М и ШТ11е(, р>0,05). При этом, в срезах тканей наблюдалась некоторая вариабельность, а два среза оказались непригодными, т.е. в них отсутствовал эпидермис, покрывающий дорсальную область у ТС/-Н0М-группы.
Таблица 19
ТС/-НОМ (N=8) ТС/-НеЕ (N=10) ит/ном (N=9) ИТ/НеЪ (N=5)
Среднее 32,35±1,44 46,33±3,10 35,81±1,90 32,16+2,97
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; Ы=число измеренных срезов.
(Ь) Средняя толщина (мкм) рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине
Несмотря на увеличение толщины эпидермиса у Ш-20-трансгенных детенышей (ТС/-) с фенотипом, либо не экспрессирующим Ш-22КА (НОМ), либо экспрессирующим одну копию гена (Не!), в коже животных ТС/-Н0М и ТС/-Не! преимущественно наблюдалось уменьшение толщины рогового слоя или ороговевшего слоя по сравнению с контрольным пометом (ШТН0М и VТ/Не!) и статистический анализ показал исключительно высокую значимость для этих групп (р<0,0001****, табл. 20). У ТС/-Не!детенышей наблюдалось примерно 36%-, 50%- и 49%-ное снижение количества кератина на поверхности эпидермиса по сравнению с ТС/-Н0М (р<0,01**), VТ/Н0М (р<0,001***) и VТ/Не! (р<0,001***) соответственно. У ТС/-Н0М-детенышей наблюдалось примерно 22%-ное значимое уменьшение толщины рогового слоя по сравнению с контролем (№Т/Н0М, р<0,05*) и лишь 17%-ное снижение по сравнению с 1№Т/Не!, что указывало на отсутствие статистической значимости (р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных детенышей, ^№Т/Н0М и 1№Т/Не!, была примерно одинаковой. Очевидно, что роговой слой в каудальном отделе грудной клетки был толще, чем в брюшине, а роговой слой брюшины был толще, чем в краниальном отделе грудной клетки.
Таблица 20
ТС/-ном (N=8) ТС/-НеЬ (N=10) ИТ/НОМ (N=9) ИТ/НеЬ (N=5)
Среднее 33,26±2,69 21,41±1,27 42,54±2,01 40,31+3,82
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; Ы=число измеренных срезов.
- 95 009026
Средняя толщина рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки (табл. 21) совпадала с толщиной рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине (табл. 20), однако, значимое уменьшение толщины рогового слоя наблюдалось только у ТС/Не!-детенышей по сравнению с ТС/-Н0М (р<0,05*) и по сравнению с \Т/Н0М (р<0,01**) соответственно. Стандартное отклонение и стандартная ошибка среднего имели высокое значение, что могло быть обусловлено плохими срезами, отсутствием образцов кожи, природной архитектурой эпидермиса или полным отсутствием эффекта в краниальном отделе грудной клетки. Примечание: процедура гистологического анализа или срезы ткани краниального отдела грудной клетки могут быть непригодными для получения качественного результата в гистоморфометрическом анализе.
Таблица 21
ТС/-НОМ (N=28) ТС/-НеС (N=30) ИТ/НОМ (N=26) ИТ/НеС (N=14)
Среднее 34,96±3,53 18,14±3,99 40,47±4,38 32,96+8,11
Результаты представлены как среднее±ср.ош.средней; N=число измеренных срезов.
Результат, полученный для средней толщины рогового слоя в каудальном отделе грудной клетки (табл. 22), был аналогичен результату, полученному для рогового краниального отдела грудной клетки, каудального отдела грудной клетки и брюшины, за исключением трех случаев: (1) у ТС/-НОМдетенышей, по сравнению с ТС/-Не! и у ТС/-НОМ-детенышей, по сравнению с \Т/Н0М, не наблюдалось статистически значимых различий (Р>0,05); (2) у ТС/-НОМ-детенышей, по сравнению с \Т/Не!, наблюдалось значимое различие (Р<0,01**); (3) роговой слой у \Т/Не! был заметно толще, что может быть следствием образования артефакта при обработке ткани, например, набухания или увеличения кератина при помещении образца в гипотонический раствор или при его слишком долгом хранении в водяной бане.
Таблица 22
ТС/-НОМ (N=10) ТО/-НеС (N=10) ИТ/НОМ (N=8) ИТ/НеС (N=4)
Среднее 35,64±3,4 24,22±1,54 44,35±3,51 53,77+7,21
Результаты представлены как среднее±ср.кв.ош.; N число измеренных срезов.
Статистически значимое различие, Р<0,05* и Р<0,001***, наблюдалось только у ТС/-Н0М по сравнению с \Т/Н0М и у ТС/-Не! по сравнению с \Т/Н0М соответственно (табл. 23). У (ТС/-)-детенышей наблюдалось уменьшение толщины рогового слоя в брюшине по сравнению с контрольным пометом (\Т/Н0М и \Т/Не!).
Таблица 23
ТС/-НОМ (N=8) ТС/-НеС (N=10) ИТ/НОМ (N=9) ИТ/НеС (N=4)
Среднее 28,84±4,36 21,86±1,30 42,45±3,15 33,25+3,96
Результаты представлены как среднее±ср.кв.средней; N=число измеренных срезов.
(с) Средняя толщина (мкм) эпидермиса+рогового слоя в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине
У ТС/-Не!-детенышей наблюдалось значимое увеличение толщины эпидермального слоя и значимое уменьшение толщины рогового слоя по сравнению с контрольным пометом (\Т/Н0М и \Т/Не!), а для ТС/-НОМ-детенышей был получен аналогичный результат, но с минимальным эффектом (табл. 24) Таблица 24
ТС/-НОМ (N=10) ТО/-НеС (N=10) ИТ/НОМ (N=9) ИТ/НеС (N=4)
Роговой 32,58 41,05 31,31 30,83
слой
Эпидермис 33,26 21,41 42,54 40,31
Результаты представлены как среднее N=число детеиышей (б) Передача Г^-20-сигиала посредством ГБ-20КА и ГБ-22КА
Эпидермис представляет собой многослойный постоянно обновляющийся эпителий в зависимости от баланса событий пролиферации клеток, дифференцировки клеток и гибели клеток в процессе гомеостаза. В нормальном эпидермисе митотически активный базальный слой способствует терминальной дифференцировке кератиноцитов, которые мигрируют за пределы этого слоя и в конечном счете слущиваются с поверхности кожи в виде слущенных роговых чешуек, причем кератиновый или ороговевший
- 96 009026 слой находится в роговом слое. Хотя известно, что функция многих белков заключается в поддержании эпидермального гомеостаза, однако, механизм молекулярной координации этих событий пока точно не известен. Ш-20 представляет собой новый взаимодействующий с рецептором белок, и этот белок передает сигналы посредством либо рецептора I^-20КА, либо рецептора Ш^КА (Ш^КА), экспрессирующегося в слое кожи, ассоциированном с пролиферацией кератиноцитов. У ΙΕ-20-трансгенных новорожденных животных наблюдалось аномальное утолщение кожи, и эти животные имели фенотип блестящей кожи. Мыши, дефицитные по Ш^КАт (НОМ), не обнаруживали ответа на введение Ш-22, тогда как у мышей дикого типа с геном I^-22КА и у мышей, обработанных Ш-22, наблюдалось значительное увеличение толщины эпидермиса (р<0,001***, см. результаты гистоморфометрического анализа, полученные для Ш^КАт-КО/Ш^, РГО 59,2). Для того чтобы определить, оказывает ли отсутствие Ш^КА влияние на фенотип блестящей кожи, наблюдаемый у трансгенных новорожденных К14-I^-20т-животных, трансгенных мышей, эктопически экспрессирующих Ш-20, скрещивали с гомозиготными (НОМ) или гетерозиготными (Не!) мышами, дефицитными по Ш-22КА. Количественный визуализирующем анализ для определения толщины эпидермального слоя предварительно осуществляли на меньшем числе детенышей в каудальном отделе грудной клетки (т.е. у 19 детенышей, 1 срез на одного детеныша, всего 19 срезов), но, при этом, статистически значимые результаты не были получены, что обусловлено ограниченным числом исследуемых животных и вариабельностью групп. Целью проведения данных исследований является гистоморфометрическая оценка большего числа образцов кожи в краниальном отделе грудной клетки, в каудальном отделе грудной клетки и в брюшине для каждого детеныша в одном и том же эксперименте (т.е. 34 детеныша, 3 среза на одного детеныша, всего 102 среза), для определения биологической функции Ш-20 или для получения надежных количественных результатов. Для проведения эффективного визуализирующего анализа, авторы сначала убедились, что ориентация кожи в парафиновом блоке была правильной, и что образцы кожи были измерены в тех же самых соответствующих участках у всех отдельных детенышей и у групп детенышей. Измерения были проведены двумя способами:
(1) толщину эпидермиса измеряли 10 раз на 10/ поле микроскопа для каждого образца кожи, причем каждый эпидермис брали из дорсального отдела спинного мозга, для исследования роли ΙΣ-20 в опосредовании пролиферации и дифференцировки кератиноцитов; (2) толщину ороговевшего слоя или рогового слоя измеряли аналогичным образом для выявления корреляции полученных результатов с фенотипом блестящей' кожи у ΙΣ-20-трансгенных новорожденных животных.
Гистоморфометрический визуализирующий анализ толщины эпидермиса выявил, что новорожденные ТС/-Не!-животные, экспрессирующие к14-I^-20т-трансген с фенотипом, экспрессирующим несколько Ш^КА из одной копии гена Ш^КА, обнаруживали утолщение эпидермиса, а новорожденные ТС/-НОМ-животные, экспрессирующие к14-I^-20т-трансген с фенотипом, не экспрессирующим ΙΣ22КА, не обнаруживали каких-либо значимых изменений. Толщина эпидермиса значительно увеличивалась у ΙΕ-20-трансгенных детенышей, у которых отсутствовала одна копия гена Ш^КА (ТС/-Не!) по сравнению с ΙΕ-20-трансгенными детенышами, у которых отсутствовали обе копии гена Ш^КА (ТС/НОМ, Р=0,001***) и по сравнению с контрольным пометом (АТ/НОМ, Р=0,001*** и АТ/Не!, Р=0,001***). У ТС/-Не!-детенышей обнаруживалось увеличение толщины некератинизированного эпидермиса, что, главным образом, обусловлено гипертрофией кератиноцитов в шиповидном слое. Толщина эпидермиса у ТС/-Не!-детенышей увеличивалась примерно на 25%, а толщина эпидермиса у ТС/-НОМдетенышей была несколько больше, примерно на 4-5% по сравнению с контролем (АТ/НОМ И АТ/Не!), и никаких статистически значимых различий между ТС/-НОМ и контролем АТ/НОМ не обнаруживалось (р>0,05).
Результаты гистоморфометрического анализа, полученные для рогового слоя, показали, что несмотря на утолщение эпидермиса у ТС/-Не!-новорожденных животных, наблюдалось значительное уменьшение количества кератина или толщины ороговевшего слоя в коже ТС/-НОМ и ТС/-Не! по сравнению с контрольным пометом (АТ/НОМ И АТ/Не!) и статистический анализ показал исключительно высокую значимость для этих групп (р<0,0001****). У ТС/-Не!-детенышей наблюдалось примерно 36%-, 50%- и 49%-ное снижение количества кератина на поверхности эпидермиса по сравнению с ТС/-НОМ (р<0,01**), АТ/НОМ (р<0,001***) и АТ/Не! (р<0,001***) соответственно. У ТС/-НОМ- детенышей наблюдалось примерно 22%-ное значимое уменьшение толщины рогового слоя по сравнению с контролем (АТ/НОМ, р<0,005*) и лишь 17%-ное снижение по сравнению с АТ/Не! (р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных детенышей, АТ/НОМ и АТ/Не!, была примерно одинаковой. Снижение средней толщины рогового слоя у новорожденных ТС/-НОМ и ТС/-Не!-животных, очевидно, коррелировало с общими данными, полученными для рогового слоя, где при общем уровне Ш-20 у (ТС)/Ш-22КА (Не!)новорожденных животных наблюдалось снижение числа новорожденных с фенотипом блестящей кожи (т.е. с низким уровнем кератина), так называемой светлой кожей, тогда как Ш-20 (ТС)/Ш-22КА (НОМ)новорожденные не имели блестящей кожи (например, они имели большее количество кератина). Гистологический анализ показал, что кератин в роговом слое у (ТС/-)-детенышей явно очевидно был более компактным, чем у детенышей дикого типа. В целом, утолщение эпидермиса, ассоциированное со значительным увеличением кератиноцитов и тонким роговым слоем у ΙΕ-20-трансгенных новорожденных животных, может служить объяснением наблюдаемого у них фенотипа блестящей кожи.
