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Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung,
unter Ausschluß von Lipid X, die durch Lipopolysaccharid
induzierte (LPS-induzierte) GTPase-Aktivität inhibiert, zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur
Behandlung von Säugern zur Verhütung der schädlichen
Auswirkungen von gramnegativem Endotoxin (Lipopolysaccharid oder
"LPS"). Diese Erfindung betrifft auch einen Assay zum
Identifizieren von Verbindungen, die Endotoxinschock verhindern,
durch Messen ihrer Fähigkeit zum Inhibieren der
LPS-induzierten GTPase-Aktivität.
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Endotoxin ist ein Lipopolysaccharid (LPS), das ein
Hauptbestandteil der Außenschicht der Membranen von gramnegativen
Bakterien ist. Strukturuntersuchungen haben gezeigt, daß es
aus den folgenden drei unterschiedlichen Domänen besteht:
1) der O-Antigenregion, die eine stammspezifische
Polysaccharidgruppe ist und die Antigenspezifität des Organismus
bestimmt; 2) die Kernregion, die in Bezug auf ihre
Zuckerzusammensetzung relativ konservativ ist und beim Erhalt der
Integrität der äußeren Membran eine Rolle spielen kann; und
3) die Lipid-A-Region, die auch konservativ ist und als
hydrophober Anker dient, der Lipopolysaccharid am Ort hält.
Der Lipid-A-Teil des Lipopolysaccharids stellt den Hauptteil
der äußeren Monoschicht der äußeren Membran bei Gramnegativen
dar.
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Es ist bekannt, daß Lipopolysaccharide viele
pathophysiologische Vorgänge bei Säugern auslösen, entweder, wenn sie
injiziert werden oder wenn sie sich bedingt durch gramnegative
Infektion ansammeln. Im allgemeinen ist die hydrophobe Lipid-
A-Gruppe für diese pathophysiologischen Auswirkungen
verantwortlich, die entweder zu immunstimulativer oder toxischer
Wirkung neigen. In der ersten Kategorie treten Vorgänge wie
B-Lymphozytenmitogenese, Makrophagenaktivierung und die
Induktion der Tumornekrose in gewissen experimentellen
Systemen auf. In der letzteren (toxischen) Kategorie treten
Reaktionen auf wie peripherer vaskulärer Kollaps
("endotoxischer" Schock), Lungenhypertension, Lungenödem, ausgedehnte
intravaskuläre Koagulopathie und Fieber.
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Es wird angenommen, daß die Freisetzung von Mediatoren wie
dem Tumornekrosefaktor-α (TNF), Interleukin-1 (IL-1) und
Interleukin-6 (IL-6) die mit Endotoxämie verbundene Toxizität
erzeugt. Trotz der hohen Mortalitätsrate beim endotoxischen
Schock ist relativ wenig bekannt über die bei den
LPS-induzierten Vorgängen beteiligten biochemischen Mechanismen, z.
B. Freisetzung von TNF und IL-1, obwohl ein Verstärkungs
system angenommen wird, wenn Nanogrammengen von LPS bei
Tieren schwere Toxizität erzeugen können. Die meisten
Verstärkungswege umfassen Rezeptoren und verschiedene
Enzymkaskaden, was verschiedene Punkte für Antagonismus im System
erlaubt. Obwohl gewisse Schritte der LPS-Wirkung bekannt
sind, wie die Stimulierung von Phosphoinositidhydrolyse, eine
vorübergehende Erhöhung der intrazellulären Ca²&spplus;-Werte und
die Aktivierung der Proteinkinase C und Phospholipase A&sub2; hat
der Mangel an spezifischer Information über die bei der LPS-
Wirkung beteiligten Zellmechanismen die Entwicklung von
therapeutischen Stoffen zur Vermeidung des Endotoxinschocks
behindert.
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Die Verwendung einer Lipid X genannten Verbindung bei der
Behandlung von Sugern wird in US-A-4918061 beschrieben. Gemäß
der Offenbarung dieses Patents können Tiere durch
Verabreichen einer sicheren und wirksamen Menge der Verbindung Lipid
X an die Tiere vor den toxischen Wirkungen von gramnegativem
Endotoxin geschützt werden. Ferner zeigt J. Cell. Biol. 109
(4 Teil 2), 1989, 52A die Lipid-X-Inhibierung von durch
Endotoxin stimulierter GTPase-Aktivität in Membranen aus der
Makrophagenzellinie RAW 264.7 und Int. Congr. Ser. - Excerpta
Med., 923, 1990, 227-37 beschreibt Lipid-X-Inhibierung der
bakteriellen lipopolysaccharidstimulierten GTPase-Aktivität.
Gemäß dieser drei Publikationen wird Lipid X als ein
biosynthetischer Endotoxinvorläufer und -untereinheit definiert.
Keine dieser Publikationen legt nahe, daß andere
LPS-stimulierte GTPase-Inhibitoren außer Lipid X zur Vermeidung einer
Endotoxintoxizität verwendet werden können. Es gibt auch
keinen Hinweis darauf, daß irgendein anderer Inhibitor die
schädlichen Wirkungen von Endotoxinmediatoren vermeiden
könnte.
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Offensichtlich wäre es vorteilhaft, einen Assay zum
Identifizieren von Verbindungen zu haben, die als therapeutische
Stoffe in Verfahren zur Vermeidung eines Endotoxinschocks
nützlich sein können. Es wäre auch nützlich, einen Assay zum
Identifizieren von Verbindungen zu haben, die die Freisetzung
des Tumornekrosefaktors (TNF) und von Interleukin-1 (IL-1)
identifizieren.
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Es ist eine Aufgabe, Anwendungen der Verbindungen zur
Behandlung von Säugern zu ihrem Schutz vor nachteiligen Wirkungen
von gramnegativen Endotoxinen und zum Inhibieren der
Freisetzung von TNF und IL-1 zu offenbaren, die die Anwendung von
Verbindungen (außer Lipid X) umfassen, die durch den Assay
gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, daß
sie LPS-induzierte GTPase in vitro inhibieren, für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
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Es ist auch Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Assay zum
Identifizieren neuer oder bekannter Verbindungen zu
offenbaren, die nützlich sind, um Endotoxinschock zu verhindern,
durch Messen ihrer Fähigkeit zum Inhibieren LPS-induzierter
GTPase in vitro.
