DE69904203T2

DE69904203T2 - Thiomolybdat verbunden mit mindestens einem kohlenhydrat, und seine verwendung zur vorbeugung und behandlung von erkrankungen, die durch eine anormale vaskularisierung gekennzeichnet sind, wie z.b. krebs, "feuchte" makuladegeneration, rheumatoide arthritis

Info

Publication number: DE69904203T2
Application number: DE69904203T
Authority: DE
Inventors: George Brewer; Dimitri Coucouvanis; D. Merajver
Original assignee: University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: NZ510038A; EP1107795B1; DK1107795T3; WO2000013712A3; CA2341752A1; KR20010082190A; AU773848B2; ATE228375T1; DE69904203D1; JP2002524426A; AU6496099A; CN100548383C; CN1457261A; PT1107795E; IL141550A0; EP1107795A2; KR100702279B1; WO2000013712A2; ES2188261T3

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Prophylaxe und Therapie von Krankheiten. Sie betrifft insbesondere Mittel, die dazu in der Lage sind, Kupfer zu binden und in bestimmten Aspekten einen Dreierkomplex mit Protein bilden, und die Verwendung dieser Mittel bei der Prävention und Behandlung von Krankheiten mit einer vaskulären Komponente wie Krebs. Zusammensetzungen für eine Kombinationstherapie dieser Krankheiten sowie therapeutische Kits werden ebenfalls bereitgestellt.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Bei festen Tumoren ist für ein anhaltendes Wachstum eine Proliferation von Blutgefäßen (Angiogenese) erforderlich, um eine ausreichende Ernährung nicht nur der an der äußersten Peripherie liegenden Zellschichten sicherzustellen (Hayes, 1994; Horak et al., 1993; Parangi et al., 1996). Normales adultes menschliches Gewebe andererseits benötigt, von der Reparatur von Wunden, der Regeneration nach Trauma oder Operationen und der Proliferation der inneren Auskleidung des Uterus während des Menstruationszyklus einmal abgesehen, nur ein geringes Wachstum an neuen Blutgefäßen. Die Angiogeneseabhängigkeit ist somit ein fundamentaler Unterschied zwischen Tumorgewebe und normalem Gewebe. Dieser Unterschied ist quantitativ bemerkenswerter als die Unterschiede bei der Zellreplikation und bei der Zellabsterberate, auf denen viele zytoreduktive Chemotherapien beruhen. Auf Grundlage der Abhängigkeit des Tumors von Angiogenese wurde das Konzept der antiangiogenen Therapie von Malignitäten entwickelt (Folkman, 1995a; Folkman, 1995b; Hanahan und Folkman, 1996).
Die Anwesenheit von Kupfer ist sowohl eine Vorausbedingung als auch ein wirksamer Stimulus für die Angiogenese, wie durch Untersuchungen zur Neovaskularisierung in der Hornhaut von Kaninchen gezeigt wurde (Parke et al., 1988). Während der durch Prostaglandin E1 (PGE1) induzierten Angiogenese in der Hornhaut des Kaninchens reichert sich an der Stelle, an der es zur Angiogenese kommt, Kupfer an (Parke et al., 1988). Umgekehrt ist in Kaninchen mit Kupfermangel die Angiogenese in der Hornhaut des Kaninchens als Reaktion auf PGE1 stark reduziert. In der Hornhaut von Kaninchen kann das Kupfer für die Angiogenese durch Ceruloplasmin (ein kupferhaltiges Protein) sowie durch gelöstes Kupfersulfat bereitgestellt werden, während Apoceruloplasmin (Ceruloplasmin ohne Kupfer) die Angiogenese nicht unterstützt (Gullino, 1986). Weitere Studien haben ebenfalls gezeigt, daß es sich bei Kupfer um ein wichtiges angiogenes Mittel handelt (Raju et al., 1982; Ziehe et al., 1982). Alle diese Studien stützen das Konzept, daß ungebundenes Kupfer für die Angiogenese erforderlich ist.
Vor einigen Jahren wurden Tumor-Tierversuche mit einem Ansatz durchgerührt, der gegen Kupfer geächtet war (Brem et al., 1990a; 1990b; Yoshida et al., 1995). Zur Absenkung der Kupferspiegel in Ratten und Kaninchen, denen intracerebrale Tumore eingepflanzt worden waren, wurden der Chelator Penicillamin und eine kupferarme Ernährung eingesetzt. Bei den kupferarm ernährten Tieren zeigte sich zwar im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen eine Verringerung der Tumorgröße, jedoch kein verbessertes Überleben.
Weiterhin wurde berichtet, daß eine Penicillamintherapie mit beträchtlichen Nebenwirkungen verbunden ist, einschließlich Übelkeit und Bauchschmerzen und ernsteren Nebenwirkungen wie Leukopenie und Thrombozytopenie, was zu aplastischer Anämie rühren kann. In einigen Fällen wurde auch nephrotisches Syndrom beschrieben.
Es gibt zahlreiche andere Beispiele von Krankheiten, die durch eine aberrante Angiogenese gekennzeichnet sind. Ein Beispiel für eine solche durch Angiogenese vermittelte Krankheit ist die okulare Revaskularisierungskrankheit. Diese Krankheit ist durch eine Invasion neuer Blutgefäße in Strukturen des Auges wie die Netzhaut oder die Hornhaut gekennzeichnet. Sie ist die häufigste Ursache von Erblindungen und spielt bei ungefähr zwanzig Augenerkrankungen eine Rolle. Bei der altersabhängigen Makuladegeneration werden die damit assoziierten visuellen Probleme durch ein Einwachsen von Aderhautkapillaren durch Defekte in der Bruch-Membran mit Proliferation von fibrovaskulärem Gewebe unterhalb des Pigmentepithels der Netzhaut verursacht.
Eine andere Krankheit, von der man annimmt, daß Angiogenese bei ihr eine Rolle spielt, ist rheumatoide Arthritis. Die Blutgefäße in der synovialen Auskleidung der Gelenke unterlaufen eine Angiogenese. Zusätzlich zur Ausbildung neuer Gefäßnetzwerke setzen die Endothelzellen Faktoren und reaktive Sauerstoff Spezies frei, die zu Unterhautfettgewebewachstum und der Zerstörung von Knorpel führen. Die an der Angiogenese beteiligten Faktoren können aktiv zum chronischen Entzündungszustand bei rheumatoider Arthritis beitragen und dabei helfen, diesen Zustand aufrechtzuerhalten.
Es besteht in der Technik weiterhin ein Bedarf an Mitteln, die durch Angiogenese gekennzeichnete Krankheiten wie Krebs, Makuladegeneration und rheumatoide Arthritis wirksam verhindern, deren Einsetzen bzw. Fortschreiten verlangsamen oder diese Krankheiten lindem oder behandeln. Die Entwicklung erfolgreicher prophylaktischer oder therapeutischer Mittel, die die Kupferspiegel in vivo ohne die mit der Anwendung anderer kupfersenkender Mittel verbundenen Nebenwirkungen und Risiken erniedrigen, würde einen besonders signifikanten Fortschritt darstellen.
In Merajver, AACR Special Conference, 24.-28. Januar 1998, Orlando, Florida (zusammengefaßter Konferenzbeitrag), wird offenbart, daß durch eine Absenkung der Kupferkonzentration im Blut das Entstehen von Mammatumoren in krebsanfälligen transgenen HER/neu+-Mäusen durch antiangiogene Mechanismen verzögert und/oder das Wachstum dieser Tumore verlangsamt wird.
In Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Annu. Meet. (1992), 33(0), 76, berichten Brem et al., daß Tetrathiomolybdat bei der Verabreichung an Mäuse mit in deren Hirnen eingepflanzten C6-Glioma eine beträchtliche Erhöhung der Serumkupferspiegel bewirkt.
In www.cancer.med.umich.edu/cgi-bin/protocol?9708_701 wird auf eine Phase-I-Studie verwiesen, in der untersucht wird, ob ein Absenken der Kupferkonzentration im Körper eines oral mit Tetrathiomolybdat als Entkupferungsmittel und Antiangiogenesemittel behandelten Patienten mit metastatischen festen Tumoren zum Schrumpfen oder der Verlangsamung des Wachstums der Tumore führt.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Diese und andere im Stand der Technik vorhandenen Mängel werden durch die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung von Zusammensetzungen überwunden, die gemäß bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung das Einsetzen bzw. Fortschreiten von durch aberrante Vaskularisierung bzw. Angiogenese charakterisierte Krankheiten wie Krebs verlangsamen oder diese Krankheiten sogar verhindern und, in anderen Aspekten der Erfindung, solche Krankheiten lindem oder behandeln. Dies wird durch die Bereitstellung von Mitteln erreicht, die die Kupferspiegel in vivo senken, in bevorzugten Aspekten durch die Bildung eines Dreierkomplexes aus Mittel, Kupfer und Protein. Mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann dies ohne die mit anderen kupfersenkenden Mitteln assoziierten Nebenwirkungen und Risiken erzielt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "aberrante Vaskularisierung" bzw. "aberrante Angiogenese" ist so zu verstehen, daß er die anormale Neubildung von Gefäßen einschließlich der Bildung neuer Blutgefäße, größerer Blutgefäße und stärker verzweigter Blutgefäße (Intussuszeption) und alle Mechanismen, gleich welcher Art, die zu einer unangemessenen oder erhöhten Blutzufuhr zu einem erkrankten Gewebe bzw. einer erkrankten Stelle rühren, umfaßt. Die Mittel der vorliegenden Erfindung sind so zu verstehen, daß sie einer "aberranten Vaskularisierung" bzw. "aberranten Angiogenese" entgegenwirken, egal durch welchen Wirkungsmechanismus.
Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen handelt es sich bei dem ersten Mittel um eine Thiomolybdatverbindung. Für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Thiomolybdatverbindungen schließen Dodecathiodimolybdat, Tetrathiomolybdat, Eisenoctathiodimolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat und Monothiomolybdat ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Bei besonders bevorzugten Aspekten der Erfindung handelt es sich bei dem ersten Mittel um Tetrathiomolybdat. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfaßt die Thiomolybdatverbindung wenigstens ein erstes Eisenatom und/oder wenigstens ein erstes Sauerstoffatom. Es versteht sich, daß eine vollständige Oxidierung der Thiomolybdatverbindung möglichst vermieden werden sollte.
Die Thiomolybdatverbindung ist mit wenigstens einem Kohlenhydrat assoziiert, das die Bildung einer stabilisierten Thiomolybdatverbindung bewirkt. Geeignete Kohlenhydratmoleküle sind beispielsweise ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Trisaccharid, ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid. Bei bevorzugten Ausrührungsformen ist die Thiomolybdatverbindung mit wenigstens einem ersten Saccharosemolekül assoziiert, so daß eine mit von 5 bis 200 Saccharosemolekülen assoziierte Thiomolybdatverbindung gebildet wird, und bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Thiomolybdatverbindung mit etwa 30 Saccharosemolekülen assoziiert.
Die vorliegende Erfindung eignet sich somit für ein Verfahren zur Verzögerung der Entstehung oder der Verhinderung oder der Behandlung von Krebs in einem Tier oder einem menschlichen Patienten, bei dem man dem Tier bzw. Patienten eine biologisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die einen kohlenhydratassoziierten Komplex eines Thiomolybdats (insbesondere Dodecathiodimolybdat, Tetrathiomolybdat, Eisenoctathiodimolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat und Monothiomolybdat) enthält.
Die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Mittel wie z. B. Tetrathiomolybdat senken die Kupferspiegel, indem sie einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, der anschließend aus dem Körper entfernt wird. Bei diesen Dreierkomplexen aus Mittel, Kupfer und Protein kommt es nicht zu einer reversib len Freisetzung des gebundenen Kupfers, wodurch sich diese Komplexe von einer reversiblen Chelierung von Kupfer in einem Zweierkomplex unterscheiden.
Der hier verwendete Ausdruck "biologisch wirksame Menge" ist als die Menge eines kupferbindenden und einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildenden Mittels zu verstehen, die bei Verabreichung an ausgewählte Tiere oder Patienten eine Verzögerung des Entstehens von mit aberranter Vaskularisierung assoziierten Krankheiten, vorzugsweise Krebs, bewirkt bzw. diese Krankheiten verhindert. In den präventativen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann mit dem Ausdruck "prophylaktisch wirksame Menge" somit auch die Menge der in Rede stehenden Zusammensetzungen beschrieben werden, mit der die Entstehung von Krankheiten und/oder Krebs bei der Verabreichung an ausgewählte Tiere oder Patienten verzögert oder verhindert werden kann.
Alternativ dazu kann in den therapeutischen Aspekten der vorliegenden Erfindung der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" auch verwendet werden, um die Menge der in Rede stehenden Zusammensetzungen zu beschreiben, die eine Verzögerung des Einsetzens oder eine Verhinderung von Krebs bewirkt. Bei einer Krebsbehandlung sind die Mengen wirksam, die bei einer Verabreichung an ausgewählte Tiere oder Patienten eine Verlangsamung des Tumorwachstums oder einen Stopp des Tumorwachstums bewirken, spezifisch in wenigstens einem Teil eines Tumors eine Nekrose herbeiführen und/oder eine Tumorregression oder -remission bewirken. Diese Wirkungen werden mit vernachlässigbaren oder beherrschbaren Nebenwirkungen auf normale, gesunde Gewebe des Tieres bzw. des Patienten erzielt. Die "therapeutisch wirksame Menge" kann somit in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren einschließlich beispielsweise des Ausmaßes der Krankheit und der Größe des Patienten von Tier zu Tier bzw. Patient zu Patient schwanken. Alle solchen Fragen zur Dosierung können vom behandelnden Arzt im Licht der vorliegenden Erfindung routinemäßig geklärt werden.
In der gesamten Patentanmeldung werden die Ausdrücke "ein", "eine" und "einen" in dem Sinne verwendet, daß sie "wenigstens ein/eine/einen", "wenigstens ein erstes/eine erste/einen ersten", "ein/eine/einen oder mehrere" oder "eine Vielzahl" der betreffenden Komponenten oder Schritte bedeuten, ausgenommen in den Fällen, bei denen anschließend eine obere Grenze angegeben wird. Die praktikablen Grenzen und Parameter für Kombinationen sowie die Mengen der einzelnen Mittel werden dem Durchschnittsfachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
Bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung liegt die biologisch wirksame Menge des ersten Mittels zwischen 20 mg und 200 mg pro Patient. Bei bestimmten Aspekten der Erfindung beträgt die therapeutisch wirksame Menge des wenigstens einen ersten Mittels zwischen 20 mg und 200 mg pro Patient über eine therapeutisch wirksame Zeit bzw. einen therapeutisch wirksamen Zeitraum. Im allgemeinen erfolgt die Verabreichung des Mittels an den Patienten täglich, und bei diesen Ausführungsformen der Erfindung beträgt die biologisch bzw. therapeutisch wirksame Menge des ersten Mittels zwischen 20 mg und 200 mg pro Patient pro Tag. "Zwischen 20 mg und 200 mg" schließt alle Werte in diesem Bereich ein und schließt somit Mengen von etwa 25 mg, etwa 30 mg, etwa 40 mg, etwa 50 mg, etwa 60 mg, etwa 70 mg, etwa 75 mg, etwa 80 mg, etwa 90 mg, etwa 100 mg, etwa 110 mg, etwa 120 mg, etwa 125 mg, etwa 130 mg, etwa 140 mg, etwa 150 mg, etwa 160 mg, etwa 170 mg, etwa 180 mg, etwa 190 mg oder etwa 195 mg ein. "Etwa" ist so zu verstehen, daß Werte oberhalb und unterhalb der angegebenen Zahl eingeschlossen sind. So ist "etwa 20 mg" so zu verstehen, daß etwa 18 mg, etwa 19 mg, etwa 21 mg und etwa 22 mg oder so eingeschlossen sind, und "etwa 200 mg" ist so zu verstehen, daß etwa 201 mg, etwa 202 mg, etwa 203 mg und etwa 204 mg oder so eingeschlossen sind.
