DK175020B1

DK175020B1 - Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse

Info

Publication number: DK175020B1
Application number: DK198606003A
Authority: DK
Inventors: Lars Abrahamsen; Bjoern Nilsson; Mathias Uhlen; Tomas Moks
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1986-12-12
Publication date: 2004-04-26
Also published as: JPS62190088A; JPH0746988A; JP2504723B2; EP0225860A3; AU6633286A; SE8505921D0; ES2052497T3; ATE82320T1; EP0225860A2; DK600386A; US5156959A; JPH082314B2; EP0225860B1; CA1314010C; DE3687112D1; DE3687112T2; GR3006597T3; DK600386D0; AU597317B2

Description

DK 175020 B1 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udlrykkelse af proteiner i gramnegative bakterier og tilvcjebringer en ckstraccllulær udskillelse af disse. Opfindelsen angår yderligere en rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektorcr og gramnegative bakterier, der omfatter en sådan rekombinant DNA-konstruktion.

5

Den relativt nye rekombinant DNA-teknologi, hvorved hidtil ukendte rekombinant DNA-strukturer kan konstrueres og indfores i en prokaryot eller eukaryot værtscelle, har gjort det teoretisk muligt at fremstille et stort antal proteiner. Anvendelsen af bakterier til fremstilling af heterologe genprodukter har gjort det muligt at opnå 10 proteiner, som ellers kun kan opnås fra naturlige kilder med betydelige omkostninger. Velkendte eksempler på polypeptider, der oprindeligt stammer fra mennesker, og som fremstilles i bakterier, er humant væksthormon (hGH), insulin, α-interferon, y-interferon, somatostatin og somatomediner (insulinlignende vækstfaktorer).

15 Anvendelsen af bakterier ti! udtrykkelse af fremmede gener har stået over for mange praktiske og biologiske problemer, hvilke omfatter stabilitet af polypeptidet som følge af proteolyse, udtrykkclsesniveau, udfældning af proteinproduktet, hvilket er forbundet med forkert foldning, og mangel på biologisk aktivitet hos proteinet efter oprensning. For at løse disse problemer er en række teknikker blevet udviklet for at 20 muliggøre anvendelsen af de velkarakteriserede enterobakterier, Escherichia coli (herefter kaldet E. coli), til udtrykkelse af et hvilket som helst genprodukt. Disse metoder omfatter anvendelsen af forskellige promotorer for at blive i stand til at regulere udtrykkelsesniveauet, genfusioner for at stabilisere normalt ustabile proteiner i cellen og anvendelsen af signalpeptider for at translokere proteiner fra det 25 cytoplasniatiske til det periplasmatiske rum, hvori disulfidbroer kan dannes, hvilket er i modsætning til cytoplasmaet, hvor de reducerende omgivelser vanskeliggør denne dannelse. Proteiner, der udtrykkes i E. coli's cytoplasma, og som har cystcinbrocr i strukturen, vil sædvanligvis ikke 1¾ den korrekte tertiære stmktur, hvilket skyldes vanskeligheder i forbindelse med dannelsen af disse broer. Dette kan potentielt føre til 30 udfældning af polypeptidet ved overproduktion, en hurtig proteolytisk nedbrydning, hvis det ikke er udfældet i cellen og ingen biologisk aktivitet af det udtrykte og oprensede polypeptid, Dette er blevet observeret i E. coli i forbindelse med , DK 175020 B1 2 udtrykkeisen afproinsulin, A-kæde-insulin, B-kæde-insulin, insulin-lignende vækstfaktorer og vævsspecifik plasminogenaktivator (t-PA). For at overvinde dette problem skal polypeptidet renalureres efter oprensning eller udskilles til det periplasnialiskc rum hos E. coli, hvor den korrekte foldning potentielt kan opnås. Et 5 andet aspekt af bakteriel genudtrykkelse og udskillelse, foruden det, der er omtalt om foldning og stabilitet, er anvendelsen af grampositive bakterier. Disse organismer har en forskellig organisering af membranstruktureme, der omgiver cellecytoplasmaet, sammenlignet med det gramnegative modstykke. De grampositive prokaryoter har kun én cellemembran, og udskilte proteiner bliver eksporteret til vækstmediet, hvorimod 10 udskillelsen i den gramnegative E. coli placerer proteinet i det periplasmatiske rum, hvilket skyldes et dobbelt membranlag, der omgiver cellecytoplasmaet. Ved anvendelse af grampositive bakterier kan udskilte genprodukter opsamles fra vækstmediet, hvilket ville lette produktets videre forarbejdning. Tilskyndelsen til at anvende grampositive bakterier i industrielle processer er således forbundet med 15 denne udskillelsesproces, men ud fra andre synspunkter ville det være foretrukket at anvende den velkarakteriserede E. coli i stor skalaproduktion af genprodukter, ganske simpelt fordi ekspressionssystemer for denne organisme er mere udviklede.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en løsning på begrænsningerne i 20 anvendelsen af E. coli i industrielle processer. Den foreliggende opfindelse åbner mulighed for, at genprodukter kvantitativt kan udskilles fra E. coli til vækstmediet.

Denne genetiske fremgangsmåde til at muliggøre eksport af et protein i gramnegative bakterier er baseret på induktion af filamentøs vækst, hvor udtrykkeisen af det ønskede genprodukt er afhængig af varmechokresponset, og at dette respons giver en 25 kvantitativ lækage af periplasmisk placerede proteiner til vækstmediumet.

Grundelementerne af denne opfindelse vil blive forklaret nedenfor.

Det er velkendt, at signalpeptider er til stede i den N-terminale ende af udtrykte proteiner, der skal udskilles gennem en membran, både i prokaryote og eukaryote 30 celler. Dette signalpeptid, der består af 20-40 aminosyrer, fraspaltes under translokationsprocessen. Det er kendt, at mange protein faktorer er forbundet med denne udskillelsesproces, men den molekylære mekanisme er ikke fuldstændig 3 DK 175020 B1 detaljeret kendt, selv om der er foreslået gode modeller, der er rimelig tæt på virkeligheden.

Den foreliggende opfindelse belyses nedenfor under henvisning til stafylokokprotein 5 A. Dette protein kendes som en cellevægbestanddcl hos den patogene bakterie Staphylococcus aureus, herefter kaldet S. aureus, og det er velkendt for dets specifikke binding til del konstante område hos visse klasser af antistoffer fra de fleste pattedyr, der også omfatter mennesker. Protein A vides også at have mange gentagelser i dets struktur, og 5 områder på omkring 58 aminosyrer i hvert område, 10 der er gentaget efter hinanden, er alle hver især funktionelle som binding til immunoglobuliner (såsom humant IgG). Det blev vist på DNA-niveau, at en signalsekvens, der er ansvarlig for translokationen af protein A fra cytoplasmaet, er til stede før disse fem IgG bindingsområder. Denne signalsekvens er blevet vist at være funktionel også i E. coli, og protein A er således fundet i det periplasmiske rum efter 15 indføring af protein A-genet.

Under det forskningsarbejde, der ligger til grund for den foreliggende opfindelse, blev fragment B fra protein A placeret umiddelbart efter signalsekvensen, hvilket resulterede i blokeret udskillelse. Den åbenbare konklusion er, at forskellen i 20 aminosyresekvensen mellem fragment B og E er vigtig i forbindelse med udskillelsesprocessen. E. c<?//-celleme, der udtrykker dette fragment B fra protein A, vokser filamentøst, hvilket skyldes ufuldstændig celledeling. Dette er tidligere blevet observeret for i E. coli udtrykte proteiner, der udfældes i cellen. Det har nu vist sig, at proteiner, der er lokaliseret i det periplasmatiske rum, såsom /?-lactamase, lækkede ud 25 til vækstmediet. Når fragmentet SE blev udtrykt, viste det sig overraskende, at dette E-fragment næsten fuldstændig eksporteres til vækstmediet for E. coli. Dette er også forbundet med filamentøs vækst af cellerne. Andre fragmenter, der er fundet at inducere filamentøs vækst (selv om det er i en anden udstrækning), var fragment SEE og SEB. Alle disse mindre fragmenter fra protein A inducerer på en eller anden måde 30 en defekt i celledelingen, hvilket fører til en eksport af periplasmatiske proteiner til vækstmediet.

4 DK 175020 B1 Når SEE fusioneres li I cl gen, der koder for human insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-I), en vækstfaktor, der består af 70 aminosyrer, hvilket resulterer i SEE-IGF-I, blev det fundet, at genproduktet kunne isoleres fra vækstmediet. Også i dette eksperiment kunne en filamentos cellcmorfologi observeres.

5

Alle de ovenfor nævnte eksperimenter blev udfort i en type A-vektor, som vist i fig. 9.

Type A-vektorcmc er baseret på pRIT4, hvor transskriptionen af det protein A afledte gen sker i modsat retning af jS-lactamase (bla)-genct. Når SEE-IGF-I placeres i en type B-vektor, blev udtrykkelsesniveauet 20-40 gange højere end ved type A-orienteringcn.

10 Type B-vektoren er baseret på pEMBL, hvor transskriptionen af det protein A afledte gen er i samme retning som jS-lactamasegenet (bla). Den filamentøse vækst af disse celler er meget udtalt. Eksporten til vækstmediet er meget effektiv.

De nærværende resultater viser, at eksport til vækstmediet af de her omhandlede 15 genprodukter er forbundet med filamentøs vækst af E. coli-ce\lerne, og også at udtrykkelsesniveauet kan forbindes til denne induktion.

Protein A-genet, der består af SEDABC i en type A-vektor, blev dyrket ved 30"C eller 42°C. Ved den højere temperatur, der er hoj nok til at opnå et vamiechok-rcspons, er 20 udtrykkelsesniveauet 20-40 gange hojere, og eksporten til vækstmediet er effektiv.

Konklusionen, der kan drages fra det forskningsarbejde, der har ført til den foreliggende opfindelse, er, at filamentos vækst af E. coli giver en eksport af periplasmatiske proteiner til vækstmediet. Filamentøs vækst induceres i E. coli-celler, 25 der indeholder protein A-promoloren og signalsekvensen og afhængig af orienteringen af fragmenterne i plasmidvektoren eller af størrelsen af den del af protein A, der udtrykkes, får vi forskellige eksportniveauer til vækstmediet af de periplasmatiske proteiner.

30 Det grundlæggende begreb af den foreliggende opfindelse udgor et betydeligt fremskridt inden for området, idet induktion af filamentøs vækst i E. coli forer til hoj 5 DK 175020 B1 udtrykkelse og effektiv udskillelse, når det er placeret efter protein A-signalsekvensen og promotoren.

Det skal bemærkes, at den foreliggende opfindelse ikke er afhængig af en biologisk 5 forklaring på observationerne af dette udtrykkelses-udskillelsessystems opførsel.

Selv om opfindelsen ikke er begrænset til en specifik teori, har vi imidlertid en rimelig forklaring på de gjorte observationer.

10 Protein A-genet er i sig selv et varmechok-gen i E. coli. Dette betyder, at protein A under et varmechok-respons transskriberes i videre udstrækning end under vegetativ ikke-varmechok-respons. Dette fænomens årsag findes opstrøms for den tidligere rapporterede E. co/r'-lignende promotor i protein A-genet, hvor en sigma-32-lignende promotor findes. Denne foreslåede sigma-32-promotorsekvens er homolog med den 15 konsensussekvens, der er foreslået for varmechok-geneme. Sigma-32-faktoren, der er ansvarlig for varmechok-responset, transskriberer tilsammen normalt 17 gener i E. coli.

Varmechok-respons udløses, når E. coli-cellen er stresset. Det er blevet foreslået, at 20 forkert foldede proteiner er hoved-udløsningseffekten, og at denne induktion kunne udføres ved varme, 4% EtOH, oxidationsmidler, kemikalier, der forårsager fejllæsning af den genetiske information eller produktion af fremmede proteiner, der ikke er i stand til at danne en rigtig tertiær struktur.

25 I det foreliggende tilfælde udløser små fragmenter af protein A eller en høj produktion fra starten varmechok-responset. Når dette respons udløses, vil protein A-genet transskriberes i højere grad, hvilket fører til en mere udtalt udløsning af transskriptionen. Dette varmechok-respons giver også defekter i celledelingen, nemlig såkaldt filamentøs vækst. I nærværende beskrivelse vises det, at også denne væksttype 30 giver en eksport af det periplasmatiske produkt til vækstmediet.

6 DK 175020 B1

Ved dyrkning af en E. coli-stamme, der indeholder protein A-genet i en type A-vektor, ved 30°C eller 42°C vises det i nærværende beskrivelse, at denne temperaturinduktion giver højere udtrykkelse og eksport, hvilket underbygger den biologiske forklaring og giver et fortrinligt induktionssystem. Dette betyder, at stammen kan dyrkes ved lav 5 temperatur, hvor den producerer på et lavt niveau, og efter at cellemassen er blevet dannet, skiftes temperaturen til 42°C, hvorefter produktionen af produktet finder sled, og produktet også udskilles.

Varmechok-respons udløser også en ATP-afhængig protease, der betegnes La.

10 Produktionen skal derfor fortrinsvis finde sted i en stamme, der mangler La-protcasen som følge af en mutation i dens gen f ion).

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til udtrykkelse af proteiner i gramnegative bakterier og tilvejebringer en ekstracellulær udskillelse af 15 disse, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: a) indførelse i en gram(-)bakterie af en rekombinant DNA-konstruktion, der omfatter en promotor, en signalsekvens, der gør translokation og bearbejdning mulig, og et strukturelt gen, der omfatter et spaltningsområde, hvori det strukturelle gen har den 20 almene formel (E)n(B)m - Y, hvor n er I, og m er 0; eller n er 2, og m er 0; eller n er 1, og m er 1; eller n er 2, m er 25 0, og Y er genet, der koder for IGF-1 eller IGF-2, og E og B betegner generne, der svarer til protein A-områdeme E og B, med det forbehold, at det strukturelle gen er forskelligt fra det, der koder for det naturlige protein A; b) dyrkning af bakterien under betingelser, der resulterer i filamentøs vækst; 30 c) isolering af det ekstracellulært udskilte protein.

7 DK 175020 B1 I sådanne fremgangsmåder er udtrykkclsen af det ønskede protein fortrinsvis under den samme transskriptionellc kontrol, som den for den filamentøse vækst. I én udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er den transskriptionelle kontrol baseret på induktion af htpR, der udtrykker sigma-32-proteinfaktoren.

5

Som tidligere angivet, er den foreliggende opfindelses princip baseret på dyrkning af gramnegative bakterier under betingelser, der resulterer i filamentos vækst. Sådan filamcntos vækst kan skyldes karakteren af den rekombinante DNA-konstruktion og proteinet, der udtrykkes derfra. Den filamentøse vækst kan også skyldes ydre 10 induktion eller en kombination af begge. Filamentøs vækst kan således forårsages af forøget dyrkningstemperatur, hvilket inducerer varmcchok-respons, men det kan også forårsages ved, at der i dyrkningsmediet indfores et denatureringsmiddel, såsom ethanol.

15 På grund af den kendsgerning, at proteinet, der udtrykkes i en værtscelle af en rekombinant DNA-konstruktion som defineret ovenfor, vil blive genkendt af cellen som fremmed eller forkert foldet, kan dette inducere et Ion-respons i bakterien.

Den rekombinante DNA-konstruktion kan indføres i bakterien på forskellige måder.

20 Således kan den indføres indeholdt i en plasmidvektor.

I en foretrukken udførelsesfonn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder den rekombinante DNA-konstruktion som signalsekvens protein A-sekvensen. Det foretrækkes, at det strukturelle gen, der stoder op til signalsekvensen, indeholder et 25 spaltningsområde, der koder for de N-terminale aminosyreresler i det modnede protein, der skal isoleres. Sådanne spaltningsområder kan sammensættes således, at de koder for mindst seks aminosyrerester. Disse rester er fortrinsvis: Ala Gin His Asp Glu Ala.

30 I fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan det strukturelle gen omfatte gener, der er udvalgt blandt E, EE og EB-domæner i protein A. Det strukturelle gen kan også 8 DK 175020 B1 omfatte et produktionsgen, såsom det, der koder for den insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1).

Opfindelsen angår også en rekombinant DNA-konstruktion, der omfatter: 5

En promotor, cn signalsekvens og et strukturelt gen, der omfatter et spaltningsområde, hvori det strukturelle gen har den almene formel: (E)n(B)m - Y, 10 hvor n er 1, og m er 0; eller n er 2, og m er 0; eller n er 1, og m er 1; eller n er 2, m er 0, og Y er genet, der koder for IGF-1 eller IGF-2, og E og B betegner generne, der svarer til protein A-områdeme E og B, med det forbehold, at det strukturelle gen er forskelligt fra det, der koder for det naturlige protein A.

15

Opfindelsen omfatter også plasmidvektorer, der omfatter rekombinant DNA-konstruktionen, der er defineret ovenfor. En sådan plasmidvektor kan være én, der stammer fra pEMBL9.

20 Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse dækker det en gramnegativ bakterie, der indeholder en sådan rekombinant DNA-konstruktion, hvor en sådan konstruktion er indeholdt i en plasmidvektor, der indeholder den samme. En fordrukken bakterie til anvendelse ifølge opfindelsen er en E. coti, såsom E. coli HB101.

25

Den foreliggende opfindelse belyses yderligere ved specifikke eksempler under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 skematisk viser protein A-genet, der antyder dets forskellige kodende områder. S er signalsekvensen, A-E er IgG-bindingsområdeme, og X er den C-terminale del, som mangler IgG-bindingsaktivitet.

Fig. 2 viser plasmidvektoren pRIT4, der omfatter protein A-genet. mp 9 multirestriktionsenzymlinkeren er vist med den foreliggende læseramme, der er 30 9 DK 175020 B1 relevant for genfusioner. CM L betegner chloramphenicolacyl-transferasegenet, Sa betegner replikationsinitieringsstedet for S. aureus, Ec betegner replikationsinitieringsstedet for E. coli, AMP betegner /3-lactamasegenet, og Prot A betegner IgG-bindingsdcIcn af protein A-genet.

5

Fig. 3 viser forskellige pAS og pASE-vektorer, der er konstrueret som beskrevet i eksempel l. CML betegner chloramphenicol-acyltransferasegenet, ori Bs betegner replikationsinitieringsstedet for B. subiilis og S. aureus, ori Ec betegner replikationsinitieringsstedet for E. coli, AMP betegner |S-lactam asegen et, S betegner 10 signalsekvensen, og E betegner E-regionen fra protein A.

Fig. 4 viser en plasmidvektor, der indeholder protein A-genet efterfulgt af en multirestriktionsenzymlinker. Prot A betegner genet, der koder for IgG-bindingsoinrådet på protein A. TC betegner genet, der koder for tetracyclinresistcns, 15 og ori betegner replikationsinitieringsstedet i E. coli.

Fig. 5 viser forskellige gen fragmenter, der koder for B-området i protein A. Pilene til venstre betegner de forskellige Bal 31 kloner, der blev opnået. EcoRJ-linkeren. der er forbundet med de forskellige Bal 31-konstruktioner, er vist. Aminosyresekvenseme 20 over EcoRl-stedet i B-området for B-0, B-l og B-2-konstruktioneme er vist. Til højre er positionen af BamHI-linkeren i 3'-enden af B-fragmentet vist. Det translationelle stop i stoplinkeren (fig. 6) i de to mulige orienteringer er også vist.

Fig. 6 viser stoplinkeren, der skaberet øjeblikkeligt translationsstop, der er uafhængigt 25 af orienteringen af stoplinkeren. De tre forskellige læserammer for hver orientering er vist.

Fig. 7 viser aminosyresekvensen for forbindelsen mellem signalpeptidet og de forskellige pASB-konstruktioner, sammenlignet med overgangen i det oprindelige 30 protein A. Pilene over hver aminosyresekvens viser forarbejdningspositionen, som den er analyseret ved aminosyresekventering af udtrykte fragmenter fra E. coli HB101.

DK 175020 B1

Fig. 8 viser nukleotidsekvensen af det syntetiske IGF-l-gen. EcoRI-stcdet og Hindlll-stedet, der omgiver det syntetiske fragment, er vist, såvel som den udledte aminosyresekvens.

5

Fig. 9 viser de to typer plasmidvektorer, der er anvendt til udtrykkelse af de forskellige protein A-afledte konstruktioner. CML betegner chloramphenicol-acyltransferasegenet, S.a. betegner replikationsinitieringsstedet for S. aureus, Ec betegner replikationsinitieringsstedet for E. coli, AMP betegner /3-lactamasegenet, og 10 Prot A angiver de forskellige protein A-konstruktioner, som de er vist i de lineære fremstillinger.

Opfindelsen belyses yderligere i det følgende ved specifikke eksempler. Eksemplerne viser anvendelsen af systemet, hvor der anvendes ct syntetisk gen, der koder for 15 human insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-I) og som er fusioneret med SEE til dannelse af SEE-1GF-I. Det blev fundet, at delte protein også blev udskilt på samme måde som de små mængder af protein A-genet, og i en type B*vektor var udlrykkelsesniveauet meget højt.

20 Vektoren pASEE er blevet deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gottingen, Vesttyskland under deponeringsnummer 3593 i en E. coli RR1AM15.

UDGANGSMATERIALER

25

Bakterielle værtsstammer

To forskellige E. coli K12-stammer blev anvendt i eksemplerne: 30 HB 101 (Boyer, H.W. et al., J. Mol. Biol., 41_, 459-472 (1969)) og JM 103 (Messing, J. Methods Enzymol., 101. 20-79 (1983)).

DK 175020 B1 π (Stammerne foreligger hos Instituttet for Biokemi og Bioteknologi, Det Kongelige Teknologiske Institut, Stockholm, Sverige).

Kloningsvektorer: 5

Kloningsvekloreme, der blev anvendt i eksemplerne, var pBR322 (Bolival, F. et al.,

Gene 2,93-113 (1977)), pEMBL8 (Dente et al., Nucl. Acids Res. U 1645 (1983)), pEMBL 9 (Dente el al., Nucl. Acids Res. J_J_, 1645 (1983)), pRlT4 (Nilsson, B. ct al., EM BO .1. 4, 1075 (1985)), pSPA 11 (Uhlén, M. et al., Gene 23, 369 (1983)) og pSPA 10 16 (Uhlén, M. et al., J. Bacteriol, 159, 713 (1984)). Det syntetiske gen, der koder for IGF-I, er omtalt andetsteds (Elmblad, A. et al., in Third European Congress on Biotechnology III, 287-296, Verlag Chemie, Wcinheim (1984)). Plasmidvektoren pASEE, der blev konstrueret i eksemplerne, er deponeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gottingen, Vesttyskland, under nr. DSM 3593.

15 PUFFERE OG MEDIER Overtrækspuffer: 20 1,59 g Na2C03, 2,93 g NaHC03 og 0,2 g NaN3, tilsat destilleret H20 op til 1 liter.

PBST: 8,0 g NaCl, 0,2 g KH2P04, 2,9 g Na2HP04 X 12H20,0,2 g KC1, 0,2 ml Tween® 20 25 og 0,2 g NaN3 fyldt op til 1 liter med destilleret H20 (pH 7,4).

TSB: 30 g tryptisk sojamedium, fyldt op til 1 liter og autoklaveret.

TBAB: 30 12 DK 175020 B1 30 g tryptisk blodagarbasc, fyldt op til l liter og autoklaveret.

ONPG-puffer:

5 2 mM o-nitrophenyl-Ø-D-galactosid (ONPG, Sigma-produkt nr. N-l 127) i 0,l M

kaliumphosphatpuffer, pH 7,3, der indeholder 15 mM 2-mercaptocthanol og l mM MgCl2.

RUTINEMÆSSIGE FREMGANGSMÅDER

10

Visse fremgangsmåder blev udfort gentagne gange i eksemplerne. Medmindre del på anden måde er specificeret, blev de udført nøjagtigt som følger, hver gang de blev anvendt.

15 Fremgangsmåder, der rutinemæssigt anvendes inden for molekylær biologi, er ikke beskrevet (såsom anvendelsen af kommercielt tilgængelige restriktionsenzymer, DNA-ligeringer, Bal 31-exonuklease, Sl-nuklease og Klenow-polymerase).

Transformationer: 20

Transformation af E. coli K12 med plasmid DNA blev udført nøjagtig som beskrevet (Morrison, D.A., Methods in Enzymology, Academic Press 68, 326-331 (1979)). Transformanteme blev selekteret på sædvanlig vis på plader (TBAB), der indeholder 70 mg/1 ampicillin.

25

Isolering af plasmid DNA:

Plasmid DNA blev isoleret som beskrevet af Bimboim, H.C. et al., Nucl. Acids Res.

7, 1513 (1979). Præparationer i lille skala til screening af et stort antal trans form anter 30 blev udfort nøjagtig som beskrevet af Kieser, T. Plasmid J_2, 19-36 (1984).

Sepharose 6B chromatografi: 13 DK 175020 B1

Plasmid DNA, der skal anvendes til Bal 31 eller S1 -behandling, blev udsat for en Scpharose 6B-gelfiltrering i en 10 mM tris, 1 mM EDTA og 500 mM NaCl-puffcr. På denne måde blev DNA adskilt fra RNA.

5

Eluering af DNA-fragmenter:

Eluering af DNA-fragmenter fra enten agarose- eller polyacrylamid-gelstykker blev udfort nøjagtig som beskrevet af Maxam et al., P.N.A.S. (USA), 24, 560-564 (1977).

10 DNA-Sckventering: DNA-Sekvensanalyse blev udfort nojagtigt som beskrevet af Sanger, F. et al., J. Mol. Biol.,143, 161 (1980).

15 Påvisning og kvantitetsbestemmelse af protein A:

En ELISA-test (enzymbundet immunosorbentassay) blev udført for at kvantitetsbestemme protein A. Analysen gor brug af en speciel mikrotiterplade 20 (Titertek, Amstelstad, Holland), der ikke har nogen nettoladning. Fordybningerne er belagt med humant IgG (Kabi AB, Sverige) i en overtrækspuffer. Analyseprøver tilsættes, og protein A bindes til Fc-delenc af det IgG, der adsorberede i fordybningerne. Protein A testes derefter ved brug af et anti-protein A (fra kaniner), der er konjugeret med /?-galactosidase (fra Pharmacia AB, Uppsala, Sverige).

25

Test:

Fordybningerne i en mikrotiterplade fyldes med 75 μΙ af en opløsning af humant IgG ved 16 ng/ml i overtrækspuffer, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i mindst 1 30 time. Fordybningerne vaskes tre gange med 100 μ\ PBST, og 50 μ\ af prøven sættes til hver fordybning. To ganges fortyndinger laves til kvanlativ bestemmelse. Efter inkubation i 1 time vaskes fordybningerne tre gange med 100 μΙ PBST efterfulgt af 14 DK 175020 B1 tilsætning af 50 μΐ anti-protein A-/?-galactosidase (mængden af protein A-bindende kapacitet, der er tilsat hver fordybning, svarer til den molære mængde IgG, der er tilsat til hver fordybning, således som det er bestemt ved titrering med protein A i overskud). Efter inkubation i 45 minutter vaskes fordybningerne tre gange med 100 μΙ 5 PBST, efterfulgt af ti Isætning af 125 μΐ ONPG-puffer. Efter inkubation i 20-30 minutter tilsættes 150 μΙ 0,1M NaOH for at stoppe reaktionen.

Kvantitetsbcstemmelsen udføres ved at køre en to ganges fortynding af en protein A-standardopløsning med kendt koncentration parallelt med to ganges fortyndingerne af 10 analyseprøveme. Absorbansen ved 405 nm måles for hver fordybning ved brug af el fotometer.

/3-Galactosidaseassay: 15 Kvantitetsbestemmelse af jS-galactosidase blev udført ved brug af en kolorimetrisk procedure, hvor o-nitrophenyl-/3-D-galactosid (ONPG, Sigma-produkt nr. N-l 127) anvendes som substrat, således som det er beskrevet af Miller, J.H. (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York; Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Reaktionen blev fulgt ved brug af et spektrofotometer ved 405 nm.

20 Ø-Lactamaseassay: Mængden af /3-lactamaseaktivitet blev bestemt spektrafotometrisk nøjagtigt som beskrevet af O'Callaghan et al., Antimicrob. Agents Chemother, 57 (1968).

25

Osmotisk chok:

De periplasmatisk lokaliserede proteiner blev frigivet ved et osmotisk chok nøjagtigt som beskrevet af Nossal et al., J. Biol. Chem. 241.3055 (1965).

30 DK 175020 B1 15 EKSEMPEL 1

Analyse af protein A-nukleotidsekvensen , 5 Protein A-genet omfatter ét IgG-bindingsområde (domæne E, D, A, B, C) og én cellevæg, der er forbundet med området (område X) (fig. 1). En signaisekvens går forud for disse to områder.

For at fremstille fusionsvektorer, der indeholder fusionspunkter efter henholdsvis 10 signalsekvensen og område E, er det onskeligt at kende nukleotidsckvensen, der omgiver fusionspunktet.

Nukleotidsckvensen for protein A kendes (Uhlén, M. et al., J. Biol. Chem. 259. 1695-1702 (1984)). Der henvises til den fuldstændige beskrivelse i denne reference.

15 I fusionspunktet efter signalsekvensen (herefter kaldet S) er der et Mstl-restriktionsenzymsted. Efter område E er der også et Mstl-restriktionsenzvmsted. Ved skæring af protein A-genct i en hensigsmæssig plasmidvektor med MstI, efterfulgt af indsættelse aflinkere, kan generelt anvendelige vektorer opnås, således som det vil 20 blive beskrevet i det følgende.

EKSEMPEL 2

Konstruktion af pAS, pASE og pASEE 25 I det folgende trin beskrives konstruktionen af plasmidvektorer, hvor unikke EcoRl-steder er placeret efter henholdsvis S og SE. Det er også beskrevet, hvorledes SEE er konstrueret, og hvor et EcoRl-sted er indeholdt mellem EF-områdeme såvel som efter SEE-konstruktionen.

A. Konstruktion af pAS, pASE og pASEE-plasmidvektorer.

30 „ DK 175020 B1 16 50 /ig pR!T4 (Nilsson, B. et al., EMBO J., 4, 1075 (1985)) (fig. 2) blev delvis skåret med Mstl under anvendelse af 5 enheder restriktionsenzym ved inkubation i 2 timer ved 37'C. Efter inkubation ved 65'C i 30 minutter blev reaktionsblandingen delt i tre adskilte reaktioner. EcoRl-linkcre med forskellig længde blev sat til hver af 5 reaktionsblandingemc. Til rør 1 blev en 8-mer-linker tilsat (GGAATTCC), til ror 2 blev en 10-mer-linker tilsat (CCGAATTCGG), og til rør 3 blev en 12-mcr-linker tilsat (CCCGAATTCGGG). Efter ligering (som beskrevet under rutinemæssige fremgangsmåder) blev hver af ligeringsblandingeme skåret med EcoRI, hvilket efterfulgtes af fortynding til 2 Mg/ml og ligering. Transformation blev udført som 10 beskrevet under de rutinemæssige fremgangsmåder, og ampicillinresistente transformanter blev selekteret. I hver reaktion blev to hovedvektortyper fundet. Én type indeholder signalsekvensen efterfulgt af EcoRl-linkeren og mp9-multilinkeren.

Den anden vektortype indeholder EcoRl-linkeren efter område E efterfulgt af mp9-linkeren. Ved tilsætningen af EcoRI med forskellige længder er mp9-15 linkerrestriktionsstedeme tilgængelige i tre læserammer for hver konstruktionstype (fig- 3)·

Foruden disse to vektortyper, der er vist i fig. 3, kunne yderligere én plasmidvektortype isoleres i eksperimentet, der indeholder 12-mer-EcoRl-linkeren.

20 Denne konstruktion indeholder SE-12-mer-linker-E-mp9-linker. På denne måde indføres 4 aminosyrer mellem de to E-områder såvel som et EcoRl-restriktionssted.

Denne vektor blev benævnt pASEE, og den har mp9-linkeren i type 3-læserammen (fig. 3). Alle konstruktioner er blevet bekræftet i forhold til linkerområdemc under anvendelse af DNA-sekventering.

25 EKSEMPEL 3

Konstruktion af B-genfragmenter 30 Det følgende eksperiment beskriver subkloningen af et genfragment, der koder for område B fra stafylokokprotein A.

17 DK 175020 B1

Udgangsmaterialet, plasmidvektoren pSPAl 1, har protein A-gcnet ned til el Sau3 AI-restriktionssted placeret i område C 117 basepar nedstroms for område B. Efter oprensning af pSPAl 1 blev det oprensede plasmid kort på en Sepharose 6B-søjle for at rense plasmidet for RNA, som virker som en kompetitiv inhibitor i Bal 31-5 behandlingen. Omkring 100 μg af det oprensede pSPAl 1 (fig. 4) blev skåret med

EcoRl. der spalter 117 basepar nedstroms fra område B. Exonukleasc Bal 31 blev anvendt som beskrevet under rutinemæssige fremgangsmåder. Efter Bal 31-behandlingen blev reaktionsblandingen udfældet med EtOH efterfulgt af behandling med 10 enheder Klenow-polymerase i nærværelse af 0,5 mM dNTPs for at sikre 10 stumpe ender. Samlingen af DNA med heterologe længder blev ligeret med BAMH1 8-mer-linkcre (CGGATCCG). Efter ligering blev reaktionsblandingen skåret med Barn Hl og Hindi II. Hindi Il-stedet er placeret 79 basepar opstroms for område B. Reaktionsblandingen blev udsat for en 5% polyacrylamidgel-elcktroforese for at adskille fragmenter med heterologe længder. Fragmenterne på omkring 250 basepar 15 blev skåret ud af gelen og elektroelueret og ligeret til pEMBL9, der på forhånd var skåret med Barn Hl og Hindi II. Efter transformation til E. coli JM103 blev hvide kolonier selekteret på TBAB-plader, der indeholder X-gal og IPTG. Dn klon, hvor fire nukleotider er fjernet fra område B, blev valgt til yderligere arbejde (Hg. 5).

20 Plasmid DNA fra denne klon blev oprenset og kort på en Sepharose 6B gel til fjernelse af RNA. Omkring 100 p.g plasmid DNA blev yderligere skåret med Hindi II og behandlet med exonukleasc Bal 31 som beskrevet under rutinemæssige fremgangsmåder. Efter behandling med Klenow-polymerase (10 enheder) i nærværelse af 0,5 mM dNTP i 30 minutter ved 37°C for at sikre stumpe ender, blev 25 reaktionsblandingen ligeret til EcoRl 10-mer-linkere (CCGAATTCGG). Efter skæring med EcoRl og Barn HI blev DNA underkastet en 5% polyacrylamidgel-elektroforcsc.

Stykker på omkring den onskede længde på 179 basepar blev skåret ud og elektroelueret. Det isolerede DNA fra elueringen blev ligeret med pEMBL9, der var skåret med EcoRl og BamHI. Efter transformation til E. coli JM103 blev hvide 30 kolonier selekteret på TBAB-plader, der indeholder X-gal og IPTG. Sekvensanalyse fremlagde tre interessante kloner (betegnet henholdsvis 0,-1 og -2), disse blev valgt til 18 DK 175020 B1 det videre arbejde. Tallene (0, -1 og -2) beskriver antallet af nukleotider, der er slettet ind i område B for bindingen af EcoRI-linkeren, som vist i fig. 5.

De tre kloner med de tre forskellige læserammer ind i område B (herefter kaldet B-0, 5 B-l og B-2) blev spaltet med BamHl. Den udragende ende fra BamHI-skæringcn blev fjernet med Sl-nuklcase, som det er beskrevet under rutinemæssige fremgangsmåder. Translationsstop-linkeren, der er vist i fig. 6, blev ligeret til hver af reaktionsblandingeme. Lysinresten i hver konstruktion vil nu blive erstattet med enten en Gly- eller Ala-rest, hvilket afhænger af orienteringen af den indkomne stop-linker, 10 som vist i fig. 6. Efier transformation til E. coli JM103 udførtes sekvensanalyse af de isolerede kloner, der indeholder B-fragmenteme, der har stop-linkeren indsat nedstrøms. Sekvensanalysen fremlagde, at B-0 afsluttes af en Gly-rest, B-l af en Ala-rest og B-2 af cn Ala-rest.

15 Disse fragmenter er nu klar til at blive klonet ind i nogle af de vektorer, der er beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 4 20 Konstruktion af pASEB, pASBl og pASB2 B-fragmentet blev nu klonet ind i pAS og pASE.

Omkring 50 μg af vektorerne, der indeholdt B-0, B-l og B-2 og stop-linkercn, blev 25 henholdsvis skåret med EcoRl og Hindlll. Hindi 11 skærer direkte efter stop-linkeren. B-fragmentct fra hver vektor blev isoleret under anvendelse af polyacrylamidgel-elektroforese.

Β-0-fragmentet blev ligeret med pAS2 (fig. 3), der var spaltet med EcoRl og Hindlll.

30 Efter transformation til E. coli HB101 og restriktionsanalyse af plasmid DNA fra enkelte kloner kunne pASB-1 plasmidvcktoren isoleres, hvilken indeholder fragment B fra protein A efter signalsekvensen.

19 DK 175020 B1 B-l-fragmentet blev ligeret med pAS3 (fig. 3), der var skåret med EcoRl og Hindi 11.

Efter transformation til E. coli HB101 og restriktionsanalyse af plasmid DNA fra enkelte kloner kunne pASB-2 plasmidvektoren isoleres, hvilken indeholder fragment 5 B fra protein A efter signalsekvensen.

Forskellen mellem pASB-1 og pASB-2 er de tre aminosyrer, der er til stede i EcoRI-linkerområdet, som vist i fig. 7.

10 B-2-fragmentet blev ligeret med pASEl (fig. 3), der var skåret med EcoRl og Hindlli.

Efter transformation til E. coli HB101 og restriktionsanalyse af plasmid DNA fra enkelte kloner kunne pASEB-plasmidvektoren isoleres, hvilken indeholder et fragment fra protein A knyttet til område E.

15 EKSEMPEL 5

Konstruktion afpASEE-lGF-I

I dette eksperiment vises det, hvorledes et syntetisk gen, der koder for human insulin-20 lignende vækstfaktor I (IGF-1), blev klonet ind i pASEE-vektoren, der er beskrevet i eksempel 1.

Det syntetiske gen, der koder for IGF-I (fig. 8) (Elmblad, A. et al., i Third European Congress on Biotechnology III, 287-296, Verlag Chcmie, Weinheim (1984)), blev 25 skåret ud af pUC8 med EcoRl og Hindlli. Gen fragmentet, der koder for IGF-1, blev isoleret ved polyacrylamidgcl-elektroforese efterfulgt af clcktroeluering.

Plasmidvektoren pASEE blev delvis skåret med EcoRl. og den lineariserede vektor blev isoleret ved 1% agarosegel-elektroforese. Efter clcktroeluering blev den lineære 30 vektor skåret med Hindlli og efterfølgende isoleret ved 1 % agarosegel-elektroforesc. IGF-I-fragmentet blev ligeret til denne pASEE-vektor, og efter transformation kunne 20 DK 175020 B1 pASEE-lGF-l isoleres fra cn baggrund af pASE-IGF-I. Efter signalsekvensen koder pASEE-lGF-l for en EE, der er fusioneret med IGF-l.

EKSEMPEL 6 5

Konstruktion af pE8EE-IGF-l I dette afsnit vises det, hvorledes SEE-1GF-I klones i den anden orientering i pEMBL, sammenlignet med pAS-vektoreme, der er beskrevet i eksempel 1.

10

Ca. 50 μg pASEE-IGF-I (som beskrevet i eksempel 5) blev skåret med Taql og HindiII. Restriktionsendonukleasen Taql skærer 179 basepar opstrøms for translationsstartstedet for protein A-genet, og Hindlll skærer nedstroms for IGF-l-genet. Reaktionsblandingen blev udsat for en 4% polyacrylamidgcl-elektroforese, og 15 SEE-IGFI-I-fragmentet blev skåret ud og elektroelueret.

Dette fragment blev ligeret til pEMBLS, der var skåret med Acel og Hindlll. Efter transfonnation til E. coli HB101 kunne plasmidet pE8EE-IGF-I isoleres og analyseres ved restriktionsanalyse.

20 EKSEMPEL 7

Konstruktion af pE9EDABC

25 I dette afsnit vises det, hvorledes SEDABC klones ind i pEMBL9 for at få den IgG-bindende del af protein A i den modsatte orientering.

Plasmidvektoren pRIT4 blev skåret med Taql og EcoRI. Restriktionsendonukleasen Taql skærer 179 basepar opstrøms fra TTG-startkodonen, og EcoRI spalter i område 30 C af protein A.

2] DK 175020 B1

Dette fragment blev ligeret til pEMBL9, der var skåret med Accl og EcoRI. Efter Iransformation til E. coli HB101 kunne plasmidvcktoren pE9EDABC isoleres. Dette plasmid har protein A-genet orienteret fra replikationsstartstedet.

5 EKSEMPEL 8

Udtrykkelse og placering af protein A-aflcdte fragmenter i E. coli

Forskellige protein A-konslruktioner blev dyrket natten over og 10 udtrykkelsesniveaueme og placeringen af protein A, /3-galaclos idase (intracellulær markør) og /3-lactamase (periplasmatisk markør) blev målt. Plasmidet pASEE blev transformeret til E. coli HB101 for at være indeholdt i den samme E. cø//-stamme som de andre konstruktioner. Efter dyrkning natten over blev cellerne centrifugeret.

Cellerne blev udsat for et osmotisk chok efterfulgt af centrifugering (som beskrevet 15 under rutinemæssige fremgangsmåder). Sfæroplasleme i pelleten blev sonikeret for at frigive de intracellulære proteiner.

Vektortype (A eller B) henviser til orienteringen af protein A-afledte konstruktioner, sammenlignet med /?-lactamasen (AM-gen) (fig. 8). Analysemetoder for β-20 galatosidase, /3-lactamase og protein A udfores som beskrevet under rutinemæssige fremgangsmåder.

Resultaterne af eksperimenterne kan ses i tabel 1.

25 Det fremgår, at små fragmenter af protein A inducerer filamentagtig vækst såvel som lækage af de periplasmatisk lokaliserede proteiner, der omfatter det protein A-afledte fragment.

I genkonstruktioneme, der indeholder område B direkte efter signalsekvcnsen (pASBl 30 og pASB2), findes den storste del af protein A-fragmentet i den intracellulære fraktion. Konklusionen er, at denne opførsel skyldes, at lederpeptidasen er ude af 22 DK 175020 B1 stand til at fraspalte signalpcptidet, og at det translaterede B-peptid sidder fast i den cytoplasmatiske membran.

N-terminalsckventering (ved brug af en konventionel Edman-nedbrydningsteknik) af 5 B-fragmenterne, der var oprenset fra E. cø//-kulturcr, der henholdsvis indeholder pASBl og pASB2-plasmiderne, viste bcarbcjdningsstcdcr i signalsekvcnscn, der bekræfter, at lederpeptidasen ikke fraspalter signalpeptidet (fig. 7). Derudover ses forogede udtrykkelsesniveauer fra disse konstruktioner, filamentøs vækst såvel som lækage af de normalt pcriplasmatiske proteiner til de ekslracellulære områder.

10 pASEE-IGF-I-konstruktioneme giver også et ekstracellulært hybridprotein, der også er forbundet med filamentøs vækst.

De to konstruktioner, der repræsenterer en type B-vektor (pE8EE-lGF-l og 15 pE8EDABC), giver den mest udtalte filamentøse vækst.

Det er bemærkelsesværdigt, at den pESEDABC, der udtrykkes i E. coli HB10I, giver et højt udtrykkclscsniveau såvel som udskillelse, medens pRIT4 giver en lav udtrykkelse. Det kan diskuteres, om denne forogede udtrykkelse er afhængig af 20 opstrøms lac-promotoren i pE9EDABC-konstruktionen. Det blev imidlertid vist, at denne filamentøse vækst og dette udtrykkelsesniveau er uafhængigt af tilsætning af IPTG (der erkendt til induktion af transskription fra lac-promotoren).

Det, der kan konkluderes ud fra dette eksempel, er, at forskellige konstruktioner 25 baseret på protein A-promotoren og signalsekvensen inducerer filamentøs vækst, eksport af periplasmatiske proteiner til vækstmediet og forøget udtrykkelse fra protein A-konstruktioneme.

Da filamentøs vækst er forbundet med varmechok-respons i E. coli, blev det næste 30 eksperiment udfort for at se, om den hoje udtrykkelse fra protein A-promotoren skyldes varmechok-respons, eller om en hoj udtrykkelse af ukendte årsager giver et varmechok-respons.

23 DK 175020 B1 EKSEMPEL 9

Udtrykkclsc afpRIT4 i HBlOl med og uden et vamiechok 5 Plasmid pRIT4 indeholder IgG-bindingsdelen af protein A i en type A-veklor (fig. 2, fig. 9 og eksempel 8). Når en E. coli HB101 dyrkes natten over, udskilles protein A i ringe mængde (9%) til vækstmediet. Det blev valgt, at denne protein A-konstruktion skulle dyrkes med og uden et vamiechok som en stigning i temperatur, selv om det 4% EtOH og forskellige oxidative midler er velkendte til på anden måde at opnå et 10 varmechok-respons.

E. coli HB101, der indeholder pR!T4, blev dyrket natten over (30°C).

Overnatskulturen blev inokuleret (150 μΐ) i 15 ml nylig fremstillet TSB-medium, der indeholdt 70 /tg/ml ampicillin, og cellerne blev dyrket i 2 1/2 time i to separate 15 rystekolber.

Én af kulturerne blev fortyndet med 15 ml TSB (30°C) og inkuberet ved 30°C. Til den anden kolbe tilsattes 15 ml TSB ved 54°C, og kolben blev inkuberet ved 42°C.

20 Efter 3 timers inkubation regnet fra skift-tidspunktet blev cellerne centrifugeret.

CellcpcIIcten blev vasket én gang med 10 ml PBST og resuspenderet i 5 ml PBST og sonikeret i 3 x 30 sekunder (i en MSE-sonikator, niikrotip, styrkeniveau 6). Efter centrifugering ved 16.000 g i 10 minutter blev supematanten opsamlet.

25 Protein A blev kvantitetsbestemt både i mediet og i den sonikerede fraktion, som svarer til den totale mængde i periplasmaet og cytoplasmaet. Resulteme er: 30 24 DK 175020 B1

Udtrykkel- Filamentsesniveau agtig % Ekstra- 5 Plasmid Temperatur OD580 nm i (mg/l) vækst cellulær pRIT4 30°0 30°C 0,210 0,16 (-) 13 pRiT4 30°O42°C 0,289 3,14 + 68 10 _

Den relativt lave udtrykkelse er bekræftet af den lave optiske tæthed (ODS80). Udtrykkelsesniveauet i den varmechokbehandlede cellekultur er forøget 20 gange.

15 Dette kan kun forklares, hvis transskriptionskontrollen af protein A-genet i sig selv også er den for varmechok-responset.

Selv om opfindelsen er blevet eksemplificeret under anvendelse af kun (¾ specifikke gener, er det klart, at opfindelsens grundlæggende principper kan anvendes til at 20 omfatte gener, der udtrykker et hvilket som helst onsket genprodukt. Således kan opfindelsen ud over at udtrykke fx 1GF-1 anvendes til produktion af andre proteiner, såsom andre medicinsk anvendelige proteiner, fx andre somatomediner, såsom IGF-ll, nervevækstfaktor (NGF), epidermisk vækstfaktor (EGF), blodplade-afiedt vækstfaktor (PDGF). Teknikken ifølge opfindelsen kan også anvendes til produktion af a-, β- og γ· 25 interferoner, interleuciner, insulin, neuropeptider, gastrointestinale peptider eller andre peptider, der er af interesse.

Det må yderligere bemærkes, at opfindelsen ikke er begrænset til anvendelsen af E. coli som en værtscelle, men også kan anvendes under anvendelse af andre bakterielle 30 værtsceller. Andre signalsekvcnser end dem, der stammer fra protein A, kan derudover anvendes.

25 DK 175020 B1

C

r— C-

•^vn 2 *" w*> Oi r^ r* β O

'w' (3

£ <-* mrjOu^oQCODQQ

3Λ — ►Ou-ittZZZZzz; .<h 3 L! O C i- — «sif~.r->QQQOoei E -1 z z z z z z ——R——---- C. Q 03 O (— un -c r— rnc?ioo

W Z 03 »O N N »- 03 N

e

rH -c K> O — OC2QQQQO

i Z> Cntoo-^inZZZZZZ

U

C — •-'-OOQQQQ

> — Z Z Z Z Z Z

Γ; ,- ΟΝ£ΛΝο^γ*ΝΝΝΚ1 ^ Λ, Z β 1Λ

W

C

0 (j fOKi><irr*?QQOCiaQ

^}2 zzzzzz 1 Λ w .

« °y Kitn.-^rjoQncicjad

H-i Oicr>cncr,cr>zZZZ ZZ

«3 G) >

•H

rj ,____ in s-i 0) G) in s-)

1 ί Ή H

15 03 t—i X \

2 C fM

pi s H ansn^on^-Nr- —< Z N fO Orno

“I

-r· <; 20 ^ in % > in g S ^ S 11 + + + + + + + 1 + £ ^ * + w +

-S

25--- c

•H

g J

S I 1<<<<<<β3<=5 g t >

O

ii ‘ 0) 30 “* ^ o o u "3 —i ^ s —< ~> N O I I <

E N -- - N a B) U 113 » Q

tn m<aoaaaat’i-u i te iawinwwwwe-to — W<<<<<<U3^Z) o — aaaan.caaa"& z

Claims

26 DK 175020 B1

1. Fremgangsmåde til udtrykkelse af proteiner i gram(-)bakterier og tilvejebringelse af ekstracel lulær udskillelse af disse, 5 kendetegnet ved, at: a) indførelse i en gram(-)bakterie af en rekombinant DNA-konstruktion, der omfatter en promotor, en signalsekvcns, der gør translokation og bearbejdning mulig, og et strukturelt gen, der omfatter et spaltningsområde, hvori del strukturelle gen har den 10 almene formel (E)„(B)m - Y, hvor n er 1, og m er 0; eller n er 2, og m er 0; eller n er 1, og m er 1; eller n er 2, m er 15 0, og Y er genet, der koder for IGF-1 eller IGF-2, og E og B betegner generne, der svarer til protein A-områdeme E og B, med det forbehold, at det strukturelle gen er forskelligt fra det, der koder for det naturlige protein A; b) dyrkning af bakterien under betingelser, der resulterer i filamentøs vækst; og 20 c) isolering af det ekstracellulært udskilte protein.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ekspressionen af det ønskede protein er under den samme transskriptionskontrol som den, der gælder for den 25 filamentøs vækst.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at transskriptionskontrollcn er baseret på induktion af htpR, der udtrykker Sigma-32 proteinfaktoren.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den filamentøse vækst under trin b) skyldes karakteren af den rckombinante DNA-konstruktion, og det protein A, der udtrykkes derfra; og/eller at den filamentøse 2? DK 175020 B1 vækst under trin b) skyldes ekstern induktion; og/ellcr at den filamentose vækst under trin b) skyldes både karakteren af den rekombinante DNA-konstruktion og proteinet A, der udtrykkes derfra og den eksterne induktion.

. 5 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det udtryktc protein, der genkendes som fremmed eller forkert foldet, inducerer Ion-respons i bakterien.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den filamentøse vækst forårsages af forøget temperatur under dyrkningen, hvilket inducerer el 10 varmechokrespons; og/eller at den filamentøse vækst forårsages af tilsætning af el denatureringsmiddel i dyrkningsmediet.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den rekombinante DNA-konstruktion indføres i bakterien ved hjælp af en 15 plasmidvektor.

8. Fremgangsmåde ifolge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den rekombinante DNA-konstruktion som en signalsekvens indeholder signalsekvensen fra protein A. 20

9. Fremgangsmåde ifolge krav 8, kendetegnet ved, at det strukturelle gen, der støder op til signalsekvensen, indeholder et spaltningsområde, der koder for de N-terminale aminosyrerester af det modne protein, der skal isoleres.

10. Fremgangsmåde ifolge krav 9, kendetegnet ved, at spaltningsområdet er udformet således, at det koder for mindst 6 aminosyrerester.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at de omtalte rester er:

30 Ala Gin His Asp Glu Ala. 28 DK 175020 B1

12. Fremgangsmåde ifolgc krav 8, 9, 10 eller 11, kendetegnet ved, at det strukturelle gen omfatter gener, der er udvalgt blandt E, EE og EB-domæneme i protein A.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det strukturelle gen også 5 omfatter genet, der koder for den insulin-lignende vækstfaktor l(lGF-l).

14. Rckombinant DNA-konstruktion, der omfatter: en promotor, en signalsekvens og et strukturelt gen, der omfatter et spaltningsområde, 10 kendetegnet ved, at det strukturelle gen har den almene formel (E)n(B)m-Y, hvor n er 1, og m er 0; eller n er 2, og m er 0; eller n er 1, og m er 1; eller n er 2, m er 15 0, og Y er genet, der koder for IGF-1 eller 1GF-2, og E og B betegner generne, der svarer til protein A-områdcme E og B, med det forbehold, at det strukturelle gen er forskelligt fra det, der koder for det naturlige protein A.

15. Rekombinant DNA-konstruktion ifølge krav 14, kendetegnet ved, at 20 spaltningsområdet er udformet til at kode for mindst 6 aminosyrerester.

16. Rekombinant DNA-konstruktion ifølge krav 15, kendetegnet ved, at de omtalte rester cr :

25 Ala Gin His Asp Glu Ala.

17. Plasmidvektor, kendetegnet ved, at den omfatter den rekombinantc DNA-konstruktion ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16.

18. Plasmidvektor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den stammer fra pEMBL9. 29 DK 175020 B1

19. Gram(-)bakterie, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-konstruktion ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16.

20. Gram(-)bakterie, kendetegnet ved, at den indeholder plasmidvektoren ifølge krav L 5 17 eller 18.

21. Gram(-)bakterie ifølge et hvilket som helst af kravene 19-20, kendetegnet ved, at den er en E. coli, især E. coli HB101.