- 97 009026
Повышенная гипертрофия и нарушение терминальной дифференцировки кератиноцитов наблюдалось у I^-20-трансгенных новорожденных животных, специально сконструированных так, чтобы у них отсутствовала одна копия гена ΖΕ-22ΒΑ (Не!). В их коже наблюдалось значительное увеличение кератиноцитов, но полностью отсутствовала их дифференцировка, что приводило к отсутствию кератина или рогового слоя. У I^-20-трансгенных новорожденных животных с дизрупцией двух копий генов Π,-22ΙΒΑ (НОМ) наблюдался фенотип, совпадающий с фенотипом кожи ТС/-Не!, однако, этот эффект был почти не обнаружимым, либо совсем минимальным (фиг. 12-15). Очевидно, что отсутствие !Ε-22ΒΑ (НОМ) частично оказывает влияние на фенотип блестящей кожи, наблюдаемый у новорожденных ^4-^20т-трансгенных животных, а отсутствие Π,-22ΒΑ (Не!) оказывает минимальное влияние на фенотип блестящей кожи, либо вообще не оказывает такого влияния. Другими словами, передача сигнала П.-20, нового взаимодействующего с рецептором белка, который передает сигналы посредством либо рецептора ^^ΒΑ, либо рецептора !Ε-22ΒΑ ^Ε^ΒΑ), вероятно, не нарушается дефицитом экспрессии одной копии гена ^^ΒΑ (Не!), но частично нарушается дефицитом экспрессии двух копий гена Π,-22ΙΒΑ (НОМ).
Эти результаты показали, что эффективное блокирование активности ^^ΒΑ, например, благодаря отсутствию гена ΕΕ^ΒΑ, или аналогичным образом, благодаря присутствию нейтрализующего моноклонального антитела против ^^ΒΑ настоящего изобретения, будет, аналогичным образом, приводить к ослаблению ЕБ-20-индуцированных кожных проявлений, а также ЕБ-22-индуцированных кожных проявлений, например, при псориазе, ВЗК, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцированных 0,-20 и/или П.-22.
Пример 34. Действие Ш-22 на мышей, дефицитных по ΕΕ-22ΒΑ мышей, включая 23 I^-22ΒΑ-К0(Н0М)-мышей и 13 контрольных мышей (УТ), обрабатывали путем подкожного введения либо Ш-22, либо РВЗ с помощью имплантации этим мышам мини-насоса с трубкой, либо одного мини-насоса (табл. 25).
Таблица 25
НОМ/РВЗ (группа 1) НОМ/1Ь-22 (группа 2) ИТ/РВЗ (группа 3) ИТ/1Ь-22 (группа 4)
Самцы п=3 п=20 п=3 п=8
Самки п=0 п=10 п=0 п=2
Всего п=3 п=20 п=3 п=10
Образец кожи, длиной 1,5-2,5 см и толщиной 4,0-5,0 мм, брали от каждого животного из участка введения насоса для проведения рутинного гистологического анализа и гистоморфометрического визуализирующего анализа. Все образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и заливали в парафиновые блоки. От каждого образца кожи каждого животного получали шесть сегментарных срезов, 5 мкм толщиной, с интервалом 10 мкм между соседними срезами, с эпителием, покрывающим всю поверхность, и среды окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Гистоморфометрический визуализирующий анализ образцов кожи проводили с использованием микроскопа 01утρиκ ВН-2, видеокамеры Щаде-МЛ, МюШдап С1!у, Ш) и компьютерной программы ВюРиап! Тгие Со1ог Утс1о\у 98 (К&М Вюте!пск, Ыс. №кЬ^11е, ТN 37209) со следующими данными: параметр: 10х увеличение, Ζ принимали равным 0; Массив: длина (мкм); измерение: в ручном и аддитивном режиме. Толщину эпидермиса (мкм) для каждого среза кожи измеряли 5 раз в каждом 10х поле микроскопа для всех 4 полей, с захватом 0,4 см от центра каждого среза (например, одно поле 10х микроскопа=0,1 см, а 4 поля 10х микроскопа=0,4 см). Все 6 срезов, полученных от каждого животного, измеряли и получали среднюю величину, стандартное отклонение и ст.ош.средней путем вычисления в Ехсе1. Все срезы были рандомизированы и измерены проводили слепым методом. После измерений срезы анализировали неслепым методом, и результаты соответствовали группе обработки. Конечные результаты для группы обработки разделяли на следующие классы: 1. Толщина эпидермиса у самцов и самок мышей НОМ и УТ; 2. Толщина эпидермиса у самцов мышей НОМ и УТ. Полученные данные анализировали с использованием компьютерной программы ΕγιρΚΕιΟ йЗш (Р^аρЬРаά Зойуаге, йс., Зап [Дедо, СΑ 92121). Для оценки статистической значимости различий средних величин для групп 1-4 проводили односторонний дисперсионный анализ (ΑN0УΑ). Для определения статистической значимости различий средних величин для двух групп использовали критерий множественного сравнения Тьюки-Крамера и непарный Т-критерий. Наблюдения р<0,05 рассматривались как статистически значимые.
III. Результаты гистоморфометрических анализов (1). Толщина эпидермиса (мкм) у самцов и самок мышей НОМ и УТ
Толщина эпидермиса кожи значительно увеличивалась у мышей УТ, обработанных Ш-22 (УТ/Ш22), по сравнению с УТ/РВЗ-контролем (Р=0,0001). В коже I^-22ΒΑт-КО-мышей, обработанных Ш-22 (I ЮМЛк-ЗЗ), наблюдалось увеличение средней величины толщины эпидермиса по сравнению с Н0М/РВЗ-контролем, однако, статистические данные не выявили каких-либо значимых различий между двумя группами (р>0,05). У I^-22ΒΑ-КО-мышей наблюдалось значительное уменьшение толщины эпи
- 98 009026 дермиса по сравнению с мышами дикого типа (например, у Н0МЛЬ-2 по сравнению с УТЛЬ-22: р<0,001) (табл. 26).
Таблица 26
НОМ/РВЗ (N=3) ΗΟΜ/ΙΕ-22 (N=19) ЮТ/РВЗ (N=3) ИТ/1Ь-22 (N=10)
Среднее 14,15±0,19 19,01±1,03 23,34+5,49 43,08+1,85
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней; N число животных.
(2). Толщина эпидермиса (мкм) у самцов мышей НОМ и УТ
У самцов мышей УТ, обработанных II.-22 (УТЛЬ-22), толщина эпидермиса кожи увеличивалась примерно в 2 раза по сравнению с контрольными самцами УТ/РВ8 (Р=0,0001), однако, у самцов II.22КАт-КО-мышей, обработанных II.-22 (ΗОМ/I^-22), наблюдалось лишь небольшое увеличение толщины эпидермиса по сравнению с контрольными самцами НОМ/РВ8 (р>0,05). Примечательно, что у Ш22КАт-КО-мышей обнаруживалось заметное уменьшение толщины эпидермиса по сравнению с контрольными самцами мышей УТ (например, НОМ/РВ8 по сравнению с УТ/РВ8: р<0,05; Н0МЛЬ-22 по сравнению с УТЛЬ-22: р<0,001) (табл. 27).
Таблица 27
НОМ/РВЗ (N=3) НОМ/1Ь-22 (N=9) ИТ/РВЗ (N=3) МТ/1Ь-22 (N=8)
Среднее 14,15±0,19 15,86±0,75 23,34+5,49 41,41±1,71
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней (3). Толщина эпидермиса (мкм) у самцов мышей НОМ и УТ по сравнению с самками
Было обнаружено, что эпидермис у самок мышей был толще, чем эпидермис у самцов мышей (например, Н0МНЬ-22/самец по сравнению с Н0МНЬ-22/самкой: р<0,01; УТЛЬ-22/самец по сравнению с УТ/П.-22/са\1кой: р<0,05) (табл. 28).
Таблица 28
Н0М/1Б-22 (Самец, N=9) НОМ/11,-22 (Самка, N=10) ИТ/1Ь-22 (Самец, N=8) ИТ/1Ь-22 (Самка, N=2)
Среднее 15,86+0,75 21,85±1,3 41,41+1,71 49,75+4,82
Результаты представлены как среднее±ст.ош.средней (4). Толщина эпидермиса (мкм) у мышей НОМ. Сравнение результатов, полученных при введении II .-22 с помощью насоса и с помощью насоса с трубкой
Было обнаружено, что эпидермис у Ш^КАт-КО-мышей (НОМ), которым вводили И.-22 с помощью насоса и трубки, был значительно толще, чем эпидермис у Ш^КАт-КО-мышей (НОМ), которым вводили П.-22 только с помощью насоса (р<0,0001; непарный Т-критерий) (табл. 29).
Таблица 29
НОМ, введение 1Ь-22 с помощью насоса (М=8 & Е=2, N=10) НОМ, введение 1Ъ-22 с помощью насоса и трубки
(М=2 & Е=8, N=10)
Среднее 15,85+0,65 23,30+1, 36
Результаты представлены как среднее ± ст.ош.средней
М - самец; Р - самка; N - общее число мышей.
IV. Обсуждение
В общих чертах, целью данного исследования является характеризация эпидермальных эффектов в II .-22-обработаииой коже Ш^КАт-КО-мышей и мышей УТ, и оценка результатов этого исследования с точки зрения возможности их клинического применения. Количественный визуализирующий анализ проводили для определения толщины эпидермиса в срезах кожи, окрашенных Н&Е. Образцы кожи, взятые от каждого животного, подвергали гистоморфометрическому анализу 120 раз (т.е. 20 раз для каждого срезах6 сегментарных срезов от каждой мыши=120 измерений) и среднюю величину толщины эпидермиса вычисляли с помощью программы Ехсе1. Гистоморфометрические исследования продемонстрировали, что присутствие II .-22 приводило к значительному увеличению толщины эпидермиса, а особенно у мышей дикого типа (УТ), у которых присутствовал рецептор Ш^КА (р<0,0001, ΛNОVΛ, результаты рассматривались как в высокой степени значимые), причем эти эффекты отсутствовали или были совсем минимальными у Ш^Кат-КО-мышей (НОМ), у которых отсутствовал рецептор Ш^КА (р>0,05). Толщина эпидермиса у Π.-22-обработаишых мышей УТ увеличивалась примерно на 43% по сравнению с мышами, обработанными РВ8 (например, УТ/РВ8, р<0,001), тогда как у П.-22-обработаишых П.-221К11ПКО-мышей (НОМ) наблюдалось лишь 26%-ное увеличение толщины эпидермиса по сравнению с кон
- 99 009026 тролем (НОМ/РВ8, р>0,05). У 1Ь-22Кат-КО-мышей обнаруживался более тонкий эпидермис по сравнению с мышами АТ (р<0,001). В целом, биологические эффекты ГЬ-22 в коже мышей позволяют предположить, что этот фактор может участвовать в регуляции роста и пролиферации эпидермиса.
Пример 35. Фармакокинетика моноклонального антитела против человеческого II.-20 (клон # 262.7.1.3.2.4)
Тестируемое моноклональное антитело, т.е. шАЬ против человеческого ГЬ-20 (клон # 262.7.1.3.2.4), получали в виде 3x3 мл аликвот в концентрации 1,08 мг/мл (как было определено по УФ-поглощению при 280 нМ) и хранили при -80°С до использования. Носитель представлял собой 1хРВ8 (50 мМ \'аР0.|, 109 мМ Т'аСТ), рН 7,3. Перед использованием, тАЬ оттаивали при комнатной температуре и из аликвот 1 и 2 получали группы доз по 100 мкг для ί.ν. и к.с.-введения соответственно. Одну половину аликвоты 3 разводили 1:2 в 1хРВ8 с получением группы доз по 50 мкг для к.с.-введения, вторую половину аликвоты 3 разводили 1:10 в 1хРВ8 с получением группы доз по 10 мкг для к.с.-введения. Самок мышей 8СГО (и=96) закупали у Сйаг1ек КАег ЬаЬк. Животных, после их доставки и помещения группами в клетки (по 3 животных на клетку), исследовали на общее состояние здоровья. К началу исследования мыши имели возраст 12 недель и среднюю массу тела 22 г.
Протокол введения доз
Самок мышей 8СГО (и=24/группу доз) произвольно разделяли на четыре группы по вводимым дозам (см. табл. 30). Группе 1 вводили приблизительно 93 мкл анти-1т11.-20 шАЬ путем ί.ν.-инъекции в хвостовую вену, а группам 2, 3 и 4 вводили приблизительно 93 мкл тАЬ путем к.с.-инъекции в заднюю часть шеи.