Bei anderen Ausrührungsformen der vorliegenden Erfindung liegt die biologisch bzw. therapeutisch wirksame Menge des ersten Mittels zwischen 20 mg und 190 mg, zwischen 20 mg und 180 mg, zwischen 20 mg und 170 mg, zwischen 20 mg und 160 mg, zwischen 20 mg und 150 mg, zwischen 20 mg und 140 mg, zwischen 20 mg und 130 mg, zwischen 20 mg und 120 mg, zwischen 20 mg und 110 mg, zwischen 20 mg und 100 mg, zwischen 20 mg und 90 mg, zwischen 20 mg und 80 mg, zwischen 20 mg und 70 mg, zwischen 20 mg und 60 mg, zwischen 20 mg und 50 mg, zwischen 20 mg und 40 mg, zwischen 20 mg und 30 mg, zwischen 30 mg und 200 mg, zwischen 40 mg und 200 mg, zwischen 50 mg und 200 mg, zwischen 60 mg und 200 mg, zwischen 70 mg und 200 mg, zwischen 80 mg und 200 mg, zwischen 90 mg und 200 mg, zwischen 100 mg und 200 mg, zwischen 110 mg und 200 mg, zwischen 120 mg und 200 mg, zwischen 130 mg und 200 mg, zwischen 140 mg und 200 mg, zwischen 150 mg und 200 mg, zwischen 160 mg und 200 mg, zwischen 170 mg und 200 mg, zwischen 180 mg und 200 mg, zwischen 190 mg und 200 mg, zwischen 30 mg und 190 mg, zwischen 40 mg und 180 mg, zwischen 50 mg und 170 mg, zwischen 60 mg und 160 mg, zwischen 70 mg und 150 mg, zwischen 80 mg und 140 mg, zwischen 90 mg und 130 mg, zwischen 100 mg und 120 mg, zwischen 125 mg und 200 mg oder zwischen 150 mg und 180 mg pro Patient pro Tag.
Diese Werte können auch als mg/kg Körpergewicht ausgedrückt werden. Wie oben beschrieben kann die biologisch bzw. therapeutisch wirksame Menge je nach Größe des Tieres bzw. menschlichen Patienten schwanken. Nimmt man jedoch das durchschnittliche Gewicht eines männlichen Menschen als etwa 70 kg an, so würde die biologisch bzw. therapeutisch wirksame Menge des kupferbindenden Mittels, das einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, für den durchschnittlichen männlichen Menschen zwischen 0,3 mg/kg und 3 mg/kg oder so liegen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung aller Formen von festen Tumoren mit einer vaskulären Komponente, insbesondere denen, die extensiv vaskularisiert sind, verwendet werden, wenngleich dies nicht für alle Aspekte der Erfindung erforderlich ist. Feste Tumore wie Karzinome und Sarkome sind Tumortypen, die einer Behandlung mit den in Rede stehenden Zusammensetzungen zugänglich sind. Besondere Beispiele von Tumortypen, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung verhindert oder behandelt werden können, sind Nieren-, Lungen-, Brust-, Kolon-, Prostata-, Magen-, Leber-, Bauchspeicheldrüsen-, Speiseröhren-, Hirn- und Kehlkopftumore sowie Angiosarkome und Chondrosarkome, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, Tumore verschiedener Größen zu behandeln. So werden für eine Behandlung unter Anwendung der vorliegenden Erfindung kleine Tumore einschließlich metastatischer Tumore, beispielsweise Tumore mit einem Durchmesser von etwa 1 cm oder weniger, mittlere oder mäßig große Tumore, beispielsweise Tumore mit einem Durchmesser zwischen 1 cm und 5 cm, und große Tumore, beispielsweise Tumore mit einem Durchmesser von etwa 5 cm oder mehr, in Betracht gezogen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "ein vaskularisierter Tumor" ganz besonders bevorzugt einen vaskularisierten, malignen Tumor, festen Tumor oder "Krebs".
Da, wie oben angesrochen, die in Rede stehenden Zusammensetzungen nicht vollständig spezifisch für einen bestimmten Tumortyp sind, ist es auch möglich, Patienten mit mehr als einem Tumortyp mit der vorliegenden Erfindung zu behandeln. So werden für eine Behandlung unter Anwendung der vorliegenden Erfindung Patienten mit wenigstens einem ersten und wenigstens einem zweiten davon verschiedenen Tumortyp, beispielsweise einem Brusttumor und einem Chondrosarkom oder einem Nierentumor und einem Lungentumor, wobei diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt ist, wenigstens drei verschiedenen Tumortypen, wenigstens vier verschiedenen Tumortypen, wenigstens fünf verschiedenen Tumortypen oder mehr in Betracht gezogen. Bei bestimmten bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung wird dem Patienten das Mittel oral verabreicht. Jedoch werden auch andere Verabreichungswege in Betracht gezogen, einschließlich intravenöser, intramuskulärer und subkutaner Injektionen, Retard-Formulierungen und dergleichen, wobei diese Aufzählung jedoch nicht hierauf beschränkt ist.
Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, dem menschlichen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines zweiten Mittels gegen Krebs zu verabreichen. Beispiele für die für eine Verwendung in Betracht gezogenen zusätzlichen Mittel gegen Krebs sind chemotherapeutische Mittel, radiotherapeutische Mittel, getrennte, kupferbindende Mittel, antiangiogenetische Mittel, apop tose-induzierende Mittel oder Zinkverbindungen. Es wird weiterhin in Betracht gezogen, den Patienten einem operativen Eingriff oder einer Strahlentherapie zu unterziehen.
Bei dem zweiten Mittel gegen Krebs kann es sich um ein "chemotherapeutisches Mittel" handeln. Mit dem hier verwendeten Ausdruck "chemotherapeutisches Mittel" wird auf ein klassisches chemotherapeutisches Mittel oder ein zur Behandlung von Malignitäten verwendetes Arzneimittel Bezug genommen. Dieser Ausdruck wird der Einfachheit halber verwendet, ungeachtet der Tatsache, daß andere Verbindungen einschließlich Immunotoxinen technisch als chemotherapeutische Mittel beschrieben werden können, da sie eine gegen Krebs gerichtete Wirkung haben. "Chemotherapeutisch" hat jedoch inzwischen im Stand der Technik eine davon verschiedene Bedeutung und wird entsprechend dieser Standardbedeutung verwendet. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezieht sich "Chemotherapeutika" im allgemeinen nicht auf Immunotoxine, Radiotherapeutika und dergleichen, trotz ihrer funktionellen Überschneidung.
In Tabelle 1 sind eine Reihe chemotherapeutischer Mittel beispielhaft aufgeführt. Dem Durchschnittsfachmann werden die Anwendungen und geeigneten Dosierungen der Chemotherapeutika leicht verständlich sein, wenngleich die Dosierung bei einer Anwendung in Kombination mit der vorliegenden Erfindung auch gut heruntergesetzt werden kann. Eine neue Klasse von Arzneimitteln, die gleichfalls als "Chemotherapeutika" bezeichnet werden können, sind apoptoseinduzierende Mittel. Es ist auch möglich, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eines oder mehrere dieser Arzneimittel einschließlich Genen, Vektoren und Antisense-Konstrukten anzuwenden.
Bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist es von Nutzen, dem Tier oder dem menschlichen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer Zinkverbindung zu verabreichen. Das erste Mittel wird dem Tier bzw. dem menschlichen Patienten vorzugsweise in einer solchen Menge und über einen solchen Zeitraum verabreicht, daß die Kupferkonzentration in dem Tier bzw. dem menschlichen Patienten auf etwa 20% der Kupferkonzentration in dem Tier bzw. menschlichen Patienten vor Verabreichung des ersten Mittels reduziert wird, woraufhin dem Tier bzw. dem menschlichen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer Zinkverbindung wie Zinkacetat verabreicht wird. Bei weiteren bevorzugten Aspekten verabreicht man dem Tier bzw. dem menschlichen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer Zinkverbindung über einen solchen Zeitraum, daß die Kupferkonzentration in dem Tier bzw. dem menschlichen Patienten auf etwa 20% der Kupferkonzentration in dem Tier bzw. menschlichen Patienten vor Verabreichung des wenigstens einen ersten Mittels gehalten wird.
Die Erfindung ist weiterhin bei Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem menschlichen Patienten von Nutzen, bei dem man einem an Krebs leidenden menschlichen Patienten eine Tetrathiomolybdat enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung in einer solchen Menge und über einen solchen Zeitraum verabreicht, daß die Kupferkonzentration in dem menschlichen Patienten auf etwa 20% der Kupferkonzentration in dem menschlichen Patienten vor Verabreichung des Tetrathiomolybdats reduziert wird, und dem menschlichen Patienten eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Zinkverbindung enthält.
Die vorliegende Erfindung eignet sich weiterhin zur Behandlung oder Prävention von feuchter Makuladegeneration oder rheumatoider Arthritis.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung bzw. eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine kombinierte therapeutische Menge eines ersten Mittels, das Kupfer bindet und einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, und eines zweiten Mittels gegen Krebs enthält. Bei dem kohlenhydratassoziierten Komplex eines ersten Mittels handelt es sich um eine Thiomolybdatverbindung wie Dodecathiodimolybdat, Tetrathiomolybdat, Eisenoctathiodimolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat oder Monothiomolybdat. Bei bevorzugten Aspekten der Erfindung handelt es sich bei dem ersten Mittel um Tetrathiomolybdat. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Mittel gegen Krebs um ein chemotherapeutisches Mittel, ein radiotherapeutisches Mittel, ein getrenntes, kupferbindendes Mittel, ein antiangiogenetisches Mittel, ein apoptoseinduzierendes Mittel oder eine Zinkverbindung.
Weiterhin wird ein therapeutisches Kit bereitgestellt, daß, in einem geeigneten Behältnis, eine therapeutisch wirksame kombinierte Menge eines ersten Mittel, das Kupfer bindet und einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, und eines zweiten Mittels gegen Krebs enthält. Bei dem ersten Mittel handelt es sich um eine Thiomolybdatverbindung wie Dodecathiodimolybdat, Tetrathiomolybdat, Eisenoctathiodimolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat oder Monothiomolybdat. Die Thiomolybdatverbindung ist mit einem Kohlenhydratmolekül assoziiert. Bei weiteren Aspekten der therapeutischen Kits der Erfindung handelt es sich bei dem zweiten Mittel gegen Krebs um ein chemotherapeutisches Mittel, ein radiotherapeutisches Mittel, ein getrenntes, kupferbindendes Mittel, ein antiangiogenetisches Mittel, ein apoptoseinduzierendes Mittel oder eine Zinkverbindung. Bei besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind das erste Mittel, das Kupfer bindet und einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, und das zweite Mittel gegen Krebs in getrennten Behältern enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die eine Thiomolybdatverbindung in Assoziation mit einem stabilisierenden Kohlenhydratmolekül bzw. einen "Thiomolybdat-Kohlenhydrat-Komplex" enthalten. Bei bestimmten Aspekten der Erfindung umfaßt die Thiomolybdatverbindung einen Eisenrest und/oder einen Sauerstoffrest. Bei anderen Aspekten liegt das Verhältnis von Kohlenhydratmolekülen bzw. Zuckereinheiten zur Thiomolybdatverbindung zwischen 200 zu 1 und 5 zu 1. Es versteht sich, daß auch alle Verhältnisse in diesem Bereich davon umfaßt sind, wie Verhältnisse von etwa 190 zu 1, etwa 180 zu 1, etwa 175 zu 1, etwa 170 zu 1, etwa 160 zu 1, etwa 150 zu 1, etwa 140 zu 1, etwa 130 zu 1, etwa 125 zu 1, etwa 120 zu 1, etwa 110 zu 1, etwa 100 zu 1, etwa 90 zu 1, etwa 80 zu 1, etwa 75 zu 1, etwa 70 zu 1, etwa 60 zu 1, etwa 50 zu 1, etwa 40 zu 1, etwa 30 zu 1, etwa 25 zu 1, etwa 20 zu 1, etwa 15 zu 1 und etwa 10 zu 1. Bei bevorzugten Aspekten der Erfindung beträgt das Verhältnis von Kohlenhydratmolekülen zur Thiomolybdatverbindung etwa 30 zu 1.
Bei weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Kohlenhydratmolekül um ein Monosaccharid. Bei anderen Aspekten handelt es sich bei dem Kohlenhydratmolekül um ein Disaccharid wie Saccharose. Bei noch anderen As pekten handelt es sich bei dem Kohlenhydratmolekül um ein Oligosaccharid. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Thiomolybdatverbindung mit einem ersten und einem zweiten davon verschiedenen Kohlenhydratmolekül assoziiert.
Die Thiomolybdatverbindung kann nicht kovalent mit dem stabilisierenden Kohlenhydratmolekül verbunden sein, beispielsweise über eine Wasserstoffbrückenbindung. Bei anderen Aspekten der Erfindung ist die Thiomolybdatverbindung kovalent an das stabilisierende Kohlenhydratmolekül gebunden. Bei noch anderen Aspekten ist die Thiomolybdatverbindung mit dem Kohlenhydratmolekül komplexiert. Bei anderen bevorzugten Aspekten ist die Zusammensetzung in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger dispergiert. Die vorliegende Erfindung stellt somit stabilisierte Tetrathiomolybdatzusammensetzungen bereit, die Tetrathiomolybdat in Assoziation mit etwa 30 Saccharosemolekülen enthalten.
Weiterhin wird somit die Verwendung der kupferbindenden Mittel, die einen Komplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prävention einer durch aberrante Vaskularisierung gekennzeichneten Krankheit einschließlich Krebs, feuchter Makuladegeneration oder rheumatoider Arthritis, jedoch nicht darauf beschränkt, bereitgestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die folgenden Zeichnungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung und sind beigefügt, um weitere bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen. Die Erfindung läßt sich in bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichungen zusammen mit der ausführlichen Beschreibung der hier aufgeführten speziellen Ausführungsformen besser verstehen.
Abb. 1 Krankheitsfreies Überleben von mit TM behandelten Tieren und Kontrolltieren als Funktion des Alters. Die täglichen TM-Behandlungen wurden bei den Tieren jeweils im Alter von ungefähr 100 Tagen begonnen. Bei den Behandlungs- (?) und Kontroll- (?) Gruppen handelte es sich um genetisch identische krebsanfällige transgene HER2-neu- Mäuse. Der prozentuale Anteil an krankheitsfreien Tieren ist auf der Hochachse und das Alter in Tagen auf der Längsachse gezeigt.
Abb. 2 Ceruloplasminwirkung als Funktion der Zeit bei TM-behandelten Mäusen. Das Serum der behandelten Mäuse und der Kontrollmäuse wurde während der Behandlung in regelmäßigen Abständen einem spektrophotometrischen Assay auf Wirkung unterzogen. Der Anteil an Ceruloplasmin, bezogen auf die Kontrolle, ist auf der Hochachse, die Tage der TM-Therapie auf der Längsachse gezeigt.
Abb. 3 Die zeitliche Entwicklung der Tumorgröße bei Nacktmäusen, denen Zellen der SUM149-Brustkrebszelllinie injiziert worden waren. Drei Gruppen von jeweils fünf Mäusen wurden 10&sup6; SUM149-Brustkrebszellen injiziert, und zweien der Gruppen wurden 1,2 mg/Tag/Maus TM über das Trinkwasser verabreicht, beginnend am Tag-7. Nach 34 Tagen wurde das TM bei diesen beiden Gruppen von Mäusen ausgesetzt, und dann wurde mit der Hälfte der vorherigen Dosis (0,6 mg/Tag/Maus; ?) oder der vollständigen Dosis (1,2 mg/Tag/Maus; ?) fortgefahren. Die Kontrollmäuse ( ) erhielten kein TM. Die mittlere Querschnittsfläche des Tumors (mm²) ist auf der Hochachse und die Zeit (Tage) auf der Längsachse gezeigt.
Abb. 4A, Abb. 4B und Abb. 4C Ceruloplasmin als Surrogatmarker für den Kupferzustand des gesamten Körpers. Die Geschwindigkeiten der Abnahme des Verhältnisses von Cp zum Zeitpunkt t zum Baseline-Cp als Funktion der TM-Therapie in Tagen sind für die Dosierungskonzentrationen I (Abb. 4A), II (Abb. 4B) und III (Abb. 4C) gezeigt. Die durchschnittliche Zeit bis zu einer 50%igen Abnahme von Cp beträgt 30 Tage.
Abb. 5A und Abb. 5B Durchführung einer Langzeittherapie mit TM zur Aufrechterhaltung eines Cp-Targets von 20% der Baseline bei zwei Patienten. Abb. 5A. Bei dem Patienten war zu 2 Zeitpunkten im Abstand von 60 Tagen eine Verringerung der Dosierung erforderlich. Um zu verhindern, daß der Cp unter 5 mg/d fällt, ist bei diesem Pati enten wahrscheinlich eine zukünftige Verringerung der TM-Dosis erforderlich. Abb. 5B. Nach Tag 100 wurde die TM-Dosis erhöht, um zu verhindern, daß der Cp über den Zielbereich hinaus anwuchs. Die unterschiedliche Ernährung und das Verhalten des Tumors (wie z. B. Tumorzellyse) können für die individuelle Variabilität, was das Erfordernis von Dosierungsanpassungen angeht, verantwortlich sein.