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Es ist ein weiteres Ziel, einen Assay zum Identifizieren von
Verbindungen zu offenbaren, die die Freisetzung von
Endotoxinschockmediatoren, wie TNF, inhibieren, durch Messen
ihrer Fähigkeit zum Inhibieren LPS-induzierter GTPase in
vitro.
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Der erfindungsgemäße Assay zum Identifizieren der
interessierenden Verbindungen umfaßt im Grunde ein Prüfen der
fraglichen Verbindungen, um zu bestimmen, ob sie beim
Blockieren einer durch LPS induzierten GTPase-Aktivität in
Makrophagenmembranen in vitro wirksam sind. Es wurde
gefunden, daß Verbindungen wie 2-Methylthio-ATP, die GTPase im
Assay inhibieren, auch Endotoxinschock verhindern oder die
Freisetzung von TNF inhibieren, der ein Mediator des
Endotoxinschocks ist.
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Die molekularen Mechanismen, die die Toxizität und hohe
Mortalitätsrate umgeben, die die Freisetzung von bakteriellem
Lipopolysaccharid (LPS) begleiten, sind unklar, obwohl ihre
starke Aktivität nahelegt, daß ein Verstärkungssystem
beteiligt ist. Weil frühere Studien nahelegten, daß ein G-Protein
(ein GTP bindendes Protein, das aktiv wird, wenn Verbindungen
an den Rezeptor binden und bewirken, daß das G-Protein andere
Zelleffektormoleküle aktiviert) kann an der LPS-wirkung
teilnehmen, wurden die Wirkungen von LPS auf die GTPase-Aktivitgt
in aus einer Makrophagenzellinie (RAW 264.7) isolierten
Membranen ermittelt. (G-Proteine bewirken Hydrolyse von GTP,
daher sind sie GTPasen). Es wurde gefunden, daß LPS eine
wesentliche GTPase-Aktivierung induzierte (200-300 % über
normal) und kinetische Analysen zeigten, daß die maximale
LPS-stimulierte Geschwindigkeitszunahme innerhalb von 15 min
beobachtet wird, das ist eine (GTP) Aktivität mit niedrigem
Km, die durch Ammoniumsulfat verstärkt werden kann und es
scheint unempfindlich gegen Pertussistoxin zu sein.
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Außerdem wurde gefunden, daß Phosphatase/Atpase-Inhibitoren
wie p-Nitrophenylphosphat, Ouabain, Bafilomycin oder
N-Ethylmaleimid keine Antagonisten der LPS-verstärkten
GTPase-Aktivität sind und tatsächlich durch die Zugabe von ATP oder ADP
potenziert wurden. Es wurde eine synergistische Wirkung auf
die GTPase-Aktivität gefunden, wenn sowohl LPS wie ATP oder
ADP dem Makrophagenassay zugesetzt wurden. Diese Daten legen
nahe, daß LPS ein Bindeglied zwischen GTPase und einem
Punnorezeptor darstellen kann.
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Es wurde auch gefunden, daß der LPS-Vorläufer, Lipid X, der
die letalen Wirkungen von LPS-Endotoxin reduzieren kann, eine
dosisabhängige Inhibierung der LPS-vermittelten Stimulation
der GTPase-Aktivität bewirkt. Es wurde eine halbmaximale
Inhibierung bei demselben Verhältnis von Lipid X zu LPS
beobachtet, von dem bekannt ist, daß es zur Verhinderung von
Endotoxinwirkungen in vivo wirksam ist, d. h. bei einem
Gewichtsverhältnis eins-zu-eins. Diese Wirkungen sind
spezifisch, weil andere Phospholipide, Tenside und Glycoside weder
eine basale GTPase-Aktivität stimulieren, noch eine LPS-
induzierte GTPase-Aktivität inhibieren. Die Entdeckung, daß
2-Methylthio-ATP sowohl LPS-induzierte GTPase-Aktivität wie
TNF-Produktion in RAW 2647 Makrophagen blockiert, ist ein
weiterer Beweis dafür, daß GTPase ein determinierender Weg
zur Mediation von Endotoxizität ist.
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Die Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Säuger zum
Schutz vor schädlichen Wirkungen von Endotoxin (LPS) mit
Verbindungen, die durch den Assay als GTPase inhibierend
identifiziert wurden (mit Ausnahme von Lipid X, das schon für
solche Anwendung bekannt ist). Eine solche durch den Assay
identifizierte Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung
ist 2-Methylthio-ATP.
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Das oben genannte und weitere Ziele der vorliegenden
Erfindung werden den Fachleuten aus der Beschreibung ersichtlich.
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Es wurde versucht, den Einfluß von LPS auf eine mögliche G-
Proteinfunktion durch Untersuchung der agonistenverstärkten
GTPase-Aktivität direkt zu bestimmen, die ein Ausdruck der G-
Proteinwirkung ist. Weil außerdem Makrophagen einer der
Schlüsselzelltypen bei der Freisetzung von toxischen
Mediatoren nach einem LPS-Angriff sind, wurde zuerst die Kapazität
von LPS zum Einfluß auf die GTPase-Aktivität in Membranen
ermittelt, die aus Zellen von RAW 264.7 isoliert wurden, die
eine Makrophagenzellinie mit hoher LPS-Empfindlichkeit
darstellt. In diesen Untersuchungen wurden die GTPase-Aktivität
unter Verwendung eines Standardassays gemessen. Die Aktivität
wurde unter Verwendung von 2 µM γ-³²P-GTP in Gegenwart von
0,1 mM ATP und 0,2 mM des nicht hydrolysierbaren
ATP-Analogen, AMPPNP, bestimmt, um die nicht spezifische
Nukleotidaseaktivität in den Membranpräparaten zu minimieren. Bei der
bevorzugten Praxis der vorliegenden Erfindung wird die
Fähigkeit einer zu prüfenden Verbindung&sub1; die LPS-induzierte GTPase
zu inhibieren, durch Messen der Freisetzung von ³²Pi aus γ-
³²P-GTP gemessen.
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Es wurde zunächst die optimale LPS-Konzentration zur GTPase-
Stimulation bestimmt. In allen Experimenten war die LPS-
Dosisreaktionskurve ziemlich steil, wobei die höchste
Aktivität um 200 bis 300 µg LPS/ml auftrat. Wenn der Zeitverlauf
der LPS-aktivierten GTPase untersucht wurde, zeigte sich, daß
LPS die GTP-Hydrolyserate schon 2 min nach der Zugabe erhöhte
und der Effekt war nach 15 min maximal.
1. GTPase-Assay
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Der bevorzugte Assay ist vergleichbar mit dem, der von Cassel
et al. in: Biochem. Biophys. Acta 452, 538-551 (1976) und
Neer et al. in: J. Biol. Chem. 259, 14222-14229 (1984)
beschrieben ist, mit zwei großen Ausnahmen: (1) Es wird
Ammoniumsulfat zugegeben, weil gefunden wurde, daß obwohl 300 µg
LPS/ml ohne Ammoniumsulfat die GTPase-Aktivität um ungefähr
30 % erhöht, in Gegenwart einer optimalen Menge an
Ammoniumsulfat (250 mM) die LPS-induzierte GTPase-Aktivität fast
dreimal über der reduzierten Grundrate war. Unter diesen
Bedingungen war die GTPase-Aktivierung bei 100 µg LPS/ml
(ungefähr 6 µM unter Annahme eines mittleren
Molekulargewichts von ungefähr 17000 kDa) sichtbar und die maximale
Wirkung wurde bei 300 µg/ml LPS gesehen. (2) Um den
Adenosinnukleotidsynergismus mit LPS-stimulierter GTPase-Aktivität
zu zeigen, ersetzen entweder 10 µM ATP oder 30 µM ADP die 0,1
mM ATP und 0,2 mM AMPPNP des von Cassel et al. und Neer et
al. beschriebenen Standardassays.
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Im bevorzugten Assay wird eine zu untersuchende Verbindung
(0,001 bis 1000 µM) in 100 µl eines Reaktionspuffers gelöst
oder suspendiert, der 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,01 mM ATP oder
ADP, aus RAW 264.7 Zellen isolierte Membranen, 2 µM γ-³²P-
GTP (3-9 x 10 cpm/pmol), 5 mM MgCl&sub2;, 18 µM LPS (bezogen auf
ein geschätztes Molgewicht von 17000 kDa für Endotoxin von E.
coli 0111:B4) und 250 mM Ammoniumsulfat enthält. Die Reaktion
wird durch die Zugabe des γ-³²P-GTP initiiert und die
Mischung bei 30 bis 37 ºC 15 bis 30 Minuten lang inkubiert. Die
Reaktion wird durch die Zugabe von 500 µl 5 %iger
Trichloressigsäure und 500 µl 0,1 g/ml säureaktivierter Kohle in 5
%iger Trichloressigsäure beendet. Die Proben wurden bei 14000
xg 10 Minuten lang zentrifugiert und eine Menge von 550 µl
des Überstands zur Szintillationszählung entnommen. Der
Überstand enthält das freigesetzte ³²Pi. Das Ausmaß der GTPase-
Inhibierung wird druch die Abnahme der freigesetzten Menge an
³²Pi aus γ-³²P-GTP gemessen. Geeignete Kontrollen umfassen
Mischungen, wobei eines der folgenden weggelassen wird: (i)
Testverbindung, (ii) Endotoxin und (iii) ATP, ADP oder AMPPNP.
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Die makrophagenartige Zellinie RAW 264.7 wird wie beschrieben
kultiviert, wobei das Medium RPMI 1640 versetzt mit 10 %
fetalem Kalbsserum (fetal calf serum, FCS) mit < 0,1 ng/ml
LPS verwendet wird. Die Membranen werden in 20 mM HEPES (pH
7,4), 1 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA und 10 µg Leupeptin/ml
erneut suspendiert. Probenmengen werden bei -70 ºC bis zum
Test gelagert.
2. Wirkung von ATP
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Um die Spezifität der LPS-stimulierten GTPase weiter zu
charakterisieren, wurde zuerst ihre Aktivität ohne andere
Nukleotide geprüft und dann diese Reaktion verglichen mit
der, die bei Reaktionen gefunden wurde, die verschiedene
Inhibitoren von Atpase/Nukleotidase enthielten. Wenn die
GTPase-Aktivität durch eine allgemeine Erhöhung der
nukleotidaseartigen Aktivitäten bedingt ist, würde man erwarten,
daß der Einschluß dieser Inhibitoren die LPS-stimulierte
Aktivität dämpft. Es wird vorhergesagt, daß die Freisetzung
von ³²Pi aus γ-³²P-GTP ohne diese Stoffe nicht beeinflußt
oder sogar verstärkt wäre (mehr nicht spezifische
Substrathydrolyse). Überraschend wurde beobachtet, daß bei Fehlen
eines Zusatzes an Adeninnukleotiden sehr wenig nachweisbare
LPS-verstärkte GTPase-Aktivität vorhanden war. Wenn jedoch
entweder ATP, ADP oder das nicht hydrolysierbare ATP-Analoge
AMPPNP bei der Inkubation vorhanden war, erfolgte eine
deutliche Zunahme der LPS-stimulierten GTPase-Aktivität. Außerdem
führte die Zugabe von Atpase-Inhibitoren Ouabain, Bafilomycin
und N-Ethylmaleimid nicht zu einer Blockierung der LPS-
stimulierten GTPase-Aktivität in Gegenwart von ADP. Umgekehrt
blockierte der sehr allgemeine
Phosphoryltransferaseinhibitor Natriumorthovanadat die LPS-Aktivität, wie erwartet.
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Weil die obigen Inhibitoruntersuchungen eine maximale LPS
stimulierte GTPase-Aktivität in Gegenwart von ATP und ATP-
Analogen zeigten, wurde diese Wechselwirkung durch Messen der
ATP-Abhängigkeit der GTPase-Aktivität in Makrophagenmembranen
mit und ohne eine optimale Dosis an LPS untersucht. ATP
allein zeigte eine biphasige Stimulation der
GTPase-Aktivität, wobei die maximale Wirkung um 1 bis 10 µM beobachtet
wurde. Diese Stimulation durch ATP kann durch die Wirkung der
purinergischen Rezeptoren bedingt sein, d. h. die
Adenosinund ATP-Rezeptoren, von denen bekannt ist, daß sie mit
verschiedenen G-Proteinen gekoppelt sind.
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Wenn ATP und LPS zusammen zugesetzt werden, zeigt sich eine
verblüffende Stimulation der GTPase-Aktivität bei 1 bis 10 µM
ATP, die viel größer ist als die, die mit ATP oder LPS allein
zu sehen ist. Diese synergistische Stimulation durch ATP plus
LPS ist auch biphasig, wobei die bei sehr hohen ATP-Werten
beobachtete Inhibierung der GTPase-Aktivität vermutlich von
konkurrierenden oder ionischen Effekten herrührt. Diese Daten
legen nahe, daß LPS in gewisser Weise mit dem
Purinorezeptorsignalübertragungsweg in Wechselwirkung stehen kann und daß
die durch LPS vermittelte GTPase-Aktivierung nicht das
Ergebnis einer unspezifischen Atpase oder einer anderen
Nukleotidaseaktivität ist.
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Um festzustellen, ob die durch LPS/ATP verstärkte GTPase eine
Form mit "niedrigem Km" ist, was für eine Reihe von
G-Proteinen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht erwartet würde,
sowie für verschiedene Proteine vom Typ GAP und ARF, im
Gegensatz zu einer Form mit "hohem Km", wie eine Phosphatase,
wurde die GTPase-Aktivität unter Verwendung von 0,2 und 50 µM
GTP im wesentlichen wie zuvor beschrieben untersucht. Im
Hinblick auf die Wechselwirkungen von LPS und ATP wurde GTPase
mit hohem und niedrigem Km ohne zugesetztes ATP gemessen
sowie in Gegenwart einer maximalen Aktivierungsdosis von ATP
(10 µM) und diese Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die
unter Verwendung der Standardversuchsbedingungen erhalten
wurden (2 µM GTP, 0,1 mM ATP, 0,2 mM AMPPNP). Die LPS und ATP
stimulierten eine GTPase-Aktivität mit niedrigem Km um
ungefähr 30 bzw. 70 %, wenn sie einzeln zugegeben wurden. Diese
Stimulation der Aktivität mit niedrigem Km war etwas größer
als die, die unter Verwendung der Standardversuchsbedingungen
angenommen wurde. Außerdem schienen die kombinierten
Wirkungen von LPS und ATP auf die GTPase-Aktivität auch einen
Einfluß auf eine Komponente mit niedrigem Km darzustellen,
wobei die für die Aktivität mit niedrigem Km (228 % der
Grundaktivität) berechnete Stimulation mit der Stimulation
vergleichbar ist (208 % der Grundaktivität), die unter
Verwendung der Standardversuchsbedingungen gemessen wurde.
Zusammengefaßt erscheint die LPS-stimulierte GTPase-Aktivität
für GTP spezifisch, sie zeigt einen niedrigen Km (GTP) und
ist gegen verschiedene Atpase-Inhibitoren unempfindlich. Die
LPS-Stimulation der GTPase-Aktivität wird durch
Adeninnukleotide verstärkt.
3. Wirkung von ATP-Analogen
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In Gegenwart von LPS führt ATP zu einer dreifachen Erhöhung
der Aktivität der GTPase. Daher wurde die Fähigkeit von ATP-
Analogen zum Stimulieren der LPS-verstärkten GTPase-Aktivität
untersucht. In Studien der dosisabhängigen Reaktion betrugen
die relativen Fähigkeiten von Purinen zum Stimulieren der
LPS-verstärkten GTPase: ATP > ATPyS > ADP > AMPPNP » β,γ-
Methylen-ATP > 2-MeSATP. Die Struktur von 2-MeSATP ist
nachfolgend angegeben:
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AMP und Adenosin waren bei 100 µM unwirksam, während ATP bei
1 µM aktiv war. Dies ist die allgemeine Ordnung der
Purinagonistenaktivität für den Purinorezeptor vom Typ P2 (P2-
R). Ebenso hat IBMX, ein Antagonist für beide Typen von P1
Purinorezeptoren, aber ohne Wirkung auf P2-Rezeptoren, die
LPS-Aktivierung der GTPase nicht verändert. (Es sind keine
bekannten P2x-, P2y- oder P2z-Rezeptorantagonisten derzeit
verfügbar, während ATP ein P2t-Inhibitor ist, aber ein
Agonist in diesem System). Interessanterweise ist eines der
Giartigen Proteine, die mit den P2-Purinorezeptoren verknüpft
sind, gegen Keuchhustentoxininaktivierung resistent, was mit
hier vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt. Ebenso ist eine
P2-Rezeptoraktivierung mit einem Inositolphosphatabfall in
HL60-Zellen verknüpft. Schließlich wurde berichtet, daß LPS
die Purinexonukleotidaseaktivität von glomerulären
Endothelzellen senkt, wie durch Enzymzytochemie bestimmt wurde. Diese
Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, daß das P2-R an den LPS-
vermittelten Aktivitäten beteiligt sein kann. Da
beispielsweise bekannt ist, daß eine ATP-Infusion zu einem Schock
führt, kann man eine Hypothese der folgenden Vorgänge
aufstellen: LPS sensibilisiert P2-R auf ATP über verstärkte
Ligandenbindung an P2-R oder erhöhte G-Proteinwechselwirkung
mit P2-R und LPS kann intravaskulären Abfall von ATP und ADP
erhöhen. Auf diese Weise können in Gegenwart von LPS normale
Konzentrationen an ATP zu einem Schock und zum Tode führen.
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Eine Untersuchung der dosisabhängigen Reaktionskurven von ATP
und ATP-Analogen zeigt, daß 2-Methylthio-ATP (2-MeSATP)
keine stimulierende Wirkung auf die LPS-induzierte GTPase-
Aktivität hat. Weil 2-MeSATP ein starker Agonist für zwei der
Untertypen der P2-R (P2y- und P2z-Rezeptoren) ist, aber im
Versuch wenig Aktivität zeigte, wurde die Hypothese
aufgestellt, daß 2-MeSATP ein Antagonist sein könnte. Es wurde
gefunden, daß 2-MeSATP für die stimulierende Wirkung von ATP
auf LPS-induzierbare GTPase-Aktivität antagonistisch ist. Bei
Zugabe zunehmender Mengen an 2-MeSATP (0 bis 100 MM) zum
Makrophagenversuchssystem, verringerte sich die Aktivität der
LPS-verstärkten GTPase.
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Außerdem verringerte 2-MeSATP die von LPS vermittelte
Produktion von TNFα durch RAW 264.7 Makrophagen. Die Produktion von
TNF durch die Makrophagenzellen wurde durch einen "Zell-
Lebensfähigkeitstest" gemessen. Dieser Standardversuch ist
bei Birkland et al. in: Adv. Exp. Med. Biol. 256: 399-402
(1990) beschrieben. Kurz gesagt, in Lösung vernichtet TNF mit
Actinomycin D sensibilisierte L929-Zellen, was durch einen
Verlust der MTT-Farbreduktion gemessen werden kann. Der
Überstand wurde von mit 2-MeSATP, LPS und ATP behandelten
RAW264.7-Zellen entfernt. Je größer die zugesetzte Menge an
2-MeSATP war (0 bis 5 µM), umso weniger TNF wurde von den
Makrophagenzel len produziert.
4. Einfluß von Lipid X auf LPS-stimulierbare GTPase
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Die Wirksamkeit des GTPase-Versuchs zum Identifizieren von
Verbindungen, die einen endotoxischen Schock inhibieren,
wurde unter Verwendung von Lipid X bestätigt, einem bekannten
Endotoxininhibitor. Weil frühere Arbeiten nahelegten, daß
Lipid X die LPS-Wirkung in vitro blockieren kann, wurden
Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Lipid X auch auf
LPS-stimulierte GTPase-Aktivität in vitro antagonistisch
wirkt. Es wurde gefunden, daß Lipid X zum dosisabhängigen
Inhibieren der LPS-verstärkten GTPase-Aktivität fähig war.
Unter Verwendung von LPS-Konzentrationen von entweder 300
µg/ml oder 1 mg/ml zum Verstärken der Makrophagen-GTPase-
Aktivität, zeigte Lipid X eine halbmaximale Inhibierung, wenn
die beiden Stoffe in einem molaren Verhältnis von ungefähr 23
zu 1 an Lipid X zu LPS (1:1 Gewichtsverhältnis) vorhanden
waren. Dies stimmt mit früheren Studien überein, wo ein
ähnliches Verhältnis von Lipid X zu LPS gefunden wurde, das zum
Blockieren eines LPS-Schocks in vivo halbmaximal wirksam ist,
was angibt, daß die relativen Konzentrationen an LPS und
Lipid X, die zur GTPase-Inhibierung erforderlich ist, fast
parallel zu der Konzentration ist, die für den Antagonismus
der LPS-Toxizität unter pathophysiologischen Bedingungen
nötig ist.
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Es wurde gefunden, daß ein synthetisches Lipid-X-Derivat,
Bisphosphoazalipid X, zum Blockieren der LPS-induzierten
GTPase-Aktivität wirksam ist. Es hat den Vorteil, daß es
besser wasserlöslich ist. Obwohl der Haupteinfluß von Lipid X
bei der Inhibierung der LPS-stimulierten GTPase-Aktivität zu
liegen scheint, war Lipid X auch in der Lage, die
Grundaktivität leicht zu reduzieren, was eine mögliche direkte
Wechselwirkung auf der Stufe der GTPase nahelegt. Im Hinblick
ferner auf die Reversibilität der Lipid-X-Inhibierung der
LPS-stimulierten GTPase-Aktivität wurde diese
GTPase-Inhibierung beobachtet, ungeachtet dessen, ob LPS oder Lipid X
zuerst mit dem Membranpräparat inkubiert wurde.
5. Spezifität der Wirkungen von LPS und Lipid X
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Im Hinblick auf die allgemeine Lipophihe von LPS und Lipid
X wurden andere hydrophobe Verbindungen getestet, um die
Spezifität der durch LPS und Lipid X vermittelten Wirkungen
auf die GTPASE-Aktivierung/-Inhibierung zu demonstrieren: Es
wurde gefunden, daß verschiedene Phospholipide, wie
Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure und Phosphatidylserin, in
Makrophagenmembranen weder die basale GTPase-Aktivität
stimulierten noch die LPS-stimulierte GTPase-Aktivität inhibierten.
Das Tensid Triton X-100 reduzierte die basale
GTPase-Aktivität, störte die LPS-stimulierte Aktivität aber nicht
wesentlich. Diese Daten legen nahe, daß die Wirkungen von LPS und
Lipid X nicht streng auf den allgemeinen Tensid oder anderen
Lipidwechselwirkungen beruhen.
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Im Hinblick auf nicht durch LPS stimulierte GTPase-Aktivität
in diesem Makrophagensystem wurde beobachtet, daß 10 % FCS (<
0,1 ng Endotoxin/ml Serum durch das
Limulus-Amöbozytenlysatverfahren) einen hohen Grad an GTPase-Aktivierung induzierte,
während 3 mg/ml Lipid X die FCS-verstärkte GTPase-Aktivität
um ungefähr 50 % inhibierte. Diese Ergebnisse legen auch
nahe, daß Lipid X direkte Wirkungen besitzen kann, weil es
offensichtlich andere durch Agonisten verstärkte
GTPase-Aktivitäten stören kann.
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Obwohl diese Experimente so vorgesehen waren, daß durch
Verwendung sehr geringer GTP-Mengen (2 µM) und sehr hoher
Konzentrationen an ATP/Nukleotidase-Antagonisten, d. h. 0,1 mM
ATP und 0,2 mM AMPPNP, nicht spezifische GTP-Hydrolyse
minimiert ist, war es noch möglich, daß einige der beobachteten
Effekte durch die Aktivierung von Membranphosphatasen, z. B.
alkalischer Phosphatase oder Atpasen wie die häufige
NaKAtpase bedingt ist. Der Beitrag dieser Enzyme kann jedoch
aufgrund der Tatsache unberücksichtigt bleiben, daß die LPS-
stimulierte GTPase-Aktivität eine Unempfindlichkeit gegen
hohe Konzentrationen des Phosphataseinhibitors,
p-Nitrophenylphosphat und des Atpase-Inhibitors Ouabain, selbst in
Gegenwart von 0,1 mM ATP und 0,2 mM AMPPNP zeigte.
6. Tierversuche
a. Allgemeines
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Bei der bevorzugten Ausführung der Anwendung der vorliegenden
Erfindung wird eine Verbindung (nicht Lipid X), die im Assay
als inhibierend auf die GTPase-Aktivität identifiziert wurde,
einem Tier in einer sicheren und wirksamen Menge verabreicht,
um es gegen die toxischen Wirkungen von gramnegativem
Endotoxin zu schützen. Die bevorzugte Verbindung ist
2-Methylthio-ATP (2-MeSATP) und der bevorzugte Verabreichungsweg ist
intravenös.
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Der Bedarf an weiteren Verbindungen, die einen
Endotoxinschock verhindern können, ist groß, weil Lipopolysaccharid
(LPS) hoch toxisch ist. Beispielsweise beträgt die LD&sub5;&sub0; für
das Lipopolysaccharid in Schafen ungefähr 10 bis 20 µg/kg
(intravenös), während sie für Mäuse ungefähr 5 mg/kg beträgt.
Bei Schafen (und vermutlich auch bei Menschen) verursacht
Lipopolysaccharid den Tod durch Freisetzung von Mediatoren,
die eine Lungenhypertension, Lungenödem und peripheren
vaskulären Kollaps auslösen. Der Tod tritt üblicherweise
innerhalb von 8 bis 48 Stunden nach Injektion des
Lipopolysaccharids oder Lipid A ein. Gelegentlich tritt der Tod nach
1 bis 2 Wochen ein. Dies ist üblicherweise die Folge
ausgedehnter intravaskulärer Koagulopathie, die zu
Nierenrindennekrose und Tod durch Nierenversagen führt.
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Die Vorbehandlung von Säugern, wie Schafen oder Mäusen, mit
einer Verbindung, die durch den erfindungsgemäßen Assay als
GTPase-Inhibitor identifiziert wurde, sollte den Säuger gegen
die tödlichen Wirkungen des gramnegativen Endotoxins
resistent machen. Es ist auch beabsichtigt, daß Behandlung eines
Säugers nachdem die Symptome des Endotoxinschocks auftreten,
die Krankheitssymptome mindern kann. Es ist anzumerken,
derzeitige Therapien zielen darauf ab, die gramnegativen
Bakterien abzutöten (Antibiotika) und im Kreislauf
vorhandenes Endotoxin zu neutralisieren (Antiendotoxinantikörper).
Diese Therapien haben jedoch den Nachteil, daß sie mehr
Endotoxin freizusetzen und keine Wirkung auf schon in die
Zellen eingedrungenes Endotoxin haben. Dieser letztere
Nachteil ist klinisch sehr relevant, weil die Zeichen und
Symptome der Endotoxämie oft erst 1,5 bis 3 Stunden nachdem das
Endotoxin in den Patienten freigesetzt ist auftreten, was
daher die Antiendotoxinantikörper weniger wirksam macht. Der
offensichtliche Antagonismus zwischen den Verbindungen, die
als GTPase-Inhibitoren identifiziert sind, und Endotoxin kann
nützliche Anwendungen in klinischen Situationen und
Krankheitszuständen haben, die durch Endotoxin ausgelöst sind, wie
gramnegative Sepsis nach chirurgischen Eingriffen bei
Menschen oder Tieren, Mastitis bei Rindern oder Schweinen und
anderen mit Endotoxin in Verbindung stehenden
Veterinärerkrankungen wie sie in den Tabellen I und II aufgelistet sind.
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Während die LPS-Aktivierung von Makrophagenpurinrezeptoren
ein spezifischer Fall einer Makrophagenaktivierung ist, kann
dies einen allgemeineren Fall für eine Makrophagenaktivierung
darstellen. Zum Beispiel kann Endotoxin (LPS) eines der
natürlich auftretenden Säugerlipide ersetzen, die bei einer
Gewebeschädigung zusammen mit intrazellulärem ATP oder ADP
freigesetzt werden. Diese Kombination von Lipid plus Purin
kann dann die Makrophagen aktivieren. Daher können 2-MeSATP
und andere purinrezeptoraktive Derivate die
Makrophagenaktivierung blockieren, die bei einer Reihe von anderen
pathophysiologischen Zuständen zu sehen sind. Daher sind verschiedene
andere Krankheitszustände, worin 2-MeSATP nützlich sein kann,
in Tabelle IV aufgelistet.
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Es wurde gezeigt, daß Lipid X die schädlichen Wirkungen von
LPS vermeiden kann und daß Lipid X, wie 2-Methylthio-ATP die
GTPase-Aktivität im Assay gemäß der vorliegenden Erfindung
inhibiert. Außer 2-Methylthio-ATP und Lipid X gibt es andere
Verbindungen, die wahrscheinlich die Fähigkeit zum Schutz
gegen die Wirkung von gramnegativem Endotoxin besitzen.
Repräsentative Verbindungen umfassen ATP-Analoge mit R-Gruppen
an den Positionen 2 und 8 des Stickstoffrings. (2-MeSATP
trägt eine -SCH&sub3;-Gruppe an der 2-Position des
Stickstoffrings). Nützliche R-Gruppen umfassen -OCH&sub3;, -NHCH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub3;,
-CH&sub3;, -CH=CH&sub2;, -COOH, -OH, -SH, -NH&sub2; und längere und/oder
verzweigte aliphatische Ketten, die direkt oder durch -O-,
-N- oder -S-Brücken mit dem Ring verknüpft sind sowie durch
verschiedene Ester- oder Amidbindungen. Halogenierte
Verbindungen wie 2-Chlor-ATP können auch ähnlich wie 2-MeSATP
funktionieren. Damit eine Verbindung wirksam ist, muß sie mit dem
Purinrezeptorsystem in Wechselwirkung treten und ein GTPase-
Antagonist sein.
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Ergebnisse von Vorversuchen legen nahe, daß Verbindungen wie
β,γ-Methylen-ATP, in denen in der Phosphatverknüpfung
Kohlenstoff gegen Sauerstoff substituiert ist, nützlich sein
können. Es ist auch beabsichtigt, daß Derivate des
Adeninstickstoffrings nützlich sein können. Die Wirkungen von IBMX, NAD,
AMP, UTP, Theophyllin und Adenosin (bei 100 µM) wurden
untersucht. Diese adeninartigen Purine und ein Pyrimidin wirkten
nicht synergistisch zur Erhöhung der LPS-induzierten GTPase-
Aktivität. In dieser Hinsicht sind sie ähnlich wie 2-MeSATP.
b. Spezifische Tiere im Test
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In den folgenden beiden Experimenten mit Schafen und Mäusen
wurde versucht, die Fähigkeit des Lipid X, das die LPS-
induzierte GTPase-Aktivität in vitro inhibiert, zum
Inhibieren des Endotoxinschocks in vivo zu messen.
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Schafe aus Mischzucht von 30 bis 70 kg Gewicht wurden von
den Versuchsfarmen der University of Wisconsin erhalten.
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Schafe wurden wie folgt präpariert: mindestens 24 Stunden vor
jedem Experiment wurden Katheter perkutan in die
Lungenartene eingesetzt. Weitere Katheterisierungen, die zur Infusion
erforderlich sind, werden zu dieser Zeit vorgenommen. Alle
Studien wurden an wachen, freilaufenden Schafen durchgeführt,
die in tragbare Gitterboxen mit Futter und Wasser ad libitum
eingestellt waren. Es wurden elektronisch berechnete
Lungenarteriendruckwerte sowie Herzfrequenzen in verschiedenen
Zeitabständen auf einem Polygraphen aufgezeichnet. Um vor der
Injektion der Testverbindungen eine stabile Basislinie zu
erhalten, wurden ungefähr eine Stunde lang
Basislinienmessungen aufgezeichnet.
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Acht Wochen alte Mäuse (Stamm C57BL/10) ließ man mindestens 7
Tage nach ihrer Ankunft ausruhen und sie wurden nach
Geschlechtern getrennt und zu 5 pro Käfig mit Futter und Wasser
ad libitum untergebracht. Es wurde eine intravense Injektion
einer GTPase inhibierenden Verbindung (Lipid X aufgelöst in
Salzlösung wie oben beschrieben) und/oder Lipopolysaccharid
über den Weg des retroorbitalen Sinus unter Verwendung einer
27er Nadel erreicht. Es wurden nicht mehr als 0,1 ml
Flüssigkeit auf einmal eingespritzt. Unmittelbar vor der Injektion
wurden die Mäuse leicht mit Ether betäubt. Nach der Injektion
wurden die Mäuse alle 0,5 bis 6 Stunden beobachtet und der
Zeitpunkt des Todes vermerkt. In einigen Experimenten
erhielten die Mäuse die Injektion intraperitoneal mit Lösungen von
Lipid X und/oder Lipopolysaccharid ähnlich wie oben
beschrieben.
Schutz von Mäusen gegen letale Endotoxämie
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Zur Überprüfung der Toxizität von Lipid X bei Mäusen, wurden
C57BL/10 Mäuse mit 750, 2000 oder 5000 µg Lipid X
intrapentoneal (12 Mäuse) oder mit 750, 1500 oder 3000 µg intravenös
(7 Mäuse) konfrontiert. Alle diese Mäuse lebten. Folglich
schien Lipid X bei den Mäusen, wie bei Schafen nicht toxisch
zu sein. Wie nachfolgend ausführlicher diskutiert wird, wurde
40 Schafen Lipid X injiziert und es wurden bisher keine
ernsthaften nachteiligen Komplikationen der Verabreichung von
Lipid X beobachtet.
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Die letale Dosis von E. coli-Endotoxin wurde sowohl für die
intravenöse wie für die intraperitoneale Verabreichung
bestimmt. Die letale Dosis, die 100 % der Mäuse tötete (LD&sub1;&sub0;&sub0;),
betrug 250 µg intravenös und 500 µg intraperitoneal. (Es ist
wichtig, jede Charge Endotoxin mit jeder Charge an Mäusen zu
standardisieren). Um die ungefähre Dosis von Lipid X zu
bestimmen, die erforderlich ist, um gegen einen letalen Angriff
von Endotoxin zu schützen, wurden Mäuse 2 Stunden vor der
Verabreichung von 1500 µg Endotoxin, was der 3fachen letalen
LD&sub1;&sub0;&sub0;-Dosis entspricht, mit Lipid X intraperitoneal
vorbehandelt. Die Vorbehandlung der Mäuse mit Lipid X schien die Zeit
bis zum Tode um das 4fache zu verlängern (von ungefähr 20
Stunden auf 80 Stunden).
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Weil sowohl Lipid X wie Lipopolysaccharid (LPS) in diesen
Vorversuchen intraperitoneal gegeben wurden, bestand die
Möglichkeit einer langsamen oder veränderlichen Absorptionsrate.
Folglich wurde ein intravenöser Verabreichungsweg ausgewählt,
um die Schutzwirkung zu prüfen. Mäusen wurden 750 µg Lipid X
von 24 Stunden vor bis 6 Stunden nach dem Endotoxinangriff
mit 1 bis 2 LD&sub1;&sub0;&sub0;-Dosen gegeben. Einundvierzig Prozent der
Mäuse, die 500 µg Lipid X im Zeitraum von 6 Stunden vor der
Endotoxingabe bis 1 Stunde nach LPS-Gabe erhielten,
überlebten. Wenn eine niedrigere Endotoxinverabreichungsdosis (250
µg) verwendet wurde, überlebten 81 % der Mäuse, wenn sie im
Zeitraum von 1 Stunde vor bis 4 Stunden nach LPS-Gabe mit
Lipid X behandelt wurden. Bei beiden Verabreichungsdosen von
Endotoxin, zeigte die Mäusegruppe, die Lipid X kurz nach der
Endotoxingabe erhielten, eine höhere Sterblichkeit als die
anderen Gruppen. Dies ist vielleicht dadurch bedingt, daß
diese Tiere zweimal innerhalb einer kurzen Zeit anästhesiert
wurden und die Endotoxingabe erhielten, bevor sie Lipid X
erhielten. Die Umkehrung der letalen Toxizität von Endotoxin zu
Zeitpunkten wie 4 Stunden nach der Endotoxingabe ist
besonders auffällig. Obwohl dies am besten bei der geringeren
Endotoxindosis von 250 µg pro Maus demonstriert ist, stellt
dies immer noch einen massiven Angriff (ungefähr 10 mg
Lipopolysaccharid pro kg Körpergewicht) dar. 4 Stunden nach
intravenöser Injektion der 250 µg Lipopolysaccharid zeigten die
Mäuse kein normales Verhalten, d. h. kein Nestbau, es trat
verringerte spontane Aktivität auf und die Tiere zitterten.
Schutz von Schafen gegen letale Endotoxämie
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Wie oben angegeben liegt die LD&sub5;&sub0; für Lipopolysaccharid bei
Schafen im Bereich von 10 bis 20 µg/kg bei intravenöser
Injektion. Schafe reagieren auf Lipopolysaccharid in einer
Weise, die mehr der Sitation entspricht wie sie bei
Krankheiten des Menschen auftritt.
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Wie in der Literatur berichtet ist, erzeugt Lipid x selbst
(40 bis 1000 µg/kg) keine ausgeprägte Krankheit oder Fieber,
nur einen Zeitraum mit vorübergehender Lungenhypertension und
leichte Kurzatmigkeit, die nach 30 Minuten abklingt. Ungefähr
30 Schafe wurden von Burhop im Hinblick auf Lipid-X-Toxizität
untersucht.
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Im Gegensatz zu Lipid X, bewirkt eine einzige Injektion von
LPS (10 bis 20 µg/kg) eine ernste Lungenhypertension und nach
15 bis 30 Minuten beginnt ein mit LPS behandeltes Tier zu
zittern, hustet und legt sich hin. Die Symptome werden
während der nächsten Stunden stärker und sind von Fieber
begleitet. Etwa die Hälfte der Tiere sterben in 24 Stunden.
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Im Hinblick auf den teilweisen Schutz, der von Lipid X gegen
LPS-induzierte Sterblichkeit bei Mäusen erreicht wird, wurde
die Möglichkeit eines solchen Schutzes auch bei Schafen
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Das Schafsystem hat den großen Vorteil, daß es die
Verabreichung viel größerer Lipid-X-Dosen im Verhältnis zu LPS
erlaubt. Für das Überleben ist das Verhältnis von Lipid X zum
Endotoxin kritisch. Wie in Tabelle III gezeigt ist,
überlebten alle Schafe, die 100 bis 200 µg/kg Lipid X während der
Vorbehandlungsphase erhielten, den nachfolgenden LPS-Angriff.
Es ist offensichtlich, daß ein 5- bis 10facher Überschuß an
Lipid X (auf Gewicht bezogen) zu LPS erforderlich ist, um ein
Überleben zu sichern. (Wegen der inhärenten LPS-Resistenz bei
Mäusen, ihrem geringen Körpervolumen und der begrenzten
Löslichkeit von Lipid X in Wasser ist es unmöglich, einen 5- bis
10fachen Überschuß an Lipid X bezogen auf LPS im Mäusesystem
zu erreichen).
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Außer der Rettung der Schafe vor den tödlichen Auswirkungen
des LPS, lindert die Vorbehandlung mit Lipid X auch einige
der schweren klinischen Symptome darunter Kurzatmigkeit,
Schwäche, Durchfall usw. Lipid X verhindert jedoch nicht
vollständig die Lungenhypertension oder Fieber, die durch LPS
ausgelöst werden.
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Frühere Arbeiten über die letale Endotoxizität von LPS
zeigten, daß nur eine begrenzte Verhütung der Komplikationen der
Injektion dieses Materials durch die Verabreichung von
Glucocortikoiden, Protstaglandinen, Naloxon, blutdrucksteigernden
Mitteln, Flüssigkeitsersatztherapie oder Anti-LPS-Antikörper
erreicht werden konnte. Außerdem hängen alle bekannten
Therapien gegen die Letalität von LPS davon ab, daß sie vor oder
sehr kurze Zeit nach der Verabreichung von LPS gegeben
werden. Bei der Maus scheint Lipid X jedoch die letale
Endotoxizität
selbst dann zu verhindern, wenn es 6 Stunden nach dem
Lipopolysaccharid gegeben wird.
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Der von Lipid X erreichte akute Schutz kann eine gewisse
Beziehung zu der biologischen LPS-Toleranz haben, die in der
klinischen Literatur beschrieben ist. Ein Lipid-X-induzierter
Schutz gegen LPS ist jedoch unmittelbar und klingt nach
einigen Stunden ab, während die klassische Toleranz mehrere Tage
nicht erscheint und teilweise durch Antikörper vermittelt
sein kann.
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Die Erfindung ist nützlich zum Lindern pathologischer
Zustände, die durch viele der endotoxininduzierten Krankheiten wie
sie in Tabelle I aufgelistet sind, hervorgerufen werden. Dies
ist ein äußerst wichtiger therapeutischer Aspekt, da die
Zeichen und Symptome einer Krankheit nicht immer auftreten
müssen, bevor eine Therapie eingeleitet wird. Obwohl der
Mechanismus (die Mechanismen), wodurch schützende Verbindungen
eine durch LPS induzierbare GTPase-Aktivität inhibieren, im
Assay unerkannt bleibt, passen die Daten am besten für
Stoffe, die einen Signalübertragungsweg unterbrechen, bei dem
Purinrezeptoren beteiligt sind, die mit einem auf Endotoxin
reagierenden G-Protein verknüpft sind (d. h. GTPase), was
letztlich zu einer Freisetzung von TNF durch die Makrophagen
führt.
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Die als inhibierend für die GTPase-Aktivität identifizierten
Verbindungen und ihre verschiedenen modifizierten Derivate
können auf intravenösem, intraperitonealem oder
intramuskulärem Wege in den Kreislauf eines Tiers eingeführt werden, um
einen Zustand relativer Resistenz gegen die schädlichen
Wirkungen von Lipopolysaccharid zu induzieren. Wenn sie auf
diese Art angewendet werden, können die Verbindungen in Form
parenteraler Lösungen verabreicht werden, die ausgewählte
Schutzverbindung in einer sterilen Flüssigkeit enthalten,
die für intravenöse oder eine andere Verabreichung geeignet
ist. Der exakte Weg, die Dosis und Verabreichungszeit der
aktiven Verbindung schwankt je nach Größe und Gewicht des
Tiers und der Art und dem gewünschten Maß an Schutz. Im
allgemeinen ist die Dosis jedoch ähnlich der für Lipid X und
proportional zur Fähigkeit der Verbindung, GTPase im
Vergleich zu Lipid X zu inhibieren.
Tabelle I
Endotoxämien bei Haustieren und Nutztieren und anderen
pathophysiologischen Gruppen mit hoher Wahrscheinlichkeit
eines Schutzes oder einer Behandlung durch Verabreichung von
Verbindungen, die GTPase inhibieren sind folgende:
(Forts. Tabelle I)
Tabelle II
Krankheiten des Menschen mit hoher Wahrscheinlichkeit eines
Schutzes oder einer Behandlung durch Verabreichung von
Verbindungen, die GTPase inhibieren sind folgende:
Tabelle III
Schutz von Schafen gegen die tödlichen Wirkungen von
intravenösem Lipopolysaccharid
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a) Verabreicht 1 Stunde vor dem Endotoxin
-
b) Verabreicht 15 min vor dem Endotoxin
Tabelle IV
Weitere Anwendungen für Purinorezeptorinhibitoren außer
Endotoxin: