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DE9107670U1 - Modifizierte Mikrotiterplatten - Google Patents

Modifizierte Mikrotiterplatten

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Publication number
DE9107670U1
DE9107670U1 DE9107670U DE9107670U DE9107670U1 DE 9107670 U1 DE9107670 U1 DE 9107670U1 DE 9107670 U DE9107670 U DE 9107670U DE 9107670 U DE9107670 U DE 9107670U DE 9107670 U1 DE9107670 U1 DE 9107670U1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
microtiter plates
groups
monomers
mtp
meth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE9107670U
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English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roehm GmbH Darmstadt
Original Assignee
Roehm GmbH Darmstadt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE9107670U priority Critical patent/DE9107670U1/de
Publication of DE9107670U1 publication Critical patent/DE9107670U1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft modifizierte Mikrotiterplatten, deren Oberfläche durch Polymerbeschichtung funkionalisiert wurde zur Fixierung von Substanzen.
Stand der Technik
Aus dem europ. Patent 71 704 sind oberflächenreiche Systeme bekannt mit reaktiven Einheiten zur Fixierung von nucleophile Gruppen enthaltenden Substraten, wobei die reaktiven Einheiten Bestandteile eines Polymerlatex sind, der selbst zu einem oberflächenreichen System aggregiert und/oder an einem oberflächenreichen Trägermaterial fixiert ist. Die Bindung der nucleophile Gruppen enthaltenden Substrate ist in jedem Falle kovalent. Als Träger werden neben solchen auf Kohlehydratbasis u.a. Materialien auf Basis synthetischer Polymerer wie z.B. Polyamide, Polyester, Polyurethan, Polyacrylnitril und Polyimidschäume genannt. Weiter wird ausgeführt, daß sich besonders interessante Aspekte bieten, wenn die genannten Stoffe als Flächengebilde wie z.B. Vliesen, Watten oder Papier zur Anwendung kommen.
Die Verwendung von Mikrotiterplatten hat sich in die Immundiagnostik eingeführt und geeignete Produkte werden kommerziell angeboten. Dabei handelt es sich vornehmlich um Matrices auf Polystyrol-Basis.
Hochmolekulare Substanzen wie z.B. Proteine werden absorptiv an solche Mikrotiterplatten gebunden und die
Fixierung hochmolekularer Substanzen bietet deshalb auch keine als besonders gravierend angesehenen Probleme. Schwach oder gar nicht binden hingegen viele niedermolekulare Substanzklassen (z.B. Haptene, Peptide). Um auch diese Substanzen binden zu können wurden beispielsweise "funktionalisierte" Mikrotiterplatten entwickelt, die sekundäre Aminogruppen tragen (COVALINK NH). In Anlehnung an bekannte Bindungsverfahren, beispielsweise der Peptidchemie z.B. mittels Carbodiimid oder bifunktionellen Reagentien können niedermolekulare Verbindungen kovalent an die funktionalisierte Mikrotiterplatten-Oberflache gebunden werden. Diese sogenannte "COVALINK-Mikrotiterplatten" tragen jedoch eine relativ geringe Anzahl reaktionsfähiger Amino-Gruppen an ihrer Oberfläche. Man ist daher nicht in der Lage damit hohe Bindungsraten zu erzielen. Außerdem sind die zur Immobilisierung der oben genannten Verbindungen erforderlichen Aktivierungsschritte aufwendig.
Aufgabe und Lösung
Es bestand daher die Aufgabe Mikrotiterplatten zur Verfügung zu stellen, die eine effektivere Fixierung der zu bindenden Substanzen gestattet als der Stand der Technik.
Die vorliegende Aufgabe richtete sich insbesondere auf die Fixierung (relativ) niedermolekularer Substanzen NS, im allgemeinen biologischen Ursprungs, wobei die Anwesenheit nucleophil wirksamer Gruppen wie z.B. von Aminogruppen, Thiolgruppen oder - mit geringerer Bedeutung - von Hydroxygruppen vorausgesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Mikrotiterplatten (MT) aus an sich üblichen Matrixmaterialien, die an ihrer Oberfläche eine transparente Polymerbeschichtung besitzen, die eine Vielzahl von Epoxygruppen enthält.
Die Beschichtung die zu den erfindungsgemäßen Mikrotiterplatten MT führt, kann sich weitgehend an die im EP 71 704 (bzw. CA-PS 1 212 058) dargebotene technische Lehre anschließen, insbesondere an die Ausführungen über die Anwendung filmbildender Dispersionen.
Der Anteil der funktioneilen Monomeren FM am Polymerisat P aus dem die Beschichtung besteht liegt im allgemeinen bei mindestens 0,1 Gew.-%, vorzugsweise bei 0,1 50 Gew.-%, kann aber gegebenenfalls bis gegen 100 Gew.-% gehen.
Bei dem oder den funktioneilen Monomeren FM handelt es sich um solche mit einer Glycidylgruppe, beispielsweise der Formel
CH2 = C - X - (A)n) - CH2 - CH - CH2
worin R^ für Wasserstoff oder Methyl
0 O
X für -CN - ; -C-O- oder -CH2O -
A für eine Gruppe -CH2 CHOH- und &eegr; für null oder eins steht.
Genannt seinen insbesondere das Glycidylacrylamid und -
methacrylamid (X = -C-NH ; H = 0, R = CH3, H), daneben der Allylglycidylether (X = CH2O-, &eegr; = 0) und das Anlagerungsprodukt der (Meth)acrylsäure an 1,4-
0
U
Butandioldiglycidylether (X = -CO-, &eegr; = 1)
Als weitere Monomerbestandteile seien solche der Formel II
CH2 = C - COOR
II
worin R1^ für Wasserstoff oder Methyl und R für einen AlJcylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl und Ethyl steht, genannt.
Als weitere Monomerbestandteile am Polymerisat P kommen an sich bekannte, insbesondere überwiegend hydrophile Monomere infrage. Genannt seien beispielsweise Monomere der Formel III
CH2 = C - CONR2R3 III