BESCHREIBUNG ERLÄUTERNDER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Mehr als 90% aller Tumore in Menschen sind feste Tumore (Shockley et al., 1991). Die therapeutische Anwendung von monoklonalen Antikörpern und Immunotoxinen wurden in der Therapie von Lymphomen und Leukämien untersucht (Lowder et al., 1987; Vitteta et al., 1991), waren jedoch bei klinischen Studien gegen feste Tumore in enttäuschender Weise unwirksam (Byers und Baldwin, 1988; Abrams und Oldham, 1985).
Einer der Hauptgründe für die Unwirksamkeit von auf Antikörpern beruhenden Behandlungen ist die Tatsache, daß Makromoleküle nicht einfach in feste Tumore transportiert werden (Sands, 1988; Epenetos et al., 1986). Selbst wenn diese Moleküle in die Tumormasse gelangen, verteilen sie sich aufgrund der Verschlußkontakte zwischen Tumorzellen (Dvorak et al., 1991), fibrösen Stroma (Baxter et al., 1991), interstitiellen Druckgradienten (Jain, 1990) und Bindungsstellenbameren (Juweid et al., 1992) nicht in gleichmäßiger Form.
Bei der Bekämpfung von Krebs muß allzuhäufig ein hochfunktionelles Individuum mit einer hohen Wahrscheinlichkeit einer klinischen Krebsdiagnose oder dem unerbittlichen Fortschreiten eines größtenteils asymptomatischen Krebs zum lethalen Stadium zurechtkommen. Auf der zellulären Ebene ist trotz der vielen verschiedenen klinischen Umstände für alle entstehenden oder bereits existierenden Tumore das Wachstum neuer Blutgefäße bzw. eine Angiogenese Voraussetzung dafür, daß es zu einer Beeinträchtigung der Lebensqualität ihrer Wirte kommen kann. Daher könnte es mit der Entwicklung erfolgreicher antiangiogener Therapien möglich sein, entstehende Tumore daran zu hindern, klinisch relevant zu werden, oder den asymptomatischen Zustand bei einer stabilen metastatischen Krankheit zu verlängern. Darüber hinaus könnte eine solche Therapie auch eine Rückführung offensichtlicher Tumore auf ein früheres Stadium bewirken.
Es ist seit den 70er Jahren bekannt, daß Kupfer ein Kofaktor bei der Angiogenese ist. Viele angiogene Mediatoren wie FGF, Angiogenin und SPARC binden oder wechselwirken in ihrem proangiogenen Stadium mit Kupfer. Das Konzept einer antiangiogenen Behandlung fester Tumore (Folkman, 1972; 1995c; 1997) beruht auf einem festen Grundprinzip und zeigt in Tiertumormodellen Wirkung (Volpert et al., 1996; Millauer et al., 1996, Warren et al., 1995; Borgstom et al., 1996; 1998; Yuan et al., 1996; O'Reilly et al., 1997; Benjamin et al., 1999 und Merajver et al., 1998). Verbindungen, die entscheidende Schritte in der Angiogenesekaskade stören, linden erste klinische Anwendungen (Marshall et al., 1997). Die für eine erfolgreiche Tumorangiogenese an primären und metastatischen Stellen erforderlichen Schritte sind unterschiedlich und hängen von einem Ungleichgewicht zwischen Angiogeneseaktivatoren (Iruela-Arispe und Dvorak, 1997; Hanahan und Folkman, 1996) wie VEGF und bFGF und -inhibitoren wie Thrombospondin-1 (TSP-1) (Volpert et al., 1995; Salnikow et al., 1997; Guo et al., 1997; Schapira und Schapira, 1983; Qian et al., 1997), Angiostatin (O'Reilly et al., 1994; Lannutti et al., 1997; Sim et al., 1997) und Endostatin (O'Reilly et al., 1997) ab. Die relative Wichtigkeit verschiedener angiogenesemodulierender Moleküle in verschiedenen Geweben kann die relative Wirksamkeit antiangiogener Verbindungen beim Hervorrufen einer Reaktion sowohl bei primären als auch bei metastatischen Stellen bestimmen.
Es gibt reichlich Belege dafür, daß Kupfer für die Angiogenese benötigt wird (Parke et al., 1988; Raju et al., 1982; Ziehe et al., 1982). Brem et al. (1990a, b) und vor kurzem Yoshida et al. (1995) versuchten, einen gegen Kupfer gerichteten Ansatz zur Behandlung von Tumoren in Tierstudien anzuwenden. Sie wandten eine als CDPT bezeichnete Kombination von kupferarmer Ernährung und Penicillamintherapie an. Diese Studien zeigten eine relative Inhibierung des Wachstums von Kaninchen-VX2-Karzinomen im Hirn von Kaninchen (Brem et al., 1990b) und von Ratte-9L-Gliosarkomen im Hirn von Ratten (Brem et al., 1990a; Yoshida et al., 1995) als Ergebnis einer solchen Behandlung; signifikanterweise wurde jedoch von keiner das Gesamtüberleben betreffenden Verbesserung berichtet. Die Tiere in der Studie von Yoshida et al. wurden getötet, bevor das Gesamtüberleben beurteilt werden konnte. Bei den Untersuchungen von Brem et al. trat der Tod aufgrund von begleitenden intracerebralen Ödemen ein, die so schwerwiegend waren, daß bei den behandelten Tieren der Tod mit der gleichen Rate eintrat wie bei den Kontrolltieren durch den unbehandelten Tumor. Weiterhin war es im Gegensatz zum Kaninchenhirnmodell mit CDPT nicht möglich, das Tumorwachstum und die Vaskularisierung des VX2-Karzinoms im Oberschenkelmuskel und bei dessen Metastasen in der Lunge zu hemmen. Die ausbleibende Verbesserung in Hinsicht auf das Überleben bei Hirntumorimplantatmodellen und die ausbleibende Wirkung bei anderen Tumoren als Hirntumoren scheint von weiteren Arbeiten auf diesem Gebiet abgeschreckt zu haben.
Die Erfinder folgerten, daß es überaus wünschenswert wäre, eine Antiangiogenesestrategie zu entwickeln, mit der mehrere Aktivatoren der Angiogenese angesprochen werden können, um so eine allgemein auf Tumore des Menschen anwendbare Strategie zu erhalten. Viele der zur Kontrolle von Angiogenese vorgeschlagenen Ansätze sind gegen ein einzelnes Ziel gerichtet. Da Kupfer ein für viele Schlüsselmediatoren der Angiogenese wie bFGF (Watanabe et al., 1990; Engleka und Maciag, 1994; Shing, 1988; Patstone und Maher, 1996), VEGF und Angiogenin (Badet et al., 1989) erforderlicher Kofaktor ist, entwickelten die Erfinder eine Antiangiogenesestrategie zur Behandlung von Krebs und anderen durch eine aberrante Angiogenese gekennzeichneten Krankheiten auf der Grundlage der Modulation des Kupferstatus des gesamten Körpers. Die Basis, auf der sich diese Arbeit begründet, ist, daß es eine Lücke bei der Kupferdefizienz gibt, bei der die Angiogenese gestört ist, andere kupferabhängige zelluläre Prozesse jedoch nicht in einem solchen Ausmaß beeinträchtigt sind, daß es zu einer klinischen Toxizität kommt. Die Erfinder haben ihre klinischen Ziele trotz der dokumentierten Fehlschläge anderer mit Tiermodellen erreicht.
Die Entwicklung sicherer und wirksamer prophylaktischer oder therapeutischer Mittel, die die Kupferkonzentrationen in vivo senken, ist ein in der Technik bekanntes Problem. Die dem Anti-Kupfer-, Anti-angiogenese-Ansatz der Erfinder zugrundeliegende Hypothese ist, daß die für die Angiogenese erforderliche Kupferkonzentration vergleichsweise höher ist als die für essentielle kupferabhängige Zellfunktionen wie Hämsynthese, Cytochromfunktion und Einbau von Kupfer in Enzyme und andere Proteine erforderliche Konzentration. Die Erfinder argumentierten, daß die einzigartigen und vorteilhaften Charakteristika von Tetrathiomolybdat (TM) als Mittel gegen Kupfer verglichen mit anderen gegen Kupfer gerichteten Arzneimitteln TM zu einer nichttoxischen, wirkungsvollen neuen Waffe in einer gegen Kupfer gerichteten Antiangiogenesetherapie machen könnten.
Wie unten ausführlich beschrieben haben die Erfinder in den letzten 20 Jahren neue Antikupfertherapien gegen Wilson-Krankheit, eine autosomale rezessive Krankheit, die mit dem Kupfertransport in Zusammenhang steht und zu einer anormalen Anreicherung von Kupfer und Toxizität führt, entwickelt. Eines der gegenwärtig verwendeten Arzneimittel ist TM, daß die einzigartigen und wünschenswerten Eigenschaften von schneller Wirkung, Kupferspezifität und geringer Toxizität (Brewer et al., 1991a; 1994b; 1996) sowie einen einzigartigen Wirkungsmechanismus aufweist. TM bildet einen stabilen Dreierkomplex mit Kupfer und Protein. Bei der Verabreichung mit dem Essen komplexiert es das Kupfer im Essen mit Nahrungsmittelprotein und verhindert die Resorption von Kupfer aus dem Magen-Darm-Trakt. Kupfer wird endogen mit dem Speichel und mit mit der Nahrungsmittelaufnahme assoziierten Magensekretionen sezerniert, und dieses Kupfer wird ebenfalls durch TM komplexiert, wenn man es mit den Mahlzeiten einnimmt, wodurch die Reabsorption von Kupfer verhindert wird. Die Kupferbilanz der Patienten wird somit unmittelbar nach der Gabe von TM mit dem Essen in den negativen Bereich verschoben. Wird TM zwischen den Mahlzeiten verabreicht, wird es in den Blutstrom absorbiert, wo es freies oder lose gebundenes Kupfer mit Serumalbumin komplexiert. Diese TM-gebundene Kupferfraktion steht nicht mehr für eine zellulare Aufnahme zur Verfügung und hat keine bekannte biologische Aktivität.
Aus den Studien der vorliegenden Erfindung geht in der Tat hervor, daß TM ein sicheres und wirksames Mittel gegen Krebs ist. TM störte die Entwicklung von de novo Mammatumoren in transgenen Her2-neu-Mäusen (Beispiel 2) und zeigte bei einer Absenkung der Kupferkonzentrationen auf 10% Baseline keine klinisch offensichtliche Toxizität. Die vorliegende Offenbarung enthält weiterhin Einzelheiten der ersten Studie an Menschen, bei der ein auf der Anwendung von Tetrathiomolybdat in Patienten mit metastatischem Krebs beruhender, gegen Kupfer gerichteter Ansatz in der Antiangiogenesetherapie zur Anwendung kam (Beispiele 3 und 4). Die Phase-I-Studie mit TM, bei der Informationen zur Dosierung, zur Dosis-Reaktions-Kurve, zur Bewertung des Kupferstatus in Patienten und zur Toxizität und Wirksamkeit erhalten wurden, zeigte überraschend positive Ergebnisse, insbesondere angesichts der von anderen durchgeführten enttäuschenden Tierversuche (Brem et al., 1990a, b; Yoshida et al., 1995). Neue Ansätze zur Beobachtung des Krankheitszustands bei Versuchen mit antiangiogenen Verbindungen werden ebenfalls offenbart.

