DE69932607T2

DE69932607T2 - Verfahren und vorrichtung zur erstellung eines arrays für schnelle molekulare profilidentifizierungen

Info

Publication number: DE69932607T2
Application number: DE69932607T
Authority: DE
Inventors: B. Stephen Silver Spring LEIGHTON; Juha Rockville KONONEN; Olli Rockville KALLIONIEMI
Original assignee: UNITED STATES GOVERNMENT AS REPRESENTED BY DEPARTMENT HUMAN SERVICES; US Department of Health and Human Services
Current assignee: UNITED STATES GOVERNMENT AS REPRESENTED BY DEPARTMENT HUMAN SERVICES; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-24
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: DE69932607D1; EP1715340B1; CA2318984C; WO1999044063A2; CY1108634T1; ATE407360T1; DE69939503D1; JP2009244269A; CA2627799A1; AU2875799A; EP1068528B1; EP1715340A3; ATE335199T1; ES2272057T3; WO1999044063B1; EP1715340A2; JP4374139B2; WO1999044063A3; CY1105756T1; DK1068528T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur mikroskopischen, histologischen und/oder molekularen Analyse von Gewebeproben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die biologischen Mechanismen vieler Krankheiten wurden durch mikroskopische Untersuchung von Gewebeproben aufgeklärt. Die histopathologische Untersuchung erlaubte ebenfalls die Entwicklung von effektiven medizinischen Behandlungen für eine Vielzahl an Krankheiten. In der gewöhnlichen anatomischen Pathologie wird eine Diagnose auf der Basis von Zellmorphologie und Anfärbeeigenschaften angefertigt. Tumorproben können zum Beispiel untersucht werden, um den Tumortyp zu charakterisieren und vorherzusagen, ob der Patient auf eine bestimmte Form der Chemotherapie ansprechen wird. Obwohl diese mikroskopische Untersuchung und Klassifizierung von Tumoren die medizinische Behandlung verbessert hat, liefert das mikroskopische Erscheinungsbild einer Gewebeprobe, die durch gewöhnliche Verfahren (wie zum Beispiel Hämatoxylin und Eosin) angefärbt wurde, oft nur eine begrenzte Menge an diagnostischer oder molekularer Information.
Neueste Fortschritte in der Molekularmedizin haben sogar eine noch größere Gelegenheit zum Verständnis der zellulären Mechanismen von Krankheit geliefert und wählen angemessene Behandlungen mit der größtmöglichen Erfolgswahrscheinlichkeit aus. Einige hormonabhängige Brusttumorzellen haben zum Beispiel eine erhöhte Expression von Östrogenrezeptoren auf ihren Zelloberflächen, die anzeigt, dass der Patient, von dem der Tumor entnommen wurde, wahrscheinlich auf bestimmte anti-östrogenische Arzneibehandlungen ansprechen wird. Andere diagnostische und prognostische zelluläre Veränderungen beinhalten die Gegenwart von tumorspezifischen Zelloberflächenantigenen (wie in Melanomen), der Herstellung von embryonischen Proteinen (wie zum Beispiel α-Fetoprotein in Leberkrebs und karzinoembryonisches Glykoproteinantigen, das durch Ma gen-Darm-Tumore produziert wurde) und genetischen Abnormitäten (wie zum Beispiel aktivierte Onkogene in Tumoren). Es sind eine Vielzahl von Techniken zur Detektion der Gegenwart dieser zellulären Abnormitäten, einschließlich Immunphänotypisierung mit monoklonalen Antikörpern, in situ Hybridisierung mit Sonden und DNA-Amplifizierung unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), entstanden.
Die Entwicklung neuer molekularen Marker wurde jedoch durch die Unfähigkeit, große Anzahlen an Gewebeproben innerhalb einer kleinen Oberfläche anzuordnen, behindert. Nur eine geringe Menge an hybridomen Überstand kann zur Verfügung stehen, besonders während der frühen Phase der Bildung von monoklonalen Antikörpern, die die Anzahl an Proben, die analysiert werden können, einschränkt. Selbst wenn große Mengen des immunohistologischen Erregers zur Verfügung stehen, sind die Reagenzien jedoch teuer und können in der Reaktivität variieren. Diese Probleme führten Battifora et al. dazu, in Lab. Invest. 55:244-248 (1986) und im U.S. Patent Nr. 4,820,504 vorzuschlagen, dass mehrere Gewebeproben auf einem einzigen Objektträger zusammen angeordnet werden könnten, um zu ermöglichen, dass die Proben gleichzeitig durch die Anwendung eines einzigen Tropfens von hybridomem Überstand überprüft werden. Diese Proben wurden durch die Verwendung einer in der Hand gehaltenen Rasierklinge, um entparaffinierte und dehydrierte Proben in Scheiben zu schneiden, die dann zufällig zusammen gebündelt, in einer Wursthaut eingewickelt und wieder in Paraffin eingebettet wurden, hergestellt. Diese Technik erforderte ein hohes Maß an manueller Geschicklichkeit und vereinigte Proben in einem zusammenhängenden Block in einer Weise, die es schwer machte, bestimmte interessierende Proben zu finden und zu identifizieren.
Eine Abwandelung dieses Verfahrens wurde von Wan et al., J Immunol. Meth. 103:121-129 (1987) und Furmanski et al. in U.S. Patent Nr. 4,914,022 offen gelegt, in dem Kernstücke von in Paraffin eingebettetem Gewebe aus gewöhnlichen Gewebeblöcken erhalten werden. Durch manuelles Rollen der Kernstücke auf einer warmen Oberfläche wurden diese erweicht und geglättet und dann innerhalb eines konventionellen Trinkhalms gebündelt. Diese Methode gilt als geeignet zur gleichzeitigen histologischen Untersuchung von mehreren Gewebeproben, zum Beispiel bei der Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern. Die Technik von Miller und Groothuis, A.J.C.P. 96:228-232 (1991) rollte Gewebestreifen ähnlich zu „Stämmen", aus denen querlaufende Sektionen zur Einbettung in Paraffin entnommen wurden. Diese Halm- und Stamm-Techniken waren jedoch arbeitsintensiv, benötigten einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit und ordneten die Pro ben auch zufällig in einer Weise an, die die Identifizierung interessierender Proben komplizierte.
Battifora und Mehta, Lab. Invest. 63:722-724 (1990) und U.S. Patent Nr. 5,002,377 versuchten einige der Probleme der zufälligen Anordnung dadurch zu lösen, dass Proben in eine Vielzahl von schmalen Streifen geschnitten wurden, die einzeln in parallelen rechteckigen Rillen in einer Schmelze gesetzt wurden. Die Gewebestreifen wurden in Agargel eingebettet, das in die Rillen gegossen wurde, um ein plattenähnliches Element mit einer Reihe von Erhöhungen zu erzeugen. Einige der erhöhten Platten wurden zusammen gestapelt und in Paraffin eingebettet, um einen Gewebeblock zu erzeugen. Ein ähnlicher Ansatz wurde von Sundblad, A.J.C.P. 102:192-193 (1993) vorgeschlagen, in dem die Gewebestreifen in dreieckigen Keilen anstelle von rechteckigen Rillen plaziert wurden. Schneiden des Gewebes in Scheiben, dessen Anordnung in Reihen und dessen Einbettung in mehreren Schritten zur Bildung des Blocks war eine zeitaufwendige Methode, die die Effizienz der Untersuchung einer großen Anzahl an Gewebeproben reduzierte.
Alle dieser Techniken waren zur effizienten Herstellung eines Arrays von Gewebeproben, die zur schnellen, parallelen Analyse einer Vielzahl an unabhängigen molekularen Markern verwendet werden können, ungeeignet. Diese Ineffizienz war ein erhebliches Problem in Gebieten wie zum Beispiel der Krebsforschung, da Krebsentwicklung und -progression ein mehrstufiger Prozess ist, der mit sequentiellen Verlusten, Umordnungen und Amplifikationen von mehreren chromosomalen Regionen und mehreren Genen verbunden ist. Diese Vorgänge führen zu einer Fehlregulation von kritischen Transduktionsbahnen für Zeltwachstum, -tod und -differenzierung. Die Details dieses komplexen Prozesses bleiben unvollständig verstanden, zum Teil da Hochdurchsatzstrategien und Techniken zur Analyse solcher genetischen Veränderungen in großen Anzahlen von unkultivierten menschlichen Tumoren nicht verfügbar waren.
Gleichzeitige Analyse von mehreren Genen innerhalb der gleichen Signaltransduktionsbahn oder ähnlichen Signaltransduktionsbahnen kann zum Beispiel notwendig sein, um kritische, geschwindigkeitsbestimmende Schritte in der Fehlregulation des Wachstums von Krebszellen genau zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Analyse von strukturellen und zahlenmäßigen Veränderungen, die gleichzeitig auf mehrere Chromosome, Loci und Gene wirken, notwendig sein, um die Muster der Akkumulierung von genetischen Veränderungen in verschiedenen Stufen der Krebsprogression zu verstehen. Schließlich, nachdem neue Gene und genetische Veränderungen von potentieller Wichtigkeit bei Krebs identifiziert wurden, wird normalerweise zusätzlich beträchtliche Forschung benötigt, um die diagnostische, prognostische und therapeutische Bedeutung dieser molekularen Marker in der klinischen Onkologie zu bestimmen.
Da die Gewebemenge oftmals geschwindigkeitsbestimmend für solche Studien wird, ist die Fähigkeit, Gewebe für die molekulare Analyse in einer Weise, die den Verbrauch der oftmals einzigartigen, wertvollen Tumorprobe minimiert, effizient zu besorgen, zu fixieren, zu lagern und zu verteilen wichtig. Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung molekulare Profilierung von Gewebeproben (wie zum Beispiel Tumore) in großem Umfang mit minimalem Gewebebedarf durchzuführen, in einer Weise, die die schnelle parallele Analyse von molekularen Charakteristika (wie zum Beispiel Gendosierung und -expression) von Hunderten morphologisch kontrollierter Tumorproben erlaubt. Die U.S. Anmeldung 4,684,613 bezieht sich auf ein Gerät zur Durchführung von Probenentnahmen aus halbfestem Medium mittels einer Hubkolbenstanze.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorhergehenden Ziele werden durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 verwirklicht. Eine Vielzahl von Sektionen kann aus dem Empfängerarray erhalten werden, so dass jede Sektion eine Vielzahl von Spenderproben enthält, die ihre zugewiesenen Stellen beibehalten. Eine andersartige histologische Analyse wird an jeder Sektion durchgeführt, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen den Ergebnissen der verschiedenen Analysen an korrespondierenden Stellen des Arrays gibt. In speziellen Ausführungsformen wird die Spenderprobe durch Bohren einer gestreckten Probe, wie zum Beispiel ein zylindrischer Kern, aus dem Spendergewebe und Plazieren der Spenderprobe in eine Aufnahme von komplementärer Form, wie zum Beispiel eine zylindrische Hülse, im Empfängerarray erhalten. An der Spenderprobe ausgeführte Analysen beinhalten immunologische Analyse, Nukleinsäurehybridisierung und klinikopathologische Charakterisierung der Probe.