worin R1 1 Wasserstoff oder Methyl und R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, also unsubstituierte Amide sowie die mit primären und sekundären Aminen gebildeten Amide sowie Verbindungen, bei denen R2 und R3 zusammen mit
dem Stickstoffatom einen, gegebenenfalls ein oder mehrere zusätzliche Heteroatome, insbesondere Stickstoff oder Sauerstoff enthaltenden, gegebenenfalls alkylsubstituierten 5- oder 6-gliedrigen, kohlenstoffhaltigen Ring bilden, infrage. Besonders genannt seien (Meth)-acrylsäureamid, N-Methyl- (bzw. Isopropyl- oder -Butyl)-(meth)-acrylsäureamid, N, N-Dimethyl-(meth)-acrylsäureamid, desweiteren (Meth)acrylsauremorpholid (Sonderfall, in dem der Stickstoff über R2 und R3 Teil eines Rings ist) und N-Vinylpyrrolidon-2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kommt eine filmbildende Dispersion, aufgebaut aus Glycidylmethacrylat, Methacrylamid und Ethylacrylat, beispielsweise im Verhältnis 40 : 10 : Gew.-%, zur Anwendung. Ferner hydroxygruppenhaltige Monomere des Acrylat- oder des Methacrylattyps, insbesondere hydroxygruppenhaltige Ester oder Amide der Acryl- und der Methacrylsäure sowie Alkoxyalkylester- und/oder Amide der Acryl- und der Methacrylsäure sowie weitere hydrophile Monomere, z.B. Vertreter der allgemeinen Formel IV
CH2 = C - CO - [Q - (CH2)r]m - OR4 IV
worin R'i Wasserstoff oder Methyl, R4 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Q Sauerstoff oder eine Gruppe -NR14, worin R14 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, r eine ganze Zahl von 1 bis 3,
vorzugsweise 2, und m eine ganze Zahl von 1 bis 25 bedeuted, mit der Maßgabe, daß, wenn Q für Sauerstoff steht, r nicht gleich 1 sein soll. Besonders genannt sei das Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, 2-Hydroxyethyl(meth)-acrylamid, 2-Hydroxypropyl(meth)-acrylamid, Monoester der (Meth)acrylsäure des Glycerins und anderer Polyole.
Der Anteil der Monomeren II + III + IV kann bei 99,9 bis Gew.-% bezogen auf die Gesamtheit der Monomeren im Polymerisat P liegen, vorzugsweise im Bereich 50 bis 99,9 Gew.-%, wobei die Monomeren der Formel IV die Monomeren der Formel III substituieren könnnen. In der Regel liegt aber der Anteil der hydrophilen Monomeren im Bereich 0 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 12 Gew.-%.
Insgesamt ist darauf zu achten, daß bei der Herstellung der Dispersionen Bedingungen angewendet werden, unter welchen die an sich empfindlichen Epoxyfunktionen nicht angegriffen, insbesondere hydrolysiert werden. Derartige Bedingungen sind in der oben genannten EP 71 704 beschrieben.
Vorzugsweise handelt es sich bei den zum Überziehen der Mikrotiterplatten geeigneten Dispersionen um filmbildende. Dazu ist erforderlich, daß die Filmbildungstemperatur über der Einfriertemperatur liegt (vgl. H. Rauch-Puntigam, Th. Völker Acryl- und Methacry!verbindungen Springer Verlag 1967, S. 329 ff).
Als ein praktisches Auftrageverfahren hat sich erwiesen,
in die Kavitäten käuflicher Mikrotiterplatten, beispielsweise solcher auf Basis Polystyrol eine mit der Kavität korrespondierende Menge - als Anhalt seien 150 jil - der epoxidgruppenhaltigen Dispersion zu pipettieren und diese für kurze Zeit, beispielsweise 5 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Anschließend zieht man die Dispersion vorsichtig z.B. durch Ansaugen mit der Pipette aus den Kavitäten ab und läßt die so partiell mit einem Film überzogene Mikrotiterplatte an der Luft trocknen.
Nach dem Trocknungsvorgang steht die Mikrotiterplatte zur Immobilisierung von biologisch signifikanten Substraten, insbesondere über deren Amino- und/oder Sulfhydrylgruppen zur Verfügung. Diese Substrate können vorteilhaft aus wäßriger Lösung bzw. Suspension zur Immobilisierung gebracht werden. Der Beschichtungsvorgang läßt sich unter Anwendung der einschlägigen technischen Vorrichtung auch automatisieren.
Besonders genannt seien Spacermoleküle z.B. Amino- und Diaminoverbindungen (z.B. NH3, Hydrazin, Diaminopropan, Diaminohydroxypropan, Diaminohexan, Diaminononan, Diaminododecan), Mercaptane, Aminomercaptane, aber auch Antigene [z.B. Peptide und Haptene (Triazine)]. (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 4. Auflage Bd. 21, S. 273 - 310, Verlag Chemie 1982).
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
BEISPIELE Beispiel 1
Beschichtung käuflicher Polystyrol-Mikroiiterplatten mit dem Polymerfilm P
150 jul einer Polymerdispersion aus 40 Gew.-% Glycidylmethacrylat, 50 Gew.-% Ethylacrylat und 10 Gew.-% Methacrylamid werden in die Kavitäten pipettiert und für kurze Zeit bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Dispersion vorsichtig aus den Kavitäten abgezogen und die MTP an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknungsvorgang steht die MTP zur Immobilisierung zur Verfügung.
Beispiel 2
Immobilisierung von Diaminohydroxypropan an epoxyaktivierte Mikrotiterplatte (MTP)
pipettiert je 100 &mgr;&idiagr; einer 10 - 25 %igen (W/V) Diaminoverbindung (gelöst in H2O dest.) in die Kavitäten der epoxyaktivierten MTP
inkubiert 4 h bei Raumtemperatur
wäscht die Kavitäten 6-8 mal mit H2O und trocknet MTP 16 h bei Raumtemperatur.
Beispiel 3
Immobilisierung von Amino-Triazin an epoxyaktivierte MTP
Man pipettiert je 100 ul einer Amino-Triazinlösung (100 g/ml in 0,1 M Carbonatpuffer pH 8,5) in die Kavitäten der epoxyaktivierten MTP
inkubiert 16 h bei Raumtemperatur
- wäscht die Kavitäten 6-8 mal mit H2O und trocknet die MTP 16 h bei Raumtemperatur

Claims (1)

SCHUTZANSPRÜCHE
1. Modifizierte Mikrotiterplatten an sich bekannter Zusammensetzung zur Fixierung von biologisch signifikanten Materialien, die Amino- oder SuIfhydrilgruppen besitzen,
dadurch gekennzeichnet,
daß deren Oberfläche mindestens im Bereich der Kavität eine transparente Polymerbeschichtung besitzt, die eine Vielzahl von Epoxygruppen enthält.
DE9107670U 1991-06-21 1991-06-21 Modifizierte Mikrotiterplatten Expired - Lifetime DE9107670U1 (de)

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DE (1) DE9107670U1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4209064A1 (de) * 1992-03-20 1993-09-23 Vironos Diagnostika Gmbh Vorrichtung zum zufuehren von kleinen fluessigkeitsvolumina auf kleine transparente testfelder und zum absaugen von kleinen fluessigkeitsvolumina von kleinen transparenten, mit fixierten zellen beschichtbaren testfeldern
US8007744B2 (en) 2003-01-17 2011-08-30 Greiner Bio-One Gmbh Sample container for analyses
US9005549B2 (en) 2003-01-17 2015-04-14 Greiner Bio-One Gmbh High throughput polymer-based microarray slide

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE4209064A1 (de) * 1992-03-20 1993-09-23 Vironos Diagnostika Gmbh Vorrichtung zum zufuehren von kleinen fluessigkeitsvolumina auf kleine transparente testfelder und zum absaugen von kleinen fluessigkeitsvolumina von kleinen transparenten, mit fixierten zellen beschichtbaren testfeldern
US8007744B2 (en) 2003-01-17 2011-08-30 Greiner Bio-One Gmbh Sample container for analyses
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