DE69206701T2

DE69206701T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen und zur Feststellung von des Mikrobenwachstums in Gegenwart von antimikrobiellen Substanzen

Info

Publication number: DE69206701T2
Application number: DE69206701T
Authority: DE
Inventors: Michael John Calandra; James Lawrence Diguiseppi; Richard Cornelius Driscoll; Thurman Clay Thorpe; James Edward Turner
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-13
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2012-07-14
Also published as: CA2074110A1; FI923291A0; EP0523805A2; KR100213841B1; FI923291L; IE922294A1; EP0523805B1; AU2039792A; KR930002506A; ATE131526T1; EP0523805A3; ES2083670T3; US5162229A; AU669481B2; JP3169269B2; DE69206701D1; GR3019110T3; FI99024B; ZA925281B; DK0523805T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum schnellen Nachweisen von Mikroorganismen und zum Vergrössern der Anzahl der während dem Kultivieren einer Probe festgestellten Mikroorganismen durch Zufügen von harzhaltigen und nichtharzhaltigen Adsorptionsmitteln und Molekularsieben in das Wachstumsmedium. Man hat festgestellt, dass diese Agenzien in Proben und Medien gefundene inhibierende und antimikrobielle Substanzen neutralisieren oder entfernen. Es ist herkömmliche Praxis, das Vorkommen von Mikroorganismen in Proben festzustellen, indem Proben in einem flüssigen Wachstumsmedium kultiviert werden. Medizinische Testproben umfassen Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und cerebrale Rückenmarksflüssigkeit sowie andere feste oder halbfeste Proben wie in Salzlösung oder anderen flüssigen Reagenzien verflüssigtes Gewebe. Industrielle Proben umfassen Arzneimittel, Lebensmittel oder irgendein Produkt, das auf Vorkommen oder Konzentrationen von Mikroorganismen getestet werden muss.
Der Nachweis dieser Mikroorganismen kann durch den Zustand der Proben selber beeinträchtigt werden. Zum Beispiel können medizinische Proben infolge Behandlungstherapien Antibiotikakonzentrationen enthalten, während bekannt ist, dass Serum, Plasma und lysierte Erythrozyten auf natürliche Weise mikrobielle Inhibitoren enthalten. Industrielle Proben wie Arzneimittel und Lebensmittel können ebenfalls antimikrobielle Substanzen oder Konservierungsmittel enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen inhibieren. Wenn Nährmedium hergestellt wird, kann das Behandeln des Mediums im Autoklaven bei hohen Temperaturen unter Druck zusätzlich zur Bildung von Nebenprodukten führen, die für Mikroorganismen toxisch sind. Das Entfernen oder Neutralisieren dieser inhibierenden oder bakteriziden Substanzen ist notwendig, um mikrobielle Verunreinigung nachzuweisen.
Die Verwendung von synthetischen Anionenaustausch- und nichtionischen Adsorptionsharzen zum Entfernen von antimikrobiellen Substanzen ist sehr bekannt und wurde vorgangig für die Verwendung bei medizinischen Diagnoseverfahren beschrieben. Insbesondere haben sich diese Harze beim Entfernen von Antibiotika und anderen antimikrobiellen Substanzen aus Blutproben als nützlich erwiesen. Das Entfernen dieser Inhibitoren in medizinischen Proben ermöglicht die Gewinnung und und den schnelleren Nachweis von Mikroorganismen, so dass mikrobielle Identifikation und genaues antibiotisches Empfindlichkeitstesten durchgeführt werden kann.
Melnick et al., US 4 145 304, beschreibt die Verwendung von synthetischen Anionaustausch- und nichtionischen Harzen, um antimikrobielle Substanzen, einschliesslich Antibiotika, aus Körperflüssigkeiten zu entfernen, wodurch die Gewinnung von Krankheitserregern ermöglicht wird unter Verwendung herkömmlicher Kultivierungstechniken. Die beschriebenen Harze werden mit einem nichtionischen Reinigungsmittel überzogen, um geladene Antibiotika selektiv zu entfernen, während das Anhaften von Bakterien an die Harze inhibiert wird. Nach der Behandlung der Probe mit dem Harz wird das Eluat in einem Wachstumsmedium kultiviert. Es wird angegeben, dass der Antibiotikabindungsgrad der Harze von Gesamtaustauschkapazität, Porendurchmesser und Oberflächenbereich des Harzes abhängig ist.
Waters, US 4 632 902, beschreibt eine Verbesserung gegenüber Melnick indem Ionenaustauschharze und nichtfunktionelle Adsorptionsharze direkt in das Wachstumsmedium eingebaut werden. Entfernte Inhibitoren schliessen an Patienten verabreichte Antibiotika und natürlich vorkommende Inhibitoren mitein, die in Serum, Plasma und lysierten Erythrozyten enthalten sind. Die Harze werden vor dem Gebrauch nicht mit einem nichtionischen Reingungsmittel oder einer oberflächenaktiven Substanz überzogen, und die Porengrösse der Harze ist nicht kritisch.
Die Verwendung von Harzen wie oben beschrieben weist daraufhin, dass eine Reinigungsmittel-Behandlung der Harze, insbesondere des nichtionischen Polystyrolharzes, das äusserst hydrophob ist, notwendig oder auch nicht notwendig sein kann. Die Verwirrung kann von der Tatsache herkommen, dass nichtionische Polystyrolharze vor dem Versand durch den Hersteller im allgemeinen mit oberflächenaktiven Substanzen vorbehandelt werden, damit sie in hydrophilen Umgebungen verwendet werden können. Deshalb ist für diese nassen Harze eine Behandlung mit oberflächenaktiven Substanzen oder Reinigungsmitteln eine absolute Voraussetzung, wodurch eine hydrophile Interaktion ermöglicht wird, insbesondere mit einem Nährmedium. Wenn das hydrophobe Harz nicht behandelt wird, schwimmt der Harz auf der Oberfläche eines flüssigen Nährmediums, ohne dass eine Interaktion möglich ist, um antimikrobielle Komponenten zu binden.
Das Verwenden von Adsorptionsmitteln in Nährmedien kann jedoch ein nichtspezifisches Binden von Proteinen, Kohlendydraten und anderen Mediumkomponenten an das Adsorptionsmittel verursachen. Wenn von diesen Komponenten genug gebunden und somit für die Mikroorganismen nicht zugänglich sind, werden keine Mikroorganismen festgestellt. Dieses Binden hängt vom Verhältnis des Adsorptionsmittels zu Mediumvolumen und -konzentration ab.
Das Entfernen von toxischen Nebenprodukten und Wachstumskomponenten aus dem Medium beeinflusst dessen Farbe. Je nach der Menge Adsorptionsmaterial und der Zusammensetzung des spezifischen Mediums, kann dieses farblos werden, was eine Unfähigkeit Wachstum zu unterstützen anzeigen kann. Die Fähigkeit des Mediums Wachstum zu unterstützen wird jedoch nicht immer durch Farbe angezeigt, da chemisch definierte oder halbdefinierte Medien farblos sind und dennoch eine optimale Wachstumsleistung erbringen können.
Die Kulturmediumformulierung ist kritisch für das Erbringen von optimiertem Wachstum für eine grosse Vielfalt von Mikroorganismen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Produktion von Kohlendioxid als Mass für mikrobielles Wachstum verwendet wird, wie dies zum Beispiel in der US 4 945 060 beschrieben ist. Das richtige Verhältnis an wachstumsfördernden Komponenten ist wesentlich, um eine optimale Kohlendioxidproduktion aus einer Vielfalt von Mikroorganismen mit unterschiedlichen Stoffwechselwegen zu erzeugen, damit mikrobielles Wachstum schnell nachgewiesen werden kann. Das Entfernen von Mediumkomponenten durch irgendein Adsorptionsmaterial muss sorgfältig gesteuert werden, um die für den Nachweis von Mikroorganismen erforderliche optimale Kohlendixoidproduktion aufrechtzuhalten, insbesondere wenn keine weiteren Wachstumszusätze wie Blut hinzugefügt werden.
Die Verwendung von synthetischen Harzen im Nährmedium verbessert die Gewinnung von Mikroorganismen aus Körperflüssigkeiten, und insbesondere aus Blut. Diese Flüssigkeiten sind nährstoffreich und gleichen einen Nährstoffmangel im Adsorptionsmittel enthaltenden Nährmedium aus. In Situationen jedoch, in denen die Testprobe dem harzenthaltenden Medium keinen Nährwert hinzufügen kann, kann die Fähigkeit zum Gewinnen und Nachweisen von Mikroorganismen stark in Frage gestellt sein.
Wenn antimikrobielle Substanzen aus einem Nährmedium entfernt oder darin neutralisiert werden, hängt der Neutralisierungsgrad von einer Anzahl Faktoren ab. Diese Faktoren umfassen das Verdünnungsverhältnis der Probe zum Medium, die Konzentration der antimikrobiellen Substanz in der Probe und die antimikrobielle Empfindlichkeit des in der Probe enthaltenen spezifischen Organismus. Im Fall von Blutproben von unter Antibiotika stehenden Patienten gibt es ein maximales therapeutisches Niveau für ein spezifisches Antibiotikum, das erreicht werden kann, welches bei jedem Antibiotikum anders ist. In einer optimalen Testsituation sollte die Adsorptionsmittelmenge bei jeder Probe variieren. Obwohl bekannt ist, dass synthetische Harze inhibierende Substanzen aus Körperflüssigkeiten enthaltenden Kulturen entfernen, ist es wünschenswert, andere Substanzen zu finden, die eine ähnliche Funktion sowohl auf Körperflüssigkeiten als auch auf Nichtkörperflüssigkeiten wie Lebensmittel und Industrieprodukte ausüben.
Die US 3 671 399 bezieht sich auf die Verwendung von verschiedenen polyanionischen Verbindungen wie Sulfatpolysaccharide, die wahlweise mit einem Salz kombiniert sein können, zum Beispiel mit einem Alkalimetallsalz, um in der Körperflüssigkeit vorhandene natürliche bakteriostatische Komponenten zu eliminieren und Antibiotika zu inhibieren, so dass das Kultivieren von Proben dieser Körperflüssigkeiten erleichtert wird.
Die vorliegende Erfindung enternt, inhibiert oder isoliert antimikrobielle Substanzen in Testproben, während die Komponenten des zum schnellen Gewinnen und Nachweisen von Mikroorganismen notwendigen Mediums erhalten bleiben.
Die Erfindung besteht aus einer Vorrichtung und einem Verfahren zur verbesserten Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen in Proben, die in einem Wachstumsmedium kultiviert werden, das Adsorptionsmittel enthält, welches Harze oder nichtharzhaltige Adsorptionsmittel sind, und zwar in der Gegenwart von antimikrobiellen Substanzen. Das Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen ist nicht auf diejenigen beschränkt, die in Körperflüssigkeiten vorhanden sind, sondern umfasst auch industrielle Proben, die inhibierende Substanzen und toxische Nebenprodukte enthalten, die in mikrobiellen Wachstumsmedien inhärent enthalten sind.
Die Vorrichtung zur verbesserten Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen und zur kontinuierlichen Ueberwachung biologischer Aktivität in einer Probe umfasst einen versiegelbaren Probenbehälter, der einen Innenraum aufweist, in dem eine Probe kultiviert werden kann mit einem sterilen Nährmedium und Adsorptionsmitteln, die Harze oder nichtharzhaltige Adsorptionsmittel oder Kombinationen davon sind, in Mengen, die wirksam sind im Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen, die in dieser Probe und in diesem Medium enthalten sind, umfassend mindestens ein transparenter Abschnitt in diesem Behälter und ein sich in diesem Behälter im Bereich des transparenten Abschnitts befindliches Sensormittel, wobei Veränderungen im Aussehen des Sensormittels von ausserhalb des Behälters durch den transparenten Abschnitt kontinuierlich überwacht werden können, wodurch die biologische Aktivität überwacht werden kann, ohne die Integrität des Behälters nach dem Versiegeln zu verletzen. Das Sensormittel umfasst eine Membran, die ein Befestigungs- oder Trägermedium ist, und ein Anzeigemedium, wobei das Anzeigemedium nach seiner Fähigkeit ausgewählt wird, eine nachweisbare Veränderung darzustellen, wenn es Produkten der Stoffwechselaktivität eines Organismus ausgesetzt ist.
Das Verfahren zur verbesserten Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen in Kulturen umfasst Herstellung des Nährmediums, Zufügen ins Medium von nichtharzhaltigen Adsorptionsmitteln in Mengen, die wirksam sind im Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen im Nährmedium, Beimpfen des Mediums mit einer Probe, Inkubieren sowie Bestimmen der Resultate.
Eine Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Vorrichtung zum Nachweisen von mikrobiellem Wachstum mittels klassischer Verfahren der visuellen Prüfung auf Trübung oder mittels Nachweis des Wachstums von Mikroorganismen durch ihre Stoffwechselprodukte, zum Beispiel durch Nachweis von Kohlendioxid durch Verwendung eines Kohlendioxidsensors, der inwendig an der Vorrichtung angeklebt ist, wie dies in den co-pendenten EP-A-0 333 253 und US 4 945 060 beschrieben ist. Diese Vorrichtung kann im Nährmedium auch Materialien enthalten wie die harzhaltigen Materialien, die in der US 4 632 902 beschrieben sind, und nichtharzhaltige Adsorptionsmittel, die antimikrobielle Substanzen von Proben in Nährmedien neutralisieren, binden oder inhibieren, und die deshalb eine grössere Gewinnung und Nachweis von Mikroorganismen in diesen Proben ermöglichen.
Im allgemeinen umfassen antimikrobielle Substanzen unter anderem Antibiotika, Antibiotika in Körperflüssigkeitsproben, Konservierungsmittel, Bakteriostatika, Bakterizide und alle toxischen Nebenprodukte, die während dem Herstellen von Nährmedien produziert werden. Antimikrobielle Substanzen umfassen ebenfalls natürlich vorkommende Komponenten in Blut wie Komplement und Antikörper.
Der Ausdruck "Adsorptionsmittel" umfasst für den Zweck dieser Anmeldung alle Adsorptionsmaterialien, die antimikrobielle Substanzen neutralisieren, binden und inhibieren. Diese Adsorptionsmittel umfassen Harze wie sie in der US 4 632 902 definiert sind, sowie nichtharzhaltige Adsorptionsmittel.
Wie hierin verwendet bedeutet "Harz" eine Unterklasse von Adsorptionsmitteln und ist weiter so definiert, dass natürlich vorkommende und synthetische Harze miteingeschlossen sind, zum Beispiel Ionenaustauschharze, nichtfunktionelle Polymerharz-Adsorptionsmittel und insbesondere Polystyrolharze, die mit Divinylbenzol vernetzt sind.
Die bevorzugten Materialien, wie die hierin verwendeten "nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel", stellen eine weitere Unterklasse von Adsorptionsmittel dar und sind definiert als natürlich vorkommende und synthetische nichtharzhaltige Adsorptionsmittel und Molekularsiebe, die zum Klären, Deodorieren, Entfärben und Filtern verwendet werden können. Einige dieser nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel sind die gleichen wie diejenigen, die während der Herstellung von Antibiotika verwendet werden, um Antibiotika von Nährmedien zu entfernen, in denen antibiotikaproduzierende Bakterien wachsen. Ob diese Bakterien während des Vorgangs verletzt werden oder nicht ist unbekannt, genauso der Gewinnungsgrad dieser im Medium verbleibenden Bakterien.
Diese nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel umfassen verschiedene Formen von 1) Aluminiumoxid (Alumina), 2) kolloidale natürlich wasserhaltige Aluminiumsilikate (Tone) wie Bentonit, Kaolin und Walkerde, 3) kristalline wasserhaltige Alkalialuminiumsilikate (Natrium oder Calciumzeolithe), 4) Silica (Silicagel, Silicaperlen) wie Davisil, 5) kieselhaltige Frustulen und Fragmente von verschiedenen Diatomeearten (Infusorienerde, diatomeenhaltige Erde) wie Celite (Manville Products Corporation, Denver, Colorado, USA) und 6) amorphe Kohle (insbesondere Aktivkohle) wie Carboraffin, Norit (American Norit Company, Inc., Jacksonville, Florida, USA), Opocerbyl und Ultracarbon. Natürlich vorkommende adsorbierende Aktivkohle, die verwendet wird, um die tödlichen Auswirkungen der Oxidation im Transport- und im Wachstumsmedium zu verhindern, kann ebenfalls verwendet werden. Dieses Medium wird für den Transport von anspruchsvollen Organismen wie Neisseria Gonorrhoeae und für die Kultivierung von Legionella-Arten verwendet. Nichtharzhaltige Adsorptionsmittel benötigen keine Vorbehandlung mit oberflächenaktiven Substanz um zu funktionieren. Eine Behandlung mit oberflächenaktiven Substanzen kann sogar die Adsorptionsfähigkeiten dieser Materialien herabsetzen.
Die Verwendung von Adsorptionsmitteln in einem geeigneten Verhältnis zum Medium kann ebenfalls toxische Nebenprodukte entfernen, die im Autoklaven behandelten Medium erzeugt werden, und dennoch ein optimales nährstoffreiches Nährmedium liefern, wobei die Fähigkeit zum Neutralisieren von antimikrobiellen Substanzen aufrecherhalten wird.
Viele dieser nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel entfernen antimikrobielle Substanzen in Kulturen. Bevorzugte nichtharzhaltige Adsorptionsmittel sind die Adsorptionsmaterialgruppen der kolbidalen natürlich wasserhaltigen Aluminiumsilikate (Tone) und der amorphen Kohle (Aktivkohle). Zusätzlich bevorzugte Materialien sind Walkerde oder Aktivkohle, die einzeln oder kombiniert verwendet werden.
Besonders bevorzugte nichtharzhaltige Adsorptionsmittel sind an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle (Ecosorb GL 241), an Zellulosefasern gebundene Walkerde (Ecosorb GL 247) und an Walkerde gebundene hochaktive Aktivkohle (Ecosorb GL 248). Diese Materialien werden von Graver Chemical, Union, New Jersey, USA, hergestellt, wobei in erster Linie das in der US 4 238 334 beschriebene Ecosorb -Verfahren verwendet wird. Kurz, Filterhilfsmaterialien, welche im allgemeinen Fasern wie Zellulose, Nylonfasern, Kunstseidefasern, Polypropylenfasern und Polyvinylchloridfasern sind und entweder nagativ oder positiv geladen sein können, werden mit einer elektrolytartigen Verbindung behandelt, die eine Oberflächenladung erzeugt, die der normalen Oberflächenladung entgegengesetzt ist. Das behandelte Filterhilfsmaterial wird in einer wässerigen Suspension mit einem aktiven partikulären Material gemischt, welches eine Ladung aufweist, die derjenigen des Filterhilfsmaterials entgegengesetzt ist, um das Endadsorptionsmittel oder Filtermaterial zu bilden. Verbindungen, die verwendet werden können, um auf den Fasern eine umgekehrte Oberflächenladung zu erzeugen, müssen eine Vielzahl von Ladungsstellen aufweisen, so dass eine Bindung mit dem Filterhilfsmaterial gebildet werden kann und auch überzählige Ladungsstellen übrigbleiben, um eine Oberflächenladung zu erzeugen, die der normalen Oberflächenladung entgegengesetzt ist. Beispiele von geeigneten kationischen organischen Polyelektrolyten umfassen Polyalkylenimine, Polyalkylenpolyamide und Polyvinylbenzylquaterammonium-Salze.
Die Vorrichtung enhält Nährmedien, die so formuliert sind, dass sie für die vorliegenden Adsorptionsmittel nützlich sind. Diese umfassen Mehrzweckmedien wie tryptische Soyanährlösung, Gehirn- Herz-Infusionsnährlösung, Columbia-Nährlösung und Brucella-Nährlösung. Quantitäten von nichtharzhaltigen Adsorptionsmitteln, welche die Neutralisierung von antimikrobiellen Substanzen bewirken, werden den Nährmedien hinzugefügt und reichen von ungefähr 0,025 bis ungefähr 0,50 Gramm pro Millimeter Medium, je nach Nährmedium.
Die Verbesserung der Wachstumsleistung in Gegenwart von nichtharzhaltigen Adsorptionsmitteln ist wegen der Detoxifikation des Mediums artabhängig. Dies ist aufgrund der Unterschiede in der Empfindlichkeit des Testorganismus auf toxische Nebenprodukte, die im Medium inhärent vorhanden sind. Wie in der Tabelle 2, Beispiel 2, dargestellt ist, hatten E. coli und X. maltophilia identische Nachweiszeiten in Medien, die keine Adsorptionsmittel aufwiesen und in Medien, die an Walkerde gebundene Aktivkohle enthielten, während P. aeruginosa zum Nachweis mit dem Adsorptionsmittel längere Zeit benötigte. H. influenzae, N. meningitidis, S. aureus, S. pneumoniae und S. pyogenes wurden alle in kürzerer Zeit nachgewiesen mit dem nichtharzigen Adsorptionsmittel als ohne dieses.
Die Formulierung des Mediums kann, falls erforderlich, aus einer Zusammensetzung bestehen, welche Gewinnung und Nachweis von verunreinigenden Organismen bei industriellen Proben wie Arzneimitteln ermöglicht, die keinen zusätzlichen Nährwert besitzen. Im weiteren kann die Interaktion des Adsorptionsmaterials mit dem Medium, falls notwendig, manipuliert werden, um toxische Nebenprodukte im Medium zu eliminieren, was verbesserte Gewinnung und Nachweis von Mikroorganismen ermöglicht unabhängig von der Zugabe einer Probe. Um dies zu tun würde ein Fachmann auf diesem Gebiet die Adsorptionsmittelmenge mit der Mediummenge abstimmen und die Endzusammensetzung auf ihre Neutralisierungseigenschaften und Wachstumsleistung für Testorganismen prüfen, und zwar in Gegenwart und Abwesenheit von antimikrobiellen Substanzen.
Die Probe wird in die Vorrichtung eingeführt und die Vorrichtung wird inkubiert, bis entweder positives Wachstum nachgewiesen, oder, im allgemeinen nach 5-7 Tagen, kein Wachstum nachgewiesen wird.
Die vorliegenden Adsorptionsmittel sind nicht auf die Verwendung mit der Vorrichtung beschränkt. Sie können jedem Standardnährmedium zugefügt werden, das dann mit einer Probe beimpft und bei der richtigen Temperatur während einer für den zu testenden Probentyp geeigneten Zeit inkubiert wird, währenddem es üblicherweise geschüttelt oder gerüttelt wird, um einen grösseren Oberflächenbereich des Adsorptionsmittel der Flüssigkeit auszusetzen, um alle vorhandenen Organismen besser mit Nährstoffen in Kontakt zu bringen, und um Bereiche mit hoher Konzentration an Stoffwechselnebenprodukten zu verhindern. Die für die Bestimmung von Mikroorganismenwachstum benötigten Temperaturen und Zeitperioden sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und variieren etwas unter verschiedenen Organismentypen.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die Merkmale der Erfindung weiter zu illustrieren, beabsichtigen aber in keiner Weise, den Bereich der Erfindung einzuschränken.

BEISPIEL 1. Antibiotikum-Neutralisierung durch Adsorptionsmittel

Die für die verbesserte Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen und zum kontinuierlichen Ueberwachen der biologischen Aktivität in einer Probe verwendete Kulturflaschenvorrichtung ist ein versiegelbarer, sterilisierbarer Behälter mit einem Innenraum, der mindestens einen transparenten Abschnitt aufweist sowie ein im Innern des Behälters im Bereich des transparenten Abschnitts angeordnetes Sensormittel. Der Sensor verändert sein Aussehen je nach der biologischen Aktivität innerhalb des Behälters, und die Veränderungen können durch den transparenten Abschnitt überwacht werden, ohne die Integrität des Behälters nach dem Versiegeln zu verletzen. Der Sensor ist ein fester Träger wie eine Membran, entweder intakt oder aufgerauht oder in Stücke zerkleinert, an den ein Indikator gebunden oder befestigt ist, und der Indikator wird ausgewählt aufgrund seiner Fähigkeit, eine nachweisbare Veränderung anzuzeigen, wenn er den Stoffwechselprodukten eines Organismus ausgesetzt ist. Der Behälter, auch bekannt als Kulturflasche, enthält Nährmedium und ein Adsorptionsmittel wie unten beschrieben, in welche die Probe eingeimpft wird.
Kulturflaschen wurden hergestellt, indem eine ergänzte Gehirn- Herz-Infusions-Nährlösung verwendet wurde, der folgende nichtharzhaltige Adsorptionsmittel zugefügt wurden: Walkerde in einer Konzentration von 0,13 g/ml; an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle in Konzentrationen von 0,13 g/ml und 0,27 g/ml (Ecosorb GL 241); an Walkerde gebundene hochaktive Aktivkohle in Konzentrationen von 0,09 g/ml und 0,17 g/ml "Ecosorb GL 248); und eine Mischung von Ecosorb GL 241 und Ecosorb GL 248 in einem Verhältnis von 1:1 mit 0,13 g/ml. Diese Flaschen wurden dann beimpft, um eine Anfangsimpfgut von 10 bis 100 KBE/ml Staphylococcus aureus, ATCC 12600 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) herzustellen. Die Flaschen wurden ebenfalls mit repräsentativen Antibiotika beimpft, zum Beispiel Amikacin, Cephalothin, Clindamycin, Erythromycin, Gentamycin, Methicillin, Tetracyclin und Tobramycin, um Niveaus oberhalb der minimalen inhibitorischen Konzentrationen dieser Antibiotika für diesen 5. aureus-Stamm zu erhalten. Diese Antibiotikumkonzentrationen stellen auch die erreichbaren therapeutischen Niveaus für Menschen dar nach Verdünnung einer Blutprobe im Nährmedium. Eine kein Adsorptionsmittel enthaltende Kontrolle wurde verwendet. Die beimpften Flaschen wurden dann im BacT/Alert Microbial Detection System" (Organon Teknika Corporation, Durham, N.C., USA) plaziert zwecks Inkubation und Ueberwachung, wobei die Resultate jeweils automatisch angezeigt wurden, wenn die Kulturen für mikrobielles Wachstum positiv wurden.
Die Resultate sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die letzte Kolonne zeigt, dass in Gegenwart von Antibiotika ohne nichtharzhaltige Adsorptionsmittel im Nährmedium kein Wachstum des Testorganismus erfolgte. Je nach dem nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel und dessen Konzentration gibt es jedoch eine Gewinnung und Nachweisung des Testorganismus mit allen Antibiotika. Bei dieser Antibiotikapalette ergaben an Zellulosefasern gebundene Aktivkohle und an Walkerde gebundene Aktivkohle in einer Konzentration von 0,09 g/ml und 0,17 g/ml die beste Gewinnung an S. aureus, und zwar bei all den verschiedenen Antibiotika. Die Nachweiszeit bei positiven Kulturen war ebenfalls vom nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel und dessen Konzentration abängig. TABELLE 1 Antibiotikum-Neutralisierung durch Adsorptionsmittel mit Stahylococcus aureus ATCC 126001 Zeit bis zum Nachweis (Stunden)² Antibiotikum (Konzentration) Kein Adsorptionsmittel Amikacin Cephalothin Clindamycin Erythromycin Gentamycin Methicillin Tetrocycline Tobramycin
¹ Das Anfangsimpfgut bestand aus ungefähr 10 bis 100 KBE/ml.
² Die Zeit bis zum Nachweis wurde vom Bact/Alert "Microbial Detection System" automatisch angezeigt.
³ FE = Walkerde
&sup4; C = an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle.
&sup5; C + FE = an Walkerde gebundene hochaktive Aktivkohle.
&sup6; Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen waren oben die minimal inhibierenden Konzentrationen von S.aureus ATCC 12600 und befinden sich ebenfalls in der therapeutisch erreichbaren Grössenordnung.
&sup7; NG = Kein Wachstum
&sup8; An Zellulosefasern gebundene Walkerde + an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle in einem Verhältnis 1:1.

BEISPIEL 2. Wachstumsleistung von Mikroorganismen in der Gegenwart eines Adsorptionsmittels

Kulturflaschen wie in Beispiel 1 beschrieben wurden mit einer supplementierten Gehirn-Herz-Infusion vorbereitet, die 0,09 g/ml an Walkerde gebundene hochaktive Aktivkohle enthielt. Jede Flasche wurde dann mit einem der folgenden Mikroorganismen beimpft: E. coli, H. influenzae, N. meningitidis, P. aeruginosa, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes und X. maltophilia. Das Anfangsimpfgut reichte von 10 bis 100 KBE/ml. Dem Medium wurden keine weiteren Zusätze zugefügt, mit Ausnahme des Mediums, das für die Gewinnung von H. influenzae verwendet wurde, dem die in Pferdeblut gefundenen Wachstumsfaktoren beigefügt wurden. Die beimpften Flaschen wurden dann zur Ueberwachung im BacT/Alert "Microbial Detection System" plaziert. Die Zeiten bis zum Nachweis von Positiven sind in Stunden angegeben.
Die Daten in Tabelle 2 zeigen eine bedeutende Abnahme der Zeit bis zum Nachweis für mehrere Testorganismen, die in Medium eingeimpft wurden, das nichtharzhaltiges Adsorptionsmittel enthält, im Verleich zu Medium ohne dieses. Die Zeit bis zum Nachweis ist artabhängig, wie dies in dieser Tabelle dargestellt ist. H. influenzae, N. meningitidis, S. aureus, S. pneumoniae und S. pyogenes zeigten eine verringerte Zeit bis zum Nachweis in Gegenwart des Adsorptionsmittels, während E. coli, P. aeruginosa und X. maltophilia mit oder ohne Adsorptionsmittel keinen bedeutenden Unterschied in der Zeit bis zum Nachweis zeigten. Dies bedeutet, dass das nichtharzhaltige Adsorptionsmittel beim Entfernen der toxischen Nebenprodukte im Medium selber wirksam ist. TABELLE 2 Wachstumsleistung von Mikroorganismen in der Gegenwart von Adsorptionsmitteln¹ Zeit bis zum Nachweis (Stunden)² Mikroorganismen Kein Adsorptionsmittel Esherichia coli Haemophilus influenzae&sup4; Weisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococuis pneumoniae Streptococcus pyogenes Xanthomonas maltophilia
¹ Das Anfangsimpfgut bestand aus ungefähr 10 bis 100 KbE/ml.
² Die Zeit bis zum Nachweis wurde vom Bact/Alert "Microbial Detection System" automatisch angezeigt.
³ C + FE = an Walkerde gebundene hochaktive Aktivkohle.
&sup4; Pferdeblut wurde hinzugefügt für zusätzliche für die Gewinnung dieses Organismus erforderliche Wachstumsfaktoren.
BEISPIEL 3. Wirkung einer Reinigungsmittelbehandlung auf die Antibiotikum-Neutralisierung eines Adsorptionsmittels
Das Vorgehen für die Vorbereitung der Kulturflaschen, die Herstellung des Impfgutes und die Antibiotikum-Verdünnungen waren die gleichen wie in Beispiel 1. Eine Probe mit an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle wurde jedoch mit einer wässerigen Lösung von 0,1 Gewichtsprozent der oberflächenaktiven Substanz Triton X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA, USA) behandelt und dann sorgfältig mit Wasser gewaschen, um restliche oberflächenaktive Substanz zu entfernen. Kulturflaschen wurden dann vorbereitet mit der gleichen Konzentration an behandeltem und unbehandeltem nichtharzhaltigem Adsorptionsmittel.
Die in Tabelle 3 dargestellten Resultate zeigen, dass die Behandlung von nichtharzhaltigem Adsorptionsmittel eine Abschwächung der Neutralisierung von gewissen Antibiotika zur Folge hatte, wodurch die Fähigkeit zur Gewinnung von Mikroorganismen herabgesetzt wurde, mit einer Verlängerung der Zeit bis zum Nachweis des Testorganismus in Gegenwart von gewissen Organismen. TABELLE 3 Wirkung der Reinigungsmittelbehandlung auf die Antibiotikum-Neutralisierung durch ein Adsorptionsmittel mit Staphylococcus aureus ATCC 12600¹ Zeit bis zum Nachweis (Stunden)² Antibiotikum (Konzentration) Kein Adsorptionsmittel behandeltes Reinigungsmittel None Amikacin Cephalothin Clindamycin Erythromycin Gentamycin Methicillin Tetrocycline Tobramycin
¹ Das Anfangsimpfgut bestand aus ungefähr 10 bis 100 KbE/ml.
² Die Zeit bis zum Nachweis wurde vom Bact/Alert "Microbial Detection System" automatisch angezeigt.
³ C = an Zellulosefasern gebundene hochaktive Aktivkohle.
&sup4; An Zellulosefasern gebundene mit Triton X-100 behandelte hochaktive Aktivkohle.
&sup5; Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen waren höher als die minimal inhibierenden Konzentrationen von S. aureus ATCC 12600.
&sup6; NG = Kein Wachstum

Figur 1 - Blutkultur-Instrument

Diese Zeichnung zeigt ein Gesamtbild der Vorrichtung und den funktionellen Teil eines Instruments, das verwendet werden kann, um die Vorrichtung zu überwachen. Dargestellt sind der Behälter (1), der Sensor (2), das Nährmedium (3), das ein harzhaltiges oder nichtharzhaltiges Adsorptionsmittel enthält, die Lichtquelle (4) und den Photozellendetektor (5). In Betrieb wird die gesamte Vorrichtung auf einem Schüttelgerät in einem Inkubator plaziert, der für mikrobielles Wachstum eine geeignete Umgebung bietet und Raumlicht von den Photozellendetektoren fernhält.

Claims

1. Vorrichtung zur verbesserten Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen und zur kontinuierlichen Ueberwachung der biologischen Aktivität in einer Probe, umfassend einen versiegelbaren, sterilisierbaren Probenbehälter mit einem Innenraum, in dem eine Probe kultiviert werden kann, wobei der Innenraum ein steriles Nährmedium und ein Adsorptionsmittel umfasst, in einer Menge, die zum Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen wirksam ist, die in dieser Probe und in diesem Medium vorhandenen sind, worin dieses Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Aluminiumoxid, kolloidalen natürlich wässerigen Aluminiumsilikaten, kristallinen wässerigen Alkalialuminiumsilikaten, Silica, kieseligen Frustulen, Fragmenten verschiedener Diatomeenarten, amorpher Kohle und Kombinationen davon, wobei der Behälter mindestens einen transparenten Abschnitt aufweist und ein Sensormittel, das sich innerhalb dieses Behälters im Bereich des transparenten Abschnitts befindet, wobei dieses Sensormittel eine Membran und ein Indikatormedium umfasst, wobei das Indikatormedium ausgewählt wird aufgrund seiner Fähigkeit, eine nachweisbare Veränderung anzuzeigen, wenn es den Stoffwechselprodukten eines Organismus ausgesetzt ist, wodurch Veränderungen im Aussehen des Sensormittels von ausserhalb dieses Behälters durch diesen transparenten Abschnitt kontinuierlich überwacht werden können, wodurch die biologische Aktivität überwacht wird, ohne die Integrität dieses Behälters nach dem Versiegeln zu verletzen.

2. Vorrichtung zur verbesserten Gewinnung und Nachweisung von Mikroorganismen und zur kontinuierlichen Ueberwachung der biologischen Aktivität in einer Probe, umfassend einen versiegelbaren, sterilisierbaren Probenbehälter, der einen Innenraum aufweist, in dem eine Probe kultiviert werden kann, wobei der Innenraum ein steriles Nährmedium und ein Adsorptionsmittel umfasst, in einer Menge, die zum Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen wirksam ist, die in dieser Probe und in diesem Medium vorhanden sind, worin dieses Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus an Fasern gebundene Kohle, an Fasern gebundene Walkerde, an Walkerde gebundene Kohle und einer Mischung aus an Zellulosefasern gebundene Aktivkohle und an Walkerde gebundene Zellulosefasern, wobei der Behälter mindestens einen transparenten Abschnitt aufweist und ein Sensormittel, das sich innerhalb dieses Behälters im Bereich des transparenten Abschnitts befindet, wobei dieses Sensormittel eine Membran und ein Indikatormedium umfasst, wobei das Indikatormedium ausgewählt wird aufgrund seiner Fähigkeit, eine nachweisbare Veränderung anzuzeigen, wenn es den Stoffwechselprodukten eines Organismus ausgesetzt ist, wodurch Veränderungen im Aussehen des Sensormittels von ausserhalb dieses Behälters durch diesen transparenten Abschnitt kontinuierlich überwacht werden können, wodurch die biologische Aktivität überwacht wird, ohne die Integrität des Behälters nach dem Versiegeln zu verletzen.

3. Verfahren zur Neutralisierung von antimikrobiellen Substanzen in einem Nährmedium und in einer Probe, um Gewinnung und Nachweis von Mikroorganismen in dieser Probe zu verbessern, umfassend:

a) Herstellen des Nährmediums;

b) Zufügen zu diesem Nährmedium von mindestens einem nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel in einer Menge, die zum Neutralisieren, Binden oder Inhibieren von antimikrobiellen Substanzen wirksam ist, und

c) Zufügen der zu testenden Probe zu diesem Medium, das dieses nichtharzhaltige Adsorptionsmittel enthält, worin dieses nichtharzhaltige Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Aluminiumoxid, kolloidalen natürlich wässerigen Aluminiumsilikaten, kristallinen wässerigen Alkalialuminiumsilikaten, Silica, kieseligen Frustulen, Fragmenten verschiedener Arten von Diatomeen, amorpher Kohle und Kombinationen davon.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin dieses nichtharzhaltige Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus an Fasern gebundene Kohle, an Fasern gebundene Walkerde und an Walkerde gebundene Kohle.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin dieses nichtharzhaltige Adsorptionsmittel an Walkerde gebundene Aktivkohle umfasst.

6. Verfahren zur Neutralisierung. von antimikrobiellen Substanzen in einer Kultur, um Gewinnung und Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe zu verbessern unter Verwendung der Vorrichtung von Anspruch 1, umfassend:

a) Herstellen des Nährmediums,

b) Zufügen zu diesem Medium von nichtharzhaltigen Adsorptionsmitteln in Mengen, die im Neutralisieren, Binden oder Inhibieren mikrobieller Substanzen wirksam sind,

c) Einführen des Mediums, das diese nichtharzhaltigen Adsorptionsmittel enthält, in diese Vorrichtung, und

d) Beimpfen des Mediums mit der Probe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dieses Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Aluminiumoxid, kolloidalen natürlich wässerigen Aluminiumsilikaten, kristallinen wässengen Alkalialuminiumsilikaten, Silika, kieseligen Frustulen, Fragmenten verschiedener Arten von Diatomeen, amorpher Kohle und Kombinationen davon.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin dieses Adsorptionsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus an Fasern gebundene Kohle, an Fasern gebundene Walkerde und an Walkerde gebundene Kohle.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin dieses Adsorptionsmittel an Walkerde gebundene Aktivkohle umfasst.