DK2576818T3 - Fremgangsmåde til DNA-sekvensering med hybridisering - Google Patents

Claims (21)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en nukleinsyresekvens, hvor fremgangsmåden omfatter de følgende trin: a) denaturere et dobbeltstrenget nukleinsyremolekyle, som svarer til nu-kleinsyresekvensen, ved at påføre fysisk kraft til molekylet; hvor den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle er en hårnål, og hvor en af enderne af den dobbeltstrengede nukleinsyre er fastgjort direkte eller indirekte til en bærer, og hvor den anden ende af den dobbeltstrengede nukleinsyre er fastgjort til en bevægelig bærer; b) tilvejebringe et enkeltstrenget nukleinsyremolekyle; c) renaturere den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle i tilstedeværelsen af den enkeltstrengede nukleinsyremolekyle; og d) detektere en blokering af renatureringen af den dobbeltstrengede nukleinsyre, hvor bestemmelsen omfatter de følgende trin: • måle afstanden (z) mellem de to ender af den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle, som er fastgjort til bæreren; • måle afstanden (zhigh) mellem de to ender af den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle, som er fastgjort til bæreren, når den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle denatureres; og • sammenligne z og zhigh, og • bestemme positionen af pausen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den dobbeltstrengede nukleinsyre denatures i trin a) ved at fjerne bærerne.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor en fysisk kraft over eller lig med 15 pN, fortrinsvis over eller lig med 17 pN, mere foretrukket over eller lig med 18 pN, påføres den dobbeltstrengede molekyle ved at fjerne bærerne.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den denaturerede dobbeltstrengede nukleinsyre renatureres i trin c) ved at bringe bærerne sammen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor den kraft, der påføres den dobbeltstrengede molekyle, formindskes til mindre end eller lig med 12 pN, fortrins vis mindre end eller lig med 11 pN, mere foretrukket mindre end eller lig med 10 pN, ved at bringe bærerne sammen.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor enderne af den dobbeltstrengede nukleinsyre, som ikke er fastgjort til en bærer, forbindes indbyrdes kovalent eller ikke-kovalent.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene, hvor trin a) til d) gentages flere gange for at akkumulere målinger og forøge signal-støjforholdet.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, omfattende et yderligere trin til at måle varigheden af blokeringen.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, omfattende et yderligere trin til at sammenligne varigheden af blokeringen med en referenceværdi.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den enkeltstrengede nukleinsyremolekyle vælges fra et bibliotek af n-mere enkeltstrengede nukleinsyrer, hvor biblioteket består af alle mulige kombinationer af di-eller tre-nukleotider, som er forbundet med alle mulige kombinationer af henholdsvis n-2 eller n-3 nukleotider, hvor n er et heltal, som fortrinsvis er mindre end eller lig med 30.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor di- eller tre-nukleotidet befinder sig i centrum af det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor di- eller tre-nukleotidet befinder sig uden for centrum af det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, hvor hver forekomst i den dobbeltstrengede nukleinsyre af mindst én af de 4 baser, adenin, cytosin, guanin og thymidin, erstattes af en specifik forstørrende markering, hvor den forstørrende markering er et oligonukleotid.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvor den enkeltstrengede nukleinsyre er et oligonukleotid, som er komplementær til en af de forstørrende markeringer.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13 eller 14, omfattende et yderligere trin til bestemmelse af hver position af blokering for den enkeltstrengede nukleinsyre på den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-15, hvor trin a) til d) og det yderligere trin til bestemmelse af hver position af blokering for den enkeltstrengede nukleinsyre på den dobbeltstrengede nukleinsyremolekyle gentages efter hinanden med enhver af oligonukleotiderne, som er komplementære til de forstørrende markeringer.

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, endvidere omfattende trinnene med: i) ligering til en opstrøms enkeltstrenget nukleinsyreprimer af en hosliggende hybridiseret enkeltstrenget nukleinsyre, og ii) overvågning af forlængelsen af primeren med: α denaturering og renaturering af den dobbeltstrengede nukleinsyre i tilstedeværelsen af den ligerede primer, og β detektering af en blokering i renatureringen.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, hvor trin (i) til (ii) gentages med en anden enkeltstrenget nukleinsyre.

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 17 og 18, hvor den enkeltstrengede nukleinsyremolekyle vælges fra et bibliotek af n-mere enkeltstrengede nukleinsyremolekyler, hvor biblioteket består af alle mulige kombinationer af di-nukleotider, som er forbundet ved deres 3'-ende med alle mulige kombinationer af n-2-nukleotider, hvor n er et heltal, som fortrinsvis er mindre end eller lig med 20.

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 17-19, hvor den nyligt syntetiserede streng udstødes eller afmonteres.

21. Fremgangsmåde til bestemmelse af en nukleinsyresekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 17-20, hvor trin i) og ii) i krav 17 gentages med en primer, som forskydes opstrøms eller nedstrøms med et nukleotid i forhold til primeren i krav 17.