DE69932709T2

DE69932709T2 - Hib/dtpa impfstoff und herstellungsmethoden

Info

Publication number: DE69932709T2
Application number: DE69932709T
Authority: DE
Inventors: Glaxosmithkline Biologicals S.A. Claude ARTOIS; Glaxosmithkline Biologicals S.A. Koen DE HEYDER; Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pierre DESMONS; Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nathalie GARCON; Glaxosmithkline Biologicals S.A. Roland MAINIL
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-03-23
Also published as: BR9909037A; AR014762A1; AU735619B2; MY133780A; GB9806456D0; CO4820442A1; ZA200004956B; IL137999A0; EP1066053B1; EP1066053B8; CZ20003536A3; CN1295481A; NZ506604A; KR20010034630A; NO20004758L; EP1066053A1; DE69932709D1; WO1999048525A1; AU3417299A; ATE335509T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung der Interferenz der Kapselpolysaccharidkomponente eines konjugiert Haemophilus influenzae B-Impfstoffs (Hib) in einem Kombinationsimpfstoff, der DTPa umfaßt – einem allgemein bekannten "trivalenten" Kombinationsimpfstoff, der Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT) und azelluläre Pertussis-Komponenten [typischerweise entgiftetes Pertussistoxoid (PT) und filamentöses Hämagglutinin (FHA) mit optionalem Pertactin (PRN) und/oder Agglutinin 1+2] enthält, zum Beispiel der vermarktete Impfstoff INFANRIX-DTPa^TM (SmithKline Beecham Biologicals), der DT-, TT-, PT-, FHA- und PRN-Antigene enthält. Die Erfindung betrifft auch Kombinationsimpfstoffe, die durch dieses Verfahren hergestellt werden.
Impfstoffe, die Polysaccharide verwenden, sind fachbekannte. Zum Beispiel beruht ein Hib-Impfstoff zur Prävention von Haemophilus influenzae B-Infektionen auf dem H. influenzae B-Kapselpolysaccharid (PRP), konjugiert mit einem Trägerprotein. Das Polysaccharid ist ein Polymer aus Ribose, Ribit und Phosphat. Beispiele für Trägerprotein schließen Diphtherie- oder Tetanustoxoid oder ein äußeres Membranprotein von N. meningitidis ein. Siehe zum Beispiel US 4,365,170 , US 4,673,574 , EP 208375 , EP 477508 und EP 161188 .
Es ist wünschenswert solche konjugierten Impfstoffe mit anderen Antigenen oder Impfstoffen zur gleichen Zeit zu verabreichen, und dies kann mehrere Injektionen involvieren. Mit mehrfachen Injektionen assoziierte Probleme schließen ein komplizierteres Verabreichungsverfahren und ein höheres Gesamtinjektionsvolumen ein. Dies ist ein besonders akutes Problem, wenn der Impfstoff für Kinder gedacht ist. Sowohl für das Kind als auch für den Arzt ist es wünschenswert, alle notwendigen Antigene in einer Injektion mit normalem Volumen zu injizieren, was das Impfungsverfahren weniger traumatisch und schmerzvoll für das Kind und effizienter und leichter durchzuführen für den Arzt macht.
Es wurde deshalb vorgeschlagen, solche konjugierten Polysaccharidimpfstoffe mit anderen Impfstoffen wie DTPa zu kombinieren, um umfassendere Kombinationsimpfstoffe herzustellen. Zusätzlich wurde auch der Einschluß weiterer Antigene in einem solchen Kombinationsimpfstoff zur Prävention von Krankheiten wie Hepatitis B oder Polio vorgeschlagen (Kombinationsimpfstoffe, die ein Antigen gegen Hepatitis B und Antigene gegen Diphtherie, Tetanus und Pertussis (HepB, DTPa) umfassen, wurden in WO 93/24148 und WO 97/46255 beschrieben).
Es wurde jedoch festgestellt, daß das einfache Vermischen der Komponenten eines Kombinationsimpfstoffs durch die Tatsache verkompliziert wird, daß nicht alle Antigene effektiv miteinander vermischt werden können. Die Reduzierung der Immunogenität eines Antigens bei Kombination mit anderen Komponenten (im Vergleich zu dem allein verabreichten, besonderen Antigen) ist als Interferenz bekannt. Es ist zum Beispiel bekannt, daß das unvorbereitete Vermischen eines DTPa-Kombinationsimpfstoffs mit Hib ohne Hilfsstoff zu einer Reduzierung von Antikörpertitern gegen die Polysaccharid-Komponente von Hib führt (WO 97/00697). Zusätzlich zeigte WO 97/00697, daß es eine signifikante Reduzierung an Antikörpertitern gegen die Polysaccharid-Komponente gibt, falls Hib an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist. Diese Ergebnisse zeigten, daß es eine Interferenz zwischen dem Aluminiumhydroxid des DTPa-Impfstoffs und Hib gab. Zum Ausprobieren und Minimieren dieser Interferenz in einem solchen unvorbereitet hergestellten Kombinationsimpfstoff wurde Hib an Aluminiumphosphat voradsorbiert.
WO 96/37222 beschreibt auch dieses Problem. In diesem Fall wird die Antigenität von Hib durch dessen Adsorbieren und der anderen DTPa-Komponenten an einen Hilfsstoff auf Aluminiumbasis mit einer Nullpunktladung von weniger als 7,2, zum Beispiel Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, an das Anionen addiert wurden, stabilisiert. Wenn jedoch Aluminiumphosphat verwendet wird, kann der Ansatz zur Erhöhung der Desorption anderer Antigene im Kombinationsimpfstoff führen, die besser bei Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff arbeiten, was auch ein Problem sein kann, wenn Aluminiumhydroxid plus Anionen verwendet werden (wobei die Oberfläche des Aluminiumhydroxids im wesentlichen durch das Anion beschichtet wurde).
Ein weiteres Problem, das bei der Formulierung von sowohl monovalenten als auch Kombinationsimpfstoffen angetroffen wird, ist die inhärente zeitliche Stabilität ihrer Mischantigene. Impfstoffe in Lösung können zeitliche Prozesse erfahren, die die Immunogenität ihrer Antigenkomponenten verringern, zum Beispiel den Abbau des Antigens oder die Desorption des Antigens vom Hilfsstoff, an den es adsorbiert wurde. Obwohl es allgemein wünschenswert ist, auf den höchstmöglichen Adsorptionsgrad von Antigen an Hilfsstoff abzuzielen, ist es für einen verläßlichen Impfstoff das Hauptziel, den höchsten Grad an Adsorption zu erreichen, der über die Lagerzeit des Impfstoffs aufrechterhalten werden kann. Auch wenn lyophilisierte Impfstoffe unvorbereitet solubilisiert werden können, ist es vorteilhaft, wenn der solubilisierte Impfstoff stabil ist, so daß er wirksam über einen langen Zeitraum ist, um dem Arzt die größte Flexibilität bei der geringsten Verschwendung von Impfstoff zu geben. Idealerweise könnte ein stabiler Impfstoff in Lösung bereitgestellt werden (ein "flüssiger" Impfstoff). Ein stabiler Impfstoff in Lösung wäre nicht nur weniger kostspielig herzustellen als ein lyophilisiertes Äquivalent, er würde auch einen zusätzlichen Handhabungsschritt des Arztes verhindern, der unter dem Risiko steht, unkorrekt durchgeführt zu werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Diagramm, das die Pertussis-Mäuselungen-Clearance-Aktivität von Formulierungen mit "leichtem Aluminiumhydroxid" (Chargen 21750 und 21751) und mit "Vollaluminiumphosphat" (Charge 21752) (mit und ohne Hib) im Vergleich mit einem handelsüblichen Standard-DTPa-Impfstoff (angegeben durch quadratische Symbole) zeigt.
Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein allgemeines Verfahren, durch das unvorbereitet hergestellte oder flüssige Hib/DTPa-Kombinationsimpfstoffe hergestellt werden können, um das Hib-Interferenzproblem gegenüber demjenigen besser zu vermeiden, das im Stand der Technik beschrieben wurde, während die maximale stabile Adsorption jedes Antigens an den Hilfsstoff auf Aluminiumbasis bewahrt werden kann, an dem es am stärksten immunogen ist. Bei dieser Durchführung werden Pertussis-Antigene in Kombinationsimpfstoffen der vorliegenden Erfindung stabil in ihrer wirksamsten Form bewahrt. Zusätzlich betrifft die Erfindung, wie das Verfahren kompatibel mit einem zusätzlichen Verfahren zur Verbesserung der Adsorption der Komponenten eines flüssigen Kombinationsimpfstoffs an Hilfsstoffe auf Aluminiumbasis in einer stabilen Weise ist. Auf diese weise kann die Immunogenität der Polysaccharid-Komponente von Hib in Kombinationsimpfstoffen durchgehend bewahrt werden und kann im flüssigen Zustand für einen längeren Zeitraum stabil bleiben. Entsprechend sind so hergestellte Impfstoffe von größerem Nutzen bei Verabreichung an Patienten, insbesondere Kinder.
Spezifisch lehrt diese Erfindung ein verläßliches Verfahren, durch das Aluminiumhydroxid als Hilfsstoff in einem DTPa-Hib-Kombinationsimpfstoff ohne Verursachung von Interferenz gegen die Hib-Komponente im Zeitverlauf in unvorbereitet hergestellten oder flüssigen Formulierungen und ohne unnötige Zugabe von Anionen zur Formulierung verwendet werden kann, wie es das in WO 96/37222 offenbarte Verfahren macht. Da Anionen nicht unnötig zur Formulierung hinzugegeben werden, wird die Stabilität aller adsorbierten Antigene maximiert, und ferner ist das Verfahren kompatibel mit einem weiter offenbarten Verfahren der Optimierung der Adsorption von Antigenen an Hilfsstoffe auf Aluminiumbasis in einem Kombinationsimpfstoff in einer stabilen Weise, spezifisch durch Optimieren ihrer Adsorption (und Minimieren anschließender Desorption) an Hilfsstoff im Zeitverlauf in einer flüssigen Formulierung durch Verwendung von "extragewaschenem" Aluminiumphosphat.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Interferenz einer Kapselpolysaccharidkomponente eines konjugierten Haemophilus influenzae B-Impfstoffs (Hib) in einem Kombinationsimpfstoff bereit, der DTPa umfaßt, worin ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Auswählen eines oder mehrerer Antigene zur Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff;
(ii) Vorsättigen des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs mit den ausgewählten Antigenen, so daß es eine Minimierung jeglicher Interferenz gegenüber Hib-Antigen im Kombinationsimpfstoff gibt, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird;
(iii) Auswählen von Hib plus einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen zur Adsorption an Aluminiumphosphat; (iv) Adsorbieren von Hib und den zusätzlichen Antigenen an Aluminiumphosphat;
(v) Kombinieren aller Antigene im Impfstoff.

Mit "Vorsättigen" ist gemeint, daß Antigene, die das Versetzen mit Aluminiumhydroxid als Hilfsstoff erfordern, an Aluminiumhydroxid voradsorbiert werden, so daß kein überschüssiges Aluminiumhydroxid vorhanden ist, das ausreichend zum Verursachen signifikanter Interferenz gegenüber Hib (ob unadsorbiert oder adsorbiert an Aluminiumphosphat) im fertigen Kombinationsimpfstoff ist, und daß Zeit für die Adsorption erlaubt wird, bevor die an Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigene mit anderen Antigenen des Impfstoffs kombiniert werden. Bevorzugt sollte die Adsorption an Aluminiumhydroxid die Vollständigkeit erreichen gelassen werden (für wenigstens einen Zeitraum von ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur). Die Vorsättigung des Aluminiumhydroxids führt somit zu einer Minimierung von etwaiger Interferenz gegenüber dem Hib-Antigen, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird. Häufig kann der Ausflockungs-(oder Aggregations-)zustand des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs im Kombinationsimpfstoff ein Indikator für Hib-Interferenz sein – je größer die Ausflockung, desto größer das Risiko von Hib-Interferenz. Zusätzlich hat die Verwendung von Antigenen zur Vorsättigung des Aluminiumhydroxids den weiteren Vorteil, daß weniger Aluminiumhydroxid pro fester Dosis von Antigen aufgenommen wird, was potentiell die mit Alaun assoziierte lokale Reaktogenität reduzieren kann.
Es sollte eingesehen werden, daß das Verfahren, obwohl das obige Verfahren das am meisten bevorzugte ist, auch durchgeführt werden kann, wenn die Hib-Komponente nicht mit Hilfsstoff versehen ist, wenn sie zur Formulierung hinzugegeben wird.
Ein anderer Aspekt, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, ist ein Verfahren, durch das entweder Hib ohne Hilfsstoff oder an Aluminiumphosphat adsorbiertes Hib unvorbereitet und wirksam mit dem Kombinationsimpfstoff bei minimaler Abnahme seiner Immunogenität kombiniert werden kann. Ein solches Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

(i) Auswählen eines oder mehrerer Antigene zur Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff;
(ii) Vorsättigen des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs mit den ausgewählten Antigenen, so daß es eine Minimierung jeglicher Interferenz gegenüber Hib-Antigen im Kombinationsimpfstoff gibt, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird;
(ii) Auswählen eines oder mehrerer zusätzlicher Antigene zur Adsorption an Aluminiumphosphat;
(iv) Adsorbieren der zusätzlichen Antigene an Aluminiumphosphat;
(v) Kombinieren aller Antigene im Impfstoff;
(vi) unvorbereitetes Zugeben von entweder Hib ohne Hilfsstoff oder von an Aluminiumphosphat adsorbiertem Hib.

Mit "DTPa" ist die oben angegebene Definition gemeint. DT, TT, PT, FHA und PRN sind allgemein fachbekannt. Die PT-Komponente kann zu einem Toxoid entweder chemisch oder genetisch gemacht werden, zum Beispiel wie in EP 515415 beschrieben. Siehe auch EP 427462 und WO 91/12020 für die Herstellung von Pertussis-Antigenen. Gegebenenfalls kann die PT-Komponente rekombinant sein (zum Beispiel wie beschrieben in EP 306318 , EP 322533 , EP 396964 , EP 322115 und EP 275689 ). Gegebenenfalls können auch die DT- und TT-Komponenten rekombinant sein. Typischerweise werden die PT-, FHA-, PRN-, HbsAg-(Hepatitis B-Oberflächenantigen-) und Hib-Komponenten im Bereich von 8–25 μg pro 0,5 ml Dosis von Bulk-Impfstoff sein. Die DT-, TT- und IPV-(inaktivierter trivalenter Poliovirus-Impfstoff) Komponenten sollten typischerweise als ca. 15–25 Lf (Flockungseinheiten), 10 Lf bzw. 40/8/32 (Typ I/II/III) DU pro 0,5 ml Dosis von Bulk-Impfstoff vorhanden sein.
Bevorzugt ist das im Hib-Konjugat verwendete Trägerprotein entweder Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid, Diphtherie-Crm₁₉₇-Protein oder ein äußeres Membranprotein aus einem Bakterium wie N. meningitidis. Die Synthese von Haemophilus influenzae-Typ B-Kapselpolysaccharid-(PRP)-Tetanustoxoid-(TT)-Konjugat wird in WO 97/00697 beschrieben.
Das Polysaccharidkonjugat kann durch jede bekannte Kupplungstechnik hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Polysaccharid über eine Thioetherbindung gekoppelt werden. Dieses Konjugationsverfahren vertraut auf die Aktivierung des Polysaccharids mit 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborat (CDAP) zur Bildung eines Cyanatesters. Das aktivierte Polysaccharid kann so direkt oder über eine Spacer-Gruppe an eine Amino-Gruppe auf dem Trägerprotein gekuppelt werden. Bevorzugt wird der Cyanatester mit Hexandiamin gekuppelt, und Amino-derivatisiertes Polysaccharid wird an das Trägerprotein unter Verwendung von Heteroligationschemie konjugiert, die die Bildung der Thioetherbindung beinhaltet. Solche Konjugate werden in WO 93/15760 (Uniformed Services University) beschrieben.
Die Konjugate können auch durch direkte reduktive Aminierungsverfahren wie in US 4365170 (Jennings) und US 4673574 (Anderson) beschrieben hergestellt werden. Andere Verfahren werden in EP 161188 , EP 208375 und EP 477508 beschrieben.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Kupplung eines mit Bromcyan aktivierten Polysaccharids, das mit Adipinsäurehydrazid (ADH) derivatisiert ist, an den Proteinträger durch Carbodiimid-Kondensation. Eine solche Konjugation wird in C. Chu et al., Infec. Immunity, 1983, 245–256 beschrieben.
Zusätzlich zu DTPa-Antigenen und Hib kann der Kombinationsimpfstoff auch andere Antigene umfassen, bevorzugt eines oder mehrere aus der Gruppe: Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), inaktiviertes Hepatitis A-Virus, Poliovirusantigene (zum Beispiel inaktiviertes trivalentes Poliovirus – IVP), N. meningitidis A-Kapselpolysaccharid (und Proteinkonjugate davon), N. meningitidis C-Kapselpolysaccharid (und Proteinkonjugate davon), Streptococcus pneumoniae-Kapselpolysaccharid (und Proteinkonjugate davon), Streptococcus pneumoniae-Proteine, Moraxella catarrhalis-Außenmembranproteine, nicht-typisierbare Haemophilus influenzae-Außenmembranproteine und N. meningitidis B-Außenmembranproteine.
Bevorzugt wird das HBsAg an Aluminiumphosphat wie in WO 93/24148 beschrieben adsorbiert werden. Zusätzlich sind Verfahren zur Adsorption von DTPa- und Hib-Antigenen an Aluminium-Hilfsstoffe fachbekannt. Siehe zum Beispiel WO 93/24148 und WO 97/00697.
Geeignete Komponenten zur Verwendung in solchen Impfstoffen sind bereits kommerziell erhältlich, und Einzelheiten können von der Weltgesundheitsorganisation erhalten werden. Zum Beispiel kann die IPV-Komponente der inaktivierte Salk-Polioimpfstoff sein. Das Hepatitis B-Oberflächenantigen kann das "S"-Antigen wie in Engerix-B^TM (SmithKline Beecham Biologicals) umfassen. Das inaktivierte Hepatitis A-Virus kann bevorzugt den als Havrix^TM (SmithKline Beecham Biologicals) bekannten kommerziellen Impfstoff umfassen, der ein abgetöteter abgeschwächter Impfstoff ist, der aus dem HM-175-Stamm des Virus stammt.
Die Addition von entweder lyophilisiertem oder flüssigem Hib (entweder ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat) zu einer Lösung der anderen Komponenten des Kombinationsimpfstoffs kann unvorbereitet durchgeführt werden oder bevor der Impfstoff den Hersteller verläßt. In jedem der obigen Fälle sollte die Immunogenität der Hib-Komponente stabil und wirksam bei minimaler Interferenz bleiben. Hib kann entweder als solches oder in einer Mischung mit anderen Komponenten, die nicht mit Aluminiumhydroxid als Hilfsstoffs versetzt sind, hinzugegeben werden.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design – The Subunit and adjuvant approach", Hrsg. Powell und Newman; Pellum Press. Vorteilhaft ist der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff ein pädiatrischer Impfstoff.
Die Menge des konjugierten Antigens in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird in Abhängigkeit davon variieren, welche spezifischen Immunogene eingesetzt werden. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1–1000 μg konjugiertes Polysaccharid (ausgedrückt in Menge von Polysaccharid), bevorzugt 2–100 μg und am meisten bevorzugt 4–40 μg umfassen wird. Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standardstudien sichergestellt werden, die die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen in Testpersonen beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Testpersonen ein oder zwei Auffrischungsinjektionen in Intervallen von ca. 4 Wochen oder länger erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung reicht das Verhältnis von Aluminiumphosphat- zu Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff (ausgedrückt als relative Mengen von Al³⁺), das im Kombinationsimpfstoff vorhanden ist, bevorzugt von 1:1 bis 20:1, besonders bevorzugt von 2:1 bis 14:1 und am meisten bevorzugt von 1,5:1 bis 14:1. Es ist bevorzugt, die PRN-Komponente an Aluminiumhydroxid in der Formulierung zu adsorbieren, da die Erfinder festgestellt haben, daß, obwohl das Antigen vollständig an Aluminiumhydroxid über einen weiten Bereich von pH-Werten adsorbiert wird, es dann, wenn es an Aluminiumphosphat adsorbiert wird, bei pH-werten von mehr als 5,1 schnell schlechter adsorbiert wird (und weniger wirksam ist). Nach 24 Stunden Adsorption bei pH 6,1 gibt es weniger als ca. 10 % nicht-adsorbiertes PRN unter Verwendung von Aluminiumhydroxid gegenüber mehr als ca. 50 % unter Verwendung von Aluminiumphosphat. Da der von der WHO für DTP-Impfstoffe spezifizierte End-pH zwischen 6 und 7 ist, ist es deshalb wichtig, PRN an Aluminiumhydroxid zur größten Wirksamkeit zu adsorbieren. Es hat sich gezeigt, daß PRN eine der wichtigsten Komponenten im Pertussis-Impfstoff ist, und es wurde jetzt gefunden, daß eine Minimierung der Adsorption die T-Zellreaktion und die Wirksamkeit des Pertussis-Impfstoffs als ganzer reduziert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert, mit der Maßgabe, daß Pertactin an Aluminiumhydroxid adsorbiert wird. Dieser Kombinationsimpfstoff verwendet den Ansatz, der als "Vollaluminiumphosphat" bezeichnet wird. Bevorzugt wird das an Aluminiumhydroxid adsorbierte Pertactin mit nicht-adsorbierten inaktivierten Poliovirusantigenen vor der Kombination mit den an Aluminiumphosphat adsorbierten Antigenen kombiniert (so daß weiter sichergestellt wird, daß das Aluminiumhydroxid vorgesättigt ist). Ein Beispiel dafür wird in Beispiel 1 beschrieben.
Der "Vollaluminiumphosphat"-Ansatz kann auch für das oben ausführlich dargestellte alternative Verfahren verwendet werden, das Hib unvorbereitet entweder in einer Form ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat zufügt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumhydroxid adsorbiert, mit der Maßgabe, daß HBsAg und Hib an Aluminiumphosphat adsorbiert werden. Dieser Kombinationsimpfstoff verwendet den Ansatz, der als "leichtes Aluminiumhydroxid" bezeichnet wird. Bevorzugt werden die an Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigene kombiniert, bevor das an Aluminiumphosphat adsorbierte HBsAg hinzugegeben wird. Bevorzugt wird das HBsAg mit den anderen Antigenen vor der Zugabe von Hib, das an Aluminiumphosphat adsorbiert ist, kombiniert. Ein Beispiel dafür wird in Beispiel 2 beschrieben. Falls jedoch die Gesamtmenge des verwendeten Hilfsstoffs (Aluminiumsalze) nicht ausreichend ist, um einen Hilfsstoffeffekt zu erzeugen, kann freies Aluminiumphosphat zu diesem Zeitpunkt ohne Umkehrung der Vorteile dieser Erfindung hinzugegeben werden.
Der "leichtes Aluminiumhydroxid"-Ansatz kann auch für das oben ausführlich dargestellte alternative Verfahren verwendet werden, das Hib unvorbereitet entweder in einer Form ohne zugesetzten Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat zufügt. In einem solchen Fall sollte etwaiges zusätzliches freies Aluminiumphosphat, das zum Kombinationsimpfstoff hinzugegeben wird, bevorzugt vor der Zugabe von Hib hinzugegeben werden.
"Hybrid-Vollaluminiumphosphat/leichtes Aluminiumhydroxid" ist noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung. In einer solchen Hybridformulierung werden ausgewählte Antigene zusätzlich zu Pertactin an Aluminiumhydroxid adsorbiert, aber nicht so viele wie in "leichtes Aluminiumhydroxid"-Formulierungen. Wiederum wird das gesamte verwendete Aluminiumhydroxid mit Antigen vorgesättigt, um das Risiko von Hib-Interferenz zu minimieren. Bevorzugt werden alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert, mit der Maßgabe, daß Pertactin, Diphtherietoxoid, Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden. Wiederum kann Hib entweder ohne zugesetzten Hilfsstoff oder an Aluminiumphosphat adsorbiert sein, wenn es zu den flüssigen oder unvorbereitet hergestellten Formulierungen gegeben wird. Bevorzugt werden an Aluminiumhydroxid adsorbiertes Pertactin, Diphtherietoxoid, Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutin mit nicht-adsorbierten inaktivierten Poliovirusantigenen kombiniert, bevor sie mit den an Aluminiumphosphat adsorbierten Antigenen kombiniert werden. Ein Beispiel dafür wird in Beispiel 3 beschrieben.
Es sollte zusätzlich eingesehen werden, daß eines oder mehrere der Antigene, die zur Vorsättigung des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs ausgewählt werden, bereits an einem anderen Hilfsstoffs, bevorzugt Aluminiumphosphat, adsorbiert sein können. Solche Formulierungen werden als "angepaßte Vollaluminiumphosphat/leichtes Aluminiumhydroxid"-Formulierungen bezeichnet, und diese stellen noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bereit. Wiederum wird das gesamte verwendete Aluminiumhydroxid mit Antigen vorgesättigt, um das Risiko von Hib-Interferenz zu minimieren. In solchen Formulierungen sollte Hib zur Formulierung unvorbereitet entweder in einem Zustand ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat gegeben werden. Bevorzugt werden alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert, mit der Maßgabe, daß Pertactin, Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden, und Diphtherietoxoid (das zuvor an Aluminiumphosphat adsorbiert wurde) wird auch mit freiem Aluminiumhydroxid vor seiner Kombination mit den anderen Antigenen kombiniert. Ein Beispiel dafür wird in Beispiel 4 beschrieben.
Bevorzugt wird das in der Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendete Aluminiumphosphat vor der Adsorption von Antigen "extragewaschen", so daß die freie Phosphationenkonzentration auf unter 10 mM und bevorzugt 3 mM oder weniger und besonders bevorzugt 2,5 mM oder weniger reduziert wird. Das extragewaschene Aluminiumphosphat sollte vor der Adsorption von Antigen sterilisiert werden (bevorzugt durch Autoklavieren). Es wurde von den Erfindern gezeigt, daß die Verwendung von extragewaschenem Aluminiumphosphat den Adsorptionsgrad von Hib und HBsAg an Aluminiumphosphat verbessert und bei der Verhinderung der Desorption aller Antigene im DTPa-Hib-Kombinationsimpfstoff hilft (und damit die Stabilität der Antigene verbessert). Ein Verfahren zum Waschen des Aluminiumphosphat-Hilfsstoffs wird in den Beispielen beschrieben.
Aufgrund des obigen nachteiligen Effekts von Phosphatanionen in Lösung, der von den Erfindern gezeigt wurde, sollte jeglicher Puffer, der im Kombinationsimpfstoff zur Stabilisierung des pH verwendet wird, bevorzugt kationischer Natur sein. Am meisten bevorzugt sollte L-Histidinmonohydrat/monochlorid verwendet werden.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Kombinationsimpfstoff bereitgestellt, der durch das oben beschriebene Verfahren der Erfindung erhalten wird.
Zusätzlich gibt es einen Kombinationsimpfstoff, der ein konjugiertes Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae B (Hib) und DTPa umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Hib an Aluminiumphosphat adsorbiert ist und jegliches freies Aluminiumhydroxid keine signifikante Interferenz mit Hib verursacht.
Das Verfahren des extragewaschenen Aluminiumphosphats kann auch unabhängig zur Erhöhung der Adsorption von Antigenen an Aluminiumphosphat und zur Verringerung ihrer anschließenden Desorption in einem Kombinationsimpfstoff, der DTPa umfaßt, verwendet werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Waschen von Aluminiumphosphat-Hilfsstoff, so daß die freie Phosphationenkonzentraion auf 3 mM oder weniger (bevorzugt weniger als 1 mM) reduziert ist;
(ii) Sterilisieren des gewaschenen Aluminiumphosphats aus (i); (iii) Auswählen von Antigenen zur Adsorption an Aluminiumphosphat-Hilfsstoff.
(iv) Adsorbieren der Antigene an das gewaschene Aluminiumphosphat;
(v) nach Bedarf Kombinieren der Antigene des Kombinatios-Impfstoffs.

Bevorzugt werden die Phosphationen entweder durch wiederholte Schritte aus Zentrifugieren und Verdünnung (siehe Beispiel 8) oder durch weitere Diafiltrationsschritte als diejenigen, die derzeit von den Aluminiumphosphat-Herstellern durchgeführt werden, unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung entfernt. Bevorzugt wird die Sterilisation des extragewaschenen Hilfsstoffs in Schritt (ii) durch Autoklavieren durchgeführt.
Zusätzlich wird durch diese Erfindung ein Kombinationsimpfstoff bereitgestellt, der DTPa und Aluminiumphosphat-Hilfsstoff umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumphosphat-Hilfsstoff gewaschen wurde, so daß die freie Phosphationenkonzentration auf 3 mM oder weniger reduziert ist.
Auch eine immunogene Zusammensetzung wird bereitgestellt, die Aluminiumphosphat-Hilfsstoff und ein Antigen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumphosphat-Hilfsstoff gewaschen wurde, so daß die freie Phosphationenkonzentration auf 3 mM oder weniger reduziert ist. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, aber beschränken nicht ihren Umfang.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer impfstofformulierung unter Verwendung des "Vollaluminiumphosphat"-Ansatzes
Das zur Herstellung eines flüssigen DTPa-Hib-HBsAg-IPV-Kombinationsimpfstoffs verwendete Verfahren war wie folgt (Mengen sind skaliert, um eine Dosis Impfstoff darzustellen):

1) 8 μg PRN, voradsorbiert an 0,05 mg Superfos-Aluminiumhydroxid, wurden mit 40/8/32 DU von nicht mit Hilfsstoff versetztem IPV (Typ 1/2/3 respektive) vermischt und für mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Umhüllung der IPV-Antigene bewahrte den Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff in seinem Antigen-gesättigten Zustand stabil im fertigen Kombinationsimpfstoff.
2) 17 Lf DT, 10 Lf TT, 25 μg PT, 25 μg FHA und 10 μg HBsAg, alle voradsorbiert an 0,17, 0,1, 0,05, 0,05 bzw. 0,2 mg extragewaschenem Superfos-Aluminiumphosphat (ausgedrückt in Mengen von Al³⁺), wurden neben dem PRN aus Schritt 1) für mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur vermischt.
3) 10 μg Hib (PRP, konjugiert an Tetanustoxoid), voradsorbiert an 0,12 mg extragewaschenes Superfos-Aluminiumphosphat, wurden zum Ergebnis aus Schritt 2) gegeben, und die Mischung wurde für mehr als 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
4) Die Mischung wurde auf 10 mM für den kationischen Puffer L-Histidinmonohydrat/monochlorid eingestellt, und der pH wurde auf 6,1 ± 0,1 eingestellt. Histidin hat einen pKa-Wert nahe dem gewünschten End-pH von 6,1 und ruft aufgrund seiner kationischen Natur keine Antigendesorption hervor.
5) 5 mg/ml 2-Phenoxyethanol wurden zur Mischung hinzugegeben, die für mehr als 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde.
6) Der pH der Mischung wurde auf 6,1 ± 0,1 überprüft (zwischen 6 und 7 gemäß Spezifikation der WHO für DT- und DTP-Impfstoffe). Das fertige vermischte Volumen betrug 0,5 ml und enthielt 140 mM NaCl.
7) Der Kombinationsimpfstoff wurde für wenigstens 2 Wochen bei Raumtemperatur vor seiner Verwendung in Untersuchungen zur immunogenen Wirksamkeit gelagert. Das Verhältnis von Aluminiumphosphat-zu-Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff (ausgedrückt als relative Mengen an Al³⁺), das im Kombinationsimpfstoff vorhanden ist, betrug 14:1.

DT, TT, PT, FHA, PRN, HbsAg und Hib wurden an ihre jeweiligen Hilfsstoffe bei pH 5,1 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,1 ± 0,1, 5,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 5,5 ± 0,1 bzw. 5,1 ± 0,1 adsorbiert.
Beispiel 2: Herstellung einer Impfstofformulierung unter Verwendung des Ansatzes "leichtes Aluminiumhydroxid"
Das zur Herstellung eines flüssigen DTPa-Hib-HBsAg-IPV-Kombinationsimpfstoffs verwendete Verfahren war wie folgt (Mengen sind skaliert, um eine Dosis Impfstoff darzustellen):

1) 25 Lf DT, 10 Lf TT, 25 μg PT, 25 μg FHA, 8 μm PRN und 40/8/32 DU IPV (Typ 1/2/2 respektive), alle voradsorbiert an 0,1, 0,025, 0,005, 0,005, 0,05 bzw. 0,01 mg Superfos-Aluminiumhydroxid (ausgedrückt in Mengen von Al³⁺), wurden für mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur vermischt. Bei diesen Mengen von Aluminiumhydroxid wurde der Hilfsstoff stabil mit Antigen gesättigt.
2) 10 μg HBsAg, voradsorbiert an 0,2 mg ungewaschenes Superfos-Aluminiumphosphat, wurden mit dem Ergebnis aus Schritt 1) vermischt und für mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
3) 10 μg Hib (PRP, konjugiert an Tetanustoxoid), voradsorbiert an 0,12 mg extragewaschenes Superfos-Aluminiumphosphat, wurden zum Ergebnis aus Schritt 2) gegeben, und die Mischung wurde für mehr als 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
4) Die Mischung wurde auf 10 mM für den kationischen Puffer L-Histidinmonohydrat/monochlorid eingestellt, und der pH wurde auf 6,1 ± 0,1 eingestellt. Histidin hat einen pKa-Wert nahe dem gewünschten End-pH von 6,1 und ruft aufgrund seiner kationischen Natur keine Antigendesorption hervor.
5) 5 mg/ml 2-Phenoxyethanol wurden zur Mischung gegeben, die für mehr als 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde.
6) Der pH der Mischung wurde auf 6,1 ± 0,1 überprüft (zwischen 6 und 7 gemäß Spezifikation der WHO für DT- und DTP-Impfstoffe). Das fertige vermischte Volumen betrug 0,5 ml und enthielt 140 mM NaCl.
7) Der Kombinationsimpfstoff wurde für wenigstens 2 Wochen bei 4°C vor seiner Verwendung in Untersuchungen zur immunogenen Wirksamkeit gelagert. Das Verhältnis von Aluminiumphosphat- zu Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff (ausgedrückt als relative Mengen von Al³⁺), das im Kombinationsimpfstoff vorhanden ist, betrug 1,7:1.

DT, TT, PT, FHA, PRN, HbsAg, IPV und Hib wurden an ihre jeweiligen Hilfsstoffe bei pH 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 5,5 ± 0,1, 6,1 ± 0,1 bzw. 5,1 ± 0,1 adsorbiert.
Beispiel 3: Herstellung einer Impfstofformulierung unter Verwendung eines Ansatzes "Hybrid-Vollaluminiumphosphat/leichtes Hydroxid"
Das zur Herstellung von DTPa-Hib-HBsAg-IPV-Kombinationsimpfstoff verwendete Verfahren war wie folgt (Mengen sind skaliert, um eine Dosis Impfstoff darzustellen):

1) 25 Lf DT, 25 μg PT, 25 μg FHA und 8 μg PRN, alle voradsorbiert an 0,1, 0,05, 0,05 bzw. 0,05 mg Superfos-Aluminiumhydroxid, wurden mit 40/8/32 DU von nicht mit Hilfsstoff versetztem IPV (Typ 1/2/3 respektive) vermischt.
2) 10 Lf TT und 10 μg HBsAg, voradsorbiert an 0,25 bzw. 0,2 mg ungewaschenes Superfos-Aluminiumphosphat (ausgedrückt in Mengen von Al³⁺), wurden zusammen mit der Mischung aus Schritt 1) vermischt und für mehr als 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
3) Die Mischung wurde auf 10 mM für den kationischen Puffer L-Histidinmonohydrat/monochlorid eingestellt. Sie wurde für mehr als 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurde der pH auf 6,1 ± 0,1 eingestellt. Histidin hat einen pKa-Wert nahe dem gewünschten End-pH von 6,1 und ruft aufgrund seiner kationischen Natur keine Antigendesorption hervor.
4) 5 mg/ml 2-Phenoxyethanol wurden zur Mischung hinzugegeben, die für mehr als 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde.
5) Der pH der Mischung wurde zu 6,1 ± 0,1 überprüft (zwischen 6 und 7 gemäß Spezifikation der WHO für DT- und DTP-Impfstoffe). Das fertige vermischte Volumen betrug 0,5 ml und enthielt 140 mM NaCl.
6) Der Kombinationsimpfstoff wurde für wenigstens 3 Wochen bei 4°C vor seiner Verwendung in Untersuchungen zur immunogenen Wirksamkeit gelagert.
7) 10 μg Hib (PRP, konjugiert an Tetanustoxoid) wurden unvorbereitet zum Ergebnis aus Schritt 6) gegeben.

DT, TT, PT, FHA, PRN und HbsAg wurden an ihre jeweiligen Hilfsstoffe bei pH 6,1 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1 bzw. 5,3 ± 0,1 adsorbiert.
Beispiel 4: Herstellung einer impfstofformulierung unter eines Ansatzes "angepaßtes Vollaluminiumphosphat/leichtes Hydroxid"
Das zur Herstellung von DTPa-Hib-HBsAg-IPV-Kombinationsimpfstoff verwendete Verfahren war wie folgt (Mengen sind skaliert, um eine Dosis Impfstoff darzustellen):

1) 25 Lf DT wurden an 0,15 mg ungewaschenes (normales) Superfos-Aluminiumphosphat adsorbiert (ausgedrückt in Mengen von Al³⁺). Dies wurde zu 0,1 mg Superfos-Aluminiumhydroxid gegeben, und die Mischung wurde für mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH wurde auf 6,1 ± 0,1 eingestellt.
2) 25 μg PT, 25 μg FHA und 8 μg PRN, alle voradsorbiert an 0,05, 0,05 bzw. 0,05 mg Superfos-Aluminiumhydroxid, wurden mit dem DT aus Schritt 1) und 40/8/32 DU von nicht mit Hilfsstoff versetztem IPV (Typ 1/2/3 respektive) vermischt.
3) 10 Lf TT und 10 μg HBsAg, voradsorbiert an 0,1 bzw. 0,2 mg ungewaschenes (normales) Superfos-Aluminiumphosphat (ausgedrückt in Mengen von Al³⁺), wurden zusammen mit der Mischung aus Schritt 2) vermischt und für mehr als 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
4) Die Mischung wurde auf 10 mM für den kationischen Puffer L-Histidinmonohydrat/monochlorid eingestellt, und der pH wurde auf 6,1 ± 0,1 eingestellt. Histidin hat einen pKa-Wert nahe dem gewünschten End-pH von 6,1 und ruft aufgrund seiner kationischen Natur keine Antigendesorption hervor.
5) 5 mg/ml 2-Phenoxyethanol wurden zur Mischung gegeben, die für mehr als 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde.
6) Der pH der Mischung wurde zu 6,1 ± 0,1 überprüft (zwischen 6 und 7 gemäß Spezifikation der WHO für DT- und DTP-Impfstoffe). Das fertige vermischte Volumen betrug 0,5 ml und enthielt 140 mM NaCl.
7) Der Kombinationsimpfstoff wurde für wenigstens 3 Wochen bei 4°C vor seiner Verwendung in Untersuchungen zur immunogenen Wirksamkeit gelagert.
8) 10 μg Hib (PRP, konjugiert an Tetanustoxoid) wurden unvorbereitet zum Ergebnis aus Schritt 7) gegeben.

DT, TT, PT, FHA, PRN und HbsAg wurden an ihre jeweiligen Hilfsstoffe bei pH 5,4 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1 bzw. 5,3 ± 0,1 adsorbiert.
Beispiel 5: interferenzmessungen in klinischen Untersuchungen der Kombinationsimpfstoffe
Die nachfolgenden klinischen Untersuchungen zeigen das Interferenzproblem, das bei Anti-PRP-Antikörpertitern in Kombinationsimpfstoffen angetroffen wurde, die DTPa (herkömmlich adsorbiert an einen Überschuß von Aluminiumhydroxid) und Hib umfassen.
Ursprünglich seronegative gesunde Säuglinge als Freiwillige wurden mit 3 Dosen Kombinationsimpfstoff immunisiert, der in den nachfolgend angegebenen Schemata verabreicht wurde. Die Reaktionen wurden als Testpersonen mit Antikörpertitern definiert, die signifikant über dem Hintergrund lagen. Die Titer wurden in mIU/ml ausgedrückt.
Die nachfolgenden Ergebnisse sind als geometrische mittlere Titer (GMT) in mIU/ml ausgedrückt. Für Anti-PRP stellt die Zahl in Klammern den Prozentwert von Individuen dar, die GMT-Werte über 1,0 hatten. Die Ergebnisse zeigen, daß das Hib-Interferenzproblem unter Verwendung des "Vollaluminiumphosphat"-Ansatzes ohne Beeinträchtigung der Wirksamkeit der anderen Antigene im Kombinationsimpfstoff abgemildert werden konnte.
Beispiel 6: Mäusepertussis-Lungen-Clearance-Aktivität der "leichtes Aluminiumhydroxid"- und "Vollaluminiumphosphat"-Formulierungen
"Leichtes Aluminiumhydroxid"- und "Vollaluminiumphosphat"-Formulierungen ohne Hib wurden kurz nach Formulierung untersucht, um ihre Pertussis-Mäuselungen-Clearance-Aktivität im Vergleich mit einer kommerziellen DTPa-Impfstofformulierung (INFANRIX^TM – SmithKline Beecham Biologicals) zu überprüfen. Die Zugabe von nicht mit Hilfsstoff versetztem Hib zu den Formulierungen wurde auf ihre Wirkung auf die Aktivität bewertet.
Die Tests erfolgten mit einem Immunisierungsschema mit zwei Dosen (unter Verwendung einer viertel Humandosis). Immunisierte Mäuse wurden mit Bordetella pertussis infiziert, und die KBE/Lungen von Bakterien wurden gegen die Zeit nach der Exposition gemessen.
Die Ergebnisse sind in 1 ersichtlich. Die Pertussis-Tierexpositionsdaten zeigen, daß die Pertussis-Lungen-Clearance-Aktivität äquivalent unter Verwendung der "leichtes Aluminiumhydroxid"- und "Vollaluminiumphosphat"-Formulierungen (mit oder ohne Hib, das nicht mit Hilfsstoff versetzt ist) im Vergleich mit früheren klassischen DTPa-Formulierungen ist.
Beispiel 7: Hib-Immunogenitätsstudien an der Babyratte mit "leichtes Aluminiumhydroxid"- und "Vollaluminiumphosphat"-Formulierungen
Ein Babyrattenmodell wurde verwendet, um die Immunogenität der Hib-Komponente in "leichtes Aluminiumhydroxid"- und "Vollaluminiumphosphat"-Impfstofformulierungen zu bewerten. Die Experimente erfolgten mit 1/10 der Humandosis (50 μl Injektion), die subkutan mit einem 0-14-28-Tageschema (beginnend mit Tag 7 nach der Geburt) subkutan verabreicht wurde, wobei Blutproben am Tag 42 entnommen wurden. 24–30 Tiere wurden pro Gruppe untersucht. An Aluminiumphosphat adsorbiertes Hib wurde entweder zur Formulierung (die "flüssige" Formulierung der Beispiele 1 und 2) zwei Wochen vor den Experimenten oder unvorbereitet hinzugegeben. Geometrische mittlere Antikörpertiter (GMT) gegen PRP wurden gemessen.
Die Ergebnisse zeigten, daß PRP-Titer für sowohl die "leichtes Aluminiumhydroxid"- als auch "Vollaluminiumphosphat"-Formulierungen (ob in einer "flüssigen" Formulierung oder in einer unvorbereitet hergestellten Formulierung) äquivalent waren oder höchstens minimal im Vergleich mit den Titern wechselwirkten, die nach der Verabreichung von monovalentem Hib, adsorbiert an Aluminiumphosphat, gemessen wurden.
Beispiel 8: Herstellung von "extragewaschenem Aluminiumphosphat-Hilfsstoff"
Zum Waschen des Aluminiumphosphats wurden die folgenden Schritte durchgeführt: die Aluminiumphosphat-Lösung wurde mit 3500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde aufgefangen. Das Pellet wurde mit 150 mM NaCl resuspendiert. Diese Schritte wurden wenigstens 3- bis 4-mal wiederholt. Das Ergebnis wurde durch ein 100 μm-Filter (zur Entfernung potentieller Aggregate) filtriert, und das Aluminiumphosphat wurde durch Autoklavieren sterilisiert. Der sterile Hilfsstoff wurde bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Extragewaschenes und autoklaviertes Aluminiumphosphat ist für wenigstens 45 Tage bei Raumtemperatur stabil.
Superfos-Aluminiumphosphat wurde für dieses Verfahren verwendet. Das vom Hersteller gelieferte Produkt enthält bis zu 5 mM freie Phosphationen. Bei sorgfältigem Waschen kann die freie Phosphatkonzentration auf weniger als 0,5 mM reduziert werden, was zu 1 mM führt, falls die gewaschene Lösung bei 37°C für 7 Tage inkubiert wird. Falls das gewaschene Aluminiumphosphat anschließend autoklaviert wird, kann die freie Phosphatkonzentration auf 2,0–3,0 mM steigen.
Ergebnisse:
Die Wirkung des Waschens von Aluminiumphosphat auf die Adsorption von Antigenen (H = Stunden, RT = Raumtemperatur) ist in Tabelle II gezeigt. Tabelle II
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, verbessert die Verwendung von extragewaschenem Aluminiumphosphat die Adsorption aller Antigen, speziell für DT und TT. Es kann auch beobachtet werden, daß die Zugabe freier Phosphationen zum Adsorptionsverfahren zu einer signifikanten Abnahme der Adsorption von HBsAg führt.
Beispiel 9: Die Wirkung von nicht-adsorbierten Antigenen und freiem Phosphat auf die Desorption von PRN
PRN sollte an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden, um Antigen stabil bei pH 6,1 wie oben beschrieben zu adsorbieren (und die Wirksamkeit zu bewahren). Bei der Handhabung kleiner Mengen von Hilfsstoff (zur Vorsättigung mit Antigen) ist es wichtig, die Stabilität des Antigens in einem Kombinationsimpfstoff zur Bestimmung zu untersuchen, ob das Aluminiumhydroxid im Zusammenhang der Kombination übersättigt ist. Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung des Vermischens von PRN, voradsorbiert an Aluminiumhydroxid (8 μg pro 10 μg oder 50 μg Al³⁺), mit einer Dosis eines nicht-adsorbierten Antigens (oder Aluminiumphosphat) über 7 Tage bei 4°C oder 37°C, pH 6,1. Antigen-Endkonzentrationen waren äquivalent zu ihren Konzentrationen in einem typischen Kombinationsimpfstoff. Der Prozentwert PRN im Überstand wurde unter Verwendung von ELISA gemessen; das PRN wurde im Überstand und im Pellet gemessen (500 mM Phosphationen wurden zur Desorption des PRN verwendet, und die Menge von freigesetztem PRN wurde gemessen). Ein Prozentwert wurde dann berechnet. Tabelle III
Wie die Tabelle zeigt, ist das Aluminiumhydroxid im Kombinationsimpfstoff-Zusammenhang mit 8 μg PRN unter Verwendung von 10 μg Aluminiumhydroxid übersättigt, aber ist stabil unter Verwendung von 50 μg des Hilfsstoffs.
Es wird auch gezeigt, daß die Wirkung von freiem Aluminiumphosphat die Verursachung einer gewissen Desorption des PRN ist. Die Verwendung von extragewaschenem Aluminiumphosphat würde diese Wirkung beschränken.

Claims

Verfahren zur Reduzierung der Interferenz einer Kapselpolysaccharidkomponente eines konjugierten Haemophilus influenzae B-Impfstoffs (Hib) in einem Kombinationsimpfstoff, der DTPa umfaßt, worin ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Auswählen eines oder mehrerer Antigene zur Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff; (ii) Vorsättigen des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs mit den ausgewählten Antigenen, so daß es eine Minimierung jeglicher Interferenz gegenüber Hib-Antigen im Kombinationsimpfstoff gibt, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird; (iii) Auswählen von Hib plus einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen zur Adsorption an Aluminiumphosphat; (iv) Adsorbieren von Hib und den zusätzlichen Antigenen an Aluminiumphosphat; (v) Kombinieren aller Antigene im Impfstoff.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das an Aluminiumphosphat adsorbierte Hib unvorbereitet mit den anderen Antigenen des Kombinationsimpfstoffs vermischt wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 2, worin der Kombinationsimpfstoff zusätzlich ein oder mehrere Antigene umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), inaktiviertes Hepatitis A-Virus, inaktiviertes Poliovirus, N. meningitidis A-Kapselpolysaccharid, N. meningitidis C-Kapselpolysaccharid, Streptococcus pneumoniae-Kapselpolysaccharid, Streptococcus pneumoniae-Proteine, Moraxella catarrhalis-Außenmembranproteine, nicht-typisierbare Haemophilus influenzae-Außenmembranproteine, N. meningitidis B-Außenmembranproteine.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der Kombinationsimpfstoff an Aluminiumphosphat adsorbiertes Hepatitis B-Oberflächenantigen umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Verhältnis von Aluminiumphosphat zu im Kombinationsimpfstoff vorhandenem Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff von 1:1 bis 20:1 reicht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert werden, mit der Maßgabe, daß Pertactin an Aluminiumhydroxid adsorbiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das an Aluminiumhydroxid adsorbierte Pertactin mit nicht-adsorbierten inaktivierten Poliovirus-Antigenen vor der Kombination mit den an Aluminiumphosphat adsorbierten Antigenen kombiniert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden, mit der Maßgabe, daß HBsAg und Hib an Aluminiumphosphat adsorbiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die an Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigene kombiniert werden, bevor das an Aluminiumphosphat adsorbierte HBsAg-Antigen hinzugegeben wird, und an Aluminiumphosphat adsorbiertes Hib kombiniert wird, nachdem das HBsAg-Antigen hinzugegeben wurde.
Verfahren gemäß Ansprüchen 8 bis 9, worin zusätzliches freies Aluminiumphosphat zum Kombinationsimpfstoff hinzugegeben wird.
Verfahren zur Reduzierung der Interferenz einer Kapselpolysaccharidkomponente eines konjugierten Haemophilus influenzae B-Impfstoffs (Hib) in einem Kombinationsimpfstoff, der DTPa umfaßt, worin ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Auswählen eines oder mehrerer Antigene zur Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff; (ii) Vorsättigen des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs mit den ausgewählten Antigenen, so daß es eine Minimierung jeglicher Interferenz gegenüber Hib-Antigen im Kombinationsimpfstoff gibt, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird; (iii) Auswählen eines oder mehrerer zusätzlicher Antigene zur Adsorption an Aluminiumphosphat; (iv) Adsorbieren der zusätzlichen Antigene an Aluminiumphosphat; (v) Kombinieren aller Antigene im Impfstoff mit Hib ohne Hilfsstoff.
Verfahren zur Reduzierung der Interferenz einer Kapselpolysaccharidkomponente eines konjugierten Haemophilus influenzae B-Impfstoffs (Hib) in einem Kombinationsimpfstoff, der DTPa umfaßt, worin ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Auswählen eines oder mehrerer Antigene zur Adsorption an Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff; (ii) Vorsättigen des Aluminiumhydroxid-Hilfsstoffs mit den ausgewählten Antigenen, so daß es eine Minimierung jeglicher Interferenz gegenüber Hib-Antigen im Kombinationsimpfstoff gibt, die durch Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff verursacht wird; (iii) Auswählen eines oder mehrerer zusätzlicher Antigene zur Adsorption an Aluminiumphosphat; (iv) Adsorbieren der zusätzlichen Antigene an Aluminiumphosphat; (v) Kombinieren aller Antigene im Impfstoff; (vi) unvorbereitetes Zugeben von entweder Hib ohne Hilfsstoff oder von an Aluminiumphosphat adsorbiertem Hib.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der Kombinationsimpfstoff zusätzlich ein oder mehrere Antigene umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), inaktiviertes Hepatitis A-Virus, inaktiviertes Poliovirus, N. meningitidis A-Kapselpolysaccharid, N. meningitidis C-Kapselpolysaccharid, Streptococcus pneumoniae-Kapselpolysaccharid, Streptococcus pneumoniae-Proteine, Moraxella catarrhalis-Außenmembranproteine, nicht-typisierbare Haemophilus influenzae-Außenmembranproteine, N. meningitidis B-Außenmembranproteine.
Verfahren gemäß Anspruch 13, worin der Kombinationsimpfstoff an Aluminiumphosphat adsorbiertes Hepatitis B-Oberflächenantigen umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das Verhältnis von Aluminiumphosphat zu im Kombinationsimpfstoff vorhandenem Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff von 1:1 bis 20:1 reicht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, worin alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert werden, mit der Maßgabe, daß Pertactin an Aluminiumhydroxid adsorbiert wird und daß Hib entweder ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin das an Aluminiumhydroxid adsorbierte Pertactin mit nicht-adsorbierten inaktivierten Poliovirus-Antigenen vor der Kombination mit den an Aluminiumphosphat adsorbierten Antigenen kombiniert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, worin alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumphosphat adsorbiert werden, mit der Maßgabe, daß Pertactin, Diphtherietoxoid, Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden und daß Hib entweder ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18, worin das an Aluminiumhydroxid absorbierte Pertactin, Diphtherietoxoid, Pertussistoxoid, filamentöse Hämagglutinin mit nicht-adsorbierten inaktivierten Poliovirus-Antigenen vor der Kombination mit den an Aluminiumphosphat adsorbierten Antigenen kombiniert werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, worin alle Antigene des Kombinationsimpfstoffs an Aluminiumhydroxid adsorbiert werden, mit der Maßgabe, daß HBsAg an Aluminiumphosphat adsorbiert wird und daß Hib entweder ohne Hilfsstoff oder adsorbiert an Aluminiumphosphat hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die an Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigene kombiniert werden, bevor das an Aluminiumphosphat adsorbierte HBsAg-Antigen hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 20 bis 21, worin zusätzliches freies Aluminiumphosphat zum Kombinationsimpfstoff vor der unvorbereiteten Zugabe von Hib ohne Hilfsstoff hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, worin eines oder mehrere der Antigene, die zur Vorsättigung des Aluminiumhydroxids ausgewählt werden, zuvor an Aluminiumphosphat adsorbiert wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 23, worin an Aluminiumphosphat adsorbiertes Diphtherietoxoid eines der Antigene ist, die zur Vorsättigung des Aluminiumhydroxids ausgewählt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, worin der Kombinationsimpfstoff mit L-Histidin gepuffert wird.
Kombinationsimpfstoff, der a) DTPa und b) an Aluminiumphosphat adsorbiertes Hib umfaßt, erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25.