DE69927841T2

DE69927841T2 - Partikel auf polyaminosäure(n)basis sowie deren herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69927841T2
Application number: DE69927841T
Authority: DE
Inventors: Sylvain Huille; Florence Nicolas; Nathan Bryson; Gerard Soula
Original assignee: Flamel Technologies SA
Current assignee: Flamel Technologies SA
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-11-20
Also published as: JP4927256B2; FR2786098A1; DE69927841D1; ES2251236T3; EP1131056B1; EP1131056A1; JP2002530323A; FR2786098B1; AU1278000A; WO2000030618A1; US6630171B1; ATE306905T1

Description

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist das von Vektorisierungspartikeln (PV), die für die Verabreichung aktiver Bestandteile (PA) verwendet werden. Bei diesen letzteren handelt es sich bevorzugt um Medikamente oder Nahrungsmittel für die Verabreichung bei einem tierischen oder menschlichen Organismus auf oralem, nasalem, vaginalem, okulärem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intradermalem, intraperitonealem, intrazerebralem, parenteralem, etc. Weg. Es kann sich aber auch um Pflanzenschutzmittel, wie beispielsweise Herbizide, Pestizide, Insektizide, Fungizide, etc. handeln. Hinsichtlich ihrer chemischen Natur betreffen die erfindungsgemäßen PA insbesondere, aber nicht ausschließlich, z.B. Proteine, Glykoproteine, Peptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Oligonukleotide und Polynukleotide.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung Vektorisierungspartikel, vorteilhafterweise vom Submikron-Typ, auf Basis von Polyaminosäuren (PAA). Die vorliegende Erfindung ist sowohl auf nackte Partikel selbst wie auch auf PA-Vektor-Systeme gerichtet, die aus Partikeln bestehen, die die mit dem (oder den) betrachteten PA beladen sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso wässrige kolloidale Suspensionen, die diese PV beinhalten.
Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung dieser Partikel und kolloidalen Suspensionen, mit und ohne PA.
Das Ziel der Verkapselung von PA in den PV liegt insbesondere darin, die Bioverfügbarkeit der PA zu erhöhen. Zahlreiche Verkapselungstechniken sind bereits vorgeschlagen worden. Solche Techniken sind einerseits darauf gerichtet, den Transport von PA an ihre therapeutische Wirkungsstelle zu erlauben, während sie dabei vor den Angriffen des Organismus (Hydrolyse, enzymatischer Verdau, etc.) geschützt wird, und andererseits darauf, die Freisetzung der PA an ihrer Wirkungsstelle zu kontrollieren, um die für den Organismus verfügbare Menge bei dem gewünschten Wert zu halten. Bei den PA, die von diesen Problemen des Transports und des Verweilens im Organismus betroffen sind, handelt es sich beispielsweise um Proteine, es können aber auch jegliche andere Produkte synthetischen oder natürlichen Ursprungs betroffen sein. Der Überblick von M. J. HUMPHREY (Delivery Systems for peptide Drugs, herausgegeben von S. DAVIS und L. ILLUM, Plenum Press, N. Y., 1986) erläutert die Problematik hinsichtlich der Verbesserung der Bioverfügbarkeit von PA und das Interesse an Vektorisierungssystemen und Systemen zur kontrollierten Freisetzung.
Von den Materialen, die zur Bildung von PV in Betracht gezogen werden können, werden Polymere aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften am häufigsten eingesetzt. Was die Liste von Spezifikationen angeht, die wünschenswert sind, um die PV zu erhalten, so ist diese Liste besonders anspruchsvoll und umfasst insbesondere die folgenden Spezifikationen.

1. Es sollte vorteilhafterweise möglich sein, eine kontrollierte Partikelgrößenverteilung zu erhalten, die an den ausgewählten Verabreichungsmodus und/oder die angedachte therapeutische Stelle angepasst ist.
2. Es ist wünschenswert, dass die PV den Schutz der PA bis an die Freisetzungsstelle gewährleisten.
3. Die PV sollten vorteilhafterweise die Geschwindigkeit der Freisetzung der PA kontrollieren.
4. Es ist bevorzugt, dass das Polymer, welches die PV bildet, biokompatibel, eliminierbar (durch Exkretion) und/oder biodegradierbar ist, und noch weiter bevorzugt kann es zu Produkten metabolisiert werden, die für den Organismus nicht toxisch sind.
5. Es ist außerdem vorteilhaft, dass das Polymer, welches die PV bildet, keine Immunantwort hervorruft.
6. Schließlich ist es auch wünschenswert, dass die PV und die PV- PA-Systeme durch ein Verfahren erhalten werden können, bei dem der PA nicht denaturiert wird.

Die früheren technischen Vorschläge, die unten beschrieben werden, haben versucht, diese Gruppe von Spezifikationen zu erfüllen. Zur Veranschaulichung werden die früheren Vorschläge (a) bis (h) erwähnt: Nach einem ersten Ansatz, der die Vorschläge (a) bis (d) umfasst, erfolgt der Einschluss des aktiven Bestandteils während der Bildung der Vektorisierungsträger; nach einem zweiten Ansatz, der in den Vorschlägen (e) bis (h) genannt ist, werden PV hergestellt, die sobald sie gebildet sind, dazu in der Lage sind, sich spontan durch Adsorption an PA zu assoziieren.

(a) Das Patent US-A-5,286,495 betrifft ein Verfahren zur Verkapselung von Proteinen durch Vaporisierung in wässriger Phase mit Hilfe von Materialien, die entgegengesetzt geladen sind, nämlich: Alginat (negativ geladen) und Polylysin (positiv geladen). Dieses Herstellungsverfahren ermöglicht es, Partikel mit einer Größe von mehr als 35 μm herzustellen.
(b) Außerdem werden Emulsionstechniken weithin verwendet, um mit PA beladene Mikropartikel herzustellen. Beispielsweise offenbaren die Patentanmeldungen WO 91/06286, WO 91/06287 und WO 89/08449 solche Emulsionstechniken, bei denen organische Lösungsmittel verwendet werden, um Polymere zu solubilisieren, beispielsweise vom Typ Polymilchsäure. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass diese Lösungsmittel insbesondere für peptidische oder polypeptidische PA denaturierend sein können.
(c) Es sind auch biokompatible PV bekannt, die in wässriger Lösung gebildet werden und als Proteinoide bezeichnet werden, die seit 1970 von W. FOX und K. DOSE in „Molecular Evolution and the origin of Life", Hrsg. Marcel DEKKER Inc. (1977) beschrieben wurden. Auch in der Patentanmeldung WO 88/01 213 wird ein System auf Grundlage eines Gemischs von künstlichen Polypeptiden vorgeschlagen, die durch thermische Kondensation von Aminosäuren erhalten werden. Die Mikropartikel gemäß dieser Erfindung werden durch eine Veränderung des pH-Werts erhalten, durch die die Präzipitation der proteinoiden Partikel hervorgerufen wird.
(d) Außerdem werden zur Erinnerung auch die Patente US 4,351,337 und 4,450,150 erwähnt, die ein anderes Gebiet als die erfindungsgemäße Vektorisierung von PA betreffen. Diese Patente offenbaren Implantate mit Masse, die an sehr präzisen Stellen im Organismus fixiert und lokalisiert sind. Die Implantate werden ausgehend von polymeren Materialien vom Typ Poly-α-Aminosäure (Leu/GluOH bzw. GluOEt/GluOH) hergestellt. Gemäß der Lehre dieses Patents sind solche Polyaminosäuren bevorzugt, die einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren (z.B. mehr als 50 Leucin oder GluOEt) aufweisen und in Wasser unlöslich sind. Der PA kann in eine Poly-α-Aminosäure-Lösung in einem organischen Lösungsmittel eingegliedert werden. Diese Lösung wird verwendet, um das Implantat durch Giessen/Trocknen (Verdampfen) zu bilden. Gemäß einer anderen Variante kann der PA im Kern einer Mikrokapsel enthalten sein, deren Hülle ausgehend von einer Copolymer-Lösung erhalten wird, und deren Durchmesser größer oder gleich 5.000 μm ist. Der Kern kann aus reinem PA bestehen oder aus einer Copolymer-Matrix, welche den PA beinhaltet und ausgehend von der PAA-Lösung in einem organischen Lösungsmittel erhalten wird.
(e) Die Patentanmeldung PCT WO/FR 97/02 810 offenbart eine Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von aktiven Bestandteilen, die eine Vielzahl von lamellenartigen Partikeln aus einem biodegradierbaren Polymer, wenigstens einen kristallinen Teil (Milchsäurepolymer) und einen auf den Partikeln absorbierten aktiven Bestandteil umfasst. Die Freisetzung des aktiven Bestandteils erfolgt durch Desorption.
(f) Die Veröffentlichung „CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSHI et al" betrifft die Stabilisierung von Insulin durch supramolekulare Komplexierung mit Nanopartikeln, die aus etwa 10 Polysaccharid-Ketten gebildet sind, die durch Propfen von Cholesterin hydrophob gemacht sind.
(g) Der in „MACROMOLECULES 1997, 30, 4013–4017" erschienene Artikel beschreibt Copolymere, die aus einem peptidischen Block auf Basis von L-Phenylalanin, γ-Benzyl-L-Glutamat oder O-(Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-L-serin und einem synthetischen Block, wie beispielsweise Poly(2-methyl-2-oxazolin) oder Poly(2-phenyl-2-oxazolin) zusammengesetzt sind. Einige dieser Polymere aggregieren in wässrigen Milieu unter Bildung von Partikeln mit 400 nm, die dazu in der Lage sind, sich mit einem Enzym, Lipase, zu assoziieren.
(h) Der Gegenstand von Patent FR 95-03978 sind Polyaminosäurepartikel, die für die Vektorisierung von aktiven Bestandteilen verwendet werden, und dadurch gekennzeichnet sind, dass ihre Polyaminosäurebestandteile wenigstens zwei Arten von wiederkehrenden Aminosäuren AAN (neutral, hydrophob) und AAI (ionisierbar und hydrophil) umfassen. Die Partikel werden spontan durch Dispersion des Polyaminosäurepulvers in einer wässrigen Lösung erhalten. Die so erhaltenen Partikel assoziieren spontan in wässriger Suspension mit aktiven, z.B. proteinartigen, Bestandteilen.

Diese früheren technischen Vorschläge erfüllen mehr oder weniger die Spezifikationen in der oben angeführten Liste von Spezifikationen. Solche Vektorisierungspartikel für aktive Bestandteile können jedoch noch perfektioniert werden.
In anbetracht dieser Tatsache ist es eines der wesentlichen Ziele der vorliegenden Erfindung, den in (h) FR 95-03 978 erwähnten früheren technischen Vorschlag zu verbessern, indem neue PV auf Grundlage von linearen, amphiphilen Poly-α-Aminosäuren (PAA) bereitgestellt werden, deren hydrophile bzw. hydrophobe Eigenschaften jeweils durch die Aminosäuren der Hauptkette des Polymers und durch hydrophobe Reste, die seitlich an einen Teil der Aminosäuren über eine kovalente Bindung angebunden sind. Diese Verbesserung betrifft genauer ein Mittel zur Regulierung der Merkmale der Assoziierung zwischen PA und PV, um das Ausmaß der Beladung mit PA zu verbessern und/oder um die Kinetik der Freisetzung von PA zu verbessern.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung ist es, eine kolloidale wässrige Suspension von Vektorisierungspartikeln mit aktiven Bestandteilen bereitzustellen, die PAA-Partikel umfasst, welche die oben angeführten Spezifikationen erfüllen und die eine pharmazeutische Form bildet, die für eine Verabreichung beispielsweise auf oralem Weg bei einem Menschen oder einem Tier geeignet und zweckmäßig ist.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von PAA-Partikeln vorzuschlagen, die insbesondere als Vektor für aktive Bestandteile verwendet werden, wobei das Verfahren noch ökonomischer, einfacher durchzuführen und für die aktiven Bestandteile nicht denaturierend sein muss, und außerdem noch eine feine Kontrolle der mittleren Partikelgröße der erhaltenen Partikel ermöglichen muss.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung ist die Verwendung der Suspensionen und Partikel zur Herstellung von Medikamenten (z.B. Vakzinen) und/oder von Nahrungsmitteln, insbesondere für die Verabreichung von aktiven Bestandteilen, wie beispielsweise Proteinen, Glykoproteinen, Peptiden, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden auf beispielsweise oralem, nasalem, vaginalem, okulärem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intradermalem, intraperitonealem, intrazerebralem oder parenteralem Weg.
Ein weiteres wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Suspensionen von PV bereitzustellen, bei denen es sich teilweise um Submikron- und Mikronpartikel handelt, auf Basis von PAA und die als Vektoren für einen PA, insbesondere einen medikamentösen und/oder nahrungsbezüglichen PA dienen können, für die Verabreichung des PA bei einem menschlichen oder tierischen Organismus.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament von der Art eines Systems für die andauernde Freisetzung von aktiven Bestandteilen bereitzustellen, das einfach und ökonomisch hergestellt werden kann und das außerdem biokompatibel ist und dazu geeignet ist, ein sehr hohes Maß an Bioverfügbarkeit des PA zu gewährleisten.
Ein anderes wesentliches Ziel der Erfindung ist es, ein System für die Vektorisierung eines Vakzins bereitzustellen, welches intrinsisch und in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen nicht immunogen ist.
Die Ziele, welche Produkte betreffen, werden unter anderem durch die vorliegende Erfindung erreicht, welche in erster Linie Partikel betrifft, die insbesondere für die Vektorisierung (PV) von aktiven Bestandteilen verwendet werden können, wie beispielsweise folgenden Arten:

• auf Grundlage von amphiphilen, linearen, α-peptidisch verknüpften Polyaminosäuren (PAA);
• die dazu in der Lage sind, sich spontan zu bilden, wenn PAA mit einem flüssigen Medium, vorzugsweise mit Wasser, in Kontakt gebracht werden, in dem der hydrophile Teil der PAA sich besser löst als der hydrophobe Teil dieser PAA, so dass diese letzteren präzipitieren, wobei sie sich in einzelnen supramolekularen Anordnungen organisieren;
• die eine mittlere Größe von weniger als 200 μm, bevorzugt weniger als 100 μm und noch weiter bevorzugt zwischen 0,01 und 20 μm aufweisen;
• und die dazu in der Lage sind, sich mit wenigstens einem PA zu assoziieren und diesen in vivo auf andauernde und kontrollierte Art und Weise freizusetzen;

• dass die wiederkehrenden Aminosäuren (AAr), welche die PAA-Hauptkette bilden, gleich oder unterschiedlich voneinander sind und aus sauren Aminosäuren ausgewählt sind wie vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure und oder deren Salzen bzw. den Glutamaten und den Aspartaten,
• und dadurch, dass manche der AAr jeweils wenigstens eine hydrophobe Gruppierung R⁰ tragen, wobei diese hydrophoben Gruppierungen R⁰ gleich oder unterschiedlich voneinander sind.

Eine der Voraussetzungen, unter denen sich die erfindungsgemäßen Partikel bilden, ist, dass der hydrophile Teil der PAA sich besser in dem flüssigen Milieu der Suspension löst als der hydrophobe Teil davon.
Die gemäß der Erfindung ausgewählten wiederkehrenden Aminosäuren (AAr) sind Aminosäuren mit Carboxylfunktionen (Glu und Asp) in Form von COOH oder in Form von Salzen (Carboxylaten) COO, X⁺, wobei X Alkalimetallen, bevorzugt Na, entspricht.
Es ist der Verdienst der Anmelderin, für das Material, welches die PV bildet, eine bestimmte Klasse von Poly-α-Aminosäuren ausgewählt zu haben, deren (Co) Monomere wiederkehrende Aminosäuren (AAr) polarer Natur sind und die amphiphil gemacht wurden, indem der hydrophile Charakter durch seitliche hydrophobe Ketten an einem Teil der AAr modifiziert wurde. Diese erworbene amphiphile Natur verleiht den PAA die Möglichkeit, kolloidale PV-Suspensionen zu bilden, die mit dem pH-Wert des physiologischen Milieus, das bei den angedachten Anwendungen angetroffen wird, verträglich sind. Diese Auswahl ermöglicht vorteilhafterweise eine größere Auswahlmöglichkeit hinsichtlich der Natur der hydrophoben Gruppen und somit ein besseres Mittel, um die Hydrophobizität des Polymers und des PV zu kontrollieren, wodurch es möglich wird, die Assoziierung und die Freisetzung der PA zu optimieren.
Die Struktur des PAA-Polymers, die Natur der Aminosäuren Asp und Glu und die hydrophoben Reste werden so ausgewählt, dass die Polymerketten spontan in Form von Partikeln mit kleiner Größe strukturiert werden, die in physiologischem Milieu stabil sind.
Die Struktur des PAA-Polymers, die Natur der Aminosäuren Asp und Glu und die hydrophoben Reste werden so ausgewählt, dass die PV Proteine oder andere PA in wässrigem Milieu über einen spontanen und für die Proteine nicht denaturierenden Mechanismus verkapseln.
Die Struktur des PAA-Polymers, die Natur der Aminosäuren Asp und Glu und die hydrophoben Reste werden so ausgewählt, dass die PV die PA in physiologischem Milieu und genauer in vivo freisetzen, wobei die Kinetik der Freisetzung eine Funktion der Natur des Polymers und der PV, die es bilden kann, ist.
Ohne darauf begrenzt zu sein, ist diese Auswahl spezieller auf PAA gerichtet, deren Hauptkette aus identischen AAr zusammengesetzt ist. Die Primärstruktur der PAA kann geordnet mit alternierenden aufeinander folgenden Blöcken (PAA-Blöcken) oder ungeordnet mit zufällig aufeinander folgenden Blöcken (statistische PAAs) sein. Gemäß einem bevorzugten erfindungsgemäßen Merkmal handelt es sich bei den PAAs um Polymere, die bis zu etwa 1.000 AAr und bevorzugt bis zu etwa 500 AAr und noch weiter bevorzugt bis zu etwa 200 AAr beinhalten.
Die hydrophoben Gruppierungen R⁰ nehmen an der Aggregierung der Polymerketten teil, die im Kern der Bildung der PV liegt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind diese Gruppierungen R⁰ identisch oder unterschiedlich und werden ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

(i) lineare oder verzweigte Alkyl-, Acyl- oder Alkenylreste, bevorzugt lineare C₁-C₂₀- und noch weiter bevorzugt C₂-C₁₈-Reste;
(ii) Kohlenwasserstoff-Gruppierungen, die ein oder mehrere Heteroatome enthalten, bevorzugt solche, die Sauerstoff und/oder Schwefel enthalten, und noch weiter bevorzugt solche, die die folgende Formel aufweisen:
worin:
– die Reste R¹ gleich oder unterschiedlich voneinander sind und Wasserstoff oder einen Rest mit der unter Punkt (i) angegebenen Definition bedeuten,
– q = 1 bis 100;
(iii) Aryl-, Aralkyl- oder Alkylaryl-, bevorzugt Arylreste;
(iv) natürliche hydrophobe Derivate, bevorzugt Cholesterin, Phosphatidylcholine und Diacylglyzerine.

Unter „Kohlenwasserstoff"-Gruppierungen versteht man erfindungsgemäß Gruppierungen, welche insbesondere Wasserstoff und Kohlenstoffatome umfassen.
Bevorzugt sind die Gruppierungen R⁰ ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Reste: Methyl, Ethyl, Propyl, Dodekyl, Hexadekyl, Oktadekyl.
Gemäß der Erfindung ist jede hydrophobe Gruppierung R⁰ durch eine spaltbare, bevorzugt durch chemische und/oder enzymatische Hydrolyse spaltbare, kovalente Bindung an die Hauptkette gebunden, wobei die Bindung insbesondere eine Ester- und/oder Amidbindung ist.
Vorteilhafterweise stellt der Anteil der monomeren AAr, welche hydrophobe Gruppierungen tragen, einen Anteil von größer oder gleich 3%, bevorzugt zwischen 3–70% und noch weiter bevorzugt, zwischen 13 und 60% dar.
In der Praxis handelt es sich bei den PAA, welche PV der erfindungsgemäßen Suspension bilden, beispielsweise um:

• Polymere auf Basis von Glutamat:
– Poly(natriumglutamat)-Block-(methylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Block-(ehylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Block-(propylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Block-(oktadekylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Block-(benzylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Co-(methylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Co-(ethylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Co-(propylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Co-(dodekylglutamat),
– Poly(natriumglutamat)-Block-(oktadekylglutamat),
• Polymere auf Basis von Aspartat:
– Poly(natriumaspartat)-Block-(methylaspartat),
– Poly(natriumaspartat)-Block-(ethylaspartat),
– Poly(natriumaspartat)-Block-(propylaspartat),
– Poly(natriumaspartat)-Block-(oktadekylaspartat),
– Poly(natriumaspartat)-Block-(benzylaspartat).

Vorteilhafterweise weisen die PV-Partikel eine mittlere Größe zwischen 0,01 μm und 0,5 μm, bevorzugt zwischen 0,01 und 0,2 μm auf. Gemäß der Erfindung versteht man unter Größe oder mittlere Partikelgröße das arithmetische Mittel der Durchmesser im Volumen [D4,3], ermittelt durch Laserdiffraktion und den Trägheitsdurchmesser, gemessen durch elastische Lichtstreuung.
Einer der Vorteile der Erfindung ist, dass eine sehr gute Kontrolle der mittleren Partikelgröße dieser Matrixeinheiten und ihrer Partikelgrößenverteilung erzielt wird. Diese Kontrolle schließt ein, dass extrem geringe Partikelgrößen erreicht werden, in der Größenordnung von wenigen Nanometern und mit sehr geringer Polydispersität, wobei bekannt ist, dass es möglich ist, die Größe dieser Nanopartikel durch Aggregierung zu erhöhen.
Die Kontrolle der Größe der PV erfolgt über die Zusammensetzung von AAr und R⁰ der Polyaminosäuren, aber auch für dieselbe Zusammensetzung über die Auswahl einer Blockstruktur und über das Herstellungsverfahren.
Gemäß einer Alternative hinsichtlich der Größe der PV der erfindungsgemäßen Suspension werden die Vektorisierungspartikel PV aggregiert, um neue, größere Partikel zu erhalten. Das PAA-Material, welches die erfindungsgemäßen PV bildet, ist bevorzugt ein Homopolymer oder ein Copolymer, in dem AAr = Asp und/oder Glu und welches amphiphil gemacht wurde, indem der hydrophile Charakter dieses AAr durch Hinzufügen von hydrophoben R⁰-Seitenketten an einen Teil der AAr modifiziert wurde. Diese erworbene Amphiphilie erlaubt es, wenigstens drei neue und überraschende Eigenschaften zu vereinigen:

1. Die erste Eigenschaft ist die Möglichkeit, spontan kolloidale PV-Suspensionen zu bilden, die mit dem pH-Wert eines physiologischen Milieus, das bei den angedachten therapeutischen Anwendungen angetroffen wird, verträglich sind;
2. Die zweite Eigenschaft ist die spontane Assoziierung von PV mit PA in Abwesenheit eines anderen Mittels als Wasser, das ihnen als Lösungsmittel dient, welches für Proteine nicht denaturierend ist;
3. Die dritte Eigenschaft ist die Möglichkeit, den PA aus dem Komplex der Assoziierung PA-PV unter den physiologischen Bedingungen freizusetzen, mit pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Profilen, die es ermöglichen, Anwendungen auf dem therapeutischen Gebiet in Betracht zu ziehen.

Die PA, insbesondere solche mit Proteinnatur, werden tatsächlich durch die Vektorisierungspartikel PV eingefangen, welche mit Matritzen vergleichbar sind, die aus Wasser und PAA gebildet sind, in denen der oder die PA dispergiert sind. Ihre Freisetzung erfolgt entweder durch spontane Dissoziierung oder nach und nach im Verlauf der Degradierung der PAA und der anschließenden Destrukturierung der Partikel. Der Einfang der PA wird spontan durch deren einfaches Vermischen in einer wässrigen kolloidalen erfindungsgemäßen PV-Suspension bewerkstelligt.
Die mit wenigstens einem aktiven Bestandteil PA beladenen Partikel PV stellen einen anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Nach einem anderen ihrer Aspekte, vorgeschaltet den Partikeln, die den wesentlichen Gegenstand der Erfindung bilden, betrifft die Erfindung außerdem Vorläufer der PV, bei denen es sich um PAAs handelt, die wie oben definiert ausgewählt sind.
Den PV nachgeschaltet umfasst die Erfindung auch die kolloidale, bevorzugt wässrige, Suspension solcher Partikel wie oben definiert.
Diese kolloidale Suspension von PV, welche mit PA beladen sind, kann für die Vektorisierung eingesetzt werden und für die andauernde und kontrollierte Freisetzung des PA in vivo für therapeutische Zwecke.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten kolloidalen Suspension von Partikeln, z.B. von Vektorisierungspartikeln (PV) für aktive Bestandteile (PA), dadurch gekennzeichnet dass es im Wesentlichen besteht aus:

I Umsetzen von linearen PAA, die α-peptidisch verknüpfte wiederkehrende Aminosäuren (AAr) aufweisen, die ausgewählt sind aus natürlichen polaren Aminosäuren wie Glutaminsäure und Asparaginsäure und/oder deren Salzen bzw. den Glutamaten und Aspartaten, wobei manche dieser AAr jeweils wenigstens eine hydrophobe Gruppierung R⁰ tragen, wobei diese Gruppierungen R⁰ gleich oder unterschiedlich voneinander sind;
II Einbringen der amphiphilen PAA in ein bevorzugt wässriges Lösungsmedium;
III Anschließend wenigstens die AAr, welche R⁰ tragen, in dem Medium unlöslich machen, so dass diese AAr ausfallen und so einzelne supramolekulare Anordnungen bilden.

Gemäß einer vorteilhaften Variante dieses Verfahrens wird wenigstens ein aktiver Bestandteil in dem flüssigen Medium, das die PV-Partikel enthält, so aufgenommen, dass eine kolloidale Suspension von PV, die mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen beladen sind, erhalten wird.
Außerdem ist es um die Größe der Partikel zu erhöhen denkbar, in dem Herstellungsverfahren der Suspension wenigstens einen zusätzlichen Schritt des Aggregierens von Partikeln mit Hilfe wenigstens eines Aggregationsmittels vorzusehen, dass aus einem Salz und/oder einer Säure und/oder einer Base und/oder einem gegebenenfalls ionischen Polymer (z.B. Polylysin, Polyethylenimin, etc.) gebildet ist. Für weitere Details wird auf die Patentanmeldung FR 95-03 918 verwiesen.
Nachdem die wesentlichen Merkmale der Erfindung hinsichtlich der PAA-Vorläufer-Partikel der Partikel einer kolloidalen Suspension dieser Partikel und die Herstellung dieser Suspension abgehandelt wurden, ist es nun angebracht, einerseits den Aspekt der Herstellung der PAA und der Partikel, die gegebenenfalls mit PA beladen sind, und andererseits den Aspekt der Verwendung der PV und der Suspensionen dieser PV in medizinischen Systemen für eine langanhaltende und kontrollierte Freisetzung von PA etwas genauer zu entwickeln.
Die PAA werden auf eine an sich bekannte Weise erhalten. Hierzu wird beispielsweise auf: „Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Band 12, S. 786; John Wiley & Sons" verwiesen. Im Rahmen der Erfindung ist es bevorzugt, Polymerisierungstechniken einzusetzen, in denen Anhydride von N-Carboxy-α-Aminosäuren verwendet werden, deren Herstellung beispielsweise in „Biopolymers, 5 1869 (1976)" angegeben ist. Was die Polymerisierungstechniken für diese monomeren N-Carboxy-α-Aminosäuren (NCA) angeht, so sind diese ausführlich in dem Werk von H. R. KRICHELDORF „α-Aminoacid-N-Carboxy Anhydride and Related Heterocycles" Springer Verlag (1987) beschrieben.
Die Art der Verteilung von hydrophoben Gruppierungen auf die Polymerketten ist je nach gewähltem Syntheseweg statistisch oder geordnet. In dieser Hinsicht gibt es zahlreiche Reaktionsschemata, welche zu den als Rohmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen PV ausgewählten PAA führen. Die drei Reaktionsschemata sind im Folgenden in nicht begrenzender Weise angegeben:

(i) Synthese oder Umsetzung (Schritt A) eines Copolymers PAA, welches wenigstens zwei Arten von wiederkehrenden hydrophoben Gruppierungen R⁰¹ und R⁰² trägt, dann wird durch selektive Eliminierung (Schritt B) wenigstens eine davon eliminiert, um AAr in seinem nicht modifizierten Zustand zurück zu gewinnen (beispielsweise R⁰¹ = Methyl, R⁰² = Benzyl; Schritt B ist ein Debenzylierungsschritt durch Hydrogenierung, durch Addition von HBr, etc.);
(ii) Synthese oder Umsetzung (Schritt A) eines hydrophoben homopolymeren PAA, welches (ausschließlich) wiederkehrende hydrophobe Aminosäuren (AAr-R⁰) trägt, die jeweils eine gleiche hydrophobe Gruppierung R⁰ (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl, Stearyl) tragen, dann teilweise Eliminierung (Schritt B) eines Teils der Gruppierungen R⁰ (z.B. durch Hydrolyse oder Verseifung von Poly(Methylglutamat)-PAA);
(iii) Synthese oder Umsetzung (Schritt A) einer homopolymeren hydrophilen PAA, welche (ausschließlich) wiederkehrende hydrophile Aminosäuren AAr trägt, dann teilweise Hydrophobisierung (Schritt B) durch die Bildung einer kovalenten Bindung mit einer oder mehreren Gruppierungen R⁰ (z.B. durch Veresterung mittels Fettalkoholen oder durch ionische Verschiebung mit Hilfe eines Halogenalkans).

Bei diesen drei Varianten (i), (ii) und (iii) ist die Verknüpfungseinheit für das Pfropfen hydrophober Gruppierungen R⁰ an die Seitengruppe der AAr vorteilhafterweise eine Ester- oder Amidfunktion.
In der Praxis sind die in Variante (i) umgesetzten hydrophoben copolymeren PAA beispielsweise Copolymere von Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure, deren seitliche Carboxylfunktionen durch Veresterung gemäß Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, geschützt. Es kann sich z.B. um Copoly(sterylglutamat-benzylglutamat) handeln, welches durch Polymerisierung von N-Carbonsäureanhydriden von AAr₀₁ (Glu-O-Stearyl) und AAr₀₂ (Glu-O-Benzyl) erhalten wird.
Die teilweise Hydrophilisierung von Co-PAA resultiert aus der selektiven Eliminierung einer der Gruppierungen R⁰ durch Hydrolyse und/oder Verseifung. Dies entspricht einer Deprotonierung, die in dem folgenden Beispiel eine selektive Debenzylierung ist. Hier werden die Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber einer Spaltung der verschiedenen Ester, welche die hydrophoben Gruppierungen R⁰¹ und R⁰² bilden, ausgenutzt. Als Beispiele für bekannte Schutzverfahren können diejenigen durch Verseifung der Methylester (STAHMAN et coll.; J. Biol. Chem., 197, 771 (1952); KYOWA HAKKO, FR 2 152 582) oder durch Debenzylierung [BLOUT et coll., J. Amer. Chem. Soc., 80, 4631 (1958)] genannt werden.
Hinsichtlich der Variante (ii) ist das hydrophobe Homopolymer PAA beispielsweise durch Polymerisierung von Glu-O-Stearyl NCA erhaltenes Polystearylglutamat. Die teilweise Hydrolyse dieses hydrophoben Homopolymers entsprechend der zuvor genannten bekannten Schutzverfahren führt zu einem Poly(Glutamat)-Co-(stearylglutamat).
In der Variante (iii) kann das hydrophile Homopolymer PAA zum Beispiel Polyglutaminsäure oder ein Polyglutamat sein, das durch Polymerisierung von Glutaminsäure-NCA hergestellt ist. Die Hydrophobisierung dieser Art von PAA-Poly- Glu erfolgt beispielsweise durch Reaktion mit Stearyliodid in basischem Milieu. Dies führt zu Poly(Glutamat)-Co-(stearylglutamat). Diese Art von Technik ist insbesondere in [Polymer Bulletin, 32, 127 (1994)] beschrieben.
Die Bildung der PV in flüssigem Medium in Form einer erfindungsgemäßen kolloidalen Suspension kann während oder nach der Synthese der oben definierten amphiphilen PAA durchgeführt werden.
Nach einer bevorzugten Variante der Erfindung erfolgt die Bildung von Partikeln durch die Zugabe von Wasser oder von Salz zu einer Lösung von PAA, die R⁰-Gruppen trägt und in einem Lösungsmittel gelöst ist. Dieser Vorgang besteht bevorzugt darin, die Löslichkeit der hydrophoben Fraktion zu erniedrigen, so dass diese präzipitiert und dabei die Bildung der Partikel hervorruft. Ein Fachmann ist in der Lage, andere einfache Mittel zur Verringerung der Löslichkeit des hydrophoben Anteils des Polymers zu finden, beispielsweise durch Modifizieren der Temperatur der/des Lösungsmittels) oder durch Kombinieren unterschiedlicher Techniken.
Auf die Herstellung der kolloidalen Suspension von PV folgt vorteilhafterweise ein Reinigungsschritt unter Beteiligung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise Destillation, Filtration, Modifikation des pH-Werts, Chromatographie und/oder Dialyse. Derartige Methoden ermöglichen es, die unerwünschten Salze oder Lösungsmittel zu eliminieren. Nach diesem fakultativen Reinigungsschritt wird eine kolloidale Suspension von PV erhalten, welche direkt verwendet werden kann, oder welche gegebenenfalls isoliert oder gewonnen werden kann im Rahmen eines Schritts IV durch beliebige physikalische Mittel, welche für sich bekannt sind und geeignet sind, wie beispielsweise durch Filtration, durch Ultrafiltration, durch Trennung über einen Dichtegradienten, durch Zentrifugation, durch Präzipitation, gegebenenfalls durch Zugeben von Salz oder durch Lyophilisierung.
Nach einer Variante der Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der kolloidalen Suspension dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein aktiver Bestandteil in dem flüssigen Medium, welches die PV-Partikel enthält, eingegliedert wird, und zwar derart, dass eine kolloidale Suspension von PV erhalten wird, die mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen PA beladen oder assoziiert ist. Diese Eingliederung, welche zu einem Einfangen von PA durch die PV führt, kann auf die folgende Weise durchgeführt werden:

– Auflösen von PA in wässriger Lösung, dann Zugeben von PV, entweder in Form einer kolloidalen Suspension oder in Form von isolierten PV (Lyophilisat oder Präzipitat);
– oder Zugeben von PA, entweder in Lösung oder in reinem oder vorformuliertem Zustand, zu einer kolloidalen Suspension von PV-Partikeln, gegebenenfalls zwischenzeitlich hergestellt durch Dispergieren trockener PV in einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser.

Der aktive Bestandteil der dazu geeignet ist, mit den erfindungsgemäßen Partikeln assoziiert zu werden, kann ein medizinischer und/oder nahrungsgsbezüglicher Bestandteil sein. Er ist bevorzugt ausgewählt aus:

• Proteinen und/oder Peptiden, wobei Hämoglobine, Zytochrome, Albumine, Interferone, Antigene, Antikörper, Erythropoietin, Insulin, Wachstumshormone, Faktor IX, Interleukine oder deren Gemische am meisten bevorzugt sind,
• Polysacchariden, wobei insbesondere Heparin ausgewählt wird,
• Nukleinsäuren und vorzugsweise RNS- und/oder DNS-Oligonukleotiden,
• Vitaminen, Aminosäuren und Spurenelementen,
• und Gemischen davon.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Vorläufer dieser PV-Partikel gerichtet, welche aus den spezifischen oben definierten PAA bestehen, und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie medizinische PA von der oben genannten Art, insbesondere Insulin, und/oder PA, die aus wenigstens einem Vakzin gebildet sind, oder Ernährungs-PA, Pflanzenschutz-PA oder kosmetische PA enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch kolloidale Suspensionen von PV, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie dieselben PA wie oben genannt, insbesondere für die Vorläufer von PV, enthalten.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung medizinische Produkte oder pharmazeutische oder nahrungsbezügliche Spezialprodukte, welche die oben definierten mit PA beladenen PV umfassen. Nach einem anderen ihrer Aspekte betrifft die Erfindung auch die Verwendung dieser mit PA beladenen PV für die Herstellung von Medikamenten vom Typ eines Systems zur kontrollierten Freisetzung von PA. Im Fall von Medikamenten kann es sich beispielsweise um solche handeln, die vorzugsweise auf oralem, nasalem, vaginalem, okulärem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intradermalem, intraperitonealem, intrazerebralem oder parenteralem Weg verabreicht werden können.
Die kosmetischen Anwendungen, die in Betracht gezogen werden können, sind beispielsweise Zusammensetzungen, die auf transdermalem Weg angewendet werden können.
Die fraglichen Pflanzenschutzprodukte können beispielsweise Herbizide, Pestizide, Insektizide, Fungizide, etc. sein.
Die vorliegende Erfindung hat außerdem Pflanzenschutz-Zusammensetzungen und kosmetische Zusammensetzungen zum Gegenstand, welche PV umfassen, die mit PA vom oben beschriebenen Typ beladen sind.
Die folgenden Beispiele ermöglichen es, die Erfindung in ihren unterschiedlichen Aspekten Produkt/Verfahren/Anwendung besser zu verstehen. Diese Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Polyaminosäurepartikeln, die mit aktiven Bestandteilen beladen sind oder nicht, und sie geben außerdem die strukturellen Merkmale und die Eigenschaften dieser Partikel wieder.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 – HERSTELLUNG DES POLY(NATRIUMGLUTAMAT)-BLOCK-(METHYLGLUTAMAT)-POLYMERS
Die verwendeten Techniken für die Polymerisation der NCA zu Polymeren mit Blockstrukturen oder zufälligen Strukturen sind dem Fachmann bekannt und sind in dem Werk von H. R. KRICHELDORF „α-aminoacides-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles" Springer Verlag (1987) ausführlich beschrieben. Die folgende Synthese ist eine Präzisierung einer dieser Synthesen.
Synthese von Poly(GluOMe)₆₃-Poly(GluOBz)₆₃: 10 g NCA-GluOMe werden bei 60°C in einem Gemisch aus 150 ml Dioxan und 450 ml Toluol gelöst. 5 ml einer Lösung von 0,91 g Benzylamin in 50 ml Dioxan werden in einer Portion zu dem Monomer hinzu gegeben. Nach einer Stunde werden 14,1 g NCA-GluOBz, welches zuvor in einem Gemisch aus 20 ml Dioxan und 60 ml Toluol gelöst wurde, hinzugefügt. Die Polymerisation dauert noch für 19–24 Stunden an. Das Polymer wird aus dem Reaktionsmedium in 2 Liter Methanol, zu welchem weitere 500 ml Wasser hinzugefügt werden, präzipitiert. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und in einem Inkubator bei 50°C unter Vakuum getrocknet.
Ausbeute 90%, Zusammensetzung gemäß ¹H-NMR (TFA-d) 45% molar GluOBz. verringerte Viskosität (0,5% von TFA bei 25°C) 0,3 dl/g. Molare Masse gemäß GPC: 20.000 g/mol.
10 g Polymer werden anschließend bei 0°C in 200 ml TFA mit 6 ml Trifluormethansulfonsäure für 15 min umgesetzt. Während der Hydrolyse der Benzylgruppen präzipitiert das Polymer in Form kolloidaler Partikel. Nach Eindampfen bis zur Trockene werden die Partikel in Wasser aufgenommen und bei pH 7,4 mit Natriumhydroxid neutralisiert. Ein Dialyseschritt gewährleistet die Entfernung von Trifluoressigsäuresalzen. Die Partikel werden schließlich durch Lyophilisierung isoliert.
Quantitative Ausbeute. Elementaranalyse [Na] 8,2% (berechnete Zusammensetzung 53% GluONa).
BEISPIEL 2 – HERSTELLUNG DES POLY(NATRIUMGLUTAMAT)-BLOCK-(ETHYLGLUTAMAT)-POLYMERS
Dieses Polymer wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei Ethylglutamat-NCA nd Benzylglutamat-NCA in einem molaren Verhältnis von 1:3 verwendet werden. Nach den Polymerisations- und Debenzylierungsschritten wird das Polymer durch Dialyse bei pH 7 gereinigt und anschließend wird es lyophilisiert, um ein weißes Pulver zu erhalten.
BEISPIEL 3 – HERSTELLUNG DES POLY(NATRIUMGLUTAMAT)-BLOCK-(HEXADEKYLGLUTAMAT)-POLYMERS
Dieses Polymer wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei Dodekylglutamat-NCA und Benzylglutamat-NCA in einem molaren Verhältnis von 1:3 verwendet werden. Nach den Polymerisierungs- und Debenzylierungsschritten wird das Polymer durch Dialyse bei pH 7 gereinigt und anschließend wird es lyophilisiert, um ein weißes Pulver zu erhalten.
BEISPIEL 4 – HERSTELLUNG DES POLY(NATRIUMGLUTAMAT)-CO-(DODEKYLGLUTAMAT)-POLYMERS
10 g Polyglutaminsäure (Polymerisationsgrad 120) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Anschließend werden 15,5 g KHCO₂ und dann 2,87 ml Ioddekan zugegeben. Das Reaktionsmedium wird für 40 h unter Stickstoffstrom bei 60°C gehalten. Das Polymer wird durch Präzipitation in 1,5 l 0,1 N Salzsäure isoliert und das so gebildete Präzipitat wird mehrmals mit Wasser gewaschen. Die gesuchte kolloidale Suspension wird erhalten, indem der pH-Wert des Mediums mit Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt wird und sie wird anschließend durch Lyophilisation dehydratisiert. Das lyophilisierte Polymer wird schließlich mehrmals mit Ethylacetat gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet. Zusammensetzung gemäß NMR (TFA-d): 12% Dodekylester von Glutaminsäuren. Restliches Wasser nach Lyophilisation 10,5%. Elementaranalyse % (ber.): C 41,29 (42,15); H 5,99 (6,01); N 7,45 (7,63); Na 10,44 (10,45).
BEISPIEL 5 – UNTERSUCHUNG DER NANOPARTIKEL DURCH LICHT-STREUUNG (DDL) UND ELEKTRONISCHE TRANSMISSIONSMIKROSKOPIE (MET).
10 mg Partikel des Polymers 1 werden in 10 ml Wasser oder in einer wässrigen Salzlösung suspendiert. Diese Lösung wird dann in ein Coulter-Granulometriegerät (oder Laserdiftraktometer) eingebracht. Die Ergebnisse der Analyse der Partikelgröße der verschiedenen untersuchten Produkte sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
BEISPIEL 6 – UNTERSUCHUNG DER ASSOZIIERUNG VON NANOPARTIKELN MIT EINEM PROTEIN (INSULIN)
Ausgehend von einer isotonischen Phosphatpufferlösung mit pH 7,5 wird eine Lösung von humanem Insulin, titriert bei 1,4 mg/ml, entsprechend 40 IU/ml, hergestellt. In 1 ml dieser Insulinlösung werden 10 mg des in Beispiel 1 hergestellten PV dispergiert. Nach 15 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur werden das mit den PV assoziierte Insulin und das freie Insulin durch Zentrifugation (60.000 g, 1 Stunde) und Ultrafiltration (Filtrationsgrenzwert 300.000 D) abgetrennt. Das freie Insulin, welches in dem Filtrat gewonnen wird, wird durch HPLC oder ELISA untersucht und die Menge an assoziiertem Insulin wird als Differenz davon abgeleitet. Die Menge des an PV assoziierten Insulins ist größer als 0,77 mg, was mehr als 55% des gesamten beteiligten Insulins entspricht.
Die folgende Tabelle fasst die Ergebnisse der Messungen des Assoziationsgrades, die mit verschiedenen PV durchgeführt wurden, zusammen. Der Assoziationsgrad drückt den Prozentsatz an assoziiertem Insulin bezogen auf das verwendete Insulin in einer bei 1,4 mg/ml titrierten Präparation von Insulin und 10 mg/ml PV aus.
Tabelle 2
Im Vergleich dazu assoziiert Insulin nicht mit Natriumpolyglutamat. Dieser vorbereitende Test dient zur Bestimmung des optimalen Gemischs von PV und Insulin, um eine optimale Formulierung mit PV und Insulin mit einem hohen Beladungsgrad zu erhalten.
BEISPIEL 7 – DISSOZIIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES PROTEINS NACH DESSEN FORMULIERUNG MIT PV (INSULIN)
Eine Formulierung wird ausgehend von PV und Insulin hergestellt, wobei die Mengen jeweils entsprechend der Messungen des Assoziationsgrades in Beispiel 6 bestimmt werden.
Unter Verwendung einer isotonischen Phosphatpufferlösung mit pH 7,4 wird eine Lösung von menschlichem Insulin, titriert bei 2,8 mg/ml, entsprechend 80 IU/ml, hergestellt. 56 mg des in Beispiel 1 hergestellten PV werden in 1 ml dieser Insulinlösung dispergiert. Der pH-Wert und die Isotonizität werden, falls erforderlich, angepasst, um eine Formulierung mit pH 7,4 und 280–300 mOs zu erhalten. Diese Präparation wird in zunehmenden Volumina an isotonischer 0,5%-iger Rinderalbuminlösung verdünnt, gepuffert bei pH 7,4 mit einem 0,01 M Phosphatpuffer. Der Anteil an freigesetztem Insulin wird durch HCLP oder ELISA untersucht. Siehe beigefügte Figur. Der freigesetzte Anteil steigt mit der Verdünnung an. Bei einer Verdünnung von 20 ist sämtliches Insulin freigesetzt. Die Untersuchungen durch HPLC und ELISA zeigen, dass > 90% des Insulins in dieser Formulierung assoziiert ist.
BEISPIEL 8 – IN VIVO-TEST MIT PV, DIE MIT EINEM THERAPEUTISCHEN PROTEIN (INSULIN) BELADEN SIND
Eine Formulierung wird unter Verwendung von PV und Insulin hergestellt, wobei die Mengen jeweils gemäß den Messungen des Assoziationsgrades in Beispiel 6 bestimmt werden.
Eine Gruppe von 4 Beagle-Hunden (männlich und weiblich) mit einem Gewicht zwischen 10 und 12 kg werden für 18 Stunden nüchtern gehalten. Eine Zubereitung wird gemäß Beispiel 8 formuliert und setzt sich aus 80 IU Insulin und 56 mg PV (hergestellt gemäß Beispiel 1) in 1 ml PBS-Puffer zusammen. Die Hunde erhalten dann eine subkutane Verabreichung dieser Insulinpräparation in einem Verhältnis von 1 IU/kg Gewicht. Blutproben werden für einen Glukosetest und einen Insulintest (–2 h, –1 h und 0 h) und (1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h, 48 h) nach Injektion entnommen. Die Glukosekonzentrationen werden in den Proben unter Verwendung des Glukoseoxydase-Verfahrens gemessen und das Seruminsulin wird unter Verwendung eines radioimmunologischen Verfahrens untersucht.
Die beigefügte 1 zeigt den Mittelwert der Entwicklung von Glukose und Seruminsulin als eine Funktion der Zeit T in Stunden (h), für die gemäß Beispiel 1 hergestellten PV. Die Kurve -•- ist die von Insulinämie, ausgedrückt in internationalen Millieinheiten. Die Kurve -o- ist die von Glykämie, ausgedrückt in mmol/ml.
Die folgende Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Wirkungsdauer von Insulin in Gegenwart verschiedener PV gemäß den Beispielen 1–5.
Tabelle 3
Dieses Beispiel zeigt, dass Insulin in Gegenwart der erfindungsgemäßen PV nicht denaturiert wird. Außerdem erlaubt dieses Beispiel 8 es, die Erhöhung der Wirkungsdauer des Insulins nachzuweisen und zeigt daher die Nützlichkeit der PV als Verzögerungssystem für die kontrollierte Freisetzung von Insulin. Es zeigt außerdem, wie die Wirkungsdauer durch die sinnvolle Auswahl der hydrophoben Gruppierung kontrolliert werden kann.

Claims

Partikel die dazu geeignet sind, insbesondere für die Vektorisierung (PV) aktiver Bestandteile (PA) verwendet zu werden, wobei: – die Partikel auf Basis linearer amphiphiler α-peptidisch verknüpfter Polyaminosäuren (PAA) sind; – die Partikel dazu in der Lage, sich spontan zu bilden, wenn PAA mit einem flüssigen Medium, vorzugsweise mit Wasser, in Kontakt gebracht werden, in dem der hydrophile Teil der PAA sich besser löst als der hydrophobe Teil dieser PAA, sodass diese letzteren ausfallen, wobei sie sich in einzelnen supra-molekularen Anordnungen organisieren; – die Partikel eine mittlere Größe kleiner als 200 μm, bevorzugt kleiner als 100 μm und noch weiter bevorzugt zwischen 0,01 und 20 μm aufweisen; – und die Partikel dazu in der Lage sind, sich mit wenigstens einem PA zu assoziieren und diesen in vivo auf andauernde und kontrollierte Art und Weise freizusetzen; dadurch gekennzeichnet, – dass die wiederkehrenden Aminosäuren (AAr) welche die PAA-Hauptkette bilden gleich oder unterschiedlich voneinander sind und dass sie ausgewählt sind aus natürlichen polaren Aminosäuren wie Glutaminsäure und Asparaginsäure und/oder deren Salzen, bzw. den Glutamaten und den Aspartaten, – und dass manche der AAr jeweils wenigstens eine hydrophobe Gruppierung R⁰ tragen, wobei diese hydrophoben Gruppierungen R⁰ gleich oder unterschiedlich voneinander sind.
Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R⁰ statistisch oder geordnet auf die Polymerketten verteilt ist.
Partikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den AAr verbundenen Gruppierungen R⁰ gleich oder unterschiedlich voneinander sind, und dass sie ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: (i) lineare oder verzweigte Alkyl-, Acyl- oder Alkenylreste, bevorzugt lineare C₁-C₂₀ und noch weiter bevorzugt C₂-C₁₈ Reste; (ii) Kohlenwasserstoff-Gruppierungen die ein oder mehrere Heteroatome enthalten, bevorzugt solche, die Sauerstoff und/oder Schwefel enthalten und noch weiter bevorzugt solche, die die folgende Formel aufweisen:
worin – die Reste R¹ gleich oder unterschiedlich voneinander sind und Wasserstoff oder einen Rest mit der unter Punkt (i) angegebenen Definition bedeuten, – q = 1 bis 100; (iii) Aryl-, Aralkyl- oder Alkylaryl-, bevorzugt Arylreste; (iv) natürliche hydrophobe Derivate, bevorzugt Cholesterin, Phosphatidylcholin und Diacylglycerin.
Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppierungen R⁰ ausgewählt sind aus der Gruppe der folgenden Reste: Methyl, Ethyl, Propyl, Hexyl, Oktyl, Dodekyl, Hexadekyl oder Oktadekyl.
Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass jede hydrophobe Gruppierung R⁰ durch eine spaltbare, bevorzugt durch chemische und/oder enzymatische Hydrolyse spaltbare, kovalente Bindung an die AAr-Kette gebunden ist, wobei die Bindung insbesondere eine Ester- und/oder Amid-Bindung ist.
Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der hydrophoben AAr₀ größer oder gleich 3% ist, bevorzugt zwischen 3 und 70% und noch weiter bevorzugt zwischen 3 und 60% liegt.
Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den PAA um Polymere handelt, die bis zu etwa 1000 AAr und bevorzugt bis zu etwa 500 AAr aufweisen.
Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Vektorisierungspartikel PV mit einer mittleren Größe zwischen 0,01 und 0,5 μm, bevorzugt zwischen 0,01 und 0,2 μm handelt.
Partikel, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Aggregierung von Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhalten sind.
Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens einen aktiven Bestandteil aufweisen.
Vorläufer von PV nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierten PAA gebildet sind.
Kolloidale bevorzugt wässrige Suspension von Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verfahren zur Herstellung der kolloidalen Suspension nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen besteht aus: I. Umsetzen von amphiphilen linearen PAA die α-peptidisch verknüpfte wiederkehrende Aminosäuren (AAr) aufweisen die ausgewählt sind aus natürlichen polaren Aminosäuren wie Glutaminsäure und Asparaginsäure und/oder deren Salzen bzw. den Glutamaten und Aspartaten, wobei manche der AAr jeweils wenigstens eine hydrophobe Gruppierung R⁰ tragen, wobei diese Gruppierungen R⁰ gleich oder unterschiedlich voneinander sind; II. Einbringen der amphiphilen PAA in ein bevorzugt wässriges Lösungsmedium, III. anschließend wenigstens die AAr, welche R⁰ tragen, in dem Medium unlöslich machen, sodass diese AAr ausfallen und so einzelne supramolekulare Anordnungen bilden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein aktiver Bestandteil in dem flüssigen Medium, das die PV-Partikel aufweist, enthalten ist, sodass eine kolloidale Suspension von PV, die mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen beladen sind, erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen zusätzlichen Schritt des Aggregierens von Partikeln mit Hilfe eines Aggregationsmittels umfasst, das aus einem Salz und/oder einer Säure und/oder einer Base und/oder einem gegebenenfalls ionischen Polymer gebildet ist.
Vorläufer nach Anspruch 11, Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Suspension nach Anspruch 12, umfassend wenigstens einen aktiven medikamentösen Bestandteil, der bevorzugt ausgewählt ist aus: – Proteinen und/oder Peptiden, wobei Hämoglobine, Cytochrome, Albumine, Interferone, Antigene, Antikörper, Erythropietin, Insulin, Wachstumshormone, Faktor IX, Interleukine oder deren Gemische am meisten bevorzugt sind, – Polysacchariden, wobei insbesondere Heparin ausgewählt wird, – Nukleinsäuren und vorzugsweise RNS- und/oder DNS-Oligonukleotiden, – deren Gemischen.
Vorläufer nach Anspruch 11, Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Suspension nach Anspruch 12, welche Insulin als den aktiven Bestandteil aufweisen.
Vorläufer nach Anspruch 11, Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Suspension nach Anspruch 12, welche einen aus wenigstens einem Vakzin gebildeten aktiven Bestandteil aufweisen.
Vorläufer nach Anspruch 11, Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Suspension nach Anspruch 12, welche wenigstens einen aktiven Bestandteil aufweisen der aus wenigstens einem Nahrungsmittel, Pflanzenschutzmittel oder Kosmetikprodukt gebildet ist.
Pharmazeutisches Mittel, Nahrungsmittel, Pflanzenschutzmittel oder Kosmetikprodukt dadurch gekennzeichnet, dass es Vorläufer nach Anspruch 11 und/oder Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder eine Suspension nach Anspruch 12 enthält.