DE69216333T2

DE69216333T2 - Nicht-a, nicht-b hepatitis test

Info

Publication number: DE69216333T2
Application number: DE69216333T
Authority: DE
Inventors: Terukatsu Arima; Delia Bethell; Michael Jolley; David Leahy; Dinesh Shah; John Todd
Original assignee: Dade International Inc
Current assignee: Dade International Inc
Priority date: 1991-03-26
Filing date: 1992-03-26
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2012-03-27
Also published as: JP2655205B2; ES2098511T3; EP0532746A1; AU1778592A; EP0532746B1; JPH05507296A; DE69216333D1; AU640569B2; CA2082924A1; US5635346A; WO1992017612A1; EP0532746A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Entdeckung des Verursachers von Hepatitis B, zusammen mit der Entwicklung von hochempfindlichen Nachweismaterialien für die Detektierung des Krankheitserregers in gespendetem Blut, haben zu einer schnellen, tatsächlichen Eliminierung dieses Virus aus der Blutversorgung geführt. Es wurden jedoch bald andere Virusformen von Hepatitis ersichtlich, die mit Transfusionen im Zusammenhang stehen, und wurden im allgemeinen mit Nicht-A und Nicht-B Hepatitis (NANBH) bezeichnet. Aus Untersuchungen, die die Einbringung von infiziertem Blut in Schimpansen betrafen, wurde ersichtlich, daß es mehr als eine infektiöse Krankheitserregerart gibt, die NANBH verursacht (siehe zum Beispiel Bradley et al., J. Infect. Dis., 148 (1983), 254). Aus den frühen Untersuchungen ist auch ersichtlich, daß die Isolierung des reinen Virus außerordentlich schwierig ist, da seine Anwesenheit in Blut, sogar in den akuten Infektionsphasen, nur in der Größenordnung von 1000 Infektionseinheiten pro ml ist.
Obwohl die Primärisolierung fehlschlug, wurde das Virus trotzdem charakterisiert, hauptsächlich durch eine Anzahl von Merkmalen. Die Inaktivierung des Krankheitserregers durch Chloroform implizierte ein umhülltes Virus (Hotta & Evans, Virology, 2 (1985), 773). Die Filtrierung von NANBH- Krankheitserregern durch Membrane mit unterschiedlichen Porengrößen deutete auf einen Größenbereich von 3 bis 60 nm. Es wurde des weiteren bestimmt, daß NANBH-Krankheitserreger bei ungefähr 200S mit einer Schwebedichte von 1,24 g/cc sedimentierten. Schließlich wurde der Krankheitserreger durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht (Cabral et al., Gastroent., 81 (1981), 120). Alle Daten stimmen mit der Schlußfolgerung überein, daß NANBH-Krankheitserreger Toga- oder Flaviviren sind, oder Mitglieder einer Gruppe, die mit den Toga- oder Flaviviren eng verwandt ist.
Der Durchbruch in der NANBH-Forschung kam im Verlauf des Durchgangs des NANBH-Virus, der aus einem kontaminierten, gereinigten Faktor VIII erhalten worden war, durch Schimpansen. Bradley et al., Seminars in Liver Disease, 6 (1986), 56, entdeckten, daß der Titer von NANBH-Infektionseinheiten in einem bestimmten Schimpansen eintausendmal größer war, wie der Titer, der normalerweise beobachtet wird. Diese angereicherte NANBH-Krankheitserregerquelle erlaubte die Erstellung und das Screening einer cDNA-Bibliothek durch Houghton et al. (EP 0 138 216), die das Lambda-GTLL-System verwendeten, das von Young & Davis, PNAS, 80 (1983), 1194, erfunden worden war. EP 0 318 216 offenbart eine große, offene Leserasterdomäne, die das C-100 Polypeptid enthält, das das Target-Antigen in einem kommerziellen Immunonachweismaterial zur Diagnose von NANBH ist. Diese Offenbarung steht im Anhang einer zweiten Europäischen Patentanmeldung (EP 0 388 232), die weitere Sequenzen offenbart, die einen beträchtlichen Abschnitt des Polypeptids wiedergeben, der möglicherweise mit den 5 Prime-Enden des Virusgenoms übereinstimmt, das mutmaßliche Strukturproteine kodiert.
Zu anderen kürzlich vorgenommenen Patentanmeldungen gehören WO 90,02206 (Seto), das weitere Sequenzen offenbart, die von Leberteilen von Patienten geklont wurden, die an NANBH leiden. WO 90/00597 (Neeley) unterbreitet ein Verfahren zur Herstellung des Virus aus immobilisierten menschlichen Leberzellen, die aktiven NANBH-Viren herstellen. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Antivirus-Genen wird in EP 0 190 972 (Yohko) offenbart und beinhaltet ein Zentrifugationsverfahren an Saccharosegradienten von Proteinen, die aus infiziertem Schimpansen-Lebergewebe abgeleitet sind. Monoklonale Antikörper wurden auch in '972 durch Umwandlung von Lymphozyten von NANBH-infizierten Menschen oder Schimpansen mit dem Epstein-Barr Virus erhalten, und Screening nach Klonen, die Antikörper absondern, die spezifisch für die gradientengereinigten Antigene sind. Die vorstehenden NANBH- Polypetidsequenzen sollen in diagnostischen Nachweismaterialien nützlich sein.
Zusätzliche Sequenzen von NANBH sind in EP 0 363 025 (Arima) angegeben. Die Sequenzen wurden aus RNA erhalten, die aus Viren extrahiert wurden, die aus ungefähr 100 Litern Plasma von Patienten mit NANBH konzentriert wurden. Die Sequenzen wurden durch Immunoscreening einer Lambda-GTLL-cDNA- Bibliothek identifiziert. Von den Klonen, die positiv gescreent wurden, enthielt ein Klon das Klon-18-Peptid mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleinsäuresequenz kodiert war, die in Anspruch 2, Formel III in EP 0 363025 (Arima) beschrieben ist.
EP-A-0445801 bildet nur nach Artikel 54(3) EPC einen Teil des Standes der Wissenschaft. Dies Dokument offenbart ein Peptid, das in der Lage ist sich an einen Antikörper anzulagern, der spezifisch für ein NANBH-Antigen ist. Die Peptide, auf die in Anspruch 2 kein Anspruch erhoben wird, werden in EP-A-0445801 offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Nachweismaterial nach Anspruch 1, ein Peptid nach Anspruch 2 und einen Impfstoff nach Anspruch 3 zur Verfügung. Die Einleitungen der Ansprüche 1 und 3 basieren auf EP-A-0363025.
