DK167162B1 - Fremgangsmaade til visualisering af tilstedevaerelsen af en analyt i et biologisk materiale samt visualiseringspolymer, detekteringsmiddel-visualiseringspolymer-kombination, visualiseringspolymerkompleks og detektionssaet til anvendelse ved femgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 167162 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til visualisering af tilstedeværelsen af en uorganisk eller organisk analyt samt en visualiseringspolymer, en detektionsmiddel-visua-liseringspolymer-kombination, et visualiseringspolymer-5 kompleks og et detektionssæt til anvendelse ved fremgangsmåden. Visualiseringspolymeren er sammensat af molekyler, såsom proteiner, enzymer og kemisk mærkede polyo-ler, polyalkener, carbonhydrater og naturlige eller syntetiske polypeptider, som kan kombineres med biologisk 10 materiale og give væsentlig kemisk forstærkning af mængden af detekteret materiale. Fremgangsmåden kan anvendes i forbindelse med lægelig diagnose.

Kravene til en lægelig diagnosemetode, som detekterer 15 og/eller kvantificerer tilstedeværelsen af biologisk materiale, inkluderer identifikation af yderst små mængder og selektion af en enkelt art materiale fra en sammensat blanding indeholdende lignende arter. Tidligere har sådanne metoder som radioaktiv mærknings-, radioaktiv bio-20 prøvnings- og immunoprøvningsteknik dannet grundlaget for en sådan lægelig diagnose. F.eks. er immunologiske reagenser blevet anvendt i udstrakt grad til detektering og/eller kvantificering af et bredt spektrum af molekyl-arter, såsom proteiner, lipider, carbonhydrater, steroi-25 der, nucleinsyrer, lægemidler, carcinogener, antibiotica, uorganiske salte osv. Polyvalente og monoklonale antistoffer er meget vigtige diagnostiske redskaber inden for de fleste områder af den kliniske lægevidenskab i dag, 30 I løbet af de sidste 40 år er der blevet udviklet en lang række procedurer til visualisering af specifikke antigenantistof -reaktioner fluorimetrisk eller kolorimetrisk. Da anvendeligheden af immunodiagnostiske procedurer ofte afhænger af den følsomhed og specificitet, hvormed mål-an-35 tigenet eller -molekylet kan detekteres, er der et stærkt ønske om nye metoder til at forøge disse detektionspara-metre. Den videnskabelige litteratur og patentlitteratu- DK 167162 B1 2 ren bugner med arbejder udformet med henblik på dette mål. En detaljeret omtale af fordelene og ulemperne ved immonologiske metoder kan findes i enhver standard-lærebog i immunocytokemi; se f.eks. L. A. Sternberger, 5 "Immunohistochemistry", 2. udgave, John Wiley and Sons,

New York, 1979.

Immunologiske detektionsmetoder kan udnytte direkte eller indirekte visualiseringsteknikker til måling af det dan-10 nede immunokompleks. I almindelighed angiver disse metoder visuelt tilstedeværelsen af komplekset ved anvendelse af en enhed koblet til komplekset, der producerer et de-tekterbart, kvantificerbart signal, såsom farve, fluorescens, radioaktivitet, enzymatisk virkning og lignende.

15 Jo mere signalintensitet, der findes pr. kompleks, jo bedre vil følsomheden for tilstedeværelsen af en ganske lille mængde af analytten være.

Af disse metoder er den simpleste og mindst følsomme di-20 rekte immunofluorescens. Ved denne metode knyttes et primært antistof (eller et specifikt ligand-bindende protein) kemisk til et fluorochrom som signalenheden. Indirekte immunofluorescensmetoder, hvorved et primært antistof anvendes umodificeret, og det på sin side detekteres med 25 et fluorescensmærket sekundært antistof, vil almindeligvis forøge detektionsfølsomheden omkring 2-4 gange i forhold til direkte metoder. En yderligere 3-5 ganges forøgelse i følsomhed er blevet rapporteret ved anvendelse af en "hapten-antis tof sandwich"-teknik; se Cammisuli et 30 al., J. Immunol. 117, 1696 (1976); Wallace et al., J.

Immunol. Methods, 2j5, 283 (1979). Ifølge denne teknik kobles 10-15 molekyler af en lille haptendeterminant, såsom 2,4-dinitrophenol, kemisk til hvert primært antistof-molekyle. Ved anvendelse af et fluorescensmærket andet 35 antistof, som danner kompleks med haptenmolekylerne fremfor med det primære antistof selv, kan der derefter findes mere af det sekundære visualiseringsprotein pr. anti- 3 DK 167162 B1 gen-center, hvorved følsomheden yderligere forøges.

Nakane og medarbejdere [se Nakane et al., J. Histochem. Cytochem., 22, 1084 (1974), Wilson et al., "Immuno- 5 fluorescence and Relates Staining Techniques", W. Knapp, H. Holuban and G. Wick, Eds. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, side 215] har koblet sekundære antistoffer til monomer peberrod-peroxidase og anvendt peroxidase-enzymets katalytiske aktivitet til at afsløre enten cen-10 tret eller mængden af antigen i prøven. Lignende enzymatiske prøvninger er blevet udviklet med sekundære antistoffer konjugeret med tarm- eller bakteriel alkalisk phosphatase; se Avrameas, Immunochemistry, i5, 43, (1969);

Mason et al., J. Clin. Path., 31, 454 (1978).

15

Det enzymatiske signal kan ved denne metode fremkomme på enhver af to måder. Enzymatisk omdannelse af et opløseligt enzymsubstrat til uopløseligt farvet produkt muliggør den direkte lokalisering af antigenet ved direkte ma-20 kroskopisk visualisering eller ved undersøgelse i lysmikroskop. Alternativt kan farveløse substrater omdannes enzymatisk til opløselige farvede produkter, som kan anvendes til at kvantificere antigenkoncentrationer ved direkte kolorimetrisk analyse. Den sidstnævnte metode er 25 grundlaget for den enzym-forbundne immuno-sorbent-prøv- ning (ELISA), som er bredt anvendt i kliniske laboratorier over hele verden; se Sternberger, Immunohisto-chemistry, 2. udgave, John Wiley and Sons, N.Y. (1979); Engvall et al., Immunochem., 8, 871 (1972); Engvall et 30 al., J. Immunol., 109, 129 (1972); Guesdon et al., J.

Histochem. and Cytochem., 27, 1131 (1979); Voller et al., "The Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)", Dynatech Laboratories Inc. Alexandria (1979).

35 Disse enzym-baserede detektionsmetoder er almindeligvis mere følsomme end direkte eller indirekte immunofluore-scensmetoder, da enzymets høje omsætning af substrat kon- 4 DK 167162 B1 tinuert akkumulerer et måleligt produkt over lange tidsrum.

For yderligere at forøge følsomheden af immunoenzymprøv-5 ninger udviklede Sternberger [ se Sternberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18, 315 (1970)] en tre-trins peroxidase- antiperoxidase (PAP)-prøvningsmetode. Efter tilsætning af et primært antistof og et sekundært antistof, der virker som bro mellem det primære antistof og antiperoxi-10 dase-antistoffet, sættes et peroxidase-antiperoxidase-antistofkompleks (PAP-kompleks) til prøven før udviklingen af den enzymatiske reaktion. Da PAP-komplekset indeholder to immunoglobuliner (antiperoxidase-antistoffer) og tre aktive peroxidase-molekyler, er nettovirkningen at 15 tilvejebringe mere enzym ved antigencentret, hvorved de-tektionssignalet forstærkes. Selv om det er ganske nyttigt, har PAP-detektionssystemet nogle begrænsninger. Det sekundære "bro"-antistof må anvendes i mætningsindhold for at sikre optimal binding af PAP-komplekset. Endvidere 20 må antiperoxidaseantistoffet og det primære antistof være af samme art eller af immunologisk krydsreagerende arter, således at det sekundære antistof vil danne bro til begge.

25 I løbet af de sidste få år er det blevet påvist, at den specifikke og stærke reaktion mellem biotin, et lille vandopløseligt vitamin, og avidin, et 68 000 dalton glycoprotein fra æggehvide, kan udnyttes til at udvikle antigen- eller ligand-detektionssystemer; se Bayer and 30 Wilchek i Voller et al., "The Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)", Dynatech Laboratories Inc., Alexandria (1979). Biotin kan kobles kovalent til amino-, carboxyl-, thiol- eller hydroxygrupper, som er til stede i proteiner, glycoproteiner, polysaccharider, steroider 35 og glycolipider, under anvendelse af velkendte kemiske reaktioner; se Guesdon et al., J. Histochem. and Cytochem., 27, 1131 (1979); Sternberger et al., J. Histochem.

5 DK 167162 B1

Cytochem., lj), 315 (1970); Bayer et al., Methods Biochem. Anal., 26, 1, (1980); Bayer et al., J. Histochem.

Cytochem., 24, 933 (1976); Heitzmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 71, 3537 (1974). Biotin kan også ind-5 føres i andre makromolekyler, såsom DNA, RNA og coenzy-mer, ved enzymatiske metoder, der udnytter biotin-mærkede nucleotidforstadier; se Langer et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 78, 6633 (1981). På lignende måde kan avidin kobles til et stort antal molekylarter ved kemiske stan-10 dardreaktioner; se Sternberger, "Immunohistochemistry", 2. udgave, John Wiley and Sons, N.Y. (1979); Nakane et al., J. Histochem. Cytochem., 22, 1084 (1974); Guesdon et al., Histochem. and Cytochem., 27, 1131 (1979); Bayer et al., Methods Biochem. Anal., 26, 1, (1980). Dette mulig-15 gør stor fleksibilitet ved udformningen af detektions-systemer til anvendelse inden for immunologi, immuno-pathologi og molekylær biologi.

I 1981 rapporterede Hsu [se Hsu et al., Amer. J. Clin.

20 Path., 75, 734 (1981); Hsu et al., J. Histochem.

Cytochem., 2£, 577 (1981)] anvendelsen af avidin/- biotinyleret peberrod-peroxidase-kompleks (ABC) til anti-gendetektion. I deres tre-trins procedure efterfølges den primære antistofinkubation af en inkubationsperiode med 25 et biotinmærket sekundært antistof og derpå med ABC-kom-plekset, dannet ved at forinkubere avidin med en titreret mængde biotinyleret peroxidase. Da avidin har fire biotinbindingscentre pr. molekyle, kan der adderes mindst tre peroxidaseenzymer til avidin uden at skade dets evne 30 til at reagere med det biotinylerede sekundære antistof.

Hsu og medarbejdere [se Hsu et al., Amer. J. Clin. Path., 75, 734 (1981); Hsu et al., J. Histochem. Cytochem., 29, 577 (1981)] rapporterede, at ABC-detektionsproceduren var 4-8 gange mere følsom til detektion af antigener i væv 35 end hvert af immunoperoxidase- eller PAP-detektions-systemerne. Madri [se Madri et al., Lab. Invest., 48, 98 (1983)] har bekræftes disse iagttagelser og vist, at ABC- 6 DK 167162 B1 metoden er fire gange mere følsom til antigendetektion under anvendelse af et ELISA-system end hver af immuno-peroxidase- eller PAP-teknikkerne. Efter alle prøvede kriterier er ABC-metoden den mest følsomme detektions-5 procedure, der er anvendt i klinisk diagnostiske laboratorier til dato.

Grænsen for ABC-metodens følsomhed viser sig imidlertid at være 30-100 pg af en analyt, såsom et protein eller en 10 nucleinsyre. Dette er væsentligt højere end den øvre grænse, som kræves til detektion af et enkelt molekyle pr. celle. Grænserne for andre mindre følsomme metoder er endog højere. I overensstemmelse hermed er det opfindelsens formål at udvikle visualiseringsmetoder, som væsent-15 ligt forbedrer følsomheden i forhold til den, som ydes af kendt visualiseringsteknik. Formålet er endvidere at udvikle et stabilt, let manipuleret visualiseringssystem, som har en lang holdbarhed. Endelig er det, som med enhver diagnostisk teknologi, et endemål at udvikle en ka-20 pacitet til detektion af et enkelt molekyle af en art i enhver given celle.

Disse formål opnås ved opfindelsen, som angår en fremgangsmåde til visualisering af tilstedeværelsen af en 25 uorganisk eller organisk analyt samt en visualiseringspolymer, og en detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kom-bination, et visualiseringspolymerkompleks og et detek-tionssæt til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden.

30 Ifølge opfindelsen kan tilstedeværelsen af en analyt visualiseres ved, at denne reagerer med en visualiserings-polymer omfattende flere enheder af en visualiseringsmonomer kovalent sammenknyttet ved polymerisation eller ved hjælp af et koblingsmiddel. Analyt-polymer-bindingen op-35 nås ved mellemkomst af et detektionsmiddel, som er selektivt for analytten og bærer visualiseringspolymeren.

DK 167162 Bl 7

Visualiseringspolymeren giver væsentlig kemisk forstærkning af den mængde analyt, som detekteres. Hver enhed af polymeren har mindst ét visualiseringscenter, og enhederne er sammenknyttet på en måde, som bevarer den iboende 5 aktivitet af enhedernes visualiseringscentre. En enhed er en visualiseringsmonomer, som kan frembringe eller producere farve, fluorescens, luminescens, lokalisering af radioaktivitet eller lokalisering af elektrontæt materia- ' le. Enhederne kan vælges blandt et enzym eller et mærket 10 naturligt eller syntetisk polypeptid, en mærket polyol, en mærket polyalken eller et mærket carbonhydrat.

Enhederne er direkte sammenknyttet ved polymerisering eller indirekte sammenknyttet ved hjælp af et koblingsmid-15 del. Direkte polymerisering eller kobling ved hjælp af koblingsmiddel sammenbinder kemiske grupper eller mono-mer-rygradsdele i naboenheder. De kemiske grupper eller rygradsdele, som udnyttes for hver enhed af en polymer vil være uafhængigt valgt blandt en aminogruppe, en oxi-20 deret form af en 1,2-diolgruppe, en carboxylgruppe, en mercaptangruppe, en hydroxygruppe eller en carbon-hydro-gen-binding.

Bevarelse af monomerenheds-visualiseringscenter-aktivite-25 ten opnås ved dannelse af polymerisationsbindinger eller ved sammenknytning af kemiske grupper eller rygradsdele i enhederne, som er mindst ét atom væk fra visualiseringscentret. Dette kan bestemmes ved fremstilling af en visualiseringspolymer med hver type koblingsmiddel eller 30 med hver type direkte polymerisationsproces og prøvning for at bestemme, om der er blevet produceret additiv aktivitet. Alternativt, hvis visualiseringscentrets samlede kemiske struktur kan bestemmes, kan monomerdele, som ikke udgør en del af denne struktur, sammenknyttes ved hjælp 35 af koblingsmidlet eller polymerisationsprocessen. Hvis f.eks. centret analyseres og findes at indeholde glycin, serin og histidin, men ikke lysin eller en sukkerart, kan 8 DK 167162 B1 lysin eller sukkerarten anvendes som den kemiske gruppe til sammenknytning.

Visualiseringscentrene i monomererne kan være centre for 5 biologisk aktivitet. F.eks. vil centre for enzymatisk virkning yde visualisering, når de omsættes med et passende substrat. På denne måde kan visualiseringscentrene udnyttes til at frembringe opløselige eller uopløselige samlinger af farve, fluorescens, luminescens, radioakti-10 vitet eller høj elektrontæthed, der kan måles og korrele-res med den detekterede mængde analyt.

Centrene kan også skabes kemisk. Ved kombination af et naturligt eller syntetisk polypeptid, polyol, polyalken 15 eller carbonhydrat med et visualiseringsmærke valgt blandt fluorescerende kemiske grupper, farvestoffer, radioaktive grupper, fotonudsendere (luminescerende grupper) og elektrontætte grupper vil der frembringes monomerenheder, som kan visualiseres. Mærket kan være til 20 stede i et ækvivalent forhold til hver enhed. Det foretrækkes imidlertid at have flere mærker pr. enhed.

Enhederne af visualiseringspolymeren føjes sammen ved direkte polymerisationsprocesbinding eller ved sammenknyt-25 ning med koblingsmiddel. Direkte polymerisation frembringer gensidig binding af forekommende kemiske grupper eller rygradsdele i naboenheder. F.eks. kan oxidative enzymer, såsom peberrod-peroxidase, anvendes til at polymeri-sere monomerenheder ved oxidativ tværbinding.

30

Alternativt bindes et koblingsmiddel afledt fra et bifunktionelt eller multifunktionelt organisk tværbindingsmiddel til den passende kemiske gruppe eller rydradsdel i enhederne. I denne sammenhæng skal "koblingsmiddel" be-35 tegne sammenknytningsgruppen efter binding og "tværbindingsreagens" betegne sammenknytningsforbindelsen før binding.

