DE69935254T2

DE69935254T2 - Verfahren zur herstellung von pyrrol-2-carbonsäure

Info

Publication number: DE69935254T2
Application number: DE69935254T
Authority: DE
Inventors: Toru Gifu-shi NAGASAWA
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-01-05
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2019-12-29
Also published as: US6635455B1; JP2000197495A; JP4139502B2; EP1143008A4; EP1143008B1; EP1143008A1; DE69935254D1; WO2000040743A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure aus Pyrrol durch das Wirken von Mikroorganismen. Pyrrol-2-carbonsäure und ihre Derivate sind nützlich als Rohstoffe für verschiedene Medikamente.
Stand der Technik
Enzymatische in vivo Decarboxylierung von Aminosäuren und α-keto-Säuren ist gut untersucht, so dass die Eigenschaften von Enzymen, die in der Reaktion beteiligt sind, nun klar verstanden werden. Es bleibt jedoch vieles unklar betreffend nicht-oxidative Decarboxylasen für aromatische Carbonsäuren.
Eine bekannte nicht-oxidative Decarboxylierungsreaktion von aromatischen Carbonsäuren durch einen Mikroorganismus ist eine Reaktion, Hydroxybenzoesäure in Phenol umzuwandeln (Microb. Ecol., 20, 103, 1990). Des Weiteren ist bekannt, dass Bakterien, die zum Genus Citrobacter gehören, Gallsäure decarboxilieren, um dadurch Pyrrogallol zu erzeugen und zu akkumulieren (Agric. Biol. Chem., 46, 2539, 1982).
Auf der anderen Seite ist ein Mikroorganismus, der bekannt ist, Kohlendioxidfixierung an aromatische Verbindungen zu katalysieren, ein Bakterium, das zum Genus Pseudomonas gehört, welches Phenol in 4-Hydroxybenzoesäure umwandelt in dem ersten Schritt zum Abbau von Phenol (Arch. Microbiol., 148, 213, 1987).
Des Weiteren sind die Eigenschaften eines Enzyms, erhalten vom Genus Clostridium, im Detail untersucht worden. D. h., es ist gezeigt worden, dass das Enzym die Decarboxylierung und Kohlendioxidfixierung von 4-Hydroxybenzoesäure und von 3,4-Dihydroxybenzoesäure durch eine reversible Reaktion katalysiert (Appl. Environ. Microbiol., 60, 4182, 1994).
Die industrielle Anwendung der Synthese von Carbonsäuren durch Kohlendioxidfixierung an aromatische Verbindungen ist von großem Wert. Jedoch ist die Kohlendioxidfixierungsaktivität der oben genannten Mikroorganismen und Enzyme so schlecht, dass sie nicht leicht praktisch angewendet werden können.
Als ein Ergebnis von gründlichen Studien von Enzymen, welche Kohlendioxidfixierung an aromatische Verbindungen katalysieren, haben wir zuvor gefunden, dass Pyrrol-2-carbonsäuredecarboxylase, erhalten vom Genus Bacillus, Kohlendioxidfixierung an Pyrrol durchführt, um so Pyrrol-2-carbonsäure zu synthetisieren (Eur. J. Biochem., 253, 480, 1998).
Das Reaktionssystem dieses Enzyms benötigt jedoch die Anwesenheit einer organischen Säure, wie Ammoniumacetat. Dies ist unpraktisch, wenn man z. B. die Isolierung des Produkts bedenkt.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter den Umständen haben wir die vorliegende Erfindung fertig gestellt als Ergebnis intensiven Studiums, indem wir herausgefunden haben, dass Mikroorganismen, welche abgeleitet sind von Bakterien, die zum Genus Serratia gehören und Pyrrol-2-carbonsäure decarboxylieren, die Reaktion in der Abwesenheit einer organischen Säure Ammonium stabil durchführen.
D. h., die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure zur Verfügung, umfassend die Schritte Wirkenlassen eines vom Genus Serratia abgeleiteten Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Decarboxylierung von Pyrrol-2-carbonsäure zu katalysieren, und in der Lage ist, die Synthese von Pyrrol-2-carbonsäure aus Pyrrol in der Gegenwart eines Carbonations zu katalysieren, auf Pyrrol, und Gewinnen der generierten Pyrrol-2-carbonsäure.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung das obige Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure zur Verfügung, worin der Mikroorganismus in der Abwesenheit einer organischen Säure wirken gelassen wird.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Enzym zur Verfügung, welches aus einem zum Genus Serratia gehörenden Mikroorganismus extrahiert wurde, die Fähigkeit hat, die Decarboxylierung von Pyrrol-2-carbonsäure zu katalysieren und die Fähigkeit hat, die Synthese von Pyrrol-2-carbonsäure aus Pyrrol in der Gegenwart eines Carbonations zu katalysieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das oben beschriebene Enzym zur Verfügung, worin der Mikroorganismus, welcher zu dem Genus Serratia gehört, Serratia grimesii (IFO13537), Serratia marcenscens (IAM12142) oder Serratia rubidaea (IFO12973) ist.
Nun folgt eine detaillierte Beschreibung dieser Erfindung.
Der beste Weg, die Erfindung auszuführen Ein Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung ist abgeleitet aus dem Genus Serratia, katalysiert die Decarboxylierung von Pyrrol-2-carbonsäure und hat die Aktivität, in der Gegenwart eines Carbonations Pyrrol in Pyrrol-2-carbonsäure umzuwandeln. Beispieler solcher Stämme umfassen Serratia grimesii (IFO13537), Serratia marcescens (IAM12142) und Serratia rubidaea (IFO12973).
Diese Mikroorganismen sind bekannt. Die Stämme IFO13537 und IFO12973 können leicht erhalten werden vom Institute for Fermentation und IAM12142 vom Institute of Molecular and Cellular Biosciences (IAM), University of Tokyo.
Im Allgemeinen kann ein Medium zum Kultivieren der Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung ein beliebiges sein, in bzw. auf welchem diese wachsen können. Beispiele von Kohlenstoffquellen umfassen Zucker, wie Glucose, Sucrose und Maltose; organische Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure und Fumarsäure, oder Salze davon; und Alkohole, wie Ethanol und Glycerol. Beispiele von Stickstoffquellen umfassen allgemeine und natürliche Stickstoffquellen, wie Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt und Aminosäuren, und verschiedene Ammoniumsalze von inorganischen und organischen Säuren und dergleichen. Falls nötig werden inorganische Salze, Mineralsalzspurenelemente, Vitamine und dergleichen in geeigneter Weise hinzugefügt. Des Weiteren ist das Hinzufügen zu einem Medium von Pyrrol-2-carbonsäure, Benzoesäure, Anthranilinsäure und ihren Derivaten und dergleichen als Induziermittel für die Enzymproduktion effektiv, um eine hohe enzymatische Aktivität zu erhalten.
Die Kultivierung kann durch Standardverfahren durchgeführt werden. Z. B. wird die Kultivierung bei einem pH von 4 bis 10 und bei einer Temperatur im Bereich von 15°C bis 40°C aerob für 6 bis 96 Stunden durchgeführt.
Die Reaktion zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure kann durchgeführt werden durch Wirkenlassen der obigen Mikroorganismen, oder jenen, die optional verarbeitet wurden, auf Pyrrol in der Gegenwart eines Carbonations und in Wasser oder in einem Puffer, wie Phorphorsäurepuffer, Carbonsäurepuffer, Borsäurepuffer und dergleichen.
Beispiele eines optional verarbeiteten Mikroorganismus umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, ein Kulturprodukt der Mikroorganismen, lebensfähige Zellen, getrocknete Zellen, aufgeschlossene Zellen, eine Enzymextraktlösung und ungereinigtes oder gereinigtes Enzym.
Die Reaktion kann im Allgemeinen bei einem pH im Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise pH 5 bis 9, und bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, vorzugsweise 5 bis 50°C durchgeführt werden. Eine geeignete Konzentration von Pyrrol ist unterschiedlich in Abhängigkeit der Reaktionstemperatur und des pH. Im Allgemeinen liegt eine bevorzugte Konzentration von Pyrrol im Bereich von 50 bis 300 mM. Zusätzlich liegt die Menge der Mikroorganismen oder jener, die optional verarbeitet wurden, die verwendet werden, im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 5 % (w/w) im Verhältnis von getrockneten Zellen zu einem Substrat.
Beispiele von Quellen eines Carbonations umfassen Carbonate, wie Natrium-, Kalium- und Ammoniumcarbonate, von welchen Ammoniumbicarbonat, Natriumbicarbonat oder dergleichen besonders effektiv sind. Da diese Reaktion eine Gleichgewichtsreaktion ist, können die Reaktionsausbeuten weiter erhöht werden durch Durchführen der Reaktion unter Kohlendioxidgasdruck zusätzlich zur Gegenwart dieser Salze.
Pyrroll-2-carbonsäure kann erhalten werden aus der Reaktionslösung durch bekannte Verfahren umfassend Bakterienelimination, Konzentration, Anionenaustauschchromatographie und Kristallisierung.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch Beispiele beschrieben.
Referenz 1
30 ml eines Mediums (pH 7,0) bestehend aus 10 g/l Natriumfumarat, 10 g/l Polypepton, 1,5 g/l pyrrol-2-carbonsäure (oder 3,0 g/l Pyrrol-2-carboaldehyd), 0,5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l Magnesiumsulfat·7 H₂O, 1 g/K₂HPO₄ und 5 ml/l Metallsalzmischung wurde in 500 ml Sakaguchi-Behälter gefüllt, und dann zur Sterilisation für 15 min. auf 121°C erhitzt. Dann wurden die in Tabelle 1 gezeigten Stämme inokuliert, gefolgt von Schüttelkultivierung bei 28°C für 24 Stunden.
Hier bestand die Metallsalzmischung (Lösung) aus 300 mg/l H₃BO₄, 400 mg/l CaCl₂·2H₂O, 40 mg/l CuSO₄·5H₂O, 100 mg/l KI, 200 mg/l FeSO₄·7H₂O, 400 mg/l MnSO₄·7H₂O, 200 mg/l H₂MoO₄·2H₂O und 10 ml/l konzentrierter Salzsäure.
Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (10.000 × g, 15 min.), und dann mit 0,85 % NaCl-Lösung gewaschen, deren Volumen gleich war zu jenem der Kulturlösung. Die Zellen wurden in 1,5 ml der 0,85 % NaCl-Lösung suspendiert [OD₆₁₀ = 9,0 (Trockengewicht der Zellen: etwa 4,5 mg/ml)].
0,5 ml der obigen Zellsuspension wurde zu einer Reaktionslösung bestehend aus 0,5 ml (200 μmol) einer 0,4 M Pyrrol-2-carbonsäure-Lösung, und 1 ml eines 0,4 M Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) hinzugefügt. Dann wurde die Mischung bei 30°C für 10 min. geschüttelt, und dann wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 0,5 ml einer 0,5 N NaOH-Lösung gestoppt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert (10.000 × g, 15 min.), um die Bakterien zu eliminieren. Der resultierende Überstand wurde einer HPLC (Shimadzu 3PD-10A, Shimadzu Corp., die Säule war Spherisorb S-500S2 (15 × 160 mm)) unterworfen. Pyrrol wurde durch Absorption bei 210 nm quantifiziert.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 1
Serratia grimesii IFO 13537 wurde in derselben Weise wie in Referenz 1 kultiviert und gewaschen. Dann wurden die Zellen in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 1 mM Dithiothreitol suspendiert, so dass die Zellen 15-fach für die Kulturlösung konzentriert waren (OD₆₁₀ = 9,0 (etwa 4,5 mg/ml getrocknete Zellen)). Anschließend wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen (Kubota INSONATOR 201M). Die resultierende Lösung wurde zentrifugiert (10.000 × g, 15 min.), um einen Überstand zu erhalten, und dann wurde eine 40 bis 70 % gesättigte Ammoniumsulfatfraktion erhalten durch Standardverfahren. Die Fraktion wurde gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, um eine ungereinigte Enzymlösung zu erhalten.
0,2 ml der obigen ungereinigten Enzymlösung wurde zu einer Reaktionslösung (etwa 2 ml) hinzugefügt, bestehend aus 0,03 ml von 200 mM Pyrrol, 0,2 ml eines 1 M Kaliumphosphatpuffers (pH 6,0), 0,6 g KHCO₃, 0,2 ml einer 0,2 M Dithiothreitollösung und 1,386 ml destilliertes Wasser, und dann bei 30°C für 3 Stunden reagieren gelassen.
Die Reaktionslösung wurde einer HPLC unterworfen (Shimadzu SPD-10A) mit einer Spherisorb S-50DS2 (15 × 160 mm)-Säule und einem Lösungsmittelsystem [10 mM KH₂PO₄-H₃PO₄ (pH 2,5):CH₃CN = 8:2 (v/v)]. Dann wurde die Absorption bei 210 nm detektiert, so dass Pyrrol und Pyrrol-2-carbonsäure quantifiziert wurden. Im Ergebnis wurde die Herstellung von 140 mM Pyrrol-2-carbonsäure (Ausbeute: etwa 70 %) bestätigt.
Beispiel 2
Serratia grimesii IFO 13537 wurde in derselben Weise wie in Referenz 1 kultiviert und gewaschen, und dann wurde eine Lösung enthaltend die aufgeschlossenen Zellen in derselben Weise hergestellt, wie in Beispiel 1. Diese Lösung wurde zentrifugiert (10.000 g, 15 min.), um einen Überstand zu erhalten. Dann wurde eine 40 bis 60 % gesättigte Ammoniumsulfatfraktion durch Standardverfahren erhalten. Die Fraktion wurde dialysiert gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer enthaltend 100 mM Essigsäure und 1 mM DTT, gefolgt von einer weiteren Dialyse gegen 50 % Glycerol enthaltend 1 mM DTT, wodurch eine ungereinigte Enzymlösung erhalten wurde.
Zwei Gruppen, von welcher jede drei Arten von Proben mit 200, 225 beziehungsweise 250 mM Startkonzentration von Pyrrol enthielt, wurden eingeteilt. 0,1 ml eines 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 5,5), 0,3 g KHCO₃, 0,1 ml 0,2 M Dithiothreitollösung, 0,4 ml der ungereinigten Enzymlösung wurden zu jeder dieser Proben hinzugefügt, und wurden dann für 3 Stunden reagieren gelassen.
Eine Gruppe wurde 3 Stunden später mit 100 mM Pyrrol gefüttert, wohingegen die andere Gruppe nicht gefüttert wurde. Die zwei Gruppen wurden dann für weitere 9 Stunden reagieren gelassen. Dann wurde die Menge der hergestellten Pyrrol-2-carbonsäure quantifiziert. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, ist die Menge von erhaltener Pyrrol-2-carbonsäure umso größer, je höher die Startkonzentration von Pyrrol ist. Des Weiteren resultierte das Hinzufügen von Pyrrol als Reaktionssubstrat in einer weiteren Steigerung der erzeugten Menge.
Beispiel 3
Serratia grimesii wurde in derselben Weise wie in Referenz 1 kultiviert, wodurch eine Zellsuspension hergestellt wurde. 400 mM Pyrrol, 0,1 ml eines 1 M Kaliumphosphatpuffers (pH 5,5), 0,3 g KHCO₃, 0,1 ml einer 0,2 M Dithiothreitollösung und 28 g getrocknete Zellen wurden zu der Suspension hinzugefügt, und dann bei 20°C für 12 Stunden geschüttelt. Anschließend wurden 0,25 ml einer 0,5 N NaOH-Lösung zu der Mischung hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. So wurde die Pyrrol-2-carbonsäure, die erzeugt worden war, quantifiziert.
Auf der anderen Seite wurde die Suspension in derselben Weise, wie oben beschrieben, behandelt, außer der Verwendung von 300 mM Pyrrol, dem Schütteln für 2,5 Stunden und dem Füttern mit 200 mM Pyrrol, wonach die Mischung für weitere 9,5 Stunden reagieren gelassen wurde.
Tabelle 3 zeigt die Menge von Pyrrol-2-carbonsäure, die in jeder Reaktion akkumulierte. Tabelle 3 Die Menge von akkumulierter Pyrrol-2-carbonsäure in der Reaktion der Zellen

*Fütterung 2,5 Stunden nach Beginn der Reaktion.

Beispiel 4
Ein Beispiel wurde in derselben Weise durchgeführt, wie in Beispiel 1, außer dass die verwendeten Zellen Serratia marcescens (IAM 12142) oder Serratia rubidaea (IFO 12973) waren. Im Ergebnis wurde die Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure für diese zwei Stämme bestätigt.
Industrielle Anwendbarkeit
In der vorliegenden Erfindung wird die Isolierung des Produkts von den Mikroorganismen erleichtert, da die hierin verwendeten Mikroorganismen die hohe Fähigkeit der Kohlendioxidfixierung aufweisen im Vergleich zu Standardmikroorganismen, und nicht die Anwesenheit eines Ammoniumsalzes einer organischen Säure in ihrem Reaktionssystem benötigen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure, umfassend die Schritte: Wirkenlassen eines vom Genus Serratia abgeleiteten Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Decarboxylierung von Pyrrol-2-carbonsäure zu katalysieren und in der Lage ist, die Synthese von Pyrrol-2-carbonsäure aus Pyrrol in der Gegenwart eines Carbonations zu katalysieren, auf Pyrrol, und Gewinnen der generierten Pyrrol-2-carbonsäure.
Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure gemäß Anspruch 1, worin der Mikroorganismus prozessiert ist zu einem Kulturprodukt, lebenden Zellen, getrockneten Zellen, aufgeschlossenen Zellen, einer Enzymextraktlösung oder einem ungereinigten/gereinigten Enzym.
Verfahren zur Herstellung von Pyrrol-2-carbonsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Mikroorganismus in der Abwesenheit einer organischen Säure wirken gelassen wird.
Enzym, welches aus einem zum Genus Serratia gehörenden Mikroorganismus extrahiert wurde, die Fähigkeit hat, die Decarboxylierung von Pyrrol-2-carbonsäure zu katalysieren und die Synthese von Pyrrol-2-carbonsäure aus Pyrrol in der Gegenwart eines Carbonations zu katalysieren.
Enzym gemäß Anspruch 3, worin der Mikroorganismus, welcher zu dem Genus Serratia gehört, Serratia grimesii (IFO13537), Serratia marcescens (IAM12142) oder Serratia rubidaea (IFO12973) ist.