В. Сбор образцов
Перед забором крови, мышей подвергали глубокой анестезии галотаном или изофлуораном. Пробы крови брали с помощью сердечной пункции в указанное время за исключением времени 168 ч (когда пробы крови брали из глаза, и у тех же самых животных снова брали пробы крови через 504 ч путем сердечной пункции). Кровь собирали в пробирки-сепаратора для отделения сыворотки и оставляли на 15 мин для свертывания. Затем пробы центрифугировали в течение 3 мин при 14000 об/мин. После центрифугирования, аликвоты 125-150 мкл вводили в помеченные пробирки Эппендорфа и сразу помещали на хранение при -80°С до проведения анализа (табл. 30).
Таблица 30
Группа # Доза (КОА) Животные Время сбора крови (РК)
1 100 мкг (ί.ν.) 3 мыши/время взятия проб* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 ч
2 100 мкг (з.с.) 3 мыши/время взятия проб* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 ч
3 50 мкг (з.с.) 3 мыши/время взятия проб* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 ч
4 10 мкг (з.с.) 3 мыши/время взятия проб* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 ч
* У тех же самых животных брали кровь через 168 и 504 ч
С. Количественная оценка концентраций анти-Ни11-20 шАЬ в сыворотке с помощью ЕЫ8А
Был разработан протокол твердофазного иммуноферментного анализа (ЕМ8А) для качественной оценки проб мышиной сыворотки, взятых у животных, которым вводили дозы анти-1Ь-20 тАЬ 267.7.1.3.2.4 в процессе фармакокинетических исследований. Этот анализ был разработан так, что в нем используется коммерчески доступное второе антитело и колориметрическая детекция с использованием ТМВ. Разведения, используемые для построения стандартной кривой, были модифицированы для упрощения определения линейной части стандартной кривой. Стандартная кривая, построенная в пределах от 100 до 0,231 нг/мл с использованием 2-кратных разведений, позволяла проводить количественную оценку проб мышиной сыворотки. РС-пробы разводили до 1:100, 1:1000 и 1:10000 в 10% сыворотке мышей 8СГО и проводили обратные вычисления по стандартной кривой.
О. Фармакокинетический анализ
Данные концентрации антител в сыворотке в зависимости от времени вводили в компьютерную программу \\'1п\'оп11п РгоГеккюиа1 4.0 (РйатыдЫ, 1ис., Сагу, ΝΟ) для проведения фармакокинетического анализа. Для определения фармакокинетических параметров исходя из средних величин для каждого момента времени проводили некомпартментальный анализ.
Е. Результаты
Средние концентрации тАЬ против человеческого 1Ь-20 в сыворотке после ί.ν. введения 100 мкг и
- 100 009026 после к.с. введения 100, 50 и 10 мкг приводятся в табл. 31.
Таблица 31
Время, (ч) Концентрация, ΐ.ν. 100 (мкг/мл) Концентрация, з.с. 10 (мкг/мл) Концентрация , з.с. 50 (мкг/мл) Концентрация, з.с. 100 (мкг/мл)
0,25 196 (12) ЪТК 0,101 (0,065) 0,481 (0,485)
1 154 (18) 0,356 (0,146) 1,61 (0,52) 3,48 (1,72)
4 118 (20) 2,42 (0,53) 10,4(3,4) 19,7 (4,7)
8 112 (20) 3,41 (0,30) 18,9 (3,6) 40,2 (6,4)
24 103 (13) 4,95 (0,05) 26,3 (0,7) 50,1 (6,2)
72 101 (16) 4,27 (0,79) 21,0 (3,4) 43,4 (2,7)
168 45,6 (15,4) 2,92 (0,53) 19,6 (2,7) 37,6 (3,4)
336 36,4 (16,6) 3,60 (0,31) 23,5 (3,5) 34,4 (5,8)
504 28,8 (3,8) 2,74 (0,39) 20,5 (3,6) 25,7 (2,1)
ЬТВ: ниже пределов значимости.
После ΐ.ν. введения, концентрация тАЬ в зависимости от времени обнаруживала биэкспоненциальное снижение. После к.с. введения, тАЬ, очевидно, находилось в фазе замедленной абсорбции, причем элиминация тАЬ была ограничена скоростью абсорбции. Фармакокинетические сывороточные параметры, полученные исходя из средних величин для каждого момента времени, представлены в табл. 32.
Таблица 32
Параметр Единицы 100 мкг, ΐ.ν. 10 мкг, з.с. 50 мкг, з.с. 100 ΜΚΓ, 3 . С .
Со (IV); Смакс (ЗС) мкг/мл 212 4,95 26,3 50,1
Тмакс часы Ν/Α 24 24 24
61/2, λζ часы 509 N0 N0 612
АПС (0-с) часы · мкг/мл 27059 1730 10845 18110
лис (ο-ίηί) часы · мкг/мл 48269 ΝΡ ΝΡ 41561
Аис (% экстраполяции) % 43,9 ΝΡ ΝΡ 56,4
ν33(ΐν); ν2/Ρ (ЗС) мл 1,34 ΝΡ ΝΡ 2,12
С1(1У); С1/Р (ЗС) мл/час 0,002 ΝΡ ΝΡ 0,002
К (биологическая доступность) % Ν/Α ΝΡ ΝΡ 86,1
N0: не определяли из-за отсутствия данных терминальной фазы элиминации концентрации в зависимости от времени
После ΐ.ν. введения наблюдалось очень медленное выведение тАЬ (клиренс (С1)=0,002 мл/ч) и продолжительное время полужизни (!1/2, λΖ«21 день). Это тАЬ имело стационарный объем распределения (У88=1,3 мл), который был меньше объема крови у мыши (®1,7 мл), что позволяет предположить, что тАЬ, в основном, не распределялось по сосудистому компартменту. Максимальная концентрация (С0), полученная путем обратного вычисления, была выше, чем это ожидалось исходя из вводимой дозы и объема крови мыши. Эти результаты, наряду с небольшим У88, позволяют предположить, что указанное тАЬ может иметь, в значительной степени, ограниченную концентрацию в сывороточной фракции крови.
После к.с.-введения, величины Стах прямо пропорционально увеличивались в зависимости от дозы. При дозе 100 мкг к.с, тАЬ имело !1/2, λΖ приблизительно 25 дней, при этом его выведение и кажущийся объем распределения были аналогичны выведению и объему распределения после введения ΐ.ν.-дозы. Биологическая доступность составляла 86%. При двух более низких к.с.-дозах большинство фармакокинетических параметров не могло быть определено из-за отсутствия измеряемой терминальной фазы эли
- 101 009026 минации, даже когда пробы были взяты через 504 ч. Абсорбция тАЬ после введения к.с.-дозы, очевидно, достигала стационарной фазы с элиминацией на протяжении всего исследования.
Пример 36. Антагонисты Ш-20 и Ш-22 у СО4'СЭ45КВН| (СО25-)-модели колита и псориаза
A. Краткое описание
Перенос СО4+СО45КВ| или СО4+СЭ25-Т-клеток сингенным мышам 8СШ приводил к развитию колита у мышей. Совместный перенос регуляторных Т-клеток (ί.Ό4+ί.Ό25+ или С^4+С^45КВ1о) приводит к ингибированию колита. После переноса СО4+СО25-Т-клеток мышам, в том случае, если им дополнительно вводили стафилококковый энтеротоксин В (8ЕВ), у этих мышей развивался не только колит, но также и псориаз. Через 0-21 день после переноса клеток вводили антитела против Ш-22КА, Ш-20, Ш-22, Ш20К и/или Ш-22К, или растворимых рецепторов Ш-22КА и проводили мониторинг симптомов колита и псориаза. Ингибирование псориазного поражения или колита (о чем свидетельствовал гистологический анализ) показало, что Ш-21 может подавлять симптомы таких аутоиммунных заболеваний.
B. Протокол исследований
У мышей В10.Э2 выделяли селезенку и паховые лимфоузлы. Затем получали моноклеточные суспензии и эти суспензии подсчитывали. С использованием системы сфер М11!епу1 Веаб, СЭ25+ клетки сортировали путем позитивного отбора. Клетки окрашивали СЭ25-РЕ (ВО РЬагшшдеп) при разведении 1:100 и инкубировали в течение 15 мин. Избыток антитела удаляли путем промывки и клетки инкубировали с 10 мкл сфер, конъюгированных с антителом против РЕ/106 клеток в течение 20 мин. Клетки промывали РВ8 и пропускали через колонку Ь8 (М11!епу1 Вю!есН). Клетки, которые проходили через колонку (СО25-), оставляли для дополнительного анализа. После этого, к полученным СЭ25- клеткам добавляли СО4-обогащенную смесь (8!ет Се11 ТесНпо1од1ек) (1:100) и смесь инкубировали в течение 15 мин. Клетки промывали РВ8. К клеткам в течение 15 мин добавляли тетрамер против биотина при разведении 1:10, а затем в течение 15 мин добавляли магнитный коллоид (60 мкл/106 клеток) (все эти реагенты были закуплены у 8!ет Се11 ТесНпо1од1ек). Клетки пропускали через колонку для негативного отбора (0,5, 8!ет Се11 ТесНпо1од1ек). Клетки, проходящие через колонку, представляли собой СО4+СЭ25--клетки. Чистоту анализировали с помощью проточной цитометрии. 0,4х106 клеток ί.ν. инъецировали СВ-17мышам 8СГО, не подвергавшимся обработке, в полном объеме 200 мкл. На следующий день (день 1) мышам 1.р. инъецировали 10 мкг 8ЕВ. Через 2-5 недель наблюдались симптомы псориаза и колита. Мышей оценивали на псориаз в соответствии со следующими критериями: 0 - поражения отсутствуют, 1 слабые поражения на шее, 2 - тяжелые поражения на шее и на спине (туловище), 3 - очень тяжелые поражения на шее, на спине и на брюхе мыши. Утолщение ушей также измеряли как показатель тяжести заболевания. Группам мышей 1.р. инъецировали РВ8, 100 мкг контрольного антитела или 10-100 мкг антител против Ш-22КА, Ш-20, Ш-22, Ш-20К или Ш-22К или растворимого Ш-22КА в течение 1-30 дней при различных схемах введения доз (3х/неделю или 2х/неделю).
C. Результаты и выводы
Ингибирование симптомов псориаза и колита у обработанных антителом мышей показало, что ингибирование функции Ш-20 и/или Ш-22 может подавлять аутоиммунные симптомы у мышей с моделью псориаза и колита.
Пример 37. Антагонисты Ш-20 и Ш-22, вводимые мышам 8СГО-1Ш с моделью трансплантированного псориаза
Пораженная псориазом кожа человека, трансплантированная мышам 8СГО, может сохранять свои клинические, оптико-микроскопические и иммуногистохимические признаки псориаза в течение нескольких недель. Эта модель представляет собой систему для оценки терапии, направленной на восстановление пораженной ткани до нормального фенотипа. После успешной трансплантации человеческой кожи, антитела против Ш-22КА, Ш-20, Ш-22, Ш-20К и/или Ш-22К или растворимых рецепторов Ш-20 или Ш-22 могут быть введены в течение нескольких недель, и толщина эпидермиса может быть проанализирована для определения влияния этих антагонистов на развития псориаза.
B. Протокол исследования
Биоптаты толщиной всего 6 мм, состоящие из полного эпидермиса и нескольких миллиметров дермы получали от взрослых здоровых добровольцев и от пациентов с псориазным поражением кожи. От каждого донора брали 4-6 биоптатов. Один биоптат от каждого донора трансплантировали на дорсальную поверхность кожи мыши-реципиента 8СГО (СВ-17, Тасошс). Животных содержали в условиях отсутствия патогенов. Обработку начинали после успешной трансплантации (через 2-3 недели после трансплантации) в следующем порядке: брали одну биопсию для негативного контроля (РВ8 или тАЬ определенного изотипа), одну биопсию для позитивного контроля (циклоспорин А) и 2-3 биопсии для обработки антителом против человеческого Ш-22КА, антителом против человеческого Ш-20, тАЬ против человеческого Ш-22 или антителом против растворимых рецепторов Ш-20 или Ш-22 (путем внутрибрюшинной инъекции, три раза в неделю в течение 2-4 недель в соответствии с М-У-Е-протоколом).
