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Die Erfindung betrifft eine stabilisierte Zubereitung humaner monoclonaler Antikörper
und betrifft insbesondere eine Zubereitung humaner monoclonaler Antikörper, die eine
hervorragende Stabilität im Lösungszustand, im Gefriertrocknungszustand und im Gefrierzustand,
insbesondere eine Wiederlösungs-(Wiederherstellungs-)Stabilität nach Gefriertrocknen zeigt.
Stand der Technik
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Seit 1975 von Koehler und Milstein [Koehler, G., Milstein, C., Nature 256 495 (1975)]
ein Verfahren zur Erzeugung monoclonaler Antikörper durch ein gentechnologisches Verfahren
vorgeschlagen wurde, wurde ein Weg eröffnet, um eine große Menge eines monoclonalen
Antikörpers als einen homogenen Antikörper zu erzeugen, und derartige monoclonale Antikörper
sind in großem Maße auf den Gebieten der Medizin und Biologie verwendet worden.
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Jüngst wurden humane monoclonale Antikörper in klinischen Tests bei Menschen
verwendet, und die Aufmerksamkeit richtete sich insbesondere auf das Gebiet der
Antitumorgerichteten Heilmittel. Jedoch besitzen gereinigte humane monoclonale Antikörper als
Zubereitung die unerwünschte Eigenschaft, daß sie in einem Lösungszustand oder zum Zeitpunkt des
Wiederlösens (der Wiederherstellung) nach Gefriertrocknen leicht aggregieren und präzipitieren
und die Entwicklung von monoclonalen Antikörperzubereitungen, die eine derartige
unerwünschte Eigenschaft nicht besitzen und stabilisiert sind, ist wünschenswert.
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Zum anderen wurden bisher als Verfahren zur Stabilisierung von Antikörpern
(Immunoglobuline) bisher folgende Verfahren vorgeschlagen: ein Verfahren, das die Zugabe von
Serumalbumin oder Serumalbumin mit Glycin und/oder Mannit zu einem sulfonierten
Immunoglobulin umfaßt (japanische Patentveröffentlichung Nr. 20965/1987); ein Verfahren, das die
Zugabe einer vergleichsweise großen Menge eines mehrwertigen Alkohols umfaßt (japanische
offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 88197/1988); ein Verfahren zur Stabilisierung eines
polyclonalen Antikörpers unter Verwendung von D-Mannit, was zu einer relativ geringen Löslichkeit
des Antikörpers nach Gefriertrocknen führt (JP-A-56/127320); ein Verfahren zur Stabilisierung
hochgereinigter Proteine, wie z. B. muriner monoclonaler Antikörper, das die Zugabe von
Kohlenhydraten, wie z. B. Mannit, während des Reinigungsverfahrens umfaßt (EP-A-0 410 207); ein
Verfahren zur Stabilisierung polyclonaler Antikörper unter Verwendung von Gluciden, wie z. B.
Glucose oder Fructose (JP-A-53/47515); ein Verfahren, das die Zugabe von Dextran umfaßt
(japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 225320/1988). Es ist jedoch mit den bisher
vorgeschlagenen Verfahren unmöglich, die oben genannte unerwünschte Eigenschaft humaner
monoclonaler Antikörperzubereitungen, insbesondere Zusammensetzungen, die CLN-IgG, der
durch Hybridoma CLN H11 (ATCC HB 8307) (im folgenden als "CLN-IgG" bezeichnet)
hergestellt werden kann, umfassen, in ausreichender Weise zu verbessern.
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Die Erfinder haben nun gefunden, daß die Stabilisierung einer humanen monoclonalen
Antikörperzusammensetzung, die CLN-IgG umfaßt, insbesondere die Stabilität gegen
Aggregation und Fällung zum Zeitpunkt der Wiederlösung nach Gefriertrocknen des humanen
monoclonalen Antikörpers CLN-IgG, in bemerkenswerter Weise durch Zugabe einer spezifizierten
kleinen Menge Mannit zum humanen monoclonalen Antikörper CLN-IgG erhöht wird. Die
Erfindung wurde vervollständigt.
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Somit wird erfindungsgemäß eine stabilisierte humane monoclonale
Antikörperzusammensetzung bereitgestellt, die den humanen monoclonalen Antikörper CLN-IgG und von 1 bis
20 mg D-Mannit pro 1 mg CLN IgG umfaßt.
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Der humane monoclonale Antikörper CLN-IgG kann in Zubereitungen zur praktischen
Verwendung als Arzneimittel, etc. formuliert werden. Als Verfahren zur Herstellung einer
Zubereitung kann z. B. ein Verfahren erwähnt werden, das je nach Notwendigkeit die folgenden
Stufen umfaßt: Konzentrieren des gereinigten humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG durch
Ultrafiltration, Natriumsulfatfraktionieren oder dergleichen, Substitution einer Pufferlösung, die
für die Zubereitung geeignet ist, mittels eines Gelfiltrationsverfahrens, in einigen Fällen ein
weiteres Einstellen der Konzentration, Durchführen einer Filtrationssterilisierung, und
Gefriertrocknen.
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Bei der Herstellung einer stabilisierten humanen monoclonalen
Antikörperzusammensetzung, umfassend CLN IgG, ist es möglich, D-Mannit als Stabilisator in jeder der oben genannten
Herstellungsstufen der Zubereitung zuzugeben; im allgemeinen ist es jedoch günstig, D-Mannit
in eine humane monoclonale Antikörperzusammensetzung, die CLN-IgG enthält, durch ein
Dialyseverfahren nach Substitution durch eine Pufferlösung, die für eine Zubereitung geeignet ist,
durch ein Gelflitrationsverfahren einzuführen. Die Konzentration von D-Mannit in einer D-
Mannit-Lösung, die für das Dialyseverfahren verwendbar ist, ist in Abhängigkeit der
Konzentration einer humanen monoclonalen Antikörperlösung, die das zu dialysierende CLN-IgG enthält,
verschieden. Z. B. ist die Konzentration günstigerweise von im allgemeinen 0,1 bis 2%
(Gew./Vol.), bevorzugt 0,5 bis 1,5% (Gew./Vol.), für den Fall, daß die Konzentration des
humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG 1 mg/ml beträgt. Die Konzentration liegt
günstigerweise im Bereich von im allgemeinen 0,1 bis 10% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,5 bis 5%
(Gew./Vol.), für den Fall, daß die Konzentration des humanen monoclonalen Antikörpers CLN-
IgG 5 mg/ml beträgt.
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Der Gehalt an D-Mannit kann im Bereich von 1 bis 20 mg, vorzugsweise 5 bis 15 mg,
pro 1 mg des humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG in der Zubereitung liegen. Ist der
Gehalt an D-Mannit geringer als 1 mg, kann ein gewünschter ausreichender Stabilisierungseffekt
nicht erhalten werden, und wenn er größer als 20 mg ist, ist umgekehrt eine Agglutination des
Antikörpers zu beobachten.
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Weiterhin wurde ermittelt, daß die Stabilität der Zubereitung weiterhin unter
Verwendung von Glycin zusätzlich zu D-Mannit erhöht wird. Die Verwendungsmenge von Glycin ist zu
der Zeit nicht streng beschränkt, es ist jedoch günstig, daß die Verwendungsmenge im Bereich
von im allgemeinen 0,005 bis 0,2 mol, vorzugsweise 0,1 bis 0,15 mol pro 1 mg des humanen
monoclonalen Antikörpers CLN-IgG liegt.
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Die Zugabe von Glycin zu der erfindungsgemäßen Zubereitung kann gleichzeitig mit der
Zugabe von D-Mannit erfolgen.
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Weiterhin ist es falls notwendig möglich, eine geeignete Menge eines Phosphatsalzes
oder dergleichen zur Einstellung des pHs der erfindungsgemäßen Zubereitung zuzugeben.
Beispiel
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Diese Erfindung wird weiter in spezifischer Weise unten gemäß der Beispiele
beschrieben.
Referenzbeispiel 1: Herstellung des humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG
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Gefrorene Zellen von Antikörper-produzierenden Zellen [humanes · humanes Hybridom
= CLN H11 (ATCC HB 8307)] wurden aufgetaut, und die aufgetauten Zellen wurden mit einem
Basismedium gewaschen und dann unter Verwendung eines Basismediums, das 10% fötales
Rinderserum enthielt, kultiviert. Nach der Kultur wurden die Zellen diesem Kulturmedium
entnommen und erneut in einem serumfreien Medium (Hybrity-II, hergestellt von Hill Biocenter
Co., Kasai-shi, Hyogo-ken, Japan) kultiviert, und dann wurde der Maßstab durch eine
Chargenkultur im gleichen Medium vergrößert. Die Zellen wurden aus 40 Litern des entstandenen
serumfreien Kulturmediums entfernt, und die entstandene Lösung wurde auf etwa 5 Liter durch
Ultrafiltration konzentriert (PROSTAKTM, hergestellt von Millipore, Co.).
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Das Aussalzen wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu dem Konzentrat
durchgeführt, so daß die Endkonzentration in der gesättigten Lösung 70% betrug, um ein
Ammoniumsulfatpräzipitat zu erhalten.
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Dieses Ammoniumsulfatpräzipitat wurde zweimal gegen 20 Liter jeweils einer 10 mM
Phosphatpufferlösung (im folgenden als PB bezeichnet) für insgesamt 24 Stunden dialysiert und
dann an eine Kationenaustauschsäule adsorbiert (S-Sepharose, fast flow, hergestellt von
Pharmacia Co.). Das an die Säule adsorbierte Material wurde in ausreichender Weise mit 10 mM PB
gewaschen und dann durch einen NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5 M in 10 mM PB
eluiert, um eine IgG-Rohfraktion zu erhalten.
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Diese wurde an eine Protein-A-Säule (hergestellt von Repligen Co.) adsorbiert und nach
ausreichendem Waschen mit 10 mM PB + 1 M NaCl wurde mit 0,1 M Glycin-Salzsäure + 1 M
NaCl (pH 3,0) eluiert.
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Das entstandene IgG wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung
(Sättigungskonzentration 50%) konzentriert, und das Konzentrat wurde einer Gelflitration unter Verwendung einer
Sephacryl S-300-Säule (hergestellt von Pharmacia Co.), die mit 10 mM phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (im folgenden als PBS bezeichnet) equilibriert worden war,
unterzogen, um gereinigtes IgG zu erhalten.
Referenzbeispiel 2: Herstellung des Stabilisators, etc.
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(1) Die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) wurde durch Auflösen von
1,15 g Na&sub2;HPO&sub4; (wasserfrei), 8,0 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4; und 0,2 g KCl in etwa 900 ml
destilliertem Wasser hergestellt. Der pH wurde auf 7,2 bis 7,4 eingestellt, und es wurde
eine Gesamtmenge von 1,0 Litern hergestellt.
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(2) Als physiologische Kochsalzlösung zur Injektion wurde eine Kochsalzlösung verwendet,
die von Otsuka Pharmaceutical Co. hergestellt wurde.
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(3) Die Mannitlösungen wurden durch Verdünnung von 20% (Gew./Vol.) D-
Mannitinjektion, hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., mit destilliertem Wasser zu
Konzentrationen von 1%, 5% bzw. 10% (Gew./Vol.) hergestellt.
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(4) 1% Mannit + physiologische Kochsalzlösung zur Injektion wurde durch Lösen von D-
Mannit in physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion hergestellt, um eine
Konzentration von 1% (Gew./Vol.) herzustellen.
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(5) Die Glycin-Mannit-Lösung wurde durch Lösen von 22,5 g Glycin, 50 ml 20% D-
Mannitlösung und 1,56 g NaH&sub2;PO&sub4; · 2H&sub2;O in etwa 900 ml Wasser hergestellt. Der pH
wurde auf 7,2 bis 7,4 eingestellt. Es wurde eine Gesamtmenge von 1,0 Litern hergestellt.
Beispiel 1
Herstellung und Stabilität von gefriergetrockneten Mitteln des humanen
monoclonalen Antikörpers CLN-IgG (1)
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Die in Referenzbeispiel 1 hergestellte humane monoclonale Antikörperlösung wurde
gegen jede in dem Referenzbeispiel 2 hergestellte Lösung dialysiert. Die jeweils entstandene
humane monoclonale Antikörperlösung wurde auf jede der folgenden Konzentrationen eingestellt: 1,0,
2,5 und 5,0 mg/ml. Die entstandenen Lösungen wurden durch einen Membranfilter von 0,22 um
geleitet und 1 ml-Teile davon wurden in Gefäße gegossen und unter Verwendung eines
Plattentrockners, der von LABCONCO Co., USA hergestellt wurde, gefriergetrocknet. Das
Gefriertrocknen erfolgte durch Halten der Proben bei einer Trocknertemperatur von -30ºC während
etwa 3 Stunden zum Einfrieren und nach vollständigem Frieren der Proben durch Beginnen des
Trocknens unter Verwendung einer Saugpumpe. Die Trocknertemperatur wurde auf 0ºC erhöht,
und etwa 20 Stunden später war das Gefriertrocknen beendet.
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1 ml Aliquots destilliertes Wasser wurden zu den Gefäßen gegeben, um die
gefriergetrockneten Pulver aufzulösen, und die Löslichkeiten wurden, basierend auf OD&sub6;&sub0;&sub0;-Werten, die
üblicherweise bei der Messung der Trübung von Kulturmedien von Bakterien, etc. verwendet
werden, verglichen. Wurden unlösliche Teilchen als Ergebnis der Aggregation des Antikörpers
etc. gebildet, so steigen die OD&sub6;&sub0;&sub0;-Werte an. Als Ergebnis wurde, wie in der folgenden Tabelle 1
gezeigt wird, ermittelt, daß die 1% (Gew./Vol.) Mannitlösung und die Glycin-Mannit-Lösung im
Hinblick auf die Löslichkeit nach Gefriertrocknen des humanen monoclonalen Antikörpers am
besten sind. Weiterhin wurde selbst im Fall der Lösungen von Mannit alleine die Löslichkeit in
den Lösungen mit den hohen Konzentrationen von 5% und 10% (Gew./Vol.) schlecht. Weiterhin
verschlechterte sich die Löslichkeit selbst, wenn die Konzentration von Mannit 1% (Gew./Vol)
betrug, das Vorhandensein von etwa 0,9% NaCl, wie im Ergebnis von 1% Mannit +
physiologische Kochsalzlösung zur Injektion gezeigt ist.
Tabelle 1 Löslichkeit (OD&sub6;&sub0;&sub0;) des humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG
nach Gefriertrocknen in jedem Stabilisierungsmittel
Beispiel 2
Herstellung und Stabilität gefriergetrockneter Mittel des humanen monoclonalen
Antikörpers CLN-IgG (2)
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Entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden gefriergetrocknete
Mittel hergestellt, die in einem Gefäß 1, 2, 5, 10, 15, 20, 50 oder 100 mg D-Mannit und 1, 2, 5
oder 5 mg des monoclonalen Antikörpers enthielten, und die Löslichkeiten wurden verglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Als Ergebnis wurde ermittelt, daß, wenn die Menge an D-Mannit nach dem
Gefriertrocknen im Bereich von 1 bis 20 mg pro 1 mg Antikörper liegt, ausreichende Löslichkeit erhalten
werden kann.
Tabelle 2 Löslichkeit (OD&sub6;&sub0;&sub0;) des humanen monoclonalen Antikörpers CLN-IgG
nach Gefriertrocknen in D-Mannit
Industrielle Anwendbarkeit
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Wie oben ausgeführt, ist die erfindungsgemäße humane monoclonale
Antikörperzusammensetzung, die CLN-IgG umfaßt, in Bezug auf die Stabilität in einem Lösungszustand, einem
Gefriertrocknungszustand und einem Gefrierzustand, insbesondere die Stabilität gegen
Aggregation und Präzipitation des humanen monoclonalen Antikörpers zum Zeitpunkt des Wiederlösens
nach dem Gefriertrocknen, hervorragend, und die Zusammensetzung ist als Arzneimittel
verwendbar.