In einer spezielleren Ausführungsform des Verfahrens wird ein Empfängerblock aus einem steifen einbettenden Medium wie zum Beispiel Paraffin, das mit einer Stanze oder einem Mikrotom gestanzt werden kann, gebildet und ein separater Spenderblock wird ebenfalls durch Einbettung einer biologischen Probe im einbettenden Medium gebildet. Zylindrische Aufnahmehülsen werden in den Empfängerblock gebohrt, um ein Array von Aufnahmen an feststehenden Positionen zu formen und zylindrische Spenderprobenkerne werden aus der eingebetteten biologischen Probe im Spenderblock erhalten. Die Spenderprobenkerne werden dann in die zylindrischen Aufnahmen an zugewiesenen Stellen im Array plaziert und der Empfängerblock wird in Scheiben geschnitten, um einen Querschnitt der Spenderprobenkerne im Array zu erhalten, ohne die zugewiesenen Stellen im Array zu trennen. Eine andersartige histologische Analyse kann an jeder Sektion durchgeführt werden, zum Beispiel durch die Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper, die verschiedene Antigene oder eine Kombination von antigenisch verschiedenen monoklonalen Antikörpern und Nukleinsäuresonden (z.B. RNA und DNA) an sequentiellen Sektionen erkennen. Das Ergebnis jeder verschiedenen histologischen Analyse an jeder Position des Arrays wird verglichen, zum Beispiel um zu bestimmen, ob ein Gewebe, das einen Östrogenrezeptor exprimiert, auch einen Hinweis darauf hat, dass ein spezielles Onkogen aktiviert wurde.
In einer spezielleren Ausführungsform des Verfahrens wird ein Empfängerblock aus einem steifen einbettenden Medium wie zum Beispiel Paraffin, das mit einer Stanze oder einem Mikrotom gestanzt werden kann, gebildet und ein separater Spenderblock wird ebenfalls durch Einbettung einer biologischen Probe im einbettenden Medium gebildet. Zylindrische Aufnahmehülsen werden in den Empfängerblock gebohrt, um ein Array von Aufnahmen an feststehenden Positionen zu formen und zylindrische Spenderprobenkerne werden aus der eingebetteten biologischen Probe im Spenderblock erhalten. Die Spenderprobenkerne werden dann in die zylindrischen Aufnahmen an zugewiesenen Stellen im Array plaziert und der Empfängerblock wird in Scheiben geschnitten, um einen Querschnitt der Spenderprobenkerne im Array zu erhalten, ohne die zugewiesenen Stellen im Array zu trennen. Eine andersartige histologische Analyse kann an jeder Sektion durchgeführt werden, zum Beispiel durch die Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper, die verschiedene Antigene oder eine Kombination von antigenisch verschiedenen monoklonalen Antikörpern und Nukleinsäuresonden (z.B. RNA und DNA) an sequentiellen Sektionen erkennen. Das Ergebnis jeder verschiedenen histologischen Analyse an jeder Position des Arrays wird verglichen, zum Beispiel um zu bestimmen, ob ein Gewebe, das einen Östrogenrezeptor exprimiert, auch einen Hinweis darauf hat, dass ein spezielles Onkogen aktiviert wurde. Die Gegenwart oder Abwesenheit des Östrogenrezeptors und Onkogens kann dann mit klinischer oder pathologischer Information über das Gewebe (wie zum Beispiel die Gegenwart einer metastasenbildenen Krankheit oder dem histologischen Grad eines Tumors) korreliert werden. Diese gleichzeitige parallele Analyse von mehreren Proben hilft bei der Klärung des Zusammenhangs von mehreren molekularen und klinischen Charakteristika des Gewebes.
Gestreckte Gewebemuster können aus einer Gewebeprobe, wie zum Beispiel einem Tumor, erhalten werden und die Probe kann einer Laboranalyse, wie zum Beispiel histologischer oder molekularer Analyse unterworfen werden. Das gestreckte Gewebemuster kann aus einer interessierenden Region der Gewebeprobe entnommen werden und die Größe des Musters ist klein genug, dass das Charakteristikum, das analysiert wird, überall in dem kleinen Muster im Wesentlichen homogen ist. In einer offen gelegten Ausführungsform ist das Muster eine zylindrische Probe, die aus einer Gewebeprobe ausgestanzt wurde, worin die zylindrische Probe ungefähr 1–4 mm lang ist und einen Durchmesser von ungefähr 0,1–4 mm, zum Beispiel ungefähr 0,3–2,0 mm, aufweist. In besonderen Ausführungsformen ist der Durchmesser des Zylinders kleiner als ungefähr 1,0 mm, zum Beispiel 0,6 mm. Das Muster wird bevorzugt in einer Weise konserviert (wie zum Beispiel Ethanolfixierung) die nicht die Analyse von Nukleinsäuren stört und daher kann das Muster jeder Art von molekularer Analyse, wie zum Beispiel jeder Art von auf isolierter DNA oder RNA basierenden molekularer Analyse, unterworfen werden.
Die Erfindung beinhaltet auch eine Vorrichtung zur Probenherstellung für die parallele Analyse von Sektionen aus Arrays biologischen Materials, wie in Anspruch 17 definiert. Die Vorrichtung kann eine Plattform und einen Spendergewebeblock auf der Plattform, eine Stanze, die eine Gewebeprobe aus dem Spenderblock stanzt oder bohrt, beinhalten. Die Plattform kann auch einen Empfängerblock tragen, in den die Stanze ein Array von Aufnahmen an zugewiesenen Positionen formt. Jede Aufnahme kann so positioniert werden, dass eine Gewebeprobe aus der Hubkolbenstanze in die Aufnahme verdrängt werden kann. Eine x-y-Positioniereinrichtung bewegt die Stanze oder den Empfängerblock bezüglich des jeweiligen anderen inkrementell während die Stanze sich hin- und herbewegt, so dass das Aufnahmenarray gebildet wird. Die x-y-Positioniereinrichtung richtet auch sequentielle Aufnahmen des Empfängerblocks an der Stanze aus, um Gewebeproben aus der Stanze in die Aufnahmen abzugeben. Ein Stilett kann in die Stanze eingeführt werden, um die Inhalte der Stanze, die entweder Paraffin aus dem Empfängerblock oder Gewebe aus dem Spenderblock sein können, zu verdrängen. Interessierende Regionen der Gewebeprobe werden durch Positionierung eines dünnen Objektträgers einer Sektion über den Spenderblock lokalisiert, um die interessierenden Strukturen im dünnen Objekt träger der Sektion an den entsprechenden Regionen der Gewebeprobe im Spenderblock auszurichten.
Die vorangehenden und anderen Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen, die mit Bezug zu den begleitenden Zeichnungen verläuft, stärker offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische, perspektivische Ansicht einer ersten Ausführungsform der Stanzeneinheit der vorliegenden Erfindung, die die Ausrichtung der Stanze oberhalb der interessierenden Region des Spendergewebes in einem Spenderblock zeigt.
2 ist eine Ansicht, ähnlich zu 1, in der jedoch die Stanze vorgerückt ist, um ein Spenderprobenmuster zu erhalten.
3 ist eine schematische, perspektivische Ansicht eines Empfängerblocks in welchen die Spenderprobe plaziert wurde.
4–8 illustrieren Schritte in der Herstellung von Arrays dünner Sektionen aus dem Empfängerblock.
9 ist eine perspektivische Ansicht einer Feststellvorrichtung zur Halterung einer auf einem Objektträger befestigten Probe oberhalb des Gewebes im Spenderblock, um eine interessierende Region zu lokalisieren.
10A ist eine Ansicht eines H&E-angefärbten Arrays dünnen Sektionsgewebes, das auf einem Objektträger zur mikroskopischen Untersuchung befestigt ist.
10B ist eine vergrößerte Ansicht eines Teils des Objektträgers in 10A, die die Ergebnisse einer erbB2 mRNA in situ Hybridisierung eines Gewebearrays aus der Region im kleinen Rechteck in 10A darstellt.
10C ist ein Elektrophoresegel, das zeigt, dass DNA und RNA mit hohem Molekulargewicht aus Brustkrebsproben extrahiert werden kann.
10D ist eine vergrößerte Ansicht einer der Gewebeproben des Arrays in 10A, das eine Immunoperoxidasefärbung für das erbB2-Antigen aufweist.
10E ist eine Ansicht ähnlich der der 10D, die einen hohen Grad an durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) des Gewebes im Array durch eine erbB2-DNA-Sonde detektierte erbB2-Genamplifikation aufweist.
11 ist eine schematische Ansicht, die ein Beispiel von paralleler Analyse von Arrays, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, verdeutlicht.
12 ist eine vergrößerte Ansicht eines Teils der 11.
13 ist eine Draufsicht einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung zur Bildung der Arrays der vorliegenden Erfindung.
14 ist eine Vorderansicht der in 13 dargestellten Vorrichtung, die die Bildung einer Aufnahme in einem Empfängerblock mit einer Empfängerstanze illustriert.
15 ist eine Ansicht ähnlich zu 14, die jedoch die Verdrängung eines Stopfens aus der Empfängerstanze in eine Abfallschale zeigt.
16 ist eine Ansicht, die eine Spenderstanze zeigt, die eine Gewebeprobe aus einem Spenderblock erhält.
17 ist eine Ansicht, die das Einsetzen des Spendergewebes in eine Aufnahme des Empfängerblockes zeigt.
18 ist eine im Querschnitt dargestellte, vergrößerte Ansicht der Spenderstanze, die oberhalb der interessierenden Struktur im Spenderblock ausgerichtet ist,
19 ist eine vergrößerte Querschnittsansicht der Empfängerstanze, während 20 eine ähnliche Ansicht der Spenderstanze ist, die die relativen Querschnittsdurchmesser der beiden Stanzen illustriert.
21 ist eine Querschnittsansicht des Empfängerblocks mit den im Empfängerarray angeordneten Spenderproben und mit dargestellten Reihen von Mikrotomsektionen des Empfängerblocks.
22 ist eine schematische Ansicht eines Computersystems in welchem das Verfahren der vorliegenden Erfindung implementiert werden kann.
23 ist ein Algorithmus, der ein Beispiel des im Computer implementierten Verfahrens der vorliegenden Erfindung illustriert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Ausführungsform der 1–10
Eine erste Ausführungsform einer Vorrichtung zur Herstellung der Mikroarrays der vorliegenden Erfindung ist in den 1-2 dargestellt, in denen ein Spenderblock 30 in einem rechteckigen Behälter 31 dargestellt ist, der auf einer stationären Plattform 32 mit einer L-förmigen Seitenkante 34, die den Spenderbehälter 31 in einer vorgegebenen Ausrichtung auf der Plattform 32 hält, montiert ist. Eine Stanzapparatur 38 ist oberhalb der Plattform 32 montiert und beinhaltet ein vertikales Leitblech 40 und eine horizontale Positionierplatte 42. Die Positionierplatte 42 ist auf einem x-y-Gestell (nicht dargestellt) montiert, das mit einem Paar digitalen Mikrometern präzise ausgerichtet werden kann.
Das vertikale Leitblech 40 hat eine flache Frontseite, die eine Präzisionsleitfläche liefert, an welcher eine Hubkolbenstanzengrundplatte 44, an einer Schiene 46, zwischen einer eingefahrenen Position, wie in 1 dargestellt und einer ausgefahrenen Position, wie in 2 dargestellt, entlang gleiten kann. Ein elastisches Band 48 hilft dabei die Bewegung der Grundplatte 44 entlang dieses Pfades zu kontrollieren und die Grenzen des Vorrückens und Rückzug der Grundplatte 44 sind durch das Schienenteil 46, das einen Anschlag bildet, der die Amplitude der Oszillation der Grundplatte 44 begrenzt, bestimmt. Eine dünnwandige Edelstahlrohrstanze 50 mit geschärften Vorderkanten ist auf der flachen Unterseite der Grundplatte 44 montiert, so dass die Stanze 50, bezogen auf die Plattform 32 und dem Behälter 31 auf der Plattform, vorgerückt und zurückgezogen werden kann. Das hohle Innere der Stanze 50 ist durchgängig, mit einer zylindrischen Bohrung durch die Grundplatte 44 und die Bohrung öffnet sich an der Öffnung 51 am horizontalen Rand 53 der Grundplatte 44.
1 zeigt, dass eine dünne Gewebesektion aus einem Spenderblock 30 erhalten und auf einem Objektträger 52 (mit geeigneter Präparation und Anfärbung) angebracht werden kann, so dass interessierende anatomische und mikroanatomische Strukturen im Block 30 lokalisiert werden können. Der Objektträger 52 kann oberhalb des Spenderblocks 30 durch einen Gelenkarmhalter 54 (9) mit einer Klemme 56, die eine Kante eines durchsichtigen Auflageobjektträgers 58 sicher festhält, gehalten werden. Der Armhalter 54 bildet an der Verbindung 60 ein Gelenk, um zwischen einer ersten Position in welcher der Aufla geobjektträger 58 in einer Position oberhalb des Behälters 31 gesichert ist und einer zweiten Position in welcher sich der Auflageobjektträger 58 horizontal aus der in 9 dargestellten Position bewegt, um freien Zugang zur Stanze 50 zu erlauben.
Während des Betriebs ist der rechteckige Behälter 31 auf der Plattform 32 untergebracht (1), wobei die Kanten des Behälters 31 an die Seitenkanten 34 angrenzen, um den Behälter 31 in einer ausgewählten Position zu halten. Ein Spenderblock 30 wird durch Einbettung einer rohen Gewebeprobe (wie zum Beispiel eine dreidimensionale Tumorprobe 62) in Paraffin hergestellt. Eine dünne Sektion des Spenderblocks 30 wird abgeschabt, angefärbt und auf einen Objektträger 52 als dünne Sektion 64 aufgebracht und der Objektträger 52 wird dann auf dem Auflageobjektträger 58 plaziert und oberhalb des Spenderblocks 30, wie in 9 dargestellt, positioniert. Der Objektträger 52 kann auf dem Auflageobjektträger 58 umher bewegt werden bis die Kanten der dünnen Sektion 64 an den Kanten der rohen pathologischen Probe 62, wie in der 9 durch die gepunkteten Linien dargestellt, ausgerichtet sind. Der Arm 54 wird dann in der ersten Position arretiert, zu welcher der Arm nach Verstellung zu einer zweiten Position anschließend zurückkehren kann.
Eine interessierende mikroanatomische oder histologische Struktur 66 kann dann durch Untersuchung der dünnen Sektion durch ein Mikroskop (nicht dargestellt) lokalisiert werden. Wenn die Gewebeprobe zum Beispiel ein Adenokarzinom der Brust ist, dann kann die interessierende Stelle 66 ein Bereich der Probe sein, in welcher die zelluläre Bauweise auf Metaplasie (z.B. pyknotische Kerne, Pleomorphismus, Invasivität) hindeutet. Sobald die interessierende Struktur 66 lokalisiert ist, wird die korrespondierende Region der Gewebeprobe 62, aus der die interessierende Struktur der dünnen Sektion erhalten wurde, unmittelbar unterhalb der interessierenden Struktur 66 aufgefunden. Wie in 1 dargestellt, kann die Positionierplatte 42 in der x- und y-Richtung (unter der Kontrolle der digitalen Mikrometer oder einem Steuerhebel) bewegt werden oder der Spenderblock kann für größere Distanzen bewegt werden, um die Stanze 50 oberhalb der interessierenden Region des Spenderblocks 30 auszurichten und der Auflageobjektträger 58 wird dann horizontal aus seiner Position oberhalb des Spenderblocks 30 um das Drehgelenk 60 herum weggeschwenkt (9).
Die Stanze 50 wird nun durch Vorwärtsbewegung des vertikalen Leitblechs 40 entlang der Schiene 46, bis die Platte 44 seine Endposition (die durch Apparat 38 vorgegeben ist) er reicht hat, in die interessierende Struktur im Spenderblock 30 eingeführt (2). Wenn sich die Stanze 50 vorwärts bewegt, bohrt ihre scharfe Vorderkante eine zylindrische Gewebeprobe aus dem Spenderblock 30 und wenn die Stanze sich zurück in ihre, in 1 gezeigte, eingezogene Position bewegt, wird die Probe innerhalb der Stanze festgehalten. Die zylindrische Gewebeprobe kann anschließend aus der Stanze 50 durch Vorwärtsbewegung eines Stiletts (nicht dargestellt) hinein in Öffnung 51 entfernt werden. Die Gewebeprobe wird zum Beispiel aus der Stanze 50 entfernt und in eine zylindrische Aufnahme von komplementärer Form und Größe in einem Array aus Aufnahmen in einem Empfängerblock 70 eingebracht, wie in 3 dargestellt.
Einer oder mehrere Empfängerblöcke 70 können vor dem Erhalt der Gewebeprobe aus dem Spenderblock 30 hergestellt werden. Block 70 kann durch Einbringen eines festen Paraffinblockes in den Behälter 31 und Verwendung der Stanze 50, um zylindrische Löcher in einem regelmäßigen Raster in Block 70 zu machen, was ein Array von zylindrischen Aufnahmen des in 3 dargestellten Typs ergibt, bereit gestellt werden. Das regelmäßige Array kann durch Positionierung der Stanze 50 an einen Startpunkt oberhalb von Block 70 (zum Beispiel eine Ecke des angehenden Arrays), Ausfahren und dann Einfahren der Stanze 50, um einen zylindrischen Kern von einer spezifischen Koordinate auf Block 70 zu entfernen, dann Entfernen des Kerns aus der Stanze durch Einführen eines Stiletts in die Öffnung 51, erzeugt werden. Die Stanzvorrichtung oder der Empfängerblock wird dann in regelmäßigen Schrittweiten in die x- und/oder y-Richtung zu der nächsten Koordinate auf dem Array bewegt und der Stanzschritt wird wiederholt. In der besonderen offengelegten Ausführungsform der 3 besitzen die zylindrischen Aufnahmen des Arrays Durchmesser von ungefähr 0,6 mm, wobei die Mittelpunkte der Zylinder in regelmäßigen Abständen von ungefähr 0,7 mm angeordnet sind (so dass zwischen den angrenzenden Kanten der Aufnahmen ungefähr ein Zwischenraum von 0,05 mm liegt).
In einem besonderen Beispiel wurden Kerngewebebiopsien, die einen Durchmesser von 0,6 mm und eine Höhe von 3–4 mm hatten, aus ausgewählten repräsentativen Regionen von einzelnen in Paraffin eingebetteten „Spender"-Tumorblöcken entnommen und präzise in einem neuen „Empfänger"-Paraffinblock (20 mm × 45 mm) angeordnet. H&E-angefärbte Sektionen wurden oberhalb der Spenderblöcke positioniert und zur Lenkung der Probennahme von morphologisch repräsentativen Stellen in den Tumoren verwendet. Obwohl der Durchmesser der Biopsiestanze verändert werden kann, wurden 0,6 mm Zylinder als geeignet befunden, da sie groß genug sind, um histologische Muster in jedem Element des Tumorarrays zu beurteilen, aber auch ausreichend klein sind, um nur minimalen Schaden an dem Originalspendergewebeblock zu verursachen und um einigermaßen homogene Gewebeblöcke zu isolieren. Bis zu 1000 solcher Gewebezylinder können in einem 20 × 45 mm Empfängerparaffinblock untergebracht werden. Spezielle offen gelegte Durchmesser der Zylinder sind 0,1–4,0 mm, zum Beispiel 0,5–2,0 mm und besonders speziell kleiner als 1 mm, zum Beispiel 0,6 mm. Automatisierung der Prozedur mit computergesteuerter Bestückung der Proben, erlaubt es sehr kleine Proben in dem Empfängerarray eng zusammen zu plazieren.
4 zeigt das Array im Empfängerblock nachdem die Aufnahmen des Arrays mit Gewebeprobenzylinder gefüllt wurden. Die Oberfläche der Oberseite des Empfängerblocks wird dann mit einer Klebefolie 74 aus einem klebstoffbeschichteten Bandschnittsystem (Instrumentics) überzogen, um dabei zu helfen, dass die Gewebezylindersektionen an ihrer Stelle im Array bleiben, wenn es geschnitten wird. Mit der angebrachten Klebefolie wird eine 4–8 μm Sektion des Empfängerblocks quer zur Längsachse der Gewebezylinder (5) geschnitten, um eine dünne Mikroarraysektion 76 (beinhaltend Gewebeprobenzylindersektionen in der Form von Scheiben) die zu einem gewöhnlichen Probenobjektträger 78 überführt wird. Die Mikroarraysektion 76 wird auf den Objektträger 78 geklebt, zum Beispiel durch Klebstoff auf dem Objektträger. Die Folie 74 wird dann vom eigentlichen Teil des Mikroarrays abgezogen, um es zur Bearbeitung freizulegen. Eine dunkle Kante 80 des Objektträgers 78 ist zur Beschriftung oder Handhabung des Objektträgers geeignet.
Eine Brustkrebsgewebeprobe wurde in kaltem Ethanol zur Konservierung von DNA und RNA mit hohem Molekulargewicht fixiert und 372 der Proben wurden in dieser Weise fixiert. Wenigstens 200 aufeinanderfolgende 4–8 μm Tumorarraysektionen können aus jedem Block geschnitten werden, was Ziele für korrelierte in situ Analysen von Kopienzahl oder Expression von mehreren Genen liefert. Diese Analyse wird durch Prüfung auf verschiedene Genamplifikationen in getrennten Arraysektionen und Vergleich der Ergebnisse der Prüfungen an identischen Koordinaten des Arrays (was Gewebeproben aus dem gleichen, vom Spenderblock erhaltenen, Gewebezylinder entspricht) durchgeführt. Dieser Ansatz erlaubt die Messung von praktisch Hunderten von molekularen Charakteristika aus jedem Tumor, was dadurch die Ausführung einer großen Serie von korrelierten genotypischen oder phänotypischen Charakteristika von unkultivierten menschlichen Tumoren erleichtert.
Ein Beispiel eines einzelnen Mikroarrays 76, das 645 Proben enthält ist in 10A dargestellt. Eine vergrößerte Sektion des Mikroarrays (hervorgehoben durch ein Rechteck in 10A) ist in 10B gezeigt, in der ein Autoradiogramm von erbB2 mRNA in situ Hybridisierung veranschaulicht, dass zwei im Array benachbarte Proben ein starkes Hybridisierungssignal aufweisen. 10C zeigt Elektrophoresegele, die veranschaulichen, dass DNA und RNA mit hohem Molekulargewicht aus über Nacht in Ethanol bei 4°C in einem Vakuumofen fixierten Brustkrebsproben extrahiert werden kann.
Eine der Gewebeproben, die die fluoreszierenden „positiven" Signale abgab, wurde auch durch Immunoperoxidaseanfärbung, wie in 10D gezeigt, analysiert, wodurch bestätigt wurde (durch die dunkle Anfärbung), dass das erbB2-Genprodukt vorlag. Eine DNA-Sonde für das erbB2-Gen wurde verwendet, um Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchzuführen. 10D zeigt eines der Tumorarrayelemente, die einen hohen Grad an erbB2-Genamplifikation aufwiesen. Die Einfügung in 10E zeigt drei Nuklei mit zahlreichen dicht zusammengedrängten erbB2-Hybridiserungssignalen und zwei Kopien der centromere Referenzsonde. Weiterführende Details über diese Assays sind in den unten stehenden Beispielen 1–4 gegeben.
Das Potential der Arraytechnologie der vorliegenden Erfindung zur schnellen parallelen Durchführung molekularer Analysen von mehreren Gewebeproben ist in 11 dargestellt, wobei die y-Achse der Graphen den prozentualen Anteilen von Tumoren in spezifischen Gruppen entspricht, die definierte klinikopathologische oder molekulare Charaktieristika haben. Dieses Diagramm zeigt Korrelationen zwischen klinischen und histopathologischen Charakteristika der Gewebeproben im Mikroarray. Jedes kleine Kästchen in den ausgerichteten Reihen der 11B stellt eine Koordinatenstelle im Array dar. Korrespondierende Koordinaten von aufeinander folgenden dünnen Sektionen des Empfängerblocks sind vertikal übereinander in den sich horizontal erstreckenden Reihen angeordnet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gewebeproben in vier Klassen von Tumoren eingeteilt werden könnten (11A), basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit von Zellmembranöstrogenrezeptorexpression und der Gegenwart oder Abwesenheit der p53-Mutation in der zellularen DNA. In 11B ist die Gegenwart der p53-Mutation durch ein dunkles Kästchen dargestellt, während die Gegenwart von Östrogenrezeptoren ebenfalls durch ein dunkles Kästchen dargestellt ist. Die Einstufung in jede der vier Gruppen (ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ und ER+/p53-) ist durch die gepunkteten Linien zwischen der 11A und 11B, die die Kategorien in die Gruppen I, II, III und IV entsprechend dem ER/p53-Status einteilt, gezeigt.
11B zeigt ebenfalls klinische Charakteristika, die mit dem Gewebe an den jeweiligen Koordinaten des Arrays in Verbindung stehen. Ein dunkles Kästchen für Alter zeigt an, dass der Patient vor den Wechseljahren ist, ein dunkles Kästchen N zeigt die Gegenwart einer metastasenbildenden Krankheit in den lokalen Lymphknoten an, ein dunkles Kästchen T zeigt einen Tumor der Stufe 3 oder 4, der klinisch weiter fortgeschritten ist, an und ein dunkles Kästchen für Grad zeigt einen hochgradigen (wenigstens Grad III) Tumor, der mit erhöhter Bösartigkeit verbunden ist, an. Die Korrelation des ER/p53-Status kann durch Vergleich der oberen vier Reihen der klinischen Indikatorkästchen (Alter, N, T, Grad) mit den mittleren zwei Reihen an Kästchen (ER/p53-Status) durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Kreuzkorrelation sind in dem Balkendiagramm der 11A dargestellt, woraus gesehen werden kann, dass ER-/p53+ (Gruppe I) Tumore dazu neigen, einen höheren Grad zu besitzen als die anderen Tumore und eine besonders hohe Frequenz der myc-Amplifikation hatten, während ER+/p53+ (Gruppe III) Tumore eine höhere Wahrscheinlichkeit, positive Knoten zur Zeit der chirurgischen Resektion zu haben, besaßen. Die ER-/p53- (Gruppe II) zeigte, dass die gewöhnlichste Genamplifikation in dieser Gruppe erbB2 war. Im Gegensatz dazu zeigten ER-/p53- (Gruppe II) und ER+/p53- (Gruppe IV) Tumore weniger Indikatoren von schwerer Krankheit, was somit eine Korrelation zwischen der Abwesenheit der p53-Mutation und einer besseren Prognose nahe legt.
Dieses Verfahren wurde auch dazu genutzt die Kopienzahl von mehreren anderen bedeutenden Brustkrebsonkogenen in den 372 angeordneten primären Brustkrebsproben in aufeinanderfolgenden FISH-Experimenten zu analysieren und diese Ergebnisse wurden verwendet, um Korrelationen zwischen der ER/p53-Einstufung und der Expression dieser anderer Onkogene zu erforschen. Diese Ergebnisse wurden durch Verwendung von Sonden für jedes der separaten Onkogene in aufeinanderfolgenden Sektionen des Empfängerblocks und Vergleich der Ergebnisse an entsprechenden Koordinaten des Arrays erhalten. In 11B wird ein positives Ergebnis für die Amplifikation des spezifischen Onkogens oder Markers (mybL2, 20q13, 17q23, myc, cnd1 und erbB2) durch ein dunkles Kästchen angezeigt. Das erbB2-Onkogen wurde in 18%, der 372 angeordneten Proben, myc in 25% und Cyclin D1 (cnd1) in 24% der Tumore amplifiziert.
Es wurde gefunden dass die zwei kürzlich entdeckten neuen Regionen von häufiger DNA-Amplifizierung in Brustkrebs, 17q23 und 20q13, in jeweils 13% und 6% der Tumore amplifiziert wurden. Es wurde gefunden, dass das Onkogen mybL2 (das kürzlich bei 20q13.1 lokalisiert wurde und von dem gefunden wurde, dass es in Brustkrebszelllinien überexprimiert wird) in 7% der gleichen Gruppe an Tumoren amplifiziert wird. MybL2 wurde in Tumoren mit normaler Kopienzahl des Hauptorts von 20q13 amplifiziert, was darauf hindeutet, dass es eine unabhängige ausgewählte Region der Amplifikation an 20q bestimmt. Die gepunkteten Linien zwischen den 11B und 11C teilen wieder die komplexe Koamplifikationsmuster dieser Gene in die Gruppen I-IV, die ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ und ER+/p53- entsprechen, auf.
Die 11C und 11D zeigen, dass 70% der ER-/p53+-Proben auf ein oder mehr dieser Onkogene positiv war und dass myc das vorwiegend amplifizierte Onkogen in dieser Gruppe war. Im Gegensatz dazu zeigten nur 43% der Proben in der ER+/p53- -Gruppe Koamplifizierung von einem dieser Onkogene und diese Information konnte wiederum mit den klinischen Parametern, die in 11A gezeigt sind, korreliert werden. Folglich erlaubt die Mikroarraytechnologie einer großen Anzahl an Tumorproben zweckmäßig und schnell auf viele dieser Charakteristika überprüft und auf Muster von Genexpression, die mit der klinischen Einstellung des Patienten und der molekularen Entwicklung der Krankheit in Beziehung stehen können, analysiert zu werden. In der Abwesenheit der Mikroarraytechnologie der vorliegenden Erfindung sind diese Korrelationen schwieriger zu erhalten.
Eine spezielles Verfahren zum Erhalt dieser Korrelationen ist in 12 dargestellt, die eine Vergrößerung des rechten Teilbereichs der 11B ist. Das Mikroarray 76 (10A) ist in Sektionen angeordnet, die siebzehn Reihen und neun Spalten von kreisförmigen Stellen enthalten, die mit Querschnitten der zylindrischen Gewebeproben aus verschiedenen Tumoren übereinstimmen, wobei jede Stelle im Mikroarray durch die Koordinaten (Reihe, Spalte) repräsentiert werden kann. Zum Beispiel haben die Proben in der ersten Reihe der ersten Sektion die Koordinatenpositionen (1,1), (1,2)... (1,9) und die Proben in der zweiten Reihe haben die Koordinatenpositionen (2,1), (2,2)... (2,9). Jede dieser Arraykoordinaten kann zur Lokalisierung von Gewebeproben aus entsprechenden Positionen auf aufeinandertolgenden Sektionen des Empfängerblocks verwendet werden, zur Identifikation von Gewebeproben des Arrays, die aus dem gleichen Gewebezylinder geschnitten wurden.
Wie in 12 gezeigt, wird die rechteckige Anordnung in eine lineare Darstellung, in der jedes Kästchen der linearen Darstellung einer Koordinatenposition des Arrays entspricht, umgewandelt. Jede dieser Reihen von Kästchen ist so angeordnet, dass jedes Kästchen mit einer identischen Arraykoordinatenposition korrespondiert, die sich oberhalb anderer Kästchen der gleichen Koordinatenposition befindet. Folglich korrespondieren die, durch die gepunktete Linie 1 verbundenen, Kästchen mit den Ergebnissen, die durch Blick auf die Ergebnisse der Koordinatenposition (1,1) in aufeinanderfolgenden dünnen Sektionen des Spenderblocks oder klinischen Daten, die möglicherweise nicht aus dem Mikroarray erhalten wurden, die aber in das System zur weiteren Identifizierung von Gewebe von einem Tumor, das zu dieser Koordinatenposition korrespondiert, eingetragen werden können. Gleichermaßen korrespondieren die durch die gepunktete Linie 10 verbundenen Kästchen zu den Ergebnissen, die an der Koordinatenposition (2,1) des Arrays gefunden werden kann und die durch die gepunktete Linie 15 verbundenen Kästchen korrespondieren zu den Ergebnissen an der Koordinatenposition (2,6) des Arrays. Die Buchstaben a, b, c, d, e, f, g und h entsprechen aufeinanderfolgenden Sektionen des Spenderblocks, die geschnitten wurden, um das Array zu bilden.
Durch Vergleich der Linie 1 entlang angeordneten Kästchen in 12 kann gesehen werden, dass ein Tumor von einer Frau nach den Wechseljahren ohne metastasenbildende Krankheit in ihren Lymphknoten zur Zeit der chirurgischen Resektion erhalten wurde, in welcher der Tumor kleiner als Stufe 3, aber in welcher die Histologie des Tumors wenigstens Grad III war. Ein Gewebeblock wurde von diesem Tumor genommen und in das Empfängerarray an der Koordinatenposition (1,1) eingeführt und sobald das Array fertig gestellt war, wurde es in acht parallele Sektionen (a, b, c, d, e, f, g und h), von denen jede einen repräsentativen Schnitt des zylindrischen Arrays enthielt, unterteilt. Jede dieser Sektionen wurde mit einer unterschiedlichen, spezifischen Sonde für ein bestimmtes molekulares Attribut untersucht. In Sektion a deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Gewebeprobe p53+ war, in Sektion b, dass sie ER- war, in Sektion c, dass sie keine Amplifikation des mybL2-Onkogens zeigte, in den gesonderten Sektionen d, e, f, g und h, dass sie positiv bezüglich der Amplifikation von 20q13, 17q23, myc, cnd1 und erbB2 war.
Ähnliche Vergleiche von molekularen Charakteristika des Tumorprobenzylinders, der an Koordinatenposition (2,1) plaziert war, können durch Folgen der vertikalen Linie 10 in 12, die das zehnte Kästchen in jeder Reihe verbindet, gemacht werden und bezieht sich auf die zweite Reihe, erste Spalte (2,1) des Arrays 76 in 10(A). In gleicher Weise kön nen die Charakteristika der Sektionen des Tumorprobenzylinders an der Koordinatenposition (2,6) durch Folgen der vertikalen Linie 15 hinunter durch das fünfzehnte Kästchen jeder Reihe untersucht werden. Auf diese Weise können parallele Informationen über die separaten Sektionen des Arrays für alle 372 Positionen des Arrays vorgeführt werden. Diese Informationen können zur Analyse wie in 12 visuell dargestellt oder in eine Datenbank zur Analyse und Korrelation von verschiedenen molekularen Charakteristika (wie zum Beispiel Muster von Onkogenamplifizierung und die Entsprechung dieser Muster der Amplifikation zur klinischen Einordnung des Tumors) eingegeben werden.
Die Analyse aufeinanderfolgender Sektionen aus den Arrays erlaubt die Ko-Lokalisierung von Hunderten verschiedenen DNA-, RNA- oder Proteinzielen in der gleichen Zellpopulation in morphologisch definierten Regionen jedes Tumors, was den Aufbau einer Datenbank mit einer großen Anzahl von korrelierten genotypischen oder phänotypischen Charaktieristika von unkultivierten menschlichen Tumoren erleichtert. Die Bewertung von mRNA-insitu-Hybridisierungen oder immunohistochemischen Anfärbungen von Proteinen wird ebenso durch Tumorgewebemikroarrays erleichtert, da geringe Mengen an identischen Reagenzien für jede Analyse verwendet werden. Die Tumorarrays reduzieren auch den Gewebeverbrauch, die Verwendung von Reagenzien und Arbeitsbelastung im Vergleich zur Bearbeitung von einzelnen gewöhnlichen Proben zur Sektionierung, Anfärbung und Bewertung erheblich. Die zusammengefasste Analyse von mehreren DNA-, RNA- und Proteinzielen liefert ein leistungsfähiges Mittel zur Schichtung von Tumorproben aufgrund Ihrer molekularen Charakteristika. Solche Muster werden bei der Entdeckung bislang unbeachteter aber wichtiger molekularer Merkmale von Tumoren hilfreich sein, die sich von diagnostischem oder prognostischem Nutzen erweisen könnten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die zur Herstellung der Gewebearray verwendeten sehr kleinen Zylinder in den meisten Fällen korrekte Informationen liefern können, besonders wenn die Stelle zur Gewebebeprobung aus dem Spenderblock so ausgewählt wird, dass sie histologische Strukturen, die am typischsten für Tumorregionen sind, enthält. Es ist auch möglich Proben aus mehreren histologisch definierten Regionen in einem einzelnen Spendergewebeblock zu sammeln, um eine umfassendere Darstellung des ursprünglichen Gewebes zu erhalten und um die Korrelation zwischen Phänotyp (Gewebemorphologie) und Genotyp direkt zu untersuchen. Ein Array könnte zum Beispiel so aufgebaut werden, dass Hunderte von Geweben, die verschiedene Stufen des Fortschreitens von Brustkrebs (z.B. normales Gewebe, Hyperplasia, untypische Hyperplasia, intraduktaler Krebs, invasi ver und metastatischer Krebs) repräsentieren, enthalten sind. Die Gewebearraytechnologie würde dann dazu genutzt werden, die molekularen Ereignisse die sich auf die Tumorentwicklung beziehen, zu untersuchen.
Eine dichtere Packung von Zylindern und ein größerer Empfängerblock kann auch eine noch höhere Anzahl an Proben pro Array liefern. Ganze Archive aus pathologischen Laboratorien könnten in replizierten 1000-Gewebeprobenmikroarrays zur molekularen Profilierung untergebracht werden. Wenn der Prozess der Probenahme und Anordnung automatisiert wird, ist es möglich Dutzende von replizierten Tumorarrays herzustellen, von denen jedes Hunderte von Sektionen zur molekularen Analyse liefert. Die gleiche Strategie und Geräteausstattung, die für Tumorarrays entwickelt wurde, ermöglicht auch Mikropräparation von Gewebezylindern zur Isolierung von RNA und DNA mit hohem Molekulargewicht aus bestens fixierten, morphologisch definierten Tumorgewebeelementen und erlaubt dadurch eine korrelierte Untersuchung der gleichen Tumore durch PCR-basierende Techniken für RNA und DNA. Wenn Nukleinsäureanalyse vorgesehen ist, wird die Gewebeprobe bevorzugt in Ethanol oder Molecular Biology Fixative (Streck Laboratories, Inc., Omaha, NE) anstatt in Formalin fixiert (bevor sie in Paraffin eingebettet wird), da Formalin die Nukleinsäuren vernetzen oder anderweitig schädigen kann. Der Gewebezylinder der vorliegenden Erfindung liefert eine ausreichende Menge an DNA oder RNA an der eine Vielzahl von molekularen Analysen durchgeführt werden kann.
Das Potential dieser Arraytechnologie wurde in FISH-Analysen von Genamplifikationen in Brustkrebs dargestellt. FISH ist eine exzellente Methode zur Visualisierung und exakten Auffindung von genetischen Umlagerungen (Amplifikationen, Löschungen oder Translokation) in einzelnen, morphologisch definierten Zellen. Die vereinigte Tumorarraytechnologie ermöglicht es FISH eine leistungsfähige Hochdurchsatzmethode zu werden, die die Analyse von Hunderten von Proben pro Tag erlaubt.
Ausführungsform der 13–23
Ein Beispiel eines automatisierten Systems zur Hochgeschwindigkeitsherstellung der Mikroarrays ist in den 13–23 gezeigt. Das System beinhaltet eine Plattform 100, die einen x-Antrieb 102 und einen y-Antrieb 104 besitzt, von denen jeder eine entsprechende Antriebswelle 106, 108 dreht. Die Welle 108 bewegt eine Probenbank 110 in eine y-Richtung, während die Welle 106 eine Schale 112 auf der Bank 110 in eine x-Richtung bewegt. In einer vorderen Reihe der Schale 112 sind drei Empfängerbehälter 116, 118 und 120 mon tiert, von denen jeder einen Empfängerparaffinblock 122, 124 oder 126 enthält und einen Spenderbehälter 128, der einen Spenderparaffinblock 130 enthält, in dem eine Gewebeprobe 132 eingebettet ist. In einer hinteren Reihe der Schale sind zwei Spenderschalen mit mehreren Bohrlöchern 132, 134 (die mehrere Behälter zur Erhaltung von Proben in flüssigem Medium enthalten) und einen Abfallbehälter 136.
Oberhalb der Plattform 100 ist eine Stanzapparatur 140 angeordnet, die sich in z-Richtung auf- und abwärts bewegen kann. Der Apparat 140 beinhaltet einen zentralen, vertikal angeordneten Stilettantrieb 142, in dem ein Stilett sich hin- und herbewegt. Der Apparat 140 beinhaltet auch einen geneigten Empfängerstanzenantrieb 146 und einen geneigten Spenderstanzenantrieb 148. Der Stanzenantrieb 146 beinhaltet einen umgekehrten Kolben 150, der eine röhrenförmige Empfängerstanze 154 an seinem Distalende trägt und der Stanzenantrieb 148 beinhaltet einen umgekehrten Kolben 152, der eine röhrenförmige Spenderstanze 156 an seinem Distalende trägt. Wenn der Kolben 150 ausgefahren wird (14), wird die Empfängerstanze 154 mit dem offenen oberen Ende ihrer röhrenförmigen Bohrung am Stilett 144 ausgerichtet und wenn der Kolben 152 ausgefahren wird (16), wird die Spenderstanze 156 mit dem offenen oberen Ende ihrer röhrenförmigen Bohrung am Stilett 144 ausgerichtet.
Der sequentielle Arbeitsablauf der Apparatur 140 ist in den 13-17 dargestellt. Wenn die Vorrichtung wie in 13, montiert ist, kann ein Computersystem zur Steuerung der Apparatur verwendet werden, um eine hohe Effizienz zu erreichen. Deshalb kann das Computersystem sich selbst initialisieren, indem die Lage der Behälter auf der Schale 112 bestimmt, wie in 13 gezeigt. Die x- und y-Antriebe 102, 104 werden dann aktiviert, um die Bank 110 und die Schale 112 in die in 14 gezeigte Position zu bewegen, so dass die Aktivierung des Kolbens 150 die Empfängerstanze 154 zu einer Position oberhalb der Position (1,1) im Empfängerblock 122 ausfährt. Wenn die Stanze 154 in Position ist, bewegt sich der Apparat in der z-Richtung abwärts, um ein zylindrisches Loch in das Paraffin des Empfängerblocks zu stanzen. Der Apparat 140 bewegt sich dann in der z-Richtung aufwärts, um die Stanze 154 aus dem Paraffinempfängerblock 122 zu heben, allerdings behält die Stanze 154 einen Kern aus Paraffin, der eine zylindrische Aufnahme im Empfängerblock 122 hinterlässt. Die x-y-Antriebe werden dann aktiviert, um die Bank zu bewegen und den Abfallbehälter 136 unter der Stanze 154 zu positionieren. Der Stilettantrieb 142 wird dann aktiviert, um das Stilett 144 in das offene obere Ende der ausgerichteten Stanze 154 vorzuschieben, um den Paraffinkern aus der Stanze 154 in den Abfallbehälter 136 zu entfernen.
Das Stilett 144 wird dann aus der Empfängerstanze 154 zurückgezogen, der Kolben 150 wird zurückgezogen und der x-y-Antrieb bewegt die Bank 110 und die Schale 112 so, dass der Spenderbehälter 128 in einer solchen Position (in 16 gezeigt) plaziert wird, dass die Vorwärtsbewegung des Kolbens 152 die Spenderstanze 156 zu einer gewünschten Lage oberhalb des Spenderblocks 130 vorschiebt. Der Apparat 140 wird dann in der z-Richtung abwärts bewegt, um einen zylindrischen Kern aus Gewebe aus dem Spenderblock 130 zu stanzen und der Apparat 140 wird dann in der z-Richtung bewegt, um die Spenderstanze 156 zurückzuziehen, wobei die zylindrische Gewebeprobe in der Stanze verbleibt. Der x-y-Antrieb bewegt dann die Bank 110 und die Schale 112 zu der in 17 gezeigten Position, so dass die Abwärtsbewegung in der z-Richtung von Apparat 140 die Spenderstanze 156 in die Aufnahme an der Koordinatenposition (1,1) im Block 122, aus welcher der Empfängerstopfen entnommen wurde, befördert. Die Spenderstanze 156 wird unterhalb des Stiletts 144 ausgerichtet und das Stilett wird ausgefahren, um den verbliebenen Gewebezylinder aus der Spenderstanze 156 zu entfernen, so dass der Spendergewebezylinder in der Aufnahme des Empfängerblocks 122 verbleibt, wenn sich der Apparat 140 in der z-Richtung aufwärts bewegt, um die Spenderstanze 156 vom Empfängerarray zurückzuziehen. Der Kolben 152 wird dann zurückgezogen.
Dieser Prozess kann solange wiederholt werden, bis eine gewünschte Anzahl an Empfängeraufnahmen gebildet und mit zylindrischen Spendergeweben an den gewünschten Koordinatenstellen des Arrays gefüllt wurden. Obwohl diese dargestellte Methode eine sequentielle abwechselnde Bildung jeder Aufnahme und Einführung des Gewebezylinders in die gebildete Aufnahme aufweist, ist es ebenso möglich alle Aufnahmen in den Empfängerblöcken 122, 124 und 126 als ersten Schritt zu bilden und dann zum Schritt des Erhalts der Gewebeproben und ihrer Einführung in die vorgeformten Aufnahmen überzugehen. Die gleiche Gewebeprobe 132 kann wiederholt verwendet werden oder die Probe 132 kann gewechselt werden, nachdem jedes Spendergewebenprobe, durch die Einführung eines neuen Spenderblocks 130 in den Behälter 128, erhalten wurde. Wenn der Spenderblock 130 nach jedem erhaltenen Gewebezylinder gewechselt wird, kann jede Koordinate des Arrays Gewebe von einer anderen Gewebeprobe enthalten.
In 18 ist eine Vorrichtung zur Positionierung gezeigt, die hilft, interessierende Strukturen, von denen Spenderproben entnommen werden können, aufzufinden. Die Vorrichtung zur Positionierung beinhaltet einen Auflageobjektträger 160 der sich zwischen den gegenüberliegenden Wänden von Spenderbehälter 128 ausdehnt, um einen Objektträger 162 zu tragen, auf dem eine dünne, angefärbte Sektion der Probe 132 in Spenderblock 130 angebracht ist. Unter Verwendung eines Mikroskops, das auf Apparat 140 montiert ist (das Objektiv des Mikroskops ist bei 166 dargestellt), können interessierende mikroanatomische Strukturen gefunden werden. Die richtige vertikale Höhe von Apparat 140 oberhalb der oberen Oberfläche des Spenderblocks 130 kann durch die Verwendung der zwei Positionierlampen 168, 170, die am Apparat 140 angebracht sind, bestimmt werden. Lichtstrahlen 172, 174 werden von den Lampen 168, 170 mit einem solchen Winkel projiziert, dass die Strahlen auf einem einzelnen Punkt 176 zusammenfallen, wenn die vertikale Höhe von Apparat 140 oberhalb der oberen Oberfläche der Lampe auf einem gewünschten z-Niveau ist. Dieses gewünschte z-Niveau positioniert die Stanzen 152, 154 auf einer angemessenen Höhe, um die Oberfläche des Blocks 130 an der gewünschten Stelle und zu einer gewünschten Tiefe zu durchdringen.
Es ist vorteilhaft, wenn die aus dem Block 130 gestanzten Gewebezylinder sicher in die Empfängeraufnahmen passen, die gebildet wurden, um diese aufzunehmen. Wenn die Spenderstanze 156 die gleichen Innen- und Außendurchmesser wie die Empfängerstanze 154 besitzt, dann wird die zylindrische Spendergewebeprobe durch den Innendurchmesser der Stanze gebildet und die Empfängeraufnahme wird durch den Außendurchmesser der Stanze gebildet. Dieser Unterschied wird eine Aufnahme liefern, die geringfügig größer im Durchmesser ist, als der Spendergewebezylinder. Deshalb, wie in den 19 und 20 gezeigt, besitzt die Empfängerstanze 154 einen geringeren Durchmesser als die Spenderstanze 156. Die Empfängerstanze wird folglich eine zylindrische Aufnahme bilden (die einen Durchmesser besitzt, die dem Außendurchmesser der Stanze 154 entspricht) die im Wesentlichen den gleichen Durchmesser hat, wie der Gewebeprobenzylinder 180, der mit einem Durchmesser gebildet wurde, der durch den Innendurchmesser der Spenderstanze 156 bestimmt ist.
21 stellt einen Querschnitt durch den Empfängerarray dar, nachdem die Aufnahmen 182 gebildet und mit Gewebeprobenzylindern 180 gefüllt wurden. Kleine Zwischenwände aus Paraffinmaterial 122 trennen die Gewebezylinder 180 und wie dargestellt sind die Aufnahmen 182 tiefer als die Probenzylinder 180, so dass eine kleiner Abstand zwischen den Proben und dem Boden der Aufnahmen vorhanden ist. Sobald der Array gebildet wurde, kann ein Mikrotom verwendet werden, um eine dünne Sektion S von der Oberseite des Blocks 122 abzuschneiden, so dass die Sektion S auf einem Probenobjektträger 162 (18) angebracht werden kann, um dabei zu helfen, interessierende Strukturen in der Gewebeprobe 132 zu lokalisieren. Das Mikrotom schneidet dann auch dünne parallele Sektionen a, b, c, d, e, f, g und h, die jede einer anderen molekularen Analyse, wie bereits beschrieben, unterzogen werden kann.
Beispielhafte Betriebsumgebung
22 und die folgende Diskussion ist dazu gedacht, eine kurze, allgemeine Beschreibung einer geeigneten Rechnerumgebung, in der die Erfindung implementiert werden kann, zu geben. Die Erfindung wird in einer Vielzahl von Programmmodulen implementiert. Im Allgemeinen beinhalten Programmmodule Routinen, Programme, Komponenten, Datenstrukturen etc., die bestimmte Aufgaben durchführen oder bestimmte abstrakte Datentypen ausführen. Die Erfindung kann mit anderen Computersystemkonfigurationen genutzt werden, einschließlich Handheld-Geräte, Multiprozessorsysteme, mikroprozessorgestützte oder programmierbare Unterhaltungselektronik, Minicomputer, Mainframecomputer und desgleichen. Die Erfindung kann auch in dezentralisierten Rechnerumgebungen genutzt werden, wo Aufgaben durch Fernbearbeitungsgeräte, die durch ein Kommunikationsnetzwerk verbunden sind, durchgeführt werden. In einer dezentralisierten Rechnerumgebung können sich Programmmodule sowohl in lokalen als auch entfernten Datenspeichereinheiten befinden.
Bezug nehmend auf 22 ist eine Betriebsumgebung für eine dargestellte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Computersystem 220 mit einem Computer 222, der wenigstens einen Hochgeschwindingkeitsprozessor (CPU) 224, in Verbindung mit einem Speichersystem 226, einer Eingabeeinheit 228 und einer Ausgabeeinheit 230 umfasst. Diese Elemente sind durch wenigstens eine Busstruktur 232 miteinander verbunden.
Die dargestellte CPU 224 ist von bekannter Bauweise und beinhaltet eine ALU 234 zur Durchführung von Berechnungen, einer Sammlung von Registern 236 zur temporären Speicherung von Daten und Befehlen und eine Kontrolleinheit 238 zur Kontrolle des Betriebs des Systems 220. Die CPU 224 kann ein Prozessor, der jede beliebige einer Vielzahl von Bauweisen einschließlich Alpha von Digital; MIPS von MIPS Technology, NEC, IDT, Siemens und anderen; x86 von Intel und anderen, einschließlich Cyrix, AMD und Nexgen; 680xO von Motorola; und PowerPC von IBM und Motorola, besitzen kann.
Das Speichersystem 226 beinhaltet im Allgemeinen Hochgeschwindigkeitshauptspeicher 240 in der Form eines Mediums wie zum Beispiel Schreib-Lese-Speicher-(RAM) und Nur-Lese-Speicher-(ROM)Halbleitereinheiten und sekundären Speicher 242 in der Form von Langzeitspeichermedien wie zum Beispiel Disketten, Festplatten, Band, CD-ROM, Flash-Speicher etc. und andere Geräte, die Daten unter Verwendung von elektrischen, magnetischen, optischen oder anderen Aufzeichnungsmedien speichern. Der Hauptspeicher 240 kann auch einen Bildausgabespeicher zur Darstellung von Bildern mittels eines Anzeigegerätes beinhalten. Der Fachmann wird verstehen, dass der Speicher 226 eine Vielfalt von alternativen Komponenten mit einer Vielfalt von Speicherkapazitäten einschließen kann.
Die Eingabe- und Ausgabegeräte 228, 230 sind auch bekannt. Das Eingabegerät 228 kann eine Tastatur, eine Maus, einen Scanner, eine Kamera, eine Erfassungskarte, einen Grenzschalter (wie zum Beispiel Ausgangspositions-, Sicherheits- oder Zustandsschalter), einen physikalischen Signalumformer (z.B. ein Mikrophon) etc. umfassen. Das Ausgabegerät 230 kann einen Bildschirm, einen Drucker, einen Motorantrieb, eine Magnetspule, einen Signalwandler (z.B. einen Lautsprecher) etc. umfassen. Einige Geräte, wie zum Beispiel ein Netzwerkanschluss oder ein Modem können als Eingabe- und/oder Ausgabegeräte genutzt werden.
Wie dem Fachmann bekannt ist, beinhaltet das Computersystem 220 weiterhin ein Betriebssystem und wenigstens ein Anwendungsprogramm. Das Betriebssystem ist eine Zusammenstellung von Software, die den Betrieb des Computersystems und die Verteilung von Ressourcen steuert. Das Anwendungsprogramm ist die Zusammenstellung von Software, die eine vom Anwender gewünschte Aufgabe, unter Verwendung von durch das Betriebssystem bereitgestellten Computerressourcen, ausführt. Beide sind in dem dargestellten Speichersystem 226 angesiedelt.
Die Erfindung könnte zum Beispiel in einen von Apple Computer erhältlichen Power Macintosh 8500 oder einen IBM-kompatiblen Personal Computer (PC) implementiert werden. Der Power Macintosh verwendet eine PowerPC 604 CPU von Motorola und führt ein MacOS Betriebssystem von Apple Computer wie zum Beispiel System 8 aus. Ein- und Ausgabegeräte können mit der CPU unter Verwendung der wohlbekannten SCSI-Schnittstelle oder mit Erweiterungskarten unter Verwendung des Peripheral Component Interconnect (PCI) Busses gekoppelt werden. Eine typische Konfiguration eines Power Macintosh 8500 hat 72 Megabyte RAM als Hochgeschwindigkeitshauptspeicher und eine 2 Gigabyte Festplatte als sekundären Speicher. Ein IBM-kompatibler PC könnte eine Konfiguration mit 32 Megabyte RAM als Hochgeschwindigkeitshauptspeicher und eine 2–4 Gigabyte Festplatte als sekundären Speicher besitzen.
In Übereinstimmung mit den Gewohnheiten von Fachleuten der Computerprogrammierung ist die vorliegende Erfindung mit Bezug zu Vorgängen und symbolischen Darstellungen von Arbeiten beschrieben, die durch das Computersystem 220, soweit nicht anders angegeben, durchgeführt werden. Solche Vorgänge und Arbeiten werden manchmal als durch Computer ausgeführt bezeichnet. Es wird anerkannt, dass die Vorgänge und symbolisch dargestellten Arbeiten die Beeinflussung von elektrischen Signalen, die Datenbits repräsentieren, durch die CPU 224 beinhaltet, was eine Umwandlung oder Reduktion der Verkörperung des elektrischen Signals und die Erhaltung von Datenbits an Speicherstellen im Speichersystem 226, um dadurch die Arbeit des Computersystems umzugestalten oder anderweitig zu verändern, ebenso wie eine andere Verarbeitung von Signalen, zur Folge hat. Die Speicherstellen an denen Datenbits erhalten werden, sind physikalische Stellen, die besondere elektrische, magnetische oder optische Eigenschaften haben, die den Datenbits entsprechen.
Beschreibung des Computer-Array-Systems
Ein Blockdiagramm das ein System zur Durchführung der Erfindung darstellt ist in 23 gezeigt. Die Hardware wird bei Schritt 250 initialisiert, zum Beispiel durch Bestimmung der Position der Stanzen 154, 156, Bank 110 und Schale 112. Das System könnte dann durch den Bediener bei Schritt 252 konfiguriert werden, zum Beispiel durch Eingabe von Daten oder durch Aufforderung des Systems, die Stelle (x, y, z-Koordinaten) der oberen rechten Ecke jedes Empfängerblocks 122–126, wie auch die Stelle der Schalen 130–136 zu finden. Die Anzahl an Spenderblöcken, Aufnahmen, Betriebsgeschwindigkeit etc. könnte ebenfalls zu dieser Zeit eingegeben werden.
Bei Schritt 254 fordert das System zur Eingabe von identifizierenden Informationen über den ersten Spenderblock 130, der in der Ablage 128 plaziert wird, auf. Diese identifizierenden Informationen können Zugangsnummer-Information, klinische Information über die Probe und jede/oder andere Information, die bei der Analyse der Tumorarrays nützlich sein würden, sein. Bei Schritt 256 drückt der Bediener eine ausgewählte Funktionstaste, die die Stanzen 154, 156 anhebt und einem Steuerhebel erlaubt, die Proben unter Verwendung der x-y-Antriebe zu bewegen. Die eingegebenen Daten werden bei Schritt 258 angezeigt und bei 260 bestätigt.
Das System erhält dann eine oder mehrere Spenderproben von dem identifizierten Spenderblock bei Schritt 262 und fordert den Bediener zur Eingabe von Informationen über den nächsten Spenderblock auf. Wenn Informationen über einen weiteren Block eingegeben werden, kehrt das System zu Schritt 256 zurück und erhält die gewünschte Anzahl an Proben von den neuen Block. Nachdem ein neuer Donorblock in den Spenderbehälter 128 gelegt wurde, prüft das System die Position der Stanzen bei Schritt 268. Wenn keine Informationen über einen weiteren Block bei Schritt 264 eingegeben werden, bewegt das System die Spenderschale zur Umladeposition, so dass ein Block 130 aus der Spenderschale entfernt werden kann. Dieses System ist auch auf zylindrische Biopsien von histologisch kontrollierten Stellen von Proben (wie zum Beispiel Tumore) zur DNA/RNA-Isolierung anpassbar.
Die automatisierte Tumorarraytechnologie erlaubt einfaches Prüfen von Dutzenden oder Hunderten von Markern aus dem gleichen Satz an Tumoren. Diese Studien können in einer multizentrischen Einstellung durchgeführt werden, indem replizierte Tumorarrayblöcke oder Sektionen an andere Laboratorien geschickt werden. Der gleiche Ansatz wäre besonders wertvoll zur Prüfung von neu entdeckten molekularen Markern bezüglich ihrem diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Nutzen. Die Gewebearraytechnologie erleichtert auch grundlegende Krebsforschung, indem sie eine Plattform zur schnellen Einordnung von Hunderten oder Tausenden von Tumoren auf der DNA-, RNA- und Proteinebene liefert, was zum Aufbau einer korrelierten Datenbank von Biomarkern einer großen Kollektion an Tumoren führt. Die Suche nach Amplifizierungszielgenen zum Beispiel benötigt korrelierte Analysen von Amplifikation und Expression von Dutzenden von kandidierenden Genen und Stellen in der gleichen Zellpopulation. Solche extensiven molekularen Analysen einer definierten großen Serie von Tumoren wären mit gewöhnlichen Technologien schwierig auszuführen.
Beispiele der Arraytechnologie
Anwendungen der Gewebearraytechnologie sind nicht auf Krebsstudien begrenzt, obwohl die folgenden Beispiele 1–4 Ausführungsformen ihrer Verwendung in Verbindung mit Analysen von Geschwulsten offen legt. Arrayanalysen könnten auch beim Verständnis der Ex pression und Dosierung von mehreren Genen in anderen Krankheiten, sowohl in normalem menschlichen als auch in tierischen Geweben, einschließlich Lager von Geweben von verschiedenen trangenetischen Tieren oder kultivierten Zellen, hilfreich sein. Die folgenden spezifischen Beispiele stellen einige besondere Ausführungsformen der Erfindung dar.
BEISPIEL 1
Gewebeproben
Eine Gesamtzahl von 645 Brustkrebsproben wurde zur Herstellung eines Brustkrebstumorgewebearrays verwendet. Die Proben beinhalteten 372 frisch gefrorene Ethanolfixierte Tumore, wie auch 273 Formalin-fixierte Brustkrebse, normale Gewebe und Fixierungskontrollen. Die Teilmenge an gefrorenen Brustkrebsproben wurde zufällig aus der Tumorbank des Instituts für Pathologie der Universität Basel ausgewählt, die mehr als 1500 gefrorene Brustkrebse enthält, die durch chirurgische Resektionen zwischen 1986-1997 erhalten wurden. Lediglich die Tumore aus dieser Tumorbank wurden für die molekularen Analysen verwendet. Diese Teilmenge wurde von einen Pathologen geprüft, der bestimmte, dass die Proben 259 duktale, 52 lobulärs 9 medulläre, 6 muzinöss, 3 kribröss 3 röhrenförmige, 2 papilläre, 1 histiozytische, 1 hellzellige und 1 lipidreiche Karzinome beinhalteten. Es gab auch 15 duktale Karzinome in situ, 2 Karzinosarkome, 4 primäre Karzinome, die vor der Operation eine Chemotherapie erhalten hatten, 8 wiederkehrende Tumore und 6 Metastasen. Eine histologische Einordnung wurde nur bei invasiven primären Tumoren durchgeführt, die nicht zuvor einer Chemotherapie unterzogen worden waren. Von diesen Tumoren waren 24% Grad 1, 40% Grad 2 und 36% Grad 3. Die pT-Stufe war pT1 bei 29%, pT2 bei 54%, pT3 bei 9% und pT4 bei 8%. Von 282 Patienten (45% pN0, 46% pN1, 9% pN2) wurden Achsellymphknoten untersucht. Alle zuvor unfixierten Tumore wurden über Nacht in kaltem Ethanol bei +4°C fixiert und dann in Paraffin eingebettet.
BEISPIEL 2
Immunohistochemie
Nach Herstellung des Arrays und Sektionierung des Spenderblocks wurden zur Immunohistochemie gewöhnliche indirekte Immunoperoxidaseverfahren (ABC-Elite, Vector Laboratories) verwendet. Monoklonale Antikörper von DAKO (Glostrup, Dänemark) wurden zum Nachweis von p53 (DO-7, Maus, 1:200), erbB-2 (c-erbB-2, Kaninchen, 1:4000) und Östrogenrezeptor (ER ID5, Maus, 1:400) verwendet. Eine Mikrowellenvorbehandlung wurde bei p53- (30 Minuten bei 90°) und erbB-2-Antigen- (60 Minuten bei 90°) Rückgewinnung durchgeführt. Diaminobenzidin wurde als Chromogen verwendet. Tumore die bekanntermaßen positiv waren, wurden als positive Kontrollen verwendet. Der primäre Antikörper entfiel für die negativen Kontrollen. Tumore wurden als positiv bezüglich ER oder p53 angesehen, wenn eine unzweideutige Kernpositivität in wenigstens 10% der Tumorzellen beobachtet wurde. Die erbB-2-Anfärbung wurde subjektiv in 3 Gruppen eingeordnet: negativ (keine Anfärbung), schwach positiv (schwache membranartige Positivität), stark positiv (starke membranartige Positivität).
BEISPIEL 3
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Zweifarbige FISH-Hybridisierungen wurden unter Verwendung von mit Spectrum-Orange gekennzeichneten Cyclin D1-, myc- oder erbB2-Sonden zusammen mit entsprechenden FITC-gekennzeichneten zentrometrischen Referenzsonden (Vysis) durchgeführt. Einfarbige FISH-Hybridisierungen wurden mit Spectrum-Orange gekennzeichnetem 20q13 minimaler gemeinsamer Bereich- (Vysis und siehe Tanner et al., Cancer Res. 54:4257-4260 (1994)), mybL2- und 17q23-Sonden (Barlund et al., Genes Chrom. Cancer 20:372-376 (1997)) ausgeführt. Vor der Hybridisierung wurden die Tumorarraysektionen vom Paraffin befreit, mit Luft getrocknet und in 70, 85 und 100% Ethanol dehydriert, gefolgt von einer Denaturierung für 5 Minuten bei 74°C in 70% Formamid-2 × SSC-Lösung. Die Hybridisierungsmischung enthielt 30 ng von jeder der Sonden und 15 μg von menschlicher Cotl-DNA. Nach Hybridisierung über Nacht bei 37°C in einer Feuchtekammer wurden die Scheiben gewaschen und mit 0,2 μM DAPI in einer Antifade-Lösung kontrastgefärbt. FISH-Signale wurden mit einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Doppelbandpassfilter zur gleichzeitigen Visualisierung von FITC- und Spectrum Orange-Signalen ausgestattet war, bewertet. Über 10 FISH-Signale pro Zelle oder dichte Anhäufungen von Signalen wurden als Kriterium für Genamplifikation angesehen.
BEISPIEL 4
mRNA-in-situ-Hybridisierung
Zur mRNA-in-situ-Hybridisierung wurden Tumorarraysektionen vor der Hybridisierung vom Paraffin befreit und luftgetrocknet. Synthetische Oligonukleotidsonden, die gegen erbB2 mRNA (Genbank Zugangsnummer X03363, Nukleotide 350-396) gerichtet waren, wurden am 3'-Ende mit ³³P-dATP unter Verwendung von endständiger Deoxynukleotidyltransferase markiert. Sektionen wurden in einer Feuchtekammer bei 42°C für 18 Stunden mit 1 × 10⁷ CPM/ml der Sonde in 100 μl an Hybridisierungsmischung (50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1% Sarkosyl, 0,02 M Natriumphosphat, pH 7,0, 4 × SSC, 1 × Denhardt Lösung und 10 mg/ml ssDNA) hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Sektionen mehrfach in 1 × SSC bei 55°C gewaschen, um ungebundene Sonde zu entfernen und kurz dehydriert. Die Sektionen wurden drei Tage Phosphorimager-Überprüfungen unterzogen, um die ERBB2 mRNA-Expression zu visualisieren. Negative Kontrollsektionen wurden mit RNase vor der Hybridisierung behandelt, die alle Hybridisierungssignale beseitigte.
Das vorliegende Verfahren ermöglicht Analysen mit hohem Durchsatz von Hunderten von Proben pro Array. Diese Technologie liefert daher eine Größenordnung an Erhöhung der Anzahl an Proben die analysiert werden können, im Vergleich zu früheren Blöcken, wo ein paar Dutzend einzelne Fomalin-fixierte Proben in einer weniger definierten oder undefinierten Konfiguration sind und zur Antikörperprüfung verwendet werden. Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung beinhalten vernachlässigbare Zerstörung der Originalgewebeblöcke und ein optimiertes Fixierungsprotokoll, welches den Nutzen dieser Technik zur Visualisierung von DNA- und RNA-Zielen erweitert. Das vorliegende Verfahren erlaubt auch verbesserte Beschaffung und Verteilung von menschlichen Tumorgeweben für Forschungszwecke. Automatisierung des Verfahrens erlaubt effiziente Probenahme und Arraybildung in mehrere Gewebearrays, von denen jedes nicht weniger als 50, 100 oder selbst bis zu 200 Sektionen zur molekularen Analyse zur Verfügung stellt. Ganze Archive von Zehntausenden an existierenden Formalin-fixierten Geweben aus Pathologielaboratorien können in wenigen Dutzend hochdichten Gewebemikroarrays angeordnet werden, um viele Arten von Tumortypen, ebenso wie unterschiedliche Stufen der Tumorprogression zu untersuchen. Die Tumorarraystrategie erlaubt auch die Prüfung von Dutzenden oder selbst Hunderten von potentiellen prognostischen oder diagnostischen molekularen Markern aus dem gleichen Satz von Tumoren. Ersatzweise liefern die zylindrischen Gewebeproben Proben, die zur Isolierung von DNA und RNA zur molekularen Analyse verwendet werden können.
Im Hinblick auf die vielen möglichen Ausführungsformen, auf die die Prinzipien unserer Erfindung angewendet werden können, sollte es gewürdigt werden, dass die dargestellten Ausführungsformen bevorzugte Beispiele der Erfindung sind und nicht als Limitierung des Umfangs der Erfindung angenommen werden. Vielmehr ist der Umfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert. Wir beanspruchen daher als unsere Erfindung alles, das innerhalb des Umfangs und der Lehre dieser Ansprüche ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Arrays zur Durchführung einer Analyse von biologischen Proben, umfassend: Erhalt gestreckter Spenderproben aus einem biologischen Spendermaterial (30), das zu analysieren ist; Bereitstellen eines Empfängerelements (70) mit einem Array gestreckter Aufnahmen zur Aufnahme der Spenderproben; und Platzieren der Spenderproben in die Aufnahmen an feststehenden zugewiesenen Stellen im Empfängerelement (70), wobei die Stellen beibehalten und aufgezeichnet werden, worin die Aufnahmen eine Form aufweisen, die komplementär zur Form der Spenderproben ist, worin das Bereitstellen des Empfängerelements (90) das Bereitstellen eines Arrays von gestreckten Aufnahmen in dem Empfängerelement (70) umfasst, wobei sich die Aufnahmen quer zu einer Ebene des Arrays, das zu analysieren ist, erstrecken und worin jede Spenderprobe in einer Aufnahme mit einer Querschnittsgröße und Form, die komplementär zu einer Querschnittsgröße und Form der Spenderprobe ist, platziert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner umfassend den Erhalt mehrerer Schnitte (76) aus dem Empfängerarray, wobei jeder Schnitt (76) mehrere Spenderproben enthält, die ihre zugewiesenen Stellen beibehalten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die gestreckten Aufnahmen zylindrische Bohrungen in dem Empfängerelement (70) sind, und jede Probe durch Bohren einer zylindrischen Gewebeprobe aus dem Spendermaterial (30) erhalten wird, worin ein Durchmesser jeder gestreckten Aufnahme im Wesentlichen identisch zu dem Durchmesser der Probe ist, die in der Aufnahme platziert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend Verknüpfen eines klinischen Parameters mit jeder zugewiesenen Stelle im Empfängerarray.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Zellpräparierung ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Aufnahmen sich in einem im Wesentlichen regelmäßigen Array befinden, wobei die benachbarten Ränder der Aufnahmen in einer Distanz von 0,05 mm beabstandet sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin hunderte Spenderproben in einem im Wesentlichen regelmäßigen Array beabstandet sind, bevorzugt 372 Spenderproben.
Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Spenderblocks (30), welcher das in einem Einbettungsmedium eingebettete Spendermaterial (62) umfasst; Bohren einer oder mehrerer Spenderprobenkerne aus dem Spendermaterial (62) in dem Spenderblock; Bohren von Aufnahmekernen aus dem Empfängerelement (70) um das Array aus Aufnahmen an Koordinatenstellen, die durch ein automatisiertes System festgelegt sind, zu bilden; und Platzierung der Spenderprobenkerne in die komplementären Aufnahmen an zugewiesenen Stellen in dem Array, so dass die zugewiesenen Stellen beibehalten werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, ferner umfassend: Sektionierung des den Empfänger einbettenden Mediums quer zu den Spenderprobenkernen, um einen Querschnitt der Donorprobenkerne in dem Array zu erhalten, wobei die zugewiesenen Stellen in dem Array in aufeinanderfolgenden Querschnitten beibehalten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9 ferner umfassend: Ausrichten eines dünnen Gewebeschnitts (76) über den Spenderblock (30) zur Identifizierung ei ner interessierenden Fläche (66) aus der die Spenderprobenkerne genommen werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, worin jeder Spenderprobenkern zylindrisch ist und einen Durchmesser von 0,1 mm bis 4 mm aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Array gebildet wird: durch Stanzen von gestreckten Aufnahmen in das Empfängerelement mit einer Empfängerstanze, automatisches inkrementelles Bewegen des Empfängerelements oder der -Stanze, um die Stanze an einer neuen Koordinatenstelle auf dem Empfängerelement auszurichten und Stanzen einer weiteren gestreckten Aufnahme an der neuen Stelle.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt des Bereitstellens eines Empfängerelements umfasst: Stanzen eines Aufnahmekerns aus dem Empfängerelement (122) mittels einer Empfängerstanze (154) und Verschieben des Aufnahmekerns aus der Empfängerstanze (156) mit einem Stilett (144), und worin der Schritt des Platzierens von Spenderproben in die Aufnahmen umfasst: Stanzen eines Spenderprobe aus einem Spenderblock (130) mittels einer Spenderstanze (156), wobei die Spenderstanze (156) mit einer gewählten Aufnahme im Empfängerblock (122) ausgerichtet ist, und die Spenderprobe in die gewählte Aufnahme verschoben wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die gestreckte Spenderprobe zylindrische Kerne mit einem Durchmesser unter 1 mm sind.
Vorrichtung zur Probenherstellung für die parallele Analyse von Schnitten aus Arrays biologischen Materials, umfassend: einen Spenderblockhalter, der so ausgestaltet ist, dass er einen Gewebespenderblock (30) in einer Spenderposition hält; und eine Spenderstanze (156), die bezüglich des Halters (31) angeordnet ist, um eine Gewebeprobe (76) aus dem Gewebespenderblock (30) zu stanzen, wenn sich der Spenderblock (30) in der Spenderposition befindet; und einen Empfängerblockhalter, der so ausgestaltet ist, dass er einen Empfängerblock (122) in einer Empfängerstellung hält, worin der Empfängerblock ein Array von Aufnahmen umfasst, wobei jeder der Aufnahmen in einer vorausgewählten Position in Relation zur Spenderstanze (156) positionierbar ist, um eine Gewebeprobe aus der Spenderstanze (156) in einer Aufnahme in der vorausgewählten Position zu empfangen, ferner umfassend eine separate Empfängerstanze (154), die in der Lage ist, relativ zum Empfängerblock (122) zum Stanzen des Arrays von Aufnahmen in den Empfängerblock (122) positioniert zu werden, worin die separate Empfängerstanze (154) sich von der Spenderstanze unterscheidet, die positioniert ist, um die Probe (132) aus dem Gewebespenderblock (130) zu stanzen, so dass die Aufnahmen eine Form aufweisen, die komplementär zur Form der Gewebeprobe ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15, ferner umfassend eine x-y-Positioniereinrichtung (102, 104), die inkrementell bewegt werden kann, um die Aufnahmen und die Spenderstanze (156) auszurichten.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15 oder 16, ferner umfassend ein Stilett (144), das für die Einführung in die Spenderstanze (156) positioniert ist, um die Gewebeprobe aus der Stanze (156) in eine der Aufnahmen, die mit der Stanze ausgerichtet ist, zu verdrängen.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, ferner umfassend eine Positioniereinrichtung zur Positionierung eines Referenzobjektträger über den Spenderblock (30) um interessierende Strukturen in dem Referenzobjektträger mit entsprechenden Gewebeproben-(62, 132)-Bereichen im Spenderblock (30, 130) auszurichten.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, ferner umfassend ein Aufzeichnungsgerät zur Aufzeichnung der Koordinatenstellen der Aufnahmen in dem Empfängerblock (70, 122), welches bevorzugt ein computerimplementiertes System (220) zur Aufzeichnung der Positionen der Aufnahmen ist, und zur Aufzeichnung einer Identifikation der Gewebeprobe (62, 132), die in jeder Aufnahme platziert ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, ferner umfassend ein Mikrotom zur Sektionierung des Empfängerblocks (122) in Schnitte, die unterschiedlichen Analysen unterzogen werden können.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20 zur Herstellung von Arrays aus biologischen Proben zur seriellen Analyse, wobei die Vorrichtung ferner umfasst: ein Empfängerblock mit einem Array aus beabstandeten, gestreckten Aufnahmen, in die verschiedene biologische Proben (62, 132) an feststehenden Positionen platziert werden können.
Vorrichtung gemäß Anspruch 21, worin die Vorrichtung ferner einen Spenderblock (30, 130), welcher eine biologische Probe bereitstellt, umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 21, umfassend ein Stilett (144), das selektiv und alternativ mit der Spenderstanze (154) und der Empfängerstanze (150) ausgerichtet ist, zur Verschiebung des Inhalts der Empfängerstanze (156), nachdem ein Aufnahmekern aus dem Empfängerblock (122) ausgestanzt wurde und zur Verschiebung des Inhalts des Spenderstanze (156) in die Aufnahmen des Empfängerblock-(122)-Arrays, nachdem eine Gewebeprobe aus dem Spenderblock (130) ausgestanzt wurde.
Vorrichtung gemäß Anspruch 23, ferner umfassend ein Mikroskop (140) zur Betrachtung des Spenderblocks (130) und zum Lokalisieren einer interessierenden Struktur in einem Referenzobjektträger, der mit dem Spenderblock (130) ausgerichtet ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 21, worin die Aufnahmestanze (156) einen Durchmesser aufweist, der kleiner als der Durchmesser der Spenderstanze (154) ist.