9 DK 167162 B1

Tværbindingsreagenset har den almene formel i:

A B

\ / R1

5 I

E

hvori R^ betyder en alifatisk gruppe på mindst 2 carbon-atomer eller en aromatisk gruppe på mindst 6 carbonato-Q mer, og de reaktive grupper A, B og E hver for sig betyder hydrogen, en carboxylsyregruppe, en syrehalogenid-gruppe, en aktiveret-ester-gruppe, en blandet-anhydrid-gruppe, en acylimidazol-gruppe, en N-(carbonyloxy)imid-gruppe, en iminoester-gruppe, en primær aminogruppe, en aldehydgruppe, en a-halogenacetylgruppe, en hydrazino-15 gruppe, en acylhydrazidgruppe, en azidogruppe, eller en N, N-maleimidgruppe, idet mindst to af A, B og E er forskellige fra hydrogen.

2ø Multifunktionelle tværbindingsreagenser med mere end tre reaktive grupper, som er mage til A, B og E, er også omfattet af opfindelsen. Disse yderligere reaktive grupper vil hver for sig kunne have de ovenstående betydninger angivet for A, B og E.

25

Valget af de reaktive grupper i formlen I vil afhænge af udvælgelsen af de kemiske grupper eller rygradsdele i de monomerenheder, som skal sammenknyttes. Hver slags kemisk gruppe eller rygradsdel vil reagere med dens tilsvarende passende reaktive gruppe eller grupper i formlen I. En

ϋ U

aminogruppe vil reagere med en carboxylsyregruppe, en syrehalogenidgruppe, en aktiveret-ester-gruppe, en blan- det-anhydrid-gruppe, en acylimidazolgruppe, en N-(carbo- nyloxy)imid-gruppe, en iminoestergruppe, en azidogruppe eller en aldehydgruppe. En oxideret 1,2-diol-gruppe (et 35 dialdehyd) vil reagere med en primær aminogruppe, en hy- 10 DK 167162 B1 drazinogruppe, en azidogruppe eller en acylhydrazidogrup-pe. En carboxylgruppe vil reagere med en primær amino-gruppe, en hydrazinogruppe, en azidogruppe eller en acyl-hydrazidogruppe. En mercaptangruppe vil reagere med en a-5 halogenacetylgruppe eller en N-maleimidgruppe. En hydr-oxygruppe vil reagere med en carboxylsyregruppe, en syre-halogenidgruppe, en aktiveret-ester-gruppe, en blandet-anhydrid-gruppe, en acylimidazolgruppe eller en N-(car-bonyloxy)imidgruppe. En carbon-hydrogenbinding vil reage-10 re med en azidogruppe (nitren).

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes et detekteringsmiddel, som er specifikt for analytten. Midlet bærer direkte eller indirekte visualiseringspolymeren til 15 analytten. Detektionsmidlet kan være et antistof, en lectin, et DNA-repressor-protein, et stereospecifikt receptor-protein, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbindende protein, avidin, streptavidin, et hormon eller en komplementær polynucleotidsekvens.

20

Detekteringsmidlet kan bære visualiseringspolymeren ved direkte kovalent binding med polymeren eller ved indirekte binding igennem en mellemliggende kovalent bindingsgruppe. Detektionsmidlet kan også bære polymeren via et 25 mellemliggende ligandbindingskompleks, hvilket arrange ment kan være direkte eller indirekte. I det direkte arrangement virker midlet også som en ligandbindingsforbindelse, og den tilsvarende ligand er kovalent bundet til visualiseringspolymeren. I det indirekte arrangement bin-30 des en første ligand til midlet, en anden ligand bindes til polymeren, og de lægges sammen med en ligandbindende forbindelse, således at den første og den anden ligand fungerer som broer, der danner kompleks med forbindelsen.

35 Ligandbindende forbindelser inkluderer et antistof, et lectin, avidin, streptavidin, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbindende protein eller en 11 DK 167162 B1 komplementær polynucleotidsekvens. Ligander vil være de passende forbindelser, der danner komplekser med hver type forbindelse. De inkluderer henholdsvis antigen, specifik sukkerart, biotin, iminobiotin, specifikt substrat, 5 polynucleotid og komplementært polynucleotid.

En foretrukken detekteringsmiddel-visualiseringspolymer-bærende kombination ifølge opfindelsen er den indirekte kombination, hvori detekteringsmidlet er et antistof, en 10 komplementær polynucleotidsekvens eller et lectin, den ligandbindende forbindelse er avidin eller streptavidin, og den første og den anden ligand hver for sig er valgt blandt biotin eller iminobiotin, N-(o-alkenyl)amido[biotin eller iminobiotin], hvori acylgruppen har en længde 15 på 4-20 carbonatomer, eller et N-(ω-oligomer)amido[biotin eller iminobiotin], hvori oligomeren er en polyol-, polyamid- eller polyvinylgruppe med en længde på 2-30 enheder. Et foretrukket forhold mellem visualiseringspolymer og avidin eller streptavidin i hvert af disse lig-20 andkomplekser er omkring 3:1.

Når detekteringsmidlet i denne foretrukne indirekte kombination er et lectin, vil analytten være en tilsvarende passende sukkerart. Når det er et antistof, vil analytten 25 være et antigen eller hapten, som danner kompleks med det antistof. Når det er en polynucleotidsekvens, vil analytten være en komplementær polynucleotidsekvens, som hybri-diserer med midlet.

30 Ved en foretrukken fremgangsmåde ifølge opfindelsen udnyttes den ovennævnte foretrukne indirekte kombination.

En særlig foretrukken fremgangsmåde til detektion af en analyt bygger på den ovennævnte foretrukne kombination, 35 men der anvendes en anden brodannelseskomponent. Komplekset, dvs. avidin- eller streptavidin-(biotinligand)-visualiseringspolymer, anvendes til at danne kompleks med 12 DK 167162 B1 et biotinmærket andet antistof. Det andet antistof er et alment reagens for det første detekteringsmiddel-antistof, som igen er specifikt for målet. Det første antistof inkuberes med målet til dannelse af et antigen-anti-5 stof-konjugat. Derpå inkuberes det andet antistof med dette konjugat. Efter den anden inkubation tilsættes visualiseringspolymerkomplekset, som binder til det andet antistof og frembringer visualisering.

10 Ved endnu en foretrukken fremgangsmåde ifølge opfindelsen udnyttes også den foretrukne indirekte kombination med kompleksdannende ligand. I denne kombination er detekteringsmidlet en komplementær polynucleotidsekvens, og ana-lytten er den tilsvarende native polynucleotidtidsekvens, 15 som vil hybridisere med den komplementære sekvens. Detekteringsmidlet og visualiseringspolymeren mærkes med en biotin- eller iminobiotingruppe. Der dannes et kompleks af avidin- eller streptavidin-(biotin-ligand)-visualiseringspolymer. Det mærkede detekteringsmiddel-polynucleo-20 tid sættes til den komplekse biologiske blanding indeholdende den native polynucleotidsekvens, som skal detekte-res. Hybridisering får lov at finde sted, og derpå tilsættes komplekset, som binder til det hybridiserede og mærkede detektionsmiddel-polynucleotid og frembringer vi-25 sualisering.

Særligt foretrukne overførende kombinationer inkluderer dem, som indgår i de to ovennævte foretrukne fremgangsmåder.

30

Komplekserne mellem den ligandbærende forbindelse og visualiseringspolymeren bundet til den tilsvarende ligand er også omfattet af opfindelsen. Disse komplekser er beskrevet ovenfor som del af den overførende kombination 35 ifølge opfindelsen.

13 DK 167162 B1

Foretrukne detekteringsmetoder og foretrukne visualiseringspolymere inkluderer polymere med flerdobbelte enheder af et enzym eller flerdobbelte enheder af et naturligt eller syntetisk polypeptid eller en polyalken kemisk 5 bundet til et mærke udvalgt blandt en fluorescerende gruppe, et farvestof, en luminescerende gruppe eller en elektrontæt gruppe. Foretrukne enzymer inkluderer alkalisk phosphatase, peroxidase, galactosidase, glucoseoxi-dase, sur phosphatidase og luciferase. Foretrukne poly-10 peptider inkluderer polyamider af dicarboxylsyrer og di-amin samt polyamider, oligomere og copolymere af a-amino-syrer, såsom glycin, lysin, asparaginsyre, cystein, orni-thin og lignende. Polyalkener inkluderer polyacylamid, polyacrylsyre, polymaleinsyre, poly(hydroxyethylacrylsy-15 reester) og lignende. Disse polypeptider og polyalkener vil blive mærket med sådanne grupper som fluorescein, rhodamin, et diazofarvestof, kolloidalt guld, luciferin, radioaktivt iod og lignende.

20 Til fremstillingen af visualiseringspolymererne foretrækkes. bindingsarrangementer af koblingsmiddel og kemisk gruppe som f.eks.: 1. Et diacyl- eller di(iminoester)-derivat af en alifa-25 tisk dicarboxylsyre med 4-20 carbonatomer, som vil danne amid- eller amidinbindinger med e- eller primære amin-grupper i monomere, der fungerer som enheder af polymeren.

30 2. Et reaktivt diacyl- eller dihydrazin-derivat af en alifatisk dicarboxylsyre med 4-20 carbonatomer eller et alifatisk dihydrazin med 4-20 carbonatomer, som vil danne amid- eller hydrazongrupper med 1,2-diolgrupper i monomere, der fungerer som enheder af polymeren, når 1,2-dio-35 len oxideres til et dialdehyd, eller som vil danne amidgrupper med carboxyl syregrupper i monomere, der fungerer som enheder af polymeren.

14 DK 167162 B1 3. Et reaktivt alkenderivat af et N-alkyl-bis(maleimid) med 4-20 carbonatomer i alkylgruppen, som vil danne di-sulfidgrupper med mercaptangrupper, der er til stede i monomere, der fungerer som enheder af polymeren.

5 4. Et reaktivt alifatisk heterobifunktionelt reagens substitueret med en N-maleimidgruppe og enten en iminoester-eller en N-(carbonyloxy)imidgruppe, hvori den alifatiske kædelængde er 4-20 carbonatomer, som vil danne en sulfid- 10 gruppe med en mercaptangruppe i en monomer, der fungerer som enhed af polymeren, og vil danne en amidin- eller amidgruppe med en amingruppe i en nabomonomer, der fungerer som enhed af polymeren.

15 5. Et reaktivt alifatisk heterobifunktionelt reagens sub stitueret med en Schiff-base-beskyttet amingruppe og en acyl- eller iminoesterderivat-gruppe af en carboxylsyre, hvori den alifatiske kædelængde er 4-20 carbonatomer, som vil danne en amid- eller amidinbinding med en amingruppe 20 i ©n monomer, der fungerer som enhed af polymeren, og efter-fjernelse af den beskyttende Schiff-base-gruppe vil danne en amidbinding ved carbonyldiimidazol- eller -di-imid-kobling med en carboxylgruppe i en nabomonomer, der fungerer som enhed af polymeren.

25 6. Et trifunktionelt lysyl-lys in-reagens, som vil danne imin- eller amidbindinger med henholdsvis oxiderede 1,2-diolgrupper eller carboxylsyregrupper, som er til stede i monomeren, der fungerer som enheder af polymeren.

30

Opfindelsen angår ligeledes et detektionssæt til analyse af tilstedeværelsen af en analyt, isæt i et biologisk materiale. Sættet inkluderer udmålte mængder af en blanding af et detektions-visualiseringskompleks eller komponen- 35 terne deraf som anført ovenfor, der er specifikt for ana-lytten, og en standardiseret mængde af den samme visualiseringspolymer. Sættet kan være i form af en kolorime- 15 DK 167162 B1 trisk, fluorescerende, luminescerende eller radioaktiv indikator, hvori prøvningsmængderne og -standarderne er i vandig opløsning og i passende beholdere til kolorime-trisk, fluorescent, luminescent eller radioaktivt analy-5 se. Sættet kan også være i form af prøvepapir og standardpapir, såsom nitrocellulose, der vil muliggøre visualisering af analytten.

Tegningerne belyser resultaterne af detektionsprøvninger 10 udført i overensstemmelse med opfindelsen.

Fig. 1 viser detektion af biotinmærket DNA på nitrocellu-lose-prikafdupninger under anvendelse af et polyenzym/-avidin-kompleks.

15

Fig. 2 viser en sammenligningsundersøgelse under anvendelse af biotinfrie DNA-sonder.

Fig. 4 viser detektion af biotinmærket DNA ved Southern-20 afdupningsmetoden under anvendelse af et polyenzym/avidin-kompleks .

Fig. 5 viser komplementær-hybridiserings-detektion af humane a- og Ø-globin-gener ved Southern-afdupningsmetoden 25 under anvendelse af en kolotimetrisk visualisering og en visualiseringspolymer ifølge opfindelsen.

Fig. 7 viser sammenlignende detektionsresultater frembragt ved visualisering af et biotinyleret protein med et 30 enzym (A) og et polyenzym (B) ifølge opfindelsen.

Fig. 6A viser resultaterne af en PAP-detektionsteknik til detektion af protein.

35 Fig. 6B viser resultaterne af poly-PAP-teknikken til detektion af protein ifølge opfindelsen.

16 DK 167162 B1

Visualiseringspolymererne og -komplekserne ifølge den foreliggende opfindelse detekterer og forstærker kemisk tilstedeværelsen af ganske små mængder uorganiske eller organiske analytter, som kan findes i biologisk materia-5 le. Almindeligvis baseres detektionen på samvirken mellem polymeren, dens kompleks og analytten, som skal detekte-res. Polymeren bæres i en kompleksbærende kombination, som kan forbinde sig med specifikke analytter og udelukke andre. Kvantitativ bestemmelse af analytten foretages ved 10 måling af mængden af polymere, som er til stede i den forbindelse, som er dannet mellem analytten og bærerkombinationen. Signalforstærkning tilvejebringes af de flerdobbelte enheder af polymeren i hver forbindelse.

15 Polymerens monomerenheder er et vigtigt træk, som tilvej ebringer visualisering af forbindelsen mellem analytten og bærerkombinationen. Enhederne kan indeholde visualiseringsmærker eller kan reagere med et substrat, der kan udnyttes som middel til kvantitativ måling. Denne må-20 ling kan gennemføres ved produktion af et let identificerbart substratprodukt eller ved produktion af et spek-troskopisk signal såvel som andre lignende typer af ikke-destruktive kvantitative analysemetoder til måling. Fortrinsvis vil visualiseringen være baseret på frembringel-25 se af farve, fluorescens, luminescens, radioaktivitet, høj elektrontæthed såvel som andre former for spektrosko-piske målinger.

Når enhederne er enzymer, kan de frembringe jprodukter, 30 som kan måles ved en sådan spektroskopisk måling. F.eks. kan de katalysere reaktionen af substrater til dannelse af farvede, fluorescerende, luminescerende, elektrontætte eller radioaktive produkter.

35 Alternativt kan de mærkede enheder udnyttes direkte som redskaber til spektroskopisk måling. F.eks. kan de naturlige eller syntetiske polypeptider, polyoler, polyalkener 17 DK 167162 B1 eller carbonhydrater være mærket med kemiske grupper, som har farvende, fluorescerende, luminescerende, elektrontætte eller radioaktive egenskaber. Disse kan derpå måles spektroskopisk.

5

Enzymer og mærkede polypeptider, polyoler, polyalkener eller carbonhydrater med de ovennævnte egenskaber er velkendte som midler til spektroskopisk kvantificering. Når det anbringes i et passende spektrometer, vil enzymsub-10 stratet eller mærket forårsage en spektrografisk ændring, som vil indicere den mængde af analytten, som er til stede. Denne fremgangsmåde betegnes almindeligvis vil visualisering, og den spektrale ændring betegnes som signalet frembragt af visualiseringsgruppen (substratet eller mær-15 ket).

Den mængde af analytten, som skal detekteres, vil sædvanligvis være ganske lille, og hvis signalet fra kompleks-analyt-forbindelsen blev frembragt på ækvivalent basis, 20 ville det også være yderst svagt. Imidlertid forstærker bærerkombinationen og dens visualiseringspolymer signalet kemisk, således at ganske små mængder analyt vil frembringe et stærkt, let bestemmeligt signal. Forstærkning opnås ved hjælp af polymeren, fordi den omfatter flere 25 enheder af visualiseringsmonomeren. Det signal, det til vejebringes af hver enhed, opretholdes af polymeren. Følgelig er dens signal summen af signalerne fra dens enheder. Desuden kan bærerkombinationen indeholde flere antal af polymeren. Selv om det ikke er nødvendigt, foretrækkes 30 denne flerdobbelte kombination, og den giver yderligere forstærkning.