I. Mittel, die einen Dreierkomplex mit Kupfer und Protein bilden

0 Tetrathiomolybdat

1. Charakterisierung und Wirkungsmechanismus

Tetrathiomolybdat (TM) ist eine Verbindung, die aus einem von vier Sulfidogruppen umgebenen Molybdänatom besteht. Die Entdeckung der biologischen Wirkungen von TM begannen mit Beobachtungen an Rindern und Schafen, bei denen es zu Kupfermangel kam, wenn sie auf Weiden mit hohem Molybdän-(Mo-)gehalt grasten (Ferguson et al., 1943; Dick und Bull, 1945; Miller und Engel, 1960). Es wurde festgestellt, daß die Verabreichung von zusätzlichem Mo bei Wiederkäuern zu einer Störung des Kupferstoffwechsels führte (Macilese Ammerman et al., 1969); jedoch hatte Mo bei Nicht-Wiederkäuern wie Ratten nur eine geringe Wirkung (Mills et al., 1958; Cox et al., 1960). Die Lösung dieses Rätsels kam von Beobachtungen, die nahelegten, daß das Mo im Pansen als Folge des dortigen hohen Sulfidmetabolismus in Thiomolybdate umge wandelt wurde und daß es sich bei den Thiomolybdaten um die wirksamen Anti- Kupfer-Mittel handelte (Dick et al., 1975). Diese Theorie wurde bestätigt, als man Ratten Thiomolybdatverbindungen verabreichte und so Antikupferwirkungen hervorrief (Mills et al., 1981a, b; Bremner et al., 1982). Von diesen ist die tetrathiosubstituierte Verbindung TM die wirksamste.
Der Antikupfermechanismus der Wirkung von TM ist zweifach (Mills et al., 1981a, b; Bremner et al., 1982; Gooneratne et al., 1981b). Ein Mechanismus wirkt im Magen- Darm-Trakt, der andere im Blut. Im Magen-Darm-Trakt bildet TM Komplexe mit Kupfer und Proteinen aus den Nahrungsmitteln (oder anderen Proteinen), wobei diese Komplexe nicht resorbiert werden. Diese Blockierung der Resorption betrifft nicht nur Kupfer aus der Nahrung, sondern auch recht beträchtliche Mengen an endogen sezerniertem Kupfer im Speichel, im Magensaft und in anderen Sekreten des Magen-Darm-Trakts (Allen und Solomons, 1984). TM ist ein wirksamerer Blocker der Kupferresorption als Zink, da Zink nur in den Regionen des Dünndarms wirkt, in denen Metallothionein induziert werden kann (Yusbasiyan-Gurkan et al., 1992). Im Gegensatz dazu wirkt TM im gesamten Magen-Darm-Trakt. Der andere Vorteil von TM im Vergleich zu Zink bei diesem Szenario ist die sofortige Wirkung von TM. Es kommt nicht zu der für die Induktion von Metallothionein erforderlichen Verzögerung.
Die zweite Wirkung von TM ist auf das Blut. Nicht zu Mahlzeiten eingenommenes TM wird recht gut ins Blut absorbiert. Dort bildet es Komplexe mit Kupfer und Albumin, wodurch das komplexierte Kupfer nicht mehr für eine Aufnahme in Zellen zur Verfügung steht (Gooneratne et al., 1981b). Das normale Plasmakupfer befindet sich in zwei Primärpools. Bei normalen Personen ist das meiste Plasmakupfer Teil des Ceruloplasminmoleküls. Dieses Kupfer steht im wesentlichen nicht für einen leichten Austausch mit Zellen zur Verfügung und wird als nichttoxisch angesehen. Der andere Kupferpool ist loser an Albumin und kleine Moleküle wie Aminosäuren gebunden. Dieser Kupferpool ist bei einer akuten Kupfertoxizität bei Krankheiten wie Wilson-Krankheit stark vergrößert und leicht für eine zelluläre Aufnahme verfügbar und daher potentiell toxisch (Scheinberg und Sternlieb, 1984). Tritt TM ins Blut über, so bildet es mit diesem letzt genannten Kupfer einen Komplex und dieses steht dadurch wie das Ceruloplasminkupfer für eine Aufnahme in Zellen und für weitere Toxizität nicht zur Verfügung.
Dafür, daß TM-komplexiertes Kupier für eine zelluläre Aufnahme nicht verfügbar ist, gibt es sehr gute Belege. Der direkteste Beleg ist, daß in Schafen Plasmakupferspiegel, die normalerweise hoch genug wären, um hämolytische Anämie hervorzurufen, dies in Gegenwart von TM nicht tun (Gooneratne et al., 1981b). Es wurde gezeigt, daß das TM- gebundene Kupfer nicht in Erythrozyten eindringt. Dies ist ein direkter Beleg dafür, daß TM-komplexiertes Kupfer nicht in Zellen eindringt.
Es sind TM und TM-Salze verfügbar; eines der bevorzugten TM-Salze ist das Ammoniumsalz. Bei dem von Aldrich Chemical Company bezogenen TM (Katalognummer W 180-0; Milwaukee, WI) handelt es sich um ein schwarzes, mäßig wasserlösliches Pulver, das eine hellrote Lösung ergibt. Für von Aldrich Chemical Company geliefertes TM (lieferbar in 1-Kilogramm-Großmengen) wird bescheinigt, daß es ausreichend rein für eine Verwendung im Menschen ist. In Großmengen sollte das Arzneimittel unter Sauerstoffausschluß gelagert werden, oder der Sauerstoff verdrängt langsam den Schwefel und macht das Arzneimittel im Verlauf der Zeit unwirksam. In Großmengen wird das Arzneimittel daher unter Argon aufbewahrt. Von den Erfindern entwickelte Stabilitätsassays zeigen, daß das Arzneimittel unter Argon mehrere Jahre lang stabil ist (Brewer et al., 1991a). Kapseln können von Hand gefüllt werden, und das Arzneimittel ist verkapselt mehrere Monate lang bei Raumtemperatur stabil.
TM wirkt, indem es mit Kupfer und Protein einen Dreierkomplex bildet (Mills et al., 1981a, b; Bremner et al., 1982). TM hat zwei Wirkmechanismen. Mit Mahlzeiten eingenommen komplexiert es Kupfer in Nahrungsmitteln und endogen sezerniertes Kupfer mit sich selbst und Protein aus dem Essen und verhindert die Resorption von Kupfer. Die Kupferbilanz der Patienten kann durch die Verabreichung von TM mit dem Essen unmittelbar auf einen negativen Wert eingestellt werden. Bei einer Verabreichung zwischen den Mahlzeiten wird das TM in den Blutstrom aufgenommen und komplexiert das Serumkupfer mit sich selbst und Albumin, wodurch das Kupfer nicht länger für eine zelluläre Aufnahme zur Verfügung steht. Da sich freies Kupfer in den Organen im Gleichgewicht mit freiem Kupfer im Blut befindet, wird bei der Bindung des Blutkupfers das freie Kupfer in den Organen und in Tumorgewebe schnell auf sehr niedrige Konzentrationen abgesenkt. Dieser Komplex wird über die Nieren und die Leber eliminiert. TM ist das wirkungsvollste und am schnellsten wirkende bekannte Ajntikupfermittel.

2. TM-Toxizität und -Wirksamkeit

Tetrathiomolybdat (TM) ist ein Arzneimittel, das von den Erfindern als "Orphan"- Therapie für Wilson-Krankheit entwickelt wurde. Das Arzneimittel leistet hervorragende Arbeit, indem es eine Kupfertoxizität schnell unter Kontrolle bringt und die neurologischen Komplikationen verhindert, die in 50% aller Fälle bei der Ausgangstherapie mit Penicillamin, einem gegen Wilson-Krankheit häufig eingesetzten Arzneimittel, auftreten (Brewer et al., 1991a; Brewer et al., 1994b; Brewer et al., 1996). Bislang wurden von den Erfindern 55 an Wilson-Krankheit leidende Patienten mit TM behandelt, im allgemeinen über einen Zeitraum von acht Wochen. TM füllt somit eine sehr wichtige Lücke bei der Ausgangstherapie von Wilson-Krankheit. Durch die Arbeiten an Wilson- Krankheit hat man umfangreiche Erfahrungen mit der Anwendung von TM bei Menschen gewonnen und die extrem geringen Toxizitätskonzentrationen in Menschen dokumentieren können.
Bei den Untersuchungen mit an Wilson-Krankheit leidenden Menschen wurde als einzige Nebenwirkung gelegentlich eine auf die Antikupferwirkungen von TM zurückzuführende reversible Anämie beobachtet. Bei Verabreichung einer zu hohen Dosis führt TM zu einem ernsten oder totalen Kupferdefizit im Knochenmark. Da Kupfer für die Erythrozytenbildung erforderlich ist, entwickelt sich eine Anämie. Diese Anämie läßt sich schnell wieder aufheben, indem man einfach die Verabreichung von TM stoppt. Bei den Studien an Wilson-krankheit wurde der Überbehandlungeffekt mit TM reduziert, indem man einfach die Dosis auf sechsmal 20 mg pro Tag verringerte. Bei Menschen, die nicht an Wilson-Krankheit leiden, wie z. B. bei Krebspatienten, lassen sich Spiegel mit milder Kupferdefizienz im Präanämiestadium feststellen, indem man einfach während der TM-Therapie die Ceruloplasmin-(Cp-)spiegel sorgfältig kontrolliert. TM wird letztlich zu Thiomolybdaten, Molybdaten und Molybdänoxiden metabolisiert, so daß die potentielle Toxizität dieser Verbindungen in Betracht gezogen werden muß. Es stellt sich jedoch heraus, daß diese Molybdänverbindungen in den durch den Abbau des in den hier beschriebenen klinischen Situationen verwendeten TM produzierten Konzentrationen recht unschädlich sind. Ungefähr 37 Gew.-% des TM ist Mo, so daß bei den hier beschriebenen Studien zwei Wochen lang bis zu 50 mg Mo/Tag verabreicht werden, und dann nicht mehr als 25 mg/Tag als Erhaltungsdosis. Es wurden bereits hohe Dosen von 350 bis 1400 mg Mo/Tag über 4-11 Monate bei Patienten mit Wilson- Krankheit angewendet, ohne daß eine toxische Wirkung beobachtet wurde (Bickel et al., 1957). Der Dosisbereich von 25-50 mg/Tag stellt somit keine vorhersehbaren Probleme und sollte völlig sicher sein.
Beträchtliche Arbeiten zur potentiellen Toxizität von TM wurden an Ratten durchgeführt (Mills et al., 1981a; Bremner et al., 1982). Bei ungefähr 6 mg TM pro Kilogramm Futter waren bei Ratten wesentliche Wirkungen auf den Kupferhaushalt festzustellen, einschließlich einer Abnahme des Ceruloplasmins im Plasma und einer Abnahme des Kupfers in Leber und Nieren. Bei ungefähr 12 mg TM waren alle diese Änderungen noch stärker ausgeprägt, und darüber hinaus waren die Mo-Konzentrationen in der Leber erhöht. Es kam zu einer leichten Anämie und bei einem von sechs Tieren zu Skelettläsionen. Bei 18 mg TM war die Anämie schwerwiegend. Die Melanogenese der Haare war gestört, es kam zu Durchfall, die Wachstumsrate war deutlich beeinträchtigt und alle Tiere hatten Skelettläsionen, die durch Dysplasie in den Epiphysenknorpelzellen der langen Knochen, eine Resorption von Trabekelknochen und strukturelle Veränderungen in den Bändern gekennzeichnet waren.
Es wurde später gezeigt, daß sich alle toxischen Wirkungen von TM bis zu 36 mg TM pro Kilogramm Futter durch orale Ergänzung von Kupfer oder intraperitoneale Injektion von Kupfer verhindern ließen (Mills et al., 1981b). Es scheint somit, daß alle durch TM induzierten toxischen Läsionen auf das durch TM induzierte Kupferdefizit zurückzufüh ren sind. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, daß fast alle der obigen Läsionen auch durch mangelndes Kupfer in der Nahrung induziert werden, mit den beiden Ausnahmen der Skelettläsionen und der Schädigung der Enterozytenmitochondrien, die zu Durchfall führt. Der Grund dafür, daß man diese beiden letztgenannten Läsionen bei der Verabreichung von TM, jedoch nicht bei Kupfermangel in der Nahrung beobachtet, könnte mit dem Schweregrad und dem schnellen Einsetzen des durch TM induzierten Kupferdefizits zusammenhängen. Bei einem Kupfermangel in der Nahrung sind immer noch einige Kupferverunreinigungen vorhanden, und Zellen, die sich schnell teilen, wie Enterozyten- und Epiphysenzellen, erhalten wahrscheinlich immer noch ausreichend Kupfer, so daß die Läsionen verhindert werden. Daß diese beiden Läsionen sowie alle anderen TM-induzierten Läsionen durch Kupferzusätze verhindert werden, deutet darauf hin, daß die Läsionen wahrscheinlich auf Kupfermangel zurückzuführen sind.
Von einer anderen Gruppe wurde die Darmpathologie in Ratten untersucht, die ungefähr 18 mg TM pro Kilogrann Futter erhielten (Fell et al., 1979). Diese Ratten erhielten gleichzeitig etwa 3 mg Kupfer pro Kilogramm Futter. Diese Wissenschaftler fanden eine Darmpathologie mit Zellapoptose, Ödemen und Nekrose, die sie nicht einer Hypocuprose zuschrieben, obwohl dies nicht bewiesen wurde. Angesichts des Befunds, daß alle diese Probleme durch einen angemessenen Zusatz an Kupfer vermieden wurden (Mills et al., 1981b), ist wahrscheinlich, daß es für eine Schutzwirkung erforderlich ist, mehr Kupfer zuzusetzen.
Patienten mit Wilson-Krankheit verfügen über große Vorräte an überschüssigem Kupfer, so daß keine der auf Kupfermangel beruhenden Toxizitäten von TM bei diesen Patienten ein Risiko darstellt. Selbst bei Skelett- und Enterozytenläsionen sollten, da eine Schutzwirkung durch die Verabreichung von Kupfer erzielt werden konnte, Patienten mit Wilson-Krankheit mit überschüssigen Kupfervorräten ebenfalls geschützt sein. Andere Forscher untersuchten die Wirkung von TM auf mit Kupfer belastete Schafe (Gooneratne et al., 1981a). Es ist gut bekannt, daß Schafe gegenüber der toxischen Wirkung von Kupfer recht empfindlich sind, was gewöhnlich zu Leberversagen und hämolytischer Anämie führt. Bei diesen Studien wurden Schafe über die Nahrung mit Kupfer belastet, bis es zu Leberschäden kam, und dann wurde TM bis zu 11 Wochen lang intravenös in Dosen von 50 oder 100 mg 2mal wöchentlich verabreicht.
Fünf der 26 Schafe starben während der Studie. Alle Todesfälle wurden nach den Ergebnissen der Autopsie einer Kupfertoxikose zugeschrieben. Zu 3 der 5 Todesfälle kam es bei Kontrolltieren, denen Kupfer, aber kein TM verabreicht worden war. Ein Todesfall trat ein, nachdem einem Tier erst eine Dosis an TM verabreicht worden war, und ein weiterer in einem Tier, das lediglich 4 Dosen erhalten hatte. Es ist klar, daß diese 2 Tiere an Kupfervergiftung starben, bevor sie durch TM gerettet werden konnten. Überlebten die Tiere das erste Auftreten der Kupfertoxikose, wurden sie durch TM gegen eine weitere Kupfertoxizität geschützt, obwohl in einigen Fällen die Verabreichung von Kupfer fortgesetzt wurde. Diese Tiere vertrugen bis zu 22 TM-Injektionen, ohne daß klinische Probleme auftraten.
Weiterhin konnten auch Belege dafür gezeigt werden, daß i. v. (Humphries et al., 1986) oder subkutan (Humphries et al., 1988) verabreichtes TM eine günstige Wirkung hat, indem es Schafe gegen eine schwere hepatische Kupfertoxizität schützt. TM reduziert nicht nur die Menge von Kupfer in der Leber, sondern auch die eigentliche Schädigung der Leber. Darüber hinaus wurde TM prophylaktisch eingesetzt, um Kupfertoxizität in kommerziellen Schafherden zu verhindern. Über 400 Tiere wurden mit TM behandelt, ohne daß nachteilige Nebenwirkungen auftraten (Humphries et al., 1988).
Vorbereitende Arbeiten haben weiterhin Anhaltspunkte dafür gegeben, daß TM eine dramatische Wirkung gegen Kupfertozixität im LEC-Rattenmodell hat (Suzuki et al., 1993). Vor kurzem wurde gezeigt, daß die genetischen Defekte bei diesen Ratten auf einen Defekt im Gen der Wilson-Krankheit zurückzuführen sind (Wu et al., 1994). Bei den Ratten kommt es zu einer schweren Lebererkrankung, und normalerweise sterben die Tiere. TM war bei der Behandlung der späteren Stadien der Lebererkrankung bei diesen Tieren sehr effektiv.
Die Verstoffwechslung von Mo in Schafen wurde nach i. v.-Injektion von mit &sup9;&sup9;Mo markiertem TM untersucht (Mason et al., 1983). Es kam zu einer schnellen Elimination aus dem Plasma im Verlauf von 15 Minuten und anschließend zu einer langsamen Elimination mit einer t¹/2 von etwa 40 h. Das TM wurde schrittweise in Molybdat umgewandelt, und über 90% wurde mit dem Urin ausgeschieden, im Vergleich zu 5% mit den Fäzes. Die gleiche Gruppe veröffentlichte anschließend über den &sup9;&sup9;Mo- und ³&sup5;S- Metabolismus nach i. v.-Injektion von doppelt markiertem TM in Schafen (Hynes et al., 1984). Das meiste &sup9;&sup9;Mo und ³&sup5;S war zunächst mit Albumin assoziiert. Verdrängtes oder ungebundenes TM wurde schnell zu Molybdat und Sulfat hydrolysiert. Es gab keine Beweise für eine irreversible Wechselwirkung von entweder ³&sup5;S oder &sup9;&sup9;Mo mit Kupfer und Plasma, wenngleich eine TCA-unlösliche Kupferfraktion auftrat.
Es ist klar, daß es, wenn hohe Kupferkonzentrationen vorliegen, bei der Verabreichung von TM zur Anreicherung von mit TM komplexiertem Kupfer sowohl in der Leber als auch in den Nieren kommt (Jones et al., 1984; Bremner und Young, 1978). Es gibt jedoch keine Beweise für eine mit diesem Komplex verbundene Speicherkrankheit. Die gegenwärtige Theorie ist, daß der Komplex disassoziiert und daß das TM zu Oxymolybdaten metabolisiert und ausgeschieden wird (Mason et al., 1983). Das Kupfer wird dann auf anderen Pfaden in der Leber weiter metabolisiert. In Gegenwart hoher Konzentrationen an Metallothionein würde es höchstwahrscheinlich von Metallothionein aufgenommen werden. Es gibt Indizien dafür, daß das Kupfer in der Niere einfach ausgeschieden wird.
Bei Patienten, die TM für eine Erhaltungstherapie erhielten, wurde von zwei Fällen von reversibler Knochenmarkdepression berichtet (Harper und Walshe, 1986). Die Erfinder haben bei sieben Patienten eine reversible Anämie festgestellt. Bei diesen Patienten löste die Therapie eine sehr starke Reaktion aus, und es kam bei diesen Patienten wahrscheinlich zu einem auf das Knochenmark lokalisierten Kupfermangel. Da Kupfer für die Hämsynthese erforderlich ist, scheint dies eine Erscheinungsform einer Überbehandlung zu sein, wenigstens was das Knochenmark betrifft. Da es sich bei TM um ein dermaßen wirksames Mittel gegen Kupfer handelt, wäre bei der Erhaltungstherapie mit TM wie bei den Fällen von Harper und Walshe (Harper und Walshe, 1986) das Auftreten einer Überbehandlung nicht unerwartet.

3. Molybdän-(Mo-)Toxizität

Etwa 37% von TM besteht aus Mo. Die normale Mo-Aufnahme beträgt etwa 350 ug/Tag (Seelig, 1972) bzw. die äquivalente Menge an Mo, die in etwa 1,0 mg TM enthalten wäre. Molybdän scheint vom Menschen recht gut vertragen zu werden. Relativ hohe Dosen von 5-20 mg/kg/Tag an Mo (entspricht dem Mo in 1-4 g TM) wurden bei einer im Jahre 1957 durchgeführten Studie 4-11 Monate bei Patienten mit Wilson- Krankheit angewendet, ohne daß eine Toxizität bekannt wurde (Bickel et al., 1957). Es zeigte jedoch keine Wirkung, da, wie bereits erläutert wurde, es sich bei dem aktiven Metaboliten um TM handelt, das nur in Wiederkäuern effizient aus Mo gebildet wird.

1 Andere Thiomolybdatverbindungen

Andere Thiomolybdatverbindungen, die auf ähnliche Weise bei der Absenkung der Konzentrationen an freiem Kupfer wirken, schließen Dodecathiomolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat und Monothiomolybdat ein. Diese Verbindungen bilden wie Tetrathiomolybdat einen Dreierkomplex mit Kupfer und Protein, wodurch das Kupfer nicht länger zur Verfügung steht, und führt letztendlich zur Clearance des Kupferkomplexes.
Die Synthese und Charakterisierung einer Reihe von Thiomolybdatkomplexen, Oxo- /Thiomolybdatkomplexen und Eisen, Molybdän und Schwefel enthaltenden heterometallischen Komplexen mit oder ohne Sauerstoff sind beschrieben worden (Coucouvanis, 1998; Coucouvanis et al., 1989; Coucouvanis et al., 1988; Hadjikyriacou und Coucouvanis, 1987; Coucouvanis et al., 1984; Teo et al., 1983; Coucouvanis et al., 1983; Kanatzidis und Coucouvanis, 1983; Coucouvanis et al., 1981; Coucouvanis, 1981; Coucouvanis et al., 1980a, b). Von diesen Komplexen wurde gezeigt, daß sie an Kupfer binden, und sie werden daher für eine Verwendung in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung in Betracht gezogen.
Zu den bevorzugten Thiomolybdatverbindungen bzw. -komplexen gehören die, die ein, zwei oder drei Molybdänatome, ein Molybdänatom und ein Eisenatom, zwei Molybdänatome und ein Eisenatom und ein Molybdänatom und zwei Eisenatome umfassen. Die Strukturen von drei allgemeinen Klassen von Thiomolybdatverbindungen und zwei der bevorzugten Thiomolybdatverbindungen sind unten gezeigt:
wobei Cat für ein Kation steht, das den Komplex wasserlöslich macht, beispielsweise NH&sub4;&spplus;, und L für einen Liganden wie Cl&supmin; oder R-Ph-S steht, wobei R für eine funktionelle Gruppe steht, die den Komplex wasserlöslich macht, wie z. B. ein Sulfonat, und Ph für eine Phenylgruppe steht.
Beispiele für die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Thiomolybdatkomplexe sind Nonathiomolybdat ([MoS&sub9;]²&supmin;), Hexathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub6;]²&supmin;), Heptathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub7;]²&supmin;), Octathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub8;]²&supmin;), Nonathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub9;]²&supmin;), Decathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub1;&sub0;]²&supmin;), Undecathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub1;&sub1;]²&supmin;), Dodecathiodimolybdat ([Mo&sub2;S&sub1;&sub2;]²&supmin;), das Ammoniumsalz von Dodecathiodimolybdat ((NH&sub4;)&sub2;(Mo&sub2;(S&sub2;)&sub6;]; Müller et al., 1980; Müller und Krickemeyer, 1990), das Ammoniumsalz von Tridecathiotrimolybdat ((NH&sub4;)&sub2;[Mo&sub3;(S)(S&sub2;)&sub6;]; Muller und Krickemeyer, 1990) und die Thiomolybdate mit einer [FeCl&sub2;S&sub2;MoS&sub2;FeCl&sub2;]²&supmin;-, [S&sub2;MoS&sub2;FeS&sub2;MoS&sub2;]³&supmin;- und [S&sub2;MoS&sub2;FeCl&sub2;]²&supmin;-Kernstruktur, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Darüber hinaus haben die Erfinder gefunden, daß Eisengluconat eine Eisenquelle ist, die keine Halogenidionen enthält. Durch die Umsetzung von Eisengluconat mit Tetrathiomolybdat in Gegenwart von Ammoniumhydroxid erhält man eine weitere bevorzugte Thiomolybdatverbindung, das neue Ammoniumsalz von Eisenoctathiodimolybdat ((NH&sub4;)&sub3;[S&sub2;MoS&sub2;FeS&sub2;MoS&sub2;]), das sehr wasserlöslich ist.
Obwohl einige dieser Verbindungen bei der Senkung der Kupferspiegel im Körper weniger stark wirksam sind als Tetrathiomolybdat, so sind sie dennoch von Nutzen und in besonderen Fällen bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung bevorzugt.

2 Stabilisierte Thiomolybdatkomplexe

Thiomolybdatkomplexe sind, wenn man sie der Luft aussetzt, oxidationsempfindlich. Die Erfinder haben gefunden, daß man, indem man einen Komplex von Thiomolybdatverbindungen mit Kohlenhydraten wie Saccharose bildet, eine stabilisierte Form der Thiomolybdatverbindungen erhält. Bei diesen Thiomolybdat-Kohlenhydrat-Komplexen ordnen sich um die Thiomolybdatverbindung Schichten von Kohlenhydratmolekülen in einem System an, das durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert ist. Diese Schichten schützen den Thiomolybdatkern gegen Oxidation und Hydrolyse. Andere Moleküle wie Aminosäuren, die dazu in der Lage sind, mit den Thiomolybdatverbindungen Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen, werden ebenfalls für eine Verwendung bei bestimmten Aspekten der Erfindung bevorzugt.
Der Ausdruck "Kohlenhydrat" beinhaltet eine große Vielzahl verschiedener chemischer Verbindungen mit der allgemeinen Formel (CH&sub2;O)n und umfaßt Verbindungen wie Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide und deren aminierte, sulfatierte, acetylierte und andersweitig derivatisierte Formen. Oligosaccharide sind Ketten, die aus Zuckereinheiten bestehen, die auch als Monosaccharide bekannt sind. Zuckereinheiten können in beliebiger Reihenfolge angeordnet und über ihre Zuckereinheiten auf eine beliebige Anzahl verschiedener Weisen verbunden sein. Die Anzahl verschiedener stereoisomerer Oligosaccharidketten ist daher möglicherweise recht groß.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, handelt es sich bei einem Monosaccharid um ein Zuckermolekül, das eine Zuckereinheit enthält. Mit dem hier verwendeten Ausdruck "Zuckereinheit" ist ein Monosaccharid gemeint. Im Stand der Technik ist ebenfalls bekannt, daß es sich bei einem Disaccharid um ein Zuckermolekül handelt, das 2 Zuckereinheiten enthält, daß ein Trisaccharid 3 Zuckereinheiten enthält, daß es sich bei einem Oligosaccharid um ein Zuckermolekül handelt, daß im allgemeinen von etwa 2 bis etwa 10 Zuckereinheiten enthält, und daß ein Polysaccharid ein Zuckermolekül ist, das mehr als 10 Zuckereinheiten enthält. Die Zuckereinheiten in Di-, Tri- und Oligosacchariden sind alle über Glykosidbindungen miteinander verbunden. Nichtsdestotrotz bedeutet der Ausdruck "Oligosaccharid", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Zuckermolekül, das wenigstens zwei Zuckereinheiten enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist "Monosaccharide" so zu verstehen, daß entweder die D- oder die L-Isomere von Triosen, Aldopentosen, Aldohexosen, Aldotetrosen, Ketopentosen und Ketohexosen unter diesen Begriff fallen, die Aufzählung damit aber noch nicht abgeschlossen ist. Die aufgerührten Verbindungen können auch in Form von Lactonen vorliegen. Zu den Aldopentosen gehören beispielsweise Ribose, Arabinose, Xylose und Lyose; zu den Aldohexosen gehören beispielsweise Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Fucose und Rhamnose, jedoch sind diese Aufzählungen jeweils nicht hierauf beschränkt. Zu den Ketopentosen gehören beispielsweise Ribulose und Xylulose, zu den Tetrosen gehören beispielsweise Erythrose und Threose, und zu den Ketohexosen gehören beispielsweise Psicose, Fruktose, Sorbose und Tagatose, jedoch sind diese Aufzählungen jeweils nicht hierauf beschränkt.
Beispiele für Disaccharide sind Trehalose, Maltose, Isomaltose, Cellobiose, Gentiobiose, Saccharose, Lactose, Chitobiose, N,N-Diacetylchitobiose, Palatinose oder Saccharose. Beispiele für Trisaccharide sind Raffinose, Panose, Melezitose oder Maltotriose. Beispiele für Oligosaccharide sind Maltotetraose, Maltohexaose oder Chitoheptaose. Unter den hier verwendeten Ausdruck "Kohlenhydrat" sollen auch Zuckeralkohole, z. B. Alditole wie Mannit, Lactit, Xylit, Glycerin oder Sorbit, fallen. Zu den Polysacchariden gehören beispielsweise Polydextrose und Maltodextrin, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Es wird angenommen, daß diese Stabilisierung bei Verwendung eines beliebigen der hier definierten Kohlenhydrate in Verhältnissen zwischen 5 Zuckereinheiten bis 100 oder 200 Zuckereinheiten oder so pro Thiomolybdatmetallzentrum wirksam ist. Dieser Bereich ist so zu verstehen, daß er alle Werte in diesem Bereich umfaßt, wie z. B. Verhältnisse von etwa 10 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 20 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 25 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 30 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 40 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 50 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 60 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 70 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 75 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 80 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 90 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 110 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 125 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 150 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum, etwa 175 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum oder etwa 190 Zuckereinheiten pro Thiomolybdatmetallzentrum.
Ein Beispiel für eine solche stabilisierte Thiomolybdatverbindung ist durch Saccharose stabilisiertes Tetrathiomolybdat. Zur Darstellung des Saccharose- Ammoniumtetrathiomolybdat-Komplexes werden 25 Gramm Saccharose in 20 ml destilliertem Wasser gelöst, 1 Gramm Ammoniumtetrathiomolybdat (TM) wird zugesetzt, und die Mischung wird unter Argon gerührt, bis das TM in Lösung gegangen ist. Das Wasser wird dann durch Flash-Verdampfung unter Hochvakuum aus der Mischung entfernt.
Das so erhaltene Pulver scheint an der freien Luft sehr viel stabiler zu sein als reines TM. Nach 3monatiger Aufbewahrung in einer offenen Schale enthielt das Saccharosepulver noch 61% des ursprünglichen Arzneimittels, bestimmt über die OD&sub4;&sub6;&sub7;, während unter den gleichen Bedingungen aufbewahrtes TM nur noch 5% seiner ursprünglichen OD&sub4;&sub6;&sub7; aufwies.

3 Überwachung der Kupferkonzentrationen

Das Serumceruloplasmin, das direkt vom Kupferstatus der Leber abhängt, ist ein genauer Indikator des Kupferstatus. Die in den früheren Studien an Nagetieren angewendete TM-Dosis würde bei Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht durchschnittlich etwa 0,5 mg/Tag betragen. Die Untersuchungen der Erfinder an Mäusen und Ratten und die umfangreichen Erfahrungen der Erfinder mit Menschen mit Wilson-Krankheit und Menschen mit Krebs weisen daraufhin, daß bei Ratten das 4fache dieser Dosis erforderlich ist, um das Serumceruloplasmin auf etwa 10% des Normalwerts abzusenken, wobei es sich bei diesen 10% um das optimale Kriterion für einen niedrigen Kupferstatus bei Nagetieren handelt. Diese Konzepte der optimalen Überwachung des Cu-Status und der TM-Dosierung wurden anschließend mit in die in Beispiel 2 beschriebenen Tierversuche mit TM aufgenommen.
Nach den hier durchgeführten Untersuchungen und der Erfahrung der Erfinder mit TM führt eine Absenkung der Konzentration an Ceruloplasmin (Cp) auf zwischen 40% und 10% des Baselinewertes vor der Behandlung zu wenigstens einer gewissen günstigen antiangiogenetischen Wirkung in der Klinik. Bei den meisten klinischen Indikationen ist jedoch eine Absenkung des Cp vor der Behandlung auf eine Konzentration von etwa 20% des Baselinewertes bevorzugt.

4 Andere kupferchelatisierende Mittel

Bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung ziehen die Erfinder die Verwendung von Zink zum Herbeiführen eines Zustands von Kupferarmut bei Krebspatienten in Betracht. Die Erfinder haben Zink als Antikupfermittel für Wilson-Krankheit entwickelt, und seine Verwendung für diesen Zweck wurde im Januar 1997 von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassen. Zink wirkt, indem es Metallothionein in den Zellen der Darmschleimhaut induziert und somit die Resorption von Kupfer blockiert (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a). Zink ist ebenfalls überaus sicher. In Studien mit inzwischen fast 200 Patienten mit Wilson-Krankheit hatte Zink in Dosen von 150 mg pro Tag überhaupt keine toxischen Wirkungen (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a).
Im allgemeinen senkt Zink die Kupferspiegel langsamer als Tetrathiomolybdat und andere Thiomolybdatverbindungen. Aufgrund der Tatsache, daß Zinkverbindungen relativ billig und leicht herzustellen und weit verfügbar sind, wird die Verwendung von Zinkverbindungen bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung bevorzugt, sowohl um den anfänglichen niedrigen Kupferstatus zu erzielen als auch bei der Erhaltungstherapie, nachdem ein niedriger Kupferstatus durch Verwendung anderer Mittel erreicht worden ist (was unten ausführlicher diskutiert wird).

5 Kombinationstherapie

Die vorliegende Erfindung läßt sich mit beliebigen anderen allgemein zur Behandlung von der bestimmten Krankheit bzw. Erkrankung des Patienten angewandten Methoden kombinieren. Bei der Behandlung fester Tumore beispielsweise kann man die vorliegende Erfindung in Kombination mit klassischen Ansätzen wie operativen Eingriffen, Strahlentherapie und dergleichen anwenden. Solange ein bestimmter therapeutischer Ansatz selbst nicht als abträglich bekannt ist oder dem Erfolg der TM-Therapie entgegenwirkt, wird eine Kombination damit in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Werden ein oder mehrere Mittel in Kombination mit der TM-Therapie einge setzt, so ist es nicht erforderlich, daß sich bei den kombinierten Ergebnissen die bei der getrennten Durchführung der einzelnen Behandlungen beobachteten Wirkungen summieren, wenngleich dies natürlich wünschenswert ist, und es ist keine besondere Vorausbedingung, daß bei der Kombinationstherapie synergistische Wirkungen auftreten, wenngleich dies durchaus möglich und vorteilhaft ist.
Was chirurgische Eingriffe betrifft, so ist eine während des Kupfermangelzustands vorgenommene Operation nicht bevorzugt, weil für das Heilen der Wunde das Wachstum von Blutgefäßen erforderlich ist. Da jedoch das Kupfer innerhalb von etwa 24 Stunden nach dem Absetzen der TM-Therapie wieder ergänzt werden kann, kann man chirurgische Eingriffe nach der Ergänzung des Kupfers vornehmen. Nach dem Heilen der Wunde, typischerweise etwa 1-2 Wochen nach der Operation, kann man dann mit der TM- Therapie fortfahren. Was eine Strahlentherapie betrifft, so werden alle Mechanismen zur Induktion einer lokalen Schädigung von DNS in Tumorzellen in Betracht gezogen, wie z. B. γ-Bestrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Bestrahlung, Mikrowellen und sogar elektronische Ausstrahlungen und dergleichen. Das direkte Einschleusen von Radioisotopen in Tumorzellen wird ebenfalls in Betracht gezogen, wobei dieses Verfahren in Verbindung mit einem zielsuchenden Antikörper oder anderen Mitteln für einen gezielten Einsatz angewendet werden kann.
Eine Therapie mit Cytokinen hat sich ebenfalls als wirksamer Partner für Kombinationstherapieprotokolle erwiesen. Bei diesen kombinierten Ansätzen lassen sich verschiedene Cytokine einsetzen. Zu den Cytokinen gehören beispielsweise IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, EL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ. Cytokine werden nach Standardprotokollen verabreicht, gemäß den klinischen Indikationen wie dem Zustand des Patienten und der relativen Toxizität des Cytokins.

0 Kupferchelatisierende Mittel

Die Erfinder ziehen die Anwendung von Zink zur längerfristigen Aufrechterhaltung eines mäßigen kupferarmen Zustands bei Krebspatienten in Betracht, wenn ein kupferarmer Zustand erreicht worden ist. Wie oben erwähnt haben die Erfinder Zink als Antikupfermittel bei Wilson-Krankheit entwickelt, und es wurde im Januar 1997 von der United States Food and Drug Administration (FDA) für diesen Zweck zugelassen. Zink wirkt, indem es Metallothionein in den Zellen der Darmschleimhaut induziert und so die Resorption von Kupfer blockiert (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a). Zink ist ebenfalls überaus sicher. In Studien mit mittlerweile nahezu 200 an Wilson-Krankheit leidenden Patienten rief Zink in Dosen von 150 mg pro Tag keinerlei toxische Wirkungen hervor (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a).

1. Zink

Zinkverbindungen wie Zinkacetat werden zur umfassenden Behandlung von Wilson- Krankheit einschließlich der Anfangsbehandlung eingesetzt (Hoogenraad et al., 1978; Hoogenraad et al., 1979; Hoogenraad et al., 1987). Zink ist jedoch (für sich alleine) für die Anfangstherapie nicht ideal, da es relativ langsam wirkt. So dauert es ungefähr zwei Wochen, bis es zur Induktion von Metallothionein im Darm und einer negativen Kupferbilanz kommt (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1992). Nach diesen zwei Wochen sorgt Zink unmittelbar für eine Umkehr der durchschnittlichen (positiven) Kupferbilanz der Patienten von +0,54 mg pro Tag, die induzierte negative Kupferbilanz ist jedoch mit einer (negativen) Kupferbilanz von durchschnittlich -0,35 mg pro Tag recht mäßig (Brewer et al., 1990; Brewer et al., 1993b). Aufgrund der geringen Geschwindigkeit, mit der das Kupfer entfernt wird, kann es bis zu sechs Monate dauern, bis mit einer Zinktherapie die Kupferspiegel im Urin und die Nichtceruloplasmin- Plasmakupferspiegel (das im Blut gemessene, potentiell toxische Kupfer) auf nichttoxische Konzentrationen reduziert sind.

2. Penicillamin

Penicillamin ist das am häufigsten verwendete und am besten bekannte Arzneimittel. Für die Anfangsbehandlung von Neurologiepatienten sollte es jedoch die letzte Wahl sein, da ein sehr großes Risiko besteht, daß sich ihr neurologischer Zustand verschlimmert (Brewer et al., 1987a; Glass et al., 1990; Brewer et al., 1994a). Ein anderes Problem mit Penicillamin ist, daß sich bei etwa einem Viertel bis einem Drittel der Patienten ein anfängliches Überempfindlichkeitssyndrom entwickelt, das beträchtliche Eingriffe erforderlich macht, beispielsweise ein zeitweises Absetzen des Arzneimittels und dessen Wiederansetzen bei einer niedrigeren Dosis, gewöhnlich mit gleichzeitiger Verabreichung von Corticosteroiden. Dies ist eine etwas erschreckende Erfahrung für Patienten, die bereits krank sind, und macht es unmöglich, den behandelnden Arzt in der Studie der Erfinder zu verblinden. Schließlich gibt es noch eine lange Liste weiterer Nebenwirkungen, die in den ersten Wochen einer Therapie mit Penicillamin auftreten können. Hierzu gehören Knochenmarkdepression, Proteinurie und Autoimmunerkrankungen.

3. Trientin

Trientin wirkt, indem es Kupfer cheliert und für dessen Ausscheidung über den Harn sorgt (Walshe, 1982). Eine therapeutische Dosis (1000-2000 mg/Tag) bewirkt gewöhnlich nur eine halb so große Kuprurese wie die, die von einer ähnlichen Dosis an Penicillamin hervorgerufen werden würde. Nichtsdestotrotz ist es mit Trientin möglich, eine anfängliche negative Kupferbilanz von mehreren mg zu bewirken, was sehr viel größer ist als bei Zink. Typischerweise nimmt diese 4-5 mg-Kuprurese innerhalb der ersten Wochen der Therapie auf mäßigere, jedoch immer noch wesentliche 2-3 mg ab. Die Aufnahme von Kupfer mit der Nahrung ist etwa 1 mg/Tag, wovon obligatorisch etwa 0,5 mg über andere Wege als den Harn verloren gehen. Eine Kuprurese von 2-3 mg führt also zu einer negativen Kupferbilanz von 1,5 bis 2,5 mg/Tag.
Trientin ist offiziell für eine Anwendung bei Patienten zugelassen, die eine Penicillamintherapie nicht vertragen. Aus diesem Grund, und weil es sehr viel später als Penicillamin eingerührt wurde, ist es nicht sehr häufig angewendet und untersucht worden. Es liegt keine formelle Toxizitätsstudie vor. Es scheint, daß das Risiko an Nebenwirkungen wesentlich geringer ist als bei Penicillamin. Von anfänglich auftretenden Überempfindlichkeitsproblemen wurde nicht berichtet. Nach mehreren Wochen der Anwendung tritt bei etwa 20% der Patienten Proteinurie auf. Es kann weiterhin gelegentlich zu einer Knochenmarkdepression und zu Autoimmunanormalitäten rühren, obwohl letztere gewöhnlich erst nach längerer Anwendung auftreten.
Bislang gibt es noch keine Berichte darüber, daß sich der Zustand von Neurologiepatienten zunächst verschlimmert, jedoch ist seine alleinige Anwendung bei dieser Art von Patienten wahrscheinlich sehr begrenzt. Nebenbei sei bemerkt, daß die Erfinder Transferpatienten behandelt haben, deren Zustand sich unter Penicillamin verschlechtert hatte, die dann kurze Zeit mit Trientin behandelt wurden und die dann, wenn sich der Zustand weiter verschlechterte (bzw. keine Besserung eintrat), für eine TM-Therapie an die Erfinder überwiesen wurden. Bei dieser Art von Patienten ist es unmöglich zu sagen, ob das Trientin in irgendeiner Weise zur Verschlechterung des Zustands beigetragen hat. Theoretisch könnte Trientin, da es wie Penicillamin Kupfer mobilisiert, höhere Blutspiegel bewirken, um eine Ausscheidung über den Harn zu erreichen. Ob sich diese erhöhten Kupferkonzentrationen im Blut jedoch auch als erhöhte Konzentrationen im Hirn und durch eine erhöhte Neurotoxizität bemerkbar machen, ist nicht bekannt.

1 Chemotherapeutische Kombinationen und Behandlung

Unabhängig davon, mit welchen Mechanismen sich eine verbesserte Zerstörung von Tumoren erzielen läßt, sind die Kombinationsbehandlungsaspekte der vorliegenden Erfindung bei der wirksamen Krankheitsbehandlung von offensichtlichem Nutzen. Zur Anwendung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit der Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels würde man einfach einem Tier ein Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, in Kombination mit dem chemotherapeutischen Mittel verabreichen, auf eine Weise, auf die ihre Antitumorwirkungen im Tier kombiniert zum Tragen kommen. Diese Mittel würden also in einer Menge und über einen Zeitraum bereitgestellt werden, die bzw. der ausreichend dafür ist, daß sie zusammen im Gefäßsystem des Tumors vorliegen und ihre Wirkungen zusammen in der Tumorumgebung entfalten können. Zum Erreichen dieses Ziels können das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, und das chemotherapeutische Mittel dem Tier gemeinsam verabreicht werden, entweder als eine Zusammensetzung oder als zwei unterschiedliche Zusammensetzungen auf zwei verschiedenen Verabreichungswegen.
Alternativ dazu kann einer Behandlung mit einem Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, eine Behandlung mit dem chemotherapeutischen Mittel vorausgehen oder folgen, in Abständen von Minuten bis Wochen. Bei Ausführungsformen, bei denen der chemotherapeutische Faktor und das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, dem Tier getrennt verabreicht werden, würde man im allgemeinen sicherstellen, das zwischen den jeweiligen Verabreichungen keine wesentlichen Zeiträume verstreichen, so daß das chemotherapeutische Mittel und das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, immer noch eine vorteilhafte kombinierte Wirkung auf den Tumor ausüben können. In diesen Fällen wird in Betracht gezogen, daß man den Tumor mit den beiden Mitteln in einem Abstand von 5 Minuten bis zu einer Woche voneinander, besonders bevorzugt innerhalb von 12-72 Stunden voneinander, in Kontakt bringt, wobei ein Abstand von nur etwa 12-48 Stunden am meisten bevorzugt ist.
In einigen Situationen könnte es jedoch wünschenswert sein, den Behandlungszeitraum beträchtlich zu verlängern, wobei zwischen den jeweiligen Verabreichungen mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) oder sogar mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) liegen. Zusätzlich wird, wie oben beschrieben, bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, zwischen einzelnen Chemotherapiephasen verabreicht, oder als Erhaltungsbehandlung nach einer Chemotherapie. Es ist somit ebenfalls denkbar, daß mehr als eine einmalige Verabreichung des Mittels, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, und/oder des chemothera peutischen Mittels wünschenswert wäre. Zum Erzielen einer Regression des Tumors werden die beiden Mittel in einer kombinierten Menge verabreicht, die dessen Wachstum wirksam hemmt, unabhängig von den Verabreichungszeiten.
Für eine Verwendung in den hier offenbarten Kombinationsbehandlungsmethoden sind verschiedene chemotherapeutische Mittel vorgesehen. Zu den beispielhaft vorgesehenen chemotherapeutischen Mitteln gehören z. B. Etoposid (VP-16), Adriamycin, 5- Fluoruracil (5FU), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Carboplatin, Paclitaxel, Docetaxel und selbst Wasserstoffperoxid. Wie dem Durchschnittsfachmann einleuten wird, liegen die entsprechenden Dosierungen der chemotherapeutischen Mittel im allgemeinen in Bereich der bereits in klinischen Therapien angewandten Dosierungen, wobei die Chemotherapeutika alleine oder in Kombination mit anderen Chemotherapeutika verabreicht werden.
Weitere Mittel, die von Nutzen sind, schließen Verbindungen ein, die die DNS- Replikation, Mitose und chromosomale Trennung stören. Zu diesen chemotherapeutischen Verbindungen gehören Adriamycin, das auch als Doxorubicin bekannt ist, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und dergleichen. Diese in der Klinik häufig zur Behandlung von Neoplasmen eingesetzten Verbindungen werden im Fall von Adriamycin intravenös als Bolusinjektion in Abständen von 21 Tagen in Dosen im Bereich von 25-75 mg/m² und im Fall von Etoposid intravenös in Dosen von 35-50 mg/m² bzw. bei oraler Verabreichung dem Doppelten der intravenösen Dosis verabreicht.
Weiterhin kann man Mittel einsetzen, die die Synthese und Genauigkeit von Polynukleotidvorstufen beeinträchtigen. Von besonderem Nutzen sind Mittel, die ausgiebigen Tests unterzogen wurden und leicht verfügbar sind. Als solches werden Mittel wie 5-Fluoruracil (5-FU) bevorzugt von neoplastischem Gewebe verwendet, weshalb dieses Mittel besonders nützlich für das Targeting von neoplastischen Zellen ist. Obwohl es relativ toxisch ist, kann man 5-FU mit einer Vielzahl verschiedener Träger einschließlich topischer Träger anwenden, jedoch erfolgt die Anwendung gewöhnlich intravenös mit einer Dosierung im Bereich von 3 bis 15 mg/kg/Tag.
Beispielhafte chemotherapeutische Mittel, die in Zusammenhang mit einer Kombmationstherapie von Nutzen sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Jedes der dort aufgeführten Mittel ist lediglich als Beispiel angeführt und in keiner Weise einschränkend. Der Fachmann sei auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Kapitel 33, insbesondere Seiten 624-652, verwiesen. Die Dosierung wird je nach Zustand des behandelten Patienten notwendigerweise etwas schwanken. In jedem Fall wird die für die Verabreichung verantwortliche Person die für den einzelnen Patienten geeignete Dosis bestimmen. Für die Verabreichung an Menschen sollten die Zubereitungen weiterhin die vom PDA Office of Biologics festgelegten Standards in bezug auf Sterilität, Pyrogenität, allgemeine Anwendungssicherheit und Reinheit erfüllen. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)

C. Antiangiogene Verbindungen

Der Ausdruck "Angiogenese" bezieht sich auf die Bildung neuer Blutgefäße, im allgemeinen in ein Gewebe oder Organ. Unter normalen physiologischen Bedingungen findet bei Menschen oder Tieren eine Angiogenese nur in sehr speziellen, eingeschränkten Situationen statt. So wird eine Angiogenese normalerweise bei der Wundheilung, bei der Entwicklung von Fetus und Embryo und bei der Bildung des Corpus luteum, des Endometriums und der Plazenta beobachtet.
Man geht davon aus, daß die kontrollierte und die unkontrollierte Angiogenese auf ähnliche Weise fortschreiten. Endothelzellen und Perizyten, die von einer Basalmembran umgeben sind, bilden kapillare Blutgefäße. Die Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme, die von Endothelzellen und Leukozyten freigesetzt werden. Die Endothelzellen, die das Lumen der Blutgefäße auskleiden, dringen dann durch die Basalmembran. Angiogene Stimulantien regen die Endothelzellen dazu an, durch die erodierte Basalmembran zu wandern. Die wandernden Zellen bilden einen vom Stammblutgefäß ausgehenden "Sproß", in dem die Endothelzellen eine Mitose durchlaufen und sich vermehren. Die Endothelsprosse vereinigen sich miteinander unter Ausbildung von Kapillarschleifen, wodurch neu Blutgefäße entstehen.
Während der Metastase von Tumoren kommt es zu einer anhaltenden, nicht regulierten Angiogenese. Die erfindungsgemäßen kupferbindenden, einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildenden Mittel können somit in Kombination mit zusätzlichen "antiangiogenen" Therapien zur Anwendung kommen. Eine zur Inhibierung der Angiogenese bevorzugt verwendete Verbindung ist ein Protein namens "Angiostatin". Diese Komponente ist in den US-Patenten 5,776,704; 5,639,725 und 5,733,876 offenbart. Bei Angiostatin handelt es sich um ein Protein mit einem durch reduzierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht zwischen 38 kDa und 45 kDa, das ungefähr die Kringle-Regionen 1 bis 4 eines Plasminogenmoleküls enthält. Angiostatin hat allgemein eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der eines Fragments von Mäuseplasminogen ähnelt, das mit der Aminosäure Nummer 98 eines intakten Mäuseplasminogenmoleküls beginnt.
Die Aminosäuresequenz von Angiostatin variiert zwischen unterschiedlichen Spezies leicht. In humanem Angiostatin beispielsweise ähnelt die Aminosäuresequenz im wesentlichen der Sequenz des oben beschriebenen Mäuseplasminogenfragments, obwohl eine aktive humane Angiostatinsequenz entweder mit Aminosäure Nummer 97 oder 99 einer intakten humanen Plasminogenaminosäuresequenz beginnen kann. Darüber hinaus kann man auch humanes Plasminogen verwenden, da es eine ähnliche antiangiogene Wirkung hat, wie in einem Mäusetumormodell gezeigt wurde.
Spezifische Inhibitoren der Angiogenese einschließlich des Anti-Invasive-Factor, Retinsäuren und Paclitaxel (US-Patent Nr. 5,716,981); AGM-1470 (Ingber et al., 1990); Haiknorpelextrakt (US-Patent Nr. 5,618,925); anionischen Polyamid- oder Polyharnstoffoligomeren (US-Patent Nr. 5,593,664); Oxindolderivaten (US-Patent Nr. 5,576,330);
Östradiolderivaten (US-Patent Nr. 5,504,074) und Thiazolopyrimidinderivaten (US-Patent Nr. 5,599,813), wobei diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt ist, werden ebenfalls für eine Verwendung als antiangiogene Zusammensetungen für die Kombinationsanwendungen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.

D. Apoptoseinduzierende Mittel

Die kupferbindenden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildenden Mittel der vorliegenden Erfindung können auch mit Behandlungsmethoden kombiniert werden, die in Zellen innerhalb des Tumors einschließlich Tumorzellen und vaskulären Endothelzellen des Tumors Apoptose induzieren. Viele Mittel gegen Krebs können als Teil ihres Wirkungsmechanismus eine apoptoseinduzierende Wirkung haben; wie unten beschrieben wurden jedoch bestimmte Mittel, bei denen dies ein Primärmechanismus ist, entdeckt, entwickelt oder ausgewählt.
Es sind eine Reihe von Onkogenen beschrieben worden, die Apoptose bzw. den programmierten Zelltod inhibieren. Zu den Onkogenen aus dieser Kategorie gehören beispielsweise bcr-abl, bcl-2 (was sich von bcl-1, Cyclin D1; GenBank-Zugangsnummem M14745, X06487; US-Patent Nr. 5,650,491 und 5,539,094, unterscheidet) und weitere Mitglieder dieser Familie einschließlich Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1, A20, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Eine Überexprimierung von bcl-2 wurde zuerst in T-Zellen-Lymphomen entdeckt. Bcl-2 wirkt als Onkogen, indem es Bax, ein Protein des Apoptosepfads, bindet und desaktiviert. Die Inhibierung der Funktion, von bcl-2 verhindert die Desaktivierung von Bax und ermöglicht der Apoptose fortzuschreiten. Somit wird eine Hemmung dieser Klasse von Onkogenen z. B. mit Antisense- Nukleotidsequenzen für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung bei Aspekten, in denen eine Verstärkung der Apoptose wünschenswert ist, in Betracht gezogen (US-Patente Nr. 5,650,491; 5,539,094 und 5,583,034).
Bei vielen Formen von Krebs wird von Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie p53 berichtet. Eine Desaktivierung von p53 hat zur Folge, daß die Apoptose nicht mehr ge fördert wird. Mit diesem Versagen schreiten die Krebszellen zur Tumorgenese fort und sind nicht länger für den Zelltod bestimmt. Ein Bereitstellen von Tumorsuppressoren wird somit ebenfalls für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung zur Stimulierung des Zelltods in Betracht gezogen. Zu den Tumorsuppressoren gehören beispielsweise p53, das Retinoblastomagen (Rb), Wilms-Tumor (WT1), bax-alpha, Interleukin- 1β-konvertierendes Enzym und die zugehörige Familie, das MEN-1-Gen, Neurofibromatose Typ 1 (NF1), der cdk-Inhibitor p16, das Kolorektalkarzinom-Gen (DCC), das Gen für familiäre adenomatose Polypose (FAP), das Multiple Tumor Suppressor-Gen (MTS-1), BRCA1 und BRCA2, wobei diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt ist.
Bevorzugt werden p53- (US-Patent Nr. 5,747,469; 5,677,178 und 5,756,455), Retinoblastoma-, BRCA1- (US-Patent Nr. 5,750,400; 5,654,155; 5,710,001; 5,756,294; 5,709,999; 5,693,473; 5,753,441; 5,622,829 und 5,747,282), MEN-1- (GenBank- Zugangsnummer U93236) und Adenovirus E1A- (US-Patent Nr. 5,776,743) Gene angewendet.
Andere Zusammensetzungen, die eingesetzt werden können, schließen Gene ein, die für den als TRAIL bezeichneten, mit dem Tumomekrosefaktor verwandten apoptoseinduzierenden Liganden und das TRAIL-Polypeptid (US-Patent Nr. 5,763,223); die 24 kDa apoptoseassoziierte Protease aus US-Patent Nr. 5,605,826 und den Fas-assoziierten Faktor 1, FAF1 (US-Patent Nr. 5,750,653), kodieren. Weiterhin für eine Verwendung in diesen Aspekten der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird die Bereitstellung von Interleukin-1β-konvertierendem Enzym und Mitgliedern dieser Familie, von denen ebenfalls berichtet wurde, daß sie die Apoptose stimulieren.
Es können auch Verbindungen wie Carbostyrilderivate (US-Patent Nr. 5,672,603 und 5,464,833); verzweigte apogene Peptide (US-Patent Nr. 5,591,717); Phosphotyrosininhibitoren und nicht hydrolysierbare Phosphotyrosinanaloga (US-Patent Nr. 5,565,491 und 5,693,627); Agonisten von RXR-Retinoidrezeptoren (US-Patent Nr. 5,399,586) und sogar Antioxidationsmittel (US-Patent 5,571,523) verwendet werden. Tyrosinkinasein hibitoren wie Genistein können ebenfalls an Liganden gebunden werden, die gegen einen Zelloberflächenrezeptor gerichtet sind (US-Patent Nr. 5,587,459).

IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits

Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten im allgemeinen eine wirksame Menge eines Mittels, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat, gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder einem wäßrigen Medium.
Die Ausdrücke "pharmazeutisch oder pharmakologisch unbedenklich" beziehen sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei einer Verabreichung an ein Tier bzw. einen Menschen keine nachteilige, allergische oder andersweitig unerwünschte Reaktion hervorrufen. Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch unbedenklicher Träger" schließt alle beliebigen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakteriellen und antifungiziden Mittel, isotonischen und resorptionsverzögemden Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Solange ein beliebiges herkömmliches Medium oder Mittel nicht mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebaut werden.

A. Parenterale Formulierungen

Die Mittel der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, werden oft für eine parenterale Verabreichung formuliert, z. B. für eine Injektion über die intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder eine andere solcher Routen, einschließlich einer direkten Instillation in einen Tumor oder einen Krankheitsherd. Wie eine wäßrige Zusammensetzung, die ein oder mehrere Mittel, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mit tel, Kupfer und Protein bilden, als Wirkstoff enthält, herzustellen ist, wird dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Typischerweise können solche Zusammensetzungen als Injektionszubereitungen, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, zubereitet werden; es ist weiterhin möglich, für die Zubereitung von Lösungen oder Suspensionen durch Zugabe einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignete feste Formen herzustellen; und die Zubereitungen können darüber hinaus emulgiert werden.
Lösungen der Wirkstoffe als freie Base oder pharmakologisch unbedenkliche Salze können in zweckmäßigerweise mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose gemischtem Wasser zubereitet werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Mischungen davon und in Ölen zubereitet werden. Bei normalen Lagerungs- und Anwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Zu den für eine Anwendung durch Injektion geeigneten pharmazeutischen Formen gehören sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen, Formulierungen, die Sesamöl, Erdnußöl oder wäßriges Propylenglykol enthalten, und sterile Pulver für die extemporierte Zubereitung steriler Injektionslösungen oder -dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril und zu einem solchen Grade fließfähig sein, daß sie leicht in eine Spritze aufgezogen werden kann. Sie muß unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen konserviert sein.
Zusammensetzungen, die die Mittel der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, enthalten, können in neutraler oder in Salzform zu einer Zusammensetzung formuliert werden. Zu den pharmazeutisch unbedenklichen Salzen gehören die Säureadditionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Proteins gebildet werden), die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäuren oder mit organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen ge bildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid oder Eisenhydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen gebildet werden.
Bei dem Träger kann es sich auch um ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium handeln, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssigen Polyethylenglykol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthält. Die richtige Fluidität läßt sich aufrechterhalten, indem man beispielsweise einen Überzug wie Lecithin verwendet, indem man bei einer Dispersion die erforderliche Partikelgröße aufrechterhält und indem man Tenside verwendet. Die Einwirkung von Mikroorganismen läßt sich durch verschiedene antibakterielle und gegen Pilze gerichtete Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen verhindern. In vielen Fällen wird man vorzugsweise Mittel zur Einstellung der Isotonizität zusetzen, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid. Eine retardierte Resorption der injizierbaren Zusammensetzungen läßt sich erzielen, indem man in die Zusammensetzungen resorptionsverzögernde Mittel, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, aufnimmt.
Sterile Injektionslösungen werden hergestellt, indem man die Wirkstoffe in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel einbringt und anschließend steril filtriert. Dispersionen werden im allgemeinen zubereitet, indem man die verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel einbringt, das das Dispersionsgrundmedium und von den oben aufgezählten die benötigten anderen Inhaltsstoffe enthält. Im Fall von sterilen Pulvern zur Zubereitung steriler Injektionslösungen sind die bevorzugten Methoden Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungsverfahren, die ein den Wirkstoff und die zusätzlich gewünschten Inhaltsstoffe enthaltendes Pulver aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergeben.
Nach der Formulierung wird man die Lösungen in einer Weise verabreichen, die mit der Verabreichungsform kompatibel ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge. For mulierungen können leicht in verschiedenen Verabreichungsformen wie dem oben beschriebenen Typ der Injektionslösungen verabreicht werden, es ist jedoch auch möglich, das Arzneimittel freisetzende Kapseln und dergleichen zu verwenden.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten im allgemeinen ein oder mehrere Mittel der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, in einer Mischung mit einem unbedenklichen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff wie einer sterilen wäßrigen Lösung, so daß man je nach der beabsichtigten Verwendung eine Reihe an Endkonzentrationen erhält. Die Zubereitungsverfahren sind im Stand der Technik wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Mack Publishing Company, 1980, das hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist, im allgemeinen gut bekannt. Es ist einzusehen, daß die Kontaminierung mit Endotoxinen minimal auf einem sicheren Niveau gehalten werden sollte, zum Beispiel auf unter 0,5 ng/mg Protein. Weiterhin sollten die Zubereitungen für die Verabreichung an Menschen die vom PDA Office of Biological Standards geforderten Standards in Hinsicht auf Sterilität, Pyrogenität, allgemeine Anwendungssicherheit und Reinheit erfüllen.
Die therapeutisch wirksamen Dosen lassen sich leicht in einem Tiermodell bestimmen, wie in den unten ausführlich dargestellten Studien gezeigt. Zur Optimierung geeigneter therapeutischer Dosen vor der Umsetzung in die Klinik werden häufig Versuchstiere mit festen Tumoren verwendet. Von diesen Modellen ist bekannt, daß sie sehr zuverlässige Ergebnisse bei der Abschätzung wirksamer Strategien gegen Krebs liefern. So werden beispielsweise bei vorklