DK2756101T3

DK2756101T3 - Sonde:antisondesammensætninger til detektering af dna eller rna med høj specificitet

Info

Publication number: DK2756101T3
Application number: DK12831521.5T
Authority: DK
Inventors: David A Shafer
Original assignee: David A Shafer
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2018-08-27
Also published as: ES2684525T3; CN103946398A; EP2756101A2; US20140287410A1; EP2756101B1; CA2849023A1; EP2756101A4; WO2013040491A3; CA2849023C; US11667971B2; CN103946398B; WO2013040491A2

Claims

1. System til selektiv detektering af en målnukleotidsekvens, hvilket system omfatter mindst ét sonde:antisondesystem, der omfatter; (a) et sondeoligonukleotid, der omfatter en nukleotidsekvens, der er komplementær til en første målnukleotidsekvens, og en første markørdel forbundet dermed; og (b) et antisondeoligonukleotid, der omfatter en nukleotidsekvens fuldt komplementær til sondeoligonukleotidet bortset fra mindst én fejlmatchet base i en ikke-terminal position, og en anden markørdel, hvor den anden markørdel er bundet til antisondeoligonukleotidet eller er et område af antisondeoligonukleotidet, hvor: (i) sondeoligonukleotidet er konfigureret til større hybridiseringsaffinitet for den første målnukleotidsekvens end for antisondeoligonukleotidet; og antisondeoligonukleotidet er konfigureret til større hybridiseringsaffinitet for sondeoligonukleotidet end sondeoligonukleotidet har hybridiseringsaffinitet for en anden målnukleotidsekvens af interesse; (ii) i tilstedeværelse af den første målnukleotidsekvens, sondeoligonukleotidet og den første målnukleotidsekvens danner et dupleks, hvorefter første og anden markørdele ikke interagerer, hvorved der tilvejebringes et første detekterbart signal; (iii) i fravær af den første målnukleotidsekvens, sondeoligonukleotidet og antisondeoligonukleotidet danner et dupleks, hvorved det gøres muligt for første og anden markørdele at interagere for at tilvejebringe et moduleret detekterbart signal, hvor det første og de modulerede detekterbare signaler kan adskilles fra hinanden; og (iv) i tilstedeværelse af den anden målnukleotidsekvens, der adskiller sig fra den første målsekvens med mindst en basefejlmatch, sondeoligonukleotidet og antisondeoligonukleotidet fortrinsvis danner et dupleks, hvorved sondeoligonukleotidet hæmmes i at danne et dupleks med den anden målnukleotidsekvens.

2. System ifølge krav 1, hvor duplekset af sondeoligonukleotidet og den første målnukleotidsekvens, og duplekset af sondeoligonukleotidet og antisondeoligonukleotidet adskiller sig med mindst ca. 2 kcal/mol i AG og mindst ca. 4 °C i Tm; og hvor duplekset af sondeoligonukleotidet og den anden målnukleotidsekvens, og duplekset af sondeoligonukleotidet og den første målnukleotidsekvens adskiller sig med mindst ca. 4 kcal/mol i AG og mindst ca. 8 °C i Tm.

3. System ifølge krav 1, hvor sondeoligonukleotidsekvensen er konfigureret med en fejlmatchet baseposition ca. to baser væk fra et forventet fejlmatch mellem den anden målnukleotidsekvens og sondens sekvens; hvorved de to fejlmatchede baser genererer et indre ikke-hybridiseret to- eller tre-base-område af sondeoligonukleotid: anden målnukleotidsekvenskomplekset, hvilket dupleks derved har AG og Tm, der er mindre end AG og Tm for sondeoligonukleotid:antisondeoligonukleotidduplekset.

4. System ifølge krav 1 til 3, hvor én markørdel er en fluorescens-emitter, og den anden markørdel omfatter en fluorescens-modulator; hvor fluorescens-modulatoren er valgt fra gruppen bestående af: en quencher-forbindelse, en fluorescerende forbindelse, en metalpartikel og et guanin-rigt konjugat.

5. System ifølge krav 1 til 3, hvor sondeoligonukleotidet omfatter en fluorescens-emitter og enten en fluorescens-modulator eller en anden fluorescens-emitter, og hvor antisondeoligonukleotidet omfatter en fluorescens-modulator og eventuelt omfatter en fluorescens-emitter eller en anden fluorescens-modulator.

6. System ifølge krav 5, hvor antisondeoligonukleotidet er kombineret med et Taqman-eller Molecular Beacon-sonde-assay; hvor antisondeoligonukleotidet omfatter en fluorescens-modulator og omfatter en sekvens delvist komplementær til en Taqman- eller Molecular Beacon-sonde.

7. System ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, der endvidere omfatter et andet sondeoligonukleotid, hvor det første og det andet sondeoligonukleotid selektivt hybridiseres til forskellige målnukleotidsekvenser af et nukleinsyretemplate; og hvor de to sondeoligonukleotider tilvejebringer to forskellige detekterbare signaler eller det samme detekterbare signal; hvor (i) det første sondeoligonukleotid omfatter en primersonde, der er konfigureret til at samvirke med et primeroligonukleotid for at amplificere et første amplikon med en første markør, hvorved der tilvejebringes et signal i forhold til amplikonfrekvens, og (ii) det andet sondeoligonukleotid enten er en anden primersonde eller en indre sonde, der omfatter em anden markør og en sekvens komplementær til en målsekvens, der omfatter et variabelt sekvenssegment af det første amplikon, eller en variabel sekvens et andet sted i en nukleinsyretemplate; hvorefter forskellen i signalering mellem den første primersonde og den anden sonde tilvejebringer en indikator for frekvensen af den varierende sekvens i forhold til frekvensen af det første amplikon; eller en ikke-mærket blokerende terminators onde til selektivt at undertrykke qPCR-amplifikation og detektering af en første målsekvens versus en anden målsekvens; hvor primersonden omfatter: (i) et oligonukleotid, der er komplementært til den første målnukleotidsekvens, (ii) en 5'-ende modificeret til at modstå exonukleasedigestion, (iii) en 3'-ende modificeret til at modstå polymerase-ekstension, og (iv) hvor primersonden endvidere er konfigureret med Tm og AG, der overstiger Tm og AG for primerne og eller sonderne fra qPCR-assayet med mindst ca. 5 kcal/mol i AG og med mindst ca. 5 °C i Tm.

8. System ifølge krav 7, hvor mindst ét af sondeoligonukleotidet og antisondeoligonukleotidet omfatter mindst ét af: et ikke-naturligt nukleotid, en Minor Groove Binder (MGB) og en Zip-nukleinsyre (ZNA).

9. System ifølge krav 7, hvor systemet, der omfatter en anden sonde, er konfigureret til at detektere en variabel multi-basedeletion inden for kodoneme 746 til 753 af exon 19 i EGFR-genet, hvilket system omfatter mindst én ikke-mærket primer, og to sonde:antisondesystemer med forskellig mærkning; hvor det første sondesystem omfatter en primersonde komplementær til en ikke-specifik første sekvens; hvor det andet sondesystem er komplementært til vildsekvensen ved exon 19-deletionsstedet og hæmmer eller udelukker detektering af måltemplates, der omfatter en multibasedeletion inden for kodonerne 746 til 753 af exon 19 i EGFR-genet; hvorefter tilstedeværelsen og frekvensen af en exon 19-deletion analyseres ved sammenligning af de to sondesystemers relative signalering; og hvor det ikke-specifikke sonde:antisonde-primer-sæt er SEQ ID NO: 56, 57 og 53, eller SEQ ID NO: 79, 80 og 12; og hvor deletion-19-wild-only-sonde:antisonde-primer-sættet er SEQ ID NO: 81, 82 og 53, eller SEQ ID NO: 54, 55 og 53, og hvor hvert ikke-specifikt sonde:antisonde-primer-sæt og deletion-19-wild-only-sonde:antisonde-primer-sættet eventuelt kan indbefatte supplerende primer SEQ ID NO: 78.

10. System ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9, hvor systemet er valgt fra gruppen bestående af: a) en iDDS-sonde, hvor 3'-ende af sondeoligonukleotidet, og eventuelt af antisondeoligonukleotidet, er blokeret for at forhindre polymerase-ekstension; og hvor systemet endvidere omfatter et par flankerende primere konfigureret til amplifikation af et nukleinsyreområde, der omfatter den første målnukleotidsekvens; b) en Flip-sonde, hvor antisondeoligonukleotidet endvidere omfatter, at ved 3'-enden deraf, et første primeroligonukleotid; hvor, eventuelt, antisondeoligonukleotidet og det første primeroligonukleotid er bundet af et abasisk spacer-område; og systemet endvidere omfatter et andet primeroligonukleotid, hvor det første og det andet primeroligonukleotid er konfigureret til amplifikation af et nukleinsyreområde, der omfatter den første målnukleotidsekvens; c) en ZIPR-sonde, der omfatter et primersonde-amplikondetekteringssystem, hvor sondeoligonukleotidet omfatter en primersekvens og er konfigureret til samvirke med et primeroligonukleotid for at amplificere en målnukleotidsekvens, hvorefter et detekterbart signal genereres, når sondeoligonukleotidet er inkorporeret i et amplikon; og d) en G-Force primersonde, der omfatter: (i) et 5'-fluorescerende mærket sondesegment, der omfatter en cytosin-rig sekvens med ca. 7 til 9 baser, (ii) en abasisk spacer, (iii) en guanin-rig antisondesekvens komplementær til det cytosin-rige sekvensområde, og (iv) en primersekvens; hvorefter, når det mærkede primersondeoligonukleotid er inkorporeret i de genererede amplikoner, et detekterbart signal aktiveres.

11. System ifølge krav 10, der endvidere omfatter et ISAM isotermisk amplifikationssystem, der er egnet til amplifikation og detektering af en RNA- eller DNA-målsekvens, hvor primersondeoligonukleotidet er konfigureret til at samvirke med en flankerende primer for at amplificere målsekvensen; hvor den flankerende primer eller primersondeoligonukleotidet eller begge endvidere omfatter en 5'-RNA- polymerasepromotersekvens; og hvor amplifikation-detekteringssystemet endvidere omfatter et RNA-polymerasepromoterenzym, et reverse trans skriptaseenzym og RNaseH-enzym; og hvor et antisondeoligonukleotid eventuelt omfatter en sekvens komplementær til RNA-polymerasepromotersekvensen; og hvor primersondeoligonukleotiderne er konfigureret til at omfatte én eller begge primere; hvorefter signalering og RNA-transskription tilvejebringes fra én eller begge ender af amplikonet; og eventuelt en primer er bundet til et fast substrat; eller hvor, når systemet er en iDDS-sonde, iDDS-sondeoligonukleotidet er komplementært til en indre målsekvens, der omfatter ca. 20 til ca. 25 nukleotider i længden; antisondeoligonukleotidet omfatter ca. 10 til ca. 15 nukleotider i længden; og én eller to af de flankerende primere endvidere omfatter en 5'-RNA-polymerase-promotersekvens; og et amplifikation-detekteringssystem, der omfatter et RNA-polymerase-promoterenzym, et reverse transskriptaseenzym og RNaseH-enzym; og eventuelt en primer er bundet til et fast substrat.

12. System ifølge krav 10 til forbedret detektering af den første målsekvens, hvor iDDS-sonden a) er komplementær til den første målnukleotidsekvens, hvilket system endvidere omfatter en ikke-mærket blokerende terminatorsonde, der omfatter: (i) et oligonukleotid, der er komplementært til den anden målnukleotidsekvens, der i alt væsentligt svarer til men ikke identisk med den første målnukleotidsekvens; (ii) en modificeret 5’-ende resistent mod exonukleasedigestion; (iii) en modificeret 3’-ende resistent mod polymerase-ekstension; eller (iv) ét eller flere eventuelle ikke-naturlige nukleotider eller eventuelt en Minor Groove Binder (MGB) eller en kombination deraf; hvor den blokerende terminatorsonde er konfigureret til at omfatte Tm og AG, der adskiller sig fra Tm og AG for iDDS-sonden a) med mindst 4 kcal/mol i AG og med mindst 6 °C i Tm.

13. System ifølge krav 10, hvor systemet er iDDS-sonden konfigureret til at detektere en variabel nukleotidbaseposition for exon 21 i EGFR-genet, hvilket system omfatter oligonukleotideme SEQ ID NO: 7-12 og 39-41.

14. System ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13, hvor sonde:antisondesystemet er konfigureret til at detektere en nukleotidvariant af exon 19, 20 eller 21 af EGFR-genet, et VKORCl-gen, et CYP2C9-gen, et uidA-gen af E. coli, et grampositivt bakterie 16s-gen, et gramnegativt bakterie 16s-gen, et mykobakterie inhA-gen, et mykobakterie rpoB-gen, et mykobakterie 16S-gen, et hæmagglutinin- (HA) gen af influenzavirus, et matrix- (M) gen af influenza A-virus, et ikke-strukturelt (NS) gen af influenza B-virus og et KRAS-gen.

15. System ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 14, hvor sonde:antisondesystemet omfatter nukleinsyresekvenserne valgt fra gruppen bestående af: SEQ ID NO: 1 og 2, SEQ ID NO: 3 og 4, SEQ ID NO: 7 og 8, SEQ ID NO: 9 og 10, SEQ ID NO: 13 og 14, SEQ ID NO: 17 og 18, SEQ ID NO: 19 og 20, SEQ ID NO: 23 og 24, SEQ ID NO: 36 og 37, SEQ ID NO: 54 og 55, SEQ ID NO: 56 og 57, SEQ ID NO: 64 og 65, SEQ ID NO: 66 og 67, SEQ ID NO: 70 og 71, SEQ ID NO: 72 og 73, SEQ ID NO: 79 og 80, SEQ ID NO: 81 og 82, SEQ ID NO: 85 og 86, SEQ ID NO: 88 og 89 og SEQ ID NO: 91 og 92.