C. Количественный анализ
Клинические наблюдения и оценки регулярно проводили и регистрировали в течение всего эксперимента. Тяжесть псориазных поражений оценивали по появлению чешуек, по уплотнению кожи и по
- 102 009026 эритеме слепым методом. Параметры могут быть оценены по трехбалльной шкале: 0=полное отсутствие поражения кожи; 1=небольшое поражение; 2=умеренное поражение и 3=тяжелое поражение. По истечении периода введения доз, каждое животное подвергали эвтаназии и ткани собирали для гистологического анализа и ГНС (1). Часть ткани фиксировали в 10% формалине и окрашивали гематоксилином и эозином. Эпидермальную область измеряли как функцию изменения толщины эпидермиса на единицу длины с использованием компьютерной программы МН Гтаде. Множество участков от каждого трансплантата количественно оценивали для получения высокой величины п и средней площади эпидермиса; (2) измеряли число воспалительных мононуклеарных клеток в очень сильном поле (0,103x0,135 мм) в верхнем слое дермы; (3) степень паракератоза оценивали по произвольной шкале от 0 до 3, где 0=отсутствие паракератоза, 1=присутствие паракератоза менее чем в одной трети среза, 2=присутствие паракератоза более чем в одной трети среза и менее чем в двух третях среза, а 3=присутствие паракератоза более чем в двух третях среза; (4) оставшуюся ткань окрашивали на К167 (маркер пролиферации кератиноцитов) для определения числа К167-циклирующих кератиноцитов на один миллиметр длины среза. Снижение тяжести псориаза определяли по толщине эпидермиса, что указывает на то, что нейтрализация функции ГЬ-20 и ГЬ-22 может оказаться эффективной в этой модели псориаза. Для количественной оценки снижения тяжести псориаза, авторами настоящего изобретения была определена толщина эпидермиса, число воспалительных клеток в верхней части дермы, число К167-циклирующих кератиноцитов и степень паракератоза.
Значительное уменьшение всех четырех параметров для групп обработки по сравнению с контрольными мышами указывало на возможность терапевтического применения антагонистов ГЬ-20 и ГЬ-22.
Пример 38. Скрининг на активность антагониста ГЬ-20 с использованием клеток ВаΡ3/Г^-22КЛ/Г^20КВ в анализе на пролиферацию с окрашиванием аламаровым синим
Зависимую от фактора пре-В-клеточную линию ВаР3 котрансфицировали ГЬ-22КА и ГЬ-20КВ (см. метод, описанный в примере 3) и обрабатывали ГЬ-20 в различных концентрациях. Пролиферацию оценивали в анализе с окрашиванием аламаровым синим, как описано в примере 3. ГЬ-20 стимулировал дозозависимую пролиферацию при концентрациях, ожидаемых для данного цитокина, что указывало на то, что ГЬ-20 связывается с гетеродимерным рецептором Г^-22КЛ/Г^-20КВ и активирует его активность при концентрациях, ожидаемых для данного цитокина. Негативный контроль, содержащий нетрансфицированные ВаР3, не обнаруживал пролиферации.
Для определения способности анти-ГЬ-22КА антител ингибировать активность ГЬ-20, вышеописанный анализ осуществляли с использованием анти-ГЬ-22КА антител в качестве антагониста активности ГЬ-20. При объединении ГЬ-20 с таким антагонистом, ответ на ГЬ-20 снижался до фоновых уровней. Таким образом, присутствие антагониста, подавляющего или снижающего пролиферативное действие ГЬ20, показало, что он является антагонистом лиганда ГЬ-20. Этот анализ может быть использован для тестирования других описанных здесь антагонистов активности ГЬ-20, таких как полипептиды антагониста, содержащего растворимый рецептор ГЬ-22КА.
Пример 39. Нейтрализация активности ГЬ-20 и ГЬ-22 моноклональным антителом против йиГЬ-22КА С помощью клеточного анализа на нейтрализацию, описанного в примере 28, добавляли очищенное мышиное моноклональное антитело против йцГЬ-22КА (пример 30(Ό)) при серийном разведении, например, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 625 нг/мл, 313 нг/мл, 156 нг/мл и 78 нг/мл. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 4 дней, и добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, ГЬ) при 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% С02, в течение 16 ч. Результаты показали, что очищенное мышиное моноклональное антитело против йиГЬ-22КА может нейтрализовать передачу сигнала йиГЬ-22 и йиГЬ-20 посредством йиГЬ-22КА. Так, например, при концентрации 10 мкг/мл, это антитело полностью нейтрализовало пролиферацию, индуцированную йиГЬ-22 или йиГЬ-20, при этом ингибирование пролиферации снижалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Мышиное тАЬ соответствующего изотипа, используемое в качестве негативного контроля и протестированное при описанных выше концентрациях, не оказывало ингибирующего действия на пролиферацию, индуцированную любым из указанных цитокинов. Эти результаты, кроме того, продемонстрировали, что моноклональные антитела против ГЬ-22КА действительно могут подавлять активность провоспалительных лигандов ГЬ-20 и ГЬ-22 при низких концентрациях.
Эти результаты также показали, что эффективное блокирование активности ГЬ-22КА, например, посредством нейтрализации моноклонального антитела против ГЬ-22КА настоящего изобретения может оказаться преимущественным для блокирования, ингибирования, снижения, подавления или нейтрализации эффектов ГЬ-20 и ГЬ-22 (одного из них или обоих) ш νίνΌ, и может приводить к снижению ГЬ-20 и/или ГЬ-22-индуцированного воспаления, например, воспаления, которое наблюдается при ГЬ-20индуцированных кожных проявлениях, а также ГЬ-22-индуцированных кожных проявлениях, например, при псориазе, ВЗК, колите или при других воспалительных заболеваниях, индуцированных ГЬ-20 и/или ГЬ-22, включая ВЗК, артрит, астму, псориазный артрит, колит, воспалительные кожные заболевания и атопический дерматит.
- 103 009026
Пример 40. Обработка беременных ΙΕ-20- и ΙΕ-22-трансгенных мышей нейтрализующим моноклональным антителом против I^-22КА
Для тестирования крысиного моноклонального антитела (тАЬ) против мышиного I^-22КА на его нейтрализующую активность т у1уо, беременным ΙΕ-20-трансгенным (Тд) мышам и ΙΕ-22-Тд мышам внутрибрюшинно вводили тАЬ против мышиного I^-22КА. Затем новорожденных мышат оценивали на присутствие или отсутствие фенотипа блестящей кожи, который обычно является отличительным признаком этого мышиного штамма.
Более конкретно, самцов мышей ΙΕ-20-Тд (которые были выведены с использованием кератина-14) или мышей ΙΕ-22-Тд (которые были выведены с использованием промотора инсулина) скрещивали с самками С57ВЕ/6Н в период течки, и на следующий день осеменных самок идентифицировали по присутствию вагинальной пробки. Каждую беременную самку отсаживали в отдельную клетку и проводили ежедневный мониторинг. Для проведения анализа на статистическую значимость для Тд- и не-Тддетенышей, в группы обработки включали по крайней мере по 4 беременных самки в каждую. Исходя из уже имеющегося опыта работы с этими Тд-мышами, было выявлено, что один помет обычно составляет примерно от 6 до 8 детенышей, из которых 2-3 детеныша являются трансгенными (Тд+).
Через 7-9 дней после спаривания мышей (возраст эмбриона 7-9; е7-9), самкам внутрибрюшинно инъецировали 250-500 мкг крысиного тАЬ против мышиного I^-22КА (крысиного антитела изотипа ^С2а) в объеме 200-250 мкл РВ8. Во избежание инъекции непосредственно в матку были использованы короткие иглы для неглубокого введения. Для успешного доступа к развивающимся эмбрионам, указанные инъекции беременным самкам вводили 3 дня в неделю (понедельник, среда и пятница) в течение 2 недель (вплоть до родов). Контрольные группы (каждая из которых содержала не менее 4 беременных самок мышей) включали: животных, которым вводили контрольное крысиное тАЬ изотипа IдС2а, тАЬ против человеческого/мышиного ΙΕ-22 (крысиное антитело изотипа ^Ш), и контрольное крысиное тАЬ изотипа Ι§Ο1. В качестве контроля для нейтрализации мышиного ΙΕ-20, беременным самкам инъецировали либо растворимый гибридный белок ΙΕ-22Β-Ε^4, который может связываться как с человеческим, так и с мышиным ΙΕ-20, и нейтрализовать его активность, либо контрольный белок Ес-4.
Через 1-2 дня после родов проводили тщательный мониторинг детенышей на появление фенотипа блестящей кожи. На 2-й день детенышей подвергали эвтаназии и брали часть хвоста для выделения ДНК в целях определения генотипа (Тд или не-Тд) каждого детеныша. Образцы кожи брали для гистологического анализа для того, чтобы определить, имеются ли у детенышей утолщенные эпидермальные клеточные слои, характерные для таких Тд-мышей. У детенышей также брали кровь из туловища (и у самок через один день после родов брали кровь из глаза) для количественной ЕШ^А-оценки с помощью ЕШЗА уровней анти-I^-22КΛ тАЬ в сыворотке каждой мыши. Поскольку такие тАЬ являются сильными ингибиторами ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22 т у1уо, то было обнаружено, что Тд-детеныши имели нормальную кожу (т.е. их кожа не имела утолщения эпидермиса или не была блестящей).
Пример 41. Антагонисты ΙΕ-20 и ΙΕ-22 в культуре органа с моделью псориаза
Кожа человека с бляшковым псориазом можно поддерживаться в культуре органа, и, при этом, аномальные гистологические признаки пораженной кожи сохраняются в отсутствии экзогенных факторов роста. Для этого могут быть введены антитела против ^-22^, ΙΕ-20, ΙΕ-22, ΙШ-20К и/или Ш-22К или растворимых рецепторов ΙΕ-20 или ΙΕ-22 и могут быть улучшены гистологические показатели пораженной псориазом кожи.
B. Протокол исследования
Биоптаты толщиной всего 2 мм, состоящие из полного эпидермиса и нескольких миллиметров дермы, получали от взрослых здоровых волонтеров или от пациентов с псориазным поражением кожи. Сразу после биопсии, ткань погружали в культуральную среду, состоящую из базальной среды для кератиноцитов (КВМ) (С1опе!1ск Шс., ^а1кегку111е, МО). В культуральную среду добавляли СаС12 до конечной концентрации 1,4 мМ Са2+ (Уатт е! а1., 1993, 1994). Затем биоптаты инкубировали в лунках 96луночного планшета, содержащего 200 мкл КВМ, в которые был добавлен Са2+, с дополнительной обработкой антителами против человеческого ΙΕ-20, ΙΕ-22, I^-22КΛ или растворимых рецепторов ΙΕ-20 или ΙΕ-22; или без дополнительной обработки. Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере с 95% воздуха и 5% С02, в течение 8 дней.
C. Количественный анализ
По окончании инкубирования ткань фиксировали в 10% забуференном формалине и, после окрашивания гематоксилином и эозином, подвергали гистологической оценке. Внешний вид пораженной псориазом ткани, обработанной антителами или растворимыми рецепторами, может иметь большее сходство с нормальными тканями, на что указывают следующие показатели: изначально деструктивные базальные эпителиальные клетки неправильной формы становятся более цилиндрическими с восстановленной полярностью; наблюдается уменьшение сети эпидермальных сосудов с меньшей площадью распространения эпителиальных клеток в пространство дермы, и почти полное отсутствие дегенерации верхних эпидермальных слоев. Культура органа с моделью заболевания представляет собой средство для быстрого и чувствительного определения возможности использования конкретного соединения в качестве средства против гиперпролиферации. Патологические гистологические признаки могут быть умень
- 104 009026 шены в присутствии антагониста ΙΕ-20, ΙΕ-22, что позволяет предположить об эффективности такого средства для лечения псориаза.
Пример 42. Картирование областей тЮЗКА (/Су!оК11т), связывающихся с нейтрализующими тАЬ К2.1.5Р4.1 и К2.1.15Е2.1
А. Эпитопы на мышином I^-22КΛ, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела
Описанные ниже эксперименты имели своей целью идентификацию области или областей в аминокислотной последовательности белка растворимого рецептора мышиного I^-22КΛ (8ЕР ΙΌ N0:62), которые играют важную роль в активности рецептора или в связывании с антагонистом или нейтрализующим антителом. Мышиный белок I^-22КΛ-Εс, которые был предварительно гидролизован тромбином для удаления Рс, затем подвергали С-концевому гидролизу до метиониновых остатков в данной последовательности путем инкубирования с бромцианом (СКВг). СКВг-генерированные пептиды фракционировали, и эти фракции тестировали на связывающую активность, как было детектировано с помощью ЕЬ^А, и на реактивность с помощью Вестерн-анализа с использованием моноклональных антител с нейтрализующими свойствами, клоны К2.1.5Р4.1 и К2.1.15Е2.1.