Bei der Formatierung eines Nachweismaterials zum Detektieren von Antikörpern, die in Patientenseren enthalten sind, auf einen NANBH-Krankheitserreger, wurde ein Polypeptid mit 63 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz
R, von der bekannt ist, daß es immunoreaktiv mit bestimmten NANBH-Sera ist, wie bei Arima in EP 0 363025 beschreiben, durch schrittweises Verkürzen der Sequenz von der Amino-Endstellung verändert. Das verbesserte Nachweismaterial der vorliegenden Erfindung verwendet ein verkürztes Fragment, das im wesentlichen homolog dem Abschnitt des Polypeptids ist, der sich aufeinanderfolgend von einem Aminosäurerest erstreckt, der aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Aminosäuren besteht, die in der Sequenz vom Rest 21 bis 26 bis zu im wesentlichen Arginin am Carboxy-Ende enthalten sind.
In einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung enthält das Peptidfragment wenigstens ein Epitop, das mit Seren reaktionsfähig ist (erhalten von Einzelpersonen, die mit NANBH befallen sind), eliminiert aber den Abschnitt des Polypeptids aus 63 Aminosäuren, der sich von einer der Aminosäuren der Reste 21 bis 26 bis zum N-Terminus erstreckt, von dem gefunden wurde, daß er zu einer unspezifischen Bindung, einer hohen Untergrundzählrate und falschen positiven Signalen in Immunonachweismaterialien beiträgt. Diese Peptide sind sowohl als Impfstoffe wie auch in diagnostischen und Screening-Nachweismaterialien von Nutzen.
In einer Ausführungsform des verbesserten Nachweismaterials, das die Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet, wird ein Target-Peptidfragment auf eine Festkörpermatrix als Beschichtung aufgetragen, und der Nachweis wird derart durchgeführt, daß eine Probe, welche auf das Peptid ausgerichtete Antikörper enthält, zur Bildung eines Anitkörper-Peptid-Komplexes inkubiert wird, wodurch nicht umgesetztes Probenmaterial von dem auf der Festkörpermatrix immobilisierten Komplex abgetrennt wird, und die Menge der Antikörper in dem Komplex mit einer Detektiereinrichtung quantitativ erfasst wird.
Die Festkörpermatrix enthält vorzugsweise Teilchen in einer Größenordnung von etwa 0,1 bis 100 µm.
In einer anderen Ausführungsform des verbesserten Nachweismaterials wird das Target-Fragment mit einem Fluorophor konjugiert, und der Nachweis wird derart durchgeführt, daß eine Probe, welche auf das Peptid ausgerichtete Antikörper enthält, zur Bildung eines Antikörper-Peptid- Komplexes inkubiert wird, und die Fluoreszenzpolarisation des Komplexes in Lösung gemessen wird. Das Ausmaß der Komplexbildung kann somit durch einen solchen homogenen Nachweis ohne einen Phasentrennungsschritt gemessen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein Diagramm, das die Polypeptid-Aminosäuresquenz veranschaulicht, und die verschiedenen Peptidfragmente, die daraus abgeleitet sind. Es ist zu beachten, daß die Aminosäurestellung 1 bei Glutamin beginnt.
Figur 2 ist ein Balkendiagramm, das die Auswirkung auf die Nachweis-Untergrundwerte beim Eliminieren der ersten 20 Aminosäuren von der Amino-Endstellung des Polypeptids zeigt.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die Peptidfragmente, die in dem verbesserten Nachweismaterial der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind von einem Polypeptid abgeleitet, das eine Antigen-Anikörper- Reaktionsspezifizität mit Seren von Patienten zeigt, die von NANBH genesen oder damit befallen sind. Die Nukleinsäuresequenz des bestimmten Polypeptids wurde in EP 0 363 025 (Arima) veröffentlicht und ist darin nachgewiesen (als Formel III in Anspruch 2). Die Immunreaktivität des Klons wurde durch Immunoscreeningmethoden nach Erstellung einer Lambda-GTLL- Bibliothek ermittelt. Die Peptidsequenz, die der Nukleotidsequenz entspricht, wird in Figur 1 , Peptid A, gezeigt, und stellt ein Polypeptid mit 63 Aminosäuren dar, mit einem Arginin in Carboxy-Endstellung und einem Glutamin in Amino- Endstellung. Bei der Herstellung synthetischer Peptide mit dieser Sequenz wird ein zusätzliches Phenylalanin am N- Terminus angefügt, um eine Zyklisierung des endständigen Glutamins während der Spaltung des Peptids vom Harz zu verhindern.
Alle Peptidfragmente, die von dem Polypeptid mit 63 Aminosäuren abgeleitet sind (sowie die vollständige Polypeptid-Kontrollprobe), wurden in Amidform auf dem Peptid- Synthetisator von Milligen-Biosearch Modell 9600 unter Verwendung des Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) Aminoschutzverfahrens und der 1-3 Diisopropylcarbodiimid-Kupplungschemie synthetisiert. Die Amidform der Sequenz wurde verwendet, weil erwartet werden konnte, daß sie das biologisch aktive Analogon eher nachahmt wie die Form der freien Säure. Aktivierte Aminosäuren wurden an ein 2,4-Dimethoxybenzhydrylamin-Harz gekoppelt. Die Peptidsynthese wurde für alle Aminosäuren durch Ninhydrin-Analyse überwacht, außer für Prolin, für das ein Isatintest durchgeführt wurde. Das synthetisierte Peptid wurde von dem Harz durch Reagens R abgespalten, das aus Trifluoressigsäure, Thioanisol, Ethandithiol und Anisol mit einem Volumenverhältnis von 90:5:3:2 besteht.
Die von den Harzen abgespaltenen Peptide wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt, und durch das Porton PI 20 90 E Integrated Micro-Sequencing System charakterisiert, um die richtige Sequenz zu bestätigen. Die Reinheit wurde durch HPLC auf einer Umkehrphasensäule unter Verwendung eines linearen Gradienten in 0,1%-iger Trifluoressigsäure aus 5 bis 40%-igem Acetonitril während 35 Minuten ermittelt. Das Absorptionsmaß wurde bei 230 nm verfolgt.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Peptide biologisch in Klonen durch Manipulation von Promotor, Ribosom-Bindung und Translations-Terminatorstellen hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können einfach in jedem Nachweissystem verwendet werden, das ein Target-Protein verwendet. In der bevorzugten Ausführungsform wird das Target- Peptidfragment durch passive oder kovalente Beschichtungsverfahren auf eine Festkörpermatrix, wie paramagnetische Mikroteilchen, aufgetragen.
Die Festkörpermatrix kann aus paramagnetischen Teilchen zur passiven und/oder kovalenten Kopplung bestehen, die bezüglich Polystyrol oder Carboxyl- oder Aminogruppen funktionalisiert sind. Im Anschluß an einen Inkubationsschritt in Anwesenheit von anti-NANBH-Antikörpern wird der gebundenen Antikörper-Peptid-Komplex von nicht umgesetzten Antikörpern durch magnetische Trennung abgetrennt, und es wird die Antikörpermenge in dem Antikörper-Peptid-Komplex bestimmt.
Der Nachweis von komplexierten anti-NANBH-Antikörpern kann einfacherweise durch weiteres Umsetzen des Komplexes mit antimenschlichen Antiseren durchgeführt werden, an die ein Enzym angelagert ist. Bei der Abtrennung des markierten Komplexes durch paramagnetische Teilchen, durch magnetische Abtrennung und Waschen, wird ein Fluoreszenz-erzeugendes Enzymsubstrat zugegeben. Das Fluoreszenz-Ausmaß ist dann direkt proportional der Menge des in der Probe vorhandenen anti-NANBH-Antikörpers.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide durch Beschichtung auf Vertiefungen von Mikrotiterplatten nach dem klassischen Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) aufgetragen, mit der Probe inkubiert, abgesaugt und ein enzymkonjugiertes antimenschliches Antiserum zugegeben werden. Die Detektierung wird üblicherweise durch Zugabe des entsprechenden Substrat/Chromogen und Messen des sich daraus ergebenen Produktes durchgeführt. Für eine allgemeine Besprechung von ELISA, siehe Langone et al., Immunological Techniques, Part D Immunoassays. Methods in Enzymology, S. 84 (1982).
Zu anderen, weiteren Nachweisformaten, die auf die vorliegenden Peptide angewandt werden können, gehören Western Blot, Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 76 (1979), 4350; Radioimmune Assay (RIA), Walsh et al., J. Infect. Dis., 21 (1970), 550; Competitive Assays, Diamandis, Clin., Biochem., 21 (1988), 139; Noncompetitive Assays, Crook et al., J. Gen. Virol., 46 (1980), 29; Immunoprecipitation, Tojo et al., Clin. Chem., 34 (1988), 2423 und Dot Blots, Jahn et al., Proc. Natl Acad Sci 81 (1984), 1684; PCFIA, Jolley et al., J. Immunol. Meth. 67 (1984), 21.
Von besonderem Interesse ist ein homogener Nachweis auf der Basis von Fluoreszenzpolarisation. Bei diesem Nachweis wird das Target-Peptidfragment mit einem Fluorophor, wie Fluorescein, konjugiert, und mit einer Probe inkubiert, die anti-NANBH-Antikörper enthält, um einen Antikörper-Peptid- Komplex zu bilden, mit anschließender Messung der gesteigerten Fluoreszenzpolarisation. Dies ist dadurch eine reizvolle Alternative gegenüber anderen Nachweisverfahren, daß Phasentrennungsschritte unnötig sind, und das Ergebnis unmittelbar von dem anfänglichen Reaktionsgemisch abgelesen werden kann.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind auch als Impfstoffe bei der Behandlung von NANBH-Infektionen nützlich. Da die Epitope des 63mer Polypeptids alle in der Familie der Peptidfragmente enthalten sind, von der die N-endständige, nichtspezifische Bindungssequenz eliminiert wird, behalten die Fragmente alle antigenen Determinanten zurück, wenn sie als Impfstoff verwendet werden. Die nachstehend angegebenen Daten der Blutungs-Reihenuntersuchung legen nahe, daß diese Peptide wenigstens ein dominantes Epitop umgrenzen, da das Detektieren bei viele Patientenseren bei früheren Blutungen erfolgt, wie sie von den Nachweismaterialien, die zur Zeit auf dem Markt sind, nachgewiesen werden können.
Unter Bezugnahme auf Figur 1, weisen die erfindungsgemäßen Peptide eine Familie von Peptiden auf, die von dem Carboxy-43mer Peptid des von Arima beschriebenen 63(64)mer (Peptid A) umgeben sind und sich von im wesentlichen Rest Nummer 63 bis zu im wesentlichen Rest 21 am Amin in Endstellung erstrecken.
Es sollte betont werden, daß geringe Änderungen der Sequenz, z.B. Substitutionen, Hinzufügungen oder Eliminierungen von Aminosäuren nicht merklich die Wirkungsweise des Nachweismaterials beeinflussen. Peptide mit solch geringen Strukturänderungen werden als Äquivalente der Peptide betrachtet, die eine strenge Homologie mit der Sequenz des ursprünglichen Polypeptids haben.
In Figur 1 ist die Aminosäuresequenz der Gesamtsequenz horizontal in einer Anzahl vertikaler Spalten mit Linien dazwischen angegeben, die die entsprechende Ausdehnung des einzelnen Peptidfragments angeben, das entsprechend dem vorstehenden allgemein gehaltenen Schriftsatz synthetisiert wurde. Somit gibt zum Beispiel die zweite Linie in Figur 1, die horizontal verläuft, das Peptid an, das das 12 bis 63mer umfasst; und die dritte Linie, die horizontal verläuft, gibt das Peptid an, das das 21 bis einschließlich 63mer umfasst, und so weiter.
Die erfindungsgemäßen Peptide wurden als Targets in anti-NANBH-Antikörper-Nachweismaterialien verwendet, die entweder in paramagnetischen Mikroteilchen oder nach dem ELISA-Format der beschichteten Vertiefungen konfiguriert waren, wie vorstehend beschrieben, und wie genauer in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß sich die Wirksamkeit des Nachweismaterials deutlich verbessert, wenn die Amino-endständigen Reste eliminiert werden, um Peptidfragmente herzustellen, die sich von im wesentlichen dem Arginin am Carboxy-Ende zu einem beliebigen Rest in der Sequenz von etwa Rest 26 bis 21 erstrecken.
Die drastische Verbesserung der Wirksamkeit des Nachweismaterials ergibt sich aus dem Verlust einer merklichen Untergrundzählrate (unspezifische Bindung) bei gleichzeitiger Signalverstärkung.

BEISPIEL 1

Es wurden Peptide entsprechend der in Figur 1 veranschaulichten Sequenz hergestellt, wie vorstehend angegeben. Die Peptide wurden dann passiv auf paramagnetische Mikroteilchen (mit der Größe 0,1 bis 10 Mikrometer) entsprechend dem nachfolgenden Verfahren als Beschichtung aufgetragen: 250 ul von 5 Gew.%/Volumen von 4 um paramagnetischer Teilchen wurden in einer Mikrozentrifuge bei 5000 UpM für 5 Minuten pelletisiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Teilchenpellets 15 Minuten mit 500 ul 70%-igen Ethanol resuspendiert. Die Teilchen wurden dann wie vorher pelletisiert, und der Überstand entfernt. Die Teilchen wurden in 500 ul 0,1 M CAPS- Puffer ((3-Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure) bei einem pH- Wert = 11,0 resuspendiert. Die Teilchen wurde wie vorher pelletisiert, und der Überstand entfernt.
Das lyophilisierte Peptid wurde ausgewogen und in sterilfiltriertem (0,22u) Wasser resuspendiert, wodurch sich eine Peptidkonzentration von 10 mg/ml ergab, und ermöglicht sich 30 Minuten bei Raumtemperatur zu einer Lösung zu lösen. Das gelöste Peptid wurde weiter auf 500 ug/ml in 0,1 M CAPS- Puffer bei einem pH-Wert = 11,0 verdünnt und ermöglicht, sich 20 Minuten bei Raumtemperatur zu stabilisieren. 250 ul dieser Peptidlösung wurden dann auf die gewaschenen Teilchenpellets übertragen. Die Teilchen wurden resuspendiert und dann 12 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur getrommelt.
Die passiv absorbierten Peptidteilchen wurden dann 3,5 Minuten bei 5000 UpM pelletisiert, der Überstand entfernt, und die Teilchen zweimal in isotonisch gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 Detergens resuspendiert. Die Teilchen wurde weiter pelletisiert und dreimal in isotonisch gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert. Die beschichteten Teilchen werden dann in isotonische gepufferter Kochsalzlösung auf eine endgültige Teilchenkonzentration von 0,025 Gew.%/Volumen resuspendiert.

BEISPIEL 2

Ein Nachweismaterial mit paramagnetischen Teilchen unter Verwendung von Teilchen, die mit Peptidfragmenten, die in Figur 1 beschrieben sind, beschichtete sind, wurde wie folgt ausgeführt: Menschliches Serum oder Plasma wurde 1:1000 in Wellpuffer verdünnt (0,103 M Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 1,05 M Natriumchlorid, 0,33% NP-40 , 0,09% Natriumazid und 15% Serum eines neugeborenen Kalbes).
50 ul der verdünnten Probe wurden in jede Vertiefung einer schwarzen Pandex Mikrotiterplatte gegeben. Die Proben wurden in Wiederholungen von wenigstens 2 untersucht. Es wurden paramagnetische Teilchen, die mit Peptiden beschichtet waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, in jede Vertiefung (20 ul) gegeben. Die Platte wurden dann 30 Minuten bei 37 ºC abgelegt.
Nach Beendigung der Inkubation wurden die Teilchen in den Vertiefungen mit 100 ul PBS und Tween-20 (2,06 g Natriumhydrogenphosphat, 0,318 g Natriumdihydrogenphosphat, 0,5 ml Tween-20 , 8,76 g Natriumchlorid und 1,0 g Natriumazid pro Liter; pH-Wert 7,4) gewaschen. Während der Waschungsschritte wurden die paramagnetischen Teilchen durch ein Magnetfeld, das am Boden der Platte angelegt war, in den Vertiefungen der Mikrofilterplatte gehalten. Die Teilchen wurden auf diese Art fünfmal gewaschen.
Die Teilchen in jeder Vertiefung wurden in 30 ul Teilchen-Resuspendierungs-Puffer (4,346 g Natriumhydrogenphosphat, 0,524 g Natriumdihydrogenphosphat, 8,76 g Natriumchlorid und 1 g Natriumazid pro Liter; pH-Wert 7,4) resuspendiert. Dann wurden 20 ul menschliches anti-IgG (H + L) von einer Ziege, konjugiert mit B-Galactosidase (konjugiert) und 1:1000 in konjugiertem Verdünnungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH- Wert 7,5, 0,5 M Natriumchlorid, 5% Glycerol, 2,3 mM Magnesiumchlorid, 0,1% Natriumazid und 20% Serum von neugeborenem Kalb) verdünnt, in die Vertiefungen gegeben.
Jedes menschliches IgG oder IgM, das an die Teilchen gebunden war, wurde durch das Konjugat erkannt mit ihm vereinigt Die Konjugatlösung war so entworfen, daß sie eine maximale Flüssigkeitsstabilität und -reaktivität ergab. Insbesondere wird das Serum eines neugeborenen Kalbes gegenüber Kalbserum bevorzugt. Nach der Inkubierung mit dem Konjugat für 15 Minuten bei 37 ºC wurden die Teilchen in den Vertiefungen fünfmal mit PBS und Tween-20 gewaschen, wie vorstehen beschrieben, um im wesentlichen das gesamte nichtgebundene Konjugat zu entfernen. Das Tween-20 in der Waschlösung steigerte das Waschverfahren und entfernte nichtspezifisch gebundenes Konjugat.
Schließlich wurden 50 ul einer Substratlösung aus 4- Methylumbelliferyl-B-D-galactosid (MUG) in jede Vertiefung gegeben (0,178 g 4-Methylumbelliferyl-B-D-galactopyranosid, 3,58 g Tricin, 5,1 ml Dimethylsulfoxid, 30 ml Methylalkohol, 0,20 g Natriumazid, 0,5 ml Tween-20 pro Liter, pH-Wert 8,5). Die Anwesenheit von B-Galactosidase (d.h. Konjugat) in den Vertiefungen löste die Spaltung von MUG aus, ein fluoreszierendes Cumarinprodukt zu erzeugen. Dies Reagens und das Konjugat wurden als empfindliches Detektierungssystem verwendet. Die Fluoreszenz (Anregungswellenlänge 400 nm/Emissionswellenlänge 450 nm) wurde in zwei Zeitabständen (d.h. 2 und 14 Minuten) nach der MUG-Zugabe gemessen. Der Unterschied zwischen den zwei Werten war eine kinetische Messung der Erzeugung des fluoreszierenden Produkts und ist eine direkte Messung des Konjugats und des menschlichen IgG/IgM, das an die Teilchen gebunden ist. Die Fluoreszenzwerte wurden in nM Cumarin-Werte unter Verwendung verschiedener Cumarinkonzentrationen selbst und ihrer so erhaltenen Fluoreszenz umgewandelt, um eine Normalkurve zu erstellen.

BEISPIEL 3

Ein Nachweisverfahren mit paramagnetischen Teilchen, das NANBH-Seren und normale Spender-Seren verwendet, wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Tabelle 1A ist eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die die Wirkungsweise der Peptidfragmente B, C, D, E, F & G vergleicht (wie in Figur 1 genau angegeben).
Die Ergebnisse für die Reaktivität von vier Patienten- NANBH-Seren werden als Signal-Rauschverhältnis wiedergegeben und wurden nach der nachfolgenden Gleichung bestimmt: Die Fluoreszenz von NANBH-positiven Prüflingen dividiert durch die Durchschnittsfluoreszenz von drei verschiedenen normalen Prüflingen.
Tabelle 1B gibt die Anzahl der Standardabweichungen (erhalten von 3 Normalproben) an, mit der eine bestimmte positive Probe von dem Durchschnitt der 3 Normalproben entfernt liegt. Beide Datensätze zeigen, daß Fragment C die beste Nachweismaterial-Wirkungsweise in der Art ergibt, daß das höchste Signal-Rauschverhältnis erhalten wird, und außerdem den größten Wert von Standardabweichungen ergibt, die ein positiver Wert von den negativen Werten entfernt liegt.

BEISPIEL4

Das in Figur 2 graphisch wiedergegebene Experiment vergleicht die Wirkungsweise von Peptid A, (Figur 2A) der Gesamtlängensequenz, mit dem des Peptidfragments C (Figur 2B) unter Verwendung des Nachweises mit paramagnetischen Teilchen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Dreizehn Proben sind auf der X- Achse aufgetragen und ihre entsprechenden Nachweis-Fluoreszenzwerte (nM Cumarin) sind auf der Y-Achse aufgetragen.
Die Probennummer 1 ist von einem NANBH-Individuum, die Probennummern 2 bis 12 sind von normalen Spendern, und Probe 13 ist eine Pufferkontrollprobe einer Probenverdünnung.
Die Daten zeigen, daß die Entfernung von 20 Aminosäuren (1 bis 20) von der Amino-Endstellung des Peptids nicht die Reaktivität des NANBH-Prüflings verringert, aber drastisch die nichtspezifische Bindungsreaktivität (Untergrund) von negativen Seren verringert.

Beispiel 5

Der Nachweis mit paramagnetischen Teilchen wurde gemäß Beispiel 2 unter Verwendung der Peptidfragmente A, B und C durchgeführt, die getrennt als Beschichtung auf Teilchen aufgetragen worden waren. Die Plasmen von zehn verschiedenen NANBH-Individuen und 1 normalen Spender wurden untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als Signal-Rauschverhältnis wiedergegeben. Das Signal-Rauschverhältnis wurde berechnet, wie früher genau angegeben (Beispiel 3).
Die Daten zeigen klar, daß die Entfernung von 11 Aminosäuren (1 bis 11) von der Amino-Endstellung des Peptids (Peptid B) eine gesteigerte Unterscheidung zwischen NANBHpositiven Patientenplasmaproben und normalen Plasmaproben ohne Verlust der Reaktivität einer positiven Probe im Vergleich zu dem Gesamtpeptid (Peptid A) zur Folge hat.
Sogar wenn mehr Aminosäuren entfernt werden, um Fragment C herzustellen (d.h.: 20 Aminosäuren), hat dies eine bessere Nachweis-Unterscheidung zur Folge.

Beispiel 6

Um weiter die N-endständigen Aminosäuren von Fragment A zu präzisieren, die zu dem Untergrund- und dem positiven Signal beitragen, wurde der in Beispiel 2 beschriebene Nachweis mit paramagnetischen Teilchen mit den Peptidfragmenten H bis L durchgeführt. Die Peptide waren, wie nachfolgend angegeben:
22 Aminosäuren von der Amino-Endstellung von Peptid A (Peptid H) entfernt
23 Aminosäuren von der Amino-Endstellung von Peptid A (Peptid I) entfernt
25 Aminosäuren von der Amino-Endstellung von Peptid A (Peptid J) entfernt
28 Aminosäuren von der Amino-Endstellung von Peptid A (Peptid K) entfernt
30 Aminosäuren von der Amino-Endstellung von Peptid A (Peptid L) entfernt.
Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Tabelle 3 als Signal-Rauschverhältnis von 8 verschiedenen positiven NANBH-Plasmen geteilt durch den Durchschnitt von 11 normalen Spenderplasmen wiedergegeben.
Die Peptide H, I und J zeigen eine starke, fast gleiche Wirkungsweise. Die Peptide K und L zeigen mit 5 der 8 positiven Seren eine drastisch verringerte Reaktivität, und eine teilweise verringerte Reaktivität mit den 3 verbliebenen positiven Seren. Das verringerte Signal-Rauschverhältnis trat aufgrund eines Verlustes von positiven Signalen auf und nicht aufgrund von gesteigerter Reaktivität mit normalen Spendern (d.h.: Untergrund). Hierdurch wird klar einen Bereich in diesen Peptiden abgegrenzt, der zur NANBH-Plasmaimmunreaktivität beiträgt. Des weiteren zeigen diese Daten, daß ein Immunreaktivitätsbereich zwischen den Aminosäuren 23 bis 29 und insbesondere den Aminosäuren 26 bis 29 besteht, wobei durch Entfernen dieses Bereichs (d.h.: wie in Fragment K) ein abgeschwächtes positives Signal bemerkt wird.

Beispiel 7

Tabelle 4 vergleicht die Wirkungsweise von Peptid A mit allen Peptidfragmenten, von denen Aminosäuren von der Amino-Endstellung entfernt wurden (Peptidfragmente B, C, H, I, J, K & L). Außerdem wurde Peptid M, das die Aminosäuren #9 bis #45 umfasst, ebenfalls unter Verwendung des Nachweises mit paramagnetischen Teilchen von Beispiel 2 untersucht.
Die Wirkungsweise eines jeden Peptids wurde unter Verwendung der Anzahl der Standardabweichungen, mit der jede positive Probe vom Durchschnitt der negativen Proben entfernt liegt, bestimmt, und wurde berechnet, wie in Tabelle 4 beschrieben.
Die Daten zeigen, daß, wenn Aminosäuren von der Amino- Endstellung von Fragment A entfernt werden, sich die Wirkungsweise des Nachweismaterials in der Art verbessert, daß B besser ist wie A, C besser ist wie B und H besser ist wie C. Die Gesamtwirkungsweise des Nachweismaterials war für H, I und J vergleichbar. Die Fragmente K, L und M haben eine schlechte Wirkungsweise des Nachweismaterials, was der abgeschwächten NANBH-positiven Signalreaktivität zuzuschreiben ist. Fragment M enthält den immunreaktiven Bereich zwischen den Aminosäuren 23 und 29, wie in Beispiel 6 beschrieben, zeigt aber eine schlechte Reaktivität gegenüber positiven Proben. Fragment M enthält nicht die 7 Aminosäuren am Carboxy-Ende der Fragmente A, B, C, H, I, J, K oder L, somit werden diese Aminosäuren sm Carboxy-Ende zusammen mit den Aminosäuren 23 bis 29 für eine NANBH-positive Probenreaktion und gute Wirkungsweise des Nachweismaterials benötigt.

Beispiel 8

Die in Tabelle 5 wiedergegebenen Daten zeigen die Auswirkung der Entfernung von 7 Aminosäuren von der Carboxy-Endstellung von Peptidfragment H, was Fragment N zur Folge hat. Die Ergebnisse wurden mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Nachweis mit paramagnetischen Teilchen erhalten und sind als Signal-Rauschverhältniswerte wiedergegeben.
Eine drastische Verringerung des Signal-Rauschverhältnisses mit den NANBH-Plasmaproben Nummer 2, 5 und 6 zeigt klar, daß bestimmte Aminosäurereste in den Aminosäuren der Nummern 56 bis 63 in einem Fragment enthalten sein müssen, um die beste Wirkungsweise des Nachweismaterials zu erhalten.

Beispiel 9

Die in Figur 1 beschriebenen Peptidfragmente wurden unter Verwendung eines ELISA-beschichteten Vertiefungs-Mikrotiterplattenformats untersucht. Der Nachweis wurde wie folgt durchgeführt: Peptid A wurde auf 75 ug/ml in 0,1 M CAPS-Puffer verdünnt. pH-Wert 11,0, und 50 ul dieser Lösung wurden zu entsprechend gekennzeichneten Vertiefungen (48 Vertiefungen eines Costar 96 Well EIA Plate) gegeben, und dem Peptid wurde ermöglicht über Nacht bei Raumtemperatur zu absorbieren. In ähnlicher Weise wurden in die verbliebenen 48 Vertiefungen 50 ul einer Lösung von Fragment H pipettiert und ermöglicht zu absorbieren.
Die Vertiefungen wurden fünfmal mit 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,05% Tween-20 gewaschen und weitere fünfmal mit 100 ul PBS. Die beschichtete Platte wurde dann unter Verwendung eines Standard-Mikrotiterplatten-Nachweisformats untersucht. Konjugat, Waschpuffer und Substrat waren von einem Ortho ELISA Testsystem.
200 ul Prüflings-Verdünnungsmittel wurden zu jeder Vertiefung gegeben, dann wurden 20 ul eines jeden Prüflings (Serum oder Plasma) zu der Vertiefung gegeben. Die Platte wurde für 10 Sekunden sanft vermischt und dann 1 Std. bei 37 ºC abgelegt. Die Platte wurde fünfmal mit PBS-Tween gewaschen, dann wurden 200 ul menschliches IG-Merrettich Antiperoxidasekonjugat in alle Vertiefungen gegeben und 1 Std. bei 37 ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann wie vorstehend gewaschen, und 200 ul OPD (o-Phenylendiamin-2HCl)/Substrat wurden in jede Vertiefung gegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden 50 ul 4N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung gegeben. Die optische Dichte wurde bei 490 nm in einem Biotek Plattenablesegerät bestimmt.
Die Ergebnisse in Tabelle 6A und 6B vergleichen die Reaktivität von Peptid A zu Peptid H unter Verwendung von neun NANBH-Patientenseren und zwölf normalen Seren. Wie bei dem Nachweis mit paramagnetischen Teilchen zu sehen war, zeigt das ELISA-System, das das verbesserte Peptidfragment verwendet (Fragment H) verbesserte Leistungsniveaus zur Unterscheidung von NANBH-positiven Patientenseren von normalen Patientenseren. Tabelle 6A gibt die Ergebnisse als Signal-Rauschverhältnis wieder, und Tabelle 6B gibt die Ergebnisse als die Anzahl der Standardabweichungen wieder, die ein positives NANBH-Patientenserum von einem negativen (normalen) Bevölkerungsdurchschnitt entfernt liegt.

Beispiel 10

Plasma von einer Aufeinanderfolge von sechs aufeinanderfolgenden Blutungen von zwei Patienten mit NANBH- Infektionen wurden unter Verwendung von Fragment H und des in Beispiel 2 beschriebenen Nachweises mit paramagnetischen Teilchen untersucht. Die in Tabelle 7 zusammengefassten Daten zeigen, daß die erfindungsgemäßen Peptide in der Lage sind positive Prüflingsreaktionen zu ähnlichen oder früheren Blutungszeiten verglichen mit einem kommerziellen Test (Ortho HCV ELISA Test System), das von Ortho Diagnostics Inc. hergestellt wird, zu detektieren. Tabelle 1A Reaktivität von NANBH-Plasmaprüflingen zu Peptdfragmenten*:
* Die Ergebnisse geben das Signal-Rauschverhältnis (Untergrund) wieder, das wie folgt bestimmt wurde:
Die Fluoreszenz von positiven Prüflingen geteilt durch die Durchschnittsfluoreszenz von 3 unterschiedlichen normalen Prüflingen.

ANMERKUNG:

Ein Signal-Rauschverhältnis > 1,0 zeigt, daß die Peptidsequenz mit NANBH-positvem Patientenplasma mehr reagiert, wie mit NANBH-negativem Patientenplasma. Tabelle 1B Anzahl der Standardabweichungen, die die Reaktivität von NANBH-positive Plasmaprüflingen von der Reaktivität normaler (negativer) Plasmaprüflingen beabstandet*
* Die Ergebnisse geben die Anzahl der Standardabweichungen wieder, die eine Probe von dem negativen Durchschnitt entfernt ist, und sind wie folgt berechnet: (NANBH-positiver Probenwert - Durchschnittswert von 3 negativen Proben) dividiert durch die Standardabweichung des Durchschnittswertes von 3 negativen Proben. Tabelle2 Vergleich des Signal-Rauschverhältnisses von Peptidfragmenten*
* Die Ergebnisse geben das Signal-Rauschverhältnis (Untergrund) wieder, das wie nachfolgend bestimmt wurde:
Die Fluoreszenz von positiven Prüflingen dividiert durch die Fluoreszenz von negativen Prüflingen.
Ein Signal-Rauschverhältnis > 1,0 zeigt, daß die Peptidsequenz mit NANBH-positvem Patientenplasma mehr reagiert, wie mit NANBH-negativem Patientenplasma. Tabelle3 Reaktivität von NANBH-Plasmaprüflingen zu Peptidfragmenten*:
* Die Ergebnisse geben das Signal-Rauschverhältnis (Untergrund) wieder, das wie nachfolgend bestimmt wurde: Die Fluoreszenz von positiven Prüflingen dividiert durch die Durchschnittsfluoreszenz von 11 unterschiedlichen negativen Prüflingen. Ein Signal-Rauschverhältnis > 1,0 zeigt an, daß die Peptidsequenz mit NANBH-positiven Patientenseren mehr wie mit NANBH-negativen Patientenseren reagiert.

Tabelle 4

Anzahl von Standardabweichungen, die die Reaktivität von NANBH-positive Plasmaprüflingen von der Reaktivität normaler (negativer) Plasmaprüflingen beabstandet*
* Die Ergebnisse geben die zahlenmäßigen Standardabweichungen wieder, die eine Probe von dem negativen Durchschnitt entfernt ist, und wird wie folgt berechnet: (Probenwert - Durchschnittswerte von 11 negativen Proben) dividiert durch die Standardabweichung des Duchschnittswertes von den 11 negativen Proben. Tabelle 5 Auswirkung der Entfernung von 8 Aminosäuren von dem C- Terminus*
* Die Signale geben das Signal-Rauschverhältnis (Untergrund) wieder, das wie folgt bestimmt wurde:
Die Fluoreszenz von positiven Prüflingen dividiert durch den Durchschnittsfluoreszenzwert von 11 unterschiedlichen negativen Prüflingen.
Ein Signal-Rauschverhältnis > 1,0 zeigt an, daß die Peptidsequenz mit NANBH-positiven Patientenseren mehr reagiert wie mit NANBH-negativen Patientenseren.

Tabelle 6A

EIA mit beschichteten Vertiefungen: Peptidfragmentvergleich Vergleich des Signal-Rauschverhältnisses von Peptidfragmenten*
* Die Ergebnisse geben das Signal-Rauschverhältnis wieder, das wie folgt bestimmt wurde:
Die optische Dichte der positiven Prüflinge dividiert durch die optische Durchschnittsdichte der negativen Prüflinge.
Ein Signal-Rauschverhältnis > 1,0 zeigt an, daß die Peptidsequenz mit NANBH-positiven Patientenseren mehr reagiert wie mit NANBH-negativen Patientenseren. Tabelle 6B EIA-Nachweis mit beschichteten Vertiefungen: Peptidfragmentvergleich Anzahl der Standardabweichungen, die die Reaktivität von NANBH-positiven Plasmaprüflingen von der Reaktivität von normalen (negativen) Plasmaprüflingen beabstandet*
* Die Ergebnisse geben die zahlenmäßigen Standardabweichungen wieder, die ein Probe von dem negativen Durchschnitt entfernt ist, und wird wie folgt berechnet:
(NANBH-positiver Probenwert - Durchschnittswerte von 12 negativen Proben) dividiert durch die Standardabweichung des Durchschnittswertes von 12 negativen Proben. Tabelle 7 Vergleich der Wirkungsweise des Fragment H-Nachweismaterials - gegen ORTHO HCV ELISA unter Verwendung von kommerziellen HCV Blutungs-Reihenuntersuchungen
* Signal/Rauschen wird wie folgt bestimmt: Die Fluoreszenz der positiven Prüflinge dividiert durch die Fluoreszenz der negativen Prüflinge.
** Signal/Abbruch wird wie folgt bestimmt: Die optische Dichte der positiven Prüflinge dividiert durch die optische Dichte des berechneten Abbruchs.

SEQUENZAUFZÄHLUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:

Leahy, David C
Todd, John A
Jolley, Michael E
Shah, Dinesh O
Bethell, Delia R
Arima, Terukatsu

(ii) TITEL DER ERFINDUNG:

VERBESSERTES NACHWEISMATERIAL FÜR NICHT-A UND NICHT-B HEPATITIS

(iii) SEQUENZANZAHL:

2

(iv) KORRESPONDENZADRESSE:

(A) ADRESSAT: Baxter Diagnostics Inc.
(B) STRASSE: One Baxter Parkway, DF2-2E
(C) STADT: Derfield
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60015

(v) COMPUTER LESBARE FORM

(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:

(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 7/675,233
(B) EINREICHUNGSDATUM: 26. März 1991
(C) KLASSIFIZIERUNG

(viii) ANWALT/TREUHÄNDERINFORMATION:

(A) NAME: Barta, Kent
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 29,042
(C) REFERENZ/LISTENNUMMER: PA-4084

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:

(A) TELEFON: 708/948-3308
(B) TELFAX: 708/948-2642

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 63 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt

(ii) MOLEKÜLART:

Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER :1:

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 64 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt

(ii) MOLEKÜLART:

Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER:2:

Claims

1. Nachweismaterial zur NANBH-Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweismaterial ein Peptidfragment als Target verwendet, das im wesentlichen homolog zu einem Abschnitt eines Polypeptids ist, welches die Aminosäuresequenz QEK--

QIRKRR aufweist und sich im wesentlichen von einem Aminosäurerest aus erstreckt, der aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Aminosäuren besteht, die in der Sequenz vom Rest 21 bis 26 am Amino-Ende bis im wesentlichen zum Arginin am Carboxy-Ende enthalten sind.

2. Peptidfragment, das im wesentlichen homolog zu einem Abschnitt eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz QEK--

QIRKRR ist, welche mindestens ein gegenüber NANBH-positiven Seren reaktionsfähiges Epitop enthält, und bei dem der Abschnitt des Polypeptids eliminiert worden ist, der sich zu dem N-Terminus von einem Rest aus erstreckt, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer in der Sequenz von Rest 26 bis 21 enthaltenen Aminosäure besteht, wobei das Peptidfragment nicht die Aminosäuresequenz QEKKGEAS--

aufweist, die sich vom Rest 21 bis Rest 28, oder vom Rest 21 bis Rest 41, oder vom Rest 21 bis Rest 30, oder vom Rest 42 bis Rest 62 der Polypeptidsequenz erstreckt.

3. Impfstoff zur Behandlung einer NANBH-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein immunogenes Peptid umfaßt, das im wesentlichen homolog zu einem Abschnitt eines Polypeptids der Aminosäuresequenz QEKKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNP- GKNKKPRVGRIKNWNR EGR KDAYQIRKRR ist, welche ein gegenüber NANBH-positiven Seren reaktionsfähiges Epitop enthält, und bei dem der Abschnitt des Polypeptids eliminiert worden ist, der sich von dem N-Terminus zu einem Rest erstreckt, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer in der Sequenz vom Rest 26 bis einschließlich Rest 21 enthaltenen Aminosäure besteht.

4. Nachweismaterial nach Anspruch 1, wobei das Target-Peptidfragment auf eine Festkörpermatrix als Beschichtung aufgetragen ist und wobei der Nachweis derart durchgeführt wird, daß eine Probe, welche auf das Peptid ausgerichtete Antikörper enthält, zur Bildung eines Antikörper-Peptid-Komplexes inkubiert wird, daß nicht in Reaktion getretene Antikörper von dem auf der Festkörpermatrix immobilisierten Komplex abgetrennt werden, und daß die Menge der Antikörper in dem Komplex mit einer Detektiereinrichtung quantitativ erfaßt wird.

5. Nachweismaterial nach Anspruch 1, wobei das Target-Peptidfragment mit Fluorophor konjugiert ist und der Nachweis derart durchgeführt wird, daß eine Probe, welche auf das Peptid ausgerichtete Antikörper enthält, zur Bildung eines Antikörper-Peptid-Komplexes inkubiert und die Fluoreszenzpolarisation des Komplexes gemessen wird.

6. Nachweismaterial nach Anspruch 4, wobei die Festkörpermatrix Teilchen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis 100 µm enthält.

7. Nachweismaterial nach Anspruch 6, wobei die Teilchen paramagnetisch sind.

8. Nachweismaterial nach Anspruch 4, wobei die Festkörpermatrix eine Mikrotiterplatte ist.

9. Nachweismaterial nach Anspruch 4, wobei die Festkörpermatrix aus paramagnetischen Teilchen zur passiven und/oder kovalenten Bindung besteht, die bezüglich Polystyrol oder Carboxyl- oder Aminogruppen funktionalisiert sind.