DE69933705T2

DE69933705T2 - Stamm yunnan sl-001

Info

Publication number: DE69933705T2
Application number: DE69933705T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Kurashiki-shi SUMI
Original assignee: Sumi Hiroyuki Kurashiki; Honda Trading Corp
Current assignee: Sumi Hiroyuki Kurashiki; Honda Trading Corp
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: EP1170360A4; EP1170360A1; US6420145B1; AU1180800A; KR20010106497A; EP1170360B1; WO2001036591A1; KR100418104B1; DE69933705D1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Stamm von Bacillus subtilis. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Bacillussubtilis-Stamm, der effizient Vitamin K oder ein Derivat davon produziert.
Stand der Technik
Bisher ist Vitamin K als Faktor bekannt, der für die Blutgerinnung oder Koagulation notwendig ist. Vitamin K ist eines der fettlöslichen Vitamine und wird auch "antihämorrhagisches Vitamin" genannt, da ein Mangel an Vitamin K eine reduzierte Gerinnungsfähigkeit von Blut verursacht. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Gerinnungsfähigkeit von Blut durch den Mangel an Vitamin K verursacht werden kann, da Vitamin K essentiell für die Biosynthese von mehreren Blutgerinnungsfaktoren einschließlich Prothrombin ist. Das Auftreten eines Vitamin-K-Mangels ist selten, da nur eine kleine Menge an Vitamin K in der Größenordnung von μg erforderlich ist, um die Reduktion der Gerinnungsfähigkeit von Blut in einem lebenden Körper zu verhindern, und Vitamin K wird beim Erwachsenen gewöhnlich durch Darmbakterien zugeführt. Synthetisches Vitamin K₁ oder K₂ wird als Therapeutikum für die Behandlung einer hämorrhagischen Krankheit aufgrund eines Vitamin-K-Mangels verwendet, und ein natürliches Vitamin-K₁-Konzentrat wird als Nahrungsmittel verwendet, um den Zustand zu verhindern. Daher hat Vitamin K weniger Aufmerksamkeit erhalten.
In den letzten Jahren hat sich jedoch gezeigt, dass Vitamin K sowohl eine die Knochenbildung stimulierende Wirkung als auch eine die Knochenresorption hemmende Wirkung hat, und die Verabreichung von Vitamin K kann die Kno chendichte erhöhen. Andererseits ist Osteoporose ein Zustand, der durch Knochenbrüchigkeit charakterisiert ist, die durch das Altern, Krankheiten oder dergleichen verursacht wird und mit Brüchen oder schweren Schmerzen einhergeht. Osteoporose ist unter dem Gesichtspunkt der medizinischen Versorgung älterer Menschen zu einem großen sozialen Problem geworden. Es wurde berichtet, dass Patienten mit Osteoporose einen Blut-Vitamin-K-Spiegel von etwa der Hälfte des Wertes haben, den man bei normalen Individuen beobachtet. Angesichts dieser Tatsachen wurde synthetisches Vitamin K als Therapeutikum für Osteoporose klinischen Tests zugeführt. Im Unterschied zu dem Fall der hämorrhagischen Krankheit zeigen klinische Tests jedoch, dass bei der Behandlung und Prävention von Osteoporose für die effektive Agglomeration von Knochenmasse eine Verabreichung von Vitamin K in einer Menge von wenigstens 45 mg pro Tag notwendig ist. Bei Osteoporose ist Prävention wichtiger als eine Behandlung nach der Entwicklung von Symptomen. Daher ist es wünschenswert, Vitamin K täglich über die Nahrung aufzunehmen. Es ist jedoch noch unbekannt, welche Menge an Vitamin K von einem normalen Individuum pro Tag genommen werden sollte, um die Knochenmasse zu erhöhen und die Osteoporose effektiv zu verhindern. Überdies scheint es schwierig zu sein, eine solche Menge Vitamin K, wie sie oben genannt ist, über vorhandene Nahrungsmittel einzunehmen.
Wie oben erwähnt wurde, ist es wünschenswert, Vitamin K über tägliche Nahrungsmittel einzunehmen. Tatsächlich kann Vitamin K₁ über grüne/gelbe Gemüse und Seetang aufgenommen werden, und Vitamin K₂ kann über fermentierte Nahrungsmittel, wie "Natto" (schleimige fermentierte Sojabohnen) aufgenommen werden. Wenn jedoch 45 mg Vitamin K (das ist die Menge, die als effektiv für eine Linderung von Osteoporose beschrieben wird) über kommerzielle Nahrungsmittel aufgenommen werden, müsste zum Beispiel bei einem Nahrungsmittel, das 1 ppm Vitamin K enthält, eine große Menge von 45 kg des Nahrungsmittels pro Tag eingenommen werden, was tatsächlich sehr schwierig ist. Ein Nahrungsmittel, das unter den vorhandenen Nahrungsmitteln am reichsten an Vitamin K ist, ist Natto, das ein Dutzend ppm Vitamin K enthält. Selbst Natto müsste jedoch in einer großen Menge von mehreren hundert Gramm bis mehreren Kilogramm täglich gegessen werden. Es scheint unter dem Aspekt des Mögens schwierig zu sein, jeden Tag eine so große Menge Natto zu essen. Wenn Vitamin K oral auf einmal aufgenommen wird, kann außerdem aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Vitamin K keine ausreichende Wirkung erhalten werden. Dagegen kann die Einnahme einer großen Menge Vitamin K auf einmal das Problem von schädlichen Nebenwirkungen verursachen. Daher ist es wünschenswert, Vitamin K in einer konzentrierten Form aufzunehmen. Kommerziell erhältliche Konzentrate von natürlichem Vitamin K, die eine Milchpulverzubereitung zum Zwecke der Prävention einer hämorrhagischen Krankheit enthalten, sind jedoch teuer. Aus diesen Gründen ist die Zugabe von Vitamin-K-Konzentraten zu Nahrungsmitteln unmöglich.
In der Vitamin-K-Gruppe kommen nur Vitamin K₁ und K₂ natürlich vor. Vitamin K₁ ist in Nahrungsmitteln, insbesondere in grünem Gemüse, Pflanzenölen, Seetang usw., reichlich enthalten. Zum Beispiel enthalten Seetang, Meersalat und Teeblätter mehrere zehn ppm, während Sojaöl, Spinat und Brokkoli mehrere ppm enthalten. Alternativ dazu kann Vitamin K₁ auch durch die Kondensation von 2-Methyl-1,4-naphthochinon und Phytylacetat synthetisiert werden. Als Vitamin-K₂-Verbindungen sind verschiedene Homologe einschließlich Menachinon-1 bis -14 (MK-1 bis -14), je nach der Länge der Seitenketten, bekannt. Von diesen ist insbesondere Menachinon-7 (im Folgenden einfach als "MK-7" bezeichnet) eine repräsentative Vitamin-K₂-Substanz. MK-7 kann in erster Linie von Bacillus natto synthetisiert werden, aber seine Isolierung ist sehr schwierig, da der Vitamin-K₂-Gehalt in Natto nur mehrere Dutzend ppm beträgt und die Halbwertszeit des Vitamin K₂ kurz ist. Die Herstellung von Lipid mit hohem MK-7-Gehalt ist wahrscheinlich nur in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 8-73396 beschrieben.
Aus diesen Gründen wurde die Produktion von Vitamin K₂ in einer großen Menge unter Verwendung von Mikroorganismen wie Bacillus natto versucht. Für die Produktion von natürlichem Vitamin K₂ sind viele Studien bekannt. Zum Beispiel seien die folgenden Verfahren erwähnt: ein Verfahren zur Gewinnung von Vita min K₂ aus einer Kultur eines Mikroorganismus, der zur Gattung Flavobacterium gehört (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 7-28748 und 7-51070); ein Verfahren zur Produktion von Vitamin K durch Einimpfen von Bacillus natto in Sojabrühe, Okara oder dergleichen, das mit Glycerin ergänzt ist, um eine Fermentation zu bewirken (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 10-295393); und ein Verfahren zur Produktion von Vitamin K durch Fermentation mit Bacillus natto unter Bedingungen einer spezifischen Kulturtemperatur und -zeit (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 8-9916 und 8-19378). Außer diesen Verfahren wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem ein Fermentationsprodukt mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, Ether, Ester oder Keton, extrahiert wird, um dadurch ein konzentriertes Lipid herzustellen, das reich an natürlichem Vitamin K2, insbesondere natürlichem MK-7, ist (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 8-73396).
Bei dem Verfahren mit Verwendung eines Vitamin-K-produzierenden Bakteriums, wie Flavobacterium, das in den Japanischen Offenlegungsschriften Nr. 7-28748 und 7-51070 offenbart ist, gibt es jedoch das Problem, dass eine Kultur oder eine Kulturbrühe von Flavobacterium nicht selbst als Lebensmittelzusatz oder Lebensmittel verwendet werden kann, da die Unbedenklichkeit von Flavobacterium als Lebensmittelprodukt noch nicht nachgewiesen ist. Bei dem Verfahren, bei dem die Kultur von Bacillus natto in Sojabrühe, Okara oder dergleichen, das mit Glycerin ergänzt ist, wie es in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 10-295393 offenbart ist, kann zwar gewiss eine Kultur mit einem relativ hohen Vitamin-K-Gehalt von bis zu 40 mg/l Kulturmedium produziert werden, doch können etwa 3 bis 10 Gew.-% Glycerin als Kontamination im Kulturmedium enthalten sein, und daher würde Glycerin unvermeidlich in der Kultur bleiben. Dementsprechend gibt es das Problem, dass die Rohstoffe des Kulturmediums (z.B. Sojabrühe, Okara) und Bacillus natto vor der Kultivierung zwar für Lebensmittel verwendet werden können, die Kultur oder der nach der Kultur erhaltene Kulturüberstand wegen der Anwesenheit von Glycerin jedoch nicht selbst als Lebensmittelzusatz oder für Lebensmittel verwendet werden kann. Bei den Verfahren, bei denen die Fermentation mit Bacillus natto unter Bedingungen einer spezifischen Kulturtemperatur und -zeit eingesetzt wird, wie sie in den Japanischen Offenlegungsschriften Nr. 8-9916 und 8-19378 offenbart sind, kann eine Kultur mit sehr hohem Vitamin-K-Gehalt von bis zu etwa 53 mg/kg Soja bzw. bis zu etwa 117 mg/l Kultur produziert werden. Insbesondere bei dem Verfahren der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 8-9916 ist die resultierende Kultur jedoch wegen des Ammoniakgeruchs nicht als Lebensmittel geeignet, wie in der Beschreibung beschrieben ist. Bei dem Verfahren, das in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 8-19378 offenbart ist, kann zwar eine Kultur mit einem hohen Vitamin-K-Gehalt produziert werden, doch sind die meisten der produzierten Vitamin-K-Substanzen nicht wasserlöslich, sondern fettlöslich, und daher ist die Verwendung der Vitamin-K-Substanzen merklich eingeschränkt.
Das Lipid mit einem hohen natürlichen Menachinon-7-Gehalt, das durch Extraktion des Fermentationsprodukts von Bacillus natto mit einem organischen Lösungsmittel hergestellt wird, wie es in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 8-73396 offenbart ist, ist nachteilig. Der Grund dafür ist, dass zwar das Lipid mit dem hohen natürlichen Menachinon-7-Gehalt aus einem Rohstoff (z.B. Sojabohne), der für Lebensmittel anwendbar ist, hergestellt werden kann, das organische Lösungsmittel aber bei Verwendung in einem Lebensmittel oder als Lebensmittel vollständig aus dem Lipid entfernt werden müsste, was zusätzliche Anlagen oder Zeit für die Entfernung erfordert. Außerdem ist, wie oben erwähnt, das resultierende Lipid, das Menachinon-7 enthält, fettlöslich, wie aus seinem Namen hervorgeht, und möglicherweise in seiner Verwendung eingeschränkt.
Wie oben erwähnt, wurden die Verfahren zur Herstellung von Vitamin K oder Menachinon-7 aus Natto oder einem Fermentationsprodukt oder Nebenprodukt des Produktionsverfahrens für Natto (z.B. Okara, Brühe) mit einem Mikroorganismus (z.B. Bacillus natto) beschrieben. Es wurden jedoch nur wenige Berichte gefunden, die die Mikroorganismen selbst betreffen, die Vitamin K oder ein Derivat davon, das auf Lebensmittel anwendbar ist, in einer hohen Ausbeute produzieren können.
Dementsprechend besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der Vitamin K oder ein Derivat davon mit guter Effizienz produzieren kann.
Offenbarung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem man den Yunnan-Stamm SL-001 (FERM BP-6713) verwendet, der zu Bacillus subtilis gehört.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt nach dem RAPD-Verfahren bestimmte DNA-Muster des Yunnan-Stamms SL-001, des Miyagino-Stamms, des Yayoi-Stamms, des Takahashi-Stamms und des Naruse-Stamms.
2 ist eine Graphik, die die Mengen von MK-7 in wässrigen Extrakten und Isopropanolextrakten von Kulturen von verschiedenen Bacillus-natto-Stämmen vier Tage nach der Kultivierung in Beispiel 1 zeigt.
3 ist eine Graphik, die die Mengen von MK-7 in Isopropanolextrakten von Kulturen des Miyagino-Stamms und des Yunnan-Stamms SL-001 als Funktion der Kultivierungszeit in Beispiel 4 zeigt.
4 ist eine Graphik, die die Mengen eines MK-7-Derivats in wässrigen Extrakten von Kulturen von verschiedenen Bacillus-natto-Stämmen vier Tage nach der Kultivierung in Beispiel 5 zeigt.
5 ist eine Graphik, die die Ergebnisse der HPLC-Analyse eines wasserlöslichen Vitamin-K-Derivats und einer Isopropanolextraktprobe einer Kultur von "Okara" (einem unextrahierten Rückstand von Sojabohnen) in Beispiel 6 zeigt.
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Der Yunnan-Stamm SL-001 gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, insbesondere zu Bacillus subtilis, und in der Lage ist, Vitamin K oder ein Derivat davon in hoher Ausbeute zu produzieren.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben.
Natto (ein Produkt, das in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellt und vertrieben wird), das unter Verwendung eines Wollmispelblatts als Behälter und durch Fermentieren und Alternlassen von Sojabohnen in dem Behälter hergestellt wird, wurde verwendet, und ein einzelner Stamm wurde daraus in der folgenden Weise gemäß dem Verdünnungstrennverfahren isoliert, wie es im Natto-Test-Verfahren beschrieben ist (S. 65-66, veröffentlicht von Kabushiki Kaisha Korin, herausgegeben von Natto Shiken-ho Kenkyukai, 1990) (auf Japanisch). Das Natto wurde mit sterilem Wasser verdünnt, die Verdünnung wurde 48 Stunden lang bei 30 °C auf einem normalen Agarmedium (10 ml) kultiviert, gebildete Kolonien wurden nach der Kultivierung während einer vorbestimmten Zeit auf einer Impföse eingeimpft, und das Verfahren wurde wiederholt, wodurch der gewünschte einzelne Stamm isoliert wurde.
Die mykologischen Merkmale des isolierten Stamms sind im Folgenden gezeigt.
(a) Morphologische Merkmale

1) Form und Größe der Zelle: Bacillus, das eine Stäbchenform mit runden Rändern mit einer Größe von 1 μm (breit) x 3-4 μm (Länge) aufweist, wenn die Zellen nach 24 Stunden Kultur bei 30 °C in einer Fleischbrühe direkt mit einem Mikroskop beobachtet wurden.
2) Polymorphologie der Zelle: kein Polymorphismus.
3) Beweglichkeit: beweglich. Insbesondere wurde auf das Vorhandensein von Beweglichkeit der Zellen sowohl aufgrund der Tatsache, dass sich, wenn die Zellen auf einem halbfesten Medium (ein festes Medium, das durch Erstarrenlassen eines Bouillonmediums, das 0,3% Agar enthält, zu einer dicken Schicht hergestellt wird) in einer Tiefe von 2/3 des Mediums durch Einstechen eingeimpft und bei 35 °C kultiviert wurden, das Zellwachstum über das gesamte Medium ausbreitet, sowie aufgrund der direkten Beobachtung der Zellen mit einem Mikroskop geschlossen.
4) Sporenbildung: positiv (thermostabile Sporen wurden gebildet) Jede Spore hat eine Größe von etwa 1 μm im Durchmesser. Im Mittelteil der Zelle wurden ovale Sporen gebildet. Es wurde kein Sporangium gebildet. Unter dem obigen Punkt 4) erfolgte die Bestätigung von Sporen kurz gesagt durch Anfärben der Sporen nach dem Moeller-Verfahren (Moeller, H., 1891, Über eine neue Methode der Sporenfärbung, Zentbl., Baket. Parasitkde Abt. I, 10, 273). Insbesondere wurden durch Feuer fixierte Zellen mit einer Karbol-Fuchsin-Lösung angefärbt, mit Wasser gewaschen, mit Ethanol entfärbt, mit Löffler-Methylenblaulösung nachgefärbt und dann mit Wasser gewaschen. Als Ergebnis wurden Zellen blau gefärbt, während Sporen rot gefärbt wurden. Zellen in Kultur wurden 10 min lang auf 80 °C erhitzt, und ob die Sporen thermostabil waren oder nicht, wurde auf der Grundlage des Überlebens der Zellen bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Sporen thermostabil waren.

(b) Kulturmerkmale

1) Fleischbrühen-Agarplatten-Kultur (30 °C, 48 Stunden): Es entstanden kreisförmige weiße Kolonien mit einer faltigen Oberfläche, die trocken zu sein scheint, und mit einer Größe von etwa 2 mm im Durchmesser, wenn sie 48 Stunden lang bei 30 °C kultiviert wurden.
2) Fleischbrühen-Flüssigkultur (30 °C): Wenn eine Öse voll Zellen in das Medium (10 ml) eingeimpft und 36 Stunden lang kultiviert wurde, wurde eine weißliche Suspension erhalten, wobei die Extinktion (OD₆₆₀) der Kultur 0,85 betrug.
3) Fleischbrühen-Gelatine-Stichkultur: + Zellen wurden in ein Agarmedium mit zugesetzter Gelatine eingeimpft und kultiviert. Nach Zugabe von Frazier-Reagens (Frazier, W.C., 1926, A method for the detection of changes in gelatin due to bacteria, J. Infect. Dis., 37, 302) wurde beobachtet, ob eine klare, transparente Zone um den Bereich des Zellwachstums herum gebildet wurde. Die Bildung einer transparenten Zone wurde als "positiv (+)" definiert.

(c) Physiologische Merkmale

1) Gram-Färbung: +
2) Nitratreduktion: –
3) VP-Test: +
4) Indolproduktion: –
5) Schwefelwasserstoffproduktion: –
6) Verwertung von Citrat: –
7) Unease: –
8) Oxidase: +
9) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
10) Arginin-Hydrolyse (Arginin-Dihydrolase-Aktivität): –
11) Lysin-Decarboxylierungsreaktion (Lysin-Decarboxylase-Aktivität): –
12) Ornithin-Decarboxylierungsreaktion (Ornithin-Decarboxylase-Aktivität): –
13) Tryptophan-Deaminierungsreaktion: –
14) ONPG-Test (β-Galactosidase-Aktivität): –
15) Biotin-Abhängigkeit: –
16) Produktion von adhäsiven Stoffen: +

Die Verfahren zur Bestimmung einiger der oben genannten physiologischen Merkmale sind im Folgenden kurz beschrieben.

1) Gram-Färbung Die Gram-Färbung wurde nach einem modifizierten Hucker-Verfahren bestimmt. Insbesondere wurden durch Feuer fixierte Zellen mit Hucker-Kristallviolett-Lösung angefärbt, iodiert, entfärbt und dann mit Pfeiffer-Fuchsinlösung nachgefärbt. Als Ergebnis wurden die Zellen violett gefärbt. Bei diesem Verfahren wird eine Gram-positive Zelle violett gefärbt, während eine Gram-negative Zelle rot gefärbt wird.
2) Nitratreduktion Zellen wurden in ein Nitrat-Bouillon-Medium eingeimpft und kultiviert. Die Kultur wurde mit 0,8% Sulfanilsäurelösung (in 5 N Acetatlösung) und 0,5% α-Naphthylamin-Lösung (in 5 N Acetatlösung) versetzt. Eine Probe, die eine rote oder rötlichbraune Farbe entwickelt, wurde als "positiv" definiert.
3) VP-Test (Acetoinproduktion) Eine Zelle, die im Voges-Proskauer-Test eine rosa bis rote Farbe entwickelt, wurde als "positiv" definiert. Insbesondere wurden Zellen in MR-VP-Bouillon-Medium eingeimpft und 24 Stunden lang bei 30 °C kultiviert. Danach wurden eine 6%ige α-Naphthol-Lösung (in Ethanol) und eine 40%ige Natriumhydroxidlösung zu der Kultur gegeben und kräftig gerührt und anschließend stehen gelassen. Wenn die Kultur ihre Farbe von Rosa nach Rot änderte, wurde die Zelle als "positiv" bestimmt (Eddy, B.P., 1961, The Voges-Proskauer reaction and its significance: a review, J. Appl. Bact., 24, 27).
4) Indolproduktion Zellen wurden in wässrige Peptonlösung, die für Indoltestzwecke hergestellt wurde, eingeimpft und dann 10-15 min lang bei 35 °C stehen gelassen. Kovacs-Reagens wurde zu der Kultur gegeben. Wenn die Kultur eine rote Farbe entwickelte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt (Kovacs, N., 1928, Eine vereinfachte Methode zum Nachweis der Indolbildung durch Bakterien, Z. Immun-Forsch. exp. Ther., 55, 311).
5) Schwefelwasserstoffproduktion Zellen wurden in Brucella-Bouillon eingeimpft. Ein Bleiacetatpapier wurde zwischen dem Stopfen und dem Reagenzglas eingefügt, so dass das Papier im Reagenzglas hing, ohne mit dem Medium in Berührung zu kommen. Wenn das Ende des Papiers nach der Kultivierung seine Farbe nach Braun oder Schwarz veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt (ZoBell, C.E., & Feltham, C.B., 1934, A comparison of lead, bismuth, and iron as detectors of hydrogen sulphide produced by bacteria, J. Bact., 28, 169).
6) Verwertung von Citrat Zellen wurden in Simmons-Citrat-Agar-Medium eingeimpft und dann 4 Tage lang bei 35 °C kultiviert. Wenn in der Kultur ein sichtbares Zellwachstum beobachtet wurde und die Kultur ihre Farbe nach Blau veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
7) Urease Zellen wurden reichlich in Christensens Harnstoff-Agar-Medium eingeimpft und über Nacht bei 35 °C kultiviert. Wenn das gesamte Medium seine Farbe nach Rot veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt (Christensen, W.B., 1946, Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella, J. Bact., 52, 461).
8) Oxidase Kovacs-Reagens wurde tropfenweise zu einer Zellmasse gegeben. Wenn die Zellen ihre Farbe nach Dunkelviolett veränderten, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt (Kovacs, N., Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction, Nature, 178, 703, 1956).
9) Verhalten gegenüber Sauerstoff Zellen wurden getrennt in zwei Stücke Plattenmedium eingeimpft. Ein Medium wurde unter aeroben Bedingungen kultiviert, während das andere unter anaeroben Bedingungen kultiviert wurde. Für die anaerobe Kultivierung wurde ein GasPack-Beutel (BBL) verwendet. Wenn die Zellen nur auf der aerob kultivierten Platte wuchsen, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
10-12) Argininhydrolyse (Arginin-Dihydrolase-Aktivität), Lysin-Decarboxylierungsreaktion (Lysin-Decarboxylase-Aktivität) und Ornithin-Decarboxylierungsreaktion (Ornithin-Decarboxylase-Aktivität) Moeller-Decarboxylase-Medium wurde jeweils mit Arginin, Lysin und Ornithin (alle in Form des Hydrochlorids) (1%) ergänzt und unter hohem Druck sterilisiert. Die Zellen wurden in das Medium eingeimpft, und steriles flüssiges Paraffin wurde darübergeschichtet. Wenn die Kultur ihre Farbe nach Violett veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
13) Tryptophan-Deaminierungsreaktion Zellen wurden reichlich in Tryptophan-Agar-Medium eingeimpft und 24 Stunden lang bei 35 °C kultiviert. Wenn nach Zugabe von 3,4%iger Kupfer(II)chlorid-Lösung entlang der Schräge des Mediums der Bereich der Schräge, der mit dem Reagens in Berührung kam, seine Farbe nach Rötlichbraun veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
14) ONPG-Test (β-Galactosidase-Aktivität) Bei dem ONPG(o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid)-Test wurden Zellen, die ihre Farbe nach Gelb veränderten, als "positiv" bestimmt. Das heißt, Zellen wurden in ONPG-Bouillon-Medium eingeimpft und 24 Stunden lang bei 35 °C kultiviert. Wenn die Kultur ihre Farbe nach Gelb veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
15) Biotin-Abhängigkeit Ein synthetisches Medium, das von Setsuko Kida et al. entwickelt wurde (Setsuko Kida, Wataru Hashimoto und Shiro Teramoto, Hakko Kogaku Zasshi, in "Nutritional study on natto and Bacillus natto" 34, 542, 1956) (auf Japanisch), wurde verwendet. Zellen wurden mit oder ohne Biotin in das synthetische Medium eingeimpft und 6 Tage lang bei 35 °C kultiviert. Wenn die Kultur aufgrund des Wachstums der Zellen trübe wurde, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.
16) Produktion von adhäsiven Stoffen Zellen wurden in ein Plattenmedium, das für den Zweck der Produktion von adhäsiven Stoffen hergestellt wurde (Yotako Muramatsu et al., Abstracts of 1995 National Meeting of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, S. 315, 1995) (auf Japanisch), eingeimpft und kultiviert. Wenn eine Produktion von irgendeinem adhäsiven Stoff auf den gebildeten Kolonien beobachtet wurde, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.

(d) Bildung von Säuren aus Zuckern
In Anwesenheit oder Abwesenheit der Bildung einer Säure aus verschiedenen Zuckern durch die Zellen ist im Folgenden gezeigt.
Zur Untersuchung der Bildung von Säuren aus den unten aufgeführten Zuckern (Kohlenhydraten) wurden Zellen in ein mit Zucker versetztes Ammonium-Agar-Medium, das jeweils mit den Kohlenhydraten auf eine Endkonzentration von 1% ergänzt war, eingeimpft und 4 Tage lang bei 35 °C kultiviert. Wenn die Kultur ihre Farbe nach Gelb veränderte, wurden die Zellen als "positiv" bestimmt.

1) Glycerin: ±
2) L-Arabinose: –
3) Ribose: –
4) D-Glucose: +
5) D-Fructose: ±
6) D-Mannose: +
7) Inosit: –
8) D-Mannit: –
9) D-Sorbit: –
10) α-Methyl-D-glycosid: ±
11) Esculin: +
12) Maltose: –
13) Saccharose: +
14) Trehalose: +
15) Inulin: +
16) Glycogen: +

Der Stamm wurde unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (8. Aufl.) oder dergleichen klassifiziert und identifiziert. Als Ergebnis zeigte sich, dass der Stamm Bacillus subtilis nahe stand.
In Bezug auf die Merkmale der Punkte (a) bis (d) wurde der Stamm, der aus dem oben beschriebenen, in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde, mit Marburg (einem typischen Bacillussubtilis-Referenzstamm) und kommerziellen Bacillus-natto-Stämmen, Miyagino-Stamm (Yugen Kaisha Miyagino Natto Seizoujo, Sendai), Yayoi-Stamm (Suzuyo Kogyo Co., Ltd., Tokyo), Takahashi-Stamm (Takahashi Yuzo Kenkyujo, Yamagata) und Naruse-Stamm (Kabushiki Kaisha Naruse Hakko Kagaku Kenkyujo, Tokyo) verglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 gezeigt.
Die Ergebnisse in den Tabellen 1 bis 3 zeigen, dass der Stamm, der aus dem in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde, in Bezug auf die Verwertung von Citrat, den ONPG-Test (β-Galactosidase-Aktivität) und Biotinabhängigkeit einen signifikanten Unterschied zu den anderen Bacillus-subtilis-Stämmen, insbesondere kommerziellen Bacillus-subtilis-Stämmen, zeigte. Die Ergebnisse zeigen auch, dass der Stamm, der aus dem in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde, in Bezug auf die Produktion von Säuren aus Zuckern einen signifikanten Unterschied bei der Produktion von L-Arabinose, Ribose, Inosit, D-Mannit, D-Sorbit, Maltose und Glycogen im Vergleich zu anderen Bacillus-subtilis-Stämmen, insbesondere kommerziellen Bacillus-subtilis-Stämmen, zeigte.
Das DNA-Muster wurde zwischen dem Stamm, der aus dem in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde, und kommerziellen Bacillus-natto-Stämmen, dem Miyagino-Stamm (Yugen Kaisha Miyagino Natto Seizoujo, Sendai), Yayoi-Stamm (Suzuyo Kogyo Co., Ltd., Tokyo), Takahashi-Stamm (Takahashi Yuzo Kenkyujo, Yamagata) und Naruse-Stamm (Kabushiki Kaisha Naruse Hakko Kagaku Kenkyujo, Tokyo) verglichen, und zwar nach dem RAPD-Verfahren [Kazuko Nishimoto, Hiroshi Kawaguchi, Tamami Yokote, Noriaki Kishimoto und Tatsuo Tano, Abstracts of 1999 National Meeting of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, in "Convenient classification method of Bacillus natto strains using RAPD (random amplified polymorphic DNA), S. 75, 1999 (auf Japanisch); Hiroshi Kawaguchi, Kazuko Nishimoto, Tamami Yokote, Hideki Morishita, Noriaki Kishimoto und Tatsuo Tano, Abstracts of 46th National Meeting of Japan Foods and Science Technology, in "Classification of food microorganisms at a strain level using RAPD method", S. 98]. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 gezeigt ist, zeigte der Stamm, der aus dem in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde (Yunnan-Stamm SL-001 in 1), ein DNA-Muster, das sich eindeutig von dem der anderen vier kommerziellen Bacillus-natto-Stämme unterschied.
Außer dem oben genannten Unterschied gilt noch: Wenn die Mengen an Menachinon-7 (eine der Vitamin-K-Substanzen) und eines Derivats davon in kultivierten Zellen und einem Kulturmedium jeweils bei dem Stamm, der aus dem in Kunming, Provinz Yunnan, China, hergestellten und vertriebenen Natto isoliert wurde, und den verschiedenen kommerziellen Bacillus-natto-Stämmen bestimmt wurden, gab es einen signifikanten Unterschied in den Mengen zwischen diesen, wie es im Einzelnen in den folgenden Beispielen beschrieben ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Stamm der vorliegenden Erfindung Merkmale hat, die von denen bekannter Bacillus-subtilis-Stämme verschieden sind. Dementsprechend wird entschieden, dass dieser Stamm ein neuer Mikroorganismus ist, der zu Bacillus subtilis gehört und als "Yunnan-Stamm SL-001" bezeichnet wird, der am 7. Mai 1999 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens unter der Zugriffs-Nr. FERM BP-6713 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) hinterlegt wurde.
Die Erfinder haben Folgendes herausgefunden: Wenn Zellen des Yunnan-Stamms SL-001 mit irgendeinem bekannten Verfahren (z.B. Filtration und Zentrifugation) aus einer Kultur gewonnen und mit irgendeinem bekannten Verfahren (z.B. Gefriertrocknen, Trocknen an der Luft und Heißtrocknen im Vakuum) getrocknet wurden, können die getrockneten Zellen in Wasser gelöst werden. Dann wurde die Kultur mit Wasser und Isopropanol getrennt extrahiert und durch HPLC analysiert, wie es im Einzelnen in den folgenden Beispielen beschrieben ist. Als Ergebnis zeigte sich, dass beide Extrakte Vitamin K enthielten (insbesondere MK-7). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass das vom Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung produzierte Vitamin K (insbesondere MK-7) eine Änderung innerhalb der Zelle erfuhr, so dass es wasserlöslich wurde. Das Vitamin K und Menachinon-7 (MK-7) in den Formen, denen Wasserlöslichkeit verliehen wurde, werden als "wasserlösliches Vitamin-K-Derivat" (oder einfach "Vitamin-K-Derivat") bzw. "wasserlösliches Menachinon-7-Derivat" (oder einfach "Menachinon-7-Derivat") bezeichnet. Das wasserlösliche Menachinon-7- Derivat zeigte eine einzelne Bande, die gemäß einer Bestimmung durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese einem Molekulargewicht von etwa 100 000 entspricht, und zeigte auch ein Molekulargewicht von nicht weniger als 100 000 gemäß einer Bestimmung durch Gelfiltration, wie es ebenfalls im Einzelnen in den folgenden Beispielen beschrieben ist. Anhand dieser Ergebnisse wird aufgrund der Tatsache, dass das Molekulargewicht von Menachinon-7 etwa 649 beträgt, angenommen, dass in den Zellen irgendeine Substanz (z.B. Zuckerprotein) an MK-7 bindet und dadurch das MK-7 in eine stabile Form bringt, die wasserlösliche Vitamin-K-Derivate bildet (einschließlich Vitamin-K₂-Derivat und Menachinon-7-Derivat; diese Erklärung wird im Folgenden weggelassen). Selbstverständlich wird man sich jedoch darüber im Klaren sein, dass diese Vermutung das Konzept der vorliegenden Erfindung nicht einschränken soll.
In der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung von Zellen des Yunnan-Stamms SL-001 im gleichen Medium unter den gleichen Kulturbedingungen durchgeführt werden, wie sie für die herkömmliche Kultivierung von Bacillus subtilis eingesetzt werden. Zum Beispiel unterliegt das Medium, das für die Kultivierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, keiner besonderen Einschränkung, und es kann sich um ein beliebiges Medium handeln, das aus dem Fachmann bekannten Komponenten besteht. Das Medium kann ein Medium, das durch geeignetes Mischen verschiedener Kulturkomponenten hergestellt wird, ein kommerziell erhältliches Medium an sich oder ein kommerziell erhältliches Medium, dem die oben genannten bekannten Komponenten als ergänzende Komponenten hinzugefügt werden, sein. Das Medium kann fest oder flüssig sein und wird je nach Verwendungszweck in geeigneter Weise ausgewählt. Solange das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine geeignete Menge einer Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und irgendwelche anderen, von dem verwendeten Mikroorganismus assimilierbaren Nährstoffquellen enthält, kann das Medium außerdem synthetisch oder natürlich sein.
Die Kohlenstoffquelle, die für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange sie von dem Stamm assimiliert werden kann. Spezielle Beispiele für die Kohlenstoffquelle sind Kohlenhydrate, wie Stärke oder deren Verbundfraktion, geröstetes Dextrin, verarbeitete Stärke, Stärkederivat, physikalisch verarbeitete Stärke, α-Stärke, lösliche Stärke, Amylose, Amylopectin, Maltooligosaccharid, Cyclodextrin, Pluran, Maisstärke, Kartoffelstärke, Süßkartoffelstärke und Dextrin, Glycerin, Galactose, Lactose, Malzextrakt, Glucose, Fructose, Mannose, R-Methyl-D-glycosid, Esculin, Saccharose, Trehalose, Inulin und Glycogen. Von diesen Kohlenstoffquellen werden unter dem Gesichtspunkt des Wachstums des Yunnan-Stamms SL-001 vorzugsweise Saccharose, Mannose, Esculin, Glucose, Stärke, Trehalose, Inulin und Glycogen verwendet. Diese Kohlenstoffquelle kann einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren davon verwendet werden.
Die Stickstoffquelle, die für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, unterliegt ebenfalls keiner besonderen Einschränkung, solange sie von dem Stamm assimiliert werden kann. Spezielle Beispiele dafür sind Fleischextrakt, Malzextrakt, Pepton, aus Sojabohnen stammendes Polypepton (z.B. Polypepton-S), Hefeextrakt, "Ajieki" (ein Hydrolysat von Sojaprotein), Sojapulver, Milchcasein, verschiedene Aminosäuren (z.B. Casaminosäuren, Glutaminsäure, Arginin, Asparagin und Prolin) und organische Stickstoffverbindungen, wie Maisquellwasser, sowie Ammoniumsalze, wie Ammoniak, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, sowie Natriumsalze, wie Natriumnitrat und Natriumsulfat, sowie anorganische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff und Harnsäure. Von diesen Stickstoffquellen werden unter dem Gesichtspunkt des Wachstums des Yunnan-Stamms SL-001 vorzugsweise aus Sojabohnen stammendes Polypepton (z.B. Polypepton-S) und Sojapulver verwendet. Diese Stickstoffquellen können ebenfalls einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren davon verwendet werden.
Die anorganischen Salze, die für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, unterliegen ebenfalls keiner besonderen Einschränkung, solange der Stamm auf dem Medium in befriedigender Weise wachsen kann. Insbesondere können ein, zwei oder mehr Vertreter, die aus Phosphaten, Hydrochloriden, Sulfaten und Acetaten von Magnesium, Mangan, Calcium, Natrium, Kalium, Kupfer, Eisen und Zink ausgewählt sind, verwendet werden.
In dem Medium für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung kann auch ein Vitamin enthalten sein. Das Vitamin unterliegt ebenfalls keiner besonderen Einschränkung, solange der Yunnan-Stamm SL-001 auf dem Medium in befriedigender Weise wachsen kann. Spezielle Beispiele für das Vitamin sind Thiamin, Riboflavin, Vitamin-B6-Verbindungen, Calciumpantothenat, Nicotinsäureamid, p-Aminobenzoesäure und Folsäure.
Wenn ein kommerziell erhältliches Medium für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst das Medium zum Beispiel Nährbouillon (Trockenbouillon) (ein Produkt der Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. oder der Nippon Seiyaku Kabushiki Kaisha), Polypepton-5 (ein Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
In der vorliegenden Erfindung kann das für die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 verwendete Medium ein Material sein, das von Bacillus natto fermentiert werden kann, wie Okara (ein unextrahierter Rückstand von Sojabohnen), Sojabohnen, Sojabrühe, die ein Nebenprodukt der Produktion von Miso (fermentierte Sojapaste) oder Natto (schleimige fermentierte Sojabohnen) ist, Okara, das ein Nebenprodukt der Produktion von Tofu (Sojaquark) oder Aburage (frittierter Tofu), Sojakuchen, der ein Nebenprodukt der Produktion von Ölen aus Sojabohnen ist, und Sojaspelzen, die ein Nebenprodukt der Produktion von Miso sind. Falls notwendig, kann die oben genannte Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle oder das anorganische Salz in geeigneter Weise zu dem Material gegeben werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung des Yunnan-Stamms SL-001 in derselben Weise durchgeführt werden wie bei herkömmlichen Verfahren. Die Bedingungen für die Kultivierung können je nach der Zusammensetzung des Kulturmediums und dem eingesetzten Kultivierungsverfahren in geeigneter Weise ausgewählt werden und unterliegen keiner besonderen Einschränkung, solange der Stamm in befriedigender Weise wachsen kann. Die Kultivierungstemperatur liegt im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 45 °C, vorzugsweise 37 bis 42 °C. Der pH-Wert des Kulturmediums, der für die Kultivierung geeignet ist, liegt im Allgemeinen im Bereich von 6,0 bis 9,5, vorzugsweise 7,0 bis 8,5.
Die so hergestellte Kultur und Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung sind in hohem Maße unbedenklich, da der Stamm Lebensmittel als Quellen verwertet. Somit wird erwartet, dass die Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung selbst als Lebensmittelzusatz oder Lebensmittel verwendet wird.
Der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung kann mit guter Effizienz Vitamin K oder ein Derivat davon produzieren. Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Vitamins K oder seines Derivats aus dem Yunnan-Stamm SL-001 kann in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen usw. variieren, wie im Folgenden ausführlich beschrieben ist. Zum Beispiel kann in dem Fall, dass das gewünschte Vitamin K oder sein Derivat in Zellen in Kultur angereichert wird, das folgende Verfahren eingesetzt werden: Zellen werden unter den oben genannten Bedingungen kultiviert, durch Filtration, Zentrifugation oder dergleichen gewonnen, physikalischen Methoden (z.B. Frieren-Tauen, Ultraschallbehandlung, Druckbehandlung, Behandlung unter osmotischer Differenz, Mahlen usw.) oder chemischen Methoden (z.B. Behandlung mit einem Enzym, das zur Lyse von Zellwänden befähigt ist, wie Lysozym; oder Behandlung durch In-Kontakt-Bringen mit einem Tensid) einzeln oder in Kombination unterzogen, wodurch die Zellen aufgeschlossen werden, und dann wird das gewünschte Vitamin K oder sein Derivat nach irgendeinem bekannten Verfahren (z.B. fraktionierte Kristallisation, fraktionierte Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie, Lösungsmittelextraktion usw.) einzeln oder in Kombination aus den aufgeschlossenen Zellen gereinigt.
Die Zellen in Kultur können einer Soxhlet-Extraktion unterzogen werden, um das Vitamin K oder sein Derivat zu gewinnen. Insbesondere werden die Zellen, die gemäß der obigen Beschreibung kultiviert werden, einer Soxhlet-Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Hexan, Diethylether, Aceton, Ethanol, Isopropanol) beim Siedepunkt des organischen Lösungsmittels, das bei Verwendung des Soxhlet-Extraktors eingesetzt wird, unterzogen, wodurch eine fettlösliche Fraktion entsteht. Dann wird die Fraktion 0,1-20 Stunden lang bei 30-100 °C mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Hexan, Diethylether, Aceton, Ethanol, Isopropanol) extrahiert. Der resultierende Extrakt wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie es oben erwähnt ist, auf ein vorbestimmtes Gesamtvolumen verdünnt. Ein Aliquot des verdünnten Extrakts wird mit Wasser und Isopropanol gemischt und dann weiter mit einem organischen Lösungsmittel, wie es oben erwähnt ist, gemischt, wobei ein Stabmixer oder ein anderes Mittel verwendet wird. Die resultierende gemischte Lösung wird zentrifugiert, und der Überstand wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Ethanol gelöst, wodurch man Vitamin K oder ein Derivat davon erhält.
Wenn das durch den Yunnan-Stamm SL-001 produzierte Vitamin-K-Derivat in der vorliegenden Erfindung wasserlöslich ist, kann das folgende Verfahren eingesetzt werden, um das gewünschte Vitamin-K-Derivat zu gewinnen. Kurz gesagt, eine Kulturbrühe oder ein Kulturüberstand der Zellen des Yunnan-Stamms SL-001, der so kultiviert wird, wie es oben erwähnt ist, wird so behandelt, dass der pH-Wert gesenkt wird, vorzugsweise auf 1-3, wodurch ein Niederschlag entsteht. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation oder dergleichen fraktioniert, wobei man das wasserlösliche Vitamin-K-Derivat erhält.
Das so hergestellte Vitamin K oder sein Derivat aus der Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung ist auch in hohem Maße unbedenklich, da der Yunnan-Stamm SL-001 Lebensmittel als Quellen verwertet, und daher ist seine Kultur oder Kulturbrühe unbedenklich. Daher wird erwartet, dass die Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung selbst als Lebensmittelzusatz oder Lebensmittel verwendet wird.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher anhand von Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Okara (Asahimatsu Foods Co., Ltd., Iida-shi) (10 g Nassgewicht) wurde in eine Petri-Schale gegeben und etwa 10 min lang bei 120 °C autoklaviert (Sterilisation in einem Autoklaven).
Andererseits wurde jeweils eine Öse voll von sieben Arten von Bacillus-natto-Stämmen, die vier Arten von Bacillus-natto-Stämmen (Miyagino-Stamm, Asahi-Stamm, Naruse-Stamm und Takahashi-Stamm), welche in kommerziellen Natto-Produkten verwendet werden und in einzelnen Schrägkulturen aufrechterhalten wurden, zwei Arten von Bacillus-natto-Stämmen (Nitto-Stamm und Meguro-Stamm), welche als Pharmaka verwendet werden, sowie den Yunnan-Stamm SL-001 (FERM BP-6713) umfassten, in sterilem Wasser (9,5 ml) suspendiert, um eine Zellsuspension herzustellen. Die kommerziellen Bacillus-natto-Stämme sind wie folgt. Im Folgenden wird nur ein Stammname für jeden der verwendeten Bacillus-natto-Stämme gezeigt.
Kommerziell erhältliche Bacillus-natto-Stämme

Miyagino-Stamm (Yugen Kaisha Miyagino Natto Seizoujo, Sendai)
Nitto-Stamm (Nitto Pharmaceutical Industries, Ltd., Kyoto)
Meguro-Stamm (Kabushiki Kaisha Meguro Kenkyujo, Osaka)
Asahi-Stamm (Kabushiki Kaisha Asahi Kogyo, Tokyo)
Naruse-Stamm (Kabushiki Kaisha Naruse Hakko Kagaku Kenkyujo, Tokyo)
Takahashi-Stamm (Takahashi Yuzo Kenkyujo, Yamagata)

Jede der oben hergestellten Zellsuspensionen (0,5 ml) wurde in das wie oben autoklavierte Okara eingeimpft und 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert.
Die Okara-Kultur jedes Bacillus-natto-Stamms wurde mit 4 Volumina destilliertem Wasser oder Isopropanol versetzt. Die gemischte Lösung wurde 10 min lang bei 20 °C mit 3000 U/min zentrifugiert, und der resultierende Überstand (0,5 ml) wurde als Extraktionsprobe verwendet. Für jede der Extraktionsproben, die mit destilliertem Wasser als Extraktionslösungsmittel hergestellt wurden, wurden destilliertes Wasser (0,5 ml) und Isopropanol (1,5 ml) damit gemischt. Für jede der Extraktionsproben, die mit Isopropanol als Extraktionslösungsmittel hergestellt wurden, wurden destilliertes Wasser (1,0 ml) und Isopropanol (1,0 ml) damit gemischt. Anschließend wurde die resultierende gemischte Lösung mit Hexan (5,0 ml) versetzt, gerührt und dann 10 min lang bei 20 °C mit 3000 U/min zentrifugiert. Die Hexanschicht (4,0 ml) wurde konzentriert und mit einem Verdampfer getrocknet, und der resultierende Rückstand wurde in Ethanol (100 μl) gelöst. Die Proben, die unter Verwendung von entweder destilliertem Wasser oder Isopropanol als Extraktionslösungsmittel hergestellt wurden, wurden als wasserextrahierte Proben bzw. isopropanolextrahierte Proben verwendet. Die so hergestellten wasserextrahierten Proben und isopropanolextrahierten Proben wurden verwendet, um den MK-7-Gehalt unter den im Folgenden gezeigten HPLC-Bedingungen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Wie in 2 gezeigt ist, hatte der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung sowohl bei den wasserextrahierten Proben als auch bei der isopropanolextrahierten Probe einen höheren MK-7-Gehalt und zeigte insbesondere bei der wasserextrahierten Probe einen signifikanten Unterschied im MK-7-Gehalt im Vergleich zu anderen kommerziellen Bacillus-natto-Stämmen.

Im vorliegenden Beispiel macht sich die Bestimmung des MK-7-Gehalts durch HPLC (high performance liquid chromatography) die Tatsache zu Nutze, dass Vitamin K mit einem Platin-Tonerde-Katalysator zu einer fluoreszenten Hydrochinonform reduziert wird, und wird insbesondere unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.

Apparatur:
Pumpe:	PU-980 (Nippon Bunko)
Injektor:	7125 (Nippon Bunko)
Säulenofen:	CO-965 (Nippon Bunko)
Detektor:	Fluoreszenzdetektor 821-FP (Nippon Bunko)
Datenverarbeitungsvorrichtung:	C-R5A (Shimadzu Corporation)
Bedingungen:
Säule:	OD5-II-Säule (4,6 × 250 mm) (Shimadzu Corporation)
Reduktionssäule:	Platin-Tonerde-Katalysatorsäule (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Platin-Tonerde Primary Grade, Packung etwa 0,2 g Pt = 5%; 4,0 ϕ × 10 mm)
mobile Phase:	97% Ethanol (Fließgeschwindigkeit: 0,7 ml/min)
Temperatur für die Trennung/Reduktion:	40 °C
Messwellenlänge:	Anregung 320 nm Fluoreszenz 430 nm
Injektionsmenge:	10 μl

Im Einklang mit diesem Bestimmungsverfahren wurden Eichkurven für MK-7, Menachinon-7 bzw. Vitamin K₁ aufgestellt. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Menge an MK-7 im Bereich von 0,05 bis 50 ng im Einklang mit der Gleichung [–0,89661 + 1,6993 × 10^–6 × (Fläche in der HPLC, die Vitamin K entspricht (μV, s))] bestimmt werden konnte und die Mengen an Menachinon-4 und Vitamin K₁ im Bereich von 0,01 bis 10 ng im Einklang mit der Gleichung [–0,58657 + 4,8030 × 10^–9 × (Fläche in der HPLC, die Vitamin K entspricht (μV, s))] bzw. der Gleichung [–0,44381 + 4,0626 × 10^–7 × (Fläche in der HPLC, die Vitamin K entspricht (μV, s))] bestimmt werden konnten.
Die Standardsubstanz für MK-7 für die Aufstellung der Eichkurve wurde wie folgt angefertigt. Natto (600 g) wurde mit 75% Isopropanol (1 Liter) und n-Hexan (1 Liter) versetzt, 1 Stunde lang sachte gerührt und dann stehen gelassen. Von den zwei Schichten, die sich getrennt hatten, wurde die obere Schicht entnommen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wodurch man einen Extrakt (etwa 20 g) erhält. Der Extrakt wurde mit n-Hexan (10 ml) gemischt, durch Chromatographie-Silicagel (400 ml) gegeben, um den Extrakt auf dem Silicagel zu adsorbieren, und dann mit n-Hexan/Toluol (1:1) (2 Liter) eluiert und fraktioniert. Eine Fraktion, die MK-7 enthielt, wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das resultierende Silicagelkonzentrat wurde in n-Hexan (5 ml) gelöst, in derselben Weise wie oben erneut mit einer Silicagel-Säule fraktioniert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man ein Produkt (etwa 350 mg) erhielt. Ein Aliquot (50 mg) des Produkts wurde in einem kleinen Volumen Aceton gelöst, durch Chromatographie-ODS-Silicagel (60 ml) gegeben, das mit Acetonitril/Methanol (1:1) gefüllt war, und dann mit Acetonitril/Methanol (1:1) entwickelt. Das Eluat wurde durch HPLC überwacht, um eine Fraktion zu gewinnen, in der eine Substanz eluiert wird, von der angenommen wird, dass es sich um MK-7 allein handelt. Die Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Für die resultierende Substanz wurden ein IR-Spektrum und ein Massenspektrum erhalten, und es wurde bestätigt, dass es sich bei der Substanz um MK-7 handelte. Für die Reinheit der Substanz wurde 99,8% gefunden. Die verwendeten Standardsubstanzen für Forphyllochinon (Vitamin K₁) und Menachinon-4 (MK-4) waren Special Grade (Sigma). Die Messung wurde für jede Probe an drei Extrakten durchgeführt, und diese Werte werden gemittelt.
Beispiel 2
Eine wasserextrahierte Probe des Yunnan-Stamms SL-001 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt und gemäß dem Fibrinausstrichverfahren auf thrombolytische Eigenschaft untersucht. Kurz gesagt, die wasserextrahierte Probe (30 μl) wurde auf ein künstliches Gerinnsel, das in einer Petri-Schale hergestellt wurde (Standardfibrinplatte) (H. Sumi et al., Experientia, 43: 1110-111, 1987), gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Als Ergebnis wurde eine Thrombolyse beobachtet. Dieses Ergebnis beweist, dass die wasserextrahierte Probe des Yunnan-Stamms SL-001 eine thrombolytische Aktivität durch die Wirkung von Natto-Kinase (NK) aufwies.
Beispiel 3
Eine wasserextrahierte Probe des Yunnan-Stamms SL-001 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt und gemäß dem Verfahren der Zersetzung eines synthetischen Substrats auf die Fähigkeit untersucht, ein Substrat für Plasmin zu zersetzen oder abzubauen. Insbesondere wurden die wasserextrahierte Probe (10 μl) und 5 × 10^–3 M 5-2251 (ein Substrat für Plasmin; N-D-Val-Leu-Lys-pNA) (20 μl) mit 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,4) (170 μl) versetzt und dann 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Lösung zeigte eine Extinktion bei 405 nm (A₄₀₅) von 0,168, und ein Abbau von S-2251 wurde beobachtet. Diese Ergebnisse beweisen, dass die wasserextrahierte Probe des Yunnan-Stamms SL-001 eine thrombolytische Aktivität durch die Wirkung von Natto-Kinase (NK) aufwies.
Beispiel 4
Okara (Asahimatsu Foods Co., Ltd., Iida-shi) (10 g Nassgewicht) wurde in eine Petri-Schale gegeben und etwa 10 min lang bei 120 °C autoklaviert (Sterilisation in einem Autoklaven).
Andererseits wurde jeweils eine Öse voll des Miyagino-Stamms (eines kommerziell erhältlichen Bacillus-natto-Stamms) und des Yunnan-Stamms SL-001 (FERM BP-6713), die beide auf einer Schrägkultur aufrechterhalten worden waren, in sterilem Wasser (9,5 ml) suspendiert. Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde in das oben autoklavierte Okara eingeimpft und 10 Tage lang bei 37 °C inkubiert.
Während der Kultivierung wurden der Okara-Kultur mit Bacillus natto im Laufe der Zeit Proben entnommen (am Tag 1, 2, 4, 6, 8 und 10). Eine isopropanolextrahierte Probe wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 aus der Kultur hergestellt, und der MK-7-Gehalt der isopropanolextrahierten Probe wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Wie in 3 gezeigt ist, zeigten sich in der Kultur des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung an allen Kulturzeitpunkten, an denen Proben entnommen worden waren, wesentlich höhere MK-Gehalte, und der MK-7-Gehalt erreichte in einer kürzeren Zeit ein Maximum als bei dem Miyagino-Stamm (einem typischen kommerziell erhältlichen Bacillus-natto-Stamm). Diese Ergebnisse beweisen, dass der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung MK-7 (eine der Vitamin-K-Substanzen) schnell und effizient produzieren kann und für die Massenproduktion von MK-7 sehr gut geeignet ist.
Beispiel 5
Okara (Asahimatsu Foods Co., Ltd., Iida-shi) wurde bei –25 °C eingefroren und gelagert und vor der Verwendung nach Bedarf wieder aufgetaut. Das aufgetaute Okara wurde 30 min lang bei 120 °C autoklaviert und dann in einen Behälter von ca. 120 ml auf Polystyrolpapier (PSP) gegeben und als Kulturmedium für Bacillus-natto-Stämme verwendet.
Andererseits wurde jede von sieben Arten von Bacillus-Stämmen, die aus vier Arten von Bacillus-natto-Stämmen (Takahashi-Stamm, Naruse-Stamm, Miyagino-Stamm und Asahi-Stamm), welche in kommerziellen Natto-Produkten verwendet werden, zwei Arten von Bacillus-natto-Stämmen (Nitto-Stamm und Meguro-Stamm), welche als Pharmaka verwendet werden, und dem Yunnan-Stamm SL-001 bestanden, 3 Tage lang bei 37 °C unter Schütteln (100 U/min) in einem Kulturmedium (150 ml) kultiviert, das 3% Nährbouillon (getrockneten Bouillon) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt, wodurch Vorkulturen der oben genannten sieben Arten von Bacillus-natto-Stämmen entstanden.
Die Vorkulturen jeder der sieben Arten von Bacillus-natto-Stämmen (virale Zellen: 2 × 10⁸ Zellen/ml) (0,5 ml) wurde zu dem oben hergestellten Okara (Nassgewicht 50 g) gegeben und bei 37 °C statisch fermentieren gelassen. Am Tag 4 der Fermentierung wurden die Zellen der Bacillus-natto-Stämme jeweils in Wasser suspendiert, durch ein Metallteesieb filtriert und dann zentrifugiert (3000 U/min × 10 min), wodurch eine Kultur von jedem Stamm entstand. Eine wasserextrahierte Probe wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 aus der Kultur hergestellt, und die Menge des MK-7-Derivats in der Probe wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wie in 4 gezeigt ist, betrug die Ausbeute an dem MK-7-Derivat in der Kultur jedes Bacillus-natto-Stamms nach 4 Tagen Kultur im Durchschnitt 36,6 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Yunnan-Stamm SL-001, 1,9 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Miyagino-Stamm, 14,2 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Naruse-Stamm, 6,8 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Takahashi-Stamm, 11,9 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Asahi-Stamm, 1,9 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Meguro-Stamm und 5,2 μg/g Okara (Nassgewicht) für den Nitto-Stamm. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, zeigte der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung eine MK-7-Ausbeute von immerhin 36,6 μg/g Okara (Nassgewicht), was mathematisch zwei- bis zwanzigmal so groß ist wie bei anderen Bacillus-natto-Stämmen und viermal so groß ist wie die berichteten Analysewerte für Natto (6,2 bis 8,7 μg/g Okara als Nassgewicht) (Michio Yanaguchi (Hrsg.), Japan Food Ingredient List, Ishiyaku Shuppan, Tokyo, S. 52-53, 1997 (auf Japanisch); Toshiyuki Sakano et al., Vitamin, 62: 393-398, 1988; H. Ikeda und Y. Doi, Eur. J. Biochem., 192: 219-223, 1990; und Hiro Ikeda, Journal of Domestic Science, 43: 643-648, 1992 (auf Japanisch)).
Beispiel 6
Okara, das von der Asahimatsu Foods Co., Ltd. (Iida-shi) bereitgestellt wurde, wurde bei –25 °C eingefroren und gelagert und vor der Verwendung nach Bedarf wieder aufgetaut.
Andererseits wurde der Yunnan-Stamm SL-001 3 Tage lang bei 37 °C unter Schütteln (100 U/min) in einem Kulturmedium (150 ml), das 3% Nährbouillon (getrockneten Bouillon) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt, in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben kultiviert, wodurch eine Vorkultur des Bacillus-natto-Stamms entstand.
Das aufgetaute Okara (1 kg Nassgewicht) wurde 30 min lang bei 120 °C autoklaviert und dann in einen Behälter von ca. 120 ml auf Polystyrolpapier (PSP) gegeben. Die oben hergestellte Vorkultur des Yunnan-Stamms SL-001 wurde in den Behälter gegeben und 4 Tage lang bei 37 °C fermentieren gelassen. Wasser wird in einem Mischungsverhältnis von 5 Liter pro kg des Okara-Natto (Nassgewicht) zu dem fermentierten Okara-Natto gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert (3000 U/min, 10 min). Der Überstand wurde mit Ionenaustauscherharz (DEAE-Sepharose CL-613) (620 g) versetzt und gerührt und anschließend 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde in eine Glassäule (7,5 cm ϕ × 100 cm) gefüllt, mit destilliertem Wasser und 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und dann einer Gradientenelution mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 bis 0,8 M NaCl enthielt, unterzogen. Die Menge an Vitamin K wurde für jede Fraktion nach dem HPLC-Verfahren in derselben Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, und Fraktionen, die Vitamin K enthalten, wurden unter Verwendung eines Membranfilters (Millipore; MW 10 000) konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, wodurch man ein wasserlösliches Vitamin-K-Derivat als blassgelbes Pulver erhält.
Das so erhaltene wasserlösliche Vitamin-K-Derivat und der Extrakt desselben Okara wie oben mit Isopropanol wurden durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. In 5 betragen die Retentionszeiten für MK-4, Vitamin K₁ und MK-7 etwa 8,2 min, etwa 11,3 min bzw. etwa 17,5 min, und Pfeile zeigen die Retentionszeit für MK-7 an. Wie in 8 gezeigt ist, zeigte sich, dass 60% oder mehr des Isopropanolextrakts des Okara in die wasserlösliche Fraktion extrahiert wurden und dass von den Vitamin-K-Substanzen die Menge an Vitamin K₁ und MK-4 kleiner waren und MK-7 über 95% des Vitamin-K-Gehalts ausmachten.
Das wasserlösliche Vitamin-K-Derivat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurde eine einzelne, wenn auch breite Bande auf der Position beobachtet, die einem MW von etwa 100 000 entspricht.
Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass das wasserlösliche Vitamin-K-Derivat zusammen mit irgendeinem anderen Zuckerprotein einen Komplex mit einem MW von etwa 100 000 bildete. Die Ausbeute des wasserlöslichen Vitamin-K-Derivats ausgehend von 1 kg des Natto betrug etwa 5,3 g (830 μg wasserlösliches MK-7-Derivat pro g), was durch Mitteln von drei Bestimmungsergebnissen bestimmt wurde.
Beispiel 7
Ein Kulturmedium, das 3% trockene Bouillon (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (300 ml) enthielt, wurde in jeden von fünf 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und 15 min lang bei 120 °C autoklaviert. In jedes der Medien wurde eine Öse voll des Yunnan-Stamms SL-001 eingeimpft, und es wurde bei 37 °C unter Schütteln (100 U/min) kultiviert. Nach 4 Tagen wurden die Kulturen miteinander kombiniert und zentrifugiert (5000 U/min × 10 min). Der Überstand wurde in drei 400-ml-Portionen aufgeteilt und mit verdünnter Salzsäure auf pH 1,02, 2,07 bzw. 3,01 eingestellt. Jede der Lösungen wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und der Überstand wurde zentrifugiert (5000 U/min × 10 min, 10 °C), wodurch ein weißer Niederschlag abgetrennt wurde. Der weiße Niederschlag wurde in einem kleinen Volumen destillierten Wassers gelöst und mit Ammoniumhydrogencarbonatpulver auf pH 7,0 eingestellt, und anschließend wurde gefriergetrocknet. Die Mengen der gefriergetrockneten Produkte betrugen 0,52 g, 0,28 g und 0,31 g für die Proben, die auf pH 1,02, 2,07 bzw. 3,01 eingestellt worden waren. Dieses Verfahren wurde wiederholt.
Das gefriergetrocknete Produkt (1 g Trockengewicht) wurde 6 Stunden lang bei 80 °C in einem Soxhlet-Extraktor (SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6C, Filter: ADVANTEC 84, 24 × 100 mm) mit Hexan (100 ml) extrahiert. Das Gesamtvolumen des Extrakts wurde mit Hexan auf 100 ml eingestellt. Der Extrakt (100 μl) wurde mit destilliertem Wasser (1,0 ml) und Isopropanol (1,5 ml) und dann weiter etwa 10 s lang mit Hilfe eines Stabmixers mit Hexan (4,9 ml) gemischt. Die gemischte Lösung wurde zentrifugiert (3000 U/min × 10 min, 20 °C). Die Hexanschicht (4,0 ml) wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Ethanol (100 μl) gelöst. Von der so hergestellten Probe wurde nach dem HPLC-Verfahren in derselben Weise wie in Beispiel 1 der MK-7-Gehalt (μg/g getrocknete Probe) bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass die MK-7-Gehalte der Proben 2800, 2200 bzw. 2000 μg/g getrocknete Probe für die Proben betrugen, die auf pH 1,02, 2,07 bzw. 3,01 eingestellt worden waren.
Eine Lösung von jedem der gefriergetrockneten Produkte (15 mg) in destilliertem Wasser (5 ml) wurde zentrifugiert (10 000 U/min × 10 min). Von dem Überstand (d.h. einer wasserlöslichen Fraktion) wurde in derselben Weise wie oben der Gehalt an MK-7-Derivat bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Gehalte der Proben an MK-7-Derivat 1500, 1800 bzw. 1800 μg/g getrocknete Probe für die Proben betrugen, die auf pH 1,02, 2,07 bzw. 3,01 eingestellt worden waren, wobei die Auflösungsraten der wasserlöslichen Fraktionen etwa 54%, etwa 82% bzw. etwa 90% betrugen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung kann mit guter Effizienz Vitamin K oder ein Derivat davon produzieren.
Der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung ist in hohem Maße unbedenklich, da der Stamm aus einem Lebensmittel isoliert wird. Dementsprechend wird erwartet, dass eine Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung selbst als Lebensmittelzusatz oder Lebensmittel verwendet wird.
Das Vitamin K oder sein Derivat, das aus der Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist auch in hohem Maße unbedenklich, da der Yunnan-Stamm SL-001 Lebensmittel als Quellen verwertet, und daher ist seine Kultur oder Kulturbrühe unbedenklich. Dementsprechend wird erwartet, dass das Vitamin K oder sein Derivat, das aus der Kultur oder Kulturbrühe des Yunnan-Stamms SL-001 der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, selbst als Lebensmittelzusatz oder Lebensmittel verwendet wird. Außer den oben genannten Vorteilen hat der Yunnan-Stamm SL-001 der vorliegenden Erfindung auch den Vorteil, dass er ein wasserlösliches Vitamin-K-Derivat in hoher Ausbeute sowie ein fettlösliches Vitamin K produzieren kann. Daher kann für den Stamm ein breiterer Anwendungsbereich erwartet werden.

Claims

Yunnan-Stamm SL-001 FERM BP-6713, der zu Bacillus subtilis gehört.