Visualiseringspolymeren ifølge opfindelsen omfatter flere enheder af monomer direkte bundet sammen eller indirekte 35 knyttet sammen ved hjælp af et koblingsmiddel bundet til kemiske grupper eller rygradsdele i enhederne. Hver enhed har også et eller flere centre, som giver visualiserings- 18 DK 167162 B1 signalet. Dette kan være en center for enzymatisk virkning eller et center, hvortil der er knyttet et eller flere visualiseringsmærker. Polymerens visualiseringssignal-aktivitet afhænger af frembringelsen af et signal af 5 hver monomerenhed. I overensstemmelse hermed bør visualiseringscentret eller -centrene hovedsageligt bevares i dets eller deres oprindelige form, således at centeraktiviteten ikke væsentligt forringes. Heraf følger, at kemisk modificering af monomerenhederne bør gennemføres på 10 en måde, som ikke væsentligt påvirker centret eller centrene .

Til dette formål bær den direkte binding eller koblingsmiddelsammenknytning forbinde kemiske grupper eller ryg-15 radsdele i enhederne, som er mindst et atom og fortrinsvis mindst 3-5 atomer væk fra visualiseringscentret eller -centrene. Ligeledes bør valget af kemiske grupper eller rygradsdele til direkte binding eller sammenknytning med koblingsmiddel begrænses til dem, som ikke findes i cen-20 tret, eller som ikke er nødvendige for centrets konforma-tion og tredimensionale konfiguration. Dette valg vil være mere vigtigt for enzymproteiner end for mærmede naturlige eller syntetiske polypeptider, polyoler, polyal-kener eller carbonhydrater? imidlertid bør skadelig ind-25 virkning på frembringelsen af mærkefluorescens, -luminescens, -farvning, -radioaktivitet eller -elektrontæt-hed også undgås.

Almindeligvis kan disse centerbevaringskrav opfyldes på 30 flere måder. Hvis typerne af biokemiske strukturer eller kemiske rester, som udgør monomerstrukturen, er kendte, så kan der vælges en, som ikke udgør en del af visualiseringscentret, som strukturen indeholdende de reaktive kemiske grupper eller rygradsdele til kobling. Sædvanligvis 35 vil der imidlertid blive anvendt en halvempirisk metode til valg af de passende reaktive kemiske grupper eller rygradsdele.

19 DK 167162 B1

Ifølge understruktur/rest-metoden vil den kemiske konstruktion af monomerenhederne blive undersøgt. De monomere rygradssubstituerede grupper og funktionelle strukturer, såsom sukkergrupper, lipider, oligomersidekæder og 5 lignende, der ikke er nødvendige for visualiseringscentervirkning, vil blive identificeret. Typisk vil dette blive bestemt ved fjernelsesmodifikation eller modifikation af sådanne understrukturer og undersøgelse af det resulterende produkts aktivitet. Kemiske grupper eller 10 rygradsdele, som hovedsageligt er til stede i disse understrukturer, kan derpå anvendes til direkte binding eller indirekte sammenknytning med koblingsmidlet. F.eks. kan de sukkergrupper i et glycoprotein, som ikke er nødvendige for enzymatisk aktivitet, oxideres til dialdehyd-15 grupper og omsættes med et hydrazinkoblingsmiddel til dannelse af visualiseringspolymeren.

Hvis den kemiske sekvens af monomeren, såsom aminosyrese-kvensen af et protein, kan bestemmes, kan denne også an-20 vendes til at vejlede direkte binding eller indirekte sammenknytning. Analyse af sekvensen for det aktive center såvel som den tredimensionale konfiguration vil vise, hvilke monomerstruktur-underenheder, der ikke er nødvendige for centrets funktion og/eller ikke findes i det.

25 Disse underenheders reaktive kemiske grupper eller rygradsdele kan anvendes til binding eller sammenknytning med koblingsmidlet. Hvis f.eks. monomeren er et protein, og det findes at indeholde en dipeptidsidekæde endende med cystein, kan cysteinets mercaptangruppe tværbindes 30 til cystein i et andet lignende protein ved omsætning med bis(N-butylenylmaleimid).

Ifølge den halvempiriske metode kan monomerens reaktive kemiske grupper og rygradsdele bestemmes ved passende 35 spektrografisk og kemisk analyse. Disse inkluderer tek nikker, såsom NMR, IR, kemisk derivatisering, elektrofo-rese, osmometri, aminosyreanalyse, elementanalyse, masse- 20 DK 167162 B1 spektrometri og lignende. De identificerede grupper og dele kan inkludere amingrupper, metcaptangrupper, carb-oxylgrupper, hydroxygrupper, sukkergrupper, carbonhydrat-grupper, estergrupper, lipidgrupper og amidbindinger, la-5 bile carbon-carbon-bindinger og carbon-hydrogen-bindinger og lignende. Andre målinger, såsom afhængigheden mellem derivatisering og centeraktivitet, afhængigheden mellem pH og centeraktivitet og den frembragte type centerreaktion i tilfælde af et enzym, vil hjælpe med til at be-10 stemme en prioritet for de funktionelle grupper baseret på sandsynligheden af deres tilstedeværelse i nærheden af det aktive center. En typisk prioritet ville være: 1. en e~ eller primær amingruppe, 2. en sukkergruppe, 3. en carboxylgruppe, 4. en mercaptangruppe, 5. en hydroxygrup-15 pe, 6. en lipidgruppe. Hvis derivatisering af amingrup-per, såsom den i lysinrester, producerer et derivatiseret produkt uden centeraktivitet, så vil den ovennævnte prioritet skifte, og amingruppen vil være sidst.

20 Under sædvanlige empiriske procedurer vil der blive fremstillet flere versioner af polymeren under anvendelse af et udvalg af flere af de reaktive kemiske grupper eller rygradsdele. Aktiviteterne af disse flere versioner prøves derpå, og der udvælges en, som har den højeste akti-25 vitet. Typisk vil udvalget af kemiske grupper eller rygradsdele omfatte tre eller fire typer, som har den mindste sandsynlighed for at påvirke aktiviteten af visualiseringscentret. Hver type af reaktiv kemisk gruppe eller rygradsdel kan i sidste ende prøves, hvis resultater med 30 de første få er utilfredsstillende. Empirisk undersøgelse af hver version af polymer vil muliggøre identificering af den med den højeste aktivitet.

De monomerenheder, som har visualiseringscentre, der er 35 mest følsomme for bindingsarrangementet mellem kemisk gruppe og rygradsdel, er enzymer, Det katalytiske center vil typisk have en konformation, der passer nært sammen 21 DK 167162 B1 med substratet, og kemisk modifikation, som ødelægger det katalytiske centers tredimensionale konfiguration, kan skade polymerens aktivitet. Ifølge de ovenstående procedurer, kan enzymcenteraktiviteten bevares. Endvidere kan 5 enzymets katalytiske center beskyttes under binding eller sammenknytning ved reversibelt at binde det til substrat.

Mærket naturligt eller syntetisk polypeptid, polyol, po-lyalken eller carbonhydrat vil have visualiseringscentre, 10 som er væsentligt mindre følsomme for bindingsarrangementet mellem kemisk gruppe og rygradsdel. Den fluorescerende gruppe, farvestoffet, den luminescerende gruppe, den radioaktive gruppe eller den elektrontætte gruppe, der virker som mærket, vil typisk ikke blive udsat for varia-15 tioner i aktivitet, når nabostillede kemiske grupper eller rygradsdele bindes direkte eller sammenknyttes indirekte med koblingsmiddel. Der må imidlertid sørges for, at den direkte binding eller koblingsmidlet ikke også reagerer eller på anden måde indvirker på mærket og for-20 mindsker dets visualiseringsaktivitet. Hvis endvidere mærket skal omdannes til en aktiv gruppe, efter at forbindelsen mellem visualiseringspolymeren og analytmoleky-let er frembragt, bør positionen af den kemiske gruppe eller rygradssammenknytningen ikke påvirke omdannelsen.

25

De kemiske grupper eller rygradsdele skal være mindst ét atom væk fra visualiseringscentret. Enzymproteinmonomere vil fortrinsvis blive bundet eller sammenknyttet omkring 3-5 atomer væk fra visualiseringscentret.

30

Visualiseringspolymerstrukturen består af flere enheder af monomer enten direkte bundet til hinanden eller tværbundet med koblingsmiddel. Polymerens strukturelle og funktionelle karakter vil være mage til monomerenheder-35 nes. Antallet af enheder pr. polymer vil afhænge af koblingsgraden, den resulterende polymers stabilitet, de kemiske gruppers eller rygradsdelenes reaktivitet i forhold 22 DK 167162 B1 til polymerkædelængden og positionen af grupperne eller delene langs monomer-rygraden.

Almindeligvis kan antallet af enheder, som inkorporeres i 5 polymeren, variere fra så få som 2-3 til så mange som 30-100 pr. polymer. Højere antal er også mulige, forudsat at polymerkæden enten ikke er af en størrelsesorden, som vil gøre polymeren yderst uopløselig i vandig opløsning eller ville være yderst modtagelig for mekanisk spaltning.

10

Polymeren kan være lineær eller forgrenet. Der kan være enkelt eller flerdobbelt kobling mellem to naboenheder. Kobling kan forekomme ved ethvert punkt langs enhedskæden, således at naboenheder kan ligge ende-mod-ende eller 15 kan overlappe helt eller delvis. Som resultat heraf kan polymerens tredimensionale struktur have alle disse træk.

Den kan være lineær, men vil mere typisk være en kombination af lineære og forgrenede enheder. Delvis overlapning vil typisk forekomme, og flerdobbelt kobling vil også fo-20 rekomme.

De kemiske gruppers eller rygradsdelenes tilgængelighed vil også påvirke polymerlængden. Hvis de er begravet i monomerstrukturen, vil sterisk inhibering have tendens 25 til at hindre kobling af et højt antal monomerenheder. Denne virkning kan der kompenseres for ved anvendelse af koblingsmidler med en kædelængde på over ca. 10 carbon-atomer. I et mere sædvanligt arrangement vil de reaktive kemiske grupper eller rygradsdelene være let tilgængelige 30 09 vil ligge enten i de proximale ender af monomerkæden eller i en tilgængelig sidekæde eller gruppe, som strækker sig bort fra det indre område af monomerens tredimensionale struktur. Denne type gruppe eller del vil være gunstig for kobling af høje antal af monomerenheder. Ty-35 pisk kan der anvendes direkte binding eller enhver kædelængde af koblingsmiddel. Imidlertid vil kobling af let tilgængelige grupper eller dele med midler, som vil holde DK 167162 Bl 23 polymerenhederne på afstand, somme tider være fordelagtig. Dette vil tillade let adgang for substrat eller reaktant og vil forhindre skadelig gensidig påvirkning mellem polymerens enheder. Typisk foretrækkes midler med en 5 carbonkædelængde på fra omkring 4 til omkring 20 carbon-atomer.

Koblingsmidlet, som knytter monomerenhederne sammen, afledes sædvanligvis fra et bifunktionelt eller multifunk-10 tionelt organisk tværbindingsreagens med den tidligere angivne formel I. I denne sammenhæng vil betegnelsen koblingsmiddel angive gruppen i dens koblede form med en kemisk gruppe eller rygradsdel. Betegnelsen tværbindingsreagens vil angive den kemiske form af midlet, før det 15 omsættes med en kemisk gruppe eller rygradsdel.

Valget af koblingsmiddel/tværbindingsreagens vil afhænge af valget af den reaktive kemiske gruppe eller rygradsdel, som skal kobles, og den kædelængde af midlet, som 20 vil forhindre gensidig påvirkning mellem enhederne i polymeren. Reaktionsskema I belyser den almene plan for omsætning mellem reagens og kemisk gruppe eller rygradsdel.

I hver af reaktionerne 1-6 i reaktionsskema I anvendes 25 det bi- eller multifunktionelle tværbindingsreagens med formlen I. Den almene formel for dette reagens er

A B

\ / R1

30 I

E

hvor A, B og E er reaktive grupper som defineret ovenfor, og R1 har den ovenfor angivne betydning. I de enkelte reaktioner er angivet en specifik reaktiv gruppe for A og 35 dens reaktion med en monomer kemisk gruppe eller rygrads- 24 DK 167162 B1 del. Grupperne B og E, som ikke er angivet, kan være de samme eller kan være valgt blandt de andre reaktive grupper, eller en af B og E kan være hydrogen. På denne måde belyser reaktionerne tværbindingsreaktioner med homo-5 (bi- eller multi-) funktionelle reagenser, hvori de reaktive grupper er de samme, og med hetero- (bi- eller multi-) funktionelle reagenser, hvori de reaktive grupper er forskellige.

10 Ri formlen I vil sædvanligvis være lineær og vil kun have lidt, om overhovedet nogen, forgrening. Fortrinsvis er R"*· en alkylenylgruppe med formlen - (CH0) . -, en cyclo-alkylenylgruppe med formlen -CH[(CH2)k]2CH-, eller en arylgruppe med formlen - (CH2)(CIi2 ^m”' hvori 3 er 15 et helt tal fra omkring 2 til omkring 30, k er et helt tal fra 0 til omkring 6, og summen af k'er vil være 4,5,6,7 eller 8, og 1 og m hver for sig er hele tal fra 0 til omkring 20. Særlig foretrukne R1-grupper vil inkludere alkylenyl, hvori j er 3-14, og aryl, hvori 1 og m er 20 0-5 og med para-substitution. Eksempler på foretrukne R1- grupper er propylenyl, butylenyl, hexylenyl, nonylenyl, undecylenyl, dodecylenyl, cyclohexylenyl, phenylenyl eller xylenyl.

25 Reaktionerne 1A, IB og 1C i reaktionsskema I viser koblingen af en fri amingruppe, sædvanligvis vil dette være en e- eller primær amingruppe i en α-amino-syrerest i proteinenheden. Eksempler på aminosyrer indeholdende e-aminogrupper inkluderer lysin og arginin. Eksempler på 30 aminosyrer med primære amingrupper inkluderer de tyve a-aminosyrer, der typisk findes i protein. Amingrupper på andre slags monomere, såsom aminosukkerarter eller amino-nucleotider, kan også kobles ved denne reaktion.

35 Reagenserne med formlen I1A, der anvendes til at gennemføre reaktion 1A, inkluderer de kendte carboxylsyrederi-vater, som vil reagere med aminer til dannelse af aminer.

25 DK 167162 B1 r

Inkluderet er acylhalogenider, blandede anhydrider, aktiverede estere, acylimidazoler afledt fra carbonyldiimida-zol, N-oxasuccinimider fremstillet ved dehydratisering af den tilsvarende carboxylsyre og N-hydroxysuccinimid med 5 et diimid-dehydratiseringsreagens, amiddannelse med dehy-dratiseringsreagenser, såsom diimider, phosphorpentoxid i organisk opløsningsmiddel og phosphoroxychlorid. Disse grupper er angivet som X i reaktion 1A.

10 Almindeligvis kan disse syrederivater fremstilles ved kondensation af den tilsvarende carboxylsyre og X-gruppe-reagenset. De kan omsættes med amingruppen ifølge reaktion 1A under anvendelse af vandigt eller polært organisk opløsningsmiddel under milde betingelser. Metoderne til 15 anvendelse af disse reagenser er velkendte? se f.eks.

"Reagents For Organic Synthesis", L. Fiezer, M. Fiezer, vol. 1-8, Wiley & Son; "Cross Linking Reagents" (1980 Ed)., Pierce Biochemical Reagent Catalog, Pierce Chemical Co., Rockford 111. og deri givne referencer eller "Advan-20 ced Organic Chemistry", J. March, McGraw Hiil (1968).

Reaktion IB viser kobling af et iminoestersalt-reagens med formlen I1B med en amingruppe til dannelse af en ami-dinkoblingsmiddel-sammenknytning. Denne fremgangsmåde er 25 også kendt inden for faget. Reagenset kan dannes ved sur alkoholyse af det tilsvarende nitril. Amidindannelsesre-aktionen kan gennemføres i vandigt eller polært organisk opløsningsmiddel under milde betingelser. Fremgangsmåderne og procedurerne er kendte, se f.eks. Lockhart et al., 30 Can. J. Biochem., 53, 861-867 (1975) og Pierce Biochemical Reagent Catalog og deri givne referencer (ovenfor).

Reaktion 1C viser kondensation af en amingruppe med et aldehydreagens med formlen I1C til dannelse af en bis-35 Schiff-base (imin). Eksempler inkluderer glutaraldehyd og andre vævsfikserende reagenser. Betingelserne inkluderer anvendelse af polært organisk opløsningsmiddel og milde 26 DK 167162 B1 temperaturer. Disse fremgangsmåder er kendte inden for faget.

Reaktionerne 2A, 2B og 2C i reaktionsskema I viser kon-5 densationskobling af en aldehydgruppe med amin- og aminder i vat-reagenser til dannelse af imin- og iminderivat-forbindelser. Disse reagenser og reaktioner inkluderer primære aminreagenser med formlen I2A, som reagerer til dannelse af en Schiff-base (imin), se reaktion 2A; sub-10 stitueret-hydrazin-reagenser med formlen I2B, som reagerer til dannelse af substituerede hydrazoner, se reaktion 2B; og acyl-hydrazid-reagenser med formlen I2C, som reagerer til dannelse af acylhydrazoner, se reaktion 2C. Den funktionelle aldehyddel vil på sin side blive skabt ved 15 oxidativ spaltning af enhver 1,2-diol- (glycol)-gruppe i monomerenheden, undtagen at oxidativ spaltning af glycol-grupper, som ville resulterer i spaltning af monomerenhedskæden, ikke kan anvendes. Sædvanligvis vil glycol-gruppen findes på en sidekæde knyttet til monomerrygra-20 den. Eksempler inkluderer carbonhydrat- og stivelsegrupper,- såvel som dihydroxyalkyl-, cycloalkyl- og acylalkyl-grupper.

Betingelserne for reaktion 2A, 2B og 2C inkluderer anven-25 delse af vandige eller polære organiske opløsningsmidler og milde til moderate temperaturer. Disse fremgangsmåder og procedurer er velkendte inden for faget, se f.eks. "Basic Principles of Organic Chemistry", Roberts and Ca-serio, W.A. Benjamin (1965) eller "Qualitative Organic 30 Analysis"; Shriner and Fuson, Wiley Interscience (1966).

Reaktionerne 3A og 3B i reaktions skema I viser koblingen af en mercaptangruppe med tværbindingsreagenserne i3A og I3B til dannelse af polymeren sammenknyttet af sulfid-35 grupper Reaktion 3A er en kondensation af mercaptangrup-pen med et α-halogenacetylreagens I3A, hvori Y er halogen, til dannelse af et carbonylmethylensulfid P3A; se 27 DK 167162 B1 f.eks. Hixon et al., Biochemistry, 14, 425 (1975). Reaktion 3B er en kobling af mercaptangruppen med et male-imidreagens I3B til dannelse af et succinyl-3-sulfid P3B.

5 Mercaptangrupperne vil findes i monomerenheden som del af en cystein-, glutathion-, cystin- eller lignende aminosy-reenhed. De kan også være til stede som et derivat af en sukkerart eller en lipidgruppe.

10 Betingelserne for reaktion 3A inkluderer anvendelsen af et vandigt eller polært organisk opløsningsmiddel, et syrebindende middel, såsom pyridin, og milde til moderate temperaturer. Betingelserne for reaktion 3B inkluderer anvendelsen af et vandigt eller polært organisk opløs-15 ningsmiddel, eventuelt en mildt sur katalysator og milde til moderate temperaturer. Disse fremgangsmåder og proce-. durer er kendte inden for faget, se Pierce Biochemical catalog og deri givne referencer (ovenfor).

20 Reaktionerne 4A og 4B viser kondensationskoblingen af en carboxylsyregruppe og et amin- eller acylhydrazid-rea-gens. Reagenset I4A kan kobles direkte med carboxylsyre-gruppen ved anvendelse af forbindelser, såsom diimid eller carbonyldiimidazol, se den ovenstående beskrivelse 25 for reaktion 1A. Det kan også kobles ved dannelse af et carboxylsyrederivat, såsom et blandet anhydrid, en aktiveret ester eller et acylhalogenid. Reagenset I4B kan kobles med carboxylsyregruppen ved anvendelse af et dehy-dratiseringsreagens, såsom et carbodiimid; se reaktion 30 1A. Carboxylsyreholdige substituenter i monomerenheder vil give carboxylsyregruppen direkte eller kan oxideres til en sådan. Disse inkluderer aminosyrerester, såsom as-paraginsyre eller glutaminsyre, såvel som oxiderede former af sukkersidekæder. Lipider, carbonhydrater og alke-35 niske carboxylsyrer er også inkluderet. Disse fremgangsmåder er kendte inden for faget, se f.eks. "Organic Syntheses", Wiley, New York, Coll. Vol. I-V.

28 DK 167162 B1

Reaktion 5 viser esterificering af en hydroxyfunktionsdel med et aktiveret-carboxylsyre-reagens 15. Disse vil inkludere de samme reagenser som angivet for formel I1A.

Hvis der er frie reaktive amingrupper i monomerenheden, 5 kan de først beskyttes med en fjernelig beskyttende gruppe, såsom en Schiff-base, dvs. kondensation af amingrup-perne med et aromatisk aldehyd, såsom p-methoxybenzalde-hyd eller benzaldehyd, der kan fjernes med fortyndet hy-drogenchlorid i acetone. Andre kendte aminbeskyttende 10 grupper kan også anvendes. Disse inkluderer dinitrofluor-benzen, t-butoxygrupper og organosilaner.

Efter beskyttelsen gennemføres esterificeringen under anvendelse af det aktiverede syrereagens. Monomerenhedsres-15 ter, som vil esterificeres på denne måde, inkluderer ami-nosyrerester i serin, threonin, hydroxylysin, tyrosin, thyroxin, hydroxyprolin og lignende. Andre rester inkluderer carbonhydrat-, stivelse-, lipid- og alkenrester med hydroxylsubstitutioner. Disse inkluderer hexoser, pento-20 ser, dextraner, amyloser, glycerolforbindelser, fedtsyrederivater, methylhydroxymethacrylat, hydroxymethylacrylat og lignende forbindelser.

Betingelserne for esterificeringen inkluderer anvendelsen 25 af vandigt eller polært organisk opløsningsmiddel og milde til moderate temperaturer. Disse fremgangsmåder og procedurer er kendte inden for faget, se f.eks. de ovennævnte afhandlinger om organisk syntese.

30 Reaktion 6 viser indsætning af en nitren fra et azidrea-gens 16 i en carbon-hydrogen-binding. Denne reaktion er uspecifik og kan finde sted ved ethvert punkt i enheden.

Da nitrenen har kort levetid, vil let tilgængelige car-bon-hydrogen-bindinger blive angrebet først. Denne reak-35 tion er særlig nyttig til kobling af de mærkede naturlige eller syntetiske polypeptider, polyoler, polyalkener og carbonhydrater såvel som til enzymer med C-H-bindinger, DK 167162 B1 1 29 der er let tilgængelige og ikke involveret i centeraktivitet.

Betingelserne for reaktion 6 inkluderer anvendelsen af 5 polært organisk opløsningsmiddel og bestråling med lys ved 300-400 nm. Fremgangsmåderne og procedurerne for denne reaktion er kendte, se f.eks. Bisson, J. Biol.

Chem., 253, 1874-1880 (1978) eller Pierce Biochemical Catalog og deri givne referencer (ovenfor).

10

Reaktion 7 er den direkte bindingspolymerisation af monomerenhederne. Den kan gennemføres ved enzymatisk oxidativ tværbinding, fotolytisk fri-radikal-dannelse og tværbinding eller fri-radikal-initiering med sådanne reagenser 15 som persulfit, hydrogenperoxid og trioxygen (ozon).

I tabel 1 er anført de typer af grupper, der kan fungere som X, Y og X' i formlerne I1A, I3A og 15 i reaktionsskema I. Disse er blevet beskrevet i sammenhæng med forkla-20 ringen af hver reaktion.

25 30 35 DK 167162 B1 30

Reaktionsskema I

Bindings- eller sammenknytninqsreaktion: IA. RNH2 + X0C-R1(BE) -Ξ> RNHCO-R1(BE)

5 I1A PIA

IB. RNH2 + H2N=C(0Me)-R1(BE) -^>RNHC(=NH)-R1(BE) 10

U PIB

IC. RNH2 + OHC-R1(BE) -RNsCH-R1(BE)

15 I1C

P1C

2A. RCHO = H2N-R1 (BE) -^ RCHrN-R1 (BE)

20 I2B P2A

2B. RCHO + H2N-NH-R1(BE) -^ RCH-NNH-R1(BE) 25

I2B P2B

2C. RCHO + H?NNHCO-R1(BE) -RCH=NNHCO-R1 (BE) 30

I2C P2C

35 31 DK 167162 B1 3A. RSH + YCH2C0-R1(BE) -* RS-CH2C0-R1(BE) I3A Jj* P3A o 5 3B. RSH + l xN-R1(BE) . i * I N-R1 (BE) å 138 P3B °-

Hk. RC02H + H2N-R1(BE) -> RCONH-R1(BE) 10

I4A P4A

UB. RC02H + H2NNHC0-R1(BE) -* RCONHNHCOR1(BE) 15

I4B P4B

5. ROH + X’OC-R1(BE) -» ROOC-R1(BE) 20 15 p5 25 6. RC-H + N3-R1(BE) -» R-C-R1 (BE) 16 P6 30 35 DK 167162 B1 32

7. 2R + direkte proces ...................... R-R

Noter til reaktionsskema I

5 R er en monomerenhed. Det bi- eller multifunktionelle tværbindingsreagens med formlen I er angivet i hver af reaktionerne. En af disse reaktive grupper (A) i formlen I er specificeret for hver reaktion. De andre reaktive grupper (B, E) i formlen I kan være valgt blandt enhver 10 af betydningerne angivet for A i reaktionerne 1-6, eller en af B og E kan være hydrogen. Homo- og hetero-bifunk- tionelle og -multifunktionelle reagenser er inkluderet.

R^- i formlen I og formlen P i hver af reaktionerne er en alifatisk gruppe med mindst to carbonatomer eller en aro- 15 matisk gruppe. Fortrinsvis er R en alkylenylgruppe, -(CH2)j-, eller en arylgruppe, "(CH2^i_C6H4“^CH2^m"' hvori j er et helt tal fra omkring 2 til omkring 30, og 1 og m hver for sig er helt tal fra 0 til omkring 20.

20 TABEL 1

1. X kan være: halogenid, især Cl, Br, I

25 2,4-dinitrophenoxy (en aktiveret ester) p-toluensulfonyloxy pivaloyloxy t-butoxycarbonyloxy acetoxy.

30 2. Y kan være:

Cl, Br, I.

35 33 DK 167162 B1 3. X' kan være:

halogenid, især Cl, Br, I

2,4-dinitrophenoxy (en aktiveret ester) 5 pivaloyloxy t-butoxycarbonyloxy acetoxy.

Monomerenhederne kan være ethvert enzym, som vil reagere 10 med et passende substrat til dannelse af et farvet, fluorescerende, luminescerende, elektrontæt eller radioaktivt produkt. Ligeledes kan enzymet reagere med et farvet, fluorescerende eller luminescerende substrat og udslukke det. Frembringelsen eller udelukkelsen af farve, fluores-15 cens eller luminescens kan være resultatet af direkte enzymkatalyse, eller enzymet kan producere et mellemprodukt, som indgår i en kæde af reaktioner, der frembringer eller udslukker farve, fluorescens eller luminescens.

20 Hvis der skal anvendes et elektrontæt eller radioaktivt substrat, vil enzymet have den virkning at immobilisere det. Dette kan gennemføres ved at gøre substratet uopløseligt, kemisk reaktivt over for enzymet eller på anden måde frembringe en immobiliserende fysisk egenskab. Med 25 denne type visualiseringspolymer vil mængden af radioaktivitet, som immobiliseres ved den enzymatiske reaktion, eller en elektronmikroskopisk bestemmelse af den tilstedeværende mængde elektrontæt materiale muliggøre analyse af den ganske lille mængde målmolekyle. Eksempler på så-30 danne enzymer inkluderer peroxidase, alkalisk eller sur phosphatase, galactosidase, glucoseoxidase, NADPase, luciferase, carboxypeptidase og lignende.

Monomerenhederne kan også være naturlige eller syntetiske 35 polypeptider, polyoler, polyalkener eller carbonhydrater, som er mærkede. Disse kan være baseret på en polyamidrygrad, en polyetherrygrad, en polyvinylrygrad eller en po- 34 DK 167162 B1 ly(sukkerstof)-rygrad. Til polyamidet kan den aminosyre eller den diaminforbindelse og dicarboxylsyreforbindelse, der kan anvendes til at frembringe rygraden, være ikke-funktionel, dvs. sammensat af en ethylenenhedskæde enden-5 de i de passende funktionelle grupper, eller den kan være substitueret med grupper, som vil tilvejebringe sidekæde-funktionalitet. Eksempler herpå inkluderer glycin, ala-nin, serin, lysin, asparaginsyre og lignende som aminosyrer. Eksempler på disyrer og diaminer inkluderer arylen-10 eller alkylendicarboxylsyrer med mindst 6 carbonatomer i arylengruppen eller 1-20 carbonatomer i alkylengruppen, og arylen- eller alkylendiaminer med mindst 6 carbonatomer i arylengruppen eller 1-20 carbonatomer i alkylengruppen. Eksempler er poly(3-aminopropionsyre), polygly-15 cin, poly(glycyl-lysin), poly(N-(aminohexyl)adipinsyre-amid), poly(N-(aminobutyl)terephthalamid) og lignende.

Til polyetherne kan anvendes epoxider og/eller oxacyclis-ke forbindelser med eller uden hydroxysubstitution som 20 rygradsbyggeblokke. Sur kondensation vil koble oxidforbindelserne. Ligeledes kan polyolerne have en poly(vinyl) -rygrad, med hydroxysubstitution. Disse kan være dannet ved vinyl/fri-radikal-polymerisation af alkylalkohol, butendiol og lignende.

25

Til polyvinylforbindelserne kan anvendes vinylforbindelser med eller uden substitution med kemiske grupper som rygradsbyggeblokke. Vinyl/f ri-radikalpolymerisation af sådanne forbindelser som acrylamid, acrylsyre, maleinsy-30 re, alkylsulfid, acrylonitril, methylacrylat, hydroxy-ethylacrylat, alkenylamin, acrolein osv. vil producere polyalkenmonomererne.

Til poly(sukkerstof)-forbindelserne kan anvendes glycosi-35 disk binding via hemiketal-kondensation af simple sukkerbyggeblokke som den carbonhydratrygradsdannende proces. Carbonhydrater, såsom methoxycellulose, poly(glucose), 35 DK 167162 B1 stivelse, dextran, polymaltose, amylose osv. er eksempler herpå.

De kemiske mærker inkluderer de kendte farvede, fluore-5 scerende, luminescerende, radioaktive og elektrontætte sonder, som vil bindes kemisk til substituenter, der er til stede i naturlige eller syntetiske polypeptider, polyoler, polyalkener og carbonhydrater. Disse inkluderer sonder med carboxylsyrederivatsubstituenter, sulfonsyre-10 substituenter, iminoestersubstituenter, maleimidsubstitu- enter, aldehydsubstituenter, azidsubstituenter og amin-substituenter, som ville reagere med den passende funktionelle gruppe i monomeren som skitseret i reaktionsskema I og tabel 1. Sonderne vil være monofunktionelle 15 snarere end difunktionelle, således at de kun kan reagere en gang med en monomer kemisk gruppe eller rygradsdel. Eksempler på farvemærker inkluderer azidoindigofarvestof, og congorødt, med sulfonylchloridsubstitution. Eksempler på fluorescerende mærker inkluderer fluorescein med en 20 azodi- eller sulfonylchlorid-reaktiv substituent, 3- azido-(2,7)-naphthalendisulfonat og rhodamin. Eksempler på radioaktive mærker inkluderer træreagenset (methyl-p-hydroxybenzimidat)-HCl, som kan være ioderet, og p-iod-benzensulfonylchlorid. Eksempler på elektrontætte mærker 25 inkluderer kolloidalt guld, kolloidalt sølv, ferritin, metalbindende proteiner og reaktive blysalte.

Isolering og rensning af visualiseringspolymeren ifølge opfindelsen kan gennemføres ved kendt teknik for polymer-30 isolering. Denne inkluderer dialyse, lyofilisering, chro-matografi, elektroforese, centrifugering, udfældning ved elektrolytindstilling eller opløsningsmiddellipophilici-tet og lignende.

35 Bærerkombinationen af visualiseringspolymer og detek- tionsmiddel kan være direkte eller indirekte. Den direkte bærerkombination vil have detektionsmidlet kovalent bun- 36 DK 167162 B1 det til visualiseringspolymeren ved hjælp af et bifunktionelt eller multifunktionelt tværbindingsreagens. Almindeligvis vil bindingen følge reaktionsskema I, og den metode, der er anført til sammenknytning af polymerens 5 monomerenheder. Disse metoder er almindeligt kendte; se f.eks. K. Peters et al., Ann Rev. Biochem., 46, 523-551 (1977); F. Wold, "Methods In Enzymology XXV", side 623.651 (1972) eller M. Das et al., Ann Rev. Biophys. Bioeng., 8, 165-193 (1979; Som med visualiseringspolyme-10 ren bør kovalent sammenknytning med kemiske grupper eller rygradsdele i detektionsmidlet finde sted i et område af midlet, som ikke vil skade dets evne til at detektere må let. Dette kan bestemmes ved enhver af de ovenfor angivne metoder, især den empiriske metode.

15

Den indirekte bærerkombination kan være af to typer. I den første kan detektionsmidlet være multivalent og have affinitet til visualiseringspolymeren såvel som analyt-ten. F.eks. kan det gennemføres ved anvendelse af et mul-20 tivalent antistof, som tværbinder med visualiseringspolymerens monomerenheder og ved anvendelse af den passende mængde antistof og polymer, således at mindst ét af antistoffets affinitetscentre forbliver åbent. Visualiseringspolymeren kan også bindes til en ligand, som danner 25 kompleks med et multivalent detektionsmiddel. Dette vil frembringe den samme slags bærerkombination. 1 den anden type indirekte bærerkombination vil der være en mellemliggende ligandbindingsforbindelse indskudt mel-30 lem detektionsmidlet og visualiseringspolymeren. Den vil vise en høj affinitet for specifikke ligander og vil inkludere et antistof, et lectin, avidin, streptavidin, et DNA-repressorprotein, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbindende protein eller en komple-35 mentær polynucleotidsekvens. Midlet og polymeren vil være tilsvarende mærket med den passende ligand. Liganden kan være forbundet med detekteringsmidlet og polymeren via en 37 DK 167162 B1 linker mage til et bi- eller multifunktionelt tværbindingsreagens R1(ABE) i reaktionsskema I. Tilknytningen af linkeren til midlet og polymeren vil følge de fremgangsmåder, der er angivet for reagenskoblingen ifølge reak-5 tionsskema I. Ligeledes kan liganden være indført i stedet for en reaktiv gruppe i det bi- eller multifunktio-nelle tværbindingsreagens R1(ABE) i reaktionsskema I.

Alternativt kan liganden være kovalent bundet direkte til 10 detektionsmidlet og polymeren. Dvs. liganden kan være bundet til en kemisk gruppe i polymeren og detektionsmidlet, som kan inkludere en amingruppe, mercaptangruppe, carboxylsyregruppe, hydroxygruppe, aldehydgruppe eller en C-H gruppe. Procedurerne og reagenserne, der er angivet 15 ifølge reaktionsskema I, vil blive anvendt til dette formål, og den passende reaktion vil blive valgt afhængigt af arten af reaktiv gruppe, som er til stede på liganden.

Metoderne til fremstilling af bærerkombinationerne og 20 komplekserne ifølge opfindelsen følger de velkendte procedurer, som er angivet i den ovennævnte baggrund. Eksempler inkluderer anvendelse af ligander, såsom biotin, iminobiotin, polynucleotidsekvenser, enzymsubstrater, sukkerstoffer, haptener, såsom 2,4-dinitrophenol, 25 2,4-dinitrophenylalkylcarboxylsyre med 1-20 carbonatomer i alkylgruppen og carboxylsyrederivater deraf. Andre eksempler på haptener inkluderer 2,4-dinitrophenylalkyl-amin med 1-20 carbonatomer i alkylgruppen, phenylarsenat, inistol og trinitrobenzen.

30

Et foretrukket eksempel på denne type bærerkombination og kompleks er baseret på anvendelse af en komplementær streng af polynucleotid som detektionsmiddel for en specifik nativ polynucleotidsekvens. Avidin eller streptavi-35 din anvendes som den ligand-bindende forbindelse, og et funktionaliseret biotin- eller iminobiotin-derivat anvendes som ligand. Binding af biotinet eller iminobiotinet 38 DK 167162 B1 til visualiseringspolymeren og polynucleotiddetektions-midlet kan gennemføres direkte eller ved anvendelse af en linkergruppe. Disse metoder er kendte inden for faget, se Langer et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 78, 6633-7 5 (1981), og følger de metoder, der er angivet for reak tionsskema I, undtagen at den ene ende af det bifunktionelle tværbindingsreagens vil være omsat med biotin eller iminobiotin. I overensstemmelse hermed inkluderer komplekset avidin- eller streptavidin- (biotin- eller imino-10 biotin-ligand)-visualiseringspolymer. Bærerkombinationen inkluderer desuden det biotin- eller iminobiotin-mærkede polynucleotiddetektionsmiddel.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan under udnyttelse af 15 dette eksempel praktiseres som følger. En isoleret dobbeltstreng af nativt polynucleotid, som skal detekteres, såsom viral DNA; brydes eller hakkes med en DNAase ved tilfældige punkter langs hver streng. Mærkede nucleotid-monomere translateres derpå ind i hakkene under anvendel-20 se af et polymeraseenzym og den anden forbundne streng som-skabelon. Alternativt kan de komplementære strenge mærkes direkte med biotinmærke. Det mærkede komplementære par af polynucleotidstrenge denatureres derpå og blandes med en denatureret blanding af ukendte native polynucleo-25 tider, som antages at indeholde det polynucleotid, som skal detekteres. Hvis det er til stede, vil der ske hy-bridisering, og den mærkede dobbeltstreng kan visualiseres med polymerkomplekset.

30 Et andet foretrukket eksempel på et kompleks er afledt fra de metoder, der er angivet i den ovennævnte baggrund for PAP- eller ABC-kompleksmetoder eller ifølge Langer et al., ovenfor. I dette eksempel anvendes avidin eller streptavidin som den mellemliggende ligand, og et anti-35 stof, et lectin eller et sekvensspecifikt polynucleotid-bindende protein anvendes som detekteringsmidlet, og en biotin- eller iminobiotinforbindelse anvendes som ligan- den, der danner kompleks af visualiseringspolymeren og detektionsmidlet med avidin eller streptavidin.

39 DK 167162 B1 I hvert af disse to foretrukne eksempler kan biotin- el-5 ler iminobiotin-forbindelsen kobles direkte med amin- eller hydroxygrupper i polymeren og midlet ved anvendelse af henholdsvis aminbindingsdannende og esterbindingsdan-nende koblingsreagenser. Disse metoder følger reaktionerne 1 og 5 i reaktionsskema I. Den kan også kobles via en 10 linkergruppe, som den der er beskrevet ovenfor. Linker- gruppen er mage til det bifunktionelle tværbindingsrea-1 gens R (ABC) i reaktionsskema I, undtagen af en af de to reaktive grupper vil være en amin- eller acylhydrazid-gruppe, som kobles med biotin eller iminobiotin.

15

Visualiseringspolymeren ifølge opfindelsen kan anvendes til at detektere ganske små mængder analyt. Denne kan findes i biologisk materiale, såsom væv og legemsvæske, såvel som i kunstige eller syntetiske systemer. Eksempler 20 inkluderer blod, lymfe, urin, fæces, organvæv, såsom lunge, -lever, hud, nyre og lignende, mikroorganismer, plantevæv, dyrkede celler, hybridceller, celler med rekombi-nant DNA; syntetiske blandinger af polypeptider, immobi-liserede enzymsystemer, syntetiseret DNA og andet biolo-25 gisk materiale.

Analytten kan være af enhver uorganisk eller organisk art, som kan frembringe affinitet med et detektionsmid-del. Foretrukne analytter vil findes i de ovennævnte bio-30 logiske materialer og systemer. Eksempler inkluderer proteiner, lipider, carbonhydrater, phospholipider, fedt stoffer, nucleotider, nucleosider, nucleosidbaser, poly-nucleotider, polypeptider, cancerogene midler, lægemidler, antibiotica, farmaceutiske midler, kontrollerede 35 stoffer, polymere, siliconer, organometalliske forbindel ser, tungmetaller, metal-protein-komplekser, toxiske uorganiske salte og andre midler eller forbindelser, som 40 DK 167162 B1 produceres af eller har en virkning på en biologisk organisme eller et materiale afledt derfra.

Almindeligvis er procedurerne til kombination og inkuba-5 tion af detektionsmidlerne og analytterne velkendte. De følger metoder, der anvendes til affinitets- og immuno-diagnostiske prøvninger; se f.eks. L.A. Sternberger, "Im-munohistochemistry", ovenfor. F.eks. vil kombination af udmålte mængder af detektionsmiddel og analyt i pufret 10 vandig opløsning efterfulgt af inkubation ved temperaturer fra stuetemperatur til omkring 37 °C i tidsrum på f.eks. 5 minutter til 18 timer frembringe konjugation. Tilsætning af visualiseringspolymeren eller dens kompleks under lignende betingelser vil derpå tilvejebringe visua-15 lisering. Endelig kan lignende teknikker følges, hvis midlet er bundet til visualiseringspolymeren.

Anvendelse af visualiseringspolymeren til de ovenfor beskrevne detektionsformål er fordelagtig, da den muliggør 20 detektion af yderst små mængder analyt. Den kan anvendes i medicinsk diagnostisk laboratorium som en analyseteknik til identifikation af biologiske produkter i legemsvæsker og væv, der tyder på en sygdomstilstand eller fejltilstand. Disse vil f.eks. inkludere unormale mængder af 25 væksthormon, tilstedeværelsen af humant gonadotropin, der tyder på cancer, detektion af viral invasion, kvantificering af hormon- og reguleringsenzymniveauer. Ligeledes kan den anvendes til at gennemføre normale kemiske væske-og vævsanalyser og kan anvendes i det biokemiske forsøgs-30 laboratorium som redskab til identifikation af biokemiske stoffer.

t

Visualiseringspolymeren kan anvendes i arbejde med syntetisk protein eller polynucleotid til at identificere syn-35 tetiserede halvsyntetiske eller native proteiner og syntetiserede rekombinante eller native polynucleotider. Anvendelser vil findes under forløbet af præparativt eller 41 DK 167162 B1 massearbejde til fremstilling af nyttige proteiner, såsom insulin, interferon, ACTH, gonadotropin, oxytocin, hypofysehormon, LH, FSH og lignende ved sådanne teknikker som rekombinant DNA eller hybridomer.

5 Bærerkombinationen af detektionsmiddel- og visualiseringspolymer-kompleks vil være formen til anvendelse ved udøvelse af de ovennævnte analyser. Da polymeren vil tilvejebringe flerdobbelte signaler fra bærerkombinations-10 forbindelsen med analytten, vil resultatet være kemisk forstærkning. I den foretrukne form af bærerkombinationen, hvor der anvendes et kompleks af polymer og ligandbindingsforbindelse, vil polymerens signalforstærkning yderligere forøges ved multivalent ligandbinding af fler-15 dobbelte antal polymere til hvert molekyle detektionsmiddel. I overensstemmelse hermed kan der i de foretrukne udførelsesformer under anvendelse af et antistof- eller komplementært-polynucleotidsekvens-detektionsmiddel, biotin- eller iminobiotin-mærker på midlet og polymeren, og 20 avidin eller streptavidin opnås detektion af femtomol--15 (10 - ) mængder. Dette vil også delvis afhænge af anven delsen af et følsomt monomerenhedssystem og de passende carbonkæde-linker-længder for både biotinmærkerne og polymerens koblingsmiddel. Et eksempel er anvendelsen af 25 enzymerne alkalisk phosphatase eller peberrod-peroxidase koblet som visualiseringspolymer ved e-aminogruppe-bin-ding med et aktivt diacylderivat af suberinsyre og anvendelsen af biotinmærker med carbonkæde-linkere med en længde på 6-14 carbonatomer.

30

Polymeren, komplekset og bærerkombinationen ifølge opfindelsen kan sammensættes som en integral del af et fast eller flydende detektionssystem og sæt. Kolorimetriske, fluorescerende, luminescerende og radioaktive systemer 35 kan fremstilles på denne måde. Sådanne systemer og sæt vil inkludere detektionskomponenterne, dvs. polymeren, dens kompleks med en ligand, en ligandbindingsforbindelse 42 DK 167162 B1 og detektionsmidlet såvel som de passende kemikalier, reagenser og opløsninger i udmålte mængder og standardiserede koncentrationer. Hvis f.eks. enzymatisk virkning med et substrat til dannelse af et farvet produkt skal 5 være visualiseringsproceduren under anvendelse af polymeren, vil systemet og sættet indeholde de nødvendige kemikalier, substrat og reagenser til gennemførelse af denne analyse. Disse materialer vil være til stede som udmålte mængder, således at den lysabsorption, som frembringes af 10 det farvede produkt, kan anvendes i forbindelse med en matematisk standardformel på grundlag af Beer's lov til bestemmelse af den detekterede koncentration af analytten. Sædvanligvis vil der blive anvendt en standardreaktion af polymer med substrat som kontrol og reference, 15 selv om standardkurver over absorption i forhold til koncentration også kan anvendes. Fluorimetriske, lumimetris-ke og radiometriske analyser kan gennemføres på lignende måde. Intensiteten af fluorescens, luminescens eller radioaktivitet produceret af polymeren i bærerkombinationen 20 forbundet med analytten vil blive målt af den passende elektroniske maskine. Nødvendige reagenser og kemikalier vil også være til stede. Udmålte mængder af komponenterne vil blive anvendt, således at intensitetsværdien kan kor-releres med mængden af analytten under anvendelse af en 25 matematisk standardformel på grundlag af Beer's lov.

I disse systemer vil der blive anvendt en koncentration af detektionsmiddel-visualiseringspolymer-komplekset i prøveopløsningen, som er tilstrækkelig til at forbinde 30 sig med al den analyt, som skal detekteres. Fortrinsvis vil der blive anvendt en overskudsmængde. Analytten kan godt adskilles fra andet materiale ved sedimentering, centrifugering eller anden adskillelsesteknik, såsom høj-tryksvæskechromatograf i, gelpermeationschromatografi, 35 elektroforese, udfældning, tyndtlagschromatografi, papir-chromatografi eller lignende. Imidlertid er dette ikke nødvendigt til opfindelsens formål. Den signalproduceren 43 DK 167162 B1 de reaktion vil blive startet ved dannelse af analyt-de-tektionsmiddel-konjugatet efterfulgt af dannelse af visualiser ingspolymer-detektionsmiddel-kombinationen og måling af visualiseringssignalet fra denne kombination.

5 Sammenligning af siganalintensiteten med en stardardkuve vil give mængden af analyt. Anden teknik, såsom konjugat-kompleks-udskiftning, der er kendt inden for immunoanaly-se, kan også anvendes.

10 Med alle de førnævnte flydende og faste analysemetoder kan der også foretages kvalitativ detektion. Da formålet i dette tilfælde vil være bestemmelse af tilstedeværelsen af den analyt, som skal detekteres, snarere end mængden af den, behøver der ikke at anvendes standardisering. De 15 kvalitative tekniker vil almindeligvis følge metoderne for de ovennævnte kvantitative teknikker.

Opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler, hvori de anvendte forkortelser og akronymer er defineret 20 som følger.

Bio-4-dUTP, Bio-ll-dUTP og Bio-16-dUTP er analoge til TTP, som indeholder et biotinmolekyle knyttet til C-5-po-sitionen i pyrimidinringen via linkerarme, som er hen-25 holdsvis 4, 11 og 16 atomer lange.

Bio-4-DNA, Bio-ll-DNA og Bio-16-DNA er DNA-sonder fremstillet med henholdsvis Bio-4-, Bio-Il og Bio-16-dUTP-analoge.

30 DNA er poly(desoxyribonucleinsyre),

IgG er immunoglobulin G fraktion.

35 DSS er disuccinimidylsuberat.

44 DK 167162 B1 BACSE er biotinyl-e-aminocapronsyre-N-hydroxysuccinimid-ester.

NMZT-puffer er defineret på side 50.

5 poly-ABAP-kompleks er et kompleks af avidin og biotinyle-ret alkalisk-phosphatase-polymer.

DAB er 3,3'-diaminobenzidin.

10 EAC er ethylaminocarbazol.

De følgende eksempler viser syntesen af visualiseringspolymere af intestinal alkalisk phosphatase og konstruktio-15 nen af avidin- (eller streptavidin-) enzympolymer-kom-plekser. Disse polymere giver visualisering, som er 20-50 gange mere følsom end hidtil kendte immunologiske eller affinitetsreagenser. Der er også beskrevet hurtige og følsomme procedurer til visualisering af biotin-mærkede 20 DNA-sonder efter hybridisering til målsekvenser immobili-seret på nitrocellulosefiltre og metoder til detektering af proteinantigener i vævssnit efter påføring på præparatglas .

25 De valgte eksempler og procedurer belyser anvendelsen af opfindelsen til detektion af en genetisk sekvens forbundet med human placental DNA og et peptidhormon forbundet med malignum. Disse er a- og Ø-globingenerne i human placental DNA og humant choriongonadotropin. Analyse af hu-30 mane gener kan anvendes til prænatal diagnose af genetiske forstyrrelser, og analyse af hCGT kan anvendes som en oncoføtal markør for cancer.

Affinitetsrenset kanin-antibiotin-IgG blev fremstillet 35 som beskrevet af Langer-Safer, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 79_, 4381 (1982). En ammoniumsulfat-fraktion af gede-antibiotin-IgG blev leveret af Enzo Biochem. Inc., NY, 45 DK 167162 B1 U.S.A. Biotinyleret kanin-antigede-IgG, biotinyleret gede-antikanin-IgG og avidin-DH/biotinyleret peberrodper-oxidase-kompleks (Vectastain ABC kit) blev købt eller givet som gaver af Vector Laboratories, Inc. Burlingame, 5 CA, U.S.A. Streptavidin [Hoffman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 4666 (1980)] blev skaffet fra enten Bethesda

Research Laboratories, Inc., Gaithersberg, MD, U.S.A. eller Enzo Biochem. Inc. Intestinal alkalisk phosphatase fra kalv (Cat. No. 567-752) og pancreatisk DNAse type I 10 blev købt af Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind, U.S.A. Biotinyl-e-aminocapronsyre-N-hydroxysuccinimid-ester blev syntetiseret ifølge Costello et al., Clin. Chem., 25, 1572 (1979). Dissucinimidylsuberat var et produkt fra Pierce Chemical Co., Tockford, 111, U.S.A.

15 Restriktionsendonucleaser og E. coli DNA-polymerase I

blev skaffet fra New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, U.S.A. Agarose (type II, Okseserumalbumin (BSA, fraktion V), 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidinsalt, ca-daverin som fri base, 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydro-20 chlorid, ficoll (type 400), ethylaminocarbazol, silde- sperma-DNA (type VII), nitroblåt-tetrazolium (grade III) og polyvinylpyrrolidon (PVP-40) var fra Sigma Chemical Co., Sti. Louis, MO, U.S.A. Plasmider indeholdende hu-mant-globin-gen-sekvenser blev leveret af Dr. Sherman 25 Weissman, Yale University. JW101 er en 0,4 kbp cDNA-a-globin-klon, og pHb C6 er et 5,2 kbp genomisk fragment indeholdende Ø-globin-genet i pBR322, Fukumaki, Cell, 28, 585 (1982). Plasmid pMM984 indeholder det komplette 5,1 kb genom af parvoviruset, lille musevirus (MVM), klonet 30 ind i pBR322. Dette plasmid indeholder et enkelt Xhol-center i MVM-sekvens-indsætningen. Human placental DNA var en gave fra Scott Van Arsdell, Yale University.

35 DK 167162 Bl 46

Polymerisation og biotinylering af intestinal alkalisk phosphatase

Intestinal alkalisk phosphatase fra kalv blev polymerise-5 ret ved tværbinding med disuccinimidylsuberat (DSS). Enzymet, som kommercielt leveres som en 10 mg/ml opløsning, blev fortyndet til 1 mg/ml i iskold NMZT-puffer (3 M NaCl, 1 mM MgC^, 0,1 mM ZnC^, 30 mM triethanolamin, pH

7,6) i en silaneret glasreaktionsbeholder eller et sila-10 neret Eppendorf-reagensglas. Alle efterfølgende reaktioner blev udført ved 4 °C. Der tilsattes en 5 mg/ml opløsning af DSS i dimethylformamid (10 ul/ml enzymopløsning) i to lige store aliquoter (30-60 sekunders mellemrum) under forsigtig omrøring. Denne opløsning, indeholdende et 15 19 ganges molært overskud af DSS i forhold til enzym, blev omrørt i 20 minutter, hvorunder der viste sig et tåget bundfald. Til reaktionsblandingen satets 10 μΐ aliquoter af fri cadaverinbase (0,1 mg/ml i MNZT-puffer) fire gange med 10 minutters intervaller. DSS/cadaverin-20 forholdet blev derpå gjort ækvimolært ved tilsætning af endnu 30 ul cadaverinopløsning for hver ml reaktionsblanding. Efter omrøring i yderligere 10 minutter tilsattes 2 umol ufortyndet cadaverin-lageropløsning, og blandingen blev omrørt i yderligere 30 minutter. Den resulterende 25 klare opløsning blev derpå dialyseret i udstrakt grad over for NMZT-puffer. (Polymerisations- og cadaverin-be-handlingerne blev ofte gentaget endnu en gang, men disse yderligere trin viste sig ikke at forøge polymerstørrelsen væsentligt, da både IX og 2X polymeriserede enzymkom-30 plekser detektorer målsekvenser med omkring lige stor følsomhed).

Monomere eller polymere former af alkalisk phosphatase blev omsat med et 60 gange molært overskud af biotinyl-e-35 aminocapronsyre-N-hydroxysuccinimidester (BACSE) ved tilsætning af 10 ul af en 20 mg/ml opløsning af BACSE (i dimethylf ormamid) for hvert mg enzym, som var til stede i 47 DK 167162 B1 dialyseposen. Efter omrøring af posen på en rotationsryster ved 4 °C i 2 timer blev reaktionsblandingen igen dialyseret i udstrakt grad over for NMZT-puffer. Der tilsattes natriumazid til en slutkoncentration på 0,02 vægt/-5 vol-%, og de biotinylerede enzymer blev opbevaret ved 4 °C indtil brug.

Fremstilling af avidin/biotinyleret alkalisk phosphatase-polymer-komplekser (poly-ABAP-komplekser) 10

Den biotinylerede enzympolymer blev blandet med et lille overskud af avidin til dannelse af komplekser, som er i stand til direkte samvirken med biotinylerede sonder hy-bridiseret på filtre. Proteinblandingen som gav et opti-15 malt signal/støj-forhold, blev bestemt empirisk ved analyse af forskellige proteinblandingers evne til at skelne mellem avidin-DH og biotinyleret gede-IgG anbragt som pletter på nitrocellulose. Proteinforholdene blev indstillet til at give en stærk reaktion med biotinyerlet 20 IgG, men kun lidt, om overhovedet noget, signal fra avi-din-DH-pletten. Komponentsammensætningen af poly-ABAP-komplekset blev yderligere optimeret til høj følsomhed og specificitet over for Bio-16-DNA-prøver anbragt som pletter på nitrocellulose, under anvendelse af en konstant 25 avidin-DH-koncentration og varierende mængder biotinyleret enzympolymer. De optimale proteinforhold blev fastslået for hver ny portion enzympolymer for at sikre maksimal specificitet og følsomhed. Enzymkomplekser blev fremstillet under anvendelse af avidin-DH eller strepta-30 vidin, og komplekser med hvert biotinbindende protein gav stort set samme resultater.

Det anvendte poly-ABAP-kompleks blev syntetisereret som følger: Avidin-DH (1,8 mg/ml) blev fortyndet til en kon-35 centration på 7,2 ug/ml i AP 7,5 puffer (0,1 M "Tris"-HC1, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 0,05 vol.% "Triton® X-100"). Proteinet sattes til et rent borsilicatreagens- 48 DK 167162 B1 glas, som i forvejen var skyllet med en opløsning af ok-seserumalbumin (3 vægt/vol.%) i AP 7,5 puffer. Derpå tilsattes biotinyleret alkalisk phosphatase-polymer (0,92 mg/ml i NMZT-puffer) til en slutkoncentration på 1,8 5 ug/ml, og kompleksdannelsen fik lov at skride frem i mindst 10 minutter før brugen.

EKSEMPEL 1 10 Fremstilling af prikafdupninger

Plasmid-pMM984-DNA, enten lineariseret ved Xhol-nedbrydning eller hak-translateret med Bio-Il eller Bio-16-dUTP-substrat blev rækkefortyndet i 50 mM "Tris”: Cl, pH 7,5, 15 og 0,3 N NaOH indeholdende 1,5 mg/ml frigjort sildesper-ma-DNA: Passende'fortyndinger blev neutraliseret som vist med iskold 3 N HC1, og 5 μΐ aliquoter blev sat som pletter direkte på BA-85 nitrocellulosefilterark (Schleicher and Scheull, Keene, NH) ovenpå "Saran"-folie. Filtrene 20 blev lufttørret, bagt i 4 timer ved 80 °C og skåret ud i strimler indeholdende en fortyndingsrække fra 0 til 129 pg plasmid-DNA pr. plet.

Fremstilling af Southern-afdupninger 25

Agarosegeler med en tykkelse på omkring 6 mm blev fremstillet på et horisontalt elektroforeseapparat, og DNA-prøver blev underkastet elektroforese som beskrevet af Alwine et al., Methods Enzymol., 68, 220 (1980). DnA blev 30 overført til nitrocelluloseark (BA-85 eller Sartorius 11336), som i forvejen var mættet med 20X NaCl/citrat som beskrevet af Southern og modificeret af Thomas, J. M01.

Biol, 98, 503 (1975); Proc. Acad. Sci. USA, 77, 5201 (1980), efter gennemførelse af det sure depurineringstrin 35 beskrevet af Wahl et al-, Proc. Nat. Acad. Sci., USA; 76, 3683 (1979). Fuldstændig overførsel blev sikret ved anvendelse af en 3 cm tyk skumsvamp mættet med 20X NaCl/ci- 49 DK 167162 B1 trat som et væskereservoir under gelen. DNA-filtre blev lufttørret, bagt ved 80 °C i 2-4 timer og opbevaret ved 4 °C over CaSO^, indtil de var hybridiseret.

5 Hybridiseringssonder

Sonder blev fremstillet ved hak-translation i hovedsagen som beskrevet af Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237 (1977). Isolater af dobbeltstrenget DNA, som skulle de-10 tekteres, blev hak-translateret med E. coli DNA-polymera-se I, som katalyserer koblingsreaktionen af nucleotider til 3'-hydroxy-enden af et hak eller brud i DNA-strengen, medens den eliminerer nucleotidrester fra 5'phosphoryl-enderne. Den komplementære DNA-streng tjente som skabe-15 Ion. Denne procedure muliggjorde tilføjelse af mærkede nucleotidrester til den dobbelte DNA-streng. Strengen blev derpå denatureret, og hver sekvens tjente som komplement til hybridisering med de native DNA-streng-part-nere i ukendt blanding.

20

Til -denne proces indeholdt reaktionsblandingerne (20-200 ul) 40 ug/ml DNA; 200 enh./ml DNA-polymerase I, 0,005 ug/ml DNAase (hakkende enzym), 50 mM "Tris"-Cl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 ug/ml BSA, 50 umol hvert af dCTP, dGTP, dATP 25 og TTP (P-L Biochemicals, Inc. Milwaukee, WN) eller Bio-dUTP-analoge. Bio-4-dUTP, BIo-ll-dUTP og Bio-16-dUTP blev syntetiseret ved metoder ifølge Langer, Proc. Nat. Acad.

Sci. USA, 78 6633 (1981). Hak-translations-reaktioner indeholdende Bio-dUTP-analoge blev inkuberet i 2 timer ved 30 14 °C, medens reaktioner med TTP blev inkuberet i 1 time ved 14 °C. Nogle af Bio-dUTP-reaktionerne indeholdt også 200 Cl/ml a- P-dCTP (Amersham, 410 Ci/mmol). Højspecifikt radioaktive sonder blev fremstillet som ovenfor med 32 5 umol TTP og 1000 Ci/mmol a- P-dATP (Amersham).

35 DK 167162 Bl 50

Forhybridisering og hybridiseringsbetingelser

Den almene forskrift, som er skitseret nedenfor, fandtes at være optimal, når der anvendes biotinmærkede hybridi-5 seringssonder. Filtre blev forhybridiseret i 2-4 timer ved 42 °C ifølge Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3683 (1979) i en forseglet plastikpose under anvendelse af en blanding indeholdende 45 vol.% deioniseret formamid (ledningsevne 10 MHO, pH 6,5 eller mindre), 5X 10 NaCl/citrat Denhardt's opløsning; Biochem. Biophys. Res.

Comm., 23, 641 (1966), 25 mM NaPO^-puffer, pH 6,5, og ultralydbehandlet sildesperma-DNA (250-500) μ5/πι1). Hybri-diseringspufferen indeholdt 45 vol.% formamid, 5X NaCl/citrat, IX Denhardt's opløsning, 25 mM NaPO^-puffer, 15 pH 6,5, 10% dextransulfat (tilsat som 20% af det endelige volumen fra en 50 vægt/vol-% lageropløsning), 250-500 g/ml ultralydbehandlet sildesperma-DNA og 200-500 ng/ml af en DNA-sonde, som var blevet hak-translateret med Βίοι 6 -dUTP. Bærer- og sonde-DNA' erne blev varmedenatureret 20 lige før tilsætningen. Der anvendtes 10 ml hybridise- 2 ringsblanding pr. 100 cm filter, og hybridiseringsreak-tionen blev inkuberet ved 42 °C (i en forseglet pose) i 30-180 minutter. Til analyse af enkelt-kopi pattedyrgen-sekvenser udførtes hybridisering almindeligvis til en Cøt 25 på 0,8 x 10-2 (f.eks. var hybridiseringstiden 120 minutter for en sondekoncentration på 350 ng/ml). Efter hybri-diseringen blev filtrene vasket fire gange ved stuetemperatur, 2-3 minutter for hver vaskning, to gange med 2X NaCl/citrat - 0,1% NaDodSO^ og to gange med 0,2X NaCl/ci-30 trat - 0,1% NaDodSO^. To strenge vaskninger (15 minutter hver) blev udført med 0,16X NaCl/citrat - 0,1% NaDodSO^ ved 50 °C efterfulgt af to vaskninger ved stuetemperatur. Filtrene blev lufttørret og monteret til autoradiografi med XAR røntgenfilm (Kodak, Rochester, NY, U.S.A.) eller 35 prøvet for biotin som beskrevet nedenfor.

51 DK 167162 B1

Kolorimetrisk detektion af Blo-DNA-sonder

Tørre nitrocellulosefilterafdupninger blev inkuberet ved 42 °C i 15 minutter i en 3 vægt/vol-% opløsning af okse-5 serumalbumin (BSA) i AP 7,5 puffer, lufttørret, bagt ved 80 °C i 30-60 minutter og derpå rehydratiseret i BSA-AP

7.5 puffer ved 42 °C i 20-30 minutter. Små filterstrimler blev behandlet i 13X 100 mm reagensglas, medens større ark blev behandlet i polyethylenbakker eller varmeforseg- 10 lede polypropylenposer. Filtre blev exponeret for enzymkomplekser i 5 minutter ved stuetemperatur; der anvendtes 2

2-5 ml kompleks for hver 100 cm filter. Filtrene blev hurtigt vasket tre gange i 250 ml AP 7,5 og to gange i AP

9.5 (0,1 M "Tris"-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl2).

15 Når der anvendtes avidin/peroxidase-(ABC) komplekser, anvendtes 2X NaCl/citrat i stedet for AP 7,5 og AP 9,5 pufferne. Til udvikling med ABAP- eller poly-ABAp-komplekser blev filtre inkuberet ved stuetemperatur i 0,5-24 timer i AP 9,5 puffer indeholdende 0,33 mg/ml NBT og 0,17 ml/ml 20 BCIP; se Histochemie, 23, 1806 (1970). Phosphatasesub- stratopløsningen blev fremstillet som følger: for hver 15 ml reagens blev 5 mg NBT suspenderet i 1,5 ml AP 9,5 i en mikrocentrifuge og slynget kraftigt i 1-2 minutter, centrifugeret kort i en mikrocentrifuge, og supernatanten 25 dekanteret ind i 10 ml AP 9,5 opvarmet til 35 °C i et po-lypropylenreagensglas. Den resterende NBT-pille blev ekstraheret to gange mere med 1,5 ml AP 9,5 puffer, og su-pernatanterne hældt sammen med den oprindelige opløsning. Glassene blev skyllet med et slutvolumen på 0,5 ml AP 30 9,5, som også blev dekanteret ind i 15 ml NBT-lageropløs- ningen, BCIP (2,5 mg) blev opløst i 50 μΐ N,N-dimethyl-formamid og sat dråbevis under forsigtig blanding til NBT-opløsningen. Der må sørges for, at der ikke finder nogen omrøring eller kraftig rystning af reagensblandin-35 gen sted, da dette kan føre til dannelsen af uønskede bundfald. Selv om dette reagens almindeligvis blev fremstillet frisk, var det stabilt ved stuetemperatur i 52 DK 167162 B1 mindst 24 timer i mørke.

Filtre blev inkuberet med substratopløsninen i forseglede polypropylenposer under anvendelse af 10-15 ml opløs-2 5 ning/100 cm filter. For at reducere uspecifik baggrund bør farveudviklingen foregå i mørke eller dæmpet lys. Enkelt-kopi pattedyrgensekvenser bliver almindeligvis synlige inden for 30 minutter, selv om stærkt farvede hybri-diseringssignaler kræver inkubationstider på flere timer.

10 Farveudviklingen blev afsluttet ved vaskning af filtrene i 10 mM "Tris"-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5. Udviklede afdupnin-ger blev opbevaret tørt eller i varmeforseglede poser indeholdende en lille mængde 20 mM "Tris"-HCl, 5 mmM EDTA, pH 9,5. Selv om farveintensiteten blegner, når nitrocel-15 lulosearket tørres, vil genbefugtning med puffer genoprette farveintensiteten, så længe filteret er blevet opbevaret uden langvarig udsættelse for stærkt lys.

Under anvendelse af den ovennævnte procedure med en kendt 20 mængde DNA, som skulle detekteres, og standardimmunologiske og affinitetsprocedurer til visualisering af biotinmærket DNA, blev sammenligningsfølsomhedsresultaterne bestemt. Rækkedobbeltfortyndinger af mål-(pMM984-plas-mid)-DNA, mærket med Bio-4-dUTP, Bio-ll-dUTP eller bio-25 16-dUTP, blev blandet med en konstant mængde bærer-silde-sperma-DNA (7,5 ug) og anbragt som plet direkte på nitrocellulosestrimler . Disse strimler blev derpå inkuberet med forskellige detektorreagenser, og følsomheden af hver metode blev bestemt. Resultaterne af sådanne forsøg er 30 sammenfattet i tabel 2. Indirekte immunofluorescens under anvendelse af en i hånden holdt UV-lyskilde til visualisering var en relativt ufølsom procedure med detektions-grænser nær ved 1 ng mål-DNA (tabel 2, linie 1 og 2). Indirekte immunoperoxidase-metoder under anvendelse af en-35 ten DAB eller EAC som substrat var bedre (tabel 2, linie 3 og 4), men stadig blev kun 150-200 pg set med et Bio- 11-DNA-mål. Sternberger's peroxidase-antiperoxidase-meto- 53 DK 167162 B1 de [Sternberger et al., J. Histochem. Cytochem., 18, 315 (1970)] forbedrede følsomheden til det dobbelte i forhold til den, som blev set med den indirekte immunoperoxidase-teknik. Imidlertid var den heller ikke følsom nok til 5 analyse af enkelt-kopi pattedyr-DNA-sekvenser. Med hver af disse immunologiske metoder forhøjede en forøgelse af længden af biotin-"linker-armen" fra 4 til 11 atomer de-tekterbarheden af målet fire gange. I modsætning hertil blev Bio-4-DNA slet ikke detekteret af komplekser af avi-10 din og biotinyleret peberrod-peroxidase (Hsu's ABC-kom-plekser, Hsu et al., J. Histochem. Cytochem., 29, 577 (1981)). Imidlertid afslørede ABC-komplekserne Bio-ll-DNA og Bio-16-DNA med lige stor effektitivitet og ved følsom-hedsgrænse på mindre end 100 pg ved en simpel 1-trins re-15 aktion (tabel 2, linie 6 og 7). Komplekser fremstillet med avidin-DH og biotinyleret intestinal alkalisk phosphatase (ABAP-komplekser) var endog mere følsomme end ABC-komplekser fremstillet med peroxidase (tabel 2, linie 10) med detektionsgrænser mellem 20 og 30 pg mål-DNA. Al-20 le forsøg på at forøge signalstyrken under anvendelse af flerdobbelt "sandwich"-teknik gav enten ikke nogen forhøjelse eller en skarp formindskelse af signalet. Dette blev iagttaget under anvendelse af enten antibiotin-IgG eller et ABC-type-kompleks som den primære detektor (ta-25 bel 2, linie 8 og 9).

Som vist i tabel 2, linie 11 betegnes intestinal-alka-lisk-phosphatse-polymeren ifølge opfindelsen syntetiseret ifølge den ovenstående procedure, som bevarede høje ni-30 veauer af enzymatisk aktivitet i komplekset, poly-ABAP.

Når det blev anvendt i forbindelse med en substratblanding af nitroblåt-tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3-indo-lylphosphat, detekterede dette kompleks 1-2 pg mål-DNA med enzyminkubationer på 3-4 timer. Dette detektionsni-35 veau er 10-15 gange bedre end den mest følsomme af de andre metoder.

54 DK 167162 B1

Hvis man antager 6-10 pg DNA pr. diploid pattedyrcelle og en gennemsnits "gen"-størrelse på 5 kbp, vil der kræves en følsomhed på 12 pg til analyse af unikke cellulære sekvenser i en 7,5 ug prøve af DNA. Poly-ABAP-komplekset 5 ifølge opfindelsen detekterede 1-2 pg DNA og har således denne kapacitet.

Tabel 2 10 Relativ følsomhed af biotin—specifikke reagenser ved detektering af biotin-mærkede polynucleotider _bundet til nitrocellulose-filtre_

Bio-ONA Detektorreagenser Substrater Detektions- _ ___ _ grænser (pg målsekvens) 15 Mi 1. Bio-1» Anti-biotin IgG+FITC-2° Ab - 2000-4000 2. Bio-11 Anti-biotin IgG+FITC-2° Ab - 500-1000 3. Bio-4 Anti-Biotin IgG+HRP-2° Ab DAB/EAC 500-1000 4. Bio-11 Anti-Biotin IgG+HRP-2 Ab DAB/EAC 150-200 20 5. Bio-4 ABC (avidin DH - Bio HRP) DAB/EAC ikke- detekteret 6. Bio-11 ABC DAB/EAC 75-150 7. Bio-16 ABC DAB/EAC 75-150 8. Bio-16 Anti-biotin IgG+Bio-20 Ab+ABC DAB/EAC 100-200 9. Bio-16 ABC+Bio-DNA+ABC DAB/EAC 100-200 10. Bio-16 ABAP (avidin-Bio Alk. Phos.) NBT + BCIP 20-30 zo 11. Bio-16 poly ABAP (avidin-poly NBT + BCIP 1-2

Bio. Alk. Phos) 30 Fig. 1 viser typiske prikafdupnings-prøvningsresultater opnået ved anvendelse af ABC-, ABAP- og poly-ABAP-enzym-detektorkomplekser ved den ovennævnte DNA-detektionsmeto-de og inkubation i 60 minutter med kendte mængder DNA, som skulle detekteres. Peroxidase-(ABC)-reaktioner (bane 35 1) gav almindeligvis højere ikke-specifik baggrund på ni trocellulosefiltrene end ABAP- eller poly-ABAP-komplekser (henholdsvis bane 2 og 3), især hvis inkubationerne med DK 167162 Bl 55 peroxidasesubstrater var længere end 3-60 minutter. Ved anvendelse af poly-ABAP-detektoren kan imidlertid 1 pg mål-DNA gøres synligt uden væsentlig baggrundsstøj med enzyminkubationer på 3-4 timer. Da NBT/BCIP-substratblan-5 dingen ikke udviste mærkbar slutproduktinhibering af phosphataseaktiviteten, kunne intensiteten af signalet forøges yderligere ved at forlænge substratinkubationsperioden til op til 24 timer.

10 Efter at have udviklet et enzymkompleks med kapacitet til at detektere pg-mængder af biotinmærket DNA; undersøgtes de optimale betingelser for anvendelse af Bio-Il- eller

Bio-16-DNA'er som hybridiseringssonder. To pMM984-DNA- 32 sonder, den ene mærket med P alene og den anden mærket 32 15 med P og biotin-nucleotider og begge sonder med identisk specifik radioaktivitet, blev hybridiseret ved forskellige sondekoncentrationer i området fra 5 til 1000 ng/ml. Resultaterne ved de forskellige sondekoncentrationer er vist i fig. 2, linie 1-6. Stribenumrene ved toppen 20 af hver kurve er analytkoncentrationer. Autoradiografiet 32 af -striberne hybridiseret med P-mærket DNA viste væsentlig uspecifik baggrund ved alle sondekoncentrationer over 25 ng/ml (fig. 2C 4 dages exponering af striben på film). I modsætning hertil gav autoradiografiet af stri- 32 25 berne hybridiseret med P-mærket Bio-16-DNA-sonde praktisk taget ingen uspecifik baggrundsstøj ved sondekoncentrationer på op til 750 ng/ml (fig. 2B 4 dages exponering af stribe på film). Dette resultat viste, at et godt sig-nal/støj-forhold kunne opnås under anvendelse af meget 30 høje koncentrationer af en Bio-DNA-sonde, hvilket gør det muligt at reducere hybridiseringstiderne, der kræves til at opnå enhver ønsket CQt-værdi, betydeligt.

32

Farvningssignalet fra den P-mærkede Bio-16-DNA-sonde 35 visualiseret med poly-ABAP-komplekset ifølge opfindelsen, som blev fremstillet ifølge den tidligere angivne procedure, ses i fig. 2A at være mere følsomt end autoradio- 56 DK 167162 B1 grafiet 2B og tilnærmelsesvis lige så følsomt som 2C. Denne udvikling krævede imidlertid kun 4,5 timer til at fuldføres. I overensstemmelse hermed er poly-ABAP-kom-plekset ifølge opfindelsen ved denne prøvning hurtigere 5 end kendte detektionsmetoder og har høj følsomhed.

Evnen hos poly-ABAP-detektionssystemet ifølge opfindelsen til at visualisere sekvenser i et Southern-afdupningsfor-mat blev først analyseret ved et rekonstruktionsforsøg.

10 Forskellige mængder lineariseret pAT153-plasmid-DNA sattes til 10 ug prøver af frigjort bærer-DNA, og blandingerne blev underkastet elektroforese på en 1,4% aga-rosegel. Fig. 4A viser disse syv gelbaner efter elektro-foresen, og gelbane M som en markør, der indeholdt 0,6 ug 15 plasmid-DNA farvet med ethidiumbromid for at angive placeringen af de ønskede plasmidbånd efter elektroforese.

De områder af de syv gelbaner, som indeholdt 3,6 kbp plasmidbåndene, blev overført til et nitrocellulosefilter, og filteret blev hybridiseret med en Bio-16-mærket 20 plasmidsonde. For at prøve systemets muligheder kritisk blev hybridiseringen gennemført under meget strenge betingelser (i 50% formamid) til en høj CQt, betingelser som vides at give mindre end maksimale resultater. Ikke desto mindre detekterede poly-ABAP-komplekset efter 2 ti-25 mers inkubation i NBT/BCIP-substratopløsningen klart bånd indeholdende så lidt som 3,1 pg plasmid-DNA, som vist i fig. 4B. Intensiteten af signalet var også proportional med mængden af målsekvens.

30 Detektion af specifik DNA i en blanding af DNA'er

Evnen hos detektorsystemet ifølge opfindelsen til at detektere specifikke polynucleotidsekvenser i en ukendt blanding blev påvist ved den følgende procedure. Human 35 placental DNA blev nedbrudt med Eco RI eller Hind III og overført til et nitrocellulosefilter efter elektroforese i en 1% agarosegel. DNA*en blev derpå hybridiseret i 2 57 DK 167162 B1 timer med Bio-16-mærkede α-globin- eller Bio-16-mærkede Ø-globin-sonder. Disse sonder var komplementære for a- og Ø-globin-generne (DNA) i den placentale DNA. a-globin-sonden (klon JW101) var en cDNA-klon, der kun indeholdt 5 400 nucleotider af α-globin-sekvensen; Æ-globin-sonden (pHB C6) var en 5,2 kbp genomisk klon. Fig. 5 viser resultaterne. Banerne 1 og 3 er EcoRI-nedbrydninger, banerne 2 og 4 er HindiII-nedbrydninger, banerne 1 og 2 er hy-bridiseret med sonde JW101, banerne 3 og 4 er hybridise-10 ret med sonde pHB C6. Bane 5 indeholdt 750 pg Hindlll-nedbrydning af λ-fag og 750 pg PstI-nedbrydning af pMM i 10 ug frigjort sildesperma-DNA og blev hybridiseret med λ- og pMM984-sonder. Der blev iagttaget restriktionsfragmenter, som havde størrelse i god overensstemmelse med 15 den publicerede litteratur; se Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 5950 (1978); Cell 19. 947 (1980); Cell, 19, 959 (1980).

Alle baner blev visualiseret med poly-ABAP efter flere 20 timers enzyminkubation som vist i fig. 5. Det mindre 2,5 kbp-EcoRi-fragment, som er hybridiseret til Ø-globinson-den (fig. 5, bane 3), er mest sandsynligt EcoRI-fragmentet fra 5'-området af δ-globin-genet, som krydshybridise-rer med Ø-globin-sonder, se Cell ovenfor. Selv om de tre 25 Hindlll-fragmenter, som hybridiserede med α-globin-sonden (fig. 5, bane 2) udviser et svagere signal end de andre bånd, der iagttages i banerne 1, 3 og 4, er dette ikke overraskende, da hvert af disse fragmenter kun hybridiserede til et undersæt af de 400 nucleotider, som er til 30 stede i sonden. Det er imidlertid klart, at unikke patte-dyrgensekvenser kan visualiseres kolorimetrisk under anvendelse af poly-ABAP-detektionssystemet. Kombinering af Bio-DNA-sonder med et poly-ABAP-detektorsystem giver således en hurtig og følsom ikke-isotopisk procedure til 35 Southern-, Northern- eller prikafdupnings-hybridiserings-analyse.

58 DK 167162 B1 EKSEMPEL 2

Sammenligning med monomere og polymere enzymvisualiseringspolymere til detektering af biotinmærkede proteiner 5

Anvendelse

Proteiner adskilt ved gelelektroforese kan overføres til nitrocellulosefilterark, og specifikke proteiner lokali-10 seres af specifikke mærkede antisera koblet med et bio-tinmærke-detektionssystem fremstillet ifølge den metode, som er beskrevet i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6633 (1981). Fire enzymsystemer til detektering af biotinmærkede antistoffer blev sammenlignet.

15

Metode

Biotinyleret gede-antikanin-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) blev rækkefortyndet i en bærerproteinop-20 løsning på 0,5 vægt/vol.% okseserumalbumin (Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO) i 2X SSC. En række på 8 pletter indeholdende mellem 0,8 og 100 pg mærket protein og en plet af bærer- (biotinfrit) protein-opløsning blev anbragt på filterstrimler. Filtrene blev derpå bagt ved 25 80 °C i 1 time for at fiksere proteinet til nitrocellulo sestrimlen.

Replikatstrimler blev "blokeret" ved forinkubering i 3% BSA i IX AP 7,5 puffer eller i 2% BSA i PBS med 0,1% 30 "Triton X-100". Blokerede strimler blev tørret ved 80 °C i 45 minutter og rehydratiseret i blokeringsreagens i 30 minutter ved 42 °C. Mængden af biotinyleret protein- "mål, som kunne detekteres af hvert af de fire avidin/-biotinyleret enzymkomplekser, blev derpå prøvet under an-35 vendelse af de i tabel 3 skitserede enzymreaktioner.

59 DK 167162 B1

Tabel 3

Detektorkompleks Enzym Enzymsubstratopløsning 5 1. ABC sæt (Vec- peberrod- 0,2 mg/ml aminoethylcarba- tor Lab.) peroxidase zol og 0,01% ^^2

NaOAc-puffer, pH 5,0 2. Detek II sæt 0,5 mg/ml diaminobenzidin 10 (Enzo Biochem samme som 1 og 0,02% ^2^2 * Enzo-puffer.

3. ABAP intestinal 0,33 mg/ml nitroblåt- (monomer) alkalisk tetrazolium og 0,17 mg/ml phosphatase bromchlorindolyl-phosphat 15 fra kalv IX AP 9,5 puffer (2).

4. poly-ABAP samme som 3 samme som 3 ifølge opfindelsen (polyme- 20 riseret ifølge den tidligere angivne procedure) 25 Enzymreaktionerne blev afsluttet ved vaskning af filterstrimlerne i 10 mM "Tris": HC1, 1 mM EDTA, pH 7,5, efter 15 eller 150 minutters inkubation ved stuetemperatur.

Resultaterne af de fire prøvninger er som følger. Ved 30 sammenligning af peroxidasekomplekserne med phosphatkom- plekserne fandtes det, at peroxidasereaktionerne var hurtige, og at følsomhederne af de to prøver af peroxidase-kompleks var helt forskellige. ABC-komplekset kunne detektere 13 pg i en 15 minutters reaktion, medens Detek II 35 ' visualiserede 1,6 pg i det samme tidsrum. Dette er vist i fig. 7A, bane 1 og 2. Forskellen kan simpelthen være en funktion af de anvendte substrater.

60 DK 167162 B1

Phosphatasekomplekserne havde lignende detektionsevner ved en 15 minutters reaktion, dvs. 13 pg for ABAP og 3 pg for poly-ABAP; se fig. 7, bane 3 og 4. Imidlertid fortsatte phosphatasereaktionerne med at skabe mere signal i 5 løbet af en 2,5 timers reaktion, medens peroxidasereak-tionerne kun forøgedes til i bedste fald det dobbelte ved denne forlængede reaktion, se fig. 7B. desuden frembragte 2,5 timers Detek II reaktionen kraftig baggrundsfarvning af nitrocellulosen og en falsk positiv reaktion fra bæ-10 rerproteinpletten nr. i (fig. 7B, bane 2). Detektions-grænserne efter 2,5 timer var 13 pg (ABC; fig. 7B, bane 1), tilnærmelsesvis 3 pg (Detek II, fig. 7B, bane 2) 3-6 pg (ABAP; fig. 7A, bane 3) og 0,8 pg (poly-ABAP; fig. 7B, bane 4).

15

Den specifikke virkning af enzympolymerisation på detek-tionsfølsomheden ses ved sammenligning af resultaterne i fig. 7 for ABAP- og poly-ABAP-detektionssystemerne efter enten 15 eller 150 minutter. Disse inkubationer viser 20 klart, at der er en 8-16 ganges forøgelse i signalet for det.polymere enzymkompleks ifølge opfindelsen (fig. 7A og B, bane 3 og 4).

Udnyttelse af avidin/biotinyleret alkalisk phosphatase-25 komplekser ved immunocytokemisk detektion af humant cho-riongonadotropin

Et sammenligningsforsøg blev foretaget for at bestemme nyttigheden af biotinylerede polymere af alkalisk phos-30 phatase ved immunocytokemi. Metoden med avidin/biotinyle-rede polymere af alkalisk phosphatase (poly-ABAP) blev sammenlignet med Sternberger's peroxidase-antiperoxidase-(PAP) teknik, Sternberger et al., J. Histochem., Cyto-chem., 18, 3156 (1970).

35 Vævssnit fra cancerøse organer indeholdende humant cho-riongonadotropin blev præpareret på præparatglas som føl- 61 DK 167162 B1 ger:

Snitterne blev afvokset i xylen to gange i hver 5 minutter og derpå hydratiseret til destilleret vand via alko-5 holgradienter. Snittene til peroxidase-antiperoxidase-(PAP) teknikken blev behandlet med 1,5% 1^0 i P.B.S. i 30 minutter for at blokere endogen peroxidase. Snittene til poly-ABAP-teknikken blev ført til det næste trin uden behandling.

10

Snittene blev behandlet med de følgende suppressor-syste-mer:

Til PAP-teknikken blev snittene behandlet med 10% normal 15 svineserum i 3% BSA i 0,05 M "Tris"-HCl-puffer pH 7,5 i 20 minutter.

Til poly-ABAP-teknikken blev snittene kun behandlet med 3% BSA i 0,05 M "Tris"-HCl-puffer pH 7,5 i 20 minutter.

20 Snittene blev taget monteret på præparatglas.

Primært antistof (kanin-anti-HCG, Accurate Chemical and Scientific Corp.) blev fortyndet fra 1:1000 til 1: 1 000 000 i "Tris"-HCl-puffer pH 7,5 og påført præparat-25 glassene både i 1 time ved stuetemperatur og natten over i et fugtigt kammer ved stuetemperatur. Præparatglassene blev vasket tre gange med "Tris"-HCl-puffer pH 7,5.

Derpå tilsattes sekundært serum.

30

Til PAP-teknikken påførtes vævssnittet en 1:20 fortynding af svine-antikanin-antiserum (Accurate Chemical and Scientific Corp.) i 0,5 time ved stuetemperatur. Til poly-ABAP-teknikken påførtes en 1:400 fortynding af bio-35 tinyleret gede-antikanin-antiserum (Vector Laboratories,

Inc.), fortyndet i "Tris"-HCl-puffer pH 7,5, i 0,5 time ved stuetemperatur. Desuden fremstilledes biotinmærket 62 DK 167162 B1 svine-antikanin-antiserum, som blev påført vævssnittene i separate forløb. Præparatglassene blev derpå vasket tre gange i "Tris"-HCl-puffer i 5 minutter hver.

5 Derpå tilsattes detektionssysternet. Til PAP-systemet fremstilledes en 1:50 fortynding af kanin-PAP i "Tris"-HCl-puffer, som blev påført præparatglassene i 1 time ved stuetemperatur. Til poly-ABAP-systemet sattes 20 ul avi-din-DH til et borsilicatreagensglas indeholdende 2,5 ml 10 "Tris"-HCl-puffer pH 7,5, derpå tilsattes 2,5 ul polyme- riseret alkalisk phosphatase, og blandingen fik lov at danne kompleks i 5 minutter. Komplekset blev derpå påført præparatglassene i 1 time ved stuetemperatur. Præparatglassene blev vasket tre gange ved stuetemperatur i 15 "Tris"-HCl-puffer pH 7,5.

Derpå tilsattes udviklingssysternet. Til PAP-teknikken blev præparatglassene udviklet i diaminobenzidin-tetrahy-drochlorid og ^0^· Til poly-ABAP-teknikken blev præpa-20 ratglassene udviklet i Napthol AS Phosphate and Fast Red TR Salt fortyndet i 0,05 M "Tris"-HC1-puffer pH 9,5 i 0,1 M NaCl med 50 mM MgCl i 20 minutter ved stuetemperatur.

Præparatglassene blev monteret, forsynet med dækglas og 25 undersøgt ved lysmikroskopi.

Resultaterne er belyst i fig. 6A og 6B som billeder af præparatglassene.

30 Fig. 6A viser resultaterne af PAP-teknikken ved 1:16 000 fortynding.

Fig. 6B viser resultaterne af poly-ABAP-teknikken ved 1:160 000 fortynding.

35

Det har vist sig, at med inkuberinger natten over og afhængigt af det primære antistof er poly-ABAP-teknikken

Claims (22)

63 DK 167162 B1 ifølge opfindelsen 4-20 gange mere følsom end PAP-teknik-ken. Ved korte primær-antistof-inkubationer på 1 time, er teknikken ifølge opfindelsen 4-6 gange mere følsom. Den forøgede følsomhed, som noteres ved inkubationer natten 5 over, har forbindelse med poly-ABAP-teknikkens evne til at forøge sin følsomhed, medens PAP-metoden forbliver ved omkring den oprindelige titer. 10 ---------------------

1. Fremgangsmåde til visualisering af tilstedeværelsen af en uorganisk eller organisk analyt i et biologisk materiale, kendetegnet ved, at analytten reagerer 15 med en visualiseringspolymer eller med et detektionsmid-del for analytten, hvilket middel bærer visualiseringspolymeren, der omfatter flerdobbelte enheder af en visualiseringsmonomer med mindst ét visualiseringscenter, hvilke enheder er direkte bundet sammen via kemiske grup-20 per eller rygradsdele i naboenheder eller sammenknyttet af et koblingsmiddel, som er kovalent bundet til kemiske grupper eller rygradsdele i naboenheder, hvilket koblingsmiddel er afledt fra et reaktivt bi- eller multi-/-homo- eller heterofunktionelt organisk tværbindingsrea-25 gens med formlen A B \ / R1 I

30 E hvori R1 betyder en alifatisk gruppe på mindst to carbon- atomer eller en aromatisk gruppe på mindst 6 carbonato- mer, og A, B og E hver for sig er valgt blandt hydrogen, en carboxylsyregruppe, en syrehalogenidgruppe, en aktive-35 ret-ester-gruppe, en b1andet-anhydrid-gruppe, en acylimi- 64 DK 167162 B1 dazolgruppe, en N-(carbonyloxy)imidgruppe, en iminoester-gruppe, en primær amingruppe, en aldehydgruppe, en a-ha-logenacetylgruppe, en hydrazingruppe, en acylhydrazid-gruppe, en azidgruppe eller en N-maleimidgruppe, idet 5 mindst to af A, B eller E er forskellige fra hydrogen, hvorhos visualiseringsmonomeren er et enzym, et mærket naturligt eller syntetisk polypeptid, en mærket polyol, en mærket 10 polyalken eller et et mærket carbonhydrat, idet mærket er valgt blandt en fluorescerende kemisk gruppe, et farvestof, en radioaktiv gruppe, en fotoudsender, eller en elektrontæt gruppe, 15 den kemiske gruppe er en amingruppe, en oxideret 1,2-diolgruppe, en carboxylgruppe, en mercaptangruppe, en hy-droxygruppe eller en carbon-hydrogen-binding, rygradsdelen er en amidbinding, en carbon-carbon-binding, 20 en carbon-oxygenbinding eller en carbon-hydrogenbinding, og - den kemiske gruppe eller rygradsdelen er lokaliseret i monomeren i en position, som er mindst ét atom væk fra 25 monomerens visualiseringscenter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten produceres af eller har en virkning på en biologisk organisme. 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at analytten er et protein, et lipid, et carbonhydrat, et hormon, et steroid, et polynucleotid, en nu-cleinsyre, et nucleoprotein, et nucleosid, et nucleotid, 35 en purin- eller pyrimidinbase, et lægemiddel, et sukkerstof, et carcinogen, et antibioticum, et hapten, et antigen, et tungmetal, en organometallisk forbindelse, et me- 65 DK 167162 B1 tal-protein-kompleks eller et toxisk uorganisk salt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at detektionsmidlet er et antistof, et lectin, et 5 DNA-repressorprotein, avidin, streptavidin, et hormon, et stereospecifikt receptorprotein, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbindende protein eller en komplementær polynucleotidsekvens.

5 E hvori R^ betyder en alifatisk gruppe med mindst 2 carbon-atomer eller en aromatisk gruppe med mindst 6 carbonato-mer, og A, B og E hver for sig er valgt blandt hydrogen, 10 en carboxylsyregruppe, en syrehalogenidgruppe, en aktive-ret-ester-gruppe, en blandet-anhydrid-gruppe, en acylimi-dazolgruppe, en N-(carbonyloxy)imidgruppe, en iminoester-gruppe, en primær amingruppe, en aldehydgruppe, en α-halogenacetyl gruppe, en hydrazingruppe, en acylhydrazid-15 gruppe, en azidgruppe eller en N-maleimidgruppe, idet mindst to af A, B og E er forskellige fra hydrogen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at detektionsmidlet bærer polymeren via et mellemliggende ligandbindingskompleks omfattende en første ligand kovalent bundet til midlet, en anden ligand kovalent bundet til visualiseringspolymeren og en ligandbindende 15 forbindelse, som har dannet kompleks med den første og den anden ligand.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at visualiseringspolymeren er bundet til detektions- 20 midlet ved hjælp af en organisk bivalent sammenknyttende gruppe.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den organiske bivalente sammenknyttende gruppe er 25 afledt fra et bi-homo- eller -heterofunktionelt organisk tværbindingsreagens.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de kemiske grupper er e- eller primære aminogrup- 30 per, som danner amidbindinger med tværbindingsreagenset med formlen I.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at monomerenhederne er peroxidase, luciferase, glu- 35 coseoxidase, galactosidase, sur phosphatase eller alkalisk phosphatase. 66 DK 167162 B1

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den kemiske gruppe er en 1,2-diol, som er oxideret til en dialdehydgruppe, og at tværbindingsreagenset danner hydrazon-, amid-, acylhydrazid- eller iminbin- 5 dinger med dialdehydgruppen.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den kemiske gruppe er en mercaptan, og at tværbindingsreagenset danner sulfidbindinger under anvendelse 10 af en a-halogenacetylgruppe eller en N-maleimidgruppe.

12. Visualiseringspolymer til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge de forudgående krav, kendetegnet ved, at den omfatter flerdobbelte enheder af en visuali- 15 seringsmonomer, som har mindst ét visualiseringscenter, hvilke enheder er direkte bundet sammen via kemiske grupper eller rygradsdele i naboenheder eller sammenknyttet af et koblingsmiddel, som er kovalent bundet til kemiske grupper eller rygradsdele i naboenheder, hvorhos monome-20 ren er et enzym, et mærket naturligt eller syntetisk po-lypeptid, en mærket polyol, en mærket polyalken eller et mærket carbonhydrat, den kemiske gruppe er en amingruppe, en oxideret 1,2-diolgruppe, en carboxylgruppe, en mercap-tangruppe, en hydroxygruppe eller en carbon-hydrogen-bin-25 ding, rygradsdelen er en amidbinding, en carbon-carbon-binding, en carbon-oxygen-binding eller en carbon-hydro-gen-binding, og den kemiske gruppe eller rygradsdelen er lokaliseret i monomeren i en position, som er mindst et atom væk fra monomerens visualiseringscenter, idet mærket 30 er valgt blandt en fluorescerende gruppe, et farvestof, en radioaktiv gruppe, en fotonudsender eller en elektrontæt gruppe, og koblingsmidlet er afledt fra et bi- eller multi-(homo- eller hetero-)funktionelt organisk tværbindingsreagens, som har formlen 35 67 DK 167162 B1 A B \ / R1 I

13. Polymer ifølge krav 12, kendetegnet ved, at monomeren er et enzym valgt blandt peroxidase, galac- 20 tosidase, luciferinase, glucoseoxidase, sur phosphatase eller alkalisk phosphatase.

14. Polymer ifølge krav 13, kendetegnet ved, at tværbindingsreagenset er et alifatisk 1,«-diacyloxy- 25 disuccinimid med 4-20 carbonatomer i den alifatiske gruppe.

15. Detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kombination, kendetegnet ved, at den omfatter et detek- 30 tionsmiddel bærende en visualiseringspolymer ifølge krav 12, hvilket detektionsmiddel er et antistof, et lectin, avidin, streptavidin, et DNA-repressorprotein, et hormon, et stereospecifikt receptorprotein, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbindende protein 35 eller en komplementær polynucleotidsekvens. 68 DK 167162 B1

16. Detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kombination i-følge krav 15, kendetegnet ved, at detek-tionsmidlet bærer polymeren via et mellemliggende ligandbindende kompleks omfattende en første ligand kovalent 5 bundet til midlet, en ligandbindende forbindelse og en anden ligand kovalent bundet til visualiseringspolymeren, idet detektionsmidlet, forbindelsen og polymeren danner et kompleks, hvor den første og den anden ligand fungerer som ligander til forbindelsen. 10

17. Detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kombination i-følge krav 16, kendetegnet ved, at detektionsmidlet er et antistof, et lectin eller en komplementær polynucleotidsekvens, at den ligandbindende forbindelse 15 er avidin eller streptavidin, og at den første og den anden ligand hver for sig er valgt blandt et Ν-(ω-acyl)amido[biotin eller iminobiotin], hvor acylgruppen er på fra omkring 2 til omkring 20 carbonatomer, et Ν-(ω-oligomer)amido[biotin eller iminobiotin], hvor oligomeren 20 er en polyol-, polyamid- eller polyvinylgruppe med en længde på fra omkring 2 til omkring 30 enheder, eller et N-(ω-alkenyl)amido[biotin eller iminobiotin], hvor alke-nylgruppen er på fra omkring 3 til omkring 20 carbonatomer. 25

18. Detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kombination i-følge krav 15, kendetegnet ved, at polymeren er bundet eller kompleksbundet direkte til detektionsmidlet. 30

19. Detektionsmiddel-visualiseringspolymer-kombination i-følge krav 18, kendetegnet ved, at detektionsmidlet er kovalent bundet til polymeren med en bindende gruppe afledt fra et bi- eller multi-(homo- eller hete- 35 ro-)funktionelt organisk tværbindingsreagens. 69 DK 167162 B1

20. Visualiseringspolymerkompleks, kendetegnet ved, at det omfatter en visualiseringspolymer ifølge krav 12 kovalent bundet til en ligand, og en ligandbindende forbindelse forbundet med liganden. 5

21. Kompleks ifølge krav 20, kendetegnet ved, at forbindelsen er et lectin, avidin, streptavidin, et højaffinitetsenzym, et sekvensspecifikt polynucleotidbin-dende protein eller en komplementær polynucleotidsekvens. 10

22. Detektionssæt til analyse af analytmolekyler i et biologisk materiale, kendetegnet ved, at det omfatter udmålte mængder af en pufret vandig opløsning af en detektionsmiddelkomponent og en pufret vandig opløs- 15 ning af en visualiseringspolymerkomplekskomponent ifølge krav 20 og en standardiseret mængde af en vandig blanding af den nævnte visualiseringspolymer, hvorhos detektions-middelkomponenten og polymerkomplekskomponenten er i stand til at forbinde sig, når de kombineres. 20 23. .Detektionssæt ifølge krav 22, kendetegnet ved, at midlet er et antistof, et lectin, avidin, streptavidin, et DNA-repressorprotein, et hormon, et stereospecifikt receptorprotein, et højaffinitetsenzym, et se- 25 kvensspecifikt polynucleotidbindende protein eller en komplementær polynucleotidsekvens. 30 35