После гидролиза СКВг, нижеследующие пептиды были, как предполагалось, генерированы из невосстановленного полноразмерного т^^КА (табл. 33). В невосстанавливающих условиях, цистеины связаны дисульфидными связями и могут образовывать внутреннюю связь в пептиде 1 и связь между пептидами 3 и 5. Остатки, обозначенные жирным шрифтом, могут участвовать в связывании с лигандом, и соответствуют остаткам человеческого 0,-221^, которые, как предполагается, участвуют в связывании с лигандом в 8ЕЕ) ΙΌ N0:2 или в 8ЕЕ) ΙΌ N0:3, как описано в примере 42В. В частности, 8ЕЕ) ΙΌ N0:48 соответствует аминокислотным остаткам 16 (Н1к) - 83 (Ме!) 8ЕС) ΙΌ N0:42; 8ЕС) ΙΌ N0:49 соответствует аминокислотным остаткам 84 (С1и) - 109 (Ме!) 8ЕС) ΙΌ N0:42, 8ЕС) ΙΌ N0:50 соответствует аминокислотным остаткам 110 (ТЬг) - 137 (Ме!) 8ЕЕ) ΙΌ N0:42, 8ЕЕ) ΙΌ N0:51 соответствует аминокислотным остаткам 138 (Ьеи) - 177 (Ме!) 8ЕО ΙΌ N0:42, а 8ЕО ΙΌ N0:52 соответствует аминокислотным остаткам 163 (Н1к) -208 (Рго) 8ЕО ΙΌ N0:42 или 163 (Н1к) - 212 (Ад) 8Е(,) ΙΌ N0:62.
Таблица 33
Номер пептида От остатка До остатка Последовательность
ΟΝΒΓ-пептид 1 1 68 ШТУОТБСШЗНУКЩЗЗМЕЕНКТООбР ΑδΏΏΤνΥδνΕΥΚΚΥΟΕΚΚ^ΑΚΑΟΟΟΕΙ ТОКРСШМ (5Ε0Π)ΝΟ:48)
Невосстановленные: цистеины в пептиде 1 являются связанными
СИБг-пептид 2 69 94 ^Μ4ΗΤΕΒ\ΎΑΚνΤΑν3ΑΟΟΡΡνΤΚΜ (5Е<2 Ю N0:49)
СИВг-пептид 3 95 122 токрзбьонтпкрроутэрку (8ΕΟΙΌΝΟ:50)
Невосстановленные: пептиды 3-5 являются связанными
СИВг-пептид 4 123 162 ЬТНРТТТРШЮСНОЕТПЕЕМЮШШ ΜνΝΗΓΥςΜ (8Ε0Π)ΝΟ:51)
СИБг-пептид 5 163 212 НШОКОКЕУЕЕЬОЬТРОТЕНЬОЗГПЬТРШЗ ΚΕδΑΡΥνΟΚλΠαΐΡΠΦΚ (8Ε0Π)ΝΟ: 52)
1. СПЕг-гидролиз и выделение пептидных фракций мкг тЕЕ-22ВА лиофилизовали и разводили в 180 мкл муравьиной кислоты (70%). Затем добавляли 1 мкл 5М СПВг, растворенного в ацетонитриле. Образец размешивали и оставляли на 18 ч в темноте при комнатной температуре для прохождения реакции. 150 мкл реакционной смеси фракционировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на аналитической колонке Ζο^Ьаx 8В300-С8. Пики разделяли с использованием градиента, начиная от 25% ацетонитрила (0,085% ТРА) и 75% воды (0,1% ТРА), и заканчивая 95% ацетонитрила (0,085% ТРА) и 5% воды (0,1% ТРА). УФ-анализ показал три главных и два небольших пика, которые затем собирали. Каждую фракцию делили пополам, и одну часть подвергали ЕЬ^А-анализу, а другую часть лиофилизовали и разводили в 150 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8). УФ-анализ РВ8-фракций подтвердил выход всех пиков, собранных с аналитической колонки. Затем РВ8-фракции подвергали Вестерн-анализу.
2. ЕЬ^А
ВЭЖХ-фракции, содержащие пептидные последовательности гидролизованного разводили до оцениваемой равной концентрации с использованием ВЭЖХ-буфера (90% ацетонитрил, 10% Н20, 0,09% трифторуксусной кислоты). Образцы загружали в 96-луночные микротитрационные планшеты в 4 лунки, в каждую по 100 мкл/лунку, и оставляли на ночь при комнатной температуре в дымовом шкафу для сушки. Планшеты промывали буфером С для ЕЫ8А (РВ8, 0,05% твина-20), а затем блокировали буфером В для ЕЬКА (РВ8, 0,1% В8А, 0,05% твина-20) в течение 2 ч при 37°С. Два моно
- 105 009026 клональных антитела (тАЬ) против Ш^КА (клоны К2.1.5Е4.1 и К2.1.15Е2.1.) разводили до 2 мкг/мл в буфере В для ЕЛЛ8А. Каждое тАЬ добавляли к каждому образцу пептидной последовательности при 100 мкл/лунку, и планшеты инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Планшеты промывали для удаления несвязанного антитела, и второе антитело (конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против крысиных ΙμΕΐ (Ласкзои)) разводили до 1 мкг/мл в буфере В для 1ЛЛ8А и добавляли во все лунки в концентрации 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Лунки промывали буфером С для ЕЛЛ8А, а затем инкубировали с субстратом, т.е. с компонентом ПХ-ТМВ1 (ТМВ 1 Сотроиеи! НКР М1сго\е11 (ВюЕх)) в течение 5 мин. Реакцию прекращали путем добавления 450 нМ терминирующего реагента для ТМВ М1сго\е11 (ВюЕх), и планшеты считывали при оптической плотности 450 нм в планшет-ридере для ЕЫ8А □уиа1есй (Мо1еси1аг Неу1сез).
Результаты показали, что клон тАЬ К2.1.5Е4.1 реагировал с ВЭЖХ-фракцией #4 в реакционной смеси тI^-22ΒΑ-СNΒ^, который также давал полосу в Вестерн-блот-анализах.
3. Вестерн-анализ
ВЭЖХ-фракции, содержащие пептидные последовательности, происходящие от СЫВггидролизованного ЕЕ-22ВА, лиофилизовали в течение ночи при комнатной температуре, и разводили в РВ8. Затем образцы смешивали с невосстанавливающим буфером для образцов (ЛиуЛгоцеи) и кипятили в течение 10 мин. Образцы загружали и подвергали ДСН-ПААГ-электрофорезу в 4-12% бис-трис-гелях (Iиν^ί^οдеи) с использованием 1хбуфера МЕ8-8О8 для электрофореза (Iиν^ί^οдеи) и переносили на нитроцеллюлозу (0,2 мкм, ВюКаб) в 20% метаноловом буфере для переноса, при этом все операции проводили при комнатной температуре. Фильтры оставляли на ночь при комнатной температуре для сушки. Эти фильтры блокировали 10% обезжиренным сухим молоком в буфере А (50 мМ трис, рН 7, 4, 5 мМ ЕОТА, 0,05% Iдера1 СА-630, 150 мМ №С1, 0,25% желатина) в течение 30 мин при комнатной температуре. Моноклональное антитело (тАЬ) против ЕЕ-22ВА (клон К2.1.5Е4.1) разводили до 2 мкг/мл в буфере А, содержащем 2,5% обезжиренное сухое молоко. Блоты инкубировали с этим первым антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования блоты три раза промывали в буфере А и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторым антителом при разведении 1:5000 (конъюгированным с пероксидазой хрена козьим антителом против крысиных ^С, Ласкзои, Ιιιο) в буфере А с 2,5% обезжиренным сухим молоком. Затем блоты промывали, проявляли хемилюминесцентным субстратом (люминесцентным субстратом для Вестерн-блоттинга; Косйе), и экспонировали с использованием люминесцентного вещества (Маиийе1т Воейлидег ЬитЫтадег).
После 30-минутного экспонирования, невосстанавливающий гель обнаруживал очень яркие полосы для фракции #4 и #5 наряду со слабой полосой для фракции #3. Протестированная в ЕЫ8А фракция #4 также давала положительный результат.
Секвенирование по №концу активной фракции #4
Из пяти пептидных СЫВг-фракций, собранных с аналитической обращенно-фазовой колонки, фракция #4 обнаруживала активность в ЕЫ8А и также давала положительный результат в Вестерн-блотанализе. Для идентификации пептидов, присутствующих в активной фракции #4, образец подвергали деградации по Эдману хорошо известными методами. В этой активной фракции были идентифицированы три №конца, которые соответствовали пептидам 2 (8ЕР ΙΌ N0:49), 3 (8ЕР ΙΌ N0:50) и 5 (8ЕР ΙΌ N0:52). Эти результаты показали, что антитела связываются с пептидами 2 (8ЕР ΙΌ N0:49), 3 (8ЕР ΙΌ N0:50) и 5 (8Ер ΙΌ N0:52).
Таблица 34
Деградация по Эдману Ν-концевая последовательность Идентификаци я пептидов
Первая НЪЕСК ζ)ΚΕΥΕ ГЬСЬТ СЫВг-пептид
последовательность, ΡϋΤΕΕ 5 (ЗЕ<2 Ю
полученная из фракции #4 НЬЕСК ζ)ΚΕΥΕ ЕЬСЬТ N0:52)
СИВг-генерированная ΡϋΤΕΓ ЪС31Т ΙΙΖΓΡΙ
последовательность ш1Ь- ЬЗКЕЗ ΑΡΥνΟ К УКТЬ
22КА ΡΙΛ7ΡΚ (ЗЕ<2 Ю N0:53)
Вторая ΕΤΗΝΗ ΤΕΕΥΥ АКУТА СИВг-пептид
последовательность, УЗАСС 2 (ЗЕС 10
полученная из фракции #4 ΕΤΗΝΗ ΤΕΓΥΥ АКУТА N0:49)
СИВг-генерированная УЗАСО РРУТК Μ (ЗЕО Ю
последовательность ΝΟ:54)
т!Ь-22КА
- 106 009026
Третья ТБКЕЗ ХЫ2НТ ΧΙΧΡΧ СИВг-пептид
последовательность, БХХХ1 3 (3Εζ) Ю
полученная из фракции #4 ТБКЕЗ ЗЫ2НТ ΤΙΚΡΡ N0:50)
СИБг-генерированная ϋντοί РКУКЗ ЮМ (ЗЕ<2 Ю
последовательность N0:55)
т!Ь-22КА
Обсуждение
Из смеси СКЕг-гидролизованных пептидов тГБ-22КА выделяли пять фракций. Из них только фракция #4 была активной в ЕБГ8А и позитивной в Вестерн-анализе. Деградация по Эдману идентифицировала три Оконца, соответствующие СКВг-пептидам 2 (8Е^ ГБ N0:49), 3 (8Е^ ГБ N0:50) и 5 (8Е^ ГБ N0:52) во фракции #4. В этих областях шесть остатков, как предполагается, участвуют в связывании с лигандом. Эти остатки представляют собой Υ93, К112, К210 и Е211 ВЕС) ГБ N0:42, которые также соответствуют остаткам Υ78, К97, К195 и Е196 ВЕС) ГБ N0:62. Остатки Υ60 и Е164 ВЕС) ГБ N0:42 также участвуют в связывании с лигандом.
В. Эпитопы на человеческом ГБ-22КА, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела
Описанные ниже эксперименты имели своей целью идентификацию области или областей во внеклеточном домене аминокислотной последовательности человеческого белка ГБ-22КА (8Е^ ГБ N0:2), которые играют важную роль в активности рецептора или в связывании с антагонистом или нейтрализующим антителом. Белок человеческого растворимого рецептора ГБ-22КА (например, содержащий ВЕС) ГБ N0:3, такой как ГЕ-22КА-Ес, гидролизованный тромбином для удаления Ес) затем подвергали Сконцевому гидролизу до метиониновых остатков в данной последовательности путем инкубирования с бромцианом (СУНг) или с другими известными агентами, гидролизующими человеческий белок на определенные фрагменты. СNВ^-генерированные пептиды фракционировали, и полученные фракции тестировали на связывающую активность, как было детектировано с помощью ЕБГВА, и на реактивность с помощью Вестерн-анализа с использованием моноклональных антител с нейтрализующими свойствами.
Четыре цистеина, как предполагалось, были связаны дисульфидными связями типа Суз71-Суз79 и Суз204-Суз217 ВЕС) ГБ N0:2. После СNВ^-гидролиза, из невосстановленного полноразмерного человеческого ГБ-22КА, были генерированы, как предполагалось, следующие пептиды: пептид 6 (8Е^ ГБ N0:56), пептид 7 (ВЕО ГБ N0:57), пептид 8 (8Е^ ГБ N0:58), пептид 9 (8Е^ ГБ N0:59), пептид 10 (8Е^ ГБ N0:60) и пептид 11 (8Е^ ГБ N0:61) (табл. 35). Цистеины связаны дисульфидными связями и могут, как предполагается, образовывать связь между пептидами 7 (8Е^ ГБ N0:57) и 10 (8Е^ ГБ N0:60). В частности, ВЕО ГБ N0:56 соответствует аминокислотным остаткам 1 (Рго) - 92 (Ме!) ВЕО ГБ N0:3; ВЕО ГБ N0:57 соответствует аминокислотным остаткам 93 (ТЬг) - 120 (Ме!) ВЕО ГБ N0:3, ВЕО ГБ N0:58 соответствует аминокислотным остаткам 121 (Г1е) - 160 (Ме!) ВЕО ГБ N0:3, ВЕО ГБ N0:59 соответствует аминокислотным остаткам 161 (Н1з) - 185 (Ме!) ВЕО ГБ N0:3, ВЕО ГБ N0:60 соответствует аминокислотным остаткам 186 (Г1е) - 199 (Ме!) ВЕО ГБ N0:3, а ВЕО ГБ N0:61 соответствует аминокислотным остаткам 200 (Суз) 211 (ТЬг) ВЕО ГБ N0:3.
Таблица 35
Номер пептида От остатка До остатка Последовательность
СИБг-пептид 6 1 92 Рго С1и Авр Рго Зег Авр Ьеи Ьеи 01п Йв Уа1 Ьув РЬе С1п Зег 8ег Авп РЬе СНи Авп Бе Ьеи ТЬг Тгр Авр Зег СЛу Рго 01и СИу ТЬг Рго Азр ТЬг Уа1 Туг Зег Не 01и Туг Ьув ТЬг Туг СИу 01и Ат§ Авр Тгр Уа1 А1а Ьуз Ьуз СИу Суз 01л Ат§ Не ТЬг Аг§ Ьуз Зег Суз Азп Ьеи ТЬг Уа1 СНи ТЬг 01у Авп Ьеи ТЬг СНи Ьеи Туг Туг А1а Аг& Уа1 ТЬг А1а Уа1 Зег А1а СИу 01у Аг§ Зег А1а ТЬг Ьув Ме! (ЗЩЕ>№:56)
СИВг-пептид 7 93 120 ТЬг Авр Аг§ РЬе Зег Зег Ьеи С1п Ηΐε ТЬг ТЬг Ьеи Ьуз Рго Рго Азр Уа1 ТЬг Сув Не Зег Ьув Уа1 Аг§ Зег Не СИп Ме! (3Ε0©ΝΟ:57)
СЫВг-пептид 8 121 160 Не Уа1 Ηίδ Рго ТЬг Рго ТЬг Рго Не Аг§ А1а 01у Авр 01у ΗΪ5 Аг§ Ьеи ТЬг Ьеи 01и Авр Ле РЬе Ив Авр Ьеи РЬе Туг Ηίδ Ьеи 01и 1^и СНп Уа1 Авп Аг§ ТЬг Туг Ой Ме! (8Εζ)©Ν0:58)
- 107 009026
СЦВг-пептид 9 161 185 Из Ьеи 01у О1у Ьуз 01п Агд 01и Туг 01и РЬе РЬе 01у Ьеи ТЬг Рго Азр ТЬг 01и РЬе Ьеи С1у ТЬгПеМе! (δΕ<2©Ν0: 59)
СЦВг-пептид 10 186 199 Пе Суз Уа] Рго ТЬг Тгр А1а Ьуз О1и Зег А1а Рго Туг Мег (8ΕΟ©ΝΟ:60)
СМВг-пептид 11 200 211 Суз Аг§ Уа) Ьуз ТЬг Ьеи Рго Азр Аг§ ТЬг Тгр ТЬг (5Ε<2©ΝΟ:61)
4. СNВ^-гидролиз и выделение пептидных фракций, Вестерн- и ЕЫБА-анализы и секвенирование по №концу
Примерно 50 мкг человеческого I^-22КА лиофилизовали и разводили, а затем фракционировали, собирали и анализировали с помощью Вестерн-анализа и ЕЫБА-анализа как описано в примере 42А для идентификации фракций, содержащих моноклональные антитела против I^-22КА, и фракций, связывающихся с I^-22КА, на что указывали ЕЫ8А- и Вестерн-анализы. СNВ^-пептидные фракции, собранные с аналитической обращенно-фазовой колонки, были протестированы на активность в ЕЫ8А, и было подтверждено, что они являются позитивными, на что указывал Вестерн-блот-анализ. Пептиды для позитивный фракций идентифицировали путем деградации по Эдману хорошо известными методами.
Обсуждение
Мышиный СNВ^-пептид #5 (8ЕР ГО N0:52) соответствует человеческим СNВ^-пептидам #9 и #10 (8ЕР ГО N0:59 и 81:0 ГО N0:60); мышиный СNВ^-пептид #2 (8ЕР ГО N0:49) соответствует человеческому СNВ^-пептиду #6 (8ЕР ГО N0:56); а мышиный СNВ^-пептид #3 (8ЕР ГО N0:50) соответствует человеческому СNВ^-пептиду #7 (8ЕР ГО N0:57). Из фракций, выделенных из смеси СА'Вггидролизованных пептидов человеческого ГО-22КА, шесть остатков в предполагаемых областях, вероятно, участвуют в связывании с лигандом, а именно: остатки 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕР ГО N0:3), которые играют важную роль в связывании лиганда с рецептором, включают Туг-60, РНе164, Туг-93, Агд-112, Ьук-210 и С1и-211, 81:0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 81:0 ГО N0:3). Кроме того, первичные остатки 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕР ГО N0:3), которые играют важную роль в непосредственном связывании лиганда с рецептором, включают Туг-60 и РНе-164 8Е0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 8Е0 ГО N0:3), а вторичные остатки включают Туг-93, Агд-112, Бук210 и С1и-211 81:0 ГО N0:2 (и соответствующие остатки 81:0 ГО N0:3).
Исходя из представленного выше описания, очевидно, что хотя конкретные варианты осуществления изобретения приводятся лишь в иллюстративных целях, однако, в них могут быть внесены различные модификации, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения. В соответствии с этим, настоящее изобретение ограничено лишь прилагаемой формулой изобретения.

Claims (73)

    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
  1. (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3, простирающейся от аминокислоты 203 (Ьук) до аминокислоты 209 (ТЬг);
    (т) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:3; и (и) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности БЕЦ ΙΌ N0:4, где указанный полипептид вырабатывает иммунный ответ у животного путем продуцирования антитела; и выделение указанного антитела из указанного животного, где указанное антитело специфически связывается с полипептидом I^-22КΛ (БЕЦ ΙΌ N0:2 или БЕЦ ΙΌ N0:3) и снижает активность либо ΙΕ-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8), либо Ш-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6).
    1. Способ продуцирования антитела против полипептида, предусматривающий инокуляцию животного полипептидом, выбранным из группы:
    (a) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Акр);
    (b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго);
    (c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Бук) до аминокислоты 47 (Акр);
    (й) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:2, простирающейся от аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Сук);
    (е) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Бук) до аминокислоты 62 (Сук);
    (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (8ег);
    (д) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 103 (ТНг) до аминокислоты 108 (Акр);
    (H) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1к);
    (I) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 164 (С1у) до аминокислоты 166 (Бук);
    (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и);
    (к) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, простирающей
    - 108 009026 ся от аминокислоты 193 (Ьук) до аминокислоты 196 (А1а);
  2. (2) введение композиции, содержащей антитело по п.16, в фармацевтически приемлемом носителе;
    (2) введение композиции, содержащей антитело по п.15, в фармацевтически приемлемом носителе;
    (2) введение композиции, содержащей антитело, определенное в п.5, в фармацевтически приемлемом носителе;
    (2) введение композиции, содержащей антитело, определенное в п.3, в фармацевтически приемлемом носителе;
    2. Способ по п.1, где указанное антитело, продуцированное указанным способом, снижает провоспалительную активность либо ΙΕ-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8), либо ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6).
  3. (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения композиции;
    (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения композиции;
    (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения композиции;
    - 110 009026 (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижения уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения композиции;
    3. Способ по п.1, где указанное антитело, продуцированное указанным способом, нейтрализует взаимодействие либо Ш-20 (БеЦ ГО N0:8), либо ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6) с I^-22КΛ (БЕЦ ΙΌ N0:2).
  4. (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижения уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижения уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижения уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    4. Способ по п.3, где нейтрализацию указанным антителом определяют путем детекции нейтрализации либо ΙΕ-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8), либо ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6) в клеточном анализе на нейтрализацию 1и У1!го.
  5. 5. Способ по п.1, где указанное антитело, продуцированное указанным способом, снижает провоспалительную активность ΙΕ-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8) и ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6).
  6. 6. Способ по п.1, где указанное антитело, продуцированное указанным способом, нейтрализует взаимодействие Ш-20 (БЕЦ ГО N0:8) и Ш-22 (БЕЦ ГО N0:6) с Ш-22КА (БЕЦ ГО N0:2).
  7. 7. Способ по п.3, где нейтрализацию указанным антителом определяют путем детекции нейтрализации Ш-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8) и ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6) в клеточном анализе на нейтрализацию шУ1!го.
  8. 8. Антитело, продуцированное способом по п.1, где указанное антитело связывается с полипептидом БЕЦ ГО N0:2 или БЕЦ ГО N0:3, и антитело дополнительно включает водорастворимый полимер.
  9. 9. Способ по п.2, где антителом, продуцированным указанным способом, является (а) поликлональное антитело, (Ь) мышиное моноклональное антитело, (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь), (й) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело.
  10. 10. Способ по п.2, где антитело, продуцированное указанным способом, дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин.
  11. 11. Способ по п.9, где антитело дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  12. 12. Способ по п.5, где антителом, продуцированным указанным способом, является (а) поликлональное антитело, (Ь) мышиное моноклональное антитело, (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь), (й) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело.
  13. 13. Способ по п.5, где антитело, продуцированное указанным способом, дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  14. 14. Способ по п.12, где антитело дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  15. 15. Антитело или фрагмент антитела, которые связываются с полипептидом, содержащим последовательность аминокислотных остатков, представленную в БЕЦ ГО N0:3, и снижают провоспалительную активность либо Ш-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8), либо ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6), где антитело дополнительно включает водорастворимый полимер.
  16. 16. Антитело или фрагмент антитела по п.15, где указанное антитело или указанный фрагмент антитела снижает провоспалительную активность Ш-20 (БЕЦ ΙΌ N0:8) и ΙΕ-22 (БЕЦ ΙΌ N0:6).
  17. 17. Антитело или фрагмент антитела по п.15, где указанным антителом или фрагментом антитела является (а) поликлональное антитело, (Ь) мышиное моноклональное антитело, (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь), (й) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело.
  18. 18. Антитело или фрагмент антитела по п.15, где указанное антитело дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  19. 19. Антитело по п.17, которое дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  20. 20. Антитело или фрагмент антитела по п.16, где указанным антителом или фрагментом антитела является (а) поликлональное антитело, (Ь) мышиное моноклональное антитело, (с) гуманизованное антитело, происходящее от антитела (Ь), (й) фрагмент антитела или (е) человеческое моноклональное антитело.
  21. 21. Антитело или фрагмент антитела по п.16, где указанное антитело дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  22. 22. Антитело по п.20, где антитело дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  23. 23. Способ подавления или ингибирования ΙΕ-22-индуцированной или ΙΕ-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, где указанный способ предусматривает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело, указанное в п.3, в количестве, достаточном для подавления
    - 109 009026 пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови, по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствии указанного антитела.
  24. 24. Способ по п.23, где указанными гемопоэтическими клетками и предшественниками гемопоэтических клеток являются лимфоидные клетки.
  25. 25. Способ по п.24, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
  26. 26. Способ ослабления I^-22-индуцированного или I^-20-индуцированного воспаления у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему количества композиции, включающей антитело, определенное в п.3, которое ослабляет воспаление.
  27. 27. Способ подавления или ингибирования I^-22-индуцированной и I^-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, где указанный способ предусматривает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело, определенное в п.5, в количестве, достаточном для подавления пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови, по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствии указанного антитела.
  28. 28. Способ по п.27, где указанными гемопоэтическими клетками и предшественниками гемопоэтических клеток являются лимфоидные клетки.
  29. 29. Способ по п.28, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
  30. 30. Способ ослабления I^-22-индуцированного и I^-20-индуцированного воспаления у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему количества композиции, включающей антитело, продуцированное способом по п.5, которое ослабляет воспаление.
  31. 31. Способ подавления или ингибирования I^-22-индуцированной и I^-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, где указанный способ предусматривает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело или фрагмент антитела по п.15 в количестве, достаточном для подавления пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови, по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствии указанного антитела или фрагмента антитела.
  32. 32. Способ по п.31, где указанными гемопоэтическими клетками и предшественниками гемопоэтических клеток являются лимфоидные клетки.
  33. 33. Способ по п.32, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
  34. 34. Способ ослабления I^-22-индуцированного и I^-20-индуцированного воспаления, предусматривающий введение млекопитающему количества композиции, включающей антитело или фрагмент антитела по п.15, которое ослабляет воспаление.
  35. 35. Способ подавления или ингибирования I^-22-индуцированной и I^-20-индуцированной пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и предшественников гемопоэтических клеток, где указанный способ предусматривает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело или фрагмент антитела по п.16 в количестве, достаточном для подавления пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови, по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствии указанного антитела.
  36. 36. Способ по п.35, где указанными гемопоэтическими клетками и предшественниками гемопоэтических клеток являются лимфоидные клетки.
  37. 37. Способ по п.36, где указанными лимфоидными клетками являются макрофаги или Т-клетки.
  38. 38. Способ ослабления I^-22-индуцированного и I^-20-индуцированного воспаления, предусматривающий введение млекопитающему количества композиции, включающей антитело или фрагмент антитела, определенного в п.3, которое ослабляет воспаление.
  39. 39. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего, предусматривающий:
  40. 40. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, предусматривающий:
  41. 41. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, предусматривающий:
  42. 42. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, предусматривающий:
  43. 43. Способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играют Ш-22 или ΙΣ-20, где указанный способ предусматривает введение антагониста Ш-22 или ΙΣ-20 млекопитающему для ослабления воспаления, где указанный антагонист включает (1) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом или фрагментом полипептида Ш^КА (8ЕЦ ΙΌ NО:3), или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида Ш-22КА (8ЕЦ ΙΌ NО:3), где воспалительная активность либо ΙΣ-22 (8ЕЦ ΙΌ NО:6), либо ΙΣ-20 (8ЕЦ ΙΌ NО:8) является сниженной.
  44. 44. Способ по п.43, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание.
  45. 45. Способ по п.44, где указанным хроническим воспалительным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  46. 46. Способ по п.43, где указанным воспалительным заболеванием является острое воспалительное заболевание.
  47. 47. Способ по п.46, где указанное острое воспалительное заболевание включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
  48. 48. Способ по п.43, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно включают радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  49. 49. Способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играют Ш-22 и ΙΣ-20, где указанный способ предусматривает введение антагониста Ш-22 и ΙΣ-20 млекопитающему для ослабления воспаления, где указанный антагонист включает (ί) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом или фрагментом полипептида Ш-22КА (8ЕЦ ΙΌ NО:3), или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида Ш-22КА (8ЕЦ ΙΌ NО:3), где воспалительная активность Ш-22 (8ЕЦ ΙΌ NО:6) и ΙΣ-20 (8ЕЦ ΙΌ NО:8) является сниженной.
  50. 50. Способ по п.49, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание.
  51. 51. Способ по п.50, где указанное хроническое воспалительное заболевание включает воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  52. 52. Способ по п.49, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание.
  53. 53. Способ по п.52, где указанное острое воспалительное заболевание включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
  54. 54. Способ по п.49, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно включают радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  55. 55. Антитело, включающее моноклональное антитело, которое специфически связывается с антигенным эпитопом человеческого Ш^КА (8ЕЦ ΙΌ NО:3), из группы:
    (a) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО:3, простирающейся от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Акр);
    (b) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО:3, простирающейся от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго);
    (c) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Ьук) до аминокислоты 47 (Акр);
    (б) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО:2, простирающейся от
    - 111 009026 аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Сук);
    (е) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 41 (Ьук) до аминокислоты 62 (Сук);
    (Т) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (Зег);
    (д) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 103 (ТНг) до аминокислоты 108 (Акр);
    (H) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1к);
    (ί) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 164 (С1у) до аминокислоты 166 (Ьук);
    (ί) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и);
    (к) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 193 (Ьук) до аминокислоты 196 (А1а);
    (I) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3, простирающейся от аминокислоты 203 (Ьук) до аминокислоты 209 (ТНг);
    (ш) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:3; и (п) эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности ЗЕЦ ГО N0:4, где указанное антитело снижает или нейтрализует активность либо человеческого Ш-22 (ЗЕЦ ГО N0:8), либо Ш-20 (ЗЕЦ ГО N0:6), и антитело дополнительно включает водорастворимый полимер.
  56. 56. Антитело по п.55, где указанное антитело снижает или нейтрализует активность человеческого Ш-22 (ЗЕО ГО N0:6) и Ш-22 (ЗЕО ГО N0:8).
  57. 57. Антитело по п.55, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из (а) мышиного моноклонального антитела, (Ь) гуманизованного антитела, происходящего от антитела (а), (с) фрагмента антитела или (б) человеческого моноклонального антитела.
  58. 58. Антитело по п.57, где указанное антитело дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  59. 59. Антитело по п.56, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из (а) мышиного моноклонального антитела, (Ь) гуманизованного антитела, происходящего от антитела (а), (с) фрагмента антитела или (б) человеческого моноклонального антитела.
  60. 60. Антитело по п.59, где указанное антитело дополнительно включает полиэтиленгликоль.
  61. 61. Способ лечения патологического состояния у индивидуума, ассоциированного с активностью Ш-22КА, где указанный способ предусматривает введение антитела по п.55 в количестве, эффективном для лечения указанного патологического состояния.
  62. 62. Способ по п.61, где указанным патологическим состоянием является хроническое воспалительное состояние.
  63. 63. Способ по п.62, где указанное хроническое воспалительное состояние включает воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  64. 64. Способ по п.61, где указанным патологическим состоянием является острое воспалительное состояние.
  65. 65. Способ по п.64, где указанное острое воспалительное состояние включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
  66. 66. Способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в патогенезе которого определенную роль играет Ш-22КА, где указанный способ предусматривает введение антагониста Ш-22КА млекопитающему для ослабления воспаления, где указанный антагонист включает антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, которые специфически связываются с полипептидом или фрагментом полипептида Ш-22КА (ЗЕЦ ГО N0:3), и где указанная воспалительная активность является сниженной.
  67. 67. Способ по п.66, где указанным заболеванием является хроническое воспалительное заболевание.
  68. 68. Способ по п.67, где указанное хроническое воспалительное заболевание включает воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  69. 69. Способ по п.66, где указанным заболеванием является острое воспалительное заболевание.
  70. 70. Способ по п.69, где указанное острое воспалительное заболевание включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
  71. 71. Способ по п.66, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно включают радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.
  72. 72. Способ по п.66, где указанное антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид дополнительно включают полиэтиленгликоль.
  73. 73. Способ ослабления воспаления, предусматривающий введение млекопитающему, страдающему таким воспалением, композиции антитела по п.55 в количестве, достаточном для ослабления воспаления.
EA200501505A 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях EA009026B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45748103P 2003-03-24 2003-03-24
US52329503P 2003-11-17 2003-11-17
PCT/US2004/008956 WO2004085476A2 (en) 2003-03-24 2004-03-24 Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501505A1 EA200501505A1 (ru) 2006-06-30
EA009026B1 true EA009026B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=33101289

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501506A EA009124B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
EA200501505A EA009026B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501506A EA009124B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении

Country Status (16)

Country Link
US (6) US20040209330A1 (ru)
EP (2) EP1606316A2 (ru)
JP (2) JP2007525438A (ru)
KR (3) KR20050116392A (ru)
CN (2) CN103864934A (ru)
AT (1) ATE475673T1 (ru)
AU (2) AU2004223836A1 (ru)
BR (2) BRPI0408683A (ru)
CA (2) CA2519089C (ru)
DE (1) DE602004028347D1 (ru)
DK (1) DK1606317T3 (ru)
EA (2) EA009124B1 (ru)
ES (1) ES2347657T3 (ru)
MX (2) MXPA05010134A (ru)
NO (1) NO20054892L (ru)
WO (2) WO2004085475A2 (ru)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8431127B2 (en) 2007-12-05 2013-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating pruritus comprising administering an NR10 antagonist
RU2487136C2 (ru) * 2008-12-05 2013-07-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
US8575317B2 (en) 2007-12-05 2013-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
US9028821B2 (en) 2006-06-08 2015-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of treating an inflammatory disease comprising administering an NR 10 antibody antagonist
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2016076760A3 (ru) * 2014-11-11 2016-07-14 Петр Иванович НИКИТИН Субстанция и способ применения упомянутой субстанции для модуляции активности агента в организме
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10544227B2 (en) 2015-04-14 2020-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US11260125B2 (en) 2019-11-20 2022-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL31RA antibody-containing formulations
US11332533B2 (en) 2007-09-26 2022-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US12441804B2 (en) 2015-04-14 2025-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965704A (en) * 1997-08-05 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Class two cytokine receptor-11
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
ATE547525T1 (de) 2000-08-08 2012-03-15 Zymogenetics Inc Lösliche zcyctor 11 cytokinrezeptoren
ATE460429T1 (de) 2000-09-15 2010-03-15 Zymogenetics Inc Polypeptide enthaltend extrazellulären domäne von il-20ra und/oderr il-20rb
WO2003051384A1 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating cervical cancer
EA009124B1 (ru) * 2003-03-24 2007-10-26 Займоджинетикс, Инк. Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
JP4991307B2 (ja) * 2003-11-21 2012-08-01 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−２０抗体および結合パートナーならびに炎症において用いる方法
US20090285771A1 (en) * 2004-10-04 2009-11-19 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules
DK1812476T3 (da) * 2004-10-22 2010-10-25 Zymogenetics Inc Anti-IL-22RA-antistoffer og bindingspartnere samt fremgangsmåder til anvendelse ved inflammation
CN100515491C (zh) * 2005-01-04 2009-07-22 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22的医药用途
EP2192132A3 (en) * 2005-02-08 2010-08-18 ZymoGenetics, Inc. Anti-IL-20, anti-IL22 and anti-IL-22RA antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
WO2007126439A2 (en) * 2005-12-02 2007-11-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to il-22 and il-22r
US20070148131A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-28 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of binding partners
US7666991B2 (en) * 2005-12-05 2010-02-23 Trinity Biosystems, Inc. Compositions for needleless delivery of antibodies
AU2006330573A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Dhy & Co., Ltd Antibodies against interleukin-22 binding protein and its uses
US20090305978A1 (en) * 2006-03-16 2009-12-10 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
US20090092660A1 (en) * 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
TW201022288A (en) * 2008-06-30 2010-06-16 Novo Nordisk As Anti-human interleukin-20 antibodies
US8454956B2 (en) 2009-08-31 2013-06-04 National Cheng Kung University Methods for treating rheumatoid arthritis and osteoporosis with anti-IL-20 antibodies
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP2686347B1 (en) 2011-03-16 2018-05-02 argenx BVBA Antibodies to cd70
US10150989B2 (en) 2011-08-05 2018-12-11 Universite D'aix Marseille Fibrosis susceptibility IL22RA2 gene and uses thereof
US8597647B1 (en) * 2012-05-22 2013-12-03 National Cheng Kung University Humanized anti-IL-20 antibody and uses thereof
WO2014006230A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Novo Nordisk A/S Il-20 epitopes and il-20 ligands
US9221904B2 (en) 2012-07-19 2015-12-29 National Cheng Kung University Treatment of osteoarthritis using IL-20 antagonists
US8603470B1 (en) 2012-08-07 2013-12-10 National Cheng Kung University Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases
US8852588B2 (en) 2012-08-07 2014-10-07 National Cheng Kung University Treating allergic airway disorders using anti-IL-20 receptor antibodies
WO2014033252A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 arGEN-X BV Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
CN105601739B (zh) * 2016-02-22 2019-01-18 王晨辉 一种人源化抗白介素22基因工程抗体及其应用
EP3464357A1 (en) 2016-05-24 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of pulmonary bacterial infections
GB201612337D0 (en) * 2016-07-15 2016-08-31 Argen-X N V Ant-il-22r antibodies
JOP20190155A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-23 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2020210816A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Methodist Hospital Research Institute Therapeutic particles that enable antigen presenting cells to attack cancer cells
US20220307035A1 (en) * 2019-06-12 2022-09-29 Acurasysbio Co., Ltd. Composition for preventing or treating cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007848A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine receptor-11
WO2002012345A2 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Zymogenetics, Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
WO2002072607A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Zymogenetics, Inc. Soluble heterodimeric cytokine receptor

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) * 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
NZ212437A (en) * 1985-06-17 1992-06-25 Mark Philip Best Site-directed antibody conjugates, and their preparation
WO1989004838A1 (en) * 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5567584A (en) * 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5436155A (en) * 1991-12-31 1995-07-25 Arch Development Corporation Isolated DNA encoding a somatostatin receptor
US5789192A (en) 1992-12-10 1998-08-04 Schering Corporation Mammalian receptors for interleukin-10 (IL-10)
ATE203274T1 (de) 1994-02-01 2001-08-15 Nasa Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
JP3713074B2 (ja) * 1995-08-30 2005-11-02 栄研化学株式会社 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体
US5843697A (en) 1996-07-17 1998-12-01 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cells expressing IL-10 receptor and the CRFB4 gene product, an IL-10 receptor accessory protein
US5985614A (en) * 1996-08-30 1999-11-16 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-19
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US6133426A (en) * 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6486301B1 (en) * 1997-07-16 2002-11-26 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-20
WO1999003982A1 (en) 1997-07-16 1999-01-28 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-20
KR100236609B1 (ko) * 1997-08-01 2000-02-01 박호군 클로로하이드로실란 유도체 및 이의 제조방법
JP2001512668A (ja) 1997-08-06 2001-08-28 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド リポカリン相同体
US6551799B2 (en) * 1999-12-07 2003-04-22 Genentech, Inc. Interleukin-22 polypeptides, nucleic acids encoding the same and methods for the treatment of pancreatic disorders
EP1032671B1 (en) 1997-11-26 2004-06-23 ZymoGenetics, Inc. Mammalian cytokine-like polypeptide-10
US6576743B1 (en) * 1997-11-26 2003-06-10 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine-like polypeptide-10
CA2318482C (en) 1998-01-23 2010-04-13 Immunex Corporation Il-18 receptors
EP1062332A2 (en) 1998-03-09 2000-12-27 Schering Corporation Human receptor proteins; related reagents and methods
NZ507435A (en) 1998-03-10 2003-12-19 Genentech Inc Novel polypeptides and nucleic acids with homology to cornichon
US6197582B1 (en) * 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
US6982320B2 (en) 1998-03-19 2006-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like
WO1999061630A2 (en) 1998-05-26 1999-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric molecules comprising an extracellular ligand binding domain of a receptor and an ige fc or constant region, and their use in an assay system
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
JP3769189B2 (ja) 1998-10-26 2006-04-19 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｔ細胞誘導性因子（ｔｉｆ）をコードする単離された核酸分子、コードされたタンパク質およびその使用
US6274710B1 (en) * 1998-10-26 2001-08-14 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies which specifically bind T Cell inducible factors (TIFs)
WO2000039161A1 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Class ii cytokine receptor-like proteins and nucleic acids encoding them
JP4828703B2 (ja) 1999-04-28 2011-11-30 ジェネティックス インスティテュート エルエルシー ヒトｇｉｌ−１９／ａｅ２８９タンパク質、及び、同タンパク質をコードするポリヌクレオチド
JP2002543840A (ja) 1999-05-19 2002-12-24 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 細胞外シグナル伝達分子
AU5047600A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Schering Corporation Mammalian interleukin-10 homologs: il-d110 and il-d210
JP2003529324A (ja) 1999-06-15 2003-10-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
ES2286029T3 (es) 1999-07-07 2007-12-01 Zymogenetics Inc Receptor de citocina humano.
AU7573000A (en) 1999-09-01 2001-03-26 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU1919201A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Schering Corporation Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
US6897292B2 (en) * 1999-12-03 2005-05-24 Zymogenetics, Inc. Human cytokine receptor
JP2003524415A (ja) 1999-12-23 2003-08-19 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトカインｚｃｙｔｏ１８
WO2001046232A2 (en) 1999-12-23 2001-06-28 Zymogenetics, Inc. Soluble interleukin-20 receptor
WO2001046261A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation
US6610286B2 (en) * 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
NZ523122A (en) 2000-06-22 2004-06-25 Smithkline Beecham Corp Polypeptides and polynucleotides and methods of identifying agonists and antagonists in relation to treatment of diseases
JP2002015498A (ja) * 2000-06-29 2002-01-18 Fujitsu Ltd センス電流の設定方法
CA2419979A1 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Schering Corporation Mammalian genes; related reagents and methods
ATE460429T1 (de) * 2000-09-15 2010-03-15 Zymogenetics Inc Polypeptide enthaltend extrazellulären domäne von il-20ra und/oderr il-20rb
US7268223B2 (en) 2000-09-22 2007-09-11 Wyeth Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof
US20030022827A1 (en) * 2000-09-25 2003-01-30 Bertram Weiss Three new members of the cytokine receptor family class 2
CA2434652A1 (en) 2001-01-12 2002-08-29 Genetics Institute, Llc. Type 2 cytokine receptor and nucleic acids encoding same
WO2002058724A2 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Eli Lilly And Company Use of lp82 to treat body weight disorders
NZ527396A (en) 2001-02-23 2007-12-21 Genetics Inst Llc Antibodies and fragments thereof for the binding of IL-22 and use therefore for treating inflammatory disorders
CN1503677A (zh) * 2001-02-28 2004-06-09 用lp82治疗造血障碍
JP2004532624A (ja) * 2001-03-02 2004-10-28 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド マウスサイトカイン受容体
AU2002252460A1 (en) 2001-03-27 2002-10-08 Zymogenetics, Inc. Human cytokine receptor
ATE446317T1 (de) * 2001-05-11 2009-11-15 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung
EP1439850A4 (en) 2001-10-22 2006-05-03 Lilly Co Eli SOLUBLE PROTEINS THAT RESIST CYTOKIN SIGNAL TRANSFER PATHS
DE10154579A1 (de) 2001-11-07 2003-05-28 Medigene Ag Topikale Verwendung von Cytokinen und Chemokinen zur Behandlung von viralen oder mykotischen Hauterkrankungen oder Tumorerkrankungen
WO2003051384A1 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating cervical cancer
US20040236075A1 (en) * 2002-07-24 2004-11-25 Laure Dumoutier Novel glass II cytokine receptors, and uses thereof
CN1845937A (zh) * 2003-03-24 2006-10-11 津莫吉尼蒂克斯公司 抗il－20抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
EA009124B1 (ru) * 2003-03-24 2007-10-26 Займоджинетикс, Инк. Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
JP4991307B2 (ja) * 2003-11-21 2012-08-01 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−２０抗体および結合パートナーならびに炎症において用いる方法
DK1812476T3 (da) * 2004-10-22 2010-10-25 Zymogenetics Inc Anti-IL-22RA-antistoffer og bindingspartnere samt fremgangsmåder til anvendelse ved inflammation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007848A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine receptor-11
WO2002012345A2 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Zymogenetics, Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
WO2002072607A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Zymogenetics, Inc. Soluble heterodimeric cytokine receptor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS 'Online! BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 8 March 2001 (2001-03-08), NAGALAKSHMI MAREHALLI L. ET AL.: "Human IL-22 (IL-TIF) is a novel homolog of IL-10 that phosphorylates STAT 3 in colon carcinoma cells expressing the IL-22R1 chain", XP002311890, Database accession no. PREV200100264637, abstract & FASEB JOURNAL, vol. 15, no. 5, 8 March 2001 (2001-03-08), page A1052, ANNUAL MEETING OF THE FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY ON EXPERIMENTAL BIOL; ORLANDO, FLORIDA, USA; MARCH 31-APRIL 04, 2001, ISSN: 0892-6638 *
RAMESH R. ET AL.: "Melanoma differentiation-associated gene 7/interleukin (IL)-24 is a novel ligand that regulates angiogenesis via the IL-22 receptor" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, vol. 63, no. 16, 15 August 2003 (2003-08-15), pages 5105-5113, XP002302973, ISSN: 0008-5472 *
XIE M.-H. ET AL.: "Interleukin (IL)-22, a novel human cytokine that signals through the interferon receptor-related proteins CRF2-4 and IL-22R" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 275, no. 40, 6 October 2000 (2000-10-06), pages 31335-31339, XP002164307, ISSN: 0021-9258 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US12473375B2 (en) 2006-03-31 2025-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US9028821B2 (en) 2006-06-08 2015-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of treating an inflammatory disease comprising administering an NR 10 antibody antagonist
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11248053B2 (en) 2007-09-26 2022-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11332533B2 (en) 2007-09-26 2022-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US8575317B2 (en) 2007-12-05 2013-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
US9399680B2 (en) 2007-12-05 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-NR10 antibodies
US8431127B2 (en) 2007-12-05 2013-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating pruritus comprising administering an NR10 antagonist
US11371039B2 (en) 2008-04-11 2022-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9890377B2 (en) 2008-04-11 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US11359194B2 (en) 2008-04-11 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US10472623B2 (en) 2008-04-11 2019-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
RU2487136C2 (ru) * 2008-12-05 2013-07-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10066018B2 (en) 2009-03-19 2018-09-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2016076760A3 (ru) * 2014-11-11 2016-07-14 Петр Иванович НИКИТИН Субстанция и способ применения упомянутой субстанции для модуляции активности агента в организме
US10544227B2 (en) 2015-04-14 2020-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
US11773173B2 (en) 2015-04-14 2023-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
US12441804B2 (en) 2015-04-14 2025-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
US11260125B2 (en) 2019-11-20 2022-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL31RA antibody-containing formulations
US11723976B2 (en) 2019-11-20 2023-08-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of administering anti-IL31A antibody-containing formulations
US12171830B2 (en) 2019-11-20 2024-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-31RA antibody-containing formulations

Also Published As

Publication number Publication date
EP1606316A2 (en) 2005-12-21
AU2004223837A1 (en) 2004-10-07
AU2004223837C1 (en) 2012-03-15
WO2004085476A2 (en) 2004-10-07
KR20050116390A (ko) 2005-12-12
WO2004085475A2 (en) 2004-10-07
JP2007525438A (ja) 2007-09-06
EP1606317A2 (en) 2005-12-21
CA2519089C (en) 2014-12-23
US8163286B2 (en) 2012-04-24
EP1606317B1 (en) 2010-07-28
BRPI0408683A (pt) 2006-03-28
US20090074661A1 (en) 2009-03-19
WO2004085476A3 (en) 2005-03-31
NO20054892L (no) 2005-12-23
AU2004223837B2 (en) 2011-04-21
AU2004223836A1 (en) 2004-10-07
ATE475673T1 (de) 2010-08-15
WO2004085475A3 (en) 2005-07-14
AU2004223837A2 (en) 2004-10-07
NO20054892D0 (no) 2005-10-21
US20060134756A1 (en) 2006-06-22
BRPI0408705A (pt) 2006-03-07
CN102690350A (zh) 2012-09-26
US20120207761A1 (en) 2012-08-16
CA2519057A1 (en) 2004-10-07
CN103864934A (zh) 2014-06-18
CA2519089A1 (en) 2004-10-07
AU2004223836A2 (en) 2004-10-07
KR20110091598A (ko) 2011-08-11
US20040209330A1 (en) 2004-10-21
US20080233115A1 (en) 2008-09-25
JP2007525437A (ja) 2007-09-06
MXPA05010134A (es) 2005-11-16
MXPA05010136A (es) 2005-11-16
EA009124B1 (ru) 2007-10-26
EA200501506A1 (ru) 2006-06-30
ES2347657T3 (es) 2010-11-03
EA200501505A1 (ru) 2006-06-30
DK1606317T3 (da) 2010-10-25
US20100111948A1 (en) 2010-05-06
DE602004028347D1 (de) 2010-09-09
KR20050116392A (ko) 2005-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
JP5904985B2 (ja) 免疫調節因子であるｂａｆｆレセプター（ｂｃｍａ）
ES2334140T3 (es) Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion.
KR100834809B1 (ko) Ｂａｆｆ, 관련 차단제 및 면역 반응에서 ｂ 세포와면역글로불린을 촉진 및 억제하는데에 있어서 이들의 용도
ES2229264T5 (es) Receptor il-17.
ES2353637T3 (es) Moléculas denominadas ldcam.
EA015706B1 (ru) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
EA010594B1 (ru) Слитые белки taci-иммуноглобулина
EA015351B1 (ru) Антагонисты il-17a и il-17f и способы их применения
JP2006508023A (ja) 抗ｉｌ−ｔｉｆ抗体および炎症において使用する方法
US8440185B2 (en) Compositions and methods for the treatment of immunologic disorders
EA005948B1 (ru) Применение cd2-связывающего агента для избирательного снижения числа cd45ro-позитивных эффекторных т-лимфоцитов памяти в организме пациента
EA012567B1 (ru) Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела
JP4689275B2 (ja) Ｋｉｍ−１アンタゴニストおよび免疫系を調節するための使用
CZ34293A3 (en) Preparation for treating tumorous diseases
JP2008516985A (ja) 可溶性ｚｃｙｔｏｒ２１、抗ｚｃｙｔｏｒ２１抗体及び結合パートナー、並びに炎症における使用方法
CN1798768B (zh) 抗il-22ra抗体和结合伴侣及其应用
JP2005528087A (ja) ヒトマスト細胞により発現される膜タンパク質
CN101371923B (zh) Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
HK1173453A (en) Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU