DK143028B - Fremgangsmaade til fremstilling af n5-methyltetrahydro-homofolinsyre ud fra homofolinsyre - Google Patents

Description

(11) FREMLÆG6ELSESSKRIFT 143028 (S) DANMARK (51) lnt C|3 c 07 D 475/04 «(21) Ansegning nr. 3340/73 (22) Indleveret den 1 5 · Jun. 1973 (24) Lebedag 15· Jun. 1973 (44) Aneegningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1 6. mET · 1 9°1

DIREKTORATET FOR ^ J

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Phoritet begæret fra den

16. Jun. 1972, 263559, US

(71) THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA As REPRESENTED BY THE SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH EDUCATION AND WELFARE, Washington, D.C., US.

(72) Opfinder: Roger Lyman Khott, 1365 Main Street, Waltham, Massachusetts 02154, US: Alison Tauritbn-Rigby, 1365 Main Street, Waltham, Massa= chusetts Ο2154, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Dansk Patent Kontor ApS.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af N5-methyltetrahydro-homofolinsyre ud fra homofolinsyre.

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til frem-5 stilling af N -methyl-tetrahydro-homofolinsyre ud fra homofolinsyre.

Det omhandlede derivat er beslægtet med 5,6,7,8-tetrahydro-homo-folinsyre, hvis anvendelse er begrænset som følge af dens ustabili tet. Folat-antagonister er behandlet i J.R. Bertino, Folate Antagonists as Chemotherapeutic Agents, Annals of New York Academy of Science, bd. 186, 1971, og i Goodman and Gilman, Pharmacological Basis for Therapeutics, 4. udgave, 1970, side 1431-1444.

I patentlitteraturen er fremstilling af tetrahydro-homofolinsyre-salte beskrevet i beskrivelsen til USA-patent nr. 3.468.886 og 3.637.695.

143028 2

Fra beskrivelsen til USA-patent nr. 3.468.886 kendes det farmaceutisk aktive tetrahydro-homofolinsyre-sulfat. Denne forbindelse fremstilles ifølge eksemplerne i ovennævnte patentbeskrivelse ved hydrogenering af homofolinsyre i nærværelse af platinoxid og trifluoreddike-syre, frafiltrering af katalysatoren, omsætning af filtratet med svovlsyre i ethanol og endelig udfældning af den ønskede forbindelse ved tilsætning af ether.

Folinsyre, hvis strukturformel er vist nedenfor, betragtes almindeligvis som bestående af tre segmenter. Det første segment er en pteridindel, som er en kondenseret diazin med en pyrimidin A-ring og en I,4-diazin B-ring. En methylenbro ved C forbinder det første segment med det andet segment. Det andet segment er en para-aminobenzoesyredel, og det tredie er en glutaminsyrerest.

COOH

CH„ I 2 ™ 0 CH, 0H >.-v « I 2

N NH- -C-NH-CH

S ^

.3 6^ COOH

/ N' N'

NH

. 2 Para-aminobenzoe- Glutaminsyre syre (PABA) ^-) <->

Para-aminobenzoylglutaminsyre -> 2,4,6-substitueret pterin i-:-—» pteroinsyre 4-> * Stedet for binding af ekstra glutamatrest(er) i pteroyl-di-, -tri- eller -hepta-glutamat.

Folinsyre (pteroylglutaminsyre).

3 143028

Nedenfor vises strukturen af 5,6,7,8-tetrahydro-folinsyre og forbindelser af folinsyrerækken, hvilke er analoge med de her omhandlede forbindelser.

N5'10-methenyl-THFA > CH formiat N5'10-methylen-THFA "> CH2 formaldehyd N^-methyl-THFA - CH^ methanol

COOH

CH-

* ? K

R-----NH-<^ Ns, -C-NH-CH

OH J 10 \=/ I

I ] / COOH

λγ

XH

NH- N ' Ν' H

2 \

H

5 10 *Brudte linier angiver N - og N -stillingen for tilknytning af forskellige carbonenheder, for hvilke THFA virker som barer.

5,6,7,8-Tetrahydrofolinsyre (THFA)(FH^)(R = -H).

Homofolinsyre afviger fra folinsyre ved, at den er en analog, hvori g der er placeret en ekstra methylen- eller CH2~gruppe mellem C og i folinsyremolekylet. Tetrahydrofolinsyre er et derivat af folinsyre, hvori der er hydrogeneret i 5-, 6-, 7- og 8-stillingen.

De vigtigste folinsyrederivater, der er blevet isoleret fra levende systemer, er 5-methyl-, 5,10-methenyl- og 5,10-methylentetrahydro-folinsyre. Homofolinsyrederivaterne, der er analoge med disse forbindelser, er derfor de mest sandsynlige kandidater til syntese af folinsyre-antagonister, der skal konkurrere med folinsyre og påvirke dens funktion som overfører af en enkelt carbonenhed.

Fremstillingen af 5-methyltetrahydrofolat er beskrevet i litteraturen, 4 143028 i det mindste så tidligt som i 1963, hvor W. Sakami i Biochem. Prep.

10, 103 (1963), beskrev fremstilling af 5,10-methylentetrahydrofolat ved omsætning af tetrahydrofolinsyre med formaldehyd og beskrev påfølgende reduktion af methylentetrahydrofolatet med kaliumborhydrid.

Det rå 5-methy-ltetrahydrofolat (MeTHF) , der blev dannet ved denne fremgangsmåde, blev renset ved gradient-eluerings-kromatografi på DEAE-cellulose. V.S. Gupta og F.M. Huennekens beskriver i Arch.

Biochem. Biophys. 120, 712-718 (1967), en lignende fremgangsmåde med tetrahydrofolatderivater, hvilken også involverer kondensation af formaldehyd med tetrahydrofolat til dannelse af 5,10-methylentetrahydrof olat, som derpå spaltes reduktivt med borhydrid. Gupta et al. fandt, at der kun skete lidt eller ingen spaltning på N^-siden af methylenbroen, hvorfor der praktisk taget udelukkende blev dannet 5-methyl-variant.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af N^-methyl-tetrahydro-homofolin- 5 syre. En syntese i analogi med den for N -methyl-tetrahydrofolinsyre kendte fremgangsmåde synes imidlertid allerede udelukket på grund af skrøbeligheden af tetrahydrohomofolinsyre, der måtte anvendes som udgangsstof.

Det har imidlertid overraskende vist sig, at man ved bestemte ændringer af en sådan syntese alligevel kan gennemføre den med det ønske- 5 de resultat, nemlig opnåelse af produktet N -methyl-tetrahydrohomo-folinsyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) katalytisk reducerer homofolinsyre til tetrahydrohomofolinsyre, b) straks omsætter tetrahydrohomofolinsyren med formaldehyd til dannelse af 5,11-methylentetrahydrohomofolinsyre og c) straks reduce- 5 rer 5,11-methylentetrahydrohomofolinsyren til N -methyltetrahydrohomofolinsyre, som herefter isoleres.

Ved denne fremgangsmåde går man altså ud fra homofolinsyre.

Ved gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen reduceres homofolinsyre (NSC 79249) katalytisk i mørke under anvendelse af en platinoxidkatalysator. Katalysatoren fjernes under en inaktiv gas, såsom argon, og det resulterende tetrahydrohomofolat, som fås i 5 U3020 vandig opløsning, omsættes straks med formaldehyd under udelukkelse af lys til dannelse af mellemproduktet 5,11-methylentetrahydrohomo-folat. Dette mellemprodukt reduceres, igen uden isolering, med et alkalimetalborhydrid, såsom natriumborhydrid, til dannelse af det ønskede produkt 5-methyltetrahydrohomofolinsyre i dinatriumsalt-form. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det væsentligt, at den gennemføres hurtigt, hvorved den adskiller sig fra den kendte trinvise fremgangsmåde.

Ved at anvende eddikesyre i stedet for saltsyre og indstille pH-værdien på 3,8 fraskilles uorganiske salte, såsom natriumacetat og borsyre, fuldstændigt med alkohol (dvs. ethanol), hvori de er opløselige, men hvorfra det ønskede produkt, 5-methyl-THHF, udfældes næsten kvantitativt. Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretages afkøling af den urene opløsning til 3-10°C i ca. 16 timer, efterfulgt af frafiltrering af urenheder. Produktet i opløsning kan behandles med kul, koncentreres til en olie og udfældes med ethanol (absolut). De efter tørring opnåede udbytter ligger omkring 68%.

Denne fremgangsmåde til fraskillelse af det følsomme 5-methyl-THHF-produkt eliminerer det tidskrævende DEAE-søjlekromatografitrin, og i forhold til de kendte fremgangsmåder med folat forøges det endelige udbytte med en faktor på ca. 5.

En mere specifik fremstillingsmetode og et resumé af strukturanalysen 5 af N -methyl-THHP er anført nedenfor.

5 N -methyltetrahydrohomofolinsyre fremstilles generelt som forklaret ovenfor ved de metoder, der er beskrevet af Sakami og af Gupta og

Huennekens for fremstilling af folatforbindelserne. Den foreliggende fremgangsmåde omfatter kondensation af formaldehyd med tetrahydro- 5 11 homofolat til dannelse af N ,N -methylentetrahydrohomofolat, efterfulgt af reduktiv spaltning af sidstnævnte med borhydrid. Som forklaret ved folatrækken er denne spaltning yderst selektiv, og der sker kun en ringe eller ingen spaltning på N -siden af methylen-broen. Udgangsmaterialet, tetrahydrohomofolinsyre, blev fremstillet ved katalytisk hydrogenering af homofolinsyre ved et ringe overtryk med platinoxid. Katalysatoren blev fjernet ved filtrering, og formaldehyd blev straks tilsat. Efter opvarmning til 55°C tilsattes en 143028 β opløsning af natriumborhydrid, og blandingen blev holdt ved 55°C i 2 timer. Til strukturanalyse blev den resulterende reaktionsblanding kromatograferet på en DEAE-cellulosesøjle under anvendelse af en 5 ammoniumacetat-gradient. N -Methyltetrahydrohomofolat blev identificeret som hovedprodukt og isoleret ved udfældning med absolut ethanol som et hvidt pulver i 46%'s udbytte. Produktet blev karakteriseret ved elementaranalyse, papir- og tyndtlagskromatografi og absorptionsspektre ved pH 1, 7 og 13.

Det her omhandlede tetrahydrohomofolinsyrederivat har vist sig at have en væsentlig antileukæmi-virkning mod L1210-FR8-tumor hos mus, og det har desuden den fordel, at det er mere stabilt overfor oxidation end moderforbindelsen. Forbindelsens virkning må antages i det mindste delvis at skyldes, at den er inhibitor for thymidylatsyntetase. Forbindelsen kan fremstilles som fri syre eller fortrinsvis som alkalimetaldisalte ved glutamatdelen, såsom dinatriumsalte.

Den omhandlede forbindelse eksisterer i form af racemater som følge af nærværelsen af et asymmetrisk carbonatom ved 6-stillingen. Den stereokemiske betegnelse er således (d,l).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i det følgende eksempel.

Eksempel

Fremstilling af 5-methyltetrahydrohomofolinsyre (natriumsalt) _NSC-139490_ 3,0 g platinoxid vaskes med fire portioner vand på 20 ml hver og hydrogeneres i 130 ml vand ved 4 cm's overtryk under kraftig omrøring ved stuetemperatur. Reduktionen var fuldstændig efter 2 timer og 50 minutter med absorption af 410 ml hydrogen.

a) 5,5 g homofolinsyre (NSC-79249) suspenderes i 200 ml vand, og der tilsættes dråbevis 22 ml 1 M natriumhydroxidopløsning (til pH 7,0) over et tidsrum på 1 time under omrøring og udelukkelse af lys. Omrøringen fortsættes i yderligere 1 time, og den således opnåede gule opløsning indsprøjtes i hydrogeneringsbeholderen. Hydrogenering ved 4 cm's overtryk er fuldstændig efter 4 timer og 50 minutter med absorption af 590 ml hydrogen. Reaktionsblandingen filtreres under argon 7 U3028 gennem en sinterglastragt, og filtratet overføres til en 2 liter tre-halset kolbe, som er skyllet med argon.

b) 2,9 ml 37%'s formaldehydopløsning tilsættes, systemet skylles med argon, og reaktionsblandingen opvarmes til 55°C under omrøring under argon og udelukkelse af lys.

c) Der tilsættes hurtigt 90 ml af en 1,0 M natriumborhydridopløsning, og reaktionsblandingen holdes derpå ved 55°C i 2 timer, hvorefter udviklingen af hydrogen praktisk taget er ophørt.

Reaktionsblandingen køles til stuetemperatur; der tilsættes 8 ml mercaptoethanol, og den således opnåede lysegule opløsning indstilles på pH 3,8 med iseddike og under kontrol med et pH-meter. Den resulterende uklare opløsning afkøles ved 3°C i ca. 16 timer.

Et beige-farvet bundfald, der indeholder urenhederne, frafiltreres på en Buchner-tragt, og det blege, strågule filtrat omrøres med 500 mg Norit A i 20 minutter og filtreres. Inddampning ved reduceret tryk giver en viskos olie. Den olieagtige remanens tritureres grundigt med 900 ml koldt ethanol, og den således opnåede suspension af et hvidt, fast materiale afkøles i 1 time og omrøres så i 1 time under afkøling i is. Det hvide, fnuggede bundfald opsamles på en Buchner-tragt, vaskes gentagne gange med koldt ethanol, tørres i 5 timer i højvakuum og opbevares i vakuum.

Produktet er ensartet ifølge de accepterede kriterier for renhed.

UV-spektre, mp; λ . λ λ . λ * ’ ’ min max min max pH 1 245 266 285 291 pH 7 247 291,5 pH 13 246,5 287,5

Tyndtlagskromatografi: cellulose, opløsningsmiddelsystem:0,1 M phos- phatpuffer pH 7, 1% mercaptoethanol Rf 0,80