DE69229173T2

DE69229173T2 - Pla2 hemmende verbindungen

Info

Publication number: DE69229173T2
Application number: DE69229173T
Authority: DE
Inventors: Adam Inglis; Kieran Francis Scott; Albert Tseng
Original assignee: Garvan Institute of Medical Research
Current assignee: Scott Kieran Frances Waverley New South Wales
Priority date: 1991-07-04
Filing date: 1992-07-06
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2012-07-07
Also published as: EP0592553A4; US5656602A; JPH07500814A; WO1993001215A1; EP0592553B1; EP0592553A1; DE69229173D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die die enzymatische Aktivität von Phospholipasen A&sub2; (PLA&sub2;s) inhibieren, und sie wird veranschaulicht mit Peptiden, die die Aktivität von Typ-II-PLA&sub2;, insbesondere synoviale PLA&sub2; und Schlangen-PLA&sub2; (Crotalus durissus und Crotalus atrox), inhibieren. Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil diese Peptide enthalten und Behandlungsverfahren, die die Verabreichung dieser Zusammensetzung beinhalten.

Hintergrund der Erfindung

Phospholipasen A&sub2; stellen eine diverse Familie von Enzymen mit zwei Subklassen (Typ I und Typ II) (Fig. 1) dar, basierend auf den Positionen der Disulfidbrücken in den Molekülen, während Bienengift PLA&sub2; eine dritte im wesentlichen andere Klasse von PLA&sub2; darstellt.
Röntgenstrahlkristallographie hat gezeigt, daß die Abschnitte, die die funktionelle Struktur des Enzyms aufbauen, in den Klassen ähnlich sind. Diese Ähnlichkeit ist insbesondere herausstechend, wenn die strukturell verwandten Typ I/II-Enzyme mit dem Bienengiftenzym (2) verglichen werden. PLA&sub2; hydrolysiert die sn-2 Acylesterbindung von Phosphoglyceriden, wodurch die Abgabe von Fettsäureprecursorn von Entzündungseicosanoiden beginnt. Humanes synoviales PLA&sub2; (ein Typ II- Molekül) ist kürzlich isoliert und identifiziert worden (3). Für dasselbe PLA&sub2; ist eine Beteiligung bei der Pathogenese verschiedener entzündlicher Krankheiten bei Menschen angenommen worden, wie etwa rheumatische Arthritis und gramnegativer septischer Schock (7, 8).
Maus, inhibitorische monoklonale Antikörper, die gegen synoviales PLA&sub2; erzeugt wurden, haben präklinische Wirksamkeit gezeigt. Entsprechend besteht ein Interesse an der Entwicklung von Zusammensetzungen, die die enzymatische Aktivität von PLA&sub2; hemmen.
Tryptischer Verdau von humanem synovialem PLA&sub2; und anschließende Trennung und die Analyse von Fragmenten durch HPLC ergab ein sehr interessantes und unerwartetes Ergebnis für eine der Spitzen, da sie zwei Peptide enthielt. Eines ein Heptatpepid (das N-terminale Peptid) und das andere ein Pentapeptid, FLSYK (entsprechend den Resten 70 bis 74 in anderen PLA&sub2;-Molekülen, basierend auf dreidimensionaler struktureller "Homologie" von Säuger-PLA&sub2;-Aminosäuresequenzen (1, 4)). Das Pentapeptid wurde in einer früheren Elution gefunden, einer voll aufgelösten Spitze (wie erwartet). Da das HPLC-System verfehlte, diese zwei Peptide in der späteren Spitze vollkommen aufzutrennen, weisen diese Daten daraufhin, daß die zwei Peptide eine starke Affinität füreinander haben und führte zu Fragen wie deren struktureller Bedeutung.
Röntgenstrahldiffraktionsstudien (5, 6) haben gezeigt, daß sich Aminosäurereste in den zwei Peptiden nahe der aktiven Stelle des Enzyms befinden und sie bei der Bildung oder Stabilisierung des Kanals wichtig sind, in den das 1,2-Diacyl-3-sn-phosphoglyceridsubstrat präzise für die Hydrolyse der 2-Esterbindung positioniert wird. Die erste Schleife der N- terminalen Helix (Reste 1 bis 12) wird stabilisiert durch ein Netzwerk von Wasserstoffbrücken, die durch den N-Terminus und Rest 4, Elemente von Resten 69 bis 71 bereitgestellt werden und einer wasservermittelten Bindung zu den katalytischen Resten. Reste 2 und 5 formen den "Boden" des Kanals, Rest 9 bildet die rechte Wand und die linke Wand wird durch Rest 69 (gewöhnlich entweder Tyrosin oder Lysin) gebildet, von dem vorausgesagt wird, daß es sich, nachdem das Substrat angedockt hat, bewegt und eine Wasserstoffbrücke mit dem sn-3-Phosphat des Substrates bildet. Der chemische Beweis der starken Wechselwirkungen zwischen dem Heptapeptid und dem Pentapeptid führte zu der Spekulation, daß die PLA&sub2;- Aktivität in Gegenwart von einem dieser Peptide gehemmt werden könnte.
Unter Verwendung von synthetischer Peptidchemie haben die Erfinder das Pentapeptid FLSYK hergestellt und gezeigt, daß seine Zugabe zu dem Assaymedium die Enzymaktivität von humanem synovialem PLA&sub2; vermindert (Fig. 2a). Weiterhin wurde gezeigt, daß das Pentapeptid das die 70 bis 74 Region von Schlangen-PLA&sub2; (WDIYR) besitzt auch die Aktivität von Schlangen-PLA&sub2; hemmt (siehe Fig. 3b). Man nimmt an, daß diese Hemmung durch die Peptidbindung zu dem aminoterminalen Ende des Enzyms vermittelt wird und die Reaktion entweder durch Blockieren des Substratzugangs zu dem hydrophoben Kanal blockiert wird oder ausreichendes Verwinden der Struktur, um eine korrekte Orientierung des Substrats zu verhindern.

Kurze Darstellung der Erfindung

Demgemäß besteht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt in einem linearen oder cyclischen Peptid von mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von humanem synovialem PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist:
A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;
worin A&sub1;, für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;
A&sub2; für F oder Y oder W steht oder abwesend ist;
A&sub3; für L oder V oder I oder M steht;
A&sub4; für S oder T steht;
A&sub5; für Y oder F oder W steht;
A&sub6; für K oder R oder H steht oder abwesend ist;
A&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Pentapeptid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht A&sub1; für H und A&sub7; für OH.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid FLSYK oder KFLSY und am meisten bevorzugt FLSYK.
In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einem linearen oder cyclischen Peptid von mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von Crotalus durissus PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist:
B&sub1;-B&sub2;-B&sub3;-B&sub4;-B&sub5;-B&sub6;-B&sub7;
worin B&sub1; für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;
B&sub2; für W oder F oder Y steht oder abwesend ist;
B&sub3; für D oder E steht;
B&sub4; für I oder V oder L oder M steht;
B&sub5; für Y oder F oder W steht;
B&sub6; für R oder K oder H steht oder abwesend ist;
B&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Pentapeptid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht B&sub1; für H und B&sub7; für OH.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Pentapeptid WDIYR.
In einem dritten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem linearen oder cyclischen Peptid von mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von Crotalus atrox PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist:
C&sub1;-C&sub2;-C&sub3;-C&sub4;-C&sub5;-C&sub6;-C&sub7;
worin C&sub1; für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;
C&sub2; für T oder S steht oder abwesend ist;
C&sub3; für V oder I oder L oder M steht;
C&sub4; für S oder T steht;
C&sub6; für Y oder F oder W steht;
C&sub6; für T oder S steht oder abwesend ist;
C&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Pentapeptid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung steht C&sub1; für H und C&sub7; für OH.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das Peptid TVSYT.
Wie für den Fachmann auf diesem Gebiet aus der hierin gemachten Offenbarung klar werden wird, veranschaulichen die Peptide des ersten und zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung wie die enzymatische Aktivität von anderen PLA&sub2;s gehemmt werden könnte. Diese Hemmung kann erreicht werden durch Verbindungen, die mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des PLA&sub2;-Moleküls in einer Weise wechselwirken, daß der Kanal in den das Phospholipid vor der katalytischen Spaltung diffundiert, destabilisiert wird.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einem vierten Aspekt ein Peptid, welches die enzymatische Aktivität von Phospholipase A&sub2; hemmt, wobei die Verbindung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mit der N- terminalen Aminosäuresequenz der Phospholipase A&sub2; derart wechselwirkt, daß der Kanal, in welchen das Phospholipid vor der katalytischen Spaltung diffundiert, entweder blockiert oder destabilisiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das PLA&sub2; humanes PLA&sub2;.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Peptid die Aminosäuresequenz FLSYK oder KFLSY.
Wie dem Fachmann auf diesem Gebiet klar werden wird, haben die Erfinder gefunden, daß die enzymatische Aktivität einer Phospholipase A&sub2; durch ein Peptid gehemmt werden kann, welches eine Sequenz aufweist, die mit einer Sequenz korrespondiert, die aus der Region der Reste 69 bis 75 der Phospholipase 2 ausgewählt ist.
Demgemäß besteht die vorliegende Erfindung in einem fünften Aspekt in einem Peptid aus 5 oder 6 Resten, welches die enzymatische Aktivität einer Phospholipase A&sub2; hemmt, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit einer Sequenz korrespondiert, die aus dem Bereich von Resten 69 bis 75 der Phospholipase A&sub2; ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ein Pentapeptid und hat eine Aminosäuresequenz, die mit der Sequenz von Rest 69 bis 73 oder 70 bis 74 der Phospholipase A&sub2; korrespondiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Phospholipase A&sub2; humane Phospholipase A&sub2;.
In einem sechsten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer Person, die an septischem Schock, rheumatischer Arthritis und/oder anderen Entzündungskrankheiten leidet, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch verträgliche Menge Peptid oder Verbindung des ersten, vierten oder fünften Aspektes der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen sterilen Träger umfaßt.
In einem siebten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zur Behandlung des septischen Schocks und/oder von Entzündungskrankheiten in einer Person, das die Verabreichung der Zusammensetzung des sechsten Aspekts der vorliegenden Erfindung an der Person umfaßt.
Es wird durch den Fachmann auf dem Gebiet anerkannt werden, daß eine Zahl von Modifikationen in den Peptiden der vorliegenden Erfindung gemacht werden kann, ohne die biologische Aktivität des Peptids schädlich zu beeinflussen. Dies kann erreicht werden durch verschiedene Veränderungen, wie etwa Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht konservativ in der Peptidsequenz, wo solche Veränderungen die biologische Aktivität des Peptids nicht im wesentlichen vermindern. Bei konservativen Substitutionen sind die beabsichtigten Kombinationen:
G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H und F, Y, W.
Es kann auch möglich sein, verschiedene Gruppen zu dem Peptid der vorliegenden Erfindung hinzuzufügen, um Vorteile, wie etwa erhöhte Wirksamkeit oder verlängerte Halbwertszeit in vivo zu erreichen, ohne die biologische Aktivität des Peptids im wesentlichen zu vermindern.
Es ist beabsichtigt, daß solche Modifikationen des Peptids der vorliegenden Erfindung, die nicht zu einer Verminderung der biologischen Aktivität führen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fällt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Damit die Art der vorliegenden Erfindung klarer verstanden werden kann, werden bevorzugte Formen davon nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, in denen:
Fig. 1 Säuger-PLA&sub2; Aminosäuresequenzen zeigt.
Fig. 2: Hemmung des humanen PLA&sub2; unter Verwendung des Peptids FLSYK zeigt.
Fig. 2(a) erhalten wurde unter Verwendung eines Peptids aus einem tryptischen Verdau des Enzyms (n = 7 Kontrolle, Inhibitor), 2(b) und 2(c) mit einem synthetischen Peptid n = 11 Kontrolle Inhibitor Kontrolle bzw. Inhibitor. Das synthetische Peptid hemmt auch das Enzym in septischem Schockserum [Fig. 2 (c)].
Fig. 3: Dosiswirkungskurven, die ansteigenden Inhibitor mit ansteigender Menge von FLSYK und humanem rekombinanten Typ II PLA&sub2; (3a Inhibitor Kontrolle) und in PLA&sub2; in septischem Schockserum (3b Inhibitor Kontrolle) zeigt.
Fig. 4: Dosiswirkungskurven für FLSYK (4a PLA&sub2; Kontrolle) und WDIYR (4b Schlange (II) Kontrolle) für humanes PLA&sub2; bzw. Schlangen (Crotalus Durissus) PLA&sub2;. Beide Peptide besetzen ähnliche Stellen in ihren Elternproteinen und zeigen hemmende Eigenschaften für die Enzymaktivität.
Fig. 5 zeigt eine Lineweaver-Buspe-Darstellung, die die Hemmung von PLA&sub2; durch FLSYK (PLA&sub2; 10 ug FLSYK, 1 ug FLSYK) zeigt.

Hemmung von PLA&sub2;-Aktivität

Proteine und Peptide

1. Synoviales PLA&sub2;, Schlangen-PLA&sub2; (Crotalus Durissus und Crotalus ATR?)
2. Phe-Leu-Ser-Tyr-Lys (FLSYK)
3. Acetyl-Phe-Leu-Ser-Tyr-Lys-Methylester (Ac-FLSYK-OMe)
4. Trp-Asp-Ile-Tyr-Arg (WDIYR)
5. Lys-Phe-Leu-Ser-Tyr (KFLSY)
6. Thr-Val-Ser-Tyr-Thr (TVSTT)
7. Phe-Lys-Thr-Tyr-Ser (FKTYS)
8. Thr-Glu-Ser-Tyr-Ser (TESYS)
9. Gly-Thr-Lys-Phe-Leu-Ser-Tyr-Lys-Phe-Ser-Asn
(GTKFLSYKFSN)
10. Lys-Phe-Leu-Ser-Tyr-Tyr (KFLSYY)
11. Phe-Leu-Ser-Tyr (FLSY)
12. Phe-Leu-Ser-Tyr-Lys-NH&sub2;. (FLSYK-NH&sub2;)

Tryptischer Verdau von PLA&sub2;:

Ungefähr 100 ug PLA&sub2; wurden in 300 ul 1 MTris pH 8,0 aufgelöst, 15 ul Trypsinlösung (10 ul 1M Tris pH 8) wurden zugegeben und die Peptid/Trypsin-Lösung wurde für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. 5 ul unverdünntes TFA wurden verwendet, um den pH zu erniedrigen und den Verdau zu stoppen. Die gesamte Lösung wurde einer Kapillar- Hochleistungschromatographie (HPLC)-Fraktionierung unterzogen.

Kapillar-Hochleistungschromatographie (HPLC)-Fraktionierung:

Ein ABI Kapillar-Hochleistungsspritzenpumpsystem Modell 140 wurde verwendet. Die Detektorwellenlänge wurde auf 220 nm bei 0,5 aufs. eingestellt. Ein RP-300 1 · 100 mm wurde verwendet. Die Fraktionierung wurde durchgeführt, indem ein linearer Puffergradient von 0,1% TFA in Wasser bis 0,1% TFA, 70% Acetonitril in Wasser für 60 Minuten gefahren wurde. Die aus den Fraktionen identifizierten Aminosäuresequenzen waren:
Fraktion #2 (K)YQYYSNK
Fraktion #4 FLSYK
Fraktion #5 FLSYK
NLVNFHR
Fraktion #7* EALLSYGFYG(C)H(C)GVGGR
(C)(C)VTHD(C)(C)YK
SQL(C)E(C)DK
IT(C)AK
AAAT(C)FAR
Fraktion #9 EAALSYGFYG
* Peptide werden zusammengehalten durch Cystinylbindungen; () bezeichnet vorgeschlagene Bestimmungen.

Peptidsynthese:

Die Peptidsynthese wurde in einem ABI Peptid Synthesiser Modell 430A durchgeführt. T-Boc Chemie wurde verwendet. HF Abspaltung wurde verwendet, um das Peptid von der Festphase zu trennen.

PLA&sub2; Serienverdünnung:

Kontrolle: 10 ul einer Standard PLA&sub2; Lösung wurde mit einer Konzentration von 120 ng/10 ul in 20 mM Tris pH 8 verwendet. Eine Serienverdünnung wurde durch Zugabe von 20 mM Tris pH 8 Puffer auf ein Endvolumen von 20 ul durchgeführt.
Inhibitorlösung: Das Pentapeptid wurde gewöhnlich in 1 ul 0,1% TFA- Lösung verdünnt und weiter wurden 9 ul 20 mM Tris pH 8 zugegeben. Diese Lösung wurde immer um pH 7 bis 8 gehalten. 10 ul dieser Inhibitorlösung wurden in 10 ul PLA&sub2; Lösung zugegeben. Inkubation: Alle Proben wurden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert.
PLA&sub2;-Lösung: Eine Standard-PLA&sub2;-Lösung wurde in 20 mM Tris pH 8,0 hergestellt, so daß 10 ul 50% (ungefähr) Hydrolyse ergeben.
Pentapeptidlösung: Eine Standardpentapeptidlösung wurde hergestellt auf 10 mg/ml in 0,1% TFA. 100 ul wurden herausgenommen und mit 900 ul 20 mM Tris pH 8 neutralisiert. 10 ul (10 ug wurden für eine Dosiswirkungskurve zusammen mit 10 ul der PLA-Lösung genommen). Eine Serienverdünnung wurde durchgeführt mit 10 ul Aliquots mit 20 mM Tris pH 8.

Septische Schockexperimente:

Septisches Schockserum wurde verdünnt 1/100 für Dosiswirkungsexperimente und konzentriert für Serienverdünnung verwendet. Das Endreaktionsvolumen lag immer im Verhältnis von 10 ul Serum/10 ul Tris oder Pentapeptidlösung vor.

Aktivitätsassay:

Die PLA&sub2;-Aktivität wurde unter Verwendung eines gemischten Micellenphosphatidylethanolamin (PE)/Natriumdeoxycholatassays gemessen, modifiziert von einem Verfahren, das von Seilhamer et al (1) beschrieben wurde. Das PE-Substrat wurde durch Lösen von frisch getrocknetem PE (Amersham, Bucks, England) in 2% DOC, anschließendes Verdünnen auf 0,22 nmol PE und 0,04% DOC pro Probe in Assaypuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 2 mM Calciumchlorid, 150 mM Natriumchlorid, 0,04% DOC) hergestellt. Die Probe wurde hergestellt durch Mischen von 10 ul des Testmaterials mit 10 ul 10 mM Tris-HCl pH 7,4 und belassen bei 37ºC für 10 Minuten. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von 25 ul vorgewärtem Substrat und beendet durch Zugabe von 10 ul 100 mM EDTA. Das Reaktionsgemisch (30 ul wurde in Punkten aufgebracht und getrocknet auf Siliciumdioxid TLC-Platten (Merck, Darmstadt, Westdeutschland) und die Platten wurden einer Chromatographie unterzogen unter Verwendung von Chloroform : Methanol : Essigsäure (90 : 10 : 1) als Lösungsmittel. Die getrockneten Platten wurden über Nacht Kodak X OMAT AR Film ausgesetzt. Radioaktivität am Anfang und von der freigesetzten Arachidonsäure wurde gezählt und die prozentuale Hydrolyse durch PLA&sub2; bestimmt.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die mit Peptiden erhalten wurden, die Resten 70-74 von verschiedenen Typ I und Typ II Enzymen entsprechen, sind in Tabelle 1 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß beträchtliche Speziesspezifität besteht, so daß Peptide, die gegen eine Spezies von PLA&sub2; aktiv sind, nicht aktiv waren gegen andere untersuchte Spezies. Zusätzlich waren keine der untersuchten Peptide aktiv gegen PLA&sub2;- Typ 1. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß Hemmung durch Peptide von dieser Region von PLA&sub2; (70-74) scheinbar nur in Typ-II-Enzymen auftritt.
Von Peptid 5 wurde gezeigt, daß es ein aktiver Inhibitor von humanem Typ II PLA&sub2; ist, jedoch Peptide 7, 8, 9, 10, 11 und 12 alle negativ waren. Dies legt nahe, daß das Peptid eine bestimmte Größe aufweisen muß, um Hemmung zu zeigen und daß eine Hemmung nur auftreten wird mit den spezifischen Sequenzen, die von dem spezifischen Typ II-Enzym, das untersucht wurde, abgeleitet sind. TABELLE 1
Aufgrund der obigen Ergebnisse glauben die Erfinder, daß kurze Peptide aus der 70 bis 74-ten Region höchstwahrscheinlich mit dem Substrat um den Zugang zu dem aktiven Zentrum konkurrieren werden und zu Inhibitorwirkungen führen. Man nimmt an, daß Variationen der Länge der Peptide, die in diesen Regionen vorhanden sind, zu einer Optimierung der Hemmung führen kann.
Das Pentapeptid besitzt offensichtlich helikale Struktur (ungefähr eineinhalb Windungen). Da die helikalen Strukturen durch Wasserstoffbrücken zwischen dem C = O eines Restes und NH des vierten Restes entlang der Kette stabilisiert werden, kann die Struktur des Pentapeptids etwas unstabil sein und empfindlicher gegenüber der Umgebung als ein längeres helikales Molekül. Auf der anderen Seite könnte man annehmen, daß der Bereich der Größen, der wirksam ist, aufgrund des begrenzten Zugangs zu dem aktiven Zentrum von PLA&sub2; begrenzt sein wird.
Man nimmt an, daß der gewöhnliche Austausch eines hydrophoben Restes, z. B. Leu zu Ile, Ser zu Thr auch die inhibitorische Wirkung belassen könnte. Das heißt, ähnliche Aminosäurereste entweder in Ladung oder Hydrophobizität könnten möglicherweise ausgetauscht werden mit solchen in den Modellen ohne die spezifische Wechselwirkung der zwei Regionen zu zerstören. Da Helix-Helix-Wechselwirkungen wahrscheinlich der Grund für die inhibitorische Wirkung sind, konnte eine geringe Erhöhung in der Länge dieser Peptide diese Struktur stabilisieren.
Die in diesen Studien erhaltenen Ergebnisse legen auch nahe, daß monoklonale Antikörper gegen Epitope gemacht werden könnten, die ein oder beide der Peptidregionen enthalten, um ein ähnliches Ergebnis auf die PLA&sub2;-Aktivität bewirken. Solche monoklonalen Antikörper könnten unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, hergestellt werden.
Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, daß das Prinzip der vorliegenden Erfindung auch Anwendung finden wird für die Hemmung der Aktivität von anderen Enzymen als PLA&sub2;, z. B. Neuraminadaseenzym des Influenza-Virus oder Neuropeptid Y. Man kann vorhersagen, daß da biologisch aktive Proteine im allgemeinen eine aktive Konformation aufweisen, die durch Wechselwirkungen mit den umgebenden Aminosäureketten stabilisiert wird, daß Peptide nahe dazu und die in der Lage sind mit den Resten innerhalb des aktiven Zentrums wechselzuwirken, die Aktivität des Enzyms hemmen werden. Es wird darauf abgezielt, daß solche anderen Peptide in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Durch den Fachmann auf dem Gebiet wird anerkannt werden, daß viele Variationen und/oder Modifikationen bei der Erfindung wie sie in den spezifischen Ausführungsformen gezeigt wurde, durchgeführt werden können, ohne von dem Gedanken oder Umfang der Erfindung in ihrer breiten Beschreibung abweichen. Die vorliegenden Ausführungsformen sollen deshalb in aller Hinsicht als Veranschaulichung und nicht als Begrenzung angesehen werden.

LITERATUR

1. Johnson L. K. et al., Advance in Exp. Med & Biol; PLA 2 Role and Function in Inflammation, P. Y-K Wong ed, Plenum Press 17-34 (1991).
2. Scott D. L. et al. Science 250, 1563 (1990).
3. Seilhamer J. J. et al., J. Biol. Chem. 264, 5335 (1989).
4. Renetseder R. et al. J. Biol Chem 260, 11627 (1985)
5. Scott D. L. et al. Science 250, 1541 (1990).
6. White S. P. et al. Science 250, 1560 (1990).
7. Prozanski W. et al. J. Rheumatol., 15: 1351-1355 (1988)
8. Vadas P., J. Lab. Clin. Med., 104: 873-881 (1984)

Claims

1. Peptid, welches die enzymatische Aktivität von Typ II Phospholipasen A&sub2; hemmt, wobei das Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich an die N- terminale Aminosäuresequenz der Phospholipase A&sub2; derart bindet, daß der Kanal, in welchen das Phospholipid vor der katalytischen Spaltung diffundiert, entweder blockiert oder destabilisiert wird.

2. Peptid nach Anspruch 1, in welchem die PLA&sub2; humane PLA&sub2; ist.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem das Peptid ein Pentapeptid ist.

4. Lineares oder cyclisches Peptid mit mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von humanem synovialem PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist:

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;

worin A&sub1; für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;

A&sub2; für F oder Y oder W steht oder abwesend ist;

A&sub3; für L oder V oder I oder M steht;

A&sub4; für S oder T steht;

A&sub5; für Y oder F oder W steht;

A&sub6; für K oder R oder H steht oder abwesend ist;

A&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.

5. Peptid nach Anspruch 4, in welchem das Peptid ein Pentapeptid ist.

6. Peptid nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, in welchem A&sub1; für H steht und A&sub7; für OH steht.

7. Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem das Peptid FLSYK oder KFLSY ist.

8. Peptid mit 5 oder 6 Resten, welches die enzymatische Aktivität einer Phospholipase A&sub2; hemmt, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die einer Sequenz entspricht, die aus dem Bereich der Reste 69- 75 der Phospholipase A&sub2; ausgewählt ist.

9. Peptid nach Anspruch 8, in welchem das Peptid ein Pentapeptid ist und eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Sequenz der Reste 69-73 oder 70- 74 der Phospholipase A&sub2; entspricht.

10. Peptid nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, in welchem die Phospholipase A&sub2; humane Phospholipase A&sub2; ist.

11. Lineares oder cyclisches Peptid mit mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von Crotalus durissus-PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist

B&sub1;-B&sub2;-B&sub3;-B&sub4;-B&sub5;-B&sub6;-B&sub7;

worin B&sub1; für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;

B&sub2; für W oder F oder Y steht oder abwesend ist;

B&sub3; für D oder E steht;

B&sub4; für I oder V oder L oder M steht;

B&sub5; für Y oder F oder W steht;

B&sub6; für R oder K oder H steht oder abwesend ist;

B&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.

12. Peptid nach Anspruch 11, in welchem B&sub1; für H steht und, B&sub7; für OH steht.

13. Peptid nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, in welchem das Peptid WDIYR ist.

14. Lineares oder cyclisches Peptid mit mindestens 5 Resten, welches die enzymatische Aktivität von Crotalus atrox-PLA&sub2; hemmt, wobei das Peptid die folgende Formel aufweist:

C&sub1;-C&sub2;-C&sub3;-C&sub4;-C&sub5;-C&sub6;-C&sub7;

worin C&sub1; für H oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht;

C&sub2; für T oder S steht oder abwesend ist;

C&sub3; für V oder I oder L oder M steht;

C&sub4; für S oder T steht;

C&sub5; für Y oder F oder W steht;

C&sub6; für T oder S steht oder abwesend ist

C&sub7; für OH oder eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren steht.

15. Peptid nach Anspruch 14, in welchem C&sub1; für H steht und C&sub7; für OH steht.

16. Peptid nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, in welchem das Peptid TVTSYT ist.

17. Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung des Subjekts, das an rheumatoider Arthritis, septischem Schock und/oder entzündlicher Erkrankung leidet, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht, und einen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Träger umfaßt.

18. Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, septischem Schock und/oder entzündlicher Erkrankung.