DE69932712T2

DE69932712T2 - Vorhersage über die rezeptor-modulierende wirkung von verbindungen

Info

Publication number: DE69932712T2
Application number: DE69932712T
Authority: DE
Inventors: A. Lisa Rougemont PAIGE; M. Dana Chapel Hill FOWLKES; P. Donald Durham MCDONNELL; J. Dale Apex CHRISTENSEN; John D. Raleigh NORRIS; Ching-Yi Durham CHANG
Original assignee: Karo Bio AB; Duke University
Current assignee: Karo Healthcare AB; Duke University
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: IL139163A0; AU3209199A; WO1999054728A3; CA2329738A1; KR20010042966A; JP2002512368A; CA2329738C; IL139163A; KR100637955B1; AU769917B2; EP1073891B1; ATE335994T1; WO1999054728A2; DE69932712D1; EP1073891A2

Description

Querverweis zu verwandten Anmeldungen
Thorp, Seriennr. 08/904,842 (publiziert als WO 99/06839), VERFAHREN ZUM IDENTIFIZIEREN UND ENTWICKELN VON LEITSTRUKTUREN FÜR MEDIKAMENTE, DIE DIE AKTIVITÄT EINES ZIELPROTEINS MODULIEREN, offenbart verschiedene Verfahren zum Identifizieren von Leitstrukturen. Im Kern wird ein Protein von Interesse in einem oder in mehreren Zuständen durch (a) dessen chemische Reaktivität mit einem oder mit mehreren charakterisierenden Reagenzien und/oder (b) dessen Bindung zu einem oder zu mehreren Aptameren (insbesondere Nukleinsäuren) gekennzeichnet, wodurch ein Muster von beschreibenden Faktoren gebildet wird, durch das das Protein als mehr oder weniger ähnlich in Bezug auf Referenzproteine gekennzeichnet werden kann, für welche ein äquivalentes Muster an beschreibenden Faktoren gebildet wurde und für welche ein oder mehrere aktivitätsvermittelnde Referenzmedikamente bekannt sind. Geeignete Leitstrukturen für das Protein von Interesse sind diejenigen, die zu den Referenzmedikamenten für die ähnlicheren Referenzproteine analog sind.
Fowlkes et al., PCT/US97/19638 (WO98/19162), 08/740,671, 09/050,359 und 09/069,827 ( US 6,617,114 ), IDENTIFIKATION VON MEDIKAMENTEN UNTER VERWENDUNG VON KOMPLEMENTÄREN KOMBINATORISCHEN BIBLIOTHEKEN, offenbart die Verwendung einer ersten kombinatorischen Bibliothek, z. B. von Peptiden, um einen Satz bindender Peptide zu erhalten, die als Surrogat für den natürlichen Liganden eines Zielproteins dienen können. Eine kleine Bibliothek aus organischen Verbindungen (vorzugsweise eine kombinatorische Bibliothek) wird dann nach Verbindungen abgesucht, welche das Binden der Surrogate an das Zielprotein inhibieren.
Paige et al., Seriennr. 60/082, 756, eingereicht am 23. April 1998, und Paige et al., Seriennr. 60/099,656, eingereicht am 9. September 1998, sind die Vorläufer der vorliegenden Anmeldung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Medikamenten, welche die biologische Aktivität eines Zielproteins beeinflussen können.
Beschreibung des Standes der Technik
Proteinbindung und biologische Aktivität
Viele der biologischen Aktivitäten von Proteinen können ihrer Fähigkeit zugeschrieben werden, spezifisch an einen oder mehrere Bindepartner (Liganden) zu binden, welche selber Proteine oder andere Biomoleküle sein können.
Wenn der Bindepartner eines Proteins bekannt ist, ist es relativ leicht zu studieren, wie die Wechselwirkung des bindenden Proteins und dessen Bindepartners die biologische Aktivität beeinflusst. Darüber hinaus kann man Verbindungen hinsichtlich der Fähigkeit der Verbindung screenen, die Bildung des Komplexes kompetitiv zu inhibieren oder einen bereits gebildeten Komplex zu dissoziieren. Solche Inhibitoren werden wahrscheinlich die biologische Aktivität des Proteins beeinflussen, wenigstens wenn sie in vivo an den Ort der Wechselwirkung übertragen werden können.
Wenn das bindende Protein ein Rezeptor ist und der Bindeparner ein Effektor der biologischen Aktivität ist, dann wird der Inhibitor die biologische Aktivität antagonisieren. Wenn der Bindepartner einer ist, welcher durch die Bindung eine biologische Aktivität blockiert, dann wird ein Inhibitor dieser Interaktion im Ergebnis ein Agonist sein.
Suchen nach Modulatoren für die Rezeptoraktivität
Der gegenwärtige Stand der Technik für das Suchen nach Modulatoren der Rezeptoraktivität beinhaltet die Entfernung eines markierten Liganden von der Ligandenbindetasche des Rezeptors. Beispielsweise kann ein Screen auf das Ersetzen von radioaktivem Estradiol auf dem Estrogenrezeptor gerichtet sein. Dieser Assay stellt nur Informationen zur Verfügung, die die relativen Affinitäten der Verbindungen für den Rezeptor betreffen, und gibt keinen Hinweis über die Aktivität der Verbindung an dem Rezeptor, das heißt, ob sie als Agonist oder als Antagonist der Rezeptoraktivität fungiert. Dies ist ein Hauptproblem, das pharmazeutische Firmen bei der Suche nach Modulatoren der Rezeptoraktivität überwinden müssen.
Die Assays, die bis heute entwickelt wurden, die zwischen Agonisten und Antagonisten unterscheiden können, beinhalten zellbasierende Assays und Reportergensysteme. McDonnell et al., Molec. Endocrinol., 9:659 (1995). Bei diesen Systemen werden ein Rezeptor und ein Reportergen in Zellen in Kultur cotransfiziert. Das Reportergen wird nur in der Gegenwart eines aktiven Rezeptors aktiviert. Die Fähigkeit einer Verbindung, die Rezeptoraktivität zu modulieren, wird durch die relative Stärke der Reportergenaktivität bestimmt. Diese Assays sind zeitaufwendig und können bei unterschiedlichen Zelllinien oder mit unterschiedlichen Reportergenen oder Responseelementen variable Ergebnisse produzieren. Somit müssen diese Daten mit Vorsicht interpretiert werden.
Verfahren wurden entwickelt, die sich die unterschiedlichen konformationalen Zustände der Rezeptoren zunutze machen. Ein proteolytischer Verdau des Estrogenrezeptors in der Gegenwart eines Agonisten oder eines Antagonisten produziert unterschiedliche Bandenmuster auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel. Bei gewissen Konformationen wird der Rezeptor vor dem Verdau an einem bestimmten Ort geschützt, während eine andere Konformation diesen Ort ungeschützt lassen könnte. Somit kann das Bandenmuster anzeigen, ob der Rezeptor an einen Agonisten oder an einen Antagonisten zum Zeitpunkt des proteolytischen Verdaus gebunden war. Dieses Verfahren erfordert enorme Mengen an Rezeptorprotein und ist zeitaufwendig und teuer in der Hinsicht, dass es erfordert, dass für jede Probe ein Gel laufen gelassen werden muss. Es ist für das Screenen von einer Vielzahl von Proben nicht geeignet.
Die Folgenden sind Beispiele von Patenten für zellbasierende Screeningverfahren:

Patent US 5723291 – Verfahren zum Screenen von Verbindungen nach einer estrogenartigen Aktivität
Patent US 5298429 – Bioassay zum Identifizieren von Liganden für Steroidhormonrezeptoren
Patent US 5445941 – Verfahren zum Screenen nach Antiosteoporosemitteln
Patent US 5071773 – Hormonrezeptor-bezogene Bioassays
Patent US 5217867 – Rezeptoren: deren Identifikation, Charakterisierung, Präparation und Verwendung.

Nukleare Rezeptoren
Nukleare Rezeptoren sind eine Familie von ligandenaktivierten transkriptionalen Aktivatoren, siehe Evans und Hollenbert, Cell, 52:1-3 (1988), wobei die Faktoren die Rezeptoren für Steroid- und Thyroidhormone, Retinoide und Vitamin D behalten. Die Steroidrezeptorfamilie ist aus Rezeptoren für Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene, Progestine und Estrogene zusammengesetzt. Diese Rezeptoren sind in unterschiedliche Domänen zum Binden an Liganden, für die Dimerisierung, für die Transaktivierung und für das DNA-Binden organisiert. Die Rezeptoraktivierung tritt nach dem Binden an Liganden auf, was konformationale Veränderungen induziert, die die Rezeptordimerisierung und das Binden von coaktivierenden Proteinen erlauben. Diese Coaktivatoren erleichtern wiederum das Binden der Rezeptoren an DNA und die anschließende transkriptionale Aktivierung von Zielgenen. Zusätzlich zu der Verwendung von coaktivierenden Proteinen wird ebenso vermutet, dass das Binden des Liganden den Rezeptor in einer Konformation anordnet, die entweder das Binden von Proteinen, die als Corepressoren der Rezeptorfunktion dienen, verhindert oder diese Proteine entfernt. Lavinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 95:2929 (1998).
Der Estrogenrezeptor ist ein Mitglied der Steroidfamilie der nuklearen Rezeptoren. Humaner ERα ist ein Protein aus 595 Aminosäuren, das aus sechs funktionellen Domänen oder Bereichen (A-F) zusammengesetzt ist. Der A/B-Bereich enthält die Transkriptionsfunktion AF-1 und die E-Domäne enthält die Transkriptionsfunktion AF-2. Diese Funktionen aktivieren die Transkription auf eine Zell- und Promotorkontextspezifische Art und Weise. AF-1 ist konstitutiv aktiv, während AF-2 durch das Binden des Hormons an den Rezeptor induziert wird. Der C-Bereich enthält die DNA-bindende Domäne und eine Dimerisierungsdomäne. Die DNA-bindende Domäne bindet an das Estrogen (Rezeptor)-Responseelement (ERE), das mit einem regulierten Gen in Verbindung steht. Die DBD enthält zwei Zinkfinger. Der C-Bereich kann ebenso für die nukleare Lokalisation verantwortlich sein. Der E-Bereich enthält die Hormon (Liganden)-bindende Domäne.
Das klassische ERE ist aus zwei umgekehrten HexaNukleotidrepeats zusammengesetzt, und ein ligandengebundener ER bindet an ERE als Homodimer. Der ER vermittelt ebenso die Gentranskription von einem AP1-Enhancerelement, das Liganden und die AP1-transkriptionalen Faktoren Fos und Jun für die transkriptionale Aktivierung benötigt. Tamoxifen inhibiert die Transkription von Genen, die durch klassische ERE reguliert werden, aber aktiviert die Transkription von Genen unter der Kontrolle eines AP1-Elements. Siehe Paech et al., Science, 277:1508-11 (1997).
In der Abwesenheit von Hormonen residiert der Estrogenrezeptor in dem Nucleus von Targetzellen, wo er mit einem inhibierenden Hitzeschockproteinkomplex in Verbindung steht (Smith et al. (1993), Mol. Endocrinol., 7:4-11). Nach dem Binden an einen Liganden wird der Rezeptor aktiviert. Dieses Verfahren erlaubt die Bildung von stabilen Rezeptordimeren und die anschließende Interaktion mit spezifischen DNA-Responseelementen, die innerhalb des regulierenden Bereiches eines Zielgens angeordnet sind (McDonnell et al. (1991), Mol. Cell Biol., 11:4350-4355). Der an DNA gebundene Rezeptor kann dann entweder die Transkription des Zielgens positiv oder negativ regulieren. Auch wenn der genaue Mechanismus, durch welchen der ER die RNA-Polymeraseaktivität moduliert, noch bestimmt werden muss, wurde kürzlich gezeigt, dass ein ER, der an einen Agonisten gebunden ist, transkriptionale Adaptoren rekrutieren kann, Proteine, die es dem Rezeptor erlauben, dessen regulatorische Information an den transkriptionalen Apparat der Zelle weiterzuleiten (Onate et al. (1995), Science, 270:1354-1357; Norris et al. (1998), J. Biol. Chem., 273:6679-6688; Smith et al. (1997), Mol. Endocrinol., 11:657-666). Andersherum, wenn der Rezeptor durch Antagonisten besetzt ist, rekrutiert der an DNA gebundene Rezeptor aktiv Corepressoren, Proteine, die es der Zelle erlauben, zwischen Agonisten und Antagonisten zu unterscheiden (Norris et al. (1998); Smith et al. (1997); Lavinsky et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2920-2925). Auf dieser Komplexität aufbauend wurde kürzlich der zweite Estrogenrezeptor, ERβ, entdeckt, diesen Wirkmechanismus ähnlich zu sein scheint, aber dennoch von ERα verschieden ist (Greene et al. (1986), Science., 231:1150-1154; Kuiper et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5925-5930; Mosselman et al. (1996), FEBS Lett., 392:49-53).
Somit gibt es zwei Formen dieses Rezeptors, α und β, die gegenwärtig bekannt sind; andere Formen können ebenso existieren. Beide Rezeptoren aktivieren die Transkription als Antwort auf Estrogene, welche eine wichtige Gruppe von Steroidhormonen darstellen, die nicht nur das Wachstum, die Differenzierung und das Funktionieren des Reproduktionssystems beeinflussen, sondern außerdem Wirkungen auf die Knochen, auf das Gehirn und auf das Kardiovaskulärsystem ausüben. Estrogene können eine breite Vielzahl von Wirkungen in diesem sehr breit gefächerten Satz an Zielgeweben ausüben. Es wird vermutet, dass diese unterschiedlichen Wirkungen teilweise durch gewebespezifische Aktivierung von zwei unterschiedlichen Transaktivierungsdomänen vermittelt werden, die an dem Aminoterminus und an dem Carboxyterminus des Rezeptors angeordnet sind. Es ist ebenso wahrscheinlich, dass die zwei Formen des Rezeptors (α und β) in unterschiedlichen Geweben agieren und dass sie dadurch die Transaktivierung von unterschiedlichen Gengruppen vermitteln (Paech et al., Science, 277:1508, 1997; Kuiper und Gustafsson, FEBS Lett., 410:87, 1997; Nichols et al., EMBO J., 17:765, 1998; Montano et al., Mol. Endo., 9:814, 1995).
Medikamente, die den Estrogenrezeptor zum Ziel haben, können eine Vielzahl von Wirkungen in unterschiedlichen Zielgeweben ausüben. Beispielsweise ist Tamoxifen ein ER-Antagonist im Brustgewebe (Jordan, V.C. (1992, Cancer, 70:977-982), aber ein ER-Agonist im Knochen- (Love et al. (1992), New Eng. J. Med., 326:852-856) und im Uterusgewebe (Kedar et al. (1994), Lancet, 343:1318-1321). Raloxifen ist ebenso ein ER-Antagonist im Brustgewebe; jedoch übt es eine agonistische Aktivität in Knochen-, aber nicht im Uterusgewebe aus (Black et al. (1993), J. Clin. Invest., 93:63-69). Tatsächlich ist es eine der größten Herausforderungen beim Verständnis der Pharmakologie des Estrogenrezeptors, zu bestimmen, wie unterschiedliche ER-Liganden solche verschiedenen biologischen Wirkungen produzieren.
Estrogene sind im Allgemeinen stimulierende Mittel, die in einer erhöhten Genexpression und in einer Zellproliferation in Zielgeweben resultieren. Jedoch wurden viele Moleküle beschrieben, die an den Estradiolbindeort des Rezeptors binden, aber die negative Wirkungen auf die Genexpression und das Zellwachstum produzieren. Diese Mittel wurden historisch als "Antiestrogene" bezeichnet, aber es hat sich herausgestellt, dass dieser Begriff viel zu stark vereinfacht ist (Tremblay et al., Can. Res., 58:877, 1988; Katzenellenboge et al., Breast Can. Res. Treatm., 44:23, 1997; Howell, Oncology (Suppl. 1), 11:59, 1997; Gallo und Kaufman, Sem. in Oncol. (Suppl. 1), 24:71, 1997). Eines dieser Mittel, das am bemerkenswertesten ist, ist Tamoxifen, welches bei der Behandlung von ER-positivem Brustkrebs erfolgreich verwendet wurde. Tamoxifen, ein Derivat des Triphenylethylens, wird in der Zelle metabolisiert, so dass 4-OH-Tamoxifen entsteht, was eine sehr hohe Affinität für die Estradiolbindetasche auf dem ER hat. Auch wenn diese Verbindung mit Estradiol für das Binden an den ER in Wettbewerb steht, induziert sie keine transkriptionale Aktivierung im Brustgewebe und fördert somit das Zellwachstum nicht und agiert als ein klassisches Antiestrogen in diesem Gewebe. Tamoxifen hat allerdings estrogenartige Aktivitäten in anderen Geweben. In dem Uterus agiert Tamoxifen als Agonist der Rezeptoraktivität, wodurch das Wachstum des Uterusgewebes stimuliert wird, was zu einem erhöhten Auftreten an endometrialer Hyperplasie bei behandelten Patienten führt. Tamoxifen produziert ebenso estrogenartige Wirkungen im Knochen und im Kardiovaskulärsystem. Diese Aktivität verursacht günstige Wirkungen, so wie das Reduzieren des Risikos, an Osteoporose zu erkranken, und das Absenken von Serum-LDL-Spiegeln. Die Vielzahl an unterschiedlichen Wirkungen, die durch solche Verbindungen wie Tamoxifen produziert werden, hat zu dem Ersatz des Begriffes "Antiestrogen" durch "selektive Estrogenrezeptormodulatoren" oder SERMs geführt. SERMs können sowohl positive als auch negative Effekte auf die ER-Aktivität haben, abhängig von der Biologie des Rezeptors und dem Gewebe, in welchem sie exprimiert werden.
Ein Ziel der gegenwärtigen Forschung ist es, SERMs zu entwickeln, die agonistische oder estrogenartige Wirkungen auf den Knochen und auf das Kardiovaskulärsystem und antagonistische oder antiestrogene Wirkungen auf die Brust und den Uterus haben. Ein SERM, der kürzlich für die Behandlung von postmenopausalen Symptomen anerkannt worden ist, ist Raloxifen. Raloxifen ist ein Benzothiophenderivat, das, wie Tamoxifen, an die Ligandenbindetasche des ER bindet. Klinische Studien zeigen, dass dieser Verbindung eine estrogenartige Aktivität in der Brust und im Uterus fehlt, aber dass sie eine estrogenartige Aktivität im Knochen und möglicherweise im Kardiovaskulärsystem produziert. Sie wird gegenwärtig für die Vorbeugung von Osteoporose bei postmenopausalen Frauen verschrieben. Es gibt verschiedene zusätzliche SERMs in klinischen Versuchen, und ein großer Aufwand wird in der pharmazeutischen Industrie betrieben, um zusätzliche SERMs zu identifizieren und zu charakterisieren.
Die Suche nach SERMs stellt ein Haupthindernis dar. Um große Verbindungsbibliotheken nach SERMs abzusuchen, ist es erforderlich, einen bequemen Assay zur Verfügung zu haben, mit dem Leitstrukturen, die den gewünschten Effekt oder die gewünschten Effekte haben, identifiziert werden können. Gegenwärtig muss immer dann, wenn eine Verbindung identifiziert wird, die mit Estradiol hinsichtlich der Bindung an den ER im Wettbewerb steht, eine Anzahl von zellbasierenden Assays ausgeführt werden, um dessen Aktivität zu bestimmen. Diese Studien sind arbeitsaufwendiger als in vitro-Assays und sagen immer noch nicht absolut das vollständige Spektrum der biologischen Aktivität des SERM voraus. Somit müssen diese Studien oft in Tiermodellen oder in klinischen Versuchen weitergeführt werden, bevor die selektiven Wirkmechanismen des SERM bestimmt werden können. Ein einfaches in vitro-System zur Unterscheidung zwischen agonistischer und antagonistischer Aktivität eines SERM würde von hoher Nützlichkeit sein.
Die Entwicklung solch eines Systems erfordert das Wissen über die Mechanismen, die die breiten Wirkungen von SERMs produzieren. Es gibt Hinweise, dass SERMs in der Lage sind, differenzielle (agonistische und antagonistische) Wirkungen aufgrund ihrer Fähigkeit zu produzieren, die Konformation des ER zu verändern. Im Allgemeinen wird vermutet, dass der Rezeptor zwei Konformationen hat, nämlich die aktive und die inaktive Konformation. Diese Konformationen werden in der Gegenwart oder in der Abwesenheit eines Liganden gebildet. Der SERM zwingt den Rezeptor in eine Konformation, die weder vollständig aktiv noch vollständig inaktiv ist. Diese Intermediatkonformation verursacht Veränderungen bei den Assoziierungsmustern der Coaktivatoren, der Corepressoren und anderen Regulationsmolekülen mit dem Rezeptor, wodurch verschiedene Wirkungen produziert werden. Der breite Wirkbereich, der durch SERMs zur Verfügung gestellt wird, kann ebenso an der selektiven Gewebeexpression von ERα und ERβ liegen, ebenso wie an Coaktivatoren und Corepressoren. Er kann ebenso an unterschiedlichen Affinitäten des SERM für die zwei Rezeptoren liegen.
Traditioneiles Medikamentenscreening
Beim traditionellen Medikamentenscreening wurden natürliche Produkte (insbesondere diejenigen, die bei Volksheilverfahren verwendet werden) hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität getestet. Die aktiven Inhaltsstoffe dieser Produkte wurden aufgereinigt und charakterisiert, und dann wurden synthetische Analoga dieser "Leitstrukturen" entworfen, hergestellt und hinsichtlich ihrer Aktivität getestet. Die besten dieser Analoga stellten die nächste Generation der "Leitstrukturen" dar, und neue Analoga wurden hergestellt und bewertet.
Sowohl natürliche Produkte als auch synthetische Verbindungen konnten für lediglich eine einzelne Aktivität getestet werden oder sie können vollständig für jede biologische Aktivität von Interesse für den Tester getestet werden. Das Testen wurde ursprünglich in Tieren ausgeführt, und später wurden weniger teure und bequemere Modellsysteme unter Verwendung von isolierten Organen, Geweben oder Zellen oder Zellkulturen, Membranextrakten oder aufgereinigten Rezeptoren für einige pharmakologische Bewertungen entwickelt.
Das Testen in vollständigen Tieren und in isolierten Organen erfordert typischerweise große Mengen einer chemischen Verbindung für den Test. Da die Quantität einer gegebenen Verbindung in einer Sammlung aus potentiellen medizinischen Verbindungen limiert ist, erfordert dies, dass die Anzahl der ausgeführten Screens limitiert werden muss.
Auch ist es inhärent schwierig, Struktur/Aktivitätsbeziehungen (SAR) unter Verbindungen zu etablieren, die unter Verwendung von ganzen Tieren oder isolierten Organen oder Geweben oder, in einem geringeren Ausmaß, von kultivierten Zellen getestet wurde. Dies liegt daran, dass das tatsächliche molekulare Target der Wirkung einer gegebenen Verbindung recht unterschiedlich von demjenigen von anderen Verbindungen sein kann, die in dem Assay als positiv bewertet werden. Durch Testen einer Batterie an Verbindungen auf ein sehr spezifisches Target kann man die Wirkung von verschiedenen chemischen Resten mit der quantitativen Aktivität korrelieren und diese Information verwenden, um eine Suche nach aktiven Verbindungen unter gewissen Verbindungsklassen zu fokussieren oder sogar um die Synthese von neuen Verbindungen zu richten, die eine Zusammensetzung an Eigenschaften aufweisen, die bei den als aktiv getesteten Verbindungen vorhanden sind.
Ein weiterer Nachteil bei Screeningverfahren unter Verwendung von ganzen Tieren, ganzen Organen, Geweben und beim zellbasierten Screening ist es, dass gewisse Limitationen es verhindern könnten, dass eine aktive Verbindung als solche erkannt wird. Beispielsweise kann die Unfähigkeit, durch die zelluläre Membranen hindurchzutreten, es verhindern, dass ein potenter Inhibitor innerhalb einer getesteten Verbindungsbibliothek auf das aktivierte Oncogen ras agiert und ein fehlerhaftes negatives Ergebnis bei Zellproliferationsassays liefert. Jedoch, wenn es möglich wäre, ras in einem isoliertem System zu testen, würde dieser potente Inhibitor als eine positive Verbindung erkannt werden und zu der Etablierung eines relevanten SAR beitragen. Anschließend könnten dann chemische Modifikationen ausgeführt werden, um die Struktur der Verbindung hinsichtlich der Membranpermeabilität zu optimieren. (Im Fall von zellbasierenden Assays kann dieses Problem zu einem gewissen Grad durch das Verändern der Membrandurchlässigkeit erleichtert werden.)
Medikamentenentdeckung. Das humane Genomprojekt könnte Gensequenzen ergeben, die für bis zu 70.000 Proteine codieren, von denen jedes ein potentielles Medikamententarget ist; und mikrobielle Genomik wird diese Zahl weiter erhöhen. Da genomische Studien Gene identifizieren, aber nicht die biologische Aktivität der entsprechenden Proteine, ist es unglücklicherweise wahrscheinlich, dass viele der Gene für Proteine codieren werden, deren Aktivierung oder Inaktivierung keine Wirkung auf das Fortschreiten einer Erkrankung hat (Gold et al., J. Nature Biotech., 15:297, 1997). Es gibt daher einen Bedarf für ein Verfahren, um zu bestimmen, für welche Proteine es am wahrscheinlichsten ist, dass sie produktive Targets für die pharmakologische Intervention sind.
Sogar wenn man vorher die möglicherweise 10.000 Proteine kennen würde, die als interessante Targets angesehen werden könnten, verbliebe das Problem des effizienten Screenens von Hunderttausenden von möglichen Medikamenten für eine nützliche Aktivität gegen diese 10.000 Targets.
Historisch war das Beschaffen von Bibliotheken aus chemischen Verbindungen eine Barriere für den Eintritt von kleineren Firmen in das Gebiet der Medikamentenentdeckung. Aufgrund der großen Menge an Chemikalien, die für das Testen an ganzen Tieren oder sogar an Zellen in Kultur erforderlich sind, war gegeben, dass, wann immer eine Verbindung synthetisiert wurde, dieses in einem relativ großen Maßstab geschehen sollte. Somit ergab dies einen Synthese- und Aufreinigungsdurchsatz von weniger als 50 Verbindungen pro Chemiker pro Jahr. Große Firmen behielten ihre immens wertvollen Sammlungen als Handelsbarrieren. Jedoch wurde durch das Reduzieren der Targets auf das molekulare Niveau und durch die Automatisierung der Screens die Menge einer gegebenen Verbindung, die für einen Assay erforderlich ist, auf sehr kleine Mengen reduziert. Diese Veränderungen haben die Tür für die Verwendung von so genannten kombinatorischen Chemiebibliotheken anstelle der traditionellen chemischen Bibliotheken geöffnet. Die kombinatorische Chemie erlaubt die schnelle und relativ preiswerte Synthese einer großen Anzahl von Verbindungen in kleinen Mengen, die für die automatisierten Assays, die auf molekulare Targets gerichtet sind, geeignet sind. Eine Vielzahl kleiner Firmen und akademischer Laboratorien haben erfolgreich kombinatorische Chemikalienbibliotheken mit einem signifikanten Diversitätsbereich hergestellt (rückschauend zusammengefasst durch Doyle, 1995, Gordon et al., 1994a, Gordon et al, 1994b).
Kombinatorische Bibliotheken. Bei einer kombinatorischen Bibliothek werden chemische Baublöcke zufällig in einer großen Anzahl (so groß wie 10E15) von unterschiedlichen Verbindungen kombiniert, welche dann simultan hinsichtlich des Bindens (oder einer anderen Aktivität) an ein oder mehrere Targets gescreent werden.
Bibliotheken aus Tausenden oder sogar Millionen von zufälligen Oligopeptiden wurden durch chemische Synthese hergestellt (Houghten et al., Nature, 354:84-6 (1991)) oder durch Genexpression (Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-97 (1991)), zur Verfügung gestellt auf chromatographischen Trägern (Lam et al., Nature, 354:82-4 (1991)), innerhalb bakterieller Zellen (Colas et al., Nature, 380:548-550 (1996)), auf bakteriellen Pili (Lu, Bio/Technology, 13:366-372 (1990)) oder Phagen (Smith, Science, 228:1315-7 (1985)), und wurden nach dem Binden an eine Vielzahl von Targets, einschließlich Antikörpern (Valadon et al., J. Mol. Biol. 261:11-22 (1996)), zellulären Proteinen (einschließlich zellulärer Proteine (Schmitz et al., J. Mol. Biol., 260:664-677 (1996)), viraler Proteine (Hong und Boulanger, Embo J. 14:4714-4727 (1995)), bakterieller Proteine (Jacobsson und Frykberg, Biotechniques, 18:878-885 (1995)), Nukleinsäuren (Cheng et al., Gene, 171:1-8/1996)) und Plastik (Siani et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 34:588-593 (1994)), abgesucht.
Proteinbibliotheken (Ladner, USP 4,664,989), Peptoide (Simon et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-71 (1992)), Nukleinsäuren (Ellington und Szostak, Nature, 246:818 (1990)), Kohlenhydrate und kleine organische Moleküle (Eichler et al., Med. Res. Rev. 15:481-96 (1995)) wurden ebenso hergestellt oder zum Zweck des Suchens nach Medikamenten vorgeschlagen.
Die ersten kombinatorischen Bibliotheken waren aus Peptiden oder Proteinen zusammengesetzt, bei welchen alle oder ausgewählte Aminosäurepositionen zufällig besetzt waren. Peptide und Proteine können eine hohe und spezifische Bindeaktivität zeigen und können als Katalysatoren agieren. Im Ergebnis sind sie von großer Wichtigkeit bei biologischen Systemen. Unglücklicherweise haben Peptide per se eine limitierte Anwendbarkeit für die Verwendung als therapeutische Einheiten. Sie sind kostspielig in der Synthese, instabil in der Gegenwart von Proteanen und treten im Allgemeinen nicht durch zelluläre Membranen hindurch. Andere Verbindungsklassen haben bessere Eigenschaften als Medikamentenkandidaten.
Nukleinsäuren wurden ebenso in kombinatorischen Bibliotheken getestet. Ihr großer Vorteil ist die Einfachheit, mit welcher eine Nukleinsäure mit entsprechender Bindeaktivität amplifiziert werden kann. Als Ergebnis können kombinatorische Bibliotheken, die aus Nukleinsäuren zusammengesetzt sind, von niedriger Redundanz und daher von hoher Diversität sein. Jedoch sind die resultierenden Oligonukleotide als Medikamente aus verschiedenen Gründen nicht geeignet. Zunächst haben die Oligonukleotide hohe Molekulargewichte und können nicht bequem in großen Mengen synthetisiert werden. Zweitens, da Oligonukleotide Polyanionen sind, treten sie nicht durch Zellmembranen hindurch. Schließlich werden Deoxy- und RiboNukleotide hydrolytisch durch Nukleasen gespalten, die in allen lebenden Systemen auftreten, und sie werden daher normalerweise zersetzt, bevor sie das Ziel erreichen.
Es gab daher viel Interesse an kombinatorischen Bibliotheken, die auf kleinen Molekülen basierten, die für pharmazeutische Verwendungen geeigneter sind, insbesondere diejenigen, die, wie Benzodiazepine, zu einer chemischen Klasse gehören, aus der bereits nützliche pharmakologische Mittel hervorgegangen sind. Die Techniken der kombinatorischen Chemie wurden als das effizienteste Mittel zum Auffinden von kleinen Molekülen erkannt, die auf diese Targets wirken. Gegenwärtig beinhaltet die kombinatorische Kleinmolekülchemie die Synthese von entweder gepoolten oder diskreten Molekülen, die verschiedene Muster an Funktionalität auf einem gewöhnlichen Raster zeigen. Diese Verbindungen werden in Bibliotheken gruppiert, die dann gegen das Ziel von Interesse entweder hinsichtlich des Bindens oder hinsichtlich der Inhibition der biologischen Aktivität abgesucht werden. Bibliotheken, die Hunderttausende von Verbindungen enthalten, werden nun routinemäßig synthetisiert; jedoch kann das Absuchen dieser großen Bibliotheken hinsichtlich des Bindens oder der Inhibition von allen 10.000 potentiellen Targets mit den vorhandenen Screentechnologien nicht sinnvoll bewerkstelligt werden, und es gibt eine Vielzahl von experimentellen und computerbasierten Strategien in der Entwicklung, um die Anzahl der Verbindungen zu reduzieren, die für jedes Ziel gescreent werden müssen.
Informationsintensive Medikamentenentwicklung. Wie durch Paterson et al., J. Med. Chem. 39: 3049-59 (1996) dargestellt, schreitet die medizinische Chemie durch duale Prozesse bei der "Leitstrukturentdeckung" und der "Leitstrukturoptimierung" fort. Bei der "Leitstrukturentdeckung" ist das Suchziel die Entdeckung einer "Aktivitätsinsel", einer chemischen Klasse mit einer hohen Frequenz an aktiven Molekülen (diese Klasse kann mathematisch als ein Volumen innerhalb eines multidimensionalen Raums definiert werden, der wiederum durch verschiedene molekulare beschreibende Faktoren definiert ist). Bei der "Leitstrukturoptimierung" wird die "Aktivitätsinsel" detailliert untersucht. Wenn jede Verbindung, die synthetisiert und getestet wurde, als eine Sonde für eine "Nachbarschaft" aus ähnlichen Verbindungen angesehen werden kann, ist es bei der "Leitstrukturentdeckung" ineffektiv, Substanzen zu testen, deren Nachbarschaften sich überschneiden.
Verbunden mit den jüngeren Fortschritten auf den Feldern der Genomik und der Molekularbiologie war eine Revolution in der Informationstechnologie, welche relative Datenbanken, Computergrafiken und neurale Netzwerke beinhaltet (13). Diese Fähigkeiten erlauben die Konstruktion von Datenbanken aus beschreibenden Faktoren, die entweder die Verbindungen oder die Targets in quantitativen Begriffen beschreiben, und diese beschreibenden Faktoren können in Bezug gesetzt werden, um Vorhersagen über die Strukturen von Verbindungen, deren biologische Aktivitäten und die Targets, auf die sie einwirken können (5-8), zu machen.
Beschreibende Faktoren für die Struktur können auf einer Vielzahl von strukturellen Eigenschaften basieren. Diese Herangehensweisen stellen Muster aus molekularen beschreibenden Faktoren zur Verfügung, die verwendet werden können, um die Ähnlichkeit von Molekülen in einer Bibliothek zu untersuchen.
Siehe Patterson et al., J. Med. Chem., 39:3049-59 (1996), Klebe und Abraham, J. Med. Chem., 36:70-80 (1993), Cummins et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 36:750-63 (1996), Matter, J. Med. Chem, 40:1219-29 (1997); Weinstein et al., Science, 275:343-9 (1997).
Für Proteine können beschreibende strukturelle Faktoren nicht direkt aus der Aminosäuresequenz errechnet werden.
Verbindungen können durch ihre Aktivität eher als durch ihre Struktur gekennzeichnet werden. Kauvar et al., Chemistry & Biology, 2:107-118 (1995) fertigten "Fingerprints" von über 5000 Verbindungen durch die Bindepotenz jeder Verbindung an jedes Mitglied einer Referenzgruppe aus acht Proteinen an (die Bindepotenz ist die Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der Aktivität des Proteins zu inhibieren). (Diese Proteine wurden auf der Basis von einer leicht überprüfbaren Aktivität, einer breiten Querreaktivität mit kleinen organischen Molekülen und einer niedrigen Korrelation miteinander in deren Bindemustern ausgewählt.) Eine Screenbibliothek aus 54 Verbindungen wurde dann basierend auf der Unterschiedlichkeit in ihren "Fingerprints" ausgewählt (inhibitorische Aktivität gegen die Proteine der Referenzgruppe).
Dieses "Trainingset" wurde verwendet, um die Ähnlichkeit der Ligandenbindungseigenschaften eines neuen Proteins zu denjenigen der Proteine der Referenzgruppe zu bewerten. Durch Regressionsanalyse wird ein Computersurrogat (eine gewichtete Summe von zwei oder mehr Proteinen der Referenzgruppe) für das neue Protein bestimmt. Die Aktivität aller Verbindungen, von denen ein Fingerprint angefertigt wurde, die Aktivität des neuen Proteins zu inhibieren, wird als die Summe ihrer entsprechend gewichteten inhibitorischen Aktivitäten gegen die Referenzproteinkomponenten des computerbasierenden Surrogats vorhergesagt. Die Vorhersagen können durch das Testen von zusätzlichen Verbindungssätzen gegen das neue Protein verbessert werden. Siehe auch L.M. Kauvar, H.O. Villar, Method to identify binding partners, US Patent 5587293.
Weinstein, supra, nahm in einer Studie der molekularen Pharmakologie des Krebses eine ähnliche Herangehensweise. Die "Aktivitäts"-Datenbank (A) enthält die Aktivitäten gegen 60 Zelllinien für 60.000 Verbindungen, die am NCl getestet wurden. Die Gleichheit der Aktivitätsprofile gegen die Gruppe aus Zelllinien kann für jegliche zwei Verbindungen berechnet werden und wird im Allgemeinen durch einen paarweisen Korrelationskoeffizienten (PCC) ermittelt, welcher durch einen Algorithmus bestimmt wird, der COMPARE genannt wird, welcher die Ähnlichkeit von allen Verbindungen in der Datenbank mit einer "Seed"-Verbindung errechnet, die vom Benutzer zur Verfügung gestellt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die effizientere Identifizierung von kleinen organischen Molekülen, vorzugsweise von Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton, welche pharmazeutisch akzeptabel sind und welche potente Modulatoren der biologischen Aktivität eines Proteins sind.
Dieses Verfahren stellt ein einfaches und konsistentes Mittel zum Identifizieren und Charakterisieren von Modulatoren der Rezeptoraktivität unter Verwendung von Oligomeren (insbesondere Peptiden) zur Verfügung, um die Rezeptorkonformation zu untersuchen. Es kann als Werkzeug sowohl bei primären als auch bei sekundären Screens nach Verbindungen verwendet werden, die die Aktivität eines Rezeptors modulieren. In einigen Ausführungsformen wird das Verfahren auch vollständig in vitro ausgeführt, so dass die Aktivität einer Verbindung ohne die Verwendung eines zellbasierenden Assays und schon gar nicht unter Verwendung eines Assays mit einem ganzen Tier überprüft werden kann.
Wir haben die Möglichkeit untersucht, dass verschiedene ER-Liganden bestimmte konformationale Veränderungen in dem ER induzieren. Diese unterschiedlichen Konformationen können wiederum die Interaktionen des Rezeptors mit zell- und gewebespezifischen coaktivierenden oder Corepressorproteinen oder sogar Estrogenresponseelementen beeinflussen, was wiederum zu einer Vielfalt an biologischen Wirkungen führt. Unter Verwendung von limitierter Proteolyse haben wir und andere gezeigt, dass der ER-Agonist Estradiol und der ER-Antagonist Imperial Chemical Industries (ICI) 182,780 unterschiedliche ER-Konformationen induzierten (McDonnell et al., (1995), Mol. Endocrinol., 9:659-669; Beekman et al., (1993), Mol. Endocrin., 7:1266-1274). Jedoch ist das Bild viel komplizierter als dieses. Es gibt eine Vielzahl an ER-Liganden, insbesondere selektive Estrogenrezeptormodulatoren (SERMs), welche weder reine Agonisten noch reine Antagonisten sind. Diese Liganden, welche Tamoxifen und Raloxifen beinhalten, produzieren unterschiedliche gewebespezifische biologische Wirkungen, jedoch können konformationale Unterschiede in den Proteaseverdauassays nicht wahrgenommen werden. Es ist wahrscheinlich, dass diese Verbindungen ebenso unterschiedliche konformationale Veränderungen hervorrufen, die die ER-Aktivität beeinflussen, aber dass diese Veränderungen so geringfügig sind, dass sie durch Proteaseverdauassays nicht detektiert werden können (Brzozowski et al. (1997), Nature, 389:753-758; Shiau et al. (1998), Cell, 95:927-937).
Diese Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass Peptide, die durch Absuchen einer Peptidphagendisplaybibliothek hinsichtlich des Bindens an den Estrogenrezeptor isoliert worden sind, dramatisch unterschiedliche Bindeaffinitäten hatten, abhängig davon, ob der Rezeptor nicht mit einem Liganden verbunden war oder ob der Rezeptor einen Komplex mit einem Agonisten oder einem Antagonisten bildete. Somit scheint das Peptidbinden ein Barometer der Proteinkonformation zu sein und daher ein Barometer dafür zu sein, ob eine Verbindung, welche einen Komplex mit dem Rezeptor bildet, ein Agonist oder ein Antagonist ist.
Im Kern wird eine Gruppe aus "BioKeys" (typischerweise Peptiden), die die Konformation eines Rezeptors auf unterscheidbar unterschiedlichen Art und Weisen ändern, verwendet, um einen "Fingerprint" davon zu erhalten, wie eine Verbindung von Interesse mit dem Rezeptor in dessen verschiedenen BioKey-modifizierten Konformationen interagiert, wobei jedes Element des Fingerprints ein Maß der Stärke der Interaktion der Verbindung mit dem Rezeptor in der Gegenwart eines gegebenen BioKey ist. Wenn Fingerprints für eine vernünftige Anzahl an Referenzverbindungen mit bekannten biologischen Aktivitäten, wie gemessen durch einen "Goldstandard"-Assay (unter Verwendung eines ganzen Tiers oder eines isolierten Organs oder eines Gewebes), erhalten werden, kann die Ähnlichkeit des Fingerprints einer neuen Verbindung zu demjenigen der Referenzverbindung errechnet und verwendet werden, um die Bioaktivität der neuen Verbindung vorherzusagen.
Diese Erfindung hat die folgenden Vorteile gegenüber den Systemen, die auf ganzen Tieren basieren, die oben beschrieben sind: 1) Dieselbe Technologie kann auf eine Vielzahl von verschiedenen Rezeptoren angewendet werden, 2) das System kann für High-Throughput-Screening und für die Charakterisierung von Verbindungen verwendet werden, und (3) das System ergibt sehr genaue Muster für Agonisten und Antagonisten der Rezeptoraktivität, wobei nur sehr wenig Protein verwendet wird.
In der "molecular braille" (MB)-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basieren die Referenz- und die Testfingerprints auf in vitro (zellfreien) Assays.
In der "cellular braille" (CB)-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basieren die Referenz- und die Testfingerprints auf zellulären Assays (aber nicht auf Assays mit gesamten multizellulären Organismen oder deren Organen oder Geweben).
Die Vorteile von "molecular braille" sind:

• Es werden Informationen über die Affinität und, basierend auf einem Fingerprint, über die Bioaktivität in einem einzelnen Assay geliefert
• Es kann schneller und weniger teuer sein, wenn das Protein a) beim Kauf nicht teuer ist oder b) leicht zu exprimieren und aufzureinigen ist
• Es werden Informationen über Strukturaktivitätsbeziehungen geliefert
• Die Peptid/Rezeptor-Interaktionen können sensitiver sein, da es keine externen Bestandteile gibt, die hiermit inferieren könnten

Die Nachteile sind:

• Das Protein könnte nicht richtig gefaltet, modifiziert oder in der Gegenwart von Cofaktoren sein, die es braucht, um aktiv zu sein
• Nicht viele der Informationen werden zur Verfügung gestellt, die durch CB geliefert werden

Im Gegensatz dazu sind die Vorteile von "cellular braille":

• Wenn Hefe verwendet wird, kann dies billiger sein als MB
• Bioaktivitätsinformationen (einschließlich Dosis:Wirkung) werden zur Verfügung gestellt
• Es wird eine genauere Indikation geliefert, wie ein ganzes Tier reagieren könnte
• Man könnte aktive Metaboliten erhalten
• Eine Proteinaufreinigung ist nicht erforderlich

Dessen Nachteile sind:

• Verbindungen, die in die Zelle nicht eintreten können, werden automatisch nicht ausgewählt werden
• Es werden keine Affinitätsinformationen direkt geliefert
• Wahrscheinlich ist der Durchsatz niedriger als mit MB, auch wenn er immer noch besser ist als bei Assays, die auf gesamten Tieren basieren

Sowohl "molecular braille" als auch "cellular braille" sind schneller und weniger teuer als Bioassays, die auf gesamten Tieren basieren, und es ist leichter, sie für einen hohen Durchsatz zu automatisieren, und ihre Verwendung als vorläufige Screens hilft bei der Minimierung der Experimente mit Tieren, was ein ethisches Ziel der Gesellschaft darstellt.
Es wird anerkannt werden, dass beide Techniken entweder nacheinander oder gleichzeitig verwendet werden können. Beispielsweise kann MB als ein erster Screen verwendet werden und CB als ein zweiter Screen, der die positiven Ergebnisse der ersten Runde verwendet. Oder es könnten Verbindungen sowohl mit MB als auch mit CB gescreent werden, und Verbindungen, die durch einen der beiden Screens ausgewählt werden, könnte weiter Aufmerksamkeit zuteilwerden. Ähnlichkeiten könnten separat aus in vitro und zellbasierenden Assays berechnet werden oder die Ergebnisse dieser zwei Assaytypen könnten in einem einzelnen Fingerprint für jede Referenz- oder Testverbindung kombiniert werden
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet dieses Verfahren Phagendisplay, um Peptide (BioKeys) zu isolieren, die die Orte der biologischen Interaktion auf sowohl dem aktiven als auch dem inaktiven Rezeptor zuordnen. Diese BioKeys sind Sonden für Veränderungen bei der Rezeptorkonformation und können leicht zwischen aktivem, inaktivem und teilweise aktivem Rezeptor unterscheiden. Die Bindemuster, die mit den Peptiden erhalten werden, stellen einen Fingerprint der Rezeptorkonformation zur Verfügung. Das Binden der individuellen Peptide wird in der Gegenwart eines Agonisten oder eines Antagonisten der Rezeptoraktivität zunehmen oder abnehmen. Solch eine Aktivität kann aber muss nicht gewebespezifisch sein. In einigen Fällen wird die Tatsache, ob ein Molekül ein Agonist oder ein Antagonist ist, von dem fraglichen Gewebe (z. B. für SERMs) oder von anderen Umweltfaktoren abhängen. Daher können die Peptide verwendet werden, um Verbindungen zu klassifizieren, nicht nur als reine Agonisten oder Antagonisten, sondern auch auf komplexere Art und Weise. Das Verfahren hat die folgenden Anwendungen:

1) Ein oder mehrere dieser Peptide können in einem kompetitiven Verdrängungsassay verwendet werden, um Modulatoren der Rezeptoraktivität in einem High-Throughput-Screen (in vitro oder einfache Zelle) zu identifizieren.
2) Die Peptide können verwendet werden, um Fingerprints von Modulatoren der Rezeptoraktivität anzufertigen und um die Modulatoren als Agonisten oder Antagonisten der Rezeptoraktivität zu klassifizieren.
3) Peptide, die für unbekannte Rezeptoren identifiziert werden, können verwendet werden, um den natürlichen Liganden dieser Rezeptoren zu identifizieren.
4) Dieses Verfahren kann sowohl für nukleare Rezeptoren verwendet werden als auch für andere Rezeptoren, so wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
5) Das Verfahren kann auf jegliches Protein angewendet werden, das eine konformationale Veränderung nach dem Binden an einen Liganden oder an ein Substrat unterläuft.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung verwendet, um die SERM-Aktivität gegen nukleare Rezeptoren, so wie den Estrogenrezeptor, vorherzusagen.
Um die SERM-Aktivität am Estrogenrezeptor zu charakterisieren, haben wir ein System entwickelt, das Peptide verwendet, um das Binden von verschiedenen ER- assoziierten Proteinen an ERα und ERβ in einer in vitro-Umgebung zu mimen. Diese Peptide binden vorzugsweise an entweder die aktive oder die inaktive Konformation des Rezeptors und werden zwischen unterschiedlichen konformationalen Veränderungen in dem ER unterscheiden, die aus der Bindung an ein SERM resultieren. Das System wird ebenso den Vergleich der Wirkungen von dem SERM auf ERα und ERβ erlauben. Dieser Assay stellt ein einfaches Verfahren zur Verfügung, um die relative agonistische/antagonistische Aktivität eines neu identifizierten SERM zu bestimmen. Die Technologie kann ebenso auf die Analyse von selektiven Modulatoren eines jeglichen Rezeptors angewendet werden.
Wir haben ein in vitro-System zum Identifizieren, Charakterisieren und Klassifizieren von Modulatoren der Rezeptoraktivität entwickelt. Diese Technik wurde unter Verwendung des Estrogenrezeptors entwickelt und basiert auf dem Zuordnen von Orten der biologischen Interaktion an dem aktiven und inaktiven Rezeptor unter Verwendung von Phagendisplaypeptidbibliotheken. Diese Peptide, die an diese Orte binden, scheinen Proteine zu mimen, die vorzugsweise an den aktiven oder inaktiven Estrogenrezeptor binden. Gewisse Orte auf dem Rezeptor sind nur für das Binden erhältlich, wenn ein Agonist an den ER gebunden ist. Andere Orte sind leichter für das Binden an einen mit einem SERM komplexierten ER erhältlich. Die relativen Bindeaffinitäten dieser Peptide an einen Estrogen-komplexierten Rezeptor oder an einen SERM-komplexierten Rezeptor relativ zu einem Rezeptor, der nicht an einen Liganden gebunden ist, stellen einen Fingerprint zur Verfügung, der für die agonistische/antagonistische Aktivität des SERM indikativ ist. Das System wurde an dem ER unter Verwendung von verschiedenen bekannten Agonisten und SERMs getestet. Agonisten der Rezeptorfunktion und SERMs produzierten unterschiedliche Fingerprints in unserem System, die indikativ für ihre genauen in vivo-Funktionen waren. Dieses System kann als primäres Screeningwerkzeug verwendet werden, um Treffer zu identifizieren, um Leitstrukturen aus einem Medikamentenscreen zu klassifizieren, um SERMs bezüglich einer agonistischen oder antagonistischen Funktion zu charakterisieren und um mögliche klinische Wirkungen von SERMs, so wie die Gewebe- und Rezeptorspezifität vorherzusagen. Dieses Verfahren kann ebenso auf die Fraktionierung von Mischungen aus SERMs angewendet werden, um zu bestimmen, welche Bestandteile agonistische und antagonistische Aktivität produzieren. Dieses Verfahren kann ebenso mit anderen Rezeptoren verwendet werden (z. B. Progesteron-Rezeptor, Androgen-Rezeptor, Glucocorticoid-Rezeptor, Thyroid-Rezeptor, Vitamin-D-Rezeptor, beta-adrenerger-Rezeptor, Dopamin-Rezeptor, Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor usw.), um die Modularen der Rezeptoraktivität zu identifizieren, zu charakterisieren und zu klassifizieren.
Während Peptide für die Verwendung als Sonden identifiziert worden sind, um die Rezeptorkonformation zu modifizieren, um beim Screenen von Verbindungsbibliotheken zu helfen, können einige dieser Peptide selbständig als Medikamente oder als Diagnostika nützlich sein.
Zusätzlich können nichtpeptidische Mimetika oder andere Analoga der vorher erwähnten Peptide als Medikamente oder als Diagnostika nützlich sein.
Die gescreenten Verbindungen und deren Analoga sind ebenso von Interesse.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt die Wirkung von sieben Medikamenten, welche die Estrogenrezeptoraktivität an fünf Wirkorten modulieren.
2 ordnet den Bindeort für die Interaktion der vier Peptide mit ERα (oder von Resten davon), wie beeinflusst durch Estradiol oder durch 4-OH-Tamoxifen, zu.
3 zeigt, dass unterschiedliche Liganden unterschiedliche strukturelle Veränderungen bei ERα und ERβ induzieren, wie gezeigt durch Unterschiede des Bindens von 11 unterschiedlichen Peptiden (die Daten in dieser Figur sind tabellarisch in Tabelle 14 dargestellt).
4 vergleicht die Wirkungen von Estradiol (einem Agonisten) und Raloxifen (einem Antagonisten) auf die ERα-Konformation.
5 zeigt, wie die Daten in 3 und Tabelle 14A verwendet werden, um Ähnlichkeiten zu errechnen.
4A stellt Tabelle 14A doppelt dar.
5B zeigt die rohen euklidischen Abstände.
5C zeigt die errechneten Ähnlichkeiten nach der Skalierung:
Mit 8 beschreibenden Faktoren (BioKeys) und Scores von 0-7 ist die maximale Distanz SQRT (7·7·8) oder 19.79899.
5D ist ein 3D-Balkendiagramm entsprechend 5C.
5E ist ein 2D-Balkendiagramm, das die Ähnlichkeitsdaten für Estradiol und 4-OH-Tamoxifen isoliert.
6 zeigt auf eine ähnliche Art und Weise die Errechnung der Ähnlichkeiten basierend auf ERβ-Daten.
7 analysiert die Wechselwirkung von sieben Medikamenten mit ERα und vier unterschiedlichen Peptiden (AB1, A2, AB3, AB5) unter Verwendung eines Säugetier-Two-Hybrid-Assay-Systems.
8 analysiert die Spezifität der Wechselwirkung von verschiedenen Medikamenten mit vier weiteren nuklearen Rezeptoren und denselben vier Peptiden unter Verwendung desselben Assaysystems.
9 erörtert die Interaktion der vier Peptide mit Rezeptormutanten (beeinträchtigte AF-2-Funktion), wie sie durch sieben verschiedene Medikamente beeinflusst wird.
10 studiert die Unterbrechung der ER-vermittelten transkriptionalen Aktivität als eine Funktion der Peptidkonzentration.
11 zeigt, dass die Unterbrechung von A2 von Tamoxifen-aktiviertem ER nicht promotorabhängig ist.
12 erörtert die Unterbrechung der ER-transkripitionalen Aktivität, wie sie durch den AP-1-Weg vermittelt wird.
13 ist ein schematisches Modell von potentiellen Wirkmechanismen von Peptiden, die die teilweise agonistische Aktivität des Tamoxifens blockieren.
14 zeigt die normalisierte Luciferaseaktivität eines Two-Hybrid-Säugetiersystemsfür ER AF2 in der Gegenwart von Estradiol (E2), 4-OH-Tamoxifen, ICI, DES, GW 7604, Estron, Equilin und D8,9DHE.
15 zeigt das Binden von verschiedenen Peptiden an sowohl Wildtyp-ER als auch an eine ER-Mutante.
16A zeigt die Unterbrechung der Eα-transkriptionalen Aktivierungsfunktion in Säugetierzellen als ein Ergebnis der Wirkung von LXXLL-enthaltenden Peptiden. B zeigt die synergistische Interaktion von zwei Kopien der LXXLL-Motivfunktion, mit endogenen Coaktivatoren in Wettbewerb zu treten.
17 zeigt, dass die LXXLL-enthaltenden Peptide die AF2-Funktionen in HepG2-Zellen unterbrechen.
18 zeigt, dass die nuklearen Rezeptoren unterschiedliche Vorzüge für unterschiedliche Peptide mit LXXLL-Motiven haben-
19 zeigt eine Ählichkeitsanalyse der Daten, die in 17 abgebildet sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Rezeptorvermittelte pharmakologische Aktivität
Viele pharmakologisch aktive Substanzen rufen eine spezifische physiologische Antwort durch das Interagieren mit einem Element, das als Rezeptor bekannt ist, aus der Zielzelle hervor. Ein Rezeptor ist ein Bestandteil, normalerweise ein makromolekularer Bestandteil, eines Organismus, mit welchem ein chemisches Mittel auf eine bestimmte Art und Weise interagiert, um eine Wirkung zu entfachen, welche zu einer beobachtbaren biologischen Wirkung führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Antikörper nicht als Rezeptoren angesehen.
Die Substanzen, welche in der Lage sind, eine Antwort durch spezifische Interaktion mit einem Rezeptorort hervorzurufen, sind als Agonisten bekannt. Typischerweise führt das Erhöhen der Konzentration des Agonisten am Ort des Rezeptors zu einer ansteigend größeren Antwort, bis eine maximale Antwort erreicht wird. Eine Substanz, die in der Lage ist, die maximale Antwort hervorzurufen, ist als ein vollständiger Agonist bekannt, und eine Substanz, die höchstens eine geringere (aber bemerkbare) Antwort hervorruft, ist ein teilweiser Agonist.
Ein pharmakologischer Antagonist ist eine Verbindung, welche mit dem Rezeptor interagiert, ohne eine Antwort hervorzurufen, und durch diese Interaktion es verhindert, dass der Rezeptor auf Agonisten antwortet. Ein kompetitiver Antagonist ist einer, dessen Wirkung durch Erhöhen der Agonistenkonzentration überwunden werden kann; ein nichtkompetitiver Antagonist ist einer, dessen Wirkung durch die Agonistenkonzentration nicht beeinflusst wird. Ein Sequestorantagonist ist einer, welcher eine Interaktion zwischen Rezeptor und Ligand dadurch inhibiert, dass er an den Liganden so bindet, dass dieser nicht länger an den Rezeptor binden kann. Ein kompetitiver Sequestorantagonist tritt mit dem Rezeptor in einen Wettbewerb für den Liganden, wohingegen ein kompetitiver pharmakologischer Antagonist mit dem Liganden für den Rezeptor in Wettbewerb tritt.
Liganden sind Substanzen, welche an Rezeptoren binden und dadurch sowohl agonistische als auch pharmakologische Antagonisten umfassen. Jedoch existieren Liganden, welche an Rezeptoren binden, aber welche weder den Rezeptor agonisieren noch antagonisieren. Liganden, welche den Rezeptor aktivieren (agonisieren) oder inhibieren (antagonisieren), werden gemeinsam als Modulatoren bezeichnet. Einige Modulatoren verändern ihre Rolle, als Agonist oder als Antagonist zu agieren, abhängig von den Umständen.
Natürliche Liganden sind diejenigen, welche in der Natur ohne einen Eingriff durch Menschen verantwortlich für das Agonisieren oder das Antagonisieren eines natürlichen Rezeptors sind. Ein natürlicher Ligand kann durch den Organismus produziert werden, für welchen der Rezeptor nativ ist. Ein Ligand, der für ein Pathogen oder für einen Parasiten nativ ist, kann an einen Rezeptor binden, der nativ für einen Wirt ist. Oder ein Ligand, der nativ für einen Wirt ist, kann an einen Rezeptor binden, der nativ für das Pathogen oder den Parasiten ist. All dieses sind natürliche Liganden.
Das klinische Konzept des Medikamentenantagonismus ist breiter als das pharmakologische Konzept und schließt Phänomene ein, die die direkte Inhibition eines einer Agonist:Rezeptor-Bindung nicht beinhalten. Ein "physiologischer" Antagonist könnte eine Substanz sein, welche direkt oder indirekt die Produktion, die Freisetzung oder den Transport des natürlichen Agonisten an den Ort des Rezeptors inhibiert oder direkt oder indirekt dessen Eliminierung von dem Ort des Rezeptors (ob physikalisch oder durch Modifikation in eine inaktive Form) erleichtert oder welche die Produktion oder die Geschwindigkeit des Turnovers des Rezeptors erhöht oder welche die Signalweiterleitung von dem aktivierten Rezeptor stört.
Ein physiologischer Antagonist eines Rezeptors (z. B. eines Estrogenrezeptors) kann ein pharmakologischer Antagonist von etwas anderem, z. B. von einem Transkriptionsfaktor, sein. Ein physiologischer Antagonist eines Rezeptors kann ein pharmakologischer Agonist eines anderen Rezeptors sein, so wie von einem, welcher ein Enzym aktiviert, welches den natürlichen Liganden des ersten Rezeptors abbaut.
Auf ähnliche Weise könnte man von einem physiologischen Agonisten sprechen, wenn es sich um eine Substanz handelt, die direkt oder indirekt die Produktion, die Freisetzung oder den Transport des natürlichen Agonisten an den Ort des Rezeptors verstärkt oder direkt oder indirekt dessen Eliminierung aus dem Ort des Rezeptors inhibiert oder die Produktion erhöht oder die Geschwindigkeit des Turnovers des Rezeptors vermindert oder auf irgendeine Weise die Signalweiterleitung vom aktivierten Rezeptor erleichtert.
Es folgt, dass es sowohl "pharmakologische" als auch "physiologische" Modulatoren gibt.
Ein funktionaler Antagonist eines Rezeptors ist eine Substanz, welche auf einen zweiten Rezeptor einwirkt, der eine biologische Antwort triggert, welche gegen die normale Antwort auf die Aktivierung des ersten Rezeptors agiert oder diese inhibiert. Somit kann ein funktionaler Antagonist von einem Rezeptor der pharmakologische Agonist eines anderen sein.
Wenn ein Krankheitszustand das Ergebnis einer nicht angemessenen Aktivierung eines Rezeptors ist, kann der Erkrankung mittels eines physiologischen oder eines pharmakologischen Antagonisten vorgebeugt oder dies behandelt werden. Andere Krankheitszustände können durch nicht angemessene Aktivierung eines Rezeptors auftreten, in welchem Fall der Erkrankung mittels eines geeigneten physiologischen oder pharmakologischen Agonisten vorgebeugt werden kann.
Eine wichtige Rezeptorklasse sind Proteine, die in die Phospholipiddoppelschicht von Zellmembranen eingebettet sind. Das Binden eines Agonisten an den Rezeptor (typischerweise an einem extrazellulären Bindeort) kann eine allosterische Veränderung an einem intrazellulären Ort verursachen, die die Interaktion des Rezeptors mit anderen Biomolekülen verändert. Die physiologische Antwort wird durch die Wechselwirkung mit diesem "zweiten Messenger" (der Agonist ist der "erste Messenger") oder mit dem "Effektor"-Molekül initiiert.
Enzyme sind eine spezielle Art von Rezeptoren. Rezeptoren interagieren mit Agonisten, um Komplexe zu bilden, welche eine biologische Antwort hervorrufen. Normale Rezeptoren setzen dann den Agonisten in einer intakten Form frei. Bei Enzymen sind die Agonisten Enzymsubstrate, und die Enzyme katalysieren eine chemische Modifikation des Substrats. Somit sind Enzymsubstrate "Liganden". Enzyme sind nicht notwendigerweise integrale Membranproteine; sie können aus der Zelle ausgeschiedene oder intrazelluläre Proteine sein. Häufig werden Enzyme durch die Wirkung von einem zweiten Messenger des Rezeptors oder auf indirektere Art und Weise durch das Produkt einer "stromaufwärts gelegenen" enzymatischen Reaktion aktiviert.
Somit können Medikamente ebenso aufgrund ihrer Wechselwirkung mit Enzymen nützlich sein. Das Medikament kann als ein Substrat für das Enzym, als Coenzym oder als Enzyminhibitor dienen. (Ein irreversibler Inhibitor ist ein "Inaktivator".) Medikamente können ebenso direkt oder indirekt die Umwandlung eines Proenzyms in ein Enzym verursachen. Viele Erkrankungszustände sind mit einer nicht angemessenen niedrigen oder hohen Aktivität von bestimmten Enzymen assoziiert.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um sowohl Agonisten als auch Antagonisten von Rezeptoren zu identifizieren. Es ist nicht ungewöhnlich, dass relativ kleine strukturelle Veränderungen einen Agonisten in einen pharmakologischen Antagonisten verwandeln, oder umgekehrt. Sogar wenn die Medikamente dafür bekannt sind, dass sie mit einem Referenzprotein alle als Agonist interagieren, können daher die fraglichen Medikamente als Leitstrukturen für die Identifikation von sowohl Agonisten als auch Antagonisten des Referenzproteins und von verwandten Proteinen dienen. Auf ähnliche Weise können bekannte Antagonisten, nicht nur für zusätzliche Antagonisten, sondern auch für Agonisten als Medikamentenleitstrukturen dienen.
Potenz
Die Potenz eines Antagonisten eines Rezeptors kann als IC50-Wert ausgedrückt werden, wobei IC50 die Konzentration des Antagonisten darstellt, welche eine 50%ige Inhibierung der Bindung des Rezeptors oder der biologischen Aktivität in einem in vitro- oder in einem in vivo-Assaysystem darstellt. Eine pharmazeutisch wirksame Dosierung eines Antagonisten hängt sowohl von dem IC50-Wert des Antagonisten und der effektiven Konzentrationen des Rezeptors als auch von dessen klinisch relevanten Bindepartnern ab.
Die Potenzen können wie folgt kategorisiert werden:

Kategorie IC50

sehr schwach > 1 mol

schwach 100 n mol bis 1 μ mol

mittel 10 n mol bis 100 n mol

stark 1 p mol bis 10 n mol

sehr stark < 1 p mol
Vorzugsweise sind die Antagonisten, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden, in einer der vier höheren Kategorien, die oben identifiziert wurden, und sind in jedem Fall potenter als jeglicher Antagonist, der für das fragliche Protein zum Zeitpunkt der Anmeldung dieser Patentanmeldung bekannt war.
Auf eine ähnliche Art und Weise kann die Potenz eines Agonisten als die Dosis quantifiziert werden, die in 50 % von dessen maximaler Wirkung auf einen Rezeptor resultiert.
Allgemeines Verfahren
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die biologische Aktivität einer Testsubstanz, wie sie durch einen bestimmten Rezeptor in einem bestimmten Organismus vermittelt wird, vorhergesagt durch:

(I) das Zur-Verfügung-Stellen einer Gruppe von "BioKeys", wobei die "BioKeys" eine unterschiedliche Fähigkeit haben, an den Rezeptor in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von einem oder von mehreren Liganden zu binden, wobei die Gruppe daher in der Lage ist, zwischen zwei oder mehreren unterschiedlichen Rezeptorkonformationen zu unterscheiden;
(II) das Screenen von einem Satz oder von zwei oder von mehr Referenzsubstanzen, von denen bekannt ist, dass sie pharmakologische Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors in einem oder in mehreren Organismen und Geweben sind, hinsichtlich der Fähigkeit, das Bindevermögen der "BioKeys" an den Rezeptor zu ändern, wobei ein Referenz-"Fingerprint" für jede Referenzsubstanz erhalten wird, welcher ein Muster von beschreibenden Faktoren ist, wobei jeder beschreibende Faktor qualitativ oder quantitativ die Wirkung der Referenzverbindung auf das Binden des BioKeys als Gruppenmitglied an den Rezeptor beschreibt;
(III) die Testverbindung wird auf ähnliche Weise hinsichtlich ihrer Fähigkeit gescreent, das Binden der "BioKeys" an den Rezeptor zu verändern, wodurch ein Testfingerprint erhalten wird;
(IV) die Ähnlichkeit des Testfingerprints zu jeglichem der Referenzfingerprints wird bestimmt; und
(V) die biologische Aktivität der Testsubstanz in einem oder in mehreren Zielorganismen und in einem oder in mehreren Zielgeweben davon wird auf der Basis der biologischen Aktivitäten der Referenzsubstanzen vorhergesagt, die angemessen gemäß der Ähnlichkeit zwischen der Testsubstanz und der Referenzsubstanz gewichtet werden.

Die BioKey-Gruppe aus Schritt (I) wird vorzugsweise durch Screenen der Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek hinsichtlich der Fähigkeit, an (a) den nicht an einen Liganden gebundenen Rezeptor und (b) an einen an einen Liganden gebundenen Rezeptor zu binden, erhalten. In einer Ausführungsform wird zunächst gegen eine kombinatorische Bibliothek gescreent (a), und dann wird entweder gegen die gesamte Bibliothek oder nur gegen die Mitglieder, die an den nicht an einen Liganden gebundenen Rezeptor binden, gescreent (b). In einer weiteren Ausführungsform wird die ganze Bibliothek gegen (a) und (b) gleichzeitig gescreent. Es ist ebenso möglich, zunächst gegen (b) und dann gegen (a) zu screenen.
Vorzugsweise ist die kombinatorische Bibliothek eine amplifizierbare kombinatorische Bibliothek, d. h. eine Bibliothek aus Nukleinsäuren oder Peptiden. Die Mitglieder der BioKey-Gruppe können individuelle Moleküle sein oder Mischungen aus Molekülen mit ähnlichen Bindecharakteristika sein.
Es wird anerkannt werden, dass Schritt (II) nur einmal für einen gegebenen Rezeptor ausgeführt werden muss und dass es nicht nötig ist, dass alle Referenzsubstanzen gleichzeitig durch einen Fingerprint charakterisiert werden. Auch können die Schritte (II) und (III) miteinander vertauscht werden.
In Schritt (IV) kann die Ähnlichkeit auf eine qualitative und subjektive Art und Weise bestimmt werden, d. h. durch "Anschauen" der Fingerprints und die Einschätzung nach Erfahrung, welche ähnlicher sind, oder in einer quantitativen und objektiven Art und Weise unter Verwendung der Ähnlichkeitsmessungen, die infra ausgeführt sind.
Auf ähnliche Art und Weise kann in Schritt (V) die biologische Aktivität auf eine qualitative und subjektive Art und Weise vorhergesagt werden oder quantitativer und objektiver durch mathematisches Wichten der Aktivitätsscores von jeder Referenzsubstanz durch die errechnete Ähnlichkeit von deren Fingerprints zu den Fingerprints der Testsubstanz.
Beispielsweise können Peptide (BioKeys), die an den ER binden, basierend auf ihrer Fähigkeit, an ER in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von ER-Agonisten zu binden, klassifiziert werden. Die unterschiedlichen Affinitäten der Peptide liegen in Veränderungen der Rezeptorkonformation begründet, die auf das Binden eines Agonisten folgen. Da SERMs ebenso die Rezeptorkonformation einzigartig verändern, ist es wahrscheinlich, dass sie das Binden der Peptide der unterschiedlichen Klassen ebenso beeinflussen können. Jeder Agonist oder jedes SERM hat assoziierte pharmakologische Wirkungen. Beispielsweise hat Estrogen eine stimulierende Aktivität in der Brust und im Uterus, im Knochen und im kardiovaskulären System. Auf ähnliche Weise stimuliert Tamoxifen im Uterus, im Knochen und im Kardiovaskulärsystem, hat aber antagonistische Wirkungen in der Brust. Das Muster des Bindens der BioKeys an den ER als Antwort auf jede Verbindung könnte mit der pharmakologischen Wirkung jeder Verbindung verbunden werden. Zusätzlich wird ein Vergleich zwischen BioKey-Fingerprints an ERα und ERβ die Informationen über die agonistische und antagonistische Aktivität anreichern und sollte eine vorhersagende Wirkung für die Gewebespezifität haben. Neue Estrogenagonisten und -antagonisten könnten dann gescreent und basierend auf ihren BioKey-Bindemustern an ERα und ERβ klassifiziert werden, und Verbindungen mit einer gewünschten gewebespezifischen Aktivität könnten leichter identifiziert werden.
Hypothetische Tabelle von einem "BioKey Fingerprint" für einen hypothetischen nuklearen Rezeptor
Hypothetische Tabelle der pharmakologischen Wirkungen von rezeptormodulierenden Verbindungen
Beispielsweise könnten unter Verwendung der obigen Tabellen Verbindungen mit unbekannten pharmakologischen Wirkungen durch "BioKey Fingerprinting" charakterisiert werden, um deren Aktivität in verschiedenen Geweben vorherzusagen. Eine Verbindung X, die einen Fingerprint aufweist, der ähnlich zur Verbindung A ist, würde so eingeschätzt werden, dass sie pharmakologische Wirkungen hat, die ähnlich zur Verbindung A sind. Das Binden oder der Mangel an Bindung eines spezifischen BioKeys an den Rezeptor könnte eine Aktivität in einem spezifischen Gewebetyp anzeigen. In den obigen Beispielen könnte das Binden des BioKey 1 an den Rezeptor in der Gegenwart einer Verbindung eine Aktivität im Uterus anzeigen, wohingegen das Binden von BioKey 5 an den Rezeptor in der Gegenwart einer Verbindung die Aktivität im Knochen anzeigen könnte.
Substanzen
Eine "Substanz" kann entweder eine reine Verbindung oder eine Mischung aus Verbindungen sein. Vorzugsweise ist sie wenigstens im Wesentlichen rein, das heißt, ausreichend rein, um für die klinische Verwendung akzeptabel zu sein. Wenn sie eine Mischung ist, dann umfasst sie wenigstens eine wirksame Menge (d. h. eine Menge, die in der Lage ist, eine detektierbare biologische Antwort in einem biologischen Assay entstehen zu lassen) einer biologisch aktiven Verbindung oder sie umfasst eine wesentliche Menge einer Verbindung, von welcher erwartet wird, dass sie biologisch aktiv ist und als Leitstruktur geeignet ist, wenn sie aktiv ist.
Testsubstanzen und Medikamentenleitstrukturen
Eine Testsubstanz umfasst eine wirksame Menge einer Verbindung, welche ein Mitglied einer strukturellen Klasse ist, welche im Allgemeinen in Bezug auf physikalische Eigenschaften (z. B. Löslichkeit) als Quelle für Medikamente geeignet ist und von welcher nicht bekannt ist, dass sie die pharmakologische Aktivität von Interesse hat. Eine Medikamentenleitstruktur ist eine frühere Testsubstanz, von welcher entweder vorhergesagt wurde, dass sie die wünschenswerte pharmakologisch Aktivität aufweist, oder von welcher tatsächlich gezeigt wurde, dass sie solch eine Aktivität hat, und welche daher effektiv als Ausgangspunkt für das Design von Analoga und Derivaten dienen könnte, welche als Medikamente nützlich sind. Die "Medikamentenleitstruktur" kann selbst ein nützliches Medikament sein oder es kann eine Substanz sein, welche als Medikament wegen einer inadäquaten Potenz oder wegen nicht wünschenswerten Nebenwirkungen nicht ausreichend ist. Im letzteren Fall werden Analoga und Derivate gesucht, welche diese Nachteile überwinden. Im ersteren Fall versucht man, das bereits nützliche Medikament zu verbessern.
Solche Analoga und Derivate können durch rationales Medikamentendesign oder durch Screenen von kombinatorischen oder nicht kombinatorischen Bibliotheken von Analoga und Derivaten identifiziert werden.
Vorzugsweise ist eine Medikamentenleitstruktur eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000, mehr bevorzugt von weniger als 750, noch mehr bevorzugt von weniger 600 und am meisten bevorzugt von weniger als 500. Vorzugsweise hat sie einen errechneten Log-Octanol-Wasser-Auftrennungskoeffizienten im Bereich von –4 bis +14, mehr bevorzugt von –2 bis zu +7,5.
Eine Bibliothek aus kleinen organischen Verbindungen ist eine Bibliothek aus Verbindungen, von welchen jede ein Molekulargewicht von weniger als 1000 hat und welche nicht Peptide oder Nukleinsäuren sind.
SERMs aus klar bestimmten strukturellen Klassen können Fingerprints produzieren, die für diese Klasse einzigartig sind. Zusätzlich können SERMs aus unterschiedlichen Klassen, die ähnliche biologische Aktivitäten haben, ähnliche Fingerprints verursachen. Von einer Vielzahl an SERMs... können mit unserem System Fingerprints angefertigt werden. Diese beinhalten steroidale Antiestrogene, so wie die ICI-Verbindungen 164,384 und 182,780, und nichtsteroidale Verbindungen, so wie das Benzothiophenderivat Raloxifen und Triphenylethylenderivate Toremifen, Droloxifen, TAT-59 und Idoxifen. Wir haben herausgefunden, dass die steroidalen SERMs Fingerprints produzieren werden, die von nichtsteroidalen SERMs unterschiedlich sind (siehe Beispiel 2). Steroidale Verbindungen, so wie die ICI-Verbindungen, wurden als reine Antiestrogene kategorisiert, da es keinen gut dokumentierten Nachweis von irgendeiner estrogenen Wirkung als Antwort auf diese Verbindungen gibt. Diese Fingerprints können ähnlich zu nicht ligandierten (inaktiven) Rezeptoren sein oder sie können anzeigen, dass ein Corepressor fester gebunden ist oder das ein Coaktivator vollständig an der Bindung gehindert wird.
Das Fingerprintingsystem sollte nützlich zum Identifizieren von agonistischen und antagonistischen Verbindungen aus komplexen Mischungen sein. Das verschreibbare Medikament Premarin wird für die Behandlung von postmenopausalen Symptomen verwendet. Es ist eine komplexe Mischung, die aus dem Urin von schwangeren Stuten abgeleitet ist. Die aktiven Bestandteile dieser Mischung sind nicht bekannt. Eine Fraktionierung von Premarin, gefolgt durch Fingerprinting der individuellen Bestandteile, würde anzeigen, welche der Bestandteile eine aktive Rolle beim Modulieren der Estrogenrezeptorfunktion spielen. Es ist ebenso wahrscheinlich, dass Bestandteile des Premarins mit anderen nuklearen Rezeptoren, so wie dem Progesteronrezeptor, interagieren. Die Wirkung dieser Bestandteile könnte ebenso bestimmt werden.
Referenzliganden
Ein Referenzligand ist eine Substanz, welche ein Ligand für einen Targetrezeptor ist. Vorzugsweise ist er ein pharmakologischer Agonist oder Antagonist eines Targetrezeptorproteins in einem oder in mehreren Zielgeweben eines Zielorganismus. Jedoch könnte ein Referenzligand nützlich sein, sogar wenn er nicht ein Agonist oder Antagonist ist, wenn er die Konformation von dessen Rezeptor ändert, z. B. so, dass wenigstens einige BioKeys, welche an den nicht an einen Liganden gebundenen Rezeptor binden, nicht so gut oder besser an den an einen Liganden gebundenen Rezeptor binden. Vorzugsweise hat ein Referenzligand eine unterschiedliche Wirkung auf BioKeys, so dass BioKeys auf der Basis von ihrer Interaktion mit dem Rezeptor in der Gegenwart des Referenzliganden differenziert werden können. Ein Referenzligand kann ein Agonist eines Rezeptors und ein Antagonist eines anderen sein. Er kann ebenso ein Agonist eines Rezeptors in einer Gewebe sein und ein Antagonist desselben Rezeptors in einem anderen Gewebe oder in einem anderen Organismus sein.
Der Referenzligand kann, aber muss kein natürlicher Ligand des Rezeptors sein.
Die Referenzliganden können, aber müssen nicht einige oder alle der gewünschten Eigenschaften erfüllen, die oben für Testsubstanzen und Medikamentenleitstrukturen ausgeführt sind.
Wenn eine Testsubstanz aus einem Screen eine Medikamentenleitstruktur wird und die Verbindung oder ein Analogon davon letztlich dafür erkannt wird, dass sie bzw. es die biologische Aktivität von wenigstens einem Rezeptor in wenigstens einem Gewebe in wenigstens einem Organismus vermittelt, kann sie bzw. es als Referenzligand in anschließenden Screenings von anderen Testsubstanzen und beim Neudefinieren der BioKey-Gruppe verwendet werden.
Referenzkonformation
Wenn ein Zielrezeptor in einem nicht an einen Liganden gebundenen Zustand ist, hat er eine bestimmte Konformation, d. h. eine bestimmte 3-D-Struktur. Wenn der Rezeptor einen Komplex mit einem Liganden bildet, verändert sich die Konformation des Rezeptors. Wenn der Ligand ein pharmakologischer Agonist ist, ist die neue Konformation eine, welche mit anderen Bestandteilen eines biologischen Signalübertragungswegs interagiert, z. B. mit Transkriptionsfaktoren, um eine biologische Antwort in dem Zielgewebe hervorzurufen. Wenn der Ligand ein pharmakologischer Antagonist ist, ist die neue Konformation eine, in welcher der Rezeptor nicht mit einem oder mit mehreren Agonisten, welche normalerweise den Rezeptor aktivieren könnten, aktiviert werden kann.
Jede der Konformationen eines Zielrezeptors, welcher als Bindeziel in einem Bindemuster verwendet wird, wird als Referenzkonformation angesehen.
Es kann sein, dass zwei unterschiedliche Liganden zufällig einen Rezeptor dazu veranlassen werden, die gleiche Konformation einzunehmen. Jedoch werden zum Zweck dieser Erfindung diese als unterschiedliche Referenzkonformationen angesehen, da unterschiedliche Liganden involviert sind.
BioKeys
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind BioKeys Substanzen, deren Fähigkeit, an einen Zielrezeptor in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von einem oder von mehreren Referenzliganden für diesen Rezeptor zu binden, verwendet werden kann, um die Referenzliganden zu unterscheiden und um letztlich den Ähnlichkeitsgrad zwischen einer Testsubstanz (mit einer messbaren Wirkung auf die Bindung der BioKeys an das Zielrezeptorprotein) und Referenzsubstanzen (die auf ähnliche Weise eine messbare Wirkung wie solch eine Bindung haben, aber deren Wirkung auf die biologische Aktivität des Rezeptorproteins in Zielorganismen und Geweben von Interesse ebenso bekannt ist) zu errechnen.
Vorzugsweise sind BioKeys Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek und insbesondere einer amplifizierbaren kombinatorischen Bibliothek, so wie einer Peptid- oder Nukleinsäurebibliothek. Die Bibliothek kann dann hinsichtlich des Bindens an verschiedene Rezeptorkonformationen gescreent werden. BioKeys brauchen nicht selbst als Medikamentenleitstrukturen geeignet zu sein.
BioKey-Gruppe
Für die Zwecke des Fingerprinting der Referenz- und der Testsubstanzen wird eine repräsentative Auswahl von BioKeys in einer Gruppe zusammengefasst. Wenn nur ein einzelner Referenzligand für einen Rezeptor bekannt ist, könnte die Gruppe ein oder mehrere repräsentative Mitglieder von jeder von wenigstens zwei der folgenden Bindeklassen enthalten:
Somit binden die Klassen A, B und C an den nicht an einen Liganden gebundenen Rezeptor (UL-R), aber der Ligand erhöht das Binden von A, senkt das Binden von B ab und hat keine Auswirkungen auf das Binden von C. Klassen D und E binden nicht an UL-R. Der Ligand verursacht, dass E, aber nicht D, an den Rezeptor bindet.
Statt von nur zwei der Obigen kann die Gruppe repräsentative Mitglieder von drei, vier oder von allen fünf Klassen enthalten, wenn BioKeys, die die entsprechenden Eigenschaften haben, identifiziert werden können.
Die obigen Klassen untersuchen die Bindung nur auf eine qualitative Art und Weise. Jedoch wäre es möglich, zwischen starken und schwachen Bindepartnern von UL-R und zwischen großen und kleinen Veränderungen bei der Bindung als Ergebnis des Liganden zu unterscheiden. Wenn gewünscht, könnte man sogar feinere Unterscheidungen machen, z. B. stark gegenüber moderat gegenüber schwach usw.
Wenn mehr als ein Ligand erhältlich ist, werden die kombinatorischen Möglichkeiten gesteigert, und wenn geeignete BioKeys identifiziert werden können, kann die Gruppe entsprechend erweitert werden.
Beispielsweise existieren die folgenden Möglichkeiten mit zwei Liganden:
Und man könnte weiterhin unterscheiden, z. B. ist für Z-1 die Wirkung von A größer als die von B, für Z-2 gilt das Umgekehrte und für Z-3 sind die Wirkungen gleich.
Vorzugsweise werden ein, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Referenzliganden verwendet, um die BioKey-Gruppe zu definieren.
Es ist nicht erforderlich, dass eine bestimmte Bindeklasse durch nur einen einzelnen BioKey dargestellt wird. Stattdessen kann sie durch eine Mischung von zwei oder mehreren BioKeys dargestellt werden, und tatsächlich kann die Mischung allen BioKeys in der BioKey-Bibliothek entsprechen, welche die Bindekriterien für die fragliche Klasse erfüllten.
Die Mitglieder der BioKey-Gruppe werden so ausgewählt, dass die Unterscheidungskraft der Gruppe maximiert wird. Beispielsweise, um einen extremen Fall zu nehmen, wenn zwei Mitglieder der Gruppe identische Bindeeigenschaften gegenüber allen erhältlichen Referenzkonformationen des Rezeptors haben, dann ist eines dieser Mitglieder redundant. Während das Aufnehmen dieses Mitglieds in die Gruppe keinen Schaden anrichtet, erhöht es unnötigerweise die Kosten des Screens.
Die Ähnlichkeit von jeglichem Paar von potentiellen Gruppenmitgliedern kann unter Verwendung der Ähnlichkeitsbemessungsgrundlagen, die infra ausgeführt sind, bestimmt werden. Die Gesamtdiversität einer gegebenen Gruppe kann durch Errechnen von sämtlichen paarweisen Unähnlichkeiten bestimmt werden. Für eine gegebene Gruppengröße, extrahiert aus einer gegebenen Bibliothek, kann man versuchen, die Gesamtdiversität der Wirkung auf die biologische Aktivität zu maximieren. Oder man kann versuchen, für einen Satz bindender Mitglieder einer Bibliothek zu bestimmen, was die Größe und Zusammensetzung des Subjekts ist, die das Verhältnis der Gesamtdiversität zu der Anzahl der Mitglieder erhöht.
Die Anzahl der gruppenbasierenden beschreibenden Faktoren in dem Fingerprint wird normalerweise der Anzahl der Mitglieder in der Gruppe gleichen. Die optimale Anzahl der Mitglieder hängt von der Anzahl der Referenzsubstanzen und der Fähigkeit der Gruppe, zwischen ihnen zu differenzieren, ab. Je größer die Anzahl der Referenzsubstanzen ist und je größer die Anzahl der Zielorganismen und der Zielgewebe ist, in welchen die biologische Aktivität der Referenzsubstanz bestimmt werden soll, desto größer sollte die Gruppe sein. Typischerweise wird es 2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9 oder 10 Gruppenmitglieder geben. Mehr Mitglieder können verwendet werden, aber die Kosten des Assays steigen an, ohne dass notwendigerweise ein kompensierender Anstieg der Vorhersagungskraft der Daten zur Verfügung gestellt wird.
Referenzsubstanzen
Referenzsubstanzen sind bekannte pharmakologische Agonisten oder Antagonisten für den fraglichen Rezeptor, und sie haben eine bekannte oder ermittelbare biologische Aktivität in einem oder in mehreren Organismen und/oder Geweben.
Typischerweise werden für einen gegebenen Rezeptor Fingerprints von einer, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Referenzsubstanzen angefertigt werden.
"Fingerprinting" von Test- und Referenzsubstanzen
Jede Testsubstanz wird durch eine Vielzahl von beschreibenden Faktoren (dem "Fingerprint") gekennzeichnet, durch welche sie mit den Referenzsubstanzen verglichen werden kann.
Diese Referenzsubstanzen können die bestimmten Referenzliganden sein, die verwendet werden, um die BioKey-Gruppe zu definieren, aber sie sind nicht auf diese Referenzliganden limitiert. So wurde in Beispiel 1 nur Estradiol verwendet, um die fünf Peptidklassen zu definieren, aber die Referenzsubstanzen waren Estradiol, Estriol, Tamoxifen, Nafoxidin und Clomiphen. Die Verwendung von Estradiol war nicht kritisch; die Referenzsubstanzen müssen nicht einen der Referenzliganden enthalten, die verwendet werden, um die BioKey-Gruppe zu definieren.
Die Referenzsubstanzen müssen pharmakologische Agonisten oder Antagonisten in wenigstens einem Organismus und Gewebe sein, während die Referenzliganden nicht so limitiert sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung muss eine Vielzahl von beschreibenden Faktoren auf die Wirkung der Testsubstanz auf das Binden eines Mitglieds der BioKey-Gruppe an eine Referenzkonformation Bezug nehmen, z. B. nicht an einen Liganden gebundener Rezeptor Y, Rezeptor Y/Ligand A, Rezeptor X/Ligand B, nicht an einen Liganden gebundener Rezeptor Y, Rezeptor Y/Ligand C, usw. Beachten Sie, dass in diesem Kontext der Begriff "Mitglied" auf eine Mischung aus BioKeys aus derselben Bindeklasse Bezug nehmen kann. Der beschreibende Faktor kann qualitativ sein (bindet gegenüber bindet nicht; erhöht gegenüber senkt ab gegenüber keine Wirkung, usw.) oder quantitativ sein. Vorzugsweise werden wenigstens 2-10 BioKey-basierte beschreibende Faktoren verwendet.
Die Testsubstanz kann zusätzlich durch andere beschreibende Faktoren gekennzeichnet sein, so wie strukturelle beschreibende Faktoren, die im Stand der Technik bekannt sind. Vorzugsweise werden Fingerprints von wenigstens 5-10 unterschiedlichen Referenzsubstanzen angefertigt.
Die Referenzsubstanzen werden auf eine ähnliche Art und Weise wie die Testsubstanzen charakterisiert, so dass deren beschreibende Faktoren mit den beschreibenden Faktoren der Testsubstanz auf solch eine Art und Weise "gepaart" werden können, dass der Grad der Ähnlichkeit errechnet werden kann.
Wenn ein Fingerprint von einer gegebenen Referenz oder einer Testsubstanz erstellt wird, kann er simultan gegen alle Gruppenmitglieder gescreent werden oder individuelle Gruppenmitglieder (oder Untergruppen von Gruppenmitgliedern) können separat getestet werden. Auch alle Referenzsubstanzen können gleichzeitig gegen eine gegebene Rezeptor/Gruppenmitglied-Kombination gescreent werden oder die Referenzsubstanzen können individuell gescreent werden. Das Gleiche gilt für das Screenen der Testsubstanzen. Die Testsubstanzen können nach, vor oder gleichzeitig mit den Referenzsubstanzen gescreent werden.
Beschreibende Faktoren
Ein "beschreibender Faktor" (auch bekannt als Parameter, Charakter, Variable oder Variate) ist eine numerisch ausgedrückte Eigenschaft einer Verbindung (welche ein Protein oder ein Proteinligand sein kann), welcher dabei hilft, die Verbindung von anderen zu unterscheiden. Ein Wert für einen beschreibenden Faktor muss nicht absolut spezifisch für eine Verbindung sein, um nützlich zu sein. Die Eigenschaften können reine strukturelle Eigenschaften sein (so wie in einem "strukturellen beschreibenden Faktor") oder sie können zu der Interaktion der Verbindung mit anderen Verbindungen in Bezug stehen. "Gepaarte beschreibende Faktoren" sind beschreibende Faktoren der gleichen Eigenschaft, die in zwei unterschiedlichen Molekülen gemessen werden. Ein "Muster aus beschreibenden Faktoren", eine "Liste" oder ein "Satz" ist ein Muster, eine Liste oder ein Satz, dessen Elemente unterschiedliche beschreibende Faktoren für das gleiche Molekül sind. Solch ein Muster, eine Liste oder ein Satz wird hierin als "Fingerprint" bezeichnet.
Eine Vielzahl von gepaarten beschreibenden Faktoren für zwei Verbindungen können verwendet werden, um eine Ähnlichkeit zwischen den zwei Verbindungen zu errechnen.
Ähnlichkeitsmaße
Ein Maß für die Ähnlichkeit oder ein Koeffizient quantifiziert die Beziehung zwischen zwei Individuen (Verbindungen), wobei die Werte eines Satzes von Variaten (beschreibenden Faktoren) gegeben sind, die beiden gemeinsam sind. Die Ähnlichkeitskoeffizienten sind normalerweise so definiert, dass sie Werte im Bereich von 0 bis 1 haben.
Ein gewöhnlich verwendetes Maß für die Ähnlichkeit ist der Produktmomentskorrelationskoeffizient. Dessen Korrelation ist das Eins-Element, wann immer zwei Profile parallel sind, unabhängig davon, wie weit entfernt voneinander ihre Niveaus sind. Zwei Profile können eine Korrelation von +1 haben, sogar wenn sie nicht parallel sind, vorausgesetzt, dass die zwei Sätze aus Werten in einem linearen Bezug zueinander stehen.
Für binäre beschreibende Faktoren ist das einfachste Maß der Ähnlichkeit der einfache Matchkoeffizient.
Der Jaccard- oder Sneath-Koeffizient modifiziert den einfachen Matchkoeffizienten durch das Ignorieren von Bits, in welchen beide, i und j, null sind, d. h. durch Ignorieren von negativen Übereinstimmungen (übereinstimmende Abwesenheiten). In anderen Worten wird er erhalten durch Dividieren der Anzahl der Bits, welche in beiden Bitstrings der beschreibenden Faktoren gesetzt sind, und Dividieren durch die Gesamtzahl der gesetzten Bits in jeglichem String der beschreibenden Faktoren. Er wird ebenso der nicht gewichtete Tanimoto-Koeffizient genannt.
Der gewichtete Tanimoto-Koeffizient für beschreibende Faktoren k und die Individuen i und j ist:
Gower hat einen generellen Ähnlichkeitskoeffizienten definiert, welcher für binäre, qualitative und quantitative Daten verwendet werden kann:
für Individuen i und j und den beschreibenden Faktor k.
W_ijk wird auf 1 gesetzt, wenn der Vergleich für die Variable k gültig ist, und andererseits auf 0. Wenn W_ijk = 0, dann ist S_ijk 0. Für binäre Daten sind W_ijk und S_ijk beide 0, wenn die Variable in beiden Individuen negativ ist. S_ijk ist nur positiv, wenn die binäre Variable für beide Individuen positiv ist. Für qualitative Daten ist S_ijk = 1, wenn die Individuen für den kth-Charakter gleich sind, und S_ijk = 0, wenn sie sich unterscheiden. Für quantitative Daten ist S_ijk = 1 – |X_ik – X_jk|/R_k, wenn X_ik der Wert des beschreibenden Faktors k für das Individuum i ist, und R_k ist der Gesamtbereich der Variable k.
Beschreibende Faktoren können quantitativ oder qualitativ sein. Quantitative beschreibende Faktoren können ganze Zahlen oder reale Zahlen sein. Qualitative beschreibende Faktoren unterteilen die Daten in Kategorien, welche als relative Größen habend ausgedrückt werden können, aber nicht müssen. Binäre beschreibende Faktoren sind ein Spezialfall der qualitativen beschreibenden Faktoren, bei welchem es lediglich zwei Kategorien gibt, die typischerweise die Gegenwart oder die Abwesenheit einer Eigenschaft beschreiben. Qualitative Daten, für welche die Variaten unterschiedliche Niveaus haben, können wie binäre Daten behandelt werden, wobei jedes Niveau einer Variate als eine einzelne binäre Variable angesehen wird (d. h. eine Variate des achten Niveaus wird als acht Bits ausgedrückt). Oder die Niveaus können sequenziell nummeriert werden (d. h. eine Variable des achten Niveaus wird als drei Bits ausgedrückt).
Ein Satz von n-beschreibenden Faktoren definiert einen n-dimensionalen Raum der beschreibenden Faktoren; jede Verbindung, für welche ein Satz von beschreibenden Faktoren erhältlich ist, kann so angesehen werden, dass sie einen Punkt in dem Raum der beschreibenden Faktoren besetzt. Die Unähnlichkeit von zwei Verbindungen kann als ein Abstand zwischen den zwei Punkten ausgedrückt werden, die sie in dem Raum der beschreibenden Faktoren besetzen.
Ein Maß für den Abstand ist ein Ähnlichkeitsmaß, welches ebenso metrisch ist, d. h. welches die Bedingungen (i) d(x, y) ≥ 0; und d(x, y) = 0, wenn x = y; (ii) d(x, y) + d(y, x); und (iii) d(x, z) + d(y, z) ≥ d(x, y) (die metrische oder trianguläre Ungleichheit) befriedigt. Natürlich ist die Ähnlichkeit umso kleiner, je größer der Abstand ist.
Abstände können auf der Basis von irgendeinem aus einer Vielzahl von Distanzmaßen errechnet werden, die im Stand der Technik der Statistik bekannt sind. Das am häufigsten verwendete Distanzmaß ist das euklidische Maß:
Es entspricht am ehesten unserem intuitiven Sinn für Abstand.
Das absolute, Cityblock- oder Manhattan-Maß ist
Die Rationale ist es, dass, wenn die Variablen Skalierungseinheiten von gleichem Wert haben, dann die Einheiten denselben Abstand haben sollten, egal ob sie zwei Einheiten entfernt von jeder der zwei Variablen oder eine Einheit entfernt von einer und drei Einheiten entfernt von der anderen sind.
Die "Kosinus theta"-Distanz ist der Kosinus des Winkels zwischen dem Vektor von dem Ursprung zum Punkt X_ik und dem Vektor von dem Ursprung zum Punkt X_jk.
Ein generalisiertes Abstandsmaß ist das Minkowski-Maß:
welches ein euklidisches Maß für r = 2 und ein Cityblock-Maß für r = 1 ist.
Das Mahalonobis-Abstandsmaß (D²) hat die Form dij = (Xi – Xj)' Σ–1(Xi – Xj)wobei F die innerhalb der Gruppe gepoolte Varianz-Covarianz-Matrix ist und X_i und X_j die Scorevektoren für die Einheiten i und j sind. Der Mahalanobis-Abstand erlaubt die Korrelationen zwischen Variablen; wenn die Variablen nicht korreliert sind, ist D² äquivalent zum euklidischen Abstand, gemessen unter Verwendung von Standardvariablen.
Das Canberra-Maß, das hierunter angegeben ist, hat den Vorteil, dass es durch den Bereich der Variable n nicht beeinflusst ist:
Eine modifizierte Form, welche negative Zustände mit einbezieht, ist
Der Calhoun-Abstand verwendet nur Rangordnungen; für die Moleküle i und i ist der Abstand der Anteil des gesamten Satzes (mit Ausnahme von i und j), der Zustände von beschreibenden Faktoren hat, die zwischen denen für i und denen für j für ein oder mehrere der beschreibenden Faktoren k liegen.
Ein Abstandsmaß kann in ein Ähnlichkeitsmaß durch irgendeine aus einer Vielzahl von Transformationen transformiert werden, die eine nicht negative Zahl in den Bereich 0..1 umwandeln, d. h. Sij = 1/(1 + dij)
Ein Ähnlichkeitsmaß kann in einen Abstand durch beispielsweise d_ii = 1 – s_ij umgewandelt werden.
Wenn es eine theoretische Maximaldistanz (d_tmax) gibt, die auf den theoretisch möglichen Abständen für jeden der beschreibenden Faktoren der Komponente basiert, wird die Ähnlichkeit ausgedrückt als Sij = 1 – (dij/dtmax)
Alternativ kann man den Abstand zwischen allen Paaren errechnen und dann die tatsächliche Maximaldistanz verwenden (d_amax): Sij = 1 – (dij/damax)
Statt der Verwendung des Verhältnisses der tatsächlichen Distanz zu der tatsächlichen oder der theoretischen Maximaldistanz kann man s_ij als die Fraktion der Paare ausdrücken, für welche der Abstand größer oder gleich d_ij ist. Dies ist ein Maß der relativen Ähnlichkeit.
Beschreibende Faktoren können aus einer Anzahl von Gründen gewichtet (oder auf andere Weise transformiert) werden, einschließlich:

(a) um den wahrgenommenen Wert des beschreibenden Faktors widerzuspiegeln, um zu bestimmen, ob zwei Proteine durch strukturell ähnliche Medikamente moduliert werden würden;
(b) um die wahrgenommene Verlässlichkeit der Daten der beschreibenden Faktoren widerzuspiegeln;
(c) um Skalierungsunterschiede zwischen den beschreibenden Faktoren so zu korrigieren, dass ein beschreibender Faktor eine Ähnlichkeits- oder Abstandsrechnung nicht nur deswegen dominiert, weil dessen Werte einen höheren Wert erreichen oder über einen größeren Bereich ausgedehnt sind; und
(d) um Korrelationen zwischen den beschreibenden Faktoren zu korrigieren.

Die rohen Werte für die beschreibenden Faktoren können, aber müssen nicht vor der Verwendung beim Berechnen der Abstände transformiert werden. Typische Transformationen sind (a) Gegenwart (1)/Abwesenheit (0), (b) 1 n(x + 1), (c) Häufigkeit in einer Probe, (d) Wurzel und (e) relativer Bereich, d. h. (Wert minus Minimum/Maximum minus Minimum).
Die rohen Werte für die beschreibenden Faktoren können standardisiert (normalisiert) werden, um einen Mittelwert von null (x' = x – μ_x) und/oder eine Einheitsvarianz (x' = x/σ x), möglicherweise beides (x' = (x – μ_x)/σ_x), zu erhalten, oder sie können standardisiert (vereinheitlicht) werden, um in den Bereich zwischen 0 und 1 zu fallen.
Die Gewichtung der beschreibenden Faktoren kann empirisch auf der Basis von speziell entworfenen Testsets angepasst werden. Ein Trainingsset von Proteinen wird identifiziert. Die beschreibenden Faktoren werden für jedes Protein in dem Satz bewertet. Ein Trainingssatz an Verbindungen, wird ebenso gegen jede Verbindung in dem Satz getestet. Diese Verbindungen werden so ausgewählt, dass es für jedes Protein in dem Satz wenigstens eine Verbindung gibt, welche ein Agonist oder ein Antagonist für es ist. Ein neurales Netz wird verwendet, um die Aktivität von jeder Verbindung gegen jedes Protein unter Verwendung der errechneten Proteinähnlichkeiten vorherzusagen, wobei die Gewichte der beschreibenden Faktoren als Inputs verwendet werden. Beispielsweise wird es die Ähnlichkeit von Protein x zu allen anderen Proteinen berechnen, dann die Aktivitäten der Verbindungen gegen die anderen Proteine als "Bekannte" behandeln und verwenden, um die Aktivität der Verbindungen gegen das Protein x vorherzusagen. Dies wird wiederholt ausgeführt, wobei jedes Protein nacheinander die Rolle des Protein x übernimmt.
Der Variationskoeffizient kann beim Vergleichen von beschreibenden Faktoren nützlich sein; es ist die Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert. Wenn keine Information über die letztendliche Signifikanz eines beschreibenden Faktors erhältlich ist, kann man beschreibenden Faktoren ein größeres Gewicht zuteilen, die einen größeren CV und eine daher uniformere Verteilung aufweisen.
Es muss betont werden, dass wir die Verwendung von gewichteten beschreibenden Faktoren nicht benötigen, und schon gar nicht die Verwendung von irgendeinem bestimmten Verfahren zur Ableitung von Gewichten.
Es ist wahrscheinlich, dass ein gewisser Grad an Korrelation zwischen den beschreibenden Faktoren existieren wird. Mathematische Standardverfahren, so wie Clusteranalyse, Hauptbestandteilanalyse oder Partial-Least-Square-Analyse, können verwendet werden, um zu bestimmen, welche beschreibenden Faktoren stark korreliert sind, und um sie durch einen neuen beschreibenden Faktor zu ersetzen, welcher eine gewichtete Summe der ursprünglich korrelierten beschreibenden Faktoren ist. Man kann alternativ (möglicherweise zufällig) einen Faktor aus jedem Paar hochkorrelierter beschreibender Faktoren wählen und ihn einfach vernachlässigen, wodurch die Menge Daten reduziert wird, welche gesammelt werden muss.
Eine Möglichkeit, Korrelationen unter beschreibenden Faktoren zu korrigieren, ist es, für jeden beschreibenden Faktor m den Durchschnitt von dessen quadrierten Korrelationskoefizienten mit allen beschreibenden Faktoren n zu berechnen (einschließlich m = n, für welchen der Koeffizient notwendigerweise eins ist) und diese Zahl von eins abzuziehen, um ein Gewicht zu erhalten, das den Anteil der Variation in dem beschreibenden Faktor m darstellt, welcher nicht durch den "Durchschnitts"-beschreibenden Faktor n erklärt wird. Mit diesem "Durchschnitts"-r²-Verfahren werden die korrelierten beschreibenden Faktoren Gewichte von jeweils 0,5 haben und die anderen werden jeweils Gewichte von 1,0 haben, wenn wir vier beschreibenden Faktoren haben und zwei von ihnen perfekt miteinander korrelieren und die beschreibenden Faktoren ansonsten vollständig unkorreliert sind.
Die Diversität eines Satzes an Verbindungen, wie gemessen durch einen Satz an beschreibenden Faktoren, kann auf unterschiedliche Arten und Weisen berechnet werden.
Ein rein geometrisches Verfahren beinhaltet die Annahme, dass jede Verbindung eine Hypersphäre in dem Raum der beschreibenden Faktoren überstreicht, wobei die Hypersphäre einen Radius hat, der als Ähnlichkeitsradius bekannt ist. Das gesamte Hypervolumen in dem Raum der beschreibenden Faktoren aus Punkten innerhalb eines Einheitsähnlichkeitsradius von einer oder mehrerer der Verbindungen wird berechnet. Dieses wird mit dem Hypervolumen verglichen, das erreichbar ist, wenn keine der Hypersphären überlappen; d. h. mit n*-Volumen einer einzelnen Hypersphäre, wobei n die Anzahl der Verbindungen in dem Satz ist. Das überstrichene Hypervolumen kann genau bestimmt werden oder durch Monte-Carlo-Verfahren bestimmt werden. Das Verhältnis der überstrichenen Hypervolumens zum maximalen Hypervolumen ist ein Maß der Diversität des Verbindungssatzes, das von 1 (Maximum) bis zu 1/n (Minimum) rangiert.
Eine weitere Herangehensweise ist es, sämtliche der paarweisen Distanzen zwischen den Verbindungen in dem Raum der beschreibenden Faktoren zu berechnen. Die mittlere Distanz ist ein Maß der Verschiedenheit. Wenn gewünscht, kann dies durch Errechnen des Verhältnisses der mittleren Distanzen zur maximalen theoretischen Distanz skaliert werden.
Eine dritte Herangehensweise ist es, Clusteranalyse auf den Verbindungssatz anzuwenden. Das verwendete Verfahren sollte eines sein, welches die Anzahl der Cluster nicht zufällig setzt, sondern welches über die Anzahl basierend auf einigen Goodness-of-fit-Kriterien entscheidet. Die resultierende Clusterzahl ist ein Maß der Verschiedenheit, da sie das Verhältnis der Anzahl der Cluster zu der Anzahl der Verbindungen darstellt.
Man kann ein Maß der Unordnung für einen beschreibenden Faktor wie folgt berechnen:
wobei m_k die Anzahl der unterschiedlichen Stadien des beschreibenden Faktors k darstellt und P_kg der beobachtete Anteil der Individuen ist, die den Zustand g für den beschreibenden Faktor k aufzeigen. Für nichtkorrelierte beschreibende Faktoren ist die Summe von H(k) für alle k ein Maß der gesamten Unterschiedlichkeit. Standardtechniken können verwendet werden, um Korrekturen für Korrelationen anzuwenden.
Zielrezeptor
Der Zielrezeptor kann eine natürlich auftretende Substanz oder eine Untereinheit oder eine Domäne davon aus irgendeiner natürlichen Quelle, einschließlich eines Virus, eines Mikroorganismus (einschließlich Bakterien, Fungi, Algen und Protozoen), eines Nichtwirbeltiers (einschließlich Insekten und Würmern) oder der normalen und Krebszellen eines Wirbeltiers (insbesondere eines Säugetiers, Vogels oder eines Fisches und unter Säugetieren insbesondere Menschen, Menschenaffen, Affen, Kühe, Schweine, Ziegen, Lamas, Schafe, Ratten, Mäuse, Kaninchen, Meerschweinchen, Katzen und Hunde), sein. (Normalerweise ist es ein Protein; es kann eine Nukleinsäure sein. Die Bezugnahmen auf Proteine sind mutatis mutandis anwendbar auf Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate und andere Makromoleküle, welche als Rezeptoren agieren können.) Alternativ kann das Rezeptorprotein eine modifizierte Form eines natürlichen Rezeptors sein. Modifikationen können eingeführt werden, um das Markieren oder die Immobilisierung des Zielrezeptors zu vereinfachen oder um dessen biologische Aktivität zu verändern (ein Inhibitor einer Rezeptormutante kann nützlich sein, um selektiv eine nicht gewünschte Aktivität der Rezeptormutante zu inhibieren und dabei die anderen Aktivitäten im Wesentlichen intakt zu belassen). Im Fall eines Proteins beinhalten die Modifikationen Mutationen (Substitutionen, Insertionen oder Deletionen von genetisch codierten Aminosäuren) und Derivatisierungen (einschließlich Glycosylierung, Phosphorylierung und Lipidierung).
Ein Zielrezeptor kann inter alia ein Glyco-, Lipo-, Phospho- oder Metalloprotein sein. Er kann ein nukleares, zytoplasmatisches, Membran- oder sekretiertes Protein sein. Er kann, aber muss kein Enzym sein.
Der Targetrezeptor kann anstelle von einem Protein eine makromolekulare Nukleinsäure, ein Lipid oder ein Kohlenhydrat sein. Wenn er eine Nukleinsäure ist, kann er eine Ribo- oder eine Deoxiribonukleinsäure sein, und er kann einzel- oder doppelsträngig sein. Er kann, aber muss keine enzymatische Aktivität haben.
Der Zielrezeptor muss kein einzelnes Makromolekül sein, sondern kann stattdessen ein Komplex aus einem Makromolekül mit einem oder mehreren zusätzlichen Molekülen, insbesondere Makromolekülen, sein. Beispiele beinhalten Ribosomen (RNA:Proteinkomplexe), Polysomen (mRNA:Ribosomkomplexe) und Chromatin (DNA:Proteinkomplexe). Für die Verwendung von Polysomen als bindende Moleküle (oder als Displaysysteme) siehe Kawasaki, USP 5,643,768 und 5,658,754; Gersuk et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:578 (1997); Mattheakis et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA, 91:9022-6 (1994).
Die bekannten Bindepartner (wenn es welche gibt) des Zielrezeptors können inter alia Proteine, Oligo- oder Polypeptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder kleine organische oder anorganische Moleküle oder Ionen sein.
Die funktionalen Gruppen des Rezeptors, welche an den Ligand-Bindeinteraktionen gemeinsam teilnehmen, bilden gemeinsam den Ligand-Bindeort oder das Paratop des Rezeptors. Auf ähnliche Weise bilden die funktionalen Gruppen des Liganden, welche an diesen Interaktionen gemeinsam teilnehmen, gemeinsam das Epitop des Liganden. ("gemeinsam" bezieht sich jeweils auf "bilden")
Im Falle eines Proteins sind die Bindeorte typischerweise relativ kleine Bereiche auf der Oberfläche. Die Bindeeigenschaften des Proteins können oft durch lokale Modifikationen an diesen Orten geändert werden, ohne dass dabei das Protein denaturiert wird.
Während es möglich ist, dass eine chemische Reaktion zwischen einer funktionellen Gruppe auf einem Rezeptor und einer auf einem Liganden stattfindet, was in einer kovalenten Bindung resultiert, tritt die Rezeptorprotein-Ligandenbindung normalerweise als Ergebnis von Aggregateffekten von verschiedenen nichtkovalenten Interaktionen auf. Elektrostatische Wechselwirkungen beinhalten Salzbrücken, Wasserstoffbrücken und van der Waals-Kräfte.
Was hydrophobe Interaktion genannt wird, ist tatsächlich die Abwesenheit von Wasserstoffbrückenbindung zwischen nichtpolaren Gruppen und Wasser, eher als eine günstige Interaktion zwischen den nichtpolaren Gruppen selbst. Hydrophobe Wechselwirkungen sind wichtig beim Stabilisieren der Konformation eines Rezeptorproteins und beeinflussen daher indirekt das Binden von Liganden, auch wenn hydrophobe Reste normalerweise verdeckt sind und keinen Teil des Bindeorts bilden.
Der Rezeptor kann mehr als ein Paratop haben und sie können gleich oder unterschiedlich sein. Unterschiedliche Paratope können mit Epitopen von unterschiedlichen Bindepartnern interagieren. Ein individuelles Paratop kann spezifisch für einen bestimmten Bindepartner sein oder es kann mit verschiedenen unterschiedlichen Bindepartnern interagieren. Ein Rezeptor kann einen bestimmten Bindepartner durch verschiedene unterschiedliche Bindeorte binden. Die Bindeorte können kontinuierlich oder diskontinuierlich sein (z. B. gegenüber der primären Sequenz eines Rezeptorproteins).
Eine Liste von Agonisten, Antagonisten, radioaktiven Liganden und Effektoren für viele unterschiedliche Rezeptoren erscheint in Appendix I von King, Medicinal Chemistry: Principles and Practice, S. 290-294 (Royal Soc'y Chem. 1994). Appendix II führt Blocker für verschiedene Ionenkanäle auf (welche eine andere spezielle Art eines Rezeptors darstellen). Einige Rezeptoren und deren Agonisten und/oder Antagonisten sind in Tabelle A aufgeführt.
Ein nuklearer Rezeptor, so wie Rezeptoren für Progestine, Androgene, Glucocorticoide, Thyroidhormone, Retinoide, Vitamin D3 und Mineralocorticoide können bei diesem Finterprintingsystem verwendet werden. Eine Affinitätsauswahl von Peptidbibliotheken könnte verwendet werden, um Peptidsequenzen zu identifizieren, die in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Agonisten, wie oben beschrieben, binden. Die Peptide könnten dann auf die Art und Weise, die oben beschrieben ist, verwendet werden, um Modulatoren der Aktivität des Rezeptors zu klassifizieren und zu charakterisieren. Wie oben beschrieben, ist es wahrscheinlich, dass Bestandteile des Premarins mit dem Progesteronrezeptor interagieren. Ein System für das Fingerprinting des Progesteronrezeptors kann entwickelt werden, um nach den aktiven Bestandteilen des Premarins zu suchen.
Als ein Beispiel eines Nichtproteinrezeptors zitieren wir DNA. DNA kann konformationale Veränderungen unterlaufen, wenn sie beispielsweise durch einen Transkriptionsfaktor oder durch ein kleines Molekül gebunden ist. Beispielsweise bindet das Antitumormittel Cisplatin an die Struktur der DNA und verändert sie. Die veränderte Struktur zieht ein zelluläres Protein an, das eine HMG-Box (High Mobility Group) enthält. Es wird vermutet, dass das Protein sterisch die Reparatur der Cisplatinläsion auf der DNA blockiert und zu der Wirksamkeit von Cisplatin bei der Behandlung von gewissen Krebsarten beiträgt. BioKeys könnten identifiziert werden, die spezifisch an DNA in gewissen Konformationen binden. Diese BioKeys könnten dann verwendet werden, um konformationale Veränderungen zu identifizieren, die in der DNA nach dem Binden eines kleinen Moleküls oder Proteins stattfinden.
Zielorganismus
Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, die biologische Aktivität in einem oder in mehreren Zielgeweben, wie hiernach definiert, eines Zielorganismus vorherzusagen.
Der Zielorganismus kann eine Pflanze, ein Tier oder ein Mikroorganismus sein.
Im Fall einer Pflanze kann er eine Nutzpflanze sein, in welchem Fall das Medikament dafür vorgesehen sein kann, die Krankheits-, Wetter- oder Schädlingsresistenz zu erhöhen, die Wachstumseigenschaften zu verändern oder auf andere Art und Weise die nützlichen Eigenschaften zu verbessern oder nicht gewünschte Eigenschaften der Pflanze verstummen zu lassen. Oder sie kann ein Unkraut sein, in welchen Fall das Medikament dafür vorgesehen sein kann, die Pflanze zu töten oder auf andere Weise das Wachstum der Pflanze zu inhibieren oder deren Eigenschaften zu verändern, um sie von einem Unkraut in eine Nutzpflanze umzuwandeln. Die Pflanze kann ein Baum, ein Strauch, eine Feldfrucht, Gras usw. sein. Die Pflanze kann eine Alge sein (welche in einigen Fällen ebenso Mikroorganismen sind) oder eine vaskuläre Pflanze, insbesondere ein Gymnosperm (insbesondere Koniferen) und ein Angiosperm. Angiosperme können Monocots oder Dicots sein. Die Pflanzen von größtem Interesse sind Reis, Weizen, Mais, Alfalfa, Sojabohnen, Kartoffeln, Erdnüsse, Tomaten, Melonen, Äpfel, Birnen, Pflaumen, Ananas, Tannen, Fichten, Pinien, Zedern und Eichen.
Wenn der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist, kann er eine Alge, ein Bakterium, ein Pilz oder ein Virus sein (auch wenn die biologische Aktivität eines Virus in einer virusinfizierten Zelle bestimmt werden muss). Die Mikroorganismen können humane oder andere Tier- oder Pflanzenpathogene sein, oder sie können nichtpathogen sein. Es kann ein Boden- oder ein Wasserorganismus sein oder einer, welcher normalerweise innerhalb anderer lebender Dinge lebt.
Wenn der Zielorganismus ein Tier ist, kann es ein Wirbeltier oder ein Nichtwirbeltier sein. Nichtwirbeltiere sind hauptsächlich von Interesse, wenn sie als Pathogene oder als Parasiten agieren, und die Medikamente sind dafür vorgesehen, als ein biozides oder biostatisches Mittel zu wirken. Nichtwirbeltiere von Interesse beinhalten Würmer, Mollusken und Arthropoden.
Die Zielorganismen können ebenso ein Wirbeltier sein, d. h. ein Säugetier, ein Vogel, ein Reptil, ein Fisch oder eine Amphibie. Unter den Säugetieren gehört das Zieltier vorzugsweise zur Ordnung der Primaten (Menschen, Menschenaffen und Affen), der Artiodactyla (z. B. Kühe, Schweine, Schafe, Ziegen, Pferde), der Rodenta (z. B. Mäuse, Ratten), der Lagomorpha (z. B. Kaninchen, Hasen) oder der Carnivora (z. B. Katzen, Hunde). Unter Vögeln gehören die Zieltiere vorzugsweise zu den Ordnungen der Anseriformes (z. B. Enten, Gänse, Schwäne) oder der Galliformes (z. B. Wachteln, Rauhfußhühner, Fasane, Truthähne und Hühner). Unter den Fischen ist das Zieltier vorzugsweise ausgewählt aus der Ordnung der Glupeiformes (z. B. Sardinen, Alse, Anchovis, Weißfisch, Lachs).
Zielgewebe
Der Begriff "Zielgewebe" betrifft jegliches gesamte Tier, jegliches physiologische System, jegliches vollständige Organ, jeden Teil eines Organs, verschiedene Gewebe, Zellen oder Zellbestandteile (z. B. die Zellmembranen) eines Zieltieres, in welchem die biologische Aktivität gemessen werden kann.
Routinegemäß würde man in Säugetieren wählen, den biologischen Einfluss auf tatsächlich jegliche und alle Gewebe zu vergleichen und zu kontrastieren, welche das gegenständliche Rezeptorprotein exprimieren. Die Hauptgewebe, die verwendet werden können, sind: Gehirn, Herz, Lunge, Niere, Leber, Pankreas, Haut, Darm, Nebennieren, Brust, Prostata, Vaskulatur, Retina, Cornea, Thyroiddrüse, Parathyroiddrüsen, Thymus, Knochenmark usw.
Eine weitere Klassifizierung wäre nach Zellart: B-Zellen, T-Zellen, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Mastzellen, Blutplättchen, Megakaryozyten, Erythrozyten, knochenmarkstomale Zellen, Fibroblasten, Neuronen, Astrozyten, Neuroglia, Mikroglia, Epithelzellen (aus jeglichem Organ, z. B. Haut, Brust, Prostata, Lunge, Darm usw.), kardiale Muskelzellen, weiche Muskelzellen, gestreifte Muskelzellen, Osteoblasten, Osteozyten, Chondroblasten, Chondrozyten, Keratinozyten, Melanozyten usw.
Das "Zielgewebe" beinhaltet diejenigen, die in Tabelle B aufgeführt sind. Natürlich gibt es im Fall von Einzellern keinen Unterschied zwischen "Zielorganismus" und "Zielgewebe".
In vitro-Assays gegen in vivo-Assays
Der Begriff "in vivo" beschreibt ein Ereignis, so wie das Binden oder die enzymatische Wirkung, welche innerhalb eines lebenden Organismus auftritt. Der fragliche Organismus kann jedoch genetisch modifiziert sein. Der Begriff "in vitro" betrifft ein Ereignis, welches außerhalb eines lebenden Organismus auftritt. Teile eines Organismus (z. B. eine Membran oder eine isolierte Biochemikalie) werden gemeinsam mit künstlichen Substraten und/oder Bedingungen verwendet. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff in vitro Ereignisse aus, die sich innerhalb oder auf einer intakten Zelle ereignen, egal ob in einem einzelligen oder in einem mehrzelligen Organismus.
In vivo-Assays beinhalten sowohl zellbasierende Assays als auch auch organbezogene Assays. Der Begriff "zellbasierende Assays" schließt sowohl Assays mit einzelligen Organismen als auch Assays auf isolierten Zellen oder Zellkulturen, die von mehrzelligen Organismen abgeleitet sind, ein. Die Zellkulturen können gemischt sein, vorausgesetzt, dass sie nicht in Gewebe oder Organe organisiert sind. Der Begriff "organbezogene Assays" betrifft Assays mit gesamten multizellulären Organismen und Assays auf isolierten Organen oder Geweben solcher Organismen.
Biologische Assays
Während es ein Hauptzweck der vorliegenden Erfindung ist, den Bedarf für biologische Assays zu minimieren, können sie nicht vollständig vermieden werden. Um die biologische Aktivität einer Substanz vorherzusagen, muss man die biologischen Aktivitäten einer vernünftigen Anzahl von Referenzsubstanzen kennen.
Ein biologischer Assay misst oder detektiert eine biologische Antwort einer biologischen Einheit auf eine Substanz. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Antworten, welche wenigstens teilweise durch einen Rezeptor vermittelt werden.
Die biologische Einheit kann ein gesamter Organismus, ein isoliertes Organ oder Gewebe, frisch isolierte Zellen, eine immortalisierte Zelllinie oder ein subzellulärer Bestandteil (so wie eine Membran; dieser Begriff sollte nicht so ausgelegt werden, dass er einen isolierten Rezeptor beinhaltet) sein. Die Einheit kann ein Organismus sein, welcher in der Natur auftritt oder welcher auf irgendeine Art und Weise modifiziert ist, oder kann von ihm abgeleitet sein. Modifikationen können genetischer Natur sein (einschließlich Bestrahlung und chemischer Mutationen und Gentechnik) oder somatischer Natur (z. B. chirurgischer, chemischer usw.). Im Falle einer multizellulären Einheit können die Modifikationen einige oder alle Zellen beeinflussen. Die Einheit muss nicht der Zielorganismus oder ein Derivat davon sein, wenn es eine vernünftige Korrelation zwischen der Bioassayaktivität in der Assayeinheit und der biologischen Aktivität in dem Zielorganismus gibt.
Die Einheit wird in einer bestimmten Umgebung angeordnet, welche mehr oder weniger natürlich sein kann. Beispielsweise kann ein Kulturmedium Serum und Serumersatzstoffe enthalten, muss es aber nicht, und es kann, aber muss keine Trägermatrix irgendeiner Art enthalten, und es kann ruhig stehen oder bewegt werden. Es kann bestimmte biologische oder chemische Mittel enthalten oder bestimmte physikalische Parameter (z. B. Temperatur) aufweisen, die dafür vorgesehen sind, die biologische Einheit zu ernähren oder sie herauszufordern.
Es muss ebenso einen detektierbaren biologischen Marker für die Antwort geben. Auf zellulärem Niveau sind die am häufigsten verwendeten Marker das Überleben der Zellen und die Proliferation, das Zellverhalten (Clustering, Motilität), die Zellmorphologie (Farbe, Form) und die biochemische Aktivität (Gesamt-DNA- Synthese, Gesamtproteinsynthese und spezifische metabolische Aktivitäten, so wie die Verwendung von bestimmten Nährstoffen, z. B. der Verbrauch von Sauerstoff, die Produktion von CO₂, die Produktion von organischen Säuren, die Aufnahme oder die Freisetzung von Ionen).
Das direkte Signal, das durch den biologischen Marker produziert wird, kann durch ein Signalproduktionssystem in ein verschiedenes Signal transformiert werden, welches leichter zu beobachten ist, zum Beispiel ein fluoreszentes oder kolorimetrisches Signal.
Die Einheit, die Umgebung, der Marker und das signalproduzierende System werden so ausgewählt, dass sie ein klinisch akzeptables Niveau an Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit erreichen.
Referenzsubstanzen sollten in entsprechenden Assays getestet werden, die relevant für die Gewebeverteilung des Zielrezeptors sind. Beispielsweise würden für den Estrogenrezeptor, welcher im Brustepithelium, in den Mesenchymalzellen der Leber, in den Osteoklasten und in dem Epithelium des Uterus (unter anderem) exprimiert wird, angemessene Assays unter anderem Brust- und Uterusepithelzellproliferierung, Osteoklastenapoptose und Hepatozytenproduktion von Lipiden, so wie Triglyceriden und Cholesterin, und Lipoproteinen, so wie High-Density-Lipoproteinen und Low-Density-Lipoproteinen, beinhalten.
Wenn man den Androgenrezeptor verwenden würde, welcher unter anderem im Prostataepithelium, in Hepatozyten, in gestreiften Muskelzellen exprimiert wird, könnte man wählen, Assays mit Referenzsubstanzen auszuführen, die unter anderem für Prostatahypertrophie, Hyperplasie oder Prostataepithelzellproliferierung, Muskelzellhyperplasie oder -hypertrophie und Heptotoxizität usw. gesetzt sind.
Ein weiteres Beispiel ist es, wenn man den beta-2-adrenergen Rezeptor verwenden würde, welcher unter anderem im Herz, im Gehirn und in der peripheren Vaskulatur exprimiert wird, dann könnte man auswählen, Referenzsubstanzen in kardialen Funktionsassays (so wie der Herzgeschwindigkeit und den elektrokardiographischen Veränderungen), in Assays hinsichtlich deren Einfluss auf den Blutdruck und in Assays, um deren Einfluss auf die neuronale Aktivität innerhalb des zentralen Nervensystems zu bewerten, zu testen.
Vorläufige Screenassays
Die Erfindung beschreibt drei Gelegenheiten für vorläufiges Screenen:

(a) das Screenen nach potentiellen "BioKeys" unter Verwendung eines bekannten Rezeptors und von ein oder mehreren bekannten pharmakologischen Modulatoren des Rezeptors (siehe allgemeines Verfahren, Schritt (I)),
(b) das Screenen von Referenzverbindungen mit einer bekannten rezeptorvermittelten Bioaktivität unter Verwendung eines bekannten Rezeptors und einer etablierten BioKey-Gruppe, um Referenzfingerprints zu erhalten (siehe allgemeines Verfahren, Schritt (II), und
(c) das Screenen von Testverbindungen hinsichtlich deren Fähigkeit, die Bindung der Gruppe aus BioKeys an den Rezeptor zu verändern, wodurch ein Testfingerprint erhalten wird (siehe allgemeines Verfahren, Schritt (III)).

Die gleichen oder unterschiedliche Screenverfahren können bei jeder Gelegenheit verwendet werden.
Vorläufige Screenassays werden typischerweise in vitro (zellfreie) Assays (für das Binden an immobilisierte Rezeptoren) oder in zellbasierende Assays (für Veränderungen des Phänotyps der Zelle) sein. Sie werden nicht das Screenen von gesamten multizellulären Organismen oder von isolierten Organen beinhalten. Die Kommentare zu biologischen Assays sind mutatis mutandis anwendbar auf das vorläufige Screenen in zellbasierten Assays.
In einem bevorzugten zellbasierenden Assay ist der Rezeptor funktional mit einem signalproduzierenden System (einem biologischen Marker) verbunden, welcher exogen oder endogen für die Zelle sein kann.
"Zero-Hybrid"-Systeme
Bei diesen Systemen resultiert das Binden eines Peptids an das Zielprotein in einer screenbaren oder auswählbaren phänotypischen Veränderung, ohne auf das Fusionieren des Zielproteins (oder eines ligandbindenden Teils davon) an ein endogenes Protein zurückgreifen zu müssen. Es kann sein, dass das Zielprotein für die Wirtszelle endogen ist oder im Wesentlichen identisch zu einem endogenen Rezeptor ist, so dass es sich den nativen Signalübertragungsweg des Letzteren zunutze machen kann. Oder ausreichende Elemente des Signalübertragungswegs, die normalerweise mit dem Zielprotein in Verbindung stehen, können in die Zelle so eingebracht werden, dass die Zelle das Binden des Zielproteins signalisiert.
"One-Hybrid"-Systeme
Bei diesen Systemen wird ein chimärer Rezeptor, ein Hybrid aus dem Zielprotein und einem endogenen Rezeptor, verwendet. Der chimäre Rezeptor hat die Ligandbindeeigenschaften des Zielproteins und die Signalübertragungseigenschaften des endogenen Rezeptors. Somit wird der normale Signalübertragungsweg des endogenen Rezeptors unterwandert.
Vorzugsweise wird der endogene Rezeptor inaktiviert, oder die Bedingungen des Assays verhindern die Aktivität des endogenen Rezeptors, um das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis zu verbessern.
Siehe Fowlkes USP 5,789,184 für ein Hefesystem.
Eine andere Art "One-Hybrid"-System kombiniert eine Peptid:DNA-bindende Domäne-Fusion mit einem nichtfusionierten Zielrezeptor, der eine Aktivierungsdomäne besitzt.
"Two-Hybrid"-System
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der zellbasierende Assay ein Two-Hybrid-System. Ein Mitglied eines Peptidliganden:Rezeptorbindepaars wird als eine Fusion mit einer DNA-bindenden Domäne (DBD) aus einem Transkriptionsfaktor (dieses Fusionsprotein wird "bait" genannt) exprimiert und das andere wird als ein Fusion mit einer Transaktivierungsdomäne (TAD) exprimiert (wobei dieses Fusionsprotein "fish", "prey" oder "catch" genannt wird). Die Transaktivierungsdomäne sollte komplementär zu der DNA-bindenden Domäne sein, d. h. sie sollte mit der Letzteren interagieren, um so die Transkription von einem speziell entworfenen Reportergen zu aktivieren, das einen Bindeort für die DNA-bindende Domäne trägt. Natürlich müssen die zwei Fusionsproteine auf ähnliche Weise komplementär sein.
Diese Komplementarität kann durch die Verwendung der komplementären und trennbaren DNA-Binde- und transkriptionalen Aktivatordomänen eines einzelnen transkriptionalen Aktivatorproteins erreicht werden, oder man kann komplementäre Domänen verwenden, die von unterschiedlichen Proteinen abgeleitet sind. Die Domänen können zu den nativen Domänen oder zu Mutanten davon identisch sein. Die Assaymitglieder können direkt an DBD oder TAD fusioniert sein oder mit einem dazwischen liegenden Linker fusioniert sein.
Der Ziel-DNA-Operator kann die native Operatorsequenz oder eine Operatormutante sein. Mutationen in dem Operator können mit Mutationen in DBD und in TAD koordiniert sein. Ein Beispiel eines geeigneten Transkriptionsaktivierungssystems ist eines, das die DNA-bindende Domäne von dem bakteriellen Repressor LexA und die Aktivierungsdomäne von dem Hefetranskriptionsfaktor Gal4 enthält, wobei das Reportergen operabel mit dem LexA-Operator verbunden ist.
Es ist nicht erforderlich, den intakten Targetrezeptor zu verwenden, lediglich der ligandbindende Teil ist ausreichend.
Die zwei Fusionsproteine können aus demselben oder aus unterschiedlichen Vektoren exprimiert werden. Auf ähnliche Weise kann das aktivierbare Reportergen aus demselben Vektor als jedes Fusionsprotein (oder als beide Proteine) oder aus einem dritten Vektor exprimiert werden.
Potentielle DNA-bindende Domänen beinhalten Gal4, LexA und mutierte Domänen, die im Wesentlichen zu den Obigen identisch sind.
Potentielle Aktivierungsdomänen beinhalten E. coli B42, Gal4-Aktivierungsdomäne II und HSW VP16 und mutierte Domänen, die im Wesentlichen zu den Obigen identisch sind.
Potentielle Operatoren beinhalten die nativen Operatoren für die gewünschte Aktivierungsdomäne und mutierte Domänen, die im Wesentlichen zu dem nativen Operator identisch sind.
Die Fusionsproteine können nukleare Lokalisierungssignale umfassen.
Das Assaysystem wird ebenfalls ein Signalproduktionssystem enthalten. Das erste Element dieses Systems ist ein Reportergen, das operabel mit einem Operator verbunden ist, der auf den DBD und TAD der Wahl antwortet. Die Expression dieses Reportergens wird direkt oder indirekt in einem auswählbaren oder screenbaren Phänotyp (dem Signal) resultieren. Das Signalproduktionssystem kann außer dem Reportergen zusätzliche genetische oder biochemische Elemente enthalten, welche bei der Produktion des Signals kooperieren. Solch ein Element könnte beispielsweise ein selektives Mittel im Zellwachstumsmedium sein. Es kann mehr als ein signalproduzierendes System geben und das System kann mehr als ein Reportergen enthalten.
Die Empfindlichkeit des Systems kann z. B. durch die Verwendung von kompetitiven Inhibitoren von jedem Schritt in der Aktivierung oder im Signalproduktionsprozess, durch Erhöhen oder Absenken der Anzahl der Operatoren, durch Verwendung von stärkeren oder schwächeren DBD oder TAD usw. angepasst werden.
Wenn das Signal der Tod oder das Überleben der fraglichen Zelle ist oder die Proliferierung oder Nichtproliferierung der fraglichen Zelle ist, wird der Assay als eine Selektion bezeichnet. Wenn das Signal lediglich in einem detektierbaren Phänotyp resultiert, durch welchen die signalisierende Zelle von derselben Zelle in einem nichtsignalisierenden Zustand unterschieden werden kann (wobei beides lebende Zellen sind), ist der Assay ein Screen. Jedoch kann der Begriff "Screenassay" in einem breiteren Sinn verwendet werden, so dass er eine Selektion umfasst. Wenn der engere Sinn gemeint ist, werden wir den Begriff "nichtselektiver Screen" verwenden.
Verschiedene Screen- und Selektionssysteme sind in Ladner, USP 5,198,346 diskutiert.
Das Screening und die Selektion kann für oder gegen die Peptid:Zielprotein- oder Verbindung:Zielprotein-Interaktion sein.
Bevorzugte Assayzellen sind mikrobielle (bakterielle, Hefe-, Algen-, Protozoen-), Invertebraten-, insbesondere Säugetier-, bevorzugt Menschen- Zellen. Die am besten entwickelten Two-Hybrid-Assays sind Hefe- und Säugetiersysteme.
Normalerweise werden Two-Hybrid-Assays verwendet, um zu bestimmen, ob ein Protein X und ein Protein Y wechselwirken unter Verwendung von deren Fähigkeit, die Wechselwirkung von DBD und TAD wiederherzustellen. Jedoch wurden verstärkt Two-Hybrid-Assays verwendet, um Interaktionen zu erkennen, die von einem dritten Nichtproteinliganden abhängen.
Für mehr Anleitungen für Two-Hybrid-Assays siehe Brent und Finley, Jr., Ann. Reve. Genet., 31:663-704 (1997); Fremont-Racine et al., Nature Genetics, 277-281 (16. Juli 1997); Allen et al., TIBS, 511-16 (Dez. 1995); LeCrenier et al., BioEssays, 20:1-6 (1998); Xu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 94:12473-8 (Nov. 1992); Esotak et al., Mol, Cell. Biol., 15:5820-9 (1995); Yang et al., Nucleic Acids Res., 23:1152-6 (1995); Bendixen et al., Nucleic Acids Res., 22:1778-9 (1994); Fuller et al., BioTechniques, 25:85-92 (Juli 1998); Cohen et al., PNAS (USA), 95:14272-7 (1998); Kolonin und Finley, Jr., PNAS (USA, 95:14266-71 (1998). Siehe auch Vasavada et al., PNAS (USA), 88:10686-90 (1991) (contingent replication assay) und Rehrauer et al., J. Biol. Chem., 271:23865-73 91996) (LexA repressor cleavage assay).
"Im Wesentlichen identisch"
Eine Proteinmutante ist im Wesentlichen identisch zu einem Referenzprotein, wenn (a) sie wenigstens 10 % einer spezifischen Bindeaktivität oder einer nicht nahrungsbezogenen biologischen Aktivität des Referenzproteins hat und (b) sie wenigstens in Bezug auf die Aminosäuresequenz zu 50 % identisch zu dem Referenzprotein ist.
Der Prozentsatz der Aminosäureidentität wird durch das Aneinanderreihen der Mutantensequenzen und der Referenzsequenzen gemäß einem strengen dynamischen Programmierungsalgorithmus bestimmt, welcher global die Sequenzen aneinanderreiht, um deren Ähnlichkeit zu maximieren, wobei die Ähnlichkeit als die Summe der Treffer für jedes aneinandergereihte Paar gemäß einer biasfreien PAM250-Matrix bewertet wird und eine Strafe für jede interne Lücke von –12 für die erste Null der Lücke und –4 für jede zusätzliche Null derselben Lücke verhängt wird. Die Identitätsprozentzahl ist die Anzahl der Übereinstimmungen, die als Prozentsatz der Angepassten (d. h. Zählen der eingefügten Nullen) der Referenzsequenz ausgerückt wird.
Eine mutierte DNA-Sequenz ist im Wesentlichen identisch zu einer Referenz-DNA-Sequenz, wenn sie strukturelle Sequenzen sind und für Mutanten- und Referenzproteine codieren, welche im Wesentlichen ähnlich sind, wie oben beschrieben.
Wenn sie stattdessen Regulationssequenzen sind, sind sie im Wesentlichen identisch, wenn die mutierte Sequenz wenigstens 10 % der regulatorischen Aktivität der Referenzsequenz hat und wenigstens 50 % identisch bezüglich der Nukleotidsequenz zu der Referenzsequenz ist. Die Prozentzahl der Identität wird wie für Proteine bestimmt, außer dass Übereinstimmungen mit +5 bewertet werden, Nichtübereinstimmungen mit –4, und die Strafe für offene Lücken –12 ist und die Strafe für die Ausdehnung der Lücke (pro Null) –4 ist.
Vorzugsweise haben Sequenzen, die im Wesentlichen identisch sind, eine minimale Identität, die größer ist als 50 %, z. B. 51 %, 66 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität.
DNA-Sequenzen können ebenso als "im Wesentlichen identisch" angesehen werden, wenn sie miteinander unter strengen Bedingungen hybridisieren, d. h. Bedingungen, bei welchen der Tm des Heteroduplex aus dem einen Strang der mutierten DNA und dem komplementäreren Strang der Referenz-DNA nicht mehr als 10° kleiner ist als der Tm des Referenz-DNA-Homoduplex. Typischerweise wird dies einer Identitätsprozentzahl von 85-90 % entsprechen.
Kombinatorische Bibliotheken
Der Begriff "Bibliothek" betrifft im Allgemeinen eine Sammlung von chemischen oder biologischen Einheiten, welche in Bezug auf ihren Ursprung, ihre Struktur und/oder ihre Funktion verwandt sind und welche gleichzeitig hinsichtlich einer Eigenschaft von Interesse gescreent werden können.
Der Begriff "kombinatorische Bibliothek" betrifft eine Bibliothek, in welcher die individuellen Mitglieder entweder systematische oder zufällige Kombinationen aus einem limitierten Satz an Basiselementen sind, wobei die Eigenschaften von jedem Mitglied abhängig von der Wahl und der Anordnung der Elemente sind, die in es mit einbezogen sind. Typischerweise sind die Mitglieder einer Bibliothek wenigstens in der Lage, gleichzeitig gescreent zu werden. Die Randomisierung kann vollständig oder partiell sein; einige Positionen können randomisiert sein und andere können vorbestimmt sein, und an den zufälligen Positionen können die Auswahlmöglichkeiten auf eine vorbestimmte Art und Weise limitiert sein. Die Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek können Oligomere oder Polymere irgendeiner Art sein, bei welcher die Variation durch die Wahl der monomeren Baublöcke an einer oder an mehreren Positionen des Oligomers oder Polymers auftritt, und möglicherweise in Bezug auf die verbindenden Brücken oder ebenfalls in Bezug auf die Länge des Oligomers oder Polymers. Oder die Mitglieder können nichtoligomere Moleküle mit einer Standard-Kernstruktur sein, wie die 1,4-Benzodiazepinstruktur, wobei die Variation durch die Wahl der Substituenten an bestimmten variablen Orten an der Kernstruktur eingeführt wird. Oder die Mitglieder können nichtoligomere Moleküle sein, die puzzleartig zusammengesetzt sind, aber wobei jedes Stück sowohl ein oder mehrere variable Reste (die zu der Diversität der Bibliothek beitragen) als auch einen oder mehrere konstante Bereiche (die die Funktionalitäten zur Verfügung stellen, um das fragliche Stück an andere Stücke zu koppeln) hat.
Die Fähigkeit von einem oder von mehreren Mitgliedern einer solchen Bibliothek, ein Zielmolekül zu erkennen, wird "kombinatorische Erkennung" genannt. In einer "einfachen kombinatorischen Bibliothek" gehören alle Mitglieder zu der gleichen Verbindungsklasse (z. B. Peptiden) und können simultan synthetisiert werden. Eine "kompositkombinatorische Bibliothek" ist eine Mischung aus zwei oder mehreren einfachen Bibliotheken, z. B. DNAs und Peptide, oder Benzodiazepine und Carbamate. Die Anzahl der einfachen Bibliotheken, die einen Bestandteil in der Kompositbibliothek bilden, wird natürlich normalerweise kleiner sein als die durchschnittliche Zahl der Mitglieder in jeder einfachen Bibliothek, da ansonsten der Vorteil der Bibliothek gegenüber einer individuellen Synthese klein ist.
Oligonukleotidbibliotheken
Eine Oligonukleotidbibliothek ist eine kombinatorische Bibliothek, wobei wenigstens einige der Mitglieder einzelsträngige Oligonukleotide sind, wobei drei oder mehr Nukleotide durch Phosphodiesterbrücken oder analoge Bindungen verbunden sind. Die Oligonukleotide können linear, cyclisch oder verzweigt sein und können Nichtnukleinsäurereste beinhalten. Die Nukleotide sind nicht auf die Nukleotide limitiert, die normalerweise in DNA oder RNA gefunden werden. Für Beispiele von Nukleotiden, die modifiziert sind, um die Nukleasewiderstandskraft und die chemische Stabilität von Aptameren zu erhöhen, siehe Chart 1 in Osborne und Ellington, Chem. Rev., 97:349-70 (1997). Zum Screenen von RNA siehe Ellington und Szostak, Nature, 346:818-22 (1990).
Es gibt keine formale minimale oder maximale Größe für diese Oligonukleotide. Jedoch steigt die Anzahl der Konformationen, welche ein Oligonukleotid annehmen kann, exponentiell mit dessen Länge in Basen an. Daher ist es wahrscheinlich, dass ein längeres Oligonukleotid in der Lage ist, sich so zu falten, dass es sich an eine Proteinoberfläche anpassen kann. Während sehr lange Moleküle synthetisiert und gescreent werden können, es sei denn, sie stellen eine deutlich überlegene Affinität zu derjenigen von kürzeren Molekülen zur Verfügung, ist es andererseits nicht wahrscheinlich, dass sie in der ausgewählten Population gefunden werden aus den Gründen, die von Osborne und Ellington (1997) erklärt wurden. Daher sind die Bibliotheken der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aus Oligonukleotiden zusammengesetzt, die eine Länge von 3 bis zu 100 Basen, mehr bevorzugt von 15 bis zu 35 Basen haben. Die Oligonukleotide in einer gegebenen Bibliothek können die gleichen Längen oder auch unterschiedliche Längen haben.
Oligonukleotidbibliotheken haben den Vorteil, dass Bibliotheken von sehr hoher Diversität (z. B. 10¹⁵) möglich sind und dass bindende Moleküle leicht in vitro durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden können. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle eine sehr hohe Spezifität und eine Affinität gegenüber Targets haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung Oligonukleotidbibliotheken durch das SELEX-Verfahren, wie beschrieben durch King und Famulok, Molec. Biol. Repts., 20:97-107 (1994); L. Gold, C. Tuerk. Methods of producing nucleic aced ligands, US#5595877; Oliphant et al., Gene 44:177 (1986), zur Verfügung und screent diese.
Der Begriff "Aptamer" betrifft diejenigen Oligonukleotide, die an das Zielprotein binden. Solche Aptamere können verwendet werden, um das Zielprotein zu charakterisieren, sowohl direkt (durch Identifizierung des Aptamers und der Kontaktpunkte zwischen dem Aptamer und dem Protein) als auch indirekt (durch die Verwendung des Aptamers als Ligand, um die chemische Reaktivität des Proteins zu modifizieren.
Peptidbibliothek
Eine Peptidbibliothek ist eine kombinatorische Bibliothek, bei der wenigstens einige der Mitglieder Peptide sind, die drei oder mehr Aminosäuren haben, die mit Peptidbindungen verbunden sind. Vorzugsweise haben sie eine Länge von wenigstens fünf, sechs, sieben oder acht Aminosäuren. Vorzugsweise bestehen sie aus weniger als 50, mehr bevorzugt aus weniger als 20 Aminosäuren.
Die Peptide können linear, verzweigt oder cyclisch sein und können Nichtpeptidylreste beinhalten. Die Aminosäuren sind nicht auf die natürlich auftretenden Aminosäuren beschränkt.
Eine mit einem Bias versehene Peptidbibliothek ist eine, bei welcher ein oder mehrere (aber nicht alle) Reste der Peptide konstante Reste sind. Die individuellen Mitglieder werden als Peptidliganden (PL) bezeichnet. In einer Ausführungsform ist ein interner Rest konstant, so dass die Peptidsequenz geschrieben werden kann als (X)_aa)_m-AA₁-(X_aa)_n
Wo Xaa entweder irgendeine natürlich auftretende Aminosäure oder irgendeine Aminosäure außer Cystein ist, werden m und n unabhängig aus dem Bereich von 2 bis 20 ausgewählt, das Xaa kann gleich oder unterschiedlich sein und AA₁ ist dieselbe natürlich auftretende Aminosäure für alle Peptide in der Bibliothek, aber kann jegliche Aminosäure sein. Vorzugsweise werden m und n unabhängig voneinader aus dem Bereich von 4 bis 9 ausgewählt.
Vorzugsweise ist AA₁ im Zentrum oder in der Nähe des Zentrums des Peptids angeordnet. Mehr bevorzugt ist es wünschenswert, dass m und n sich um nicht mehr als 2 unterscheiden; mehr bevorzugt sind m und n gleich. Sogar wenn die ausgewählte AA₁ erforderlich für die Zielprotein (TP)-Bindeaktivität ist (oder diese wenigstens zulässt), könnte man zusätzliche flankierende Reste benötigen, um sicherzustellen, dass sie richtig angeordnet ist. Wenn AA₁ mehr oder weniger zentral angeordnet ist, stellt die Bibliothek eine Vielzahl von alternativen Wahlmöglichkeiten für die flankierenden Reste zur Verfügung. Wenn AA₁ an einem Ende angeordnet ist, ist diese Flexibilität vermindert.
Die am meisten bevorzugten Bibliotheken sind diejenigen, bei welchen AA₁ Tryptophan, Prolin oder Tyrosin ist. Am zweitmeisten bevorzugt sind diejenigen, bei welchen AA₁ Phenylalanin, Histidin, Arginin, Aspartat, Leucin oder Isoleucin ist. Am drittmeisten bevorzugt sind diejenigen, bei welchen AA₁ Asparagin, Serin, Alanin oder Methionin ist. Die am wenigsten bevorzugten Wahlmöglichkeiten sind Cystein und Glycin. Diese Präferenzen basieren auf der Bewertung der Ergebnisse des Screenens von zufälligen Peptidbibliotheken für das Binden an viele unterschiedliche TPs.
Liganden, die an funktionelle Domänen binden, tendieren dazu, sowohl konstante als auch einzigartige Eigenschaften zu haben. Daher kann man unter der Verwendung von "biased" Peptidbibliotheken die Bürde des Auffindens von Liganden erleichtern. Entweder können "biased" oder "unbiased" Bibliotheken gescreent werden, um "BioKey"-Peptide für die Verwendung beim Entwickeln von Faktoren, die die Reaktivität beschreiben, und optional von Faktoren, die Peptidaptamere beschreiben, und beim Entwickeln von zusätzlichen Medikamentleitstrukturen gescreent werden zu identifizieren.
Studien von unbekannten (orphan) Rezeptoren
Unbekannte Rezeptoren wurden mittels ihrer Sequenzähnlichkeit zu bekannten nicht-unbekannten Rezeptoren identifiziert, jedoch haben sie per Definition keine bekannten natürlichen Liganden.
Der erste Schritt beim Versuch, eine durch einen orphanen Rezeptor vermittelte biologische Aktivität einer Verbindung vorherzusagen, ist es, wenigstens einen pharmakologischen Agonisten oder Antagonisten des orphanen Rezeptors zu identifizieren. (Sobald solch eine Verbindung identifiziert ist, ist der Rezeptor nicht länger streng genommen "orphan".) Dieser Ligand, welcher kein natürlicher Ligand des Rezeptors sein muss, wird dann als Referenzligand verwendet, um eine BioKey-Gruppe zu definieren usw.
Um einen Agonisten oder Antagonisten zu identifizieren, wird eine kombinatorische Bibliothek zunächst nach Mitgliedern abgesucht, welche den Rezeptor binden. Vorzugsweise werden wenigstens zwei, mehr bevorzugt wenigstens zehn unterschiedliche Mitglieder identifiziert. Vorzugsweise sollte aus Kompetitionsexperimenten zeigbar sein, dass mehr als ein Bindeort involviert ist.
Verbindungen werden dann hinsichtlich der Fähigkeit gescreent, das Binden von einer oder von mehreren der vorher erwähnten Bibliotheksmitglieder an den orphanen Rezeptor zu inhibieren. Diejenigen, die dies tun, haben wahrscheinlich die Rezeptorkonformation verändert. Diese putativen Liganden werden dann nach agonistischer oder antagonistischer Aktivität gescreent. Die biologischen Aktivitäten, die untersucht worden sind, beinhalten vorzugsweise die Aktivitäten, die nativ zu denjenigen der kognaten Rezeptoren sind, unter Bezugnahme auf welche die orphanen Rezeptoren ursprünglich identizifiert worden sind. Sie beinhalten ebenso vorzugsweise Assays für die Zellproliferation für jeden Zelltyp, von welchem bekannt sind, dass der orphane Rezeptor exprimiert wird (durch Detektion des Rezeptors oder von dessen korrespondierender mRNA).
Die gescreenten Verbindungen können kleine organische Verbindungen, so wie Verbindungen aus einer geeigneten kombinatorischen oder nichtkombinatorischen Bibliothek sein oder sie können aus natürlichen Quellen kommen, so wie Serum, Urin, Cerebrospinalfluid, lymphatischem Fluid, oder Gewebeextrakten, welche den natürlichen Liganden enthalten könnten. Optional könnten diese Materialien aus natürlichen Quellen durch konventionelle Verfahren fraktioniert werden und jede Fraktion könnte getestet werden. Die Verbindungen können bekannte Agonisten oder Antagonisten des kognaten Rezeptors sein, müssen dies aber nicht (oder sie können Analoga der Agonisten oder Antagonisten sein).
Eine Bibliothek aus kleinen organischen Verbindungen
Die Bibliothek aus kleinen organischen Verbindungen ("Verbindungsbibliothek", in Kurzform) ist eine kombinatorische Bibliothek, deren Mitglieder für die Verwendung als Medikament geeignet sind, wenn sie tatsächlich die Fähigkeit haben, eine biologische Aktivität des Zielproteins zu vermitteln.
Peptide haben gewisse Nachteile als Medikamente. Diese beinhalten die Empfänglichkeit gegenüber dem Abbau durch Serumproteasen und die Schwierigkeiten beim Eindringen in Zellmembranen. Vorzugsweise vermeiden es alle oder die meisten der Verbindungen der Verbindungsbibliothek, an einem oder an mehreren der pharmazeutischen Nachteile von Peptiden zu leiden, oder sie leiden zumindest nicht im selben Grad wie Peptide.
Beim Entwerfen von einer Verbindungsbibliothek ist es nützlich, an die Verfahren der molekularen Modifizierung zu denken, die typischerweise verwendet werden, um neue Medikamente zu erhalten. Drei grundsätzliche Arten der Modifikation können identifiziert werden: Disjunction, wobei eine Leitstruktur vereinfacht wird, um deren pharmakophore Untereinheiten als Bestandteil zu identifizieren; Conjunction, wobei zwei oder mehr bekannte pharmakophore Untereinheiten, welche gleich oder unterschiedlich sein können, miteinander verbunden werden, kovalent oder nichtkovalent, um ein neues Medikament zu bilden; und Veränderung, wobei eine Einheit durch eine andere ersetzt wird, welche ähnlich oder unterschiedlich sein kann, aber was im Ergebnis keine Disjunction oder Conjunction ist. Die Verwendung der Begriffe "Disjunction", "Conjunction" und "Veränderung" ist nur dafür vorgesehen, den strukturellen Bezug des Endprodukts zu den ursprünglichen Leitstrukturen zu bezeichnen und nicht, wie die neuen Medikamente tatsächlich synthetisiert werden, auch wenn es möglich ist, dass beides das Gleiche ist.
Das Verfahren der Disjunction wird durch Entwicklung von Neostigmin (1931) und Edrophonium (1952) aus Physostigmin (1925) illustriert. Die anschließende Conjunction wird illustriert durch Demecarium (1956) und Ambenonium (1956).
Die Veränderungen können die Größe, die Polarität oder die Elektronenverteilung eines ursprünglichen Abschnittes modifizieren. Die Veränderungen schließen Ringschlussreaktionen oder Ringöffnungen, die Bildung von niedrigeren oder höheren Homologen, die Einfügung oder die Sättigung von Doppelbindungen, die Einführung von optisch aktiven Zentren, die Einfügung, das Entfernen oder den Ersatz von raumerfüllenden Gruppen, isosterische oder bioisosterische Substition, Veränderungen in der Position oder der Orientierung einer Gruppe, die Einführung von alkylierenden Gruppen und die Einfügung, das Entfernen oder den Ersatz von Gruppen hinsichtlich des Inhibierens oder des Förderns von induktiven (elektrostatischen) oder konjugativen (Resonanz-) Effekten ein.
Somit können die Substituenten Elektronenakzeptoren und/oder Elektronendonoren beinhalten. Typische Elektronendonoren (+I) beinhalten -CH₃, -CH₂R, -CHR₂, -CR₃ und -COO^–. Typische Elektronenakzeptoren (-I) beinhalten -NH₃+, -NR₃+, NO₂, -CN, -COOH, -COOR, -CHO, -COR, -F, -Cl, -Br, -OH, -OR, -SH, -SR, -CH=CH₂, -CR=CR₂ und -C=CH.
Die Substituenten können ebenso diejenigen beinhalten, welche die elektronische Dichte in konjugierten System erhöhen oder absenken. Die ersteren (+R) Gruppen beinhalten -CH₃, -CR₃, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -OR, -COOR, -SH, -SR, -NH₂, -NR₂ und -NHCOR. Die letzteren (-R) Gruppen beinhalten -NO₂, -CN, -CHC, -COR, -COOH, -COOR, -CONH₂, -SO₂R und -CF₃.
Unter dem Gesichtspunkt der Synthese können die Modifikationen durch eine Vielzahl von Einheitsprozessen erzielt werden, einschließlich nukleophiler und elektrophiler Substitution, Reduktion und Oxidation, Additionseliminierung, Doppelbindungsspaltung und Cyclisierung.
Für den Zweck des Konstruierens einer Bibliothek kann eine Verbindung oder eine Familie aus Verbindungen mit einer oder mit mehreren pharmakologischen Aktivitäten (welche nicht mit den bekannten oder erwarteten Aktivitäten des Zielproteins in Verbindung stehen müssen) in zwei oder mehr bekannte oder potentielle pharmakophore Einheiten unterteilt werden. Analoga von jeder dieser Einheiten können identifiziert werden, und Mischungen dieser Analoga können so umgesetzt werden, dass Verbindungen wieder zusammengesetzt werden, welche einige Ähnlichkeit zu der ursprünglichen Leitstruktur haben. Es ist nicht erforderlich, dass alle Mitglieder der Bibliothek Einheitsanaloga zu allen der Einheiten der Leitstruktur besitzen.
Das Design einer Bibliothek kann am Beispiel der Benzodiazepine illustriert werden. Verschiedene Benzodiazepinmedikamente, einschließlich Chlordiazepoxid, Diazepam und Oxazepam, wurden als Antiangstmedikamente verwendet. Derivate von Benzodiazepinen haben vielseitige biologische Aktivitäten; von Derivaten wurde berichtet, dass sie nicht nur als Anxiolytikum agieren, sondern ebenso als Antikonvulsantien, Cholecystokinin (CCK)-Rezeptor Subtyp A oder B, als Kappa-Opioidrezeptor, als Blutplättchen-aktivierender Faktor und als HIV-Transaktivator Tat-Antagonisten und GPllblla, reverse Transkriptase und Ras-Farnesyltransferase-Inhibitoren.
Die Benzodiazepinstruktur wurde in ein 2-Aminobenzophenon, eine Aminosäure und ein alkylierendes Mittel unterteilt. Siehe Bunin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:4708 (1994). Da nur ein paar 2-Aminobenzophenonderivate kommerziell erhältlich sind, wurde es später in 2-Aminoarylstannan, ein Säurechlorid, eine Aminosäure und ein alkylierendes Mittel unterteilt. Bunin et al., Meth. Enzymol., 267:448 (1996). Das Arylstannan kann als Kernstruktur angesehen werden, auf welche die anderen Einheiten substituiert werden, oder alle vier können als gleichwertig angesehen werden, welche miteinander verbunden werden, um jedes Bibliotheksmitglied herzustellen.
Ein grundsätzlicher Bibliothekssyntheseplan und eine Mitgliederstruktur ist in 1 von Fowlkes et al., US-Seriennr. 08/740,671 (WO 98/19162) gezeigt. Der Säurechloridbaublock führt eine Variabilität an dem R¹-Ort ein. Der R²-Ort wird durch die Aminosäure eingeführt und der R³-Ort durch das Alkylierungsmittel. Der R⁴-Ort ist in dem Arylstannan inhärent. Bunin et al. bildeten eine 1,4-Benzodiazepinbibliothek aus 11.200 unterschiedlichen Derivaten, hergestellt aus 20 Säurechloriden, 35 Aminosäuren und 16 Alkylierungsmitteln. (Keine Diversität wurde bei R⁴ eingeführt; diese Gruppe wurde verwendet, um das Molekül an eine feste Phase zu binden). Gemäß der Available Chemicals Directory (HDL Information Systems, San Leandro CA) waren über 300 Säurechloride, 80 Fmoc-geschützte Aminosäuren und 800 Alkylierungsmittel im Handel erhältlich (und mehr konnten selbstverständlich synthetisiert werden). Die bestimmten Reste, die verwendet wurden, wurden ausgewählt, um die strukturelle Dispersion zu maximieren, während die Anzahl auf diejenigen limitiert wurde, die in den Wells einer Mikrotiterplatte bequem synthetisiert werden konnten. Bei der Auswahl zwischen strukturell ähnlichen Verbindungen wurde der am wenigsten substituierten Verbindung der Vorzug gegeben.
Die variablen Elemente beinhalteten sowohl aliphatische als auch aromatische Gruppen. Unter den aliphatischen Gruppen wurden sowohl acyclische als auch cyclische (Mono- oder Poly-) Strukturen, substituiert oder nicht, getestet. (Während alle der acyclischen Gruppen linear waren, wäre es möglich gewesen, eine verzweigte aliphatische Struktur einzufügen). Die aromatischen Gruppen stellten entweder einzelne oder mehrfache Ringe dar, fusioniert oder nicht, substituiert oder nicht, und mit Heteroatomen oder ohne Heteroatome. Die sekundären Substituenten beinhalteten -NH₂, -OH, -OMe, -CN, -Cl, -F und -COOH. Obwohl sie nicht verwendet wurden, hätten Spacerreste, so wie -O-, -S-, -OO-, -CS-, -NH- und -NR- mit einbezogen werden können.
Bunin et al. schlagen vor, dass man anstelle der Verwendung eines 1,4-Benzodiazepins als Kernstruktur eine 1,4-Benzodiazepin-2,5-dionstruktur verwenden könnte.
Wie durch Bunin et al. bemerkt, ist es vorteilhaft, auch wenn es nicht erforderlich ist, eine Verbindungsstrategie zu erwenden, welche keine Spuren der Verbrückungsfunktionalität hinterlässt, da dies die Konstruktion einer noch vielfältigeren Bibliothek ermöglicht.
Andere kombinatorische nichtoligomere Verbindungsbibliotheken, die bekannt oder im Stand der Technik vorgeschlagen sind, basierten auf Carbamaten, mercaptoacylierten Pyrrolidinen, phenolischen Mitteln, Aminimiden, N-Acylaminoethern (hergestellt aus Aminoalkoholen, aromatischen Hydroxysäuren und Carbonsäuren), N-Alkylaminoethern (hergestellt aus aromatischen Hydroxysäuren, Aminoalkoholen und Aldehyden) 1,4-Piperazinen und 1,4-Piperazin-6-onen.
DeWitt et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 90:6909-13 (1993) beschreibt die simultane, aber getrennte Synthese von 40 diskreten Hydantoinen und 40 diskreten Benzodiazepinen. Sie führen ihre Synthese auf einem festen Träger (innerhalb eines Gasdispersionsrohres) in einem Arrayformat aus, im Gegensatz zu anderen konventionellen simultanen Synthesetechniken (z. B. in einem Well oder auf einem Pin). Die Hydantoine wurden zunächst durch das simultane Entschützen und dann das Behandeln von jeder der fünf Aminosäureharze mit jedem der acht Isocyanate synthetisiert. Die Benzodiazepine wurden durch Behandeln von jedem der fünf entschützten Aminosäureharze mit jedem der acht 2-Aminobenzophenonimine synthetisiert.
Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2661-62 (1994) beschrieben die Herstellung einer kombinatorischen Pilot-Bibliothek aus Formiatestern (9 Mitglieder). Eine an ein Polymerkügelchen gebundene Aldehydpräparation wurde in drei Aliquots "aufgeteilt", jede wurde mit einem von drei unterschiedlichen Ylidreagenzien umgesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden kombiniert und dann in drei neue Aliquots unterteilt, von denen jedes mit einem unterschiedlichen Michael-Donor umgesetzt wurde. Die Verbindungsidentität stellte sich als auf einer Einzelkügelchenbasis durch Gaschromatographie/Massenspektroskopieanalyse bestimmbar heraus.
Holmes, USP 5,549,974 (1996) führt Methodologien für die kombinatorische Synthese von Bibliotheken aus Thiazolidinonen und Metathiazanonen aus. Diese Bibliotheken werden durch Kombination von Aminen, Carbonylverbindungen und Thiolen unter Cyclisierungsbedingungen hergestellt.
Ellman, USP 5,545,568 (1996) beschreibt die kombinatorische Synthese von Benzodiazepinen, Prostaglandinen, beta-turn-Mimetika und glycerolbasierenden Verbindungen. Siehe auch Ellman, USP 5,288,514.
Summerton, USP 5,506,337 (1996) beschreibt Verfahren zur Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek, vorwiegend gebildet aus Morpholinountereinheitsstrukturen.
Heterocyclische kombinatorische Bibliotheken werden rückblickend zusammengefasst in Nefzi et al., Chem. Rev., 97:449-472 (1997). Ein oder mehrere Reste der folgenden Typen können in Verbindungen der Bibliothek mit einbezogen werden, da viele Medikamente in eine oder in mehrere der folgenden Kategorien fallen:
Acetale
Säuren
Alkohole
Amide
Amidine
Amine
Aminosäuren,
Aminoalkohole
Aminoether
Aminoketene
Ammoniumverbindungen
Azoverbindungen
Enole
Ester
Ether
Glycoside
Guanidine,
halogenierte Verbindungen
Kohlenwasserstoffe
Ketone
Lactame
Lactone
Senfe
Nitroverbindungen
Nitroseverbindungen
Organomineralien
Phenone
Chinone
Semicarbazone
Stilbene
Sulfonamide
Sulfone
Thiole
Thioamide
Thioharnstoffe
Harnstoffe
Ureide
Urethane
Ohne zu versuchen, vollständig alle pharmakologischen Klassen von Medikamenten oder alle Medikamentenstrukturen zu rezitieren, wurde herausgefunden, dass eine oder mehrere Verbindungen mit den chemischen Strukturen, die hierunter aufgelistet sind, die angezeigten pharmakologischen Aktivitäten aufweisen, und diese Strukturen oder Derivate davon können als Designelemente beim Screenen nach weiteren Verbindungen mit derselben oder einer unterschiedlichen Aktivität verwendet werden. (In einigen Fällen sind einige oder mehr Leitstrukturen der Klasse angegeben.)

Hypnotika
höhere Alkohole (Clomethiazol)
Aldehyde (Chloralhydrat)
Carbamate (Meprobamat)
acyclische Ureide (Acetylcarbromal)
Barbiturate (Barbital)
Benzodiazepine (Diazepam)

Entkrampfungsmittel
Barbiturate (Phenobarbital)
Hydantoine (Phenytoin)
Oxazolidindione (Trimethadion)
Succinimide (Phensuximid)
Acylureide (Phenacemide)

narkotische Analgetika
Morphine
Phenylpiperidine (Meperidin)
Diphenylpropylamine (Methadon)
Phenothiazine (Methotrimeprazin)

Analgetika, Antipyretika, antirheumatische Mittel
Salicylate (Acetylsalicylsäure)
p-Aminophenol (Acetaminophen)
5-Pyrazolon (Dipyron)
3,5-Pyrazolidindion (Phenylbutazon)
Arylessigsäure (Indomethacin)
Adrenocorticale Steroide (Cortison, Dexamethason, Prednison, Triamcilon)
Athranilsäuren

Neuroleptika
Phenothiazin (Chlorpromazin)
Thioxanthen (Chlorprothixen)
Reserpin
Butyrophenon (Halopendol)

Anxiolytika
Propandiolcarabamate (Meprobamat)
Benzodiazepine (Chlordiazepoxid, Diazepam, Oxazepam)

Antidepressiva
tricyclische Stoffe (Imipramin)

Muskelentspannungsmittel
Propandiole und Carbamate (Mephenesin)

CNS-Stimulanzien
Xanthine (Coffein, Theophyllin)
Phenylalkylamine (Amphetamin)
(Fenetyllin ist eine Kombination aus Theophyllin und Amphetamin)
Oxazolidinone (Pemolin)

Cholinergika
Cholinester (Acetylcholin)
N,N-Dimethylcarbamate

Adrenergika
aromatische Amine (Epinephrin, Isoproterenol, Phenylephrin)
alicyclische Amine (Cyclopentamin)
aliphatische Amine (Methylhexanamin)
Imidazoline (Naphazolin)

Antiadrenergika
Indolethylaminalkaloide (Dihydroergotamin)
Imidazole (Tolazolin)
Benzodioxane (Piperoxan)
beta-Haloalkylamine (Phenoxybenzamin)
Dibenzazepine (Azapetin)
Hydrazinophthalazine (Hydralazin)

Antihistamine
Ethanolamine (Diphenhydramin)
Ethylendiamine (Tripelennomin)
Alkylamine (Chlorpheniramin)
Piperazine (Cyclizin)
Phenothiazine (Promethazin)

lokale Anästhetika
Benzoesäure
Ester (Procain, Isobucain, Cyclomethycain)
basische Amine (Dibucain)
Anilide, Toluidide, 2,6-Xylidide (Lidocain)
tertiäre Amide (Oxetacain)

Vasodilatoren
Polyolnitrate (Nitroglycerin)

Diuretika
Xanthine
Thiazide (Chlorthiazid)
Sulfonamide (Chlorthalidon)

Antihelmintika)
Cyaninfarbstoffe

Antimalariawirkstoffe
4-Aminochinoline
8-Aminochinoline
Pyrimidine
Biguanide
Acridine
Dihydrotriazine
Sulfonamide
Sulfone

antibakterielle Wirkstoffe
Antibiotika
Penicilline
Cephalosporine
Octahydronaphthacene (Tetracyclin)
Sulfonamide
Nitrofurane
cyclische Amine
Naphthyridine
Xylenole

Antitumormittel
alkylierende Mittel
Stickstoffsenfe
Aziridine
Methansulfonatester
Epoxide
Aminosäureantagonisten
Folsäureantagonisten
Pyrimidinantagonisten
Purinantagonisten

antivirale Wirkstoffe
Adamantane
Nucleoside
Thiosemicarbazone
Inosine
Amidine und Guanidine
Isochinoline
Benzimidazole
Piperazine

Für pharmakologische Klassen siehe z. B. Goth, Medical Pharmacology: Principles and Concepts (C.V. Mosby Co.: 8. Ausg. 1976); Korolkovas und Burckhalter, Essentials of Medicinal Chemistry (John Wiley & Sons, Inc.: 1976). Für synthetische Verfahren siehe z. B. Warren, Organic Synthesis: The Disconnection Approach (John Wiley & Sons, Ltd.: 1982); Fuson, Reactions of Organic Compounds (John Wiley & Sons: 1966); Payne und Payne, How to do an Organic Synthesis (Allyn und Bacon, Inc.: 1969); Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley-Interscience). Für die Auswahl von Substituenten siehe z. B. Hansch und Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology (John Wiley & Sons: 1979).

Die Bibliothek wird vorzugsweise so synthetisiert, dass die individuellen Mitglieder identifizierbar bleiben, so dass, wenn gezeigt wird, dass ein Mitglied aktiv ist, es nicht erforderlich ist, es zu analysieren. Verschiedene Verfahren zur Identifizierung wurden vorgeschlagen, einschließlich:

(1) das Codieren, d. h. das Anhaften eines identifizierbaren Restes an jedes Mitglied, welcher leichter identifiziert wird als das Mitglied allein. Dies hat den Nachteil, dass der Marker selbst die Aktivität des Konjugats beeinflussen könnte;
(2) räumliche Zuordnung, d. h. jedes Mitglied wird nur bei einer bestimmten Koordinate auf oder in einer Matrix oder in einer bestimmten Kammer synthetisiert. Dies könnte beispielsweise die Anordnung auf einem bestimmten Pin oder in einem bestimmten Well, auf einer Mikrotiterplatte oder innerhalb eines "Teebeutels" sein.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendeine bestimmte Art der Identifikation beschränkt.
Jedoch ist es möglich, die Mitglieder der Bibliothek, die sich als aktiv herausgestellt haben, einfach basierend auf den charakteristischen spektroskopischen Indizes der verschiedenen Bausteine zu charakterisieren.
Die Festphasensynthese erlaubt eine größere Kontrolle darüber, welche Derivate gebildet werden. Jedoch könnte die Festphase mit der Aktivität inferieren. Um dieses Problem zu überwinden, könnten einige oder alle Moleküle jedes Mitglieds nach der Synthese, aber vor dem Screening freigesetzt werden.
Beispiele von einfachen Kandidatenbibliotheken, welche bewertet werden könnten, beinhalten Derivate der Folgenden:

Cyclische Verbindungen, die ein Heteroatom enthalten:
Heterostickstoff
Pyrrole
pentasubstituierte Pyrrole
Pyrrolidine
Pyrroline
Proline
Indole
beta-Carboline
Pyridine
Dihydropyridine
1,4-Dihydropyridine
Pyrido[2,3-d]pyrimidine
Tetrahydro-3H-imidazo[4,5-c]pyridine
Isochinoline
Tetrahydroisochinoline
Chinolone
beta-Lactame
Azabicyclo[4.3.0]nonen-8-on-Aminosäure
Heterosauerstoff
Furane
Tetrahydrofurane
2,5-disubstituierte Tetrahydrofurane
Pyrane
Hydroxypyranone
Tetrahydroxypyranone
gamma-Butyrolactone

Heteroschwefel
Sulfolene

Cyclische Verbindungen mit zwei oder mehr Heteroatomen:

Mehrfache Heterostickstoffe
Imidazole
Pyrazole
Piperazine
Diketopiperazine
Arylpiperazine
Benzylpiperazine
Benzodiazepine
1,4-Benzodiazepine-2,5-dione
Hydantoine
5-Alkoxyhydantoine
Dihydropyrimidine
1,3-disubstituierte 5,6-dihydropyrimidin-2,4-dione
cyclische Harnstoffe
cyclische Thioharnstoffe
Chinazoline
chirale 3-substituierte Chinazolin-2,4-dione
Triazole
1,2,3-Triazole
Purine
Heterostickstoff und Heterosauerstoff
Dikelomorpholine
Isoxazole
Isoxazoline
Heterostickstoff und Heteroschwefel
Thiazolidine
N-Acylthiazolidine
Dihydrothiazole
2-Methylen-2,3-dihydrothiazate
2-Aminothiazole
Thiophene
3-Aminothiophene
4-Thiazolidinone
4-Melathiazanone
Benzisothiazolone

Für Details über die Synthese von Bibliotheken siehe Nefzi et al., Chem. Rev., 97:449-72 (1997) und die darin zitierten Referenzen.
Aminosäuren und Peptide
Aminosäuren sind die grundsätzlichen Bausteine, aus welchen Peptide und Proteine konstruiert sind. Aminosäuren besitzen sowohl eine Aminogruppe (-NH₂) als auch eine Carbonsäuregruppe (-COOH). Viele Amionsäuren, aber nicht alle, haben die Struktur NH₂-CHR-COOH, wobei R ein Wasserstoff oder irgendeine einer Vielzahl von funktionellen Gruppen ist.
Der genetische Code codiert für zwanzig Aminosäuren: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Von diesen sind alle bis auf Glycin optisch isomer, jedoch wird bei Menschen nur die L-Form gefunden. Trotzdem hat die D-Form dieser Aminosäuren eine biologische Signifikanz; D-Phe ist beispielsweise ein bekanntes Analgetikum.
Viele andere Aminosäuren sind ebenso bekannt, einschließlich: 2-Aminoadipinsäure; 3-Aminoadipinsäure; beta-Aminopropionsäure; 2-Aminobutyrsäure; 4-Aminobutyrsäure; (Piperidinsäure); 6-Aminocapronsäure; 2-Aminoheptansäure; 2-Aminoisobutyrsäure; 3-Aminoisobutyrsäure; 2-Aminopimelinsäure; 2,4-Diaminobutyrsäure; Desmosin; 2,2'-Diaminopimelinsäure; 2,3-Diaminopropionsäure; N-Ethylglycin; N-Ethylasparagin; Hydroxylysin; allo-Hydroxylysin; 3-Hydroxyprolin; 4-Hydroxyprolin; Isodesmosin; allo-Isoleucin; N-Methylglycin (Sarcosin); N-Methylisoleucin; N-Methylvalin; Norvalin; Norleucin; und Ornithin.
Peptide werden durch die Kondensation von Aminosäuren und/oder von kleineren Peptiden gebildet. Die Aminogruppe von einer Aminosäure (oder von einem Peptid) reagiert mit der Carbonsäuregruppe einer zweiten Aminosäure (oder eines Peptids), um so eine Peptidbindung (-NHCO-) zu bilden, wobei eine Wassermolekül freigesetzt wird. Wenn eine Aminosäure in ein Peptid aufgenommen wird, sollte sie daher technisch gesehen als Aminosäurerest angesprochen werden.
Ein Peptid ist aus einer Vielzahl von Aminosäureresten zusammengesetzt, die miteinander durch Peptidyl (-NHCO-)-Bindungen verbunden sind. Ein biogenes Peptid ist ein Peptid, dessen Reste alle Aminosäurereste sind, für die genetisch codiert wird; es ist nicht erforderlich, dass das biogene Peptid tatsächlich durch Genexpression hergestellt wird.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung beinhalten Peptide, deren Sequenzen in dieser Beschreibung offenbart sind, oder Sequenzen, die von den Obigen nur durch nicht mehr als eine nichtkonservative Substitution und/oder eine oder mehr konservative Substitutionen, vorzugsweise nicht mehr als eine einzige konservative Substitution abweichen. Die Substitutionen können durch (exotische) Aminosäuren erfolgen, für die der genetische Code nicht codiert, in welchem Fall das resultierende Peptid nichtbiogen ist.
Eine konservative Substitution ist eine Substitution von einer Aminosäure für eine andere derselben Austauschgruppe, wobei die Austauschgruppen wie folgt definiert sind:
I Gly, Pro, Ser, Ala (Cys) (und jegliche nichtbiogene, neutrale Aminosäure, die eine Hydrophobizität hat, die die der vorher erwähnten Aminosäuren nicht übersteigt)
I Arg, Lys, His (und jegliche nichtbiogene positiv geladene Aminosäure)
III Asp, Glu, Asn, Gln (und jegliche nichtbiogene negativ geladene Aminosäure)I
IV) Leu, Ile, Met, Val (Cys) und jegliche nichtbiogene aliphatische neutrale Aminosäure mit einer Hydrophobizität, die für die Gruppe I oben zu hoch ist)
V Phe, Trp, Tyr (und jegliche nichtbiogene aromatische neutrale Aminosäure mit einer Hydrophobizität, die für die Gruppe I oben zu hoch ist).
Beachten Sie, dass Cys sowohl zu I als auch zu IV gehört.
Hoch konservative Substitutionen, welche bevorzugt sind, sind die Folgenden:
Arg/Lys/His, Asp/Glu, Asn/Gln, Leu/Ile/Met/Val, Phe/Trp/Tyr oder Gly/Ser/Ala.
Zusätzliche Peptide innerhalb der vorliegenden Erfindung können durch systematische Mutagenese der Peptidleitstrukturen identifiziert werden, z. B.

(a) durch separate Synthese von allen möglichen einzelnen Substitutionen (insbesondere von Substitutionen durch Aminosäuren, für die der genetische Code codiert) – Mutanten jeder Peptidleitstruktur, und/oder
(b) simultane binomiale zufällige Alanin-Scanningmutagenese von jeder Peptidleitstruktur, so dass jede Aminosäureposition entweder die ursprüngliche Aminosäure oder Alanin sein kann (wobei Alanin eine semikonservative Substitution für alle anderen Aminosäuren ist), und/oder
(c) simultane zufällige Mutagenese, wodurch konservative Substitutionen von einigen oder von allen Positionen jeder Peptidleitstruktur erprobt werden, wobei die Anzahl der Sequenzen der Gesamtsequenzen für ein ausgewähltes Experiment so ist, dass jegliche Sequenz, wenn sie aktiv ist, sich innerhalb der Detektionslimits befindet (typischerweise bedeutet dies, dass nicht mehr als etwa 10¹⁰ unterschiedliche Sequenzen vorhanden sind).

Die Mutanten werden hinsichtlich ihrer Aktivität getestet, und wenn sie aktiv sind, werden sie als innerhalb der "Peptide der vorliegenden Erfindung" angesehen. Sogar inaktive Mutanten tragen zu unserem Wissen über die Struktur-Aktivitätsbeziehungen bei und assistieren dabei beim Design von Peptiden, Peptoiden und Peptidomimetika.
Vorzugsweise kann die Substitution von exotischen Aminosäuren für die ursprünglichen Aminosäuren die folgenden Formen annehmen:

(I) Ersatz von einer oder von mehreren hydrophilen Aminosäureseitenketten durch ein anderes hydrophiles organisches Radikal, das nicht mehr als das doppelte Volumen der ursprünglichen Seitenkette hat, oder
(II) Ersatz von einer oder von mehreren hydrophoben Aminosäureseitenketten durch ein anderes hydrophobes organisches Radikal, das nicht mehr als das doppelte Volumen der ursprünglichen Seitenkette hat.

Die exotischen Aminosäuren können alpha- oder nicht-alpha-Aminosäuren sein (z. B. beta-Alanin). Sie können alpha-Aminosäuren mit 2 R-Gruppen an dem Cα-Atom haben, wobei die Gruppen gleich oder unterschiedlich sein können. Sie können Dehydroaminosäuren sein (HOOC-C(NH₂) = CHR).
Für weitere Informationen über die Synthese von Peptiden, die exotische Aminosäuren beinhalten, siehe:

1. Bielfeldt, T., Peters, S., Meldal, M., Bock, K. und Paulsen, N.A. New Strategy for solid-phase synthesis of O-glycopeptides. Angew. Chem. (Engl.) 31:857-859, 1992.
2. Gurjar, M.K. und Saha, U.K. Synthesis of the glycopeptide-O-(3,4-di-O-methyl-2,0-[3,4-di-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl]-α-L-rhamnopyranosyl)-L-alanilol: An unusual part structure in the glycopeptidolipid of Mycobaterium fortuitum. Tetrahedron 48:4039-4044, 1992.
3. Kessler, H., Wittmann, V., Kock, M. und Kottenhahn, M. Synthesis of C-glycopeptides via free radical addition of glycosyl bromides to dehydroalanine derivatives. Angew. Chem. (Engl.) 31:902-904, 1992.
4. Kraus J.L. und Attardo, G. Synthesis and biological activities of new N-formylated methionyl peptides containing an α-substituted glycine residue. European Journal of Medicinal Chemistry 27:19-26, 1992.
5. Mhaskar, S.Y. Synthesis of N-lauroyl dipeptides and correlation of their structure with surfactant and antibacterial properties. J. Am. Oil Chem. Soc. 69:647-652, 1992.
6. Moree, W.J., Van der Marel, G.A. und Liskamp, R.M.J. Synthesis of peptides containing the β-substituted aminoethane sulfinamide or sulfonamide transitionstate isostere derived from amino acids. Tetrahedron Lett. 33:69-6392, 1992.
7. Paquet, A. Further Studies on the use of 2,2,2-trichloroethyl groups for phosphate protection in phosphoserine peptide synthesis. International Journal of Peptide and Protein Research 39:82-86, 1992.
8. Sewald, N., Riede, J., Bissinger, P. und Burger, K. A new convenient synthesis of 2-trifluoromethyl substituted aspartic acid and its isopeptides. Part 11. Journal of the Chemical Society. Perkin Transactions 1 1992:267-274, 1992.
9. Simon, R.J., Kania, R.S., Zuckermann, R.N., Huebner, V.D., Jewell, D.A., Banville, S., Ng, S., Wang, L., Rosenberg, S., Marlowe, C.K., Spellmeyer, D.C., Tan, R., Frankel, A.D., Santi, D.V., Cohen, F.E. und Bartlett, P.A. Peptoids: A modular approach to drug discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371, 1992.
10. Tung, C.-H., Zhu, T., Lackland, N. und Stein, S. An acridine amino acid derivative for use in Fmoc peptide synthesis. Peptide Research 5:115-118, 1992.
11. Elofsson, M. Building blocks for glycopeptide synthesis: Glycosylation of 3-mercaptopropionic acid and Fmoc amino acids with unprotected carboxyl groups. Tetrahedron Lett. 32:7613-7616, 1991.
12. McMurray, J.S. Solid phase synthesis of a cyclic peptide using Fmoc chemistry. Tetrahedron Letters 32:7679-7682, 1991.
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15. Elofsson, M., Walse, B. und Kihlberg, J. Building blocks for glycopeptide synthesis: Glycosylation of 3-mercaptopropionic acid and Fmoc amino acids with unprotected carboxyl groups. Tetrahedron Letter, 32:7613-7616, 1991.
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20. Gerz, M., Matter, H. und Kessler H., S-glycosylated cyclic peptides, Angew. Chem. (Engl.) 32:269-271, 1993.

Cyclische Peptide
Viele natürlich auftretenden Peptide sind cyclisch. Die Cyclisierung ist ein geläufiger Mechanismus für die Stabilisierung von Peptidkonformationen, wodurch eine verbesserte Assoziation des Peptids mit seinem Liganden und dadurch eine verbesserte biologische Aktivität erreicht wird. Die Cyclisierung wird normalerweise durch eine Cystinbildung zwischen den Ketten, durch Bildung von Peptidbindungen zwischen den Seitenketten oder zwischen den N- und C-Termini erreicht. Die Cyclisierung wurde normalerweise durch Peptide in Lösung erreicht, aber verschiedene Publikationen sind kürzlich erschienen, die die Cyclisierung von Peptiden auf Beads beschreiben (siehe Referenzen hierunter).

1. Spatola, A.F., Anwer, M.K. und Rao, M.N. Phase transfer catalysis in solid phase peptide synthesis. Preparation of cycle [Xxx-Pro-Gly-Yyy-Pro-Gly] model peptides and their conformational analysis. Int. J. Pept. Protein Res. 40:322-332, 1992.
2. Tromelin, A., Fulachier, M.-H., Mourier, G. und Menez, A. Solid phase synthesis of a cyclic peptide derived from a curaremimetic toxin. Tetrahedron Lett. 33:5197-5200, 1992.
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6. McMurray, J.S. Solid phase synthesis of a cyclic peptide using Fmoc chemistry. Tetrahedron Letters 32:7679-7682, 1991.
7. Rovero, P. Synthesis of cyclic peptides on solid support. Tetrahedron Letters 32:2639-2642, 1991.
8. Yajima, X. Cyclization on the bead via following Cys Acm deprotection. Tetrahedron 44:805, 1988.

Peptoid
Ein Peptoid ist ein Analogon eines Peptids, in welchem ein oder mehrere der Peptidbindungen durch Pseudopeptidbindungen ersetzt worden sind, welche gleich oder unterschiedlich sein können.
Solche Pseudopeptidbindungen können sein:
Carba Ψ(CH₂-CH₂)
Depsi Ψ(CO-O)
Hydroxyethylen Ψ(CHOH-CH₂)
Ketomethylen Ψ(CO-CH₂)
Methylen-ocy CH₂-O
reduziertes CH₂-NH
Thiomethylen CH₂-S-
Thiopeptid CS-NH
N-modifiziertes -NRCO-
Siehe auch:

1. Corringer, P.J., Weng, J.H., Ducos, B., Durieux, C., Boudeau, P., Bohme, A. und Roques, B P. CCK-B agonist or antagonist activities of structurally hindered and peptidase-resistant Boc-CCK₄ derivatives. J. Med. Chem. 36:166-172, 1993. Amino acids reported: aromatic naphthylalaninimide (Nal-NH2); N-methyl amino acids.
2. Beylin, V.G., Chen, H.G., Dunbar, J., Goel, O.P., Harter, W., Marlatt, M. und Topliss, J.G. Cyclic derivatives of 3,3-diphenylalanine (Dip) (II), novel α-amino acids for peptides of biological interest. Tetrahedron Lett. 34:953-956, 1993.
3. Garbay-Jaureguiberry, C., Ficheux, D. und Roques, B.P. Solid phase synthesis of peptides containing the non-gydrolysable analog of (O)phosphotyrosine, p(CH₂PO₃H₂)Phe. Application to the synthesis of 344-357 sequences of the β₂ adrenergic receptor. Int. J. Pept. Protein Res. 39:523-527, 1992.
4. Lüning, B., Norberg, T. und Tejbrant, J. Synthesis of glycosylated amino acids for use in solid phase glycopeptide synthesis, part 2: N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-3-O-[2,4,6-tri-O-acetyl-3-O-(2,3-,4-tri-O-acetyl-α-D-xylopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-L]serine. J. Carbohydr. Chem. 11:933-943, 1992.
5. Tung, C.H., Zhu, T., Lackland, H. und Stein, S. An acridine amino acid derivative for use in Fmoc peptide synthesis. Peptide Research 5:115-118, 1992.
6. Eric Frerot, PyBOP and PyBroP: Two reagents for the difficult coupling of the alpha,alpha-dialkyl amino acid Aib. Tetrahedron 47:259-270, 1991.
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10. Pavone, V., DiBlasio, B., Lombardi, A., Maglio, O., Isernia, D., Pedone, C., Benedette, E., Altmann, E. und Mutter, M. Non coded C^α,α-disubstituted amino acids. X-ray diffraction analysis of a dipeptide containing (S)-α-methylserine. Int. J. Pept. Protein Res. 41:15-20, 1993.
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Peptidomimetika
Ein Peptidomimetikum ist ein Molekül, welches die biologische Aktivität eines Peptids dadurch mimt, dass es im Wesentlichen den pharmakologisch relevanten Teil der Konformation des Peptids dupliziert, aber selbst kein Peptid oder Peptoid wie oben definiert ist. Vorzugsweise haben die Peptidomimetika ein Molekulargewicht von weniger als 700 Dalton.
Das Design eines Peptidomimetikums verläuft normalerweise wie folgt:

(a) Identifizieren der pharmakophoren Gruppen, die für die Aktivität verantwortlich sind;
(b) Bestimmen der räumlichen Anordnungen der pharmakophoren Gruppen in der aktiven Konformation des Peptids; und
(c) Auswählen eines pharmazeutisch akzeptablen Templates, auf welchem die pharmakophoren Gruppen auf eine Art und Weise angebracht werden können, welche es ihnen erlaubt, ihre räumliche Anordnung in der aktiven Konformation des Peptids zu erhalten.

Schritt (a) kann durch Herstellen von Mutanten des aktiven Peptids und durch Bestimmen der Wirkung der Mutation auf die Aktivität ausgeführt werden. Man kann ebenso die 3D-Struktur eines Komplexes aus dem Peptid und dem Rezeptor zum Nachweis von Interaktionen untersuchen (z. B. der Passgenauigkeit einer Seitenkette des Peptids in eine Spalte am Rezeptor; potentielle Orte für die Bildung von Wasserstoffbrücken usw.)
Schritt (b) beinhaltet im Allgemeinen das Bestimmen der 3D-Struktur des aktiven Peptids in dem Komplex durch NMR-Spektroskopie oder durch Röntgenstrukturanalyse. Das ursprüngliche 3D-Modell kann durch eine Energieminimierung und durch eine Simulation der molekularen Beweglichkeit verbessert werden.
Schritt (c) kann unter Bezugnahme auf eine Templatedatenbank ausgeführt werden, siehe Wilson et al., Tetrahedron, 49:3655-63 (1993). Die Templates werden typischerweise das Anbringen von 2-8 Pharmakophoren erlauben und sie werden eine relativ steife Struktur haben. Aus dem letzteren Grund sind aromatische Strukturen, so wie Benzol, Biphenyl, Phenanthren und Benzodiazepin, bevorzugt. Für orthogonale Schutztechniken siehe Tuchscherer et al., Tetrahedron, 17:3559-75 (1993).
Für weitere Informationen über Peptoide und Peptidomimetika siehe USP 5,811,392, USP 5,811,512, USP 5,578,629, USP 5,817,879, USP 5,817,757, USP 5,811,515.
Analoga
Ebenso von Interesse sind Analoga der offenbarten Peptide und andere Verbindungen mit einer Aktivität von Interesse.
Analoga können durch die Zuordnung eines "hashed bitmap"-strukturellen Fingerprints zu der Verbindung identifiziert werden, basierend auf dessen chemischer Struktur, und durch Bestimmen der Ähnlichkeit dieses Fingerprints mit dem Fingerprint jeder Verbindung in einer breiten chemischen Datenbank. Die Fingerprints werden durch die Fingerprintsoftware bestimmt, die für diesen Zweck durch Daylight Chemical Information Systems, Inc. kommerziell vertrieben wird, gemäß der aktuellen Softwareausgabe vom 8. Januar 1999. Zusammengefasst bildet dieser Algorithmus ein Bitmuster für jedes Atom und für dessen nächste Nachbarn, wobei die Pfade bis zu 7 Bindungen lang sind. Jedes Muster dient als Kern für einen Pseudozufallszahlengenerator, dessen Ergebnis ein Bitsatz ist, welcher logisch mit dem sich entwickelnden Fingerprint verbunden ist. Dieser Fingerprint kann fixiert sein, oder er kann eine variable Größe aufweisen.
Die Datenbank kann die Folgende sein: SPRESI'95 (InfoChem GmbH), Index Chemicus (ISI), MedChem (Pomona/Biobyte), World Drug Index (Derwent), TSCA93 (EPA), Maybridge organic chemical catalog (Maybridge), Available Chemicals Directory (MDLIS Inc.), NCl96 (NCl), Asinex catalog of organic compounds (Asinex Ltd.) oder IBIOScreen SC und NP (Inter BioScreen Ltd.), oder eine Inhouse-Datenbank.
Eine Verbindung ist ein Analogon einer Referenzverbindung, wenn sie einen Tageslicht-Fingerprint mit einer Ähnlichkeit (Tanamoto-Koeffizient) von wenigstens 0,85 zu dem Tageslicht-Fingerprint der Referenzverbindung aufweist.
Eine Verbindung ist ebenso ein Analogon einer Referenzverbindung, wenn sie konzeptuell von der Referenzverbindung durch isostere Ersetzungen abgeleitet werden kann.
Homologe sind Verbindungen, welche durch eine Steigerung oder eine Absenkung der Zahl der Methylengruppen in einem Alkylrest differieren.
Klassische Isostere sind diejenigen, welche der Erlenmeyer-Definition entsprechen: "Atome, Ionen oder Moleküle, bei welchen die peripheren Elektronenschichten als identisch angesehen werden können." Klassische Isostere beinhalten:
Nichtklassische isostere Paare beinhalten -CO- und -SO₂-, -COOH und -SO₃H, -SO₂NH₂ und -PO(OH)NH₂, -H und -F, -OC(=O)- und C(=O)O-, -OH und -NH₂.
Pharmazeutische Verfahren und Präparationen
Das bevorzugte tierische Subjekt der vorliegenden Erfindung ist ein Säugetier. Mit dem Begriff "Säugetier" ist ein Individuum gemeint, das zu der Klasse Mammalia gehört. Die Erfindung ist insbesondere nützlich bei der Behandlung von humanen Subjekten, auch wenn sie ebenso für die Verwendung in der Tiermedizin vorgesehen ist. Bevorzugte nichthumane Subjekte sind die der Ordnung der Primaten (z. B. Menschenaffen und Affen), Artiodactyla oder Perissodactyla (z. B. Kühe, Schweine, Schafe, Pferde, Ziegen), Carnivora (z. B. Katzen, Hunde), Rodenta (z. B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, Hamster), Lagomorpha (z. B. Kaninchen) oder andere Haustier-, Farm- oder Laborsäugetiere.
Der Begriff "Schutz", wie hierin verwendet, ist dazu vorgesehen, die Begriffe "Vorbeugung", "Unterdrückung" und "Behandlung" zu beinhalten. "Vorbeugung" beinhaltet die Verabreichung des Proteins vor der Induktion der Erkrankung (oder anderer abträglicher klinischer Zustände). "Unterdrückung" beinhaltet die Verabreichung der Zusammensetzung vor dem klinischen Auftreten der Erkrankung. "Behandlung" beinhaltet die Verabreichung der schützenden Zusammensetzung nach dem Auftreten der Erkrankung.
Es wird verstanden werden, dass in der humanen und in der Veterinärmedizin es nicht immer möglich ist, zwischen "Vorbeugen" und "Unterdrücken" zu unterscheiden, da das ultimative induktive Ereignis oder die Ereignisse unbekannt sein können, latent sein können oder der Patient wird erst deutlich nach dem Auftreten des Ereignisses oder der Ereignisse diagnostiziert wird. Daher ist es gewöhnlich, den Begriff "Prophylaxe" als verschieden von "Behandlung" zu verwenden, so dass er sowohl das "Vorbeugen" als auch das "Unterdrücken" umfasst, die hierin definiert sind. Der Begriff "Schutz", wie er hierin verwendet wird, beinhaltet "Prophylaxe". Es sollte ebenso verstanden werden, dass, um nützlich zu sein, der zur Verfügung gestellte Schutz nicht absolut sein muss, vorausgesetzt, dass er ausreichend ist, einen klinischen Wert zu haben. Ein Mittel, welches Schutz in einem geringeren Ausmaß zur Verfügung stellt als kompetitive Mittel, kann immer noch wertvoll sein, wenn andere Mittel für ein bestimmtes Individuum nicht effektiv sind, wenn es in Kombination mit anderen Mitteln verwendet kann, um das Niveau des Schutzes zu erhöhen, oder wenn es sicherer ist als Mittel, die mit ihm im Wettbewerb stehen. Ein Medikament kann eine heilende Wirkung, eine abschwächende Wirkung oder beides haben.
Wenigstens eines der Medikamente der vorliegenden Erfindung kann durch jedes Mittel verabreicht werden, das den vorgesehenen Zweck erreicht, ein Subjekt gegen eine Erkrankung oder gegen einen anderen nachteiligen Zustand zu schützen. Die Form der Verabreichung kann systemisch oder topisch sein. Beispielsweise kann die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung auf verschiedenen parenteralen Wegen erfolgen, so wie subkutan, intravenös, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, transdermal oder bukkal. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Weg erfolgen. Die parenterale Verabreichung kann durch eine Bolusinjektion oder durch eine graduelle Perfusion mit der Zeit ausgeführt werden.
Ein typischer Rahmen umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Medikaments, die über eine Periode verabreicht wird, die von einer einzelnen Dosis bis zur einer Dosierung über eine Zeitperiode von Stunden, Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren dauern kann.
Es muss verstanden werden, dass die geeignete Dosierung eines Medikaments der vorliegenden Erfindung von dem Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der gleichzeitig erfolgenden Behandlung, wenn eine solche vorliegt, der Häufigkeit der Behandlung und der Natur der gewünschten Wirkung abhängt. Jedoch kann die am meisten bevorzugte Dosierung an das individuelle Subjekt angepasst werden, wie es von Fachleuten verstanden wird und von ihnen bestimmbar ist, ohne dass hierbei nicht angemessenes Herumexperimentieren erforderlich ist. Dies wird typischerweise die Anpassung einer Standarddosis beinhalten, z. B. die Reduktion der Dosis, wenn der Patient ein niedriges Körpergewicht hat.
Vor der Verwendung bei Menschen wird eine Medikament zunächst hinsichtlich der Sicherheit und der Wirksamkeit bei Labortieren bewertet werden. Bei klinischen Studien mit Menschen würde man mit einer Dosis beginnen, von der erwartet wird, dass sie in Menschen sicher ist, basierend auf den präklinischen Daten für das fragliche Medikament und auf gewöhnlichen Dosierungen für analoge Medikamente (wenn es soilche gibt). Wenn diese Dosis wirksam ist, kann die Dosierung abgesenkt werden, um die minimal wirksame Dosis zu bestimmen, wenn dies erwünscht ist. Wenn diese Dosis ineffektiv ist , wird sie vorsichtig erhöht, wobei die Patienten hinsichtlich Zeichen von Nebenwirkungen überwacht werden. Siehe z. B. Berkow et al., Hrsg., The Merck Manual, 15. Ausgabe, Merck und Co., Rahway N.J., 1987, Goodman et al., Hrsg., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Ausgabe, Pergamon Press, Inc. Elmsford, N.Y., (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3. Ausgabe, ADIS Press, LTD., Wllliams und Wilkins, Baltimore, MD. (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown und Co., Boston, (1985), wobei auf die hierin zitierten Druckschriften und die darin zitierten Druckschriften vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die gesamte Dosis, die für jede Behandlung erforderlich ist, kann in mehreren Dosen oder in einer einzelnen Dosis verabreicht werden. Das Protein kann allein oder in Verbindung mit anderen Therapeutika verabreicht werden, die auf die Erkrankung gerichtet sind oder die auf andere Symptome der Erkrankung gerichtet sind.
Die entsprechende Dosierungsform wird von der Erkrankung, dem Protein und der Art der Verabreichung abhängen; Möglichkeiten beinhalten Tabletten, Kapseln, Zäpfchen, Dentalpasten, Pastillen, Inhaliermittel, Lösungen, Tinkturen und parenterale Depots. Siehe z. B. Berker, supra, Goodman, supra, Avery, supra und Ebadi, supra, auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, sowie auf die darin zitierten Referenzen, auf die ebenfalls vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Im Fall von Peptidmedikamenten kann das Medikament in der Form eines Expressionsvektors verabreicht werden, der eine Nukleinsäure enthält, die für das Peptid codiert, so wie ein Vektor, der nach der Miteinbeziehung in das genetische Komplement einer Zelle des Patienten die Synthese des Peptids dirigiert (wobei solch ein Vektor nach der Miteinbeziehung einer Zelle des Patienten in das genetische Komplement die Synthese des Peptids dirigiert). Geeignete Vektoren beinhalten genetisch hergestellte Poxviren (Vaccinia), Adenoviren, adenoassoziierte Viren, Herpesviren und Lentiviren, welche nicht pathogen sind oder welche nicht-pathogen gemacht wurden.
Zusätzlich zu wenigstens einem Medikament, das hierin beschrieben ist, kann eine pharmazeutische Zusammensetzung geeignete pharmazeutische Träger enthalten, so wie Hilfsstoffe, Träger und/oder Ergänzungsstoffe, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen in Präparationen erleichtern, welche pharmazeutisch verwendet werden können. Siehe z. B. Berker, supra, Goodman, supra, Avery, supra und Ebadi, supra.
Antikrebsanwendbarkeit
Eine Anwendbarkeit von gewissen ER-bindenden Peptiden der vorliegenden Erfindung und von verwandten Peptoiden, Peptidomimetika und Analoga und von Verbindungen, die als durch fingerprints als empfindlich für die Interaktion von solchen Peptiden mit ER eingeschätzt wurden, liegt darin, die Tamoxifenwiderstandskraft beim Brustkrebs zu umgehen.
Es wird gegenwärtig geschätzt, dass das lebenslange Risiko unter amerikanischen Frauen, mit Brustkrebs diagnostiziert zu werden, etwa ein Achtel beträgt. Auch wenn diese Zahl eine Verdoppelung der Häufigkeit dieser Erkrankung über die letzten fünfzig Jahre darstellt, wird sie durch die Beobachtung ins Gleichgewicht gerückt, dass die Mortalität von dieser Krankheit leicht in derselben Zeitperiode abgenommen hat. In dem kürzlichen NSAPB-B14-Versuch wurde demonstriert, dass der Anteil der Brustkrebspatienten, die 10 Jahre überlebten, die zum Zeitpunkt der Diagnose keine Knoten mehr aufwiesen, über 80 % betrug. Es ist wahrscheinlich, dass diese günstige Antwort zum großen Teil an Fortschritten bei der Früherkennung liegt, was die Wirkung hatte, dass die Anzahl der Frauen, die metastatische Erkrankungen aufwiesen, dies nun eher im früheren Stadium der Erkrankungen tun, indem die Erkrankungen leichter zu behandeln sind. Zusätzlich zur Früherkennung hatte die strategische Verwendung des Antiestrogens Tamoxifen für die Behandlung von metastatischen Erkrankungen und als Adjuvanschemotherapeutikum eine positive Wirkung auf das Überleben von Brustkrebspatienten. Einer der dramatischsten positiven Effekte von Tamoxifen ist, dass es das Auftreten von kontralateralen primären Tumoren in Patienten um über 50 % reduziert. Es war diese Erkenntnis, kombiniert mit den Ergebnissen des NSABP-P1-Chemovorbeugungsversuchs, was kürzlich zu der Zulassung von Tamoxifen für die Verwendung als Brustkrebschemopräventatives Mittel bei Frauen geführt hat, die ein erhöhtes Risiko zum Entwickeln von Brustkrebs aufweisen. Eindeutig ist Tamoxifen ein extrem erfolgreiches Pharmazeutikum. Wie bei den meisten Medikamenten nimmt jedoch die Wirksamkeit von Tamoxifen als chemotherapeutisches Mittel mit der Zeit ab. Im metastatischen Umfeld wurde beobachtet, dass die meisten Brustkrebse, die auf Tamoxifen antworten, schließlich gegen dessen antiestrogene Wirkungen resistent werden. Ein Absenken der Wirksamkeit mit der Zeit in der Adjuvansumgebung wird ebenso durch die Resultate des NSABP-B14-Versuches bestätigt, welcher zeigte, dass der gesamte Überlebensanteil der Brustkrebspatienten, die Tamoxifen 10 Jahre lang genommen hatten, nicht besser war und letztlich sogar schlechter war als bei Frauen, die dieses Medikament nur fünf Jahre lang genommen hatten. Das letztere Ergebnis hat zu der Vermutung geführt, dass die Tumore in Patienten, denen Tamoxifen für ausgediente Zeitperioden verabreicht wurde, ihre Fähigkeit verlieren könnten, dieses Medikament als Antiestrogen wahrzunehmen, und sich tatsächlich auf eine Art und Weise ändern könnten, so dass sie auf dieses Medikament wie auf Estrogen anspringen. Die Beobachtung, dass einige Patienten eine Entzugsantwort aufzeigen, wenn die Tamoxifenverabreichung nicht fortgeführt wird, unterstützt diese Hypothese. Konsequenterweise gab es eine enorme Menge an Interesse am Verständnis des Mechanismus, durch welchen Brusttumore Tamoxifen umgehen, um durch die Anwendung dieses Wissens, die Entwicklung von neuen Antiestrogenen mit verbesserten therapeutischen Benefits zu unterstützen.
Vor einigen Jahren wurde es als unwahrscheinlich angesehen, dass der Estrogenrezeptor (ER) ein nützliches Target in den Zellen sein könnte, welche Tamoxifen umgangen haben. Jedoch hat das Auftreten von reinen Antiestrogenen, so wie ICI182,780, welche erfolgreich verwendet wurden, um Tamoxifen-refraktorische Brustkrebse zu behandeln, ER als Target in diesem Stadium der Erkrankung validiert.
Jedoch, da sie die Estrogenwirkung nicht selektiv in allen Zielorganen blockieren, werden sie eine negative Wirkung auf die skelettalen und kardiovaskulären Systeme haben und werden konsequenterweise für die Verwendung als Adjuvanschemocherapeutika nicht geeignet sein. Es gibt daher einen medizinischen Bedarf an neuen Antiestrogenen, welche mechanistisch von Tamoxifen in der Brust verschieben sind, aber welche die positive estrogene Wirkung von Tamoxifen bei der Bindung und im Kardiovaskulärsystem behalten, dem bisher nicht entsprochen wurde.
Tamoxifen wurde ursprünglich als Antiestrogen entwickelt, welches verwendet werden konnte, um die Wirkung von Estrogen auf dem Rezeptorniveau bei Brustkrebszellen zu blockieren. Somit wurde allgemein vermutet, dass die Widerstandsfähigkeit gegen dieses Mittel als eine Konsequenz von ER-Mutationen, als selektive Extrusion der Verbindung aus Zellen oder als ein Ergebnis des Inaktivierens von metabolischen Prozessen auftrat. Jedoch scheint es nun, dass diese Mechanismen nur die Tamoxifenresistenz bei einem kleinen Prozentsatz der Fälle erklären. Andere Mechanismen werden nun in Erwägung gezogen. Wir favorisieren ein Modell, bei welchem epigenetische Veränderungen innerhalb von Targetzellen auftreten, die deren Fähigkeit beeinträchtigen, Tamoxifen als Antagonist zu erkennen, und die es den Zellen tatsächlich ermöglichen können, das Medikament als estrogenen Liganden wahrzunehmen. Diese Hypothese stammt aus der Beobachtung, dass Tamoxifen tatsächlich ein selektiver Estrogenrezeptormodulator (SERM) ist, welcher als ein ER-Antagonist oder als Agonist fungieren kann, abhängig von dem Zellhintergrund, welcher studiert wird. Daher vermuten wir, dass in der Brust der selektive Druck von Tamoxifen das Auswachstum einer Zellpopulation durch Anpassung oder Auswahl fördert, welche Tamoxifen als Agonist erkennt. Konsequenterweise haben wir und andere unsere Arbeit auf das Definieren der molekularen Basis der zellselektiven Wirkungen von Tamoxifen und von anderen SERMs fokussiert, wobei wir versuchen, die Tamoxifenresistenz und die letztendliche Entwicklung von neuen Antiestrogenen zu verstehen. Diese Studien haben ergeben, dass nach dem Binden des Liganden ER eine konformationale Änderung unterläuft, deren Natur durch die Struktur des gebundenen Liganden beeinflusst wird. Die Signifikanz dieser konformationalen Veränderungen ergab sich, als bestimmt wurde, dass ER zwei Aktivierungsdomänen enthält, AF-1, angeordnet am Aminoterminus, und AF-2, enthalten innerhalb der Homonbindedomäne, deren Aktivität durch den Zell- als auch durch den Promotorkontext beeinflusst wird. In den meisten Fällen sind beide AFs für die maximale transkriptionale Aktivität erforderlich. Dementsprechend wurde gezeigt, das Estradiol als ER-Agonist in allen Zellen fungiert, da es die Interaktion von beiden AFs mit dem Transkriptionsapparat vereinfacht. Es wurde nun bestimmt, dass Tamoxifen die ER-Struktur auf eine Art und Weise verändert, welche die AF-2-Funktion inhibiert. Somit manifestiert Tamoxifen eine antagonistische Aktivität in allen Kontexten, bei denen AF-2 erforderlich ist. In Zellkontexten, wo AF-1 alleine für die ER-transkriptionale Aktivität ausreichend ist, haben wir bestimmt, dass Tamoxifen als teilweiser Agonist fungieren kann. Diese Erkenntnis führte uns zu der Hypothese, dass die rückständige agonistische Aktivität von Tamoxifen, beobachtet in AF-1-dominanten Umgebungen, mit dem Versagen dieses Medikaments als ein Antiestrogen bei Brustkrebs verbunden sein könnte. Somit haben wir nach Verbindungen gesucht, welche AF-1 nicht aktivierten, und haben deren Fähigkeit bewertet, die partielle agonistische Aktivität des Tamoxifens zu inhibieren. Diese Arbeit führte zu der Entdeckung eines neuen Antiestrogens, GW5638, welches, wenn es im Rahmen eines Assays in vitro überprüft wird, die partielle agonistische Aktivität des Tamoxifens unter allen untersuchten Bedingungen inhibiert und wirksam das Wachstum von MCF-7-Zellheterotransplantaten in A-thymischen Nacktmäusen inhibierte. Aufgrund dieser Eigenschaften wird GW5638 in Kürze in die klinischen Versuche eintreten, um bei der Behandlung von Tamoxifen-refraktorischen Brustkrebsen bewertet zu werden.
Eine der überraschenden Eigenschaften des neuen Antiestrogens, GW5638, ist es, dass, obwohl es keine AF-1- und AF-2-agonistische Aktivität aufweist, es nicht ein reiner Antagonist ist, wenn es im Rahmen eines Assays in vivo überprüft wird. Anders als Tamoxifen zeigt GW5638 keine uterotrophe Aktivität auf. Jedoch, wie Tamoxifen, funktioniert es als Estrogen im Knochen und im Kardiovaskulärsystem. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Fähigkeit, AF-1 und AF2 differenziert zu aktiveren, wichtig sein könnte, aber dass die Pharmakologie dieser Klasse von Antiestrogenen komplexer ist, als wir erwartet hatten. Konsequenterweise haben wir uns kürzlich auf das Definieren der molekularen Mechanismen konzentriert, mit welchen Zellen zwischen Tamoxifen und GW5638 unterscheiden. Auch wenn diese Studie noch nicht abgeschlossen ist, hat sie zu der Entwicklung einer neuen Herangehensweise geführt, die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen zu inhibieren. Spezifisch unter Verwendung von Phagendisplaytechnologie haben wir kleine Peptide identifiziert, deren Wechselwirkung mit ER durch die Natur des gebundenen Liganden beeinflusst wird. Peptide wurden gefunden, welche mit ER in der Gegenwart von irgendeinem Liganden, in der Gegenwart von irgendeinem Agonisten, in der Gegenwart von irgendeinem Antagonisten interagieren, und, noch wichtiger, wir haben Peptide identifiziert, welche mit ER nur in der Gegenwart von Tamoxifen interagieren. Bezüglich der Entwicklung von Strategien, um Tamoxifen-refraktorische Brustkrebse zu behandeln, sind die letzteren Peptide am interessantesten, da wir in vitro gezeigt haben, dass diese Peptide effizient die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen inhibieren. Das Zuordnen dieser Orte auf dem ER, mit welchem diese Peptide interagieren, wird bei der Bestimmung helfen, wenn sie spezifische Coaktivatorinteraktionen mimen. Nichtsdestotrotz hat diese Arbeit verschiedene unterschiedliche Orte auf dem ER identifiziert, die als Ziele für neue Medikamentenentdeckungen dienen werden. Auch wenn Peptide nicht allgemein als gute Ausgangsorte für die Medikamentenentwicklung dienen, gab es eine enorme Menge an Fortschritt beim Entwickeln von kleinen Molekülen, welche Protein-Protein-Interaktionen modulieren. Konsequenterweise sind wir gegenwärtig dabei, nach kleinen Molekülen zu suchen, welche mit den Zielorten interagieren, die durch die neuen Peptide impliziert werden, und sind zusätzlich dabei, kleinere Peptide zu definieren, welche selbst als Medikamente geeignet sein könnten, wenn sie geeignet formuliert werden.
Bindendes Molekül
Für die Zwecke der Diskussion von diagnostischen Verfahren und Mitteln, welche folgt, ist das "bindende Molekül" das Peptid, Peptoid oder Peptidomimetikum der vorliegenden Erfindung. Der Analyt ist ein Targetprotein.
Diagnostische in vitro Verfahren und Reagenzien
Die in vitro-Assays der vorliegenden Erfindung können auf irgendeine geeignete Analyt-enthaltende Probe angewendet werden und können eine qualitative oder eine quantitative Natur besitzen. Um die Gegenwart eines Analyten zu detektieren oder um dessen Menge zu messen, muss der Assay ein signalproduzierendes System (SPS) zur Verfügung stellen, bei welchem es einen detektierbaren Unterschied beim produzierten Signal gibt, abhängig davon, ob der Analyt vorhanden ist oder abwesend ist (oder, bei quantitativen Assays, von der Menge des Analyten). Das detektierbare Signal kann eines sein, welches visuell detektierbar ist oder welches nur mit Instrumenten detektierbar ist. Geeignete Signale beinhalten die Produktion von gefärbten oder lumineszierenden Produkten, die Veränderung der Eigenschaften (einschließlich der Amplitude oder der Polarisierung) der Absorption oder der Emission von Strahlung durch einen Assaybestandteil oder durch ein Produkt und die Präzipitierung oder die Agglutinierung eines Bestandteils oder eines Produkts. Der Begriff "Signal" beinhaltet das nicht weitere Fortbestehen eines existierenden Signals oder eine Veränderung des Anteils einer Veränderung eines beobachtbaren Parameters, eher als eine Veränderung von dessem absoluten Wert . Das Signal kann manuell oder automatisch überwacht werden.
Der Bestandteil des signalproduzierenden Systems, welches eng mit dem diagnostischen Reagens verbunden ist, wird "Marker" genannt. Ein Marker kann beispielsweise sein ein Radioisotop, ein Fluorophor, ein Enzym, ein Coenzym, ein Enzymsubstrat, eine elektronendichte Verbindung, ein agglutinierbares Partikel sein.
Ein diagnostisches Reagens ist ein Konjugat, direkt oder indirekt, oder kovalent oder nichtkovalent, eines Markers mit einem bindenden Molekül der Erfindung.
Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel wie die Verwendung eines Gammastrahlenzählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie detektiert werden. Isotope, welche für den Zweck der vorliegenden Erfindung besonders nützlich sind, sind ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ¹⁴C und vorzugsweise ¹²⁵I.
Es ist ebenso möglich, eine Verbindung mit einer fluoreszenten Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszent markierte Antikörper Licht mit einer entsprechenden Wellenlänge ausgesetzt wird, kann dessen Gegenwart aufgrund von Fluoreszenz detektiert werden. Unter den am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Markierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Alternativ können fluoreszenzemittierende Metalle, so wie ¹²⁵EU oder andere der Lanthanoidgruppe, an das bindende Protein unter Verwendung von solchen metallchelatierenden Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) angebracht werden.
Die bindenden Moleküle können durch das Koppeln an eine chemilumineszente Verbindung detektierbar markiert sein. Die Gegenwart der chemilumineszenten Verbindung wird dann durch das Detektieren der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt, die während des Verlaufs einer chemischen Reaktion, nachdem ein geeigneter Reaktant zur Verfügung gestellt wurde, auftritt. Beispiele von besonders nützlichen chemilumineszenten Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Auf ähnliche Weise kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um das bindende Molekül zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen gefunden wird, bei welchen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird durch das Detektieren der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente Verbindungen für die Zwecke des Markierens sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Enzymmarker, so wie Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase, sind bevorzugt. Wenn ein enzymatischer Marker verwendet wird, muss das signalproduzierende System ebenso ein Substrat für das Enzym beinhalten. Wenn das enzymatische Reaktionsprodukt nicht selbst detektierbar ist, wird das SPS ein oder mehrere zusätzliche Reaktanten enthalten, so dass ein detektierbares Produkt erscheint.
Die Assays können in zwei grundsätzlich unterschiedliche Typen unterteilt werden, heterogene und homogene Assays. Bei heterogenen Assays beeinflusst die Interaktion des Affinitätsmoleküls und des Analyten den Marker nicht, und daher muss der gebundene Marker von dem freien Marker getrennt werden, um die Menge oder die Gegenwart eines Analyten zu bestimmen. Bei homogenen Assays beeinflusst die Wechselwirkung die Aktivität des Markers und daher können Analytniveaus ohne das Erfordernis des Abtrennungsschrittes abgeleitet werden.
Im Allgemeinen kann das Target-bindende Molekül der vorliegenden Erfindung diagnostisch auf dieselbe Art und Weise verwendet werden, wie ein Target-bindender Antikörper verwendet wird. Somit kann es abhängig von dem Assayformat verwendet werden, um das Target durch einen Assay zu überprüfen, oder um ihm Rahmen einer kompetitiven Inhibition andere Substanzen zu prüfen, welche an das Target binden. Die Probe wird normalerweise ein biologisches Fluid sein, so wie Blut, Urin, Lymphflüssigkeit, Sperma, Milch oder Cerebrospinalfluid, oder eine Fraktion oder ein Derivat davon, oder ein biologisches Gewebe in der Form von z. B. einem Gewebeabschnitt oder einem Homogenat. Jedoch könnte die Probe ebenso ein Nahrungsmittel oder ein Getränk, eine pharmazeutische oder eine diagnostische Zusammensetzung, ein Boden, Oberflächen- oder Grundwasser (oder ein Derivat von diesen) sein. Wenn sie ein biologisches Fluid oder ein Gewebe ist, kann sie einem Menschen oder einem anderen Säugetier, Wirbeltier oder einem Tier oder aus einer Pflanze entnommen werden. Die bevorzugte Probe ist Blut oder ein Teil oder Derivat davon.
In einer Ausführungsform wird das bindende Molekül dadurch unlöslich gemacht, dass es an einen makromolekularen Träger gekoppelt wird, und dem Target in der Probe wird es erlaubt, mit einer bekannten Menge eines markierten oder spezifisch markierbaren Targetanalogons in Wettbewerb zu treten. (Das Konjugat des bindenden Moleküls an einen makromolekularen Träger ist ein weiteres diagnostisches Mittel innerhalb der vorliegenden Erfindung.) Das "Targetanalogon ist ein Molekül, das in der Lage ist, mit dem Target hinsichtlich dessen Bindung an das bindende Molekül in Wettbewerb zu treten, und der Begriff ist so vorgesehen, dass er das Target selbst beinhaltet. Es kann bereits markiert sein oder es kann anschließend durch spezifisches Binden des Markers an einen Rest markiert werden, wodurch das Targetanalogon vom authentischen Target unterschieden wird. Die festen oder flüssigen Phasen werden getrennt und das markierte Targetanalogon in einer Phase wird quantifiziert. Je höher das Niveau des Targetanalogons in der festen Phase ist, d. h. das Anhaften an das bindende Molekül, desto niedriger ist das Niveau des Targetanalyten in der Probe.
In einem "Sandwichassay" wird sowohl ein unlösbar gemachtes Target-bindendes Molekül als auch ein markiertes Target-bindendes Molekül verwendet. Der Targetanalyt wird durch das unlösbar gemachte Target-bindende Molekül abgefangen und wird durch das markierte Target-bindende Molekül markiert, wodurch ein tertiärer Komplex gebildet wird. Die Reagenzien können zu der Probe in irgendeiner Reihenfolge oder gleichzeitig hinzugefügt werden. Die Target-bindenden Moleküle können gleich oder unterschiedlich sein, und nur eines von ihnen muss ein Target-bindendes Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung sein (das andere kann z. B. ein Antikörper oder ein spezifisches bindendes Fragment davon sein). Die Menge des markierten Target-bindenden Moleküls im tertiären Komplex ist direkt proportional zu der Menge des Targetanalyten in der Probe.
Die oben beschriebenen zwei Ausführungsformen sind beide heterogene Assays. Jedoch sind ebenso homogene Assays denkbar. Der Schlüssel ist, dass der Marker davon beeinflusst werden muss, ob ein Komplex gebildet wird oder nicht.
Ein Marker kann direkt oder indirekt (z. B. durch einen Antikörper, der gegen ein Target-bindendes Molekül gerichtet ist), kovalent (z. B. mit SPDP) oder nicht kovalent an das Target-bindende Molekül konjugiert werden, um ein diagnostisches Reagens zu produzieren. Auf ähnliche Weise kann das Target-bindende Molekül an einen Festphasenträger konjugiert werden, um ein diagnostisches Festphasenreagens ("capture") zu bilden. Geeignete Träger beinhalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Natur des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder in gewissem Ausmaß löslich sein oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann tatsächlich jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an sein Target zu binden. Somit kann die Trägerkonfiguration sphärisch, wie in einem Bead, oder zylindrisch, wie in der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabes, sein. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, so wie ein Blatt, ein Teststreifen usw.
In vivo diagnostische Verwendungen
Analytbindende Moleküle können für die Bildherstellung in vivo verwendet werden.
Radioaktiv markierte bindende Moleküle können an ein humanes oder ein tierisches Subjekt verabreicht werden. Die Verabreichung geschieht typischerweise durch Injektion, z. B. intravenös oder arteriell, oder durch andere Verabreichungsmittel in einer ausreichenden Menge, um eine anschließende dynamische und/oder statische Bildbildung unter Verwendung von geeigneten Vorrichtungen zur Detektion von radioaktiver Strahlung zu erlauben. Die bevorzugte Dosierung ist die kleinste Menge, die in der Lage ist, ein diagnostisch wirksames Bild zur Verfügung zu stellen, und kann mittels konventionellen im Stand der Technik bekannten Mitteln unter Verwendung von radio-imaging Mitteln als Maßstab bestimmt werden.
Typischerweise wird die Bildbildung am gesamten Körper des Subjekts oder an dem Teil des Körpers oder des Organs des Subjekts ausgeführt, das für den Zustand oder die Erkrankung relevant ist, der bzw. die gegenwärtig studiert wird. Das radioaktiv markierte bindende Molekül hat sich angesammelt. Die Menge des radioaktiv markierten bindenden Moleküls, die sich zu einem gegebenen Zeitpunkt in den entsprechenden Zielorganen angesammelt hat, kann dann quantifiziert werden.
Eine besonders geeignete Vorrichtung zur Detektion radioaktiver Strahlung ist eine Szintillationskamera, so wie eine Gammastrahlungskamera. Eine Szintillationskamera ist eine stationäre Vorrichtung, die verwendet werden kann, um die Verteilung von radioaktiv markierten bindenden Molekülen bildlich darzustellen. Die Detektionsvorrichtung in der Kamera erfühlt den radioaktiven Abbau, und die Verteilung von diesem kann aufgezeichnet werden. Die durch das Bildherstellungssystem produzierten Daten können digital verarbeitet werden. Die digitale Information kann über einen Zeitraum diskontinuierlich oder kontinuierlich analysiert werden. Die digitalisierten Daten können dann verarbeitet werden, um Bilder, des Musters der Aufnahme des radioaktiv markierten bindenden Proteins in das Targetorgan zu einem bestimmten Zeitpunkt herzustellen, die Frames genannt werden. In den meisten kontinuierlichen (dynamischen) Studien werden quantitative Daten durch das Beobachten von Veränderungen der Verteilungen des radioaktiven Zerfalls in den Targetorganen im Laufe der Zeit erhalten. In anderen Worten wird eine Zeitaktivitätsanalyse der Daten die Aufnahme durch das Absondern der radioaktiv markierten bindenden Moleküle durch die Zielorgane mit der Zeit illustrieren.
Verschiedene Faktoren sollten bei der Auswahl eines geeigneten Radioisotops in Erwägung gezogen werden. Das Radioisotop muss so ausgewählt werden, dass es eine hohe Bildauflösung zur Verfügung stellt; es sollte für diagnostische Verwendungen bei Menschen und Tieren sicher sein und es sollte vorzugsweise eine kurze physikalische Halbwertszeit haben, so dass die Menge der Strahlung, die durch den Körper aufgenommen wird, möglichst niedrig ist. Das verwendete Radioisotop sollte vorzugsweise pharmakologisch inert sein und sollte keine wesentlichen physiologischen Wirkungen in den verabreichten Mengen haben.
Das bindende Molekül kann mit unterschiedlichen Isotopen von Iod radioaktiv markiert sein, beispielsweise ¹²³I, ¹²⁵I oder ¹³¹I (siehe beispielsweise US-Patent 4,609,725). Das Ausmaß der radioaktiven Markierung muss jedoch überwacht werden, da es die Berechnungen beeinflussen wird, die basierend auf den bildlich dargestellten Ergebnissen gemacht werden (d. h. ein doppelt iodiertes bindendes Molekül wird die doppelte Strahlungsmenge eines ähnlichen einfach iodierten bindenden Moleküls im selben Zeitraum verursachen).
Bei Anwendungen mit humanen Subjekten kann es wünschenswert sein, andere Radioisotope als ¹²⁵I zum Markieren zu verwenden, um die Gesamtdosimetrieaussetzung des menschlichen Körpers zu minimieren und um die Detektierbarkeit des markierten Moleküls zu verbessern (auch wenn dieses Radioisotop verwendet werden kann, wenn die Umstände dies erfordern). Einfache Erhältlichkeit für die klinische Verwendung ist ebenso ein Faktor. Dementsprechend sind für humane Anwendungen bevorzugte radioaktive Marker beispielsweise ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ^113mIn, ¹²³I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re oder ²¹¹At.
Das radioaktiv markierte bindende Molekül kann mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Diese beinhalten die radioaktive Halogenierung durch das Chloramin-T-Verfahren oder das Lactoperoxidaseverfahren und anschließende Aufreinigung durch HPLC (Hochdruckflüssigchromatographie), beispielsweise wie beschrieben durch J. Gutkowska et al. in "Endocrinology and Metabolism Clinics of America: (1987) 16 (1):183. Andere bekannte Verfahren für das radioaktive Markieren können verwendet werden, so wie IODOBEADS^TM.
Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen Verfahren zum Übertragen des radioaktiv markierten bindenden Moleküls an den Endnutzer. Es kann mit jedem Mittel verabreicht werden, das es ermöglicht, dass das aktive Mittel den Wirkort im Körper eines Säugetiers erreicht. Wenn das Molekül verdaubar ist, wenn es oral verabreicht wird, ist die parenterale Verabreichung, z. B. intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung, normalerweise zu wenden, um die Absorption zu verbessern.
Andere Verwendungen
Die bindenden Moleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können ebenso verwendet werden, um ein Target aus einem Fluid, z. B. Blut, aufzureinigen. Zu diesem Zweck wird das Target-bindende Molekül vorzugsweise auf einem Festphasenträger immobilisiert. Solche Träger beinhalten diejenigen, die bereits als nützlich zum Herstellen von festphasendiagnostischen Reagenzien erwähnt wurden.
Peptide im Allgemeinen können als Molekulargewichtsmarker zu Referenzzwecken bei der Auftrennung oder bei der Aufreinigung von Peptiden durch Elektrophorese oder Chromatographie verwendet werden. In vielen Fällen könnte es sein, dass die Peptide denaturiert werden müssen, um als Molekulargewichtsmarker zu dienen. Eine zweite allgemeine Anwendbarkeit für Peptide ist die Verwendung von hydrolysierten Peptiden als Nahrungsmittelquelle. Hydrolysierte Peptide werden gewöhnlich als Wachstumsmedienbestandteil zum Kultivieren von Mikroorganismen verwendet, ebenso wie als Nahrungsmittelbestandteil für den menschlichen Verbrauch. Enzymatische oder Säurehydrolyse wird normalerweise ausgeführt, entweder bis zum Abschluss, was in freien Aminosäuren resultiert, oder partiell, um sowohl Peptide als auch Aminosäuren herzustellen. Jedoch entfernt die enzymatische Hydrolyse (Proteolyse), anders als die Säurehydrolyse, keine Nichtaminosäure-funktionellen Gruppen, die vorhanden sein könnten. Peptide könnten ebenso verwendet werden, um die Viskosität einer Lösung zu erhöhen.
Die Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können für jeden der vorangehenden Zwecke verwendet weden, ebenso wie für therapeutische und diagnostische Zwecke, wie weiterhin vorher in dieser Beschreibung diskutiert worden ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
Initiale Studien in Bezug auf den Estrogenrezeptor
Der Estrogenrezeptor (ER) ist ein Mitglied der Steroidfamilie von nuklearen Rezeptoren. Wie andere nukleare Rezeptoren ist ER ein ligandabhängiger transkriptionaler Aktivator. R.C.J. Ribeiro, P.J. Kushner, J.D. Baxter, Ann. Rev. Med. 46, 443 (1995); J.-M. Wurtz et al., Nat. Struct. Biol. 3, 87 (1996); D. Moras und H. Gronemeyer, Curr. Opin. Cell Biol. 10, 384 (1998). Zwei unterschiedliche Estrogenrezeptoren wurden beschrieben, ERα und ERβ, welche eigene Rollen bei der Genregulation spielen. K. Paech et al., Science 277, 1508 (1997); G.G.J.M. Kuiper und J.-A. Gustafsson, FEBS Lett. 410, 87 (1997); J.T. Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 247, 75 (1998); V. Giguére, A. Trembley, G.B. Tremblay, Steroids 63, 335 (1998). Zusätzlich zu dem natürlichen Liganden, Estradiol, wird die Aktivität des Estrogenrezeptors durch die Assoziation/Dissoziation von akzessorischen Proteinen reguliert, die kollektiv als Coaktivatoren oder Corepressoren bezeichnet werden. J. Torchia et al., Nature 387, 677 (1997); C.K. Glass, D.W. Rose, M.G. Rosenfeld, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 222 (1997); J. Torchia, C. Glass, M.G. Rosenfeld, ibid. 10, 373 (1998). Nach dem Binden von Estradiol führt der ER eine konformationale Änderung durch, die Assoziationsorte für coaktivierende Proteine exponiert. Diese Veränderung kann ebenso die Bindeorte für die Corepressoren oder für andere Moleküle unzugänglich machen, die mit dem inaktiven Rezeptor assoziiert sind, und somit deren Assoziierung verhindern.
Der Estrogenrezeptor ist ein therapeutisches Target für Erkrankungen, so wie Brust- und Eierstockkrebs, und er ist ebenso ein Target für Medikamente, die Symptome und Wirkungen der Menopause, inschließlich Osteoporose, mildern. Obwohl sie effektiv sind, können Verbindungen, die den Estrogenrezeptor zum Ziel haben, eine Vielzahl von Wirkungen in unterschiedlichen Targetgeweben aufzeigen. Beispielsweise ist Tamoxifen ein Estrogenrezeptorantagonist im Brustgewebe und ist wirksam darin, das Wachstum von ER-positiven Brusttumoren zu verlangsamen. Jedoch kann Tamoxifen agonistische Wirkungen auf das Zellwachstum im Uterus haben. M.A. Gallo und D. Kaufman Seminars in Oncology 24 (suppl. 1), S1-71 (1997). Aufgrund von derem weiten Bereich an Wirkungen können Medikamente, die den Estrogenrezeptor zum Ziel haben, nicht als strenge Agonisten oder Antagonisten klassifiziert werden, sondern werden angemessenerweise als selektive Estrogenrezeptormodulatoren oder SERMs bezeichnet. N.U. Bryant und W.H. Dere, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 45 (1998). SERMs scheinen den Rezeptor in Konformationen zu zwingen, die weder vollständig aktiv noch inaktiv sind. Das Unterscheiden zwischen diesen verschiedenen dazwischen liegenden Konformationen in einer in vitro-Umgebung war bestenfalls eine schwierige Aufgabe. Wir haben peptidische Sonden entwickelt, die die Unterscheidung zwischen ER-Konformationen erlauben, die durch unterschiedliche SERMs induziert werden. Jeder SERM, welcher eine unterschiedliche biologische Rolle hat, produziert ebenso ein einzigartiges Muster in dem Fingerprintassay. Diese Sonden sollten wertvolle Werkzeuge sowohl für die Forschung als auch für die Medikamentenentdeckung zur Verfügung stellen und könnten eine Verbindung zwischen Rezeptorkonformation und biologischer Aktivität zur Verfügung stellen.
Bei diesem Beispiel wurden Peptide identifiziert, welche an den nicht ligandierten Estrogenrezeptor α (Bsp. 1.1; Tabelle 1) oder an den Estradiol-aktivierten Rezeptor (Bsp. 1.2, Tabelle 2) binden. Diese ERα-bindenden Peptide wurden dann in fünf frei gewählte Klassen auf Basis von ihrer Fähigkeit, an ERα oder ERβ in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Estradiol zu binden, klassifiziert. (Natürlicherweise haben sie alle entweder an Apo-ERα oder an den Estradiol-aktivierten ERα gebunden.) Letztlich wurden repräsentative Peptide jeder Klasse verwendet, um ein "Fingerprint" von den bekannten ER SERMs Estradiol, Estriol, Nafoxidin, Tamoxifen oder Clomifen (Bsp. 1.4.) anzufertigen.
Beispiel 1.1: Identifizierung von Peptiden, die an den nicht ligandierfen (unaktivierten) Estrogenrezeptor α binden
ERα (Panvera Corp.) wurde auf Immulon 4-Plastikplatten (Dynatech) für die Phagenaffinitätsauswahl, wie in der Patentanmeldung Fowlkes, 09/050,359 beschrieben, immobilisiert. Die Peptidsequenzen, die für das Binden an den nicht ligandierten (nicht aktivierten) Rezeptor erhalten wurden, sind hierunter aufgelistet (Tabelle 1).
Beispiel 1.2. Identifizierung von Peptiden, die an den Estradiol-aktiverten Estrogenrezeptor α binden
Der Estrogenrezeptor wie oben beschrieben immobilisiert und mit 100 μM Estradiol 15 Minuten lang vor der Hinzufügung von Phagen zur Affinitätsauswahl inkubiert. Die Sequenzen, die in der Gegenwart von Estradiol erhalten wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
In der Gegenwart von Estradiol wurde eine große Anzahl von Sequenzen isoliert , welche die Konsensussequenz LXXLL enthalten. Dieses Motiv, welches bei nuklearen Rezeptorcoaktivatoren gefunden wird, hatte sich bereits vorher als erforderlich und ausreichend für ihre Verbindung mit nuklearen Rezeptoren herausgestellt. Diese Assoziation wird über einen helikalen Bereich ermöglicht, welcher bei der ligandbindenden Domäne von ER gefunden wird, die nach dem Binden von Estradiol exponiert wird. Kristallographische Studien haben angezeigt, dass dieser Bereich in der Gegenwart einiger SERMs nicht entsprechend positioniert ist, wodurch verhindert wird, dass der Coaktivator mit diesem Ort assoziiert . Siehe im Allgemeinen D.M. Heery, E. Kalkhoven, S. Hoare, M.G. Parker, Nature 387, 73 (1997); M. Nichols, J.M.J. Rientjes, A.F. Stewart, EMBO J. 17, 765 (1998); W. Feng et al., Science 280, 1747 (1998); A.M. Brzozowski et al., Nature 389, 753 (1997).
Konsistent mit dieser Beobachtung wurden Peptidsequenzen, die das LXXLL-Motiv enthalten, während der Affinitätsauswahl auf einem Aporezeptor oder in der Gegenwart von 4-OH-Tamoxifen nicht isoliert.
Beispiel 1.3. Klassifizierung von Peptidsequenzen
a.) Vergleich von Phagen-vis-a-vis-Bindung an dem ERα und β in der Gegenwart oder Abwesenheit von Estradiol
Phagen, die bestimmte Peptidsequenzen exprimieren, wurden gemäß einer Anzahl unterschiedlicher Parameter klassifiziert. Initiale Studien haben das relative Binden von jedem der Phagen an ERα und β in der Abwesenheit oder Gegenwart von Estradiol gemessen. ERα und β wurden auf Immulon 4-Platten immobilisiert und 15 Minuten lang mit 100 μM Estradiol oder Puffer alleine vor der Hinzufügung des Phagenüberstands aus einer frischen Übernachtkultur behandelt. Gebundene Phagen wurden unter Verwendung eines anti-M13-Antikörpers, gekoppelt an HRP, detektiert. Aus diesen Ergebnissen wurden 12 Phagen für weitere Studien ausgewählt. Sequenzen wurden ausgewählt, die vorzugsweise an ERα oder ERβ gebunden haben und die vorzugsweise in der Abwesenheit oder Gegenwart von Estradiol gebunden haben.
b.) Wettbewerb von Phagen mit einem Peptid, das ein LXXLL-Motiv enthält
Die coaktivierenden Proteine, die bis heute identifiziert worden sind, interagieren mit nuklearen Rezeptoren über eine Leucin-reiche Region auf dem Coaktivator mit der Konsensussequenz LXXLL, wobei L Leucin ist und X eine Aminosäure ist. Coaktivatoren, die dieses Konsensusmotiv enthalten, binden an den ER bei Helix 12 in der AF2-Domäne (der C-terminalen Transaktivierungsdomäne). Dieser helikale Bereich wird exponiert, wenn der Rezeptor aktiviert wird. Viele der Peptidsequenzen, die für den aktivierten Rezeptor isoliert worden sind, waren Leucin-reich, und eine große Anzahl enthielt das LXXLL-Motiv. Alle dieser Sequenzen haben vorzugsweise an den aktivierten ER gebunden. Ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv enthielt, wurde synthetisiert und in Wettbewerbsassays mit Phagen verwendet, um zu bestimmen, ob das Binden des LXXLL-Peptids an den ER das Binden der Phage beeinflussen würde. Die Peptidsequenz entspricht Peptid #4, das in der Gegenwart von Estradiol isoliert wurde:
SSNHQSSRLIELLSRSGSGK-Biotin.
ERα und β wurden wie vorher beschrieben immobilisiert und in der Gegenwart von 100 μM LXXLL-Peptid, 100 μM Estradiol, Puffer alleine oder einer Kombination aus 100 μM Estradiol und 100 μM Peptid 20 Minuten lang vor dem Hinzufügen von Phagenüberstand aus einer frischen Übernachtkultur hinkubiert. Gebundene Phagen wurden wie oben beschrieben detektiert. Alle Phagen, die ein LXXLL-enthaltendes Peptid exprimierten, traten in den Wettbewerb mit dem Peptid ein, und verschiedene andere Phagen, die das LXXLL-Motiv nicht enthielten, befanden sich ebenso in einem Wettbewerb mit dem Peptid. Diese Phagen können Sequenzen exprimieren, die das LXXLL-Motiv mimen, oder sie können allosterisch durch das Binden des Peptids beeinflusst werden. Es gab ebenso Phagen, die kein LXXLL-Motiv enthielten, die mit dem Peptid nicht in Wettbewerb traten.
Basierend auf diesen Daten wurden die Peptidsequenzen in 5 Klassen unterteilt, die hierunter aufgeführt sind, wie aus den Tabellen 3 und 4 ersehen werden kann. Tabelle 3 führt Peptide jeder Klasse auf, während Tabelle 4 die Klassen definiert. Bei einem Vergleich des Bindens an nicht ligandierte ERα und β haben Peptide aus Klasse 1 und aus Klasse 5 eine höhere Affinität für ERβ. Peptide aus Klassen 2, 3 und 4 haben eine höhere Affinität für ERα. Der Ligand (Estradiol) erhöht die Affinität von Peptiden aus Klasse 1 für sowohl ERα als auch ERβ und senkt das Binden von Peptiden aus Klasse 5 an beide Rezeptoren. Der Ligand hat keinen Einfluss auf das Binden von Peptiden aus Klasse 2 an jedweden Rezeptor. Der Ligand erhöht das Binden von Peptiden aus Klasse 3 an ERα, während er keine Wirkung auf ERβ hat, und der Ligand senkt das Binden von Peptiden aus Klasse 4 an ERα ab, während er ebenso keine Wirkung auf ERβ hat. Ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv enthält, wie oben beschrieben, war in der Lage, mit der Phage aus Klasse 1 für sowohl ERα als auch β in Wettbewerb zu treten und mit einer Phage aus Klassen 4 und 5 nur für ERα in Wettbewerb zu treten. Phagen aus Klassen 2 und 3 traten mit dem LXXLL-Peptid bei keinem Rezeptor in einen Wettbewerb ein
Beispiel 1.4. Anfertigen von Fingerprints für Estrogenrezeptoragonisten und SERMs
Es gibt viele bekannte Agonisten und SERMs für den Estrogenrezeptor. Für das initiale Testen des Fingerprintingsystems wurden zwei Agonisten, 17β-Estradiol und Estriol, und drei SERMs, 4-OH-Tamoxifen, Nafoxidin und Clomiphen, ausgewählt. Alle drei SERMs sind Derivate von Triphenylethylen. Alle Reagenzien wurde von Sigma erworben.
Die Wirkung von Agonisten und SERMs auf das Binden der Phage aus jeder der 5 Klassen, wie oben beschrieben, wurde untersucht. Um dies zu tun, wurde immobilisiertes ERα oder ERβ mit 100 μM Estradiol, Estriol, Nafoxidin, Tamoxifen oder Clomifen in TBST oder mit TBST alleine 20 Minuten lang vor der Hinzufügung des Phagenüberstandes aus einer frischen Übernachtkultur inkubiert. Folgend auf eine einstündige Inkubation wurden die Wells fünfmal mit TBST gewaschen, und gebundene Phagen wurden unter Verwendung eines anti-M13-Antikörpers, gekoppelt an HRP, visualisiert.
Die folgenden Fingerprints wurden identifiziert (Tabelle 6). Die Daten basieren auf der relativen Veränderung des Bindeverhaltens (wie bestimmt durch einen Anstieg oder ein Absinken der Absorption), verglichen mit dem nicht ligandierten Rezeptor. Die Zahl vor dem + oder – Zeichen zeigt den Grad und die Richtung der Signalveränderung an; +/– zeigt keine signifikante Veränderung an.
Die Agonisten (Estradiol und Estriol) stellen Fingerprints zur Verfügung, die von denen der SERMs verschieden sind (Tamoxifen, Nafoxidin und Clomiphen). Zusätzlich sind die Fingerprints unterschiedlich für ERα und ERβ. Wie vorhergesagt, produzieren die Agonisten, welche ähnliche biologische Wirkungen haben, Fingerprints, die für jeden Rezeptor ähnlich sind. Die SERMs sind alle aus derselben Klasse der Triphenylethylenderivate und haben ähnliche, aber doch verschiedene biologische Wirkungen. Die Fingerprintanalyse unterscheidet sie leicht von reinen Agonisten und zeigt ebenso an, dass sie ähnliche, aber unterschiedliche in vivo-Aktivitäten haben.
Wenn ein Anstieg des Bindeverhaltens eines Peptids aus Klasse 1 eine agonistische Aktivität anzeigt, dann suggeriert der Fingerprint, dass Tamoxifen niedrige Niveaus einer agonistischen Aktivität für ERα produziert und keine agonistische Aktivität für ERβ produziert. Auf ähnliche Art und Weise, wenn die Reduktion des Bindeverhaltens eines Peptids aus Klasse 4 eine agonistische Aktivität anzeigt, dann suggeriert der Fingerprint, dass Tamoxifen eine antagonistische Aktivität auf sowohl ERβ als auch ERα hat. Die Kombination der Signale mit jeder Peptidklasse stellt einen Fingerprint für den SERM zur Verfügung, der Informationen über die relativen Niveaus von antagonistischer und agonistischer Aktivität zur Verfügung stellt, die er produziert. Die relativen Veränderungen der Signale auf ERα und ERβ könnten die Gewebespezifität der Veränderung der Rezeptoraktivität als Antwort auf den SERM anzeigen.
Beispiel 2. Weitere Untersuchungen mit Estrogenrezeptoren
Die Affinitätsauswahl von Phagendisplaypeptidbibliotheken (Sparks et al. (1996), Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, S. 227-253) wurde mit sowohl ERα als auch mit ERβ unter Bedingungen ausgeführt, von denen vorhergesagt wurde, dass sie den ER in unterschiedlichen Konformationen anordnen: Apo-ER, Estradiol-gebundenen ER und 4-OH-Tamoxifen-gebundenen ER. Einzigartige Sätze von Peptiden mit hoher Affinität wurden für jede Bedingung identifiziert. Am bemerkenswertesten war, dass die Affinitätsauswahl von Peptiden in der Gegenwart von Estradiol eine Anzahl von Sequenzen ergab, die ein LXXLL-Motiv enthielten (Tabelle 100A). Dieses Motiv, welches bei Nuklearrezeptor-Coaktivatoren gefunden wird (Tabelle 100B), hat sich als erforderlich und ausreichend für ihre Assoziation mit nuklearen Rezeptoren herausgestellt (Heery et al. (1997), Nature, 387:733-736). Die Studien haben gezeigt, dass die Assoziation des LXXLL-Motivs mit dem ER über einen helikalen Bereich in der ligandbindenden Domäne des Rezeptors erreicht wird, der nach dem Binden an Estradiol exponiert wird. Strukturelle Studien unter Verwendung von X-Ray-Kristallographie haben gezeigt, dass dieser Bereich in der Gegenwart von Raloxifen (Brzozowski et al. (1997)) oder 4-OH-Tamoxifen (Shiau et al. (1998)) nicht ordentlich positioniert ist, was die Interaktion des Coaktivator-LXXLL-Motivs verhindert. Die Identifizierung dieser Sequenzen in der Gegenwart von Estradiol zeigt an, dass der ER als Antwort auf den Liganden in vitro eine konformationale Veränderungen unterläuft, die mit den Veränderungen konsistent sind, von denen vorausgesagt wird, dass sie in vivo auftreten.
Materialien
Estrogenrezeptor α und β wurden von der PanVera Corporation, Madison, WI erworben. Immulon 4 96-well-Platten waren von Dynatech. Streptavidin, 17β-Estradiol, 4-OH-Tamoxifen, Nofoxidin, Clomiphen, Diethylstilbestrol, Progesteron, 16α-OH-Estron und Estriol wurden von Sigma erworben. Premarin ist ein Produkt von Wyeth-Ayerst. Raloxifen ist ein Produkt von Eli Lilly Corporation. ICI 182,780 wurde von Tocris Cookson Inc., Ballwin, MO erworben. Anti-M13-Antiseren wurden von Pharmacia erworben. Die Sequenzierung von einzelsträngiger M13-DNA wurde durch Sequetech Corp., Mountain View, CA ausgeführt. Die Peptidsynthese wurde durch AnaSpec, San Jose, CA durchgeführt.
Beispiel 2.1
Zusätzliche Phagenaffinitätsauswahlen wurden von Peptiden gemacht, welche an Plastik-immobilisierten ERα in der Gegenwart der SERMs 4-OH-Tamoxifen, ICI 182,780 oder beiden gleichzeitig gebunden haben (siehe Tabelle 7).
Beispiel 2.2
Weitere Phagenaffinitätsauswahlen wurden mit ERα oder ERβ, konjugiert mit ERE (Estrogenresponseelement), gemacht, welches wiederum immobilisiert war. Für ERα wurden Auswahlen ohne einen vorhandenen Liganden (Aporezeptor) durchgeführt oder in der Gegenwart von 17β-Estradiol, 4-OH-Tamoxifen, Raloxifen oder ICI 182,780.
Das Verfahren ist hierunter genauer beschrieben. Die Affinitätsauswahl von Phagen für die verschiedenen Konformationen des Estrogenrezeptors wurde essentiell ausgeführt, wie beschrieben (Sparks et al. (1996)). Die Auswahlen wurden mit dem Estrogenrezeptor in TBST (10 nM Tris-HCl, pH 8,0, 150 nM NaCl, 0,05 % Tween 20) oder in TBST, enthaltend 1 μM 17β-Estradiol oder 4-OH-Tamoxifen ausgeführt. Immulon 4 96-well-Platten wurden mit Streptavidin in 0,1-Natriumbicarbonat beschichtet. Die Platten wurden dann 1 h lang mit 2 pmol biotinyliertem Vitellogenin-Estrogenresponseelement (ERE) pro well inkubiert (Anderson (1998), Biochemistry, 37:17287-17298), gefolgt durch eine einstündige Inkubation mit 3 pmol (Monamer) ERα oder ERβ pro well. Oligonukleotide, die dem Vitellogenin ERE entsprachen, Biotin-GATCTAGGTCACAGTGACCTGCG (vorwärts) und Biotin-GATCCGCAGGTCACTGTGACCTA (rückwärts) wurden durch Genoss synthetisiert. Die sequenzierten aktiven Peptide sind in Tabelle 8 gezeigt. Für ERβ wurden die Auswahlen durchgeführt ohne einen vorhandenen Liganden oder in der Gegenwart von Estradiol oder Tamoxifen. Die resultierenden aktiven Peptide sind in Tabelle 9 gezeigt.
Beispiel 2.3
Sämtliche Phagen wurden basierend auf ihrer Fähigkeit klassifiziert, an ERα und ERβ in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von SERMs zu binden. Diese Assays wurden durch Phagen-ELISA ausgeführt. Im Wesentlichen wurden Plastikplatten mit Streptavidin (Sigma) beschichtet. Biotinylierte EREs (siehe oben) wurden mit dem Festphasenstreptavidin und ER an ERE konjugiert. Gebundene Phagen wurden unter Verwendung von Meerrettichperoxidase-markierten anti-(M13-Phagen)-Antikörpern detektiert.
Die ER wurden dann mit 100 μl TBST oder TBST, enthaltend 1 μM des entsprechenden Modulators, inkubiert. Phagen (40 μl) aus einer fünfstündigen Kultur, gewachsen in DH5αF'-Zellen, wurden direkt zu den Wells hinzugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nichtgebundene Phagen wurden dann durch 5 Waschungen mit TBST entfernt. Gebundene Phagen wurden unter Verwendung eines anti-M13-Antikörpers, gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP), detektiert. Die Assays wurden mit 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und Wasserstoffperoxid 10 Minuten lang entwickelt und dann durch die Hinzufügung von 1 % SDS gestoppt. Die Absorption wurde bei 405 nm in einem Molecular Devices Mikroplattenauslesegerät gemessen.
Die Resultate sind in den Tabellen 11-13 wie folgt gezeigt:
Tabelle 11, Binden von ERα-ausgewählten Peptiden an den ERα-Rezeptor;
Tabelle 12, Binden von ERα-ausgewählten Peptiden an den ERβ-Rezeptor;
Tabelle 13; Binden von ERβ-ausgewählten Peptiden an ERα- oder ERβ-Rezeptoren.
Die Bindeaktivität ist in einem semiquantitativen Maßstab von 0 bis 7+ angegeben.
Beispiel 2.4
Auswahl und Charakterisierung der Peptide der Gruppe
Sämtliche affinitätsausgewählten Phagen wurden durch Phagen-ELISA hinsichtlich des Bindens an Apo-ERα und β und an ERα und β in der Gegenwart von Estradiol oder 4-OH-Tamoxifen wie oben beschrieben evaluiert. Viele Phagen zeigten ein bestimmtes bevorzugtes Bindeverhalten. Einige Sequenzen banden stärker an den Aporezeptor, während andere ein bevorzugtes Bindeverhalten an den Estradiolaktivierten oder 4-OH-Tamoxifen-aktivierten Rezeptor zeigten. Basierend auf dieser Analyse wurden elf Phagen für die weitere Verwendung als konformationale Sonden ausgewählt, die unterschiedliche Peptidsequenzen exprimierten und die unterschiedliche Bindepräferenzen zeigten.
Fünf dieser Sonden banden sowohl an ERα als auch an ERβ (α/βI-V), drei waren spezifisch für ERα (αI-III) und drei waren spezifisch für ERβ (βI-III) (siehe Tabelle 10). Man kann dies entweder als Definition einer Gruppe aus drei Klassen ansehen, wobei verschiedene Repräsentanten in jeder Klasse vorhanden sind, oder als eine Gruppe aus elf Klassen, wobei ein Mitglied pro Klasse vorhanden ist. Die Identifikation von unterschiedlichen Klassen von Peptiden, von denen einige sowohl ERα als auch ERβ erkannten und andere rezeptorspezifisch waren, ist konsistent mit den primären Strukturen der zwei Rezeptoren, die ähnlich, aber dennoch unterschiedlich sind.
Die Bindeorte der Sonden, α/βI-V und αI-III, wurden auf ERα unter Verwendung der ERα-Ligandenbindedomäne (Reste 282-595), fusioniert an Glutathion-S-Transferase (GST), einer ERα-aminoterminalen Domäne (1-184), fusioniert an GST, und des Gesamtlängen-ER zugeordnet. Die Assays wurden unter Verwendung des Formats ausgeführt, das in Beispiel 2.3 beschrieben ist, außer dass die Domänen direkt auf der Plastikoberfläche des Wells immobilisiert worden sind. Die Assays wurden wie für den Phagen-ELISA (Ex. 2.3) ausgeführt. Die Resultate sind in 2 gezeigt.
Alle der Sonden außer αI banden an die Ligandenbindedomäne. Die αI-Sonde, welche nur an das Gesamtlängenprotein bindet, könnte an einen Ort binden, der durch die tertiäre Struktur gebildet wird, die durch die Interaktion zwischen den Rezeptordomänen gebildet wird.
Die Sonden wurden verwendet, um fingerprints der Interaktion von ERα und ERβ mit einer Vielzahl von unterschiedlichen SERMs durch das vorher beschriebene Verfahren (unter Verwendung von ERE) anzufertigen. Als Nächstes haben wird das Bindeverhalten von jeder der Sonden an ERα und ERβ in der Gegenwart einer Vielzahl von ER-Liganden untersucht, die unterschiedliche biologische Aktivitäten haben. Das Ziel war es, zu bestimmen, ob jeder der Liganden eine konformationale Veränderung in dem ER induzieren würde, der das Bindemuster der Sonden verändern würde und somit einen "Fingerprint" für jede Verbindung produzieren würde. Die Liganden, die für diese Studie verwendet wurden, beinhalten die ER-Agonisten Estradiol, Estriol und Diethylstilbestrol (DES); die SERMs 4-OH-Tamoxifen, Nafoxidin, Clomiphen und Raloxifen; den Antagonisten ICI 182,780; und den Estradiolmetaboliten 16α-OH-Estron. Premarin, die Mischung aus konjugierten Estrogenen, die als Estrogenersatztherapie verwendet wird, wurde ebenso verwendet, aber es sollte bemerkt werden, dass viele der Bestandteile des Premarins metabolisch aktiviert werden müssen. Somit könnte deren Wirkung in diesem in vitro-Assay nicht detektiert werden. Puffer alleine (Aporezeptor) und Progesteron wurden als Kontrollen mit einbezogen. Informationen über die Strukturen und biologischen Wirkungen der SERMs, die in dieser Studie verwendet wurden, können in den folgenden Papers und Reviewartikeln gefunden werden: B.S. Katzenellenbogen, M.M. Montano, K. Ekena, M.E. Herman, E.M. Mclnerney, Breast Can. Res. Treat. 44, 23 (1997); J.I. MacGregor und V.C. Jordan, Pharmacological Rev. 50, 151 (1998); B.T. Zhu und A.H. Conney, Carcinogenesis 19, 1 (1998); M.T.R. Subbiah, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 23 (1998); Sulistiyani, S.J. Adelman, A. Chandrasekaran, J. Jayo, R.W. St. Clair, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 15, 837 (1995); B.R. Bhavnani und A. Cecutti, J. Clin. Endocrinol. and Metab. 78, 197 81994); B. Bhavnani, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 6 (1998); T.A. Grese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14105 (1997); T.A. Grese et al., J. Med. Chem. 41, 1272 (1998); A. Howell, Oncology 11, suppl 1, 59 (1997).
Wie in Tabelle 14 gezeigt, hat jeder der Liganden, die getestet wurden, tatsächlich das Bindemuster der Sonden verändert, was einen unterschiedlichen Fingerprint für jeden produzierte, wohingegen das Muster, das durch Progesteron verursacht wurde, von dem Muster, das durch Puffer verursacht wurde, nicht unterscheidbar war.
Die einzigarten ligandenabhängigen Bindemuster der Sonden zeigen an, dass jeder Ligand eine konformationale Veränderung in dem Rezeptor verursacht, die unterschiedliche Peptidbindeoberflächen exponiert. Die Bindemuster für Estradiol und ICI 182,780 sind für sowohl ERα als auch β unterschiedlich, was die konformationalen Veränderungen bestätigt, die durch frühere Proteaseverdaustudien illustriert worden sind. Der Proteaseverdauassay, welcher auf der Anordnung der Spaltorte für die Detektion von konformationalen Veränderungen beruht, konnte zwischen konformationalen Veränderungen, die durch Estradiol und 4-OH-Tamoxifen oder durch Estradiol und ICI 182,780 verursacht wurden, unterscheiden. Jedoch war er nicht in der Lage, zwischen Veränderungen zu unterscheiden, die durch 3-OH-Tamoxifen und andere ER-Modulatoren, so wie ICI 182,780, verursacht wurden sind. Der Fingerprintassay zeigt jedoch eindeutig an, dass unterschiedliche Peptidbindeoberflächen sowohl auf ERα als auch β in der Gegenwart von 4-OH-Tamoxifen exponiert sind, die in der Gegenwart von ICI 182,780 nicht exponiert sind. Tamoxifen, Nafoxidin und Clomiphen enthalten die gleiche Triphenylethylenkernstruktur. Diese drei Verbindungen produzieren unterschiedliche biologische Effekte, obwohl sie eine ähnliche Strukture aufweisen. Daher könnte vorhergesagt werden, dass diese Verbindungen ähnliche, aber unterschiedliche konformationale Veränderungen in den Rezeptoren induzieren. Der Fingerprintassay zeigt, dass die Sonden α/βIII, IV und V, welche eine hohe Affinität für den ER in der Gegenwart von 4-OH-Tamoxifen haben, eine niedrigere Affinität für den ER haben, der mit Nafoxidin und Clomiphen komplexiert ist, was anzeigt, dass diese peptidbindenden Oberflächen in der Gegenwart dieser Verbindungen unterschiedlich sind. Die αIII-Sonde unterscheidet noch deutlicher diese drei Verbindungen. Der Fingerprintassay unterscheidet ebenso zwischen 4-OH-Tamoxifen und Raloxifen. Die Sonden α/βIII, IV und V haben eine reduzierte Affinität für sowohl ERα als auch β in der Gegenwart von Raloxifen, verglichen mit 4-OH-Tamoxifen. Die Sonden α/βII, βI und βIII unterscheiden weiterhin konformationale Veränderungen bei ERβ, die durch diese zwei Verbindungen induziert werden. Das Fingerprintmuster, das durch Premarin produziert wird, ist, verglichen mit anderen Agonisten, unterschiedlich; jedoch liegen die Aktivitäten von Premarin in einer Mischung von Bestandteilen begründet. Es wäre interessant, die Bindemuster der Sonden in der Gegenwart von jedem der aufgereinigten, aktivierten Bestandteile des Premarins zu überprüfen.
Die Sonde α/βI enthält ein LXXLL-Motiv. Das Binden von Estradiol an den ER verstärkte das Binden dieser Sonde sowohl an ERα als auch an ERβ stark. Jedoch waren Estriol, Premarin und DES, welche als ebenso als ER-Agonisten angesehen werden, nicht in der Lage, das Binden dieser Sonde an ERα im selben Ausmaß wie Estradiol zu aktivieren. An ERβ war das Binden dieser Sonde durch alle der Agonisten stark verstärkt. Die SERMs, 4-OH-Tamoxifen, Nafoxidin, Clomiphen, Raloxifen und ICI 182,780 verhinderten das Binden dieser Sonde an sowohl ERα als auch β und schienen das Binden auf ein Niveau zu reduzieren, das unter dem liegt, das mit Puffer alleine beobachtet wird.
Die Sonden α/βIII-V zeigen ein verstärktes Binden in der Gegenwart von SERMs, insbesondere von 4-OH-Tamoxifen, was zeigt, dass eine neue Bindeoberfläche an dem ER in der Gegenwart dieser Verbindungen exponiert wird. Die Bindemuster dieser drei Sonden zusammen mit den Sonden α/βII, αIII, βI und βIII illustrieren Unterschiede in der Rezeptorkonformation, die durch 4-OH-Tamoxifen, Nafoxidin, Clomiphen und Raloxifen induziert werden. Da das Binden der Sonden an den ER in der Gegenwart dieser SERMs verändert sein könnte, aber nicht unterbunden werden konnte, können subtile Veränderungen in der Rezeptorkonformation sichtbar gemacht werden. Dies ist der erste in vitro-Assay, der zwischen diesen vier Verbindungen unterscheidet. Die Sonde αII ist ebenso in der Hinsicht einzigartig, dass sie an ERα in der Gegenwart von irgendeiner Verbindung bindet, die an den Estrogenrezeptor bindet, was anzeigt, dass, während einige konformationale Rezeptorveränderungen für den Modulator einzigartig sind, andere universeller sein könnten. Insgesamt erlauben diese Sonden die Detektion von sowohl subtilen als auch von deutlichen konformationalen Änderungen, die durch viele unterschiedliche Modulatoren der ER-Aktivität induziert werden.
Um zu bestätigen, dass das Binden der Sonden an den ER von dem Peptid abhängig war, das auf der Oberfläche der Phage exprimiert wurde, wurden biotinylierte Peptide entsprechend der Sequenzen synthetisiert, bei denen Biotin an das carboxyterminale Lysin angebracht wurde. Die Peptide wurden an Europium-markiertes Streptavidin gekoppelt, und Bindestudien wurden unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie (TRF) ausgeführt.
Die zeitaufgelösten Fluoreszenzassays (TRF) wurden bei Raumtemperatur wie folgt ausgeführt: Costar hochbindende 384-well-Platten wurden mit Streptavidin in 0,1 M Natriumbicarbonat beschichtet und mit bovinem Serumalbumin blockiert. Biotinyliertes ERE (2 pmol) wurde zu jedem Well hinzugefügt. Folgend auf eine einstündige Inkubation wurde Biotin hinzugefügt, um die Gegenwart irgendwelcher verbleibenden Bindeorte zu überprüfen. Die Platten wurden gewaschen und 2 pmol ERα wurden zu jedem Well hinzugefügt. Folgend auf eine einstündige Inkubation wurden die Platten gewaschen und die ER-Modulatoren wurden in einem Konzentrationsbereich von Pikomolar zu Mikromolar hinzugefügt. Folgend auf eine 30-minütige Inkubation mit den Modulatoren wurden 2 pmol eines Europium-markierten Streptavidin (Wallace)biotinylierten Peptidkonjugats (hergestellt wie hierunter beschrieben) hinzugefügt und es wurde 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen, und die Europium-Verstärkungslösung wurde hinzugefügt. Fluoreszente Auslesungen wurden mit einem POLARstar-Fluorimeter (BMG Lab Technologies) unter Verwendung eines < 400 nm Anregungsfilters und eines 620 nm Emissionsfilters erhalten. Das Europium-markierte Streptavidin-biotinylierte Peptidkonjugat wurde hergestellt durch Hinzufügen von 8 pmol biotinyliertem Peptid zu 2 pmol markiertem Streptavidin. Nach der Inkubation auf Eis für 30 min wurden die verbleibenden Biotinbindeorte mit Biotin vor der Hinzufügung in die ER-beschichtete Platte blockiert.
Das Binden der Sonden an den ER wurde gemessen. Die Resultate, die in Tabelle 15 gezeigt sind, zeigen, dass die Peptide tatsächlich die Bindespezifität verleihen. Der Vergleich der Fluoreszenzwerte, die aus den TRF-Bindeassays erhalten wurden, und der Signale, die in dem Phagen-ELISA-Fingerprint erhalten wurden, zeigt an, dass diese zwei Verfahren ähnliche Muster produzieren. Jedoch stellt der Bindeassy ebenso eine Indikation der Potenz jeder Verbindung, die konformationale Änderung zu induzieren, zur Verfügung, die für das Binden der Peptide erforderlich ist. Zusammengenommen zeigen diese Resultate an, dass die Umwandlung des Fingerprintassays von Phagen zu Peptiden einen sogar noch genaueren Assay zum Detektieren einer konformationalen Veränderung zur Verfügung stellen wird.
Eine der am meisten bemerkenswerten Beobachtungen aus dem TRF-Bindeassay ist es, dass das Binden der βI-Sonde an ERβ in der Gegenwart des SERM 4-OH-Tamoxifen verstärkt ist und in der Gegenwart von anderen SERMs, so wie Raloxifen, Nafoxidin und Clomiphen, reduziert ist. Die Reduktion der Bindung, die mit diesen Verbindungen beobachtet wird, ist ähnlich zu der Reduktion, die mit Agonisten, so wie Estradiol, Estriol und DES, beobachtet wird.
Wir haben Peptide identifiziert, die als konformationale Sonden des Estrogenrezeptors α und β dienen. Viele Sonden binden an beide Rezeptoren, während andere Sonden vorzugsweise an entweder den α- oder den β-Rezeptor binden. Konsistent mit den zwei Rezeptoren, die Bereiche mit hoher Homologie und andere mehr divergente Bereiche haben, zeigen diese Resultate an, dass die Rezeptoren einige bindenden Oberflächen gemein haben, während andere einzigartig sind. Die Implikationen hiervon sind, dass beide Rezeptoren einige derselben Regulationsproteine in der Zelle kontaktieren könnten, jedoch könnte es zusätzliche Proteine geben, die spezifisch entweder die ERα- oder die ERβ-Wirkung regulieren.
Wir haben unsere peptidischen Sonden verwendet, um zu zeigen, dass beide Rezeptoren unterschiedliche konformationale Veränderungen als Ergebnis des Bindens von unterschiedlichen Liganden unterlaufen. Die Sonden zeigen nicht nur konformationale Rezeptorveränderungen durch deren relative Veränderungen in Bezug auf die Affinität auf, sondern identifizieren ebenso einzigartige bindende Oberflächen auf den zwei Rezeptoren. Diese bindenden Oberflächen können tatsächlich die Oberflächen sein, die mit verschiedenen coregulatorischen Proteinen als Antwort auf unterschiedliche Liganden interagieren. Beispielsweise enthielten viele Peptide, die mit dem Estradiol-aktivierten Rezeptor ausgewählt wurden, Sequenzen, die in Nuklearrezeptor-Coaktivatoren gefunden werden, wie durch die Peptide illustriert wird, die das LXXLL-Motiv enthalten (1). Diese Peptidsonden mimen wahrscheinlich die Interaktion zwischen dem Rezeptor und coaktivierenden Proteinen. Potenziell können diese Sonden verwendet werden, um hierfür unbekannte Rezeptorproteininteraktionen zu identifizieren.
Zusätzliche Anwendungen der Sonden befinden sich auf dem Gebiet der Detektion von ER-Modulatoren. Eine oder mehrere Sonden können verwendet werden, um einen High-Throughput-Screen aufzubauen, um Modulatoren der ER-Aktivität zu identifizieren. Wir stellen uns vor, dass Verbindungen, die an den ER binden, die Rezeptorkonformation verändern werden und daher das Bindemuster der Sonden verändern werden. Die Orte, die durch diesen Screen angestrebt werden, müssen nicht bona fide Protein-Protein-Interaktionsoberflächen sein, sondern können Orte repräsentieren, die in der Gegenwart eines spezifischen Liganden exponiert werden, und können so als Marker für spezifische Konformationen dienen. Die Fingerprinttechnik kann ebenso angewendet werden, um schnell Treffer aus einem Screen in unterschiedliche Kategorien zu klassifizieren, so wie Agonisten (die dem Estrogenmuster ähneln), Antagonisten (die dem ICI 182,780-Muster ähneln), vermischt (die dem Tamoxifenmuster ähneln) oder neue Effektoren, bevor sie in einem zellbasierten Assay überprüft werden. Fingerprinting kann ebenso verwendet werden, um die Strukturaktivitätsbeziehungen zu bestimmen und um schnell Verbindungen nach einer chemischen Modifikation während der Leitstrukturoptimierung zu überprüfen.
Dieses ist die erste Technik, die beschrieben ist, die zwischen Estrogenrezeptorkonformationen unterscheiden kann, die durch Liganden sowohl zwischen als auch innerhalb von Ligandenklassen verursacht werden. Die mit diesem Assay gesammelten Daten stellen einen starken Nachweis zur Verfügung, dass die biologische Aktivität des Estrogenrezeptors mit den Konformationen verbunden sein kann, die nach dem Binden eines Ligandens verursacht werden. Eine Stärke dieser Fingerprinttechnik ist es, dass sie breit anwendbar auf jedes Protein oder jeden Rezeptor ist, der strukturelle Änderungen nach dem Binden an einen Liganden oder an ein Substrat durchführt.
Diese Studien bestätigen, dass die Assays leicht mit synthetischen Peptiden anstelle von phagengebundenen und -exprimierten Peptiden ausgeführt weren können.
Beispiel 2.5. Analyse von bekannten SERMs unter Verwendung der Gruppe
Für die Fingerprintanalyse von Estrogenrezeptormodulatoren für ERα und ERβ wurde der Estrogenrezeptor (3 pmol) auf 2 pmol biotinyliertem ERE immobilisiert. Immobilisierter ER wurde mit Estradiol (1 μM), Estriol (1 μM), Premarin (10 μM), 4-OH-Tamoxifen (1 μM), Nafoxidin (10 μM), Clomiphen (10 μM), Raloxifen (1 μM), ICI 182,780 (1 μM), 16a-OH-Estron (10 μM), DES (1 μM) oder Progesteron (1 μM) 5 Minuten lang vor der Hinzufügung der Phage inkubiert. Die Phagen wurden aus Plaques in DH5αF' 5 Stunden lang amplifiziert. Gebundene Phagen wurden wie vorher beschrieben detektiert. Die Assays wurden mit ABTS (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolinsulfonsäure) 10 Minuten lang entwickelt.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 14A und 14B gezeigt. Tabelle 14A zeigt das Binden an der ERα-Rezeptor und Tabelle 14B zeigt das Binden an den ERβ-Rezeptor. Es ist nicht erforderlich, alle 11 Gruppenpeptide in jeder Tabelle aufzuführen, da nur einige nur den ERα und andere nur den ERβ binden. Die Bindeaktivität ist in einem semiquantitativen Maßstab von 0 bis 7+ angegeben.
Beispiel 2.6. Berechnung der Ähnlichkeit zwischen SERMs
Basierend auf den Tabellen 14A und B kann amn einen Fingerprint für jeden SERM definieren. Dieser Fingerprint ist ein Muster von beschreibenden Faktoren, von denen jeder ein Wert in der Tabelle ist, der die Bindeaffinität eines bestimmten Gruppenpeptids für entweder ERα oder ERβ in der Gegenwart des fraglichen SERM angibt. Die fraglichen Tabellen erlauben es, dass jeder Fingerprint aus 16 beschreibenden Faktoren zusammengesetzt ist (einer für jede Reihe in den Tabellen). Wir erhalten 12 Fingerprints, einen für jeden der 11 SERMs, plus Puffer.
Wir können daher die Ähnlichkeit zwischen den 12 × 12 = 144 möglichen Paaren dieser Fingerprints berechnen. Anfangs haben wir den euklidischen Abstand zwischen jedem Fingerprint berechnet. Dies ist die Quadratwurzel der Summe der Quadrate der Unterschiede zwischen den entsprechenden Spaltenwerten in den Tabellen 14A und 14B. Beispielsweise ist der Abstand zwischen Puffer und Estradiol die Quadratwurzel der Summe der Quadrate der 16 Unterschiede zwischen den Paaren aus beschreibenden Faktoren, d. h. die Quadratwurzel aus der Summe von
(1-6)^{^}2, 25;
(7-2)^{^}2, 25;
(1-1)^{^}2, 0;
(1-1)^{^}2, 0;
(1-1)^{^}2, 0;
(7-7)^{^}2, 0;
(1-6)^{^}2, 25;
(5-2)^{^}2, 9;
(2-7)^{^}2, 25;
(7-2)^{^}2, 25;
(2-1)^{^}2, 1;
(1-1)^{^}2, 0;
(6-3)^{^}2, 9;
(1-5)^{^}2, 16; und
(7-7)^{^}2, 0;
was insgesamt 160 ergibt, wovon die Quadratwurzel etwa 12,65 beträgt.
Der maximal mögliche Abstand in dem vorliegenden Fall ist die Quadratwurzel von 16 × (7 × 7) was 28 ist. Dies liegt daran, dass jedes Paar aus beschreibenden Faktoren einen maximal möglichen Abstand von 7 hat, und es gibt 16 beschreibende Faktoren in dem Fingerprint.
Der Abstand kann in eine Ähnlichkeit durch gegenwärtige Ähnlichkeit = (maximaler Abstand – gegenwärtiger Abstand)/maximaler Abstandumgewandelt werden, was gleich 1 ist, wenn der gegenwärtige Abstand 0 ist, und 0, wenn der gegenwärtige Abstand dem maximalen Abstand entspricht. In dem gegenwärtigen Beispiel (Puffer:Estradiol) ist die Ähnlichkeit 0,55.
Im Gegensatz befinden sich die Fingerprints von Clomiphen und Raloxifen in einem euklidischen Abstand von SQRT(40) was 6,32 ist, und sie haben daher eine Ähnlichkeit von 0,77. 16α-OH-Estron und DES sind sogar noch ähnlicher, mit einem euklidischen Abstand von SQRT(7), was 2,645 ist, und sie haben daher eine Ähnlichkeit von 0,91.
Andererseits befinden sich die Fingerprints von Estradiol und Clomiphen in einem euklidischen von SQRT(210), was 14,49 ist. Dies entspricht einer Ähnlichkeit von 0,48.
Es wird anerkannt werden, dass wir die Wahl und/oder die Anzahl der beschreibenden Faktoren, die in diesen Fingerprint mit einbezogen sind, verändert haben könnten, die beschreibenden Faktoren auf irgendeine Art und Weise umskaliert und/oder gewichtet haben könnten, ein unterschiedliches Maß für den Abstand verwendet haben könnten und/oder den Abstand in eine Ähnlichkeit durch ein anderes Verfahren umgewandelt haben könnten. Wir könnten ebenso die Ähnlichkeit berechnet haben, ohne zunächst den Abstand zu berechnen.
In den obigen Text haben wir die Daten für ERα und ERβ zusammengefasst. Wir könnten separate Fingerprints und Ähnlichkeiten für jede Form des ER berechnet haben. Dies ist in 5 und 6 gezeigt.
So beträgt der Abstand für Puffer:Estradiol zwischen deren Fingerprints für das Binden an ERα SQRT(84) und für das Binden an ERβ SQRT(76) oder 9,16 und 8,72. Der maximale Abstand ist SQRT (8 × 7 × 7), was 19,8 ist. Somit sind die Ähnlichkeiten entsprechend 0,54 und 0,56, was nicht sehr unterschiedlich ist.
Andererseits berechnen wir für ICI 182 780:16α-OH-Estron Abstände von SQRT(6) für das Binden an ERα und SQRT(76) für das Binden an ERβ, was Ähnlichkeiten von 0,88 bzw. 0,56 entspricht. Somit sind diese Verbindungen ähnlicher darin, wie sie an ERα binden, als darin, wie sie an ERβ binden.
Diese Fingerprinttechnik stellt ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Verfügung, um Veränderungen bei einer Proteinkonformation zu erkennen. Wir haben diese Technik auf ERα und β angewendet und haben demonstriert, dass diese zwei Rezeptoren unterschiedliche konformationale Veränderungen in der Gegenwart von verschiedenen Aktivitätsmodulatoren unterlaufen. Da das Muster der Sondenbindung für jeden Modulator einzigartig ist, kann der Assay verwendet werden, um Verbindungen sowohl zwischen als auch innerhalb von Modulatorklassen zu unterscheiden. Der Assay kann ebenso verwendet werden, um Modulatoren zu identifizieren, die eine Spezifität für entweder die α- oder die β-Form des Rezeptors haben.
Eine oder mehrere Sonden können verwendet werden, um einen High-Throughput-Screen (HTS) aufzubauen, um Modulatoren der ER-Aktivität zu identifizieren. Verbindungen, die an den ER binden und die Rezeptorkonformation verändern, werden das Bindemuster der Sonden verändern. Diese Technik kann ebenso angewendet werden, um Treffer aus einem HTS als Agonist (entsprechend dem Estrogenmuster), Antagonist (entsprechend dem ICI 182,780-Muster) oder gemischt (entsprechend dem Tamoxifenmuster) zu klassifizieren, bevor sie in einem zellbasierten Assy überprüft werden. Fingerprinting kann ebenso für Strukturaktivitätsbeziehungen verwendet werden. Da chemische Modifikationen an Leitstrukturen gemacht werden, kann Fingerprinting ein bequemes Verfahren zur Verfügung stellen, um schnell zu bestimmen, ob die Modifikation die Rezeptorkonformation auf eine unterschiedliche Art und Weise beeinflusst als die Stammverbindung.
Alle der Verbindungen, die in dieser Studie verwendet wurden, sind dafür bekannt, einzigartige biologische Wirkungen in vivo zu produzieren. Viele der unterschiedlichen Wirkungen sind gewebespezifisch, möglicherweise aufgrund von unterschiedlicher Expression von Regulationsproteinen und/oder der zwei Formen des Rezeptors. Jede dieser Verbindungen produziert ebenso ein einzigartes Fingerprintmuster in vitro, abgeleitet von der Konformation, die durch Rezeptoren nach dem Binden an den Modulator angenommen wird. Somit wird erwartet, dass das Fingerprinting von konformationalen Veränderungen, die durch SERMs in vitro induziert werden, nützlich dafür sind, die biologischen Aktivitäten von Modulatoren in vivo vorherzusagen.
Beispiel 3: Fingerprinting unter Verwendung von Yeast Two-Hybrid-Cell basierten Assays
Die Two-Hybrid-Verfahren zum Untersuchen von Protein/Protein-Interaktionen, die ursprünglich durch Fields und Song (Nature 304:245-246 (1989) und später durch Gyrius et al. (Cell 75:791-803 (1993)) beschrieben wurden, verwenden ähnliche Technologien. In beiden Fällen wird eine Hefezelle als Wirtszelle zur Verfügung gestellt, welche ein Reportergen trägt, das durch einen stromaufwärts gelegenen Proteinbindeort (DNA-Bindeort) gesteuert wird. Die Wirtszellen tragen ein Plasmid, das Peptid/Protein-Fusionen mit dem spezifischen bindenden Protein oder einer Domäne (DNA-bindenden Domäne) exprimiert. Die Wirtszelle trägt ebenso ein Plasmid, das eine Peptid/Protein-Fusion mit einem transkriptionalen Aktivierungsprotein oder einer Domäne (Aktivierungsdomäne) exprimiert. Wenn die zwei Peptid/Protein-Fusionen zu direkten Interaktionen innerhalb der Zelle in der Lage sind, tritt die transkriptionale Aktivierung des Reportergens auf. Das Niveau der Reportergentranskription reflektiert die Stärke der Interaktion zwischen den zwei Proteinfusionen.
Das LexA-System, das wir verwenden, verwendet eine bakterielle DNA-bindende Proteindomäne, LexA, und eine bakteriell abgeleitete transkriptionale Aktivierungssequenz, B42. Proteine oder Peptide von Interesse werden in frame mit diesen Domänen fusioniert und unter Verwendung von episomalen Plasmiden in einer Hefezelle exprimiert. Die Interaktionen zwischen diesen Proteinen/Peptiden von Interesse werden durch das Überwachen des Spiegels des Reportergenprodukts, β-Galactosidase, durch einen enzymatischen Assay registriert. Die Unterschiede der Spiegel der β-Galatosidase-Aktivitäten stellen die relativen Stärken der Proteininteraktionen dar.
Wir haben die Interaktionen von den Peptiden F6 (einem affinitätsausgewählten Peptid mit einer hohen Affinität für ERα), alpha 2 (A2), alpha/beta 3 (AB3) und alpha/beta 5 (AB5) mit dem Estrogenrezeptor α unter Verwendung des LexA-Yeast-Two-Hybrid-Systems in der Gegenwart von Agonisten oder Antagonisten getestet. Diese Peptide wurden vorher aus Phagendisplaybibliotheken unter Verwendung von Estrogenrezeptor α (ERα) als Target isoliert. Die Interaktionen zwischen diesen Peptiden und ERα sind in der Gegenwart von Agonisten oder Antagonisten in dem in vitro-Phagendisplaysystem verändert. Beispielsweise wurde herausgefunden, dass das Peptid α2 in der Gegenwart von Estradiol und 4-OH-Tamoxifen bindet, aber nicht in deren Abwesenheit; das Peptid α/β 3 bindet an ERα nur in der Gegenwart von 4-OH-Tamoxifen, nicht in der Gegenwart von Estradiol oder in der Abwesenheit von irgendeiner Verbindung. Wir haben die Yeast-Two-Hybrid-Analyse unternommen, um zu untersuchen, ob diese in vitro erhaltenen Resultate in vivo rekapituliert werden könnten. Die Resultate aus dem Yeast-Two-Hybrid-System waren qualitativ ähnlich zu denjenigen, die unter Verwendung von Phagendisplay oder aufgereinigtem ERα-Protein ausgeführt worden sind.
Hefestämme und genetische Manipulationen
Referenzen für Plasmide und Stämme
Cloningvektor pJG4-5

Genbankzugangsnummer: U89961
Referenz: Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. und Brent, R. Cdi1, a human G1 und S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75 (4), 791-803 (1993)

Cloningvektor pEG202 (pLexA), vollständige Sequenz

Genbankzugangsnummer: U89960
AUTOREN: Golemis, E., Gyuris, J. und Brent, R.
TITEL: Interaction trap/two-hybrid systems to identify interacting proteins
JOURNAL: nicht publiziert

pJK103

Referenz: J. Kamens und R. Brent: A yeast transcription assay defines distinct rel and dorsal DNA recognition sequences. New Biol. 3:1005-1013 (1991)

Hefestamm EGY48

Referenz. Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. und Brent, R. Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75 (4), 791-803 (1993)

Die Hefestämme, die in dieser Studie verwendet wurden, waren EGY48 (MATα trp1 his3 ura3 Ieu2::61exAops-LEU2), erworben von OriGene Technologies für die Yeast-Two-Hybrid-Analyse. Dieser Stamm enthält 6 LexA-Operatoren stromaufwärts des LEU2-Gens in dem Hefegenom und stellt eine hohe Empfindlichkeit beim Detektieren der Protein-Protein-Interaktionen in dem LexA Two-Hybrid-System zur Verfügung. Die Plasmide, die in dieser Studie verwendet wurden, waren pEG202 (LexA-DNA-bindende Domäne), pJG4-5 (B42-Aktivierungsdomäne) und das Plasmid enthaltend einen β-Galactosidasereporter, pJK103 (OriGene Technologies). Der Gesamtlängenestrogenrezeptor wurde in frame in die EcoRI- und Xhol-Orte von pJG4-5 subkloniert, um eine ERα-B42-Aktivierungsdomänenfusion zu bilden. ERα wurde in das Aktivierungsdomänenplasmid kloniert, da ERα in der Lage war, Reporter zu autoaktivieren, wenn er mit der LexA-DNA-bindenden Domäne fusioniert wurde.
Die Peptidsequenzen, die in dieser Studie verwendet worden sind, wurden aus synthetischen Oligos gebildet, vervollständigt durch T7-Sequenase (Life Science) und subkloniert in die EcoRI-Xhol-Orte von pEG202. Die synthetischen Oligos waren:
F6, 5'-GACTGTGCGAATTCGGTCATGAACCATTAACTTTATTAGAAAGATTATTAATGGATGRTAAACAAGCTGTTCTCGAGCGTGTCAG;
αII, 5'-GACTGTGCGAATTCTCTTCTTTAACTTCTAGAGATTTTGGTTCTTGGTATGCTTCTAGACTCGAGCGTGTCAG;
α/βIII, 5'-GACTGTGCGAATTCTCTTCTTGGGATATGCATCAATTTTTTTGGGAAGGTGTTTCTAGAC TCGAGCGTGTCAG;
α/βV, 5'-GACTGTGCGAATTCTCTTCTCCAGGTTCTAGAGAATGGTTTAAAGATATGTTATCTAGACTCGAGCGTGTCAG.
Das komplementäre synthetische Oligo, das verwendet wurde, um doppelsträngige DNA zu bilden, war 3'XhoPrim, 5'-CTGACACGCTCGAG. Jedes 5'-Oligo wurde an das 3'-Oligo durch Erhitzen auf 90 °C 15 Minuten lang und durch langsames Abkühlen auf 35 °C annealed. T7-Sequenase wurde hinzugefügt und der Auffüllreaktion wurde es erlaubt, bei 30 °C 30 Minuten lang fortzuschreiten. Die Reaktion wurde durch Hitzedenaturieren des Enzyms bei 65 °C 1 Stunde lang beendet, Restriktionsverdaue wurden ausgeführt und die resultierenden DNA-Fragmente wurden in pEG202 subkloniert, um Peptid-LexA-DNA-bindende Domänenfusionen zu bilden.
Hefezellen wurden durch das Verfahren von Ito et al. (J. Bacteriol. 153:163-168 (1983)) transformiert und auf selektiven Medien wachsen gelassen.
β-Galactosidase-Aktivitätsassays
10-ml-Kulturen des Hefestammes EGY48, enthaltend pJG4-5 ERα pJK103 und pEG202-F6, -αII, -α/βIII oder -α/βV, wurden über Nacht bei 30 °C in selektiven Medien, enthaltend 100 nM Estradiol, 4-OH-Tamoxifen oder Tamoxifencitrat mit Galactose als Kohlenstoffquelle, wachsen gelassen. Die Kultur wurde auf ~2 × 106 Zellen/ml in dem gleichen Medium verdünnt und es wurde bei 30 °C erlaubt, weiterzuwachsen, bis die Kulturen eine Dichte von ~1 × 107 Zellen/ml erreichten (~4 Stunden). Die Hefezellen wurden durch Zentrifugation pelletiert, mit Extraktionspuffer (60 mM Na₂NPO₄, 40 mMNaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM PMSF, 7 mM 2-Mercaptoethanol) gewaschen und in 200 μl Extraktionspuffer resuspendiert. 100 μl säuregewaschene Glaskügelchen wurden hinzugefügt und die Zellen wurden durch kräftiges Schütteln 10 Minuten lang bei 4 °C lysiert. Der zelluläre Debris wurde durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen übertragen. 10 μg gesamtes zelluläres Protein wurde in vollständigem Z-Puffer verdünnt (60 mM Na₂HPO₄, 40 mMNaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 7 mM 2-Mercaptoethanol) bis zu einem Volumen von 100 μl in einer 96-well-Mikroplatte. 80 μg o-Nitrophenyl-β-D-pyranosid (ONPG) in 20 μl wurden zu jedem Well hinzugefügt, um eine Farbentwicklung zu initiieren. Die Reaktion wurde durch die Hinzufügung von 30 μl 1 M Na₂CO₃ gestoppt und die Zeit für die Entwicklung wurde notiert. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm bestimmt.
Hefekulturen wurden in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von 100 nM Estradiol, 4-Hydroxytamoxifen oder Tamoxifencitrat wachsen gelassen und Proteinextrakte wurden hergestellt, wie unter Verfahren beschrieben. 10 μg jedes Proteinextrakts wurden im Rahmen eines Assays hinsichtlich der β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung von o-Nitrophenyl-β-D-pyranosid als Substrat überprüft. Aktivitätseinheiten wurden definiert als 1000 × Abs₄₀₅/Minuten/mg/Protein.
Die Resultate sind in Tabelle 99 gezeigt.
Die Peptide, die in dem Two-Hybrid-Assay verwendet wurden, wurden ursprünglich durch Phagendisplay unter Verwendung von ERα als Targetprotein isoliert. Die Isolationsprozedur wurde in der Gegenwart von Agonisten oder Antagonisten (Estradiol, 4-Hydroxytamoxifen, ...) ausgeführt, was einen unterschiedlichen Satz interagierender Peptide bildete. Die Interaktionen dieser Peptide mit ERα wurden in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Agonisten und Antagonisten untersucht. Das Interaktionsprofil, das durch diese in vitro-Studien gebildet wurde, erlaubt es uns, diese Peptide als Sonden für den physischen Zustand des Estrogenrezeptors zu verwenden. Der Two-Hybrid-Assay zeigt, ob diese Interaktionen innerhalb der Zelle beibehalten werden können.
Die Resultate aus den Two-Hybrid-Experimenten zeigen ein qualitativ ähnliches Interaktionsprofil zwischen den Peptiden und ERα, wie in vitro bestimmt. Daher werden die Wirkungen von Agonisten und Antagonisten auf die Struktur und Erhältlichkeit von Peptidbindeorten auf ERα in vitro und in vivo beibehalten. Diese Resultate erlauben die Interpretation des strukturellen Zustands (aktiviert oder antagonisiert) von ERα als Antwort auf verschiedene Verbindungen. Die Resultate unter Verwendung von bekannten Aktivatoren und Antagonisten können verwendet werden, um andere nicht bekannte Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten im Rahmen eines Medikamentenscreens zu identifizieren. Die Erhältlichkeit von mehr Peptiden und die Verwendung von anderen bekannten Agonisten und Antagonisten wird bessere Werkzeuge zum Identifizieren von möglichen Verbindungen oder Leitstrukturen bilden.
Beispiel 4. Verwendung von Säugetier Two-Hybrid-Assays, um die ER-Aktivierung zu untersuchen
Der Estrogenrezeptor (ER) spielt eine wichtige Rolle sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Prozessen der menschlichen Entwicklung und von Erkrankungen. Klinisch hatten ER-Antagonisten, so wie Tamoxifen, viel Erfolg bei der Behandlung von ER-enthaltenden Brustkrebsen. Jedoch entwickelt sich eine Resistenz gegenüber Tamoxifen normalerweise innerhalb von 2-5 Jahren nach der ursprünglichen Behandlung. Ein möglicher Mechanismus zur Resistenzbildung kann die Fähigkeit von Tumoren sein, vom Erkennen von Tamoxifen als Antagonist zur Antwort auf Tamoxifen als Agonist umzuschalten.
In dieser Hinsicht wurden verschiedene neue gewebespezifische Antiestrogene entwickelt, welche eine klinische Anwendbarkeit bei der Behandlung von Tamoxifenrefraktorischen Brustkrebsen haben könnten.
In einem Versuch, neue Liganden mit hoher Affinität zu identifizieren, welche den ER/Tamoxifen-Komplex anstreben, haben wir die Verwendung von Phagendisplay benutzt, um nach zufälligen Peptiden zu suchen, welche die spezifische ER-Konformation erkennen werden, die durch Tamoxifen induziert wird. Wir haben eine Serie von 15mer-Peptiden isoliert, welche diesen Komplex erkennen können. Darüber hinaus sind diese Peptide in der Lage, in vivo mit ER Komplexe zu bilden, wie in dem Säugetier-Two-Hybrid-System untersucht. Unter Verwendung von verschiedenen ER-Mutanten haben wir die Peptidinteraktionsoberfläche der hormonbindenden Domäne zugeordnet. Wichtigerweise haben wir demonstriert, dass die Expression dieser Peptide die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen in Zellen, die mit ER transfiziert sind, blockieren kann. Auch wenn der Mechanismus, durch diese Peptide die ER/Tamoxifen-transkriptionale Aktivität blockieren, unbekannt bleibt, scheint es, dass das DNA-Binden und die ER-Stabilität durch die Peptidexpression nicht beeinflusst werden. Daher ist es möglich, dass diese Peptide einen funktional aktiven Ort zum Ziel haben, der in der ER/Tamoxifen-Konformation vorhanden ist.
Dies ermöglicht eine neue Herangehensweise in der Entwicklung von rationellem Medikamentendesign für die Behandlung von Tamoxifen-refraktorischen Brustkrebsen. Traditionell wurden nur Moleküle für die Entwicklung neuer ER-Antagonisten in Erwägung gezogen, die mit der Ligandenbindetasche interagieren. Zusätzlich zu diesen traditionellen "hormonalen" Mitteln schlagen wir vor, dass die Fähigkeit, spezifische Rezeptorkonformationen, die durch Hormone induziert werden, anzustreben, in der Entwicklung von therapeutisch wichtigen neuen Pharmazeutika resultieren wird. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse auf andere nukleare Rezeptoren angewendet werden, für welche die transkriptionale Unterbrechung klinisch nützlich sein könnte.
Beispiel 4.1
7 zeigt die Entwicklung eines zellbasierenden Assays, um die Peptidrezeptorinteraktionen zu überprüfen. Peptidsequenzen, die jede Klasse repräsentieren, wurden an die DNA-bindende Domäne (DBD) von Hefetranskriptionsfaktor Gal4 fusioniert. HepG2-Zellen wurden dann transient mit Expressionsvektoren für ERα-VP16 und die Gal4-Peptidfusionsproteine transfiziert. Zusätzlich wurde ein Luciferasereporterkonstrukt unter der Kontrolle von 5 Kopien eines stromaufwärts gelegenen Gal4-Enhancerelements ebenso gemeinsam mit einem pCMV-β-Galactosidasevektor transfiziert, um hinsichtlich der Transfektionseffizienz zu normalisieren. Die Transfektion von Gal4 DBD alleine ist als Kontrolle ebenfalls beinhaltet. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Liganden wie in der Figur angegeben induziert und hinsichtlich der Luciferaseaktivität und der β-Galactosidase-Aktivität im Rahmen eines Assays überprüft. Die normalisierte Antwort wurde durch Dividieren der Luciferaseaktivität durch die β-Galactosidase-Aktivität erhalten.
Ergebnisse. ERα interagiert nicht mit der Gal4 DBD alleine in irgendeiner Umgebung. αβI interagiert mit ER in der Gegenwart von Estradiol und etwas mit dem Aporezeptor. αII interagiert mit dem Rezeptor unter allen Bedingungen, wobei der Aporezeptor und der ICI 182,780-gebundene Rezeptor die wenigste Aktivität zeigen. αβIII und αβV interagieren fast ausschließlich mit dem Tamoxifen-gebundenen Rezeptor. Diese Daten bestätigen im Allgemeinen die Daten, die aus der zeitaufgelösten Fluoreszenzstudie erhalten worden sind. Weiterhin bestätigt die Fähigkeit dieser Peptide, als konformationale Detektoren in der Zelle zu agieren, frühere Beobachtungen, die aus Proteaseverdau und Kristallisationsstudien erhalten wurden, dass der Rezeptor unterschiedliche konformationale Veränderungen unterläuft, wenn er durch unterschiedliche Liganden gebunden wird.
Beispiel 4.2
Die Spezifität der Peptid-Nuklearrezeptor-Interaktion wurde unter Verwendung des Säugetier-Two-Hybrid-Systems analysiert (8). Das experimentelle Design ist dasselbe wie in 2, außer dass entweder Progesteronrezeptor (PRB-VP16), Estrogenrezeptor beta (ERβ-VP16), Glucocorticoidrezeptor (GR-VP16) oder Thyroidrezeptor beta (TRβ-VP16) getestet wurden.
Resultate. Alle getesteten Rezeptoren interagierten wie erwartet mit dem aβI-Peptid in der Gegenwart des entsprechenden Agonisten für den Rezeptor. Keiner dieser Rezeptoren, die getestet wurden, interagierten signifikant mit dem αII- oder αβIII-Peptid. Dies war etwas überraschend unter Berücksichtigung der Tatsache, dass αβIII ursprünglich mit ERβ isoliert wurde. Dies suggeriert, dass die Konformation von ERβ in der Zelle unterschiedlich von der des aufgereinigten Rezeptors in vitro sein könnte. Interessanterweise war αβV in der Lage, sowohl mit PRB als auch mit ERβ zu assoziieren. Dieses Peptid band an ERβ nur in der Gegenwart von Tamoxifen, aber war in der Lage, mit PRB in der Gegenwart des PR-Antagonisten RU 486 und ZK 98299 zu assoziieren. Dies suggeriert, dass αβV in der Lage ist, die antagonistische Konformation einer Untergruppe von Familienmitgliedern der Nuklearrezeptoren zu erkennen.
Beispiel 4.3
9 demonstriert, dass gewisse Peptide, welche mit dem Tamoxifen-aktivierten Estrogenrezeptor interagieren, AF-2 des Rezeptors (Helix 12) nicht erfordern. Drei ER α-Mutanten wurden mit Wildtyp-ERα verglichen. ER-LL war durch die Mutationen L540A/L541A gekennzeichnet. Die Mutante ER3X war durch die Mutationen D538N/E542Q/D545N gekennzeichnet. Schließlich war die Mutante ER535-stop nach dem Rest V535 trunkiert. Es wurde gezeigt, dass diese Mutationen signifikant die ER-AF-2-transkriptionale Aktivität und deren Interaktion mit verschiedenen bekannten Coaktivatoren kompromittieren. Die Mutante ER3X ist insbesondere AF-2-aktiv, und ERLL und ER535-stop sind AF-2-inaktiv. Das experimentelle Design ist dasselbe wie in 7, außer dass entweder (A). ER3X, (B) ERLL oder (C) ER535-stop hinsichtlich des Bindens an konformationssensitive Peptide analysiert wurde.
Resultate. αβI-Peptid ist nicht in der Lage, mit den ERLL- und ER535-stop-Rezeptorenmutanten in der Gegenwart von Estradiol zu interagieren, was anzeigt, dass diese Mutationen das Binden des Coaktivators unterbinden könnten. Das αβI-Peptid behält einige Fähigkeit bei, mit der ER3X-Rezeptormutante in der Gegenwart von Estradiol in Wechselwirkung zu treten, was suggeriert, dass diese Mutationen die Affinität des Rezeptors für Coaktivatoren signifikant vermindern, aber dass sie diese Interaktionen nicht zerstören. Diese Erkenntnisse sind konsistent mit den transkriptionalen Eigenschaften dieser Rezeptoren. Die αII-Peptid-Bindespezifität bleibt im Wesentlichen durch jede der getesteten Rezeptormutationen unbeeinflusst. Interessanterweise wird die αβIII- und αβV-Peptidspezifität der Interaktion mit jeder folgenden Mutation modifiziert, was in einem Verlust der Tamoxifenspezifität resultiert und in der Fähigkeit dieser Peptide, mit dem Rezeptor in der Gegenwart von vielen der Liganden, die getestet wurden, in Wechselwirkung zu treten, resultiert. Diese Resultate suggerieren, dass, obwohl Helix 12 für das Binden der Peptide, welche die Konformation, die durch Tamoxifen induziert wird, erkennen, nicht erforderlich ist, die normale Helix 12-Struktur für die Spezifität der Wechselwirkung von αβIII- und αβV-Peptiden erforderlich ist.
Beispiel 4.4
10 studiert die Unterbrechung der ER-vermittelten transkriptionalen Aktivität durch Gal4-Peptidfusionsproteine. HepG2-Zellen wurden mit dem estrogenempfindlichen C3-Luc-Reportergen transfiziert, zusammen mit den Expressionsvektoren für ERα und β-Galactosidase. Die Zellen wurden entweder mit Estradiol oder Tamoxifen wie in der Figur angegeben induziert und hinsichtlich der Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität (10A) analysiert.
Dann wurden HepG2-Zellen wie oben transfiziert, außer dass Expressionsvektoren für Gal4-Peptidfusionen wie in 10B angegeben beinhaltet waren. Die Kontrolle stellt die transkriptionale Aktivität von Estradiol (10 nM)-aktiviertem ER in der Gegenwart von dem Gal4-DBD alleine dar und ist als 100%ige Aktivität gesetzt. Ansteigende Mengen des Inputplasmids für jede Gal4-Peptidfusion ist ebenso gezeigt mit der resultierenden transkriptionalen Aktivität, die als %-ige Aktivierung der Kontrolle angegeben ist. Die Daten sind als Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten (jedes dreifach durchgeführt) angegeben, wobei Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts angeben, unter Fig. C ist dasselbe wie in (B), außer dass 4-OH-Tamoxifen verwendet wurde, um den Rezeptor zu aktivieren.
Resultate. Tamoxifen zeigt eine partielle agonistische Aktivität in HepG2-Zellen. Diese Aktivität beträgt bis zu 30 % der Aktivität, die durch Estrogen gezeigt wird. αβI- und αII-Peptide sind nicht in der Lage, die Fähigkeit von Estradiol, die Transkription bis zu 50 % unter den Assaybedingungen zu aktivieren, zu inhibieren. Es ist nicht überraschend, dass das αβI-Peptid die ER-Aktivität inhibiert aufgrund der Tatsache, dass es möglicherweise mit der Coaktivatorbindung in Wettbewerb tritt. Die Fähigkeit des αII-Peptids, die ER-transkriptionale Aktivität zu unterbrechen, könnte suggerieren, dass dieses Peptid eine Tasche in dem Rezeptor erkennt, die ebenso für die Coaktivatorbindung wichtig ist. Die Unfähigkeit von αβIII und αβV, Estradiolvermittelte Transkription zu blockieren, korreliert gut mit deren Unfähigkeit, den Rezeptor zu binden, wenn er durch Estradiol gebunden ist. Interessanterweise sind αII, αβIII und αβV in der Lage, effizient die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen zu blockieren, während αβI dies nicht ist. Diese Erkenntnisse befinden sich in Übereinstimmung mit den Bindeeigenschaften dieser Peptide und könnten suggerieren, dass die Tasche oder die Taschen, die durch diese Peptide erkannt werden, wichtig für die Fähigkeit von Tamoxifen ist, als partieller Agonist zu wirken.
Beispiel 4.5
11 zeigt, dass die Unterbrechung von Tamoxifen-aktivierter ER-transkriptionaler Aktivität durch das αII-Peptid nicht promotorabhängig ist. Das experimentelle Design ist dasselbe wie in 6, außer dass die Fähigkeit des αII-Peptids, die Tamoxifen (10 nM)-aktivierte Transkription zu inhibieren, mit verschiedenen unterschiedlichen Promotoren, einschließlich 1X-ERE-Luc, 3X-ERE-Luc, TK-ERE-Luc und C3-Luc, getestet wurde.
Resultate. Die Fähigkeit des αII-Peptids, die Tamoxifen-aktivierte Transkription zu blockieren, hängt nicht von dem Kontext des Promotors ab. Dieses Peptid blockiert die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen bei allen getesteten Promotoren.
Beispiel 4.6
12 zeigt die Unterbrechung der ER-vermittelten transkriptionalen Aktivität durch den AP-1-Weg durch Gal4-Peptidfusionsproteine. (A) HepG2-Zellen wurden mit dem AP-1-empfindlichen Kollagenasereportergenkonstrukt (pCOL-Luc) und mit Expressionsvektoren für ERα und β-Galactosidase transfiziert. Die Zellen wurden dann entweder mit Estradiol oder mit Tamoxifen wie in der Figur angegeben induziert und im Rahmen eines Assays hinsichtlich der Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität geprüft und wie in 7 ausgeführt normalisiert. (B) Wie (A), außer dass GAl4-Peptidfusionskonstrukte ebenso transfiziert wurden, wie in der Figur angegeben. Die Kontrolle stellt die transkriptionale Aktivität von entweder Estradiol oder Tamoxifen (100 nM)-aktiviertem ER in der Gegenwart von Gal4 DBD alleine dar und wird auf 100 % Aktivität gesetzt. Die transkriptionale Aktivität von Estradiol und Tamoxifen ist in der Gegenwart jeder Gal4-Peptidfusion mit der resultierenden transkriptionalen Aktivität, dargestellt als %-ige Aktivierung der Kontrolle, gezeigt. Die angegebenen Daten stammen aus einem einzelnen repräsentativen Experiment.
Resultate. Sowohl Estradiol als auch Tamoxifen sind in der Lage, die Transkription des AP-1-empfindlichen Kollagenasereportergens zu aktivieren. Diese Aktivität ist in der Abwesenheit eines Estrogenresponseelements (ERE) manifestiert, und es wird vermutet, dass sie durch einen Mechanismus abläuft, der eine Interaktion zwischen ER und den AP-1-Proteinen Fos und Jun beinhaltet. Wie mit dem C3-Luc-Reportergen ist jedes Peptid in der Lage, die ER-vermittelte transkriptionale Aktivität gemäß dessen Fähigkeit, mit dem Rezeptor auf eine ligandenabhängige Art und Weise zu interagieren, zu inhibieren. Diese Peptide, welche mit dem Estradiol-gebundenen Rezeptor interagieren, inhibieren die Estradiol-vermittelte Transkription, während diejenigen, die mit dem Tamoxifen-gebundenen Rezeptor interagieren, die Tamoxifen-vermittelte Transkription inhibieren.
Beispiel 4. 7
13 ist ein Modell der potentiellen Mechanismen, durch welche Peptide die partielle agonistische Aktivität von Tamoxifen blockieren. (A) Modell des Aktivierungswegs, durch welchen Tamoxifen seine partielle agonistische Aktivität aufzeigt. Nach dem Binden an Tamoxifen (T) macht der Rezeptor eine konformationale Änderung durch, welche es ihm erlaubt, mit einem bisher nicht identifizierten Coaktivatorprotein zu interagieren Dieses Protein übermittelt wiederum ein Signal zu der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie, was in einer Aktivierung der Transkription resultiert. (B) Bei diesem Inhibierungsmodell unterläuft der Rezeptor eine konformationale Veränderung, wenn er durch Tamoxifen gebunden ist, aber das Coaktivatorprotein ist nicht in der Lage, mit dem Rezeptor in Wechselwirkung zu treten, da es sich in einem Wettbewerb mit dem Peptid für denselben Ort befindet. (C) Bei diesem Inhibierungsmodell unterläuft der Rezeptor eine Konformationsveränderung in der Gegenwart von Tamoxifen, was in der Bildung von bestimmten Taschen auf dem Rezeptor resultiert. Eine Tasche, welche von dem Coaktivatorbindeort entfernt liegt, interagiert mit dem Peptid. Als Ergebnis dieser Interaktion tritt eine zusätzliche konformationale Änderung auf, die die Interaktion zwischen dem Coaktivator und dem Rezeptor verhindert.
Beispiel 5
20 zeigt eine Ähnlichkeitsanalyse der Daten, die in 7 abgebildet sind. Jeder Ligand hat einen Footprint, der aus fünf Elementen besteht, wobei die Elemente der normalisierten transkriptionalen Antwort entsprechen, welche er in einem Säugetier-Two-Hybrid-System verursacht hat, das entweder den Aporezeptor (Kontrolle) oder den Rezeptor in der Gegenwart von einem der Peptide αβ1, α2, αβ3 oder αβ5 präsentiert.
Beispiel 101
Einer der distalen Schritte bei der transkriptionalen Aktivierung durch den Estrogenrezeptor (ER) ist die Rekrutierung von einem aus einer Anzahl an Coaktivatorproteinen durch den ligandengebundenen Rezeptor. Diese Aktivität erlaubt es ER, mit der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie zu interagieren und dessen regulative Wirkungen auf Targetgenpromotoren auszuüben. Es hat sich nun herausgestellt, dass eine der Wirkungen der Agonistbindung es ist, eine konformationale Änderung innerhalb des ER zu induzieren, was die Interaktion der ER-Helices 3 und 12 erlaubt und die anschließende Bildung einer Tasche verursacht, welche es den Coaktivatorproteinen erlaubt, anzudocken. Diese Beobachtungen suggerieren, dass Rezeptorantagonisten die ER-transkriptionale Aktivität durch Beeinflussen der Bildung der Coaktivatorbindetasche und durch Reduzieren der Affinität von ER für Coaktivatoren inhibieren. Auch wenn ein ER-spezifisches Coaktivatorprotein noch identifiziert werden muss, wurden einige Coaktivatoren identifiziert, die die transkriptionale Aktivität von ER und anderen Mitgliedern der Steroidrezeptorüberfamilie potenzieren. Weiterhin hat die Erkenntnis, dass die Coaktivatoren eine hochkonserviertes LXXLL-Motiv verwenden, um mit den Rezeptoren zu interagieren, es unsicher gemacht, ob Rezeptorcofaktorinteraktionen durch einfache Kompetition bestimmt werden oder ob etwas mehr Spezifität in das System eingebaut ist.
Um diese Möglichkeiten zu überprüfen, haben wir eine molekulare Herangehensweise gewählt, um die LXXLL-ER-Interaktion detailliert zu untersuchen und um die Rolle der flankierenden Sequenzen bei der Einflussnahme auf diese Interaktionen zu bewerten. Wir haben Phagendisplaytechnologie verwendet, um 10 × 107 Variationen des LXXLL-Kernmotivs zu screenen. Unter Verwendung von Estradiol-aktiviertem ER als Target haben wir eine Anzahl Phagen identifiziert, welche für ER-interagierende Peptide mit hoher Affinität codierten. Unter Verwendung der Sequenzinformation, die von diesen Phagen abgeleitet wurde, haben wir eine Serie von GAL4-Peptidfusionen konstruiert und ihre Fähigkeit überprüft, mit ERα, ERβ, GR und PR zu interagieren, wobei wir einen Two-Hybrid-Assay in Säugetierzellen verwendet haben. Die Resultate dieses Assays haben bestätigt, dass das LXXLL-Motiv das Binden an nukleare Rezeptoren zulässt, aber sie haben auch ergeben, dass die Sequenzen, die dieses Motiv flankieren, wichtige Determinanten für die Spezifität sind. Somit sind, wie erwartet, nicht alle LXXLL-Motive gleich. Dies suggeriert, dass innerhalb einer Zelle Spezifität und nicht nur Massenwirkung die Fähigkeit eines Nuklearrezeptors beeinflusst, einen erforderlichen Cofaktor zu finden. In einem Versuch, die Mechanismen zu verstehen, die dieser beobachteten Spezifität zugrunde liegen, haben wir die Fähigkeit dieser Peptidfusionen überprüft, mit einer Serie von ER-Helix-12-Mutanten zu interagieren. Unter Verwendung dieser Herangehensweise haben wir bemerkt, dass die Mutation der konservierten hydrophoben Reste in dieser Helix die ER-AF-2-Funktion unterbindet und die Interaktion aller LXXLL-Peptide mit ER blockiert. Die Unterbrechung der Helix 12 durch Mutieren der drei konservierten geladenen Reste (D538N/E542Q/D545N) verhinderte, dass die meisten Peptide binden, und unterband ebenfalls die AF-2-Funktion. Jedoch blieben eine große Anzahl der untersuchten LXXLL-enthaltenden Peptide durch diese Manipulation unbeeinflusst. Dies ist eine wichtige Beobachtung, da die letztere Mutation ebenso die Interaktion von ER mit GRIP-1 und SRC-1 blockiert. Kumulativ zeigen unsere Daten, dass die Steroidrezeptoren deutliche Vorzüge für unterschiedliche LXXLL-Motivklassen aufzeigen, was eine molekulare Basis für die Cofaktor-Rezeptorspezifität suggeriert. Wichtig ist jedoch, dass sie ebenso zeigen, dass AF-2- Funktion und Coaktivatorbindung nicht synonym sind, ein Ergebnis, das zeigt, dass es wahrscheinlich ist, dass es zusätzliche Cofaktoren gibt, die von SRC-1 und GRIP-1 verschieden sind, welche noch entdeckt werden müssen.
Plasmide: Alle Gal4DBD-Peptidfusionen wurden wie folgt konstruiert: DNA-Sequenzcodes für die Peptide wurden aus einem mBAX-Vektor mit Xhol- und Xbal-Restriktionsenzymen ausgeschnitten und in einen pMsx-Vektor mit einer Linkersequenz subkloniert, der vom pM-Vektor (Clontech) abgeleitet war, um in frame Sall- und Nhel-Orte zum Klonieren zu bilden. Ein VP16ER-a-Konstrukt wurde durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) aus gesamtlängenhumaner ERα-cDNA mit Primern gebildet, die eine EcoRI-Flankierung sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden enthielten. Das PCR-Produkt wurde dann in den pVP16-Vektor (Clontech) subkloniert, um die VP16-ERα-Fusion zu bilden, wobei VP16 an dem N-Terminus der ERα-cDNA angeordnet ist. pVP16-ERβ, pVP16-RARα und pVP16-RXRα wurden auf eine ähnliche Art und Weise gebildet. pVP16VDR ist eine großzügige Gabe von J.W. Pike (University of Cincinnati, Cincinnati, OH); VP16TRβ-Expressionsplasmid (pCMX-VP-F-hTRβ wurde durch D.D. More (Baylor College of Medicine, Houston, TX zur Verfügung gestellt; VP16Gr, VP16PR-b und VP16AR waren Gaben von J. Miner (GR), D.X. Wen (PR-a und Pr-b) und K. Marschke (AR) (Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA). VP16-ER-Mutantenkonstrukte wurden durch das Ausschneiden von mutierten ER-cDNAs aus ER-Expressionsplasmiden gebildet (ER-TAF1, ER-LL und ER-535-Stopplasmide, Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 1994 (8):21-30 und Norris et al., J. Biol. Chem. (273):6679-6688, 1998) und in den pVP16-Vektor subkloniert. Säugetierexpressionsplasmide für ERα, ERβ und ER179C ebenso wie das 3xERELuc-Rezeptorkonstrukt sind woanders beschrieben (Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 1994 (8):21-30). Das 5xGal4Luc3-Konstrukt wurde aus dem 5xGal4-TATALuc-Plasmid modifiziert (eine Gabe von X.F. Wang, Duke University, Durham, NC), wobei das Luciferasegen durch eine modifizierte Version der Luciferase-cDNA aus dem basalen pGL3-Vektor (Promega) ersetzt wurde, GRIP-1- und SRC-1-Konstrukte wurden durch Subklonieren von PCR-Produkten entsprechend GRIP-1 a.a. 629-760 und SRC-1 a.a. 621-765 in den pM-Vektor gebildet (P.H. Giangrande, nicht publizierte Daten). Alle PCR-Produkte wurden sequenziert, um die Richtigkeit der resultierenden Konstrukte sicherzustellen.
Beispiel 101.1
Eine fokussierte zufällige Peptidbibliothek (X₇-LXXLL-X₇, X = irgendeine AA, L = Leu) wurde konstruiert und in M13-Pagen ausgestellt.
Baculovirus-exprimierter Gesamtlängen-ERα wurde mit 10^–6 M 17β-Estradiol behandelt und auf 96-well-Immulon-4-Platten als Selektionstargets immobilisiert. M13-Phagen-basierte zufällige Peptidbibliotheken wurden mit Targetproteinen in den Wells inkubiert, ER-bindende Phagen wurden zurückgehalten, während nichtgebundene Phagen abgewaschen wurden. Gebundene Phagen wurden durch einen Puffer mit niedrigem pH-Wert eluiert, in DH5αF'-Zellen amplifiziert und einer anschließenden Selektionsrunde ausgesetzt. Die Auswahlverfahren wurden 2- bis 3-mal wiederholt, um die ER-bindenden Phagen anzureichern. Die individuellen Phagen wurden plaque-aufgereinigt, amplifiziert und deren Bindeeigenschaften wurden durch ELISA untersucht. Phagen, die an ER nur in der Gegenwart von Estradiol banden, wurden ausgewählt und die Peptidsequenzen wurden durch DNA-Sequenzieren abgeleitet (Tabelle 101).
Die LXXLL-Motiv-enthaltenden Peptide sind die hauptsächlich bindenden Spezies bei der Affinitätsauswahl, wenn Estradiol-aktivierter ERα als Target verwendet wurde. ER4 (Tabelle 101) bindet an agonistenbesetzten ER, aber nicht an ER, die durch partielle Agonisten oder Antagonisten besetzt sind.
Beispiel 101.2
Die Fähigkeit des ER4-Peptids, mit ERα in Säugetierzellen zu interagieren, wurde in einem Säugetier-Two-Hybrid-System überprüft. Die ER4-Peptidsequenz wurde an die Gal4 DNA-bindende Domäne (GAL4DBD) fusioniert, während der Gesamtlängen-ER mit der VP16-Transaktivierungsdomäne fusioniert wurde. Die Interaktion zwischen dem ER4-Peptid und ERα wird durch die Expression des 5xGal4Luc3-Reportergens gemessen. HepG2-Zellen wurden transient mit (14A) dem ERα-Expressionsvektor und dem Reporter 3xERELuc oder (14B) Gal4DBD-ER4, VP16-ERα und 5xGal4Luc3 transfiziert und mit unterschiedlichen ER-Liganden behandelt. Die Luciferaseaktivität wurde in Bezug auf die Aktivität des cotransfizierten pCMVβgal normalisiert. Die Fähigkeit von ER4, mit ERα in der Gegenwart von unterschiedlichen ER-Agonisten zu interagieren, war parallel zu der ER-Transaktivierungsfunktion, wie durch den 3xERELuc-Reporter überprüft. Jedoch inhibierten partielle Agonisten oder Antagonisten diese Interaktion (14C und 14D). Daher stellen die LXXLL-enthaltenden Peptide eine empfindliche Sonde für die AF2-Aktivierung dar.
Beispiel 101.3
Um zu testen, ob unterschiedliche Peptide mit dem LXXLL-Motiv mit der gleichen Region des ER interagieren, wurden Säugetier-Two-Hybrid-Assays verwendet.
Ausgewählte Peptidsequenzen und unterschiedliche ER-Mutanten (ER-LL, ER-3X, ER-535 STOP) wurden als Fusionsproteine mit Gal4DBD bzw. VP16 (TAD) exprimiert. Die Bindeaffinität unterschiedlicher Peptide (ER4, F6, D47, C33, D22, D48) an Wildtyp-ER und die drei ER-Mutanten wurde durch die Expression des 5xGal4Luc3-Reporterkonstrukts gemessen. GRIP-1*- und SRC-1*-Konstrukte enthalten die zentralen drei Kopien des LXXLL-Motivs (a.a. 629-761 für GRIP-1 und a.a. 622-765 for SRC-1), fusioniert an Gal4DBD. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
Beispiel 101.4
HeLa-Zellen wurden mit dem ERα-Expressionsplasmid (RST7ERα), 3xERELuc-Reporter, pCMVβgal zusammen mit unterschiedlichen Peptid-Gal4DBD-Fusionskonstrukten transfiziert. pM ist die Gal4DBD-Kontrolle ohne Peptidfusion. Die Luciferaseaktivität wurde gemessen und normalisiert (16). Die Fähigkeit unterschiedlicher Peptide, die ERα-transkriptionale Aktivität zu unterbrechen, korreliert mit der Affinität dieser Peptide an ERα, wie in Säugetier-Two-Hybrid-Assays gemessen [15(A)]. Eine Ausnahme ist, dass das GRIP-1-Konstrukt sich als exzellenter Kandidat dafür herausstellte, die ER-transkriptionale Aktivität zu unterbrechen, obwohl es eine relativ schwächere Bindeaffinität an ER in Säugetier-Two-Hybrid-Assays zeigte. Zwei Kopien des LXXLL-Motivs interagieren synergistisch, um die ER-transkriptionale Aktivität zu unterbrechen. 2XF6: Zwei Kopien des F6-Peptids wurden im Tandem mit einem 54-Aminosäurelinkerspacer konstruiert, der dieselbe Sequenz hat wie der zwischen GRIP-1 NR Box 2 und NR Box III. F6G:Gal4DBD-F6-Fusion mit nur einer Kopie des F6-Peptids plus Linker. Transiente Transfektion wurde in HeLa-Zellen mit 3xERELuc, RST7ERα, pCMVβgal und ansteigenden Mengen des Gal4DBD-Peptidfusionskonstrukts, wie auf der X-Achse angegeben, ausgeführt.
Beispiel 101.5
LXXLL-enthaltende Peptide unterbrachen die AF2-Funktion in HepG2-Zellen, aber haben die wtER-Transaktivierungsfunktion in HepG2-Zellen nicht vollständig unterbrochen, wo die AF-1-Funktion dominant ist (17). Jedoch war in demselben Kontext die transkriptionale Aktivität einer trunkierten Form von ER (ER179C), der die AF-1-Domäne fehlt, durch LXXLL-enthaltende Peptide vermindert. HepG2 wurde mit entweder wtER- oder ER179C-Expressionsplasmiden zusammen mit dem 3xERELus-Reporter, Gal4DBD-Peptidfusionskonstrukten und pCMVβgal transfiziert, um hinsichtlich der Transfektionseffizienz zu normalisieren. Nach der Transfektion wurden die Zellen mit unterschiedlichen 17β-Estradiol-Konzentrationen 16 h lang vor dem Assay induziert.
Die Interaktionen zwischen unterschiedlichen LXXLL-Motiven und unterschiedlichen nuklearen Rezeptoren wurden in einem Säugetier-Two-Hybrid-System überprüft (18). Gesamtlängenrezeptoren und ausgewählte Peptide wurden als VP16- bzw. Gal4-DBD-Fusionen exprimiert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch die Aktivität des 5xGal4Luc3-Reportergens gemessen. NH: kein Hormon; H: Hormonbehandlungen. Hormone, die bei diesem Experiment verwendet wurden: 10^–7 M 17β-Estradiol für ERα und ERβ, 10^–7 M Progesteron für Pr-a und PR-b, 10^–7 M Dexamethason für GR, 10^–7 M 9-cis-Retinolsäure für RAR und RXR, 10^–7 M T3 für TR, 10^–7 M 1,25-Dihydroxy Vit.D3 für VDR und 10^–6 M 5α-Dihydrotestosteron für AR.
Beispiel 101. 7
Peptid #293 (ERβ 15e2, Sequenz SSIKDFPNLISLLSR) wurde aus einem Phagendisplay von Estradiol-aktiviertem ERβ ausgewählt. Es enthält das LXXLL-Motiv. Es zeigte selektive Interaktionen mit ERβ, TRβ und RARα, aber nicht mit den anderen Rezeptoren, die, wie in 7 gezeigt, getestet wurde. Die Expression dieses Peptids störte die transkriptionale Aktivität von ERα nicht, aber störte die transkriptionale Aktivierung durch ERβ sehr (19). HeLa-Zellen wurden mit entweder ERα- oder ERβ-Expressionsplasmiden gemeinsam mit dem 3xERELuc-Reporter, pCMVβgal- und Peptid-DBD-Fusionskonstrukten wie angezeigt transfiziert. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen 17β-Estradiol-Konzentrationen 16 Stunden lang behandelt, bevor der Assay durchgeführt wurde.
Schlüsse:

• Peptide mit LXXLL-Motiven haben verwandte, aber unterschiedliche Aktivitäten. Die flankierenden Sequenzen bestimmen: 1. deren Affinität für nukleare Rezeptoren 2. die Erfordernisse für ein funktionales AF2 bei ERα für die Interaktion 3. deren Spezifität der Wechselwirkung mit unterschiedlichen nuklearen Rezeptoren
• LXXLL-Motive können die Estradiol-induzierte transkriptionale Funktion von ERα in HeLa-Zellen inaktivieren, wo sowohl AF1- als auch AF2-Funktionen für die Aktivität erforderlich sind. Jedoch in einem Zellkontext, wo die AF1-Funktion dominant ist (so wie bei HepG2-Zellen), können LXXLL-Motive nicht vollständig die Estradiol-aktivierte transkriptionale Aktivität verhindern. Diese Beobachtung impliziert zwei mögliche Erklärungen: 1. In HepG2-Zellen liegt die AF1-Aktivität in einem unterschiedlichen Coaktivator begründet, der in erster Linie mit der AF1-Region in Kontakt tritt. Daher stört die Unterbrechung der Interaktion zwischen ERα und LXXLL-enthaltenden Cofaktoren die AF1-Funktion nicht. 2. Ein HepG2-spezifischer Cofaktor kontaktiert sowohl AF1- als auch AF2-Domänen. Die Unterbrechung des AF2-Bindeortes ist nicht ausreichend, um die Interaktion der Cofaktor-ER-Interaktion zu verhindern.
• Peptide mit Estrogenrezeptor-spezifischen LXXLL-enthaltenden Motiven können durch Phagendisplayscreening erhalten werden, und wenn sie aktiv und pharmazeutisch akzeptabel bei Menschen sind, können sie als rezeptorspezifische Antagonisten verwendet werden.

Beispiel 201. Anwendung der Technologie auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Ga-Unfereinheiten
Das in vitro Medikamentenidentifizierungssystem, das oben beschrieben wurde, kann ebenso auf andere Klassen biologischer signalmodulierender Proteine ausgedehnt werden, so wie die Serpentinrezeptoren (ebenso bekannt als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und sieben Transmembran-überspannende Rezeptoren) und deren verwandte G-Proteine. Wir werden diese als GPCRs bezeichnen. GPCRS wurden ausführlich als Targets für die Medikamentenentdeckung auf vielen therapeutischen Gebieten ausgenutzt, so wie gastrointestinalen, kardiovaskulären und neurologischen Erkrankungen. Die Fähigkeit, schnell und preiswert Medikamente zu identifizieren, die GPCRs aktivieren oder blockieren, wäre von hoher Nützlichkeit für die pharmazeutische Industrie.
Alle GPCRs haben wenigstens zwei funktionale Domänen. Eine ist die Ligandenbindedomäne auf der externen Oberfläche und die andere ist die G-Protein-bindende Domäne, die sich auf der intrazellulären Oberfläche befindet.
Im Ruhezustand existieren die G-Proteine, die durch GPCRs aktiviert werden, als G-Protein (αβγ)-Heterotrimere, die Guanindiphosphat enthalten (GDP), das an Gα-Untereinheiten gebunden ist. GPCRs aktivieren deren verwandte G-Proteine durch Agieren als GuaninNukleotidaustauschfaktoren (GEFs). Nach der GPCR-Aktivierung ersetzt freies GTP GDP, das an die α-Untereinheit des G-Proteins gebunden ist. Die GTP-gebundene Gα-Untereinheit und Gβγ disassoziieren dann und regulieren die Funktion von sekundären Messengerenzymen und Ionenkanälen. GPCRs aktivieren ihre verwandten G-Proteine durch Agieren als Guanin-Nukleotidaustauschfaktoren (GEFs). Bevor GPCRs G-Proteine aktivieren können, müssen sie von einem inaktiven Zustand in einen aktiven Zustand durch die Wirkung eines entsprechenden Liganden überführt werden. GPCRs haben wenig oder keine detektierbare Affinität für deren verwandte G-Proteine, bis sie aktiviert sind. Chemikalien, die die Wirkung von GPCR-Liganden mimen, sind als Agonisten bekannt und induzieren eine Veränderung beim GPCR, so dass es eine selektive Affinität für dessen verwandtes G-Protein annimmt. Chemikalien, die die Wirkung der GPCR-Liganden blockieren, sind als Antagonisten bekannt und verhindern die Induktion von strukturellen Veränderungen, die für GPCR erforderlich sind, um an das verwandte G-Protein zu binden.
BioKeys (Peptide und ähnliche Moleküle), die nach GPCRs suchen, können sowohl von den GPCRs selbst als auch von ihren verwandten Gα-Untereinheiten abgeleitet sein. Die Gα-Untereinheiten können die GPCR-Aktivierung anzeigen, da, wenn GPCRs aktiviert werden, GTP an die Gα-Untereinheit gebunden wird, und wenn sie inaktiv sind, ist GDP gebunden. Für GPCRs werden diese BioKeys spezifisch zwei grundsätzliche funktionale Domänen erkennen, den Ligandenbindeort und den aktivierten Rezeptor über den G-Protein-Bindeort. In dem Fall von Gα-Untereinheiten werden die BioKeys spezifisch die GDP- oder GTP-gebunden Formen erkennen. Somit können vier BioKey-Klassen identifiziert werden, jeweils zwei für Gα-Untereinheiten und für GPCRs. Solche BioKeys können einen immensen Wert für die Identifizierung von neuen therapeutischen Mitteln (Medikamenten) unter Verwendung von in vitro-Screeningvertahren haben.
Gegenwärtig werden Medikamente, die auf GPCRs wirken, im Allgemeinen auf einem von zwei Wegen identifiziert. Ein Weg (der zellbasierte Assay) ist die Verwendung von Gesamtzellassays, die sehr mühsam und teuer auszuführen sind. Der andere Weg (Ligandenersatzassay) ist die Verwendung von markierten Liganden, um die Fähigkeit einer Testsubstanz zu bestimmen, hinsichtlich des Bindens des Liganden an GPCR in Wetbewerb zu treten. Während der letztere Weg wesentlich weniger teuer ist und wesentlich bequemer auszuführen ist, ist es nicht möglich, Agonisten von Antagonisten zu unterscheiden, und somit ist die Nützlichkeit eines solchen Assays limitiert.
Durch die Verwendung von BioKeys, die für jede der basalen funktionellen Domänen von GPCRs spezifisch sind, können wir einfache preiswerte in vitro-Screens für sowohl Antagonisten als auch für Agonisten für GPCRs ausführen und können den vollständigen Bereich von Aktivitäten für solche Verbindungen von reinen Agonisten zu partiellen Agonisten zu vollständigen Antagonisten unterscheiden.
Beispiel A: Screen nach Agonisten und Antagonisten für den β2-adrenergischen Rezeptor (AR). AR wird durch Liganden, so wie Epinephrin und Isoproterenol, aktiviert. Diese Liganden sind Agonisten, und sie sind nützlich für die Behandlung von Erkrankungen, so wie Asthma und schweren allergischen Reaktionen. Antagonisten gegen AR sind nützlich zum Regulieren der Herzkreislauffunktion und zur Behandlung von Bluthochdruck und kardiaien Arrhythmien.
Klasse I-BioKeys für AR werden durch Affinitätsauswahl von Peptiden mit hoher Affinität (besser als 50 Mikromolar) aus BioKey-Bibliotheken identifiziert. AR können unter Verwendung von rekombinanten Techniken produziert werden, die Fachleuten bekannt sind, unter Verwendung von Systemen, so wie dem Baculovirus-Expressionssystem in Insektenzellen. AR enthaltende Membranen oder aufgereinigte AR können für die Affinitätsauswahl von BioKeys für den Ligandenbindeort verwendet werden. Die Selektivität für den Ort kann durch den Ersatz des BioKey durch den Agonisten Isoproterenol bestätigt werden.
Auf eine ähnliche Art und Weise können Klasse II-BioKeys für die G-Protein-Bindedomäne von aktiviertem AR identifiziert werden. Zunächst wird AR mit einem Überschuss an Agonist, z. B. Isoproterenol, vorbehandelt, um die "aktive" Konformation beim AR zu induzieren. BioKeys werden wie hierin beschrieben ausgewählt, und die Selektivität und Spezifität wird durch deren Fähigkeit bestätigt, an Agonist-behandelte AR zu binden, aber nicht an unbehandelte AR oder an Antagonist-behandelte AR.
Klasse III-BioKeys können für die GDP-gebundene Form von Gsα-Untereinheiten identifiziert werden. Aufgereinigte GSα-Untereinheiten werden unter Verwendung von rekombinanten Techniken und Expression in Bakterienzellen produziert und aufgereinigt. Aufgereinigte Gsα-Untereinheiten werden mit einem Überschuss an GDP vorbehandelt, um die "inaktive" Konformation oder die GDP-gebundene Form von Gsα (GDP-Gsα) zu induzieren. BioKeys werden ausgewählt wie hierin beschrieben, und deren Selektivität und Spezifität wird durch deren Fähigkeit, an GTP-behandelte, aber nicht an GDP-behandelte Gsα-Untereinheiten zu binden, bestätigt.
Repräsentative BioKeys für alle vier Klassen können mit einem geeigneten Rest, wie an anderem Ort hierin beschrieben, markiert werden, so wie Europium-markiertem Streptavidin, und in einem Medikamentenscreen unter Verwendung von Fluoreszenzmessvorrichtungen verwendet werden. Viele andere Mittel für die Verwendung von BioKeys als Surrogatliganden werden Fachleuten auf dem Gebiet der Suche nach Medikamentverbindungen bekannt sein.
Wie aus Tabelle 5 ersehen werden kann, ist es sehr leicht, drei Verbindungsklassen aus einer chemischen Verbindungssammlung zu unterscheiden. Inaktive Verbindungen binden nicht an relevante funktionale Domänen auf dem AR, und somit wird keine Signalveränderung von irgendeinem BioKey gesehen. Für GPCRs werden Agonisten leicht aufgrund ihrer Fähigkeit, den AR in einen konformationalen Zustand zu bringen, so dass die G-Protein-Bindedomäne in der Lage ist, Klasse II-BioKeys zu binden, die Surrogate für das verwandte G-Protein von AR sind, identifiziert. Agonisten, die an den Ligandenbindeort binden, werden ebenso zu einem messbaren Absinken der Bindung der Klasse I-BioKeys führen. Antagonisten werden durch deren Fähigkeit identifiziert, an die Ligandenbindedomäne zu binden, und daher sind sie in der Lage, die Bindung des natürlichen Liganden zu blockieren. Jedoch, anders als Agonisten, haben sie keine Fähigkeit, die Aktivierung des Rezeptors zu induzieren; und daher gibt es keine Konformationsveränderung der G-Protein-Bindedomäne von AR und keine Veränderung der Fähigkeit, Klasse II-BioKeys zu binden.
Alternativ kann das Screenen für Verbindungsagonisten oder -antagonisten unter Verwendung von AR-enthaltenden Membranen, Gs und BioKeys ausgeführt werden, die spezifisch für GTP-Gsα oder GDP-Gsα sind. Agonisten werden den Rezeptor aktivieren und in der Bildung von GTP-Gsα resultieren. Das Signal der BioKeys, die für GDP-Gsα spezifisch sind, wird abnehmen, wenn ein Agonist an den Rezeptor bindet. Auf ähnliche Weise wird das Signal von BioKeys, die für GTP-Gsα spezifisch sind, zunehmen, wenn ein Agonist an den AR gebunden ist. Antagonisten sind nicht in der Lage, den Rezeptor zu aktivieren, und sind daher nicht in der Lage, G-Proteine zu aktivieren. Das G-Protein wird dann ein Heterotrimer bleiben, das GDP enthält, das an dessen Gsα-Untereinheit gebunden ist. Ein Screen nach Antagonisten unter Verwendung von AR-enthaltenden Membranen, die mit einem Agonisten vorbehandelt sind. Das Signal von BioKeys, die für GTP-Gsα spezifisch sind, wird abnehmen, wenn ein Antagonist an den Rezeptor bindet. Auf ähnliche Weise wird das Signal von den BioKeys, die für GTP-Gsα spezifisch sind, zunehmen, wenn ein Agonist an AR gebunden ist.
Dieses System kann leicht auf andere GPCRs ausgedehnt werden, für welche man Zugang zu einem natürlichen Liganden oder einem Agonisten hat.
Beispiel 401. Finterprint von Modulatoren des Glucocorticoidrezeptors
Rezeptor
Peptidsequenzen

F6: GHEPLTLLERLLMDDKQAV
α/βIII: SSWDMHQFFWEGVSR
α/βV: SSPGSREWFKDMLSR
αII: SSLTSRDFGSWYASR

Beachten Sie, dass diese Peptide, während sie ursprünglich als Peptide identifiziert wurden, welche an den Estrogenrezeptor binden, beim Fingerprinting von Modulatoren des Glucocorticoidrezeptors verwendbar sind. Die ER-bindenden Peptide funktionieren mit dem Glucocorticoidrezeptor, da nukleare Rezeptoren strukturelle Ähnlichkeiten haben. Die genaue Natur dieser Ähnlichkeiten ist nicht bekannt, auch wenn es Sequenzähnlichkeiten gibt. Identische Coaktivatorproteine binden sowohl an den Rezeptor und enthalten LXXLL-Motive. Somit ist es nicht überraschend, dass unsere LXXLL-Peptide ebenso beide Rezeptoren in der Gegenwart eines Agonisten binden könnten. Siehe Mclnerney et al., Genes & Development, 12:3357-68 (1998); Nolte et al., Nature, 395:134-143 (10. September 1998).
Titration von GR gegenüber F6 mit Deoxycorticosteron und Dexamethason
Der Hefestamm EGY48 (MATα trp1 his3 ura3 Ieu2::6LexAop-Leu2) wurde mit den Plasmiden pJK103 (2 μM, 2LexAop-LacZ), pJG4-5-F6 (2 μM, LexADBD-F6-Peptid) und pEG202-GR (2 μM, B42AD-Glucocorticoidrezeptor α) transformiert. Der resultierende transformierte Stamm wurde über Nacht in einem Medium wachsen gelassen, das Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, um die Expression von GR zu induzieren. Deoxycorticosteron und Dexamethason wurden seriell in 100 μl Medium in einer 96-well-Mikroplatte verdünnt. 100 μl-Aliquots der Übernacht-Hefekultur wurden zu den Mikroplattenwells hinzugefügt und bei 30 °C 3 Stunden lang inkubiert. Um die Interaktion des F6-Peptids mit GR zu überwachen, wurde ein kinetischer Assay für die β-Galactosidase-Aktivität ausgeführt. Die Zelldichte in jedem Well wurde durch Auslesen des OD₆₅₀ bestimmt. Die Hefe wurde durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 3000 rpm pelletiert und das Medium wurde entfernt. 20 μl 1 × Z-Puffer (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 7 mM 2-Mercaptoethanol), enthaltend 1,5 % CHAPS-Detergens, wurden hinzugefügt und kurz durch Agitation gemischt. Folgend auf eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 μl 1 × Z-Puffer, enthaltend 40 μg o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranosid (ONPG), zu jedem Well hinzugefügt. Die Farbentwicklung wurde durch Messen der OD₄₀₅-Veränderung in Bezug auf den OD₆₅₀-Wert über 10 Minuten (20-Sekunden-Intervalle) überwacht. Die β-Galactosidase-Aktivität wird als Δ (OD₄₀₅-OD₆₅₀)/initialer OD₆₅₀-Wert ausgedrückt.
Interaktion von GR mit Peptiden

Der Hefestamm EGY48 (MATα trp1 his3 ura3 Ieu2::6LexAop-Leu2) wurde mit den Plasmiden pJK103 (2 μM, 2LexAop-LacZ), pEG202-GR (2 μM, LexADBD-F6, –α/βIII, –α/βV oder –αIi Peptiden) transformiert. Der resultierende transformierte Stamm wurde über Nacht in einem Medium wachsen gelassen, das Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, um die Expression von GR zu induzieren. Die Kultur wurde auf einen OD₆₀₀ von 0,1 in 10 ml Medium verdünnt, und Doexycorticosteron, Dexamethason, Corticosteron oder β-Estradiol wurden bis auf eine finale Konzentration von 1 μM hinzugefügt. Die Kulturen wurden bei 30 °C 3 Stunden lang inkubiert. Proteinpräparationen wurden durch Lysieren der Hefe durch Agitation mit Glasbeads hergestellt. Der zelluläre Debris wurde entfernt, und das Protein wurde durch Präzipitierung mit 50 % Ammoniumsulfat 30 Minuten lang bei 4 °C konzentriert. Das Proteinpellet wurde in Lagerpuffer (100 nM HEPES, 50 mM EDTA, 40 % Glycerin, 7 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8) suspendiert und die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt. Um die Interaktion der Peptide mit GR zu bestimmen, wurde ein Endpunktassay für die β-Galactosidase-Aktivität ausgeführt. 10 μg Proteinextrakt wurde in einem finalen Volumen von 100 μl 1 × Z-Puffer verdünnt, und die Farbentwicklung wurde durch die Hinzufügung von 80 μg ONPG initiiert. Die Reaktionen wurden durch Hinzufügung von 30 μl 1 M Na₂CO₃ gestoppt und die Zeit der Entwicklung wurde notiert. Die β-Galactosidase-Aktivität wird als 1000·OD₄₀₅/min/mg Protein ausgedrückt. Tabelle A: Liste der Proteine für die Fingerprintanalyse:

Rezeptoren	Modulatoren der Aktivität
Nukleare Rezeptoren
Estrogenrezeptor	Estradiol (agon), Tamoxifen (antag), ICI 182,780
α und β	(antag), Raloxifen (antag)
Progesteron	Progestine, Estrogene (agon), RU486 (antag),
	ZX98299 (antag), Onapriston (antag)

Androgen	Dihydroxytestosteron (agon), Hydroxyflutamid (antag)
Glucocorticoid	Cortison (agon), Dexamethason (agon)
Mineralocorticoid	Aldosteron (agon), Spironolacton (antag)
Retinolsäure	9-cis-Retinolsäure (agon)
Thyroid	Thyroidhormon (agon)
Vitamin D3	Vitamin D3 (agon)
PPAR(s)	Eicosinoide (agon), oxidiertes LDS (agon)
LXR	oxidierte Cholesterinmetabolite ((agon)
FXR	Farnesoidmetabolite (agon)
BXR	3-Aminoethylbgenzoate (agon)
SXR	Steroide (agon), Phytoestrogene (agon), Xenobiotika (agon)

Orphane nukleare Rezeptoren

Nurr1
Nor1
NGF1-B
ERR1
SHP
HNF-4
Coup-TF II

Tyrosinkinaserezeptoren

epidermaler Wachstumsfaktor	EGP (agon), ATP
Insulin	Insulin (agon), ATP
plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor	PDGF (agon), ATP

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
β-adrenergischer Rezeptor	Isopreterenol (agon), Aprenolol (antag)
Rhodopsin
Dopamin D2	Dopamin (agon), Haloperidol (antag)
Opiod	Leu-Enkephalin (agon), Naltrindol (agon)
Endothelin	Endothelin 1 (agon), BQ-123 (antag)
Erythropoietinrezeptor	Erythropoietin
FAS-Ligandenrezeptor	FAS-Ligand
Interleukinrezeptor	Interferon (agon), IL-6 (agon)

Signaltransduktionsproteine
Kinasen
Proteinkinasen
Proteinkinase C	Diacylglycerol (agon), Staurosporin (antag)
Tyrosinkinase	ATP, Genistein (antag)
Serinkinase	ATP
Threoninkinase	ATP
Nukleotidkinase	ATP
PolyNukleotidkinase	ATP, DNA, PO₄

Phosphatase
Proteinphosphatase
Serin/Threonin
Tyrosin
Nukleotidphosphatase
Säurephosphatase
alkalische Phosphatase
Pyrophosphatase

Zellzyklusregulatoren
Cylin CDK-2
CDC2
CDC25
p53
Retinoblastoma
GTPasen
Große G-Proteine
Gas – Suramin (antag), Mastoparin (agon), GAPs (agon), GEF (antag)

Kleine G-Proteine
Rac
Rho
Rab
Ras

Proteasen
Endoprotease
Exprotease
Metalloprotease
Serinprotease
Cysteinprotease

Nukleasen

Polymerasen

Ionenkanäle

Chaperonine
Hitzeschockproteine

Virale Proteine

Deaminasen

Nukleasen
Deoxyribonuklease
Ribonuklease
Endonukleasen
Exonukleasen

Polymerasen
DNA-abhängige RNA-Polymerase
DNA-abhängige DNA-Polymerase
Telomerase
Primase

Helicase

Dehydrogenase

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Transferasen
Peptidyltransferase
Transaminase
Glycosyltransferase
Ribosyltransferase
Acetyltransferasen
Acyltransferasen

Hydrolasen

Carboxylasen

Isomerasen
Dismutase
Rotase
Topoisomerase

Glycosidase
Endoglycosidase
Exoglycosidase

Deaminase

Lipasen

Esterasen

Sulfatasen

Cellulase

Lyasen

Reduktasen

Synthetase

DNA-bindende Proteine

RNA-bindende Proteine

Nuclearrezeptor-Coaktivatoren

Ligasen
RNA
DNA

Tumorsuppressor

Adhäsionsmolekül

Oxygenase
Peroxidase

Transporter
Elektronentransporter
Proteintransporter
Peptidtransport
Hormontransport
Serotonin
DOPA
Nukleinsäuretransport

Transkriptionsfaktoren
Neurotransmitter
Informationsträger/Lagerung
Antigenerkennungsprotein
MHC I-Komplex
MHC II-Komplex

Antag = Antagonist des Rezeptors
Agon = Agonist des Rezeptors

Tabelle B: Zielgewebe

Zirkulatorisches und lymphatisches System Herz Wände Klappen Blutgefäße Blutzellen Erythrozyten Plättchen Leukozyten Lymphknoten Lymphatische Gewebe Milz Thymus Mandeln Atmungssystem Lungen Trachea Bronchien Bronchiolen Alveoli Pleura Pharynx Larynx Trachea Endokrines System Hypophyse Schilddrüse Nebenschilddrüse Nebenniere Nebennierenmark Nebennierenrinde Bauchspeicheldrüse Langerhans Inseln Leber Gallenblase Brustdrüsen Zentrales Nervensystem Gehirn Neuronen Glialzellen Rückenmark Nerven Peripheres Nervensystem Auge Retina Linse Ohr Ohrtrommel Ampullae spirales Corti-Organ Nase olfaktorischer Bulbus Zunge Geschmacksknospen Verdauungssystem Zunge Speicheldrüse Pharynx Esophagus Magen Dünndarm Dickdarm Urinärsystem Niere Nephron Blase Männliches Reproduktionssystem Hoden Prostatadrüse Bulbourethraldrüsen (Cowper Drüsen) Penis Spermienzellen Muskelskelettales System Knochen (verschiedende) Knochenmark Gelenke (verschiedene) Muskeln (verschiedene) Bänder (verschiedene Weibliches reproduktives System Eierstöcke Uterus Bartholinische Drüsen Paraurethraldrüsen Eizellen Integumentsystem Haut Epidermis Dermis Hypodermis Schweißdrüsen Talkdrüsen Haare Nägel Tabelle 1: Peptide, die an den nicht ligandierten (unaktivierten) Estrogenrezeptor binden
Tabelle 2: Peptide, die an den Estradiol-aktivierten Rezeptor binden

Andere ER-bindenden Peptide beinhalten

SSKYSYSRSSEGHSR
SSYQWETHSDKWRSR
SSVTKKALTIAKDSR

Die letzteren zwei binden ER in der Gegenwart von Estradiol. Tabelle 3: Phage/Peptid-Klassifizierung

Tabelle 4: Eigenschaften der 5 Phagenklassen
Tabelle 5

*BioKey-spezifisch für den Ligandenbindeort
@ BioKey-spezifisch für den G-Proteinbindeort auf dem aktivierten Rezeptor

Tabelle 10: Gruppenpeptide für Beispiel 2

[17β-Estradiol]

α/βI, SSNHQSSRLIELLSR (AB1)

[kein Modulator]

α/βII, SAPRATISHYLMGG (AB2)

[4-OH-Tamoxifen]

α/βIII, SSWDMHQFFWEGVSR (AB3)

[dasselbe]

α/βIV, SRLPPSVFSMCGSEVCLSR (AB4)

[dasselbe]

α/βV, SSPGSREWFKDMLSR (AB5)

[17β-Estradiol]

αI, SSEYCFYWDSAHCSR (A1)

[17β-Estradiol]

αII, SSLTSRDFGSWYASR (A2)

[kein Modulator]

αIII, SRTWESPLGTWEWSR (A3)

[4-OH-Tamoxifen]

βI, SREWEDGFGGRWLSR (B1)

[17β-Estradiol]

βII, SSLDLSQFPMTASFLRESR (B2)

[kein Modulator]

βIII, SSEACVGRWMLCEQLGVSR. (B3)
- Alternative Namen in Klammern.
- Modulator, der verwendet wurde, um die Peptide zu isolieren, in Klammern.

Tabelle 11: ERα-Bindeaktivität in der Gegenwart von SERMs oder Puffer, von Peptiden, die auf ERα-ERE isoliert worden sind.
Tabelle 12: ERβ-Bindeaktivität in der Gegenwart von Puffer oder SERMs, von Peptiden, die auf ERα-ERE isoliert worden sind.
Tabelle 13: Binden von neuen ERβ-ERE-Peptiden in der Gegenwart von Puffer oder SERMs an ERα- oder ERβ-Rezeptoren Rezeptorform, an die gebunden wird, und vorhandener Modulator
Tabelle 14A: Klassenspezifischer Fingerprint an ERα
Tabelle 14B: Klassenspezifischer Fingerprint an ERβ
Bemerkungen zu Tabelle 14:

Fingerprintanalyse von Estrogenrezeptormodulatoren an (A) ERα und (B) ERβ
Immobilisierter ER wurde mit Estradiol (1 μM), Estriol (1 μM), Premarin (10 μM), 4-OH-Tamoxifen (1 μM), Nafoxidin (10 μM), Clomiphen (10 μM), Raloxifen (1 μM), ICI 182,780 (1 μM), 16a-OH-Estron (10 μM), DES (1 μM) oder Progesteron (1 μM) inkubiert. Phagen-ELISAs wurden ausgeführt wie beschrieben.

Tabelle 15a: Binden von Peptidsonden an ERα in der Gegenwart von Modulatoren

^a Äquivalenz kann positiv oder negativ sein. Diese werden beide in relativen (prozentzahligen) Begriffen ausgedrückt, aber die positiven und negativen Standards (100 % und –100 % Marken) werden unterschiedlich gesetzt. Somit sind die positiven und negativen Werte unterschiedlich skaliert. Positive Äquivalenz ist definiert als die maximale Stimulierung, die mit einer gegebenen Verbindung erzielt wird als ein Prozentsatz der maximalen Stimulation, die mit einem positiven Modulator erreicht wird, der für die Isolation einer gegebenen Peptidsonde verwendet wird (siehe Tabelle 10). Negative Werte zeigen an, dass ein Anstieg der Konzentration einer Verbindung in einer Reduktion des Bindens der Peptidsonde, verglichen mit dem Binden der Sonde in Puffer, resultiert. Diese werden ausgedrückt als Prozentsatz der Reduktion durch ICI 182,780. Für αII agiert ICI 182,780 als ein Agonist, und dessen Äquivalenz wird daher als ein Prozentsatz des Referenzmodulators β-Estradiol ausgedrückt. Die Ergebnisse für αIII waren in allen Klassen null.
^b EC50 ist definiert als die nanomolare Konzentration einer gegebenen Verbindung, die erforderlich ist, um 50 % des maximalen Signals für die Verbindung zu erzielen.

Tabelle 15b. Binden von Peptidsonden an ERβ in der Gegenwart von Modulatoren

^a Positive Äquivalenz ist definiert als die maximale Stimulierung, die mit einer gegebenen Verbindung erreicht wird als Prozentsatz der maximalen Stimulation, die mit dem Modulator erreicht wird, der für die Isolation einer gegebenen Peptidsonde verwendet wird. Die Äquivalenzzahlen für diese Referenzmodulatoren sind in Fettdruck wiedergegeben. Siehe auch Tabelle 10. Negative Werte zeigen an, dass ein Anstieg der Konzentration einer Verbindung in einer Reduktion des Bindeverhaltens der Peptidsonde, verglichen mit dem Binden der Sonde in Puffer, resultiert. Diese negativen Werte werden als Prozentsatz der Reduktion durch ICI 182,780 ausgedrückt, somit wurde ICI 182,780 als –100 per Definition bewertet und wird ebenso fettgedruckt. Die Ergebnisse für αβII waren in allen Klassen null.
^b EC50 ist definiert als die nanomolare Konzentration einer gegebenen Verbindung, die erforderlich ist, um 50 % des maximalen Signals für die Verbindung zu erreichen.

Tabelle 99 Peptidinteraktionen mit ERα

Die Werte sind in β-Galactosidase-Einheiten (MOD/min/mg) angegeben.

Tabelle 100
Tabelle 101
Referenzen

Anzick, S. L., Kononen, J., Walker, R. L., Azorsa, D. O., Tanner, M. M., Guan, X.-Y., Sauter, G., Kallioniemi, O.-P., Trent, J. M. und Meltzer, P. S. (1997) AIB1 a steroid receptor coactivator amplified in breast and ovarian cancer. Science 277, 965-968.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Vorhersage der Rezeptor-modulierenden Aktivität einer Verbindung, welche die biologische Aktivität eines Rezeptors moduliert, welches umfasst: (a) zur Verfügung stellen eines Liganden für den Rezeptor; (b) Screenen einer ersten kombinatorischen Bibliothek umfassend eine Mehrzahl von Mitgliedern nach der Fähigkeit, einen Rezeptor in wenigstens zwei verschiedenen Referenzkonformationen zu binden, (c) basierend auf diesem Screening das zur Verfügung stellen einer Auswahl von ersten Bibliotheksmitgliedern, wobei die Auswahl Mitglieder umfasst, welche sich bezüglich ihrer Fähigkeit, an den Rezeptor zu binden, abhängig von dessen Konformation unterscheidet, (d) Screenen einer Mehrzahl von Referenzsubstanzen, von denen bekannt ist, dass sie die biologische Aktivität des Rezeptors modulieren, um deren Wirkung auf die Bindung jedes Mitglieds der Auswahl an den Rezeptor zu bestimmen, wobei ein Referenzfingerprint für jede Referenzsubstanz erhalten wird, wobei der Fingerprint eine Vielzahl von Auswahl-basierenden beschreibenden Eigenschaften umfasst, wobei jede Auswahl-basierende beschreibende Eigenschaft die Wirkung der Referenzsubstanz auf das Binden eines bestimmten Auswahlmitgliedes an den Rezeptor charakterisiert, wobei die Auswahl-basierenden beschreibenden Eigenschaften des Referenzfingerprints gemeinsam die Wirkung der Referenzsubstanz auf das Binden sämtlicher Auswahlmitglieder an den Rezeptor charakterisieren, (e) Screenen einer Testsubstanz von unbekannter Aktivität relativ zu dem Rezeptor, um dessen Wirkung auf das Binden jedes Mitgliedes der Auswahl an den Rezeptor zu bestimmen, wobei ein Testfingerprint für die Testsubstanz erhalten wird, (f) Vergleichen des Testfingerprints mit den Referenzfingerprints, und (g) Vorhersagen der biologischen Aktivität der Testsubstanz basierend auf der Annahme, dass dessen biologische Aktivität ähnlich zu derjenigen der Referenzsubstanzen mit ähnlichen Fingerprints sein wird, wobei die Screeningschritte (b), (d) und/oder (e) entweder in einem zellfreien in vitro-Assay oder in einem zellbasierendem Assay ausgeführt werden, wobei der zellbasierende Assay kein Assay ist, der auf einem gesamten multizellulären Tier oder auf Geweben oder Organen, die aus einem solchen Tier isoliert worden, sind, basiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens eine Referenzkonformation eine Liganden-freie Konformation des Rezeptors ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei wenigstens eine Referenzkonformation eine Konformation mit einem Liganden des Rezeptors ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konformationen eine erste Konformation mit Liganden umfasst, die durch einen ersten Liganden induziert wird und eine zweite Konformation mit einem Liganden umfassen, die durch einen zweiten, unterschiedlichen Liganden induziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Auswahl wenigstens zwei der folgenden umfasst: (i) ein Mitglied, welches den Liganden-gebundenen Rezeptor stärker bindet, als es den nicht durch einen Liganden gebundenen Rezeptor bindet, und welches den nicht durch einen Liganden gebundenen Rezeptor detektierbar bindet, (ii) ein Mitglied, welches den Liganden-gebundenen Rezeptor weniger stark bindet, als es den nicht durch einen Liganden gebundenen Rezeptor bindet, und (iii) ein Mitglied, welches den Liganden-gebundenen Rezeptor in etwa ebenso stark bindet, wie es den nicht durch einen Liganden gebundenen Rezeptor bindet, und beide detektierbar bindet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine Vielzahl von unterschiedlichen Liganden bei der Charakterisierung der Auswahl verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die biologische Aktivität der Referenzsubstanzen bei diesem Rezeptor für eine Vielzahl von unterschiedlichen Geweben bekannt ist, so dass die biologische Aktivität der Testsubstanzen in diesen Geweben vorhergesagt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein nuklearer Rezeptor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein Estrogenrezeptor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, ein G-Protein oder eine G-Proteinuntereinheit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens ein Ligand ein pharmakologischer Agonist oder Antagonist des Rezeptors ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens eine Konformation durch einen natürlichen Liganden des Rezeptors induziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens eine Konformation durch einen Liganden induziert wird, welcher kein natürlicher Ligand des Rezeptors ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste kombinatorische Bibliothek eine Oligopeptid-Bibliothek ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste kombinatorische Bibliothek eine Nukleinsäure-Bibliothek ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Testsubstanzen in der Form einer kombinatorischen Bibliothek zur Verfügung gestellt und gescreent werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der biologisch aktive Bestandteil der Testsubstanz eine organische Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Screeningschritte (b), (d) und (e) in einem zellfreien in-vitro Assay durchgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Screeningschritte (b), (d) und (e) in einem zellbasierenden Assay durchgeführt werden, wobei der Assay kein Assay ist, der auf einem gesamten multizellulären Tier oder auf Geweben und Organen, die aus solche einem Tier isoliert wurden, basiert.
Verfahren gemäß Anspruch 19, bei welchem die Screeningschritte (d) und (e) in einem two-hybrid Assaysystem durchgeführt werden, und die Mitglieder der Auswahl Peptide sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein Glucokortikoidrezeptor ist.