DK2742152T3

DK2742152T3 - Fremgangsmåde til isolering af nukleinsyrer

Info

Publication number: DK2742152T3
Application number: DK12756397.1T
Authority: DK
Inventors: Thorsten Voss
Original assignee: Qiagen Gmbh
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2017-07-31
Also published as: EP3789500A1; EP3216877B1; US20180094296A1; WO2013024072A1; US9695465B2; EP2742152A1; EP3216877A1; US20140199689A1; JP6096774B2; EP2742152B1; JP2014525234A; US20210130872A1; US10808276B2

Claims

FREMGANGSMÅDE TIL ISOLERING AF NUKLEINSYRER Patentkrav

1. Fremgangsmåde til isolering af nukleinsyrer ud fra en prøve, fortrinsvis en blodprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: a) opnåelse af en prøve, som er blevet stabiliseret ved anvendelse af mindst én kationisk detergent, hvor den kationiske detergent har dannet komplekser med nukleinsyrerne; b) opnåelse af komplekserne valgfrit sammen med andre prøvekomponenter ud fra den stabiliserede prøve, hvor komplekserne omfatter de nukleinsyrer, der skal isoleres; c) resuspendering af komplekserne og valgfri tilsætning af ét eller flere tilsætningsstoffer inden, under og/eller efter resuspendering, hvorved der opnås en resuspenderet prøve, der mindst omfatter i) den nukleinsyre, der skal isoleres; ii) mindst ét chaotropt middel; og iii) mindst ét chelateringsmiddel; og d) isolering af nukleinsyrer ud fra den resuspenderede prøve, hvor der fremstilles en flerhed af prøver ifølge trin a) til c), hvorved der tilvejebringes en flerhed af resuspenderede prøver, hvor de resuspenderede prøver opdeles i batcher, og nukleinsyrerne isoleres ud fra batcherne ifølge trin d), og hvor holdetiden mellem trin c) og d) varierer mellem mindst to batcher.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den resuspenderede prøve bliver holdt mellem trin c) og trin d) i mindst 0,2 timer, mindst 0,3 timer, mindst 0,4 timer, mindst 0,5 timer, mindst 0,75 timer eller mindst 1 time og/eller i et tidsrum på 0,5 timer til 12 timer, 1 timer til 10 timer, 1,5 timer til 8 timer, 2 timer til 7 timer eller 3 timer til 6 timer.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvor den resuspendering, der foretages i trin c), har én eller flere af følgende egenskaber: a) der tilsættes en resuspensionsopløsning, hvor resuspensionsopløsningen omfatter et ikke-chaotropt salt, fortrinsvis et ammoniumsalt; b) chelateringsmidlet tilsættes inden, under eller efter resuspendering; c) chelateringsmidlet tilsættes særskilt fra resuspensionsopløsningen; d) chelateringsmidlet er indeholdt i en resuspensionsopløsning; e) chelateringsmidlet tilsættes i en sådan koncentration, at den resuspenderede prøve omfatter chelateringsmidlet i en koncentration, som er valgt blandt 0,5 mM til 75 mM, 1 mM til 50 mM, 2,5 mM til 25 mM og 5 til 15 mM; f) chelateringsmidlet er valgt fra gruppen bestående af diethylentriaminpentaeddikesyre (DTPA), ethylendinitrilotetraeddikesyre (EDTA), ethylenglycoltetraeddikesyre (EGTA) og N,N-bis(carboxymethyl)glycin (NTA) og/eller g) der tilsættes mindst ét tilsætningsstof inden, under og/eller efter resuspendering, hvilket tilsætningsstof er valgt fra gruppen bestående af chaotrope midler, proteinnedbrydende forbindelser og buffermidler og dermed er indeholdt i den resuspenderede prøve.
4. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 3, hvor det chelateringsmiddel, der forekommer i den resuspenderede prøve, a) reducerer bindingen af den udfældede prøve til den beholder, der omfatter prøven; b) forøger udbyttet af den isolerede nukleinsyre; og/eller c) reducerer de variationer i nukleinsyreisoleringseffektiviteten eller-kvantiteten, som kan tilskrives forskellige holdetider mellem trin c) og d).
5. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 4, hvor fremgangsmåden med hensyn til det chaotrope middel, der er indeholdt i den resuspenderede prøve, har én eller flere af følgende egenskaber: a) koncentrationen af det chaotrope middel i den resuspenderede prøve er valgt fra gruppen bestående af 0,1 M til 4 M, 0,5 M til 3 M og 0,75 M til 2,5 M og er fortrinsvis mindst 1 M; b) det chaotrope middel tilsættes i trin c) i form af en separat opløsning; c) det chaotrope middel tilsættes i trin c) efter resuspendering af komplekserne og er dermed indeholdt i den resuspenderede prøve; og/eller d) det chaotrope middel, som forekommer i trin c), er valgt fra gruppen bestående af chaotrope salte, guanidiniumhydrochlorid, guanidiniumthiocyanat, guanidiniumisothiocyanat, natriumthiocyanat, natriumiodid, natriumperchlorat, natriumtrichloracetat, natriumtrifluoracetat, urea, og er fortrinsvis GTC eller GITC.
6. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 5, hvor der tilsættes en proteinnedbrydende forbindelse i trin c).
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor fremgangsmåden med hensyn til den proteinnedbrydende forbindelse, som tilsættes i trin c), har én eller flere af følgende egenskaber: a) den proteinnedbrydende forbindelse er et proteolytisk enzym; og/eller b) den proteinnedbrydende forbindelse er et proteolytisk enzym, som er valgt fra gruppen bestående af proteinaser, proteaser, subtilisiner og subtilaser, og er fortrinsvis proteinase K.
8. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 7, hvor trin c) omfatter aa) at der tilsættes en resuspensionsopløsning, som omfatter et ikke-chaotropt salt og et chelateringsmiddel, og som ikke omfatter et chaotropt middel, og komplekserne resuspenderes, bb) at der tilsættes et chaotropt middel efter resuspendering af komplekserne, og dermed bliver det indeholdt i den resuspenderede prøve, hvor det chaotrope middel fortrinsvis tilsættes til de resuspenderede komplekser i form afen vandig opløsning, cc) der tilsættes valgfrit et proteolytisk enzym efter resuspendering af komplekserne, og dermed er det indbefattet i den resuspenderede prøve.
9. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 8, hvor den isolering, der foretages i trin d), omfatter følgende trin: i) spaltning og/eller denaturering af den resuspenderede prøve, fortrinsvis ved opvarmning og/eller omrystning af den resuspenderede prøve i nærværelse af et proteolytisk enzym; ii) binding af nukleinsyrerne til en fast fase under anvendelse af egnede bindingsbetingelser, og iii) valgfri vaskning af nukleinsyrerne; iv) valgfri eluering af nukleinsyrerne.
10. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 9, hvor prøven er en blodprøve, og i trin a) stabiliseres blodprøven ved at bringe blodprøven i kontakt med en stabiliserende sammensætning, der omfatter i) en kationisk forbindelse med den almene formel:

hvor Y angiver nitrogen eller phosphor, fortrinsvis nitrogen, R1R2R3 og R4 uafhængigt af hinanden angiver en forgrenet eller uforgrenet Ci-C2o-alkylgruppe, en C6-C2o-arylgruppe og/eller en C6-C26-aralkylgruppe; X' angiver en anion af en uorganisk eller organisk, mono- eller polybasisk syre; og ii) mindst én protondonor.
11. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 9, hvor prøven er en blodprøve, og i trin a) stabiliseres blodprøven ved at bringe blodprøven i kontakt med en stabiliserende sammensætning, der omfatter (I) et amino-overfladeaktivt middel med følgende formel (2):

hvor, R1 og R2 hver især uafhængigt af hinanden er H, C1-C6-alkylrest, C6-C12 arylrest eller C6-C12-aralkylrest, R3 er C1-C20-alkylgruppe, C6-C26-arylrest eller C6-C26-aralkylrest, X er et helt tal på 0 og 1 og (i) en syre eller et syresalt.
12. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 11 og med én eller flere af følgende egenskaber: a) nukleinsyren er RNA; b) trin d) foretages under anvendelse af et automatiseret system; c) hvor en flerhed af prøver processeres manuelt op til trin c), hvorved der tilvejebringes en flerhed af resuspenderede prøver, og hvor de resuspenderede prøver fortrinsvis processeres under anvendelse af et automatiseret system til isolering af nukleinsyrerne i trin d); og/eller d) mindst RNA isoleres ud fra en prøve, der omfatter mindst RNA og DNA, og hvor isoleringstrin d) omfatter følgende trin - opnåelse af den resuspenderede prøve, der omfatter et proteolytisk enzym, og fortsættelse af spaltningen af den resuspenderede prøve, fortrinsvis ved inkubering af den resuspenderede prøve i mindst 5 min. over stuetemperatur, fortrinsvis over 50 °C; - fjernelse af mindst en del af DNA'et fra den resuspenderede og spaltede prøve ved at binde DNA til en første fast fase og separere det DNA, der er bundet til den første faste fase, fra den tilbageværende prøve, der omfatter RNA'et, - binding af RNA'et til en anden fast fase, hvor der anvendes mindst ét chaotropt middel og mindst én alkohol i en koncentration på > 30 % vol/vol under dette RNA-bindingstrin, - valgfri udførelse af mindst ét vasketrin til vaskning af det RNA, som er bundet til den anden faste fase, og - valgfri udførelse af en DNase-spaltning og/eller en spaltning under anvendelse af et proteolytisk enzym, - valgfri eluering af RNA'et.
13. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af kravene 1 til 12 til isolering af RNA ud fra en blodprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: a) opnåelse af en prøve, som er blevet stabiliseret ved anvendelse af mindst én kationisk detergent, hvor den kationiske detergent har dannet komplekser med nukleinsyrerne, og hvor der til stabilisering fortrinsvis blev anvendt en kationisk detergent som defineret i krav 10 eller 11; b) opnåelse af komplekserne valgfrit sammen med andre prøvekomponenter ud fra den stabiliserede prøve, hvor komplekserne omfatter de nukleinsyrer, der skal isoleres; c) resuspendering af komplekserne og valgfri tilsætning af ét eller flere tilsætningsstoffer inden, under og/eller efter resuspendering, hvor trin c) omfatter: aa) tilsætning af en resuspensionsopløsning, som omfatter et ikke-chaotropt salt og et chelateringsmiddel, hvor resuspensionsopløsningen ikke omfatter et chaotropt salt, og resuspendering af komplekserne, bb) tilsætning af et chaotropt middel efter resuspendering af komplekserne, hvor det chaotrope middel fortrinsvis tilsættes til de resuspenderede komplekser i form af en vandig opløsning, cc) valgfri tilsætning af et proteolytisk enzym efter resuspendering af komplekserne, hvorved der opnås en resuspenderet prøve, der mindst omfatter i) den nukleinsyre, der skal isoleres; ii) mindst ét chaotropt middel; og iii) mindst ét chelateringsmiddel; og iv) valgfrit et proteolytisk enzym; og d) isolering af RNA ud fra den resuspenderede prøve, hvor RNA'et fortrinsvis isoleres ifølge karakteristikaene i krav 12 d), og hvor der fortrinsvis anvendes magnetiske silicapartikler som fast fase til binding af RNA'et, og hvor der fortrinsvis anvendes et automatiseret system til RNA-isolering, og hvor der fremstilles en flerhed af prøver ifølge trin a) til c), hvorved der tilvejebringes en flerhed af resuspenderede prøver, hvor de resuspenderede prøver opdeles i batcher, og nukleinsyrerne isoleres ud fra batcherne ifølge trin d), og hvor holdetiden mellem trin c) og d) varierer mellem mindst to batcher.
14. Anvendelse af et chelateringsmiddel med henblik på at forhindre eller reducere dannelsen af et præcipitat, der binder til beholdervæggen for en prøve, der omfatter mindst ét chaotropt middel og nukleinsyrer.
15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor prøven omfatter mindst én bestanddel, som er valgt fra gruppen bestående afen kationisk detergent, en proteinnedbrydende forbindelse, et salt og/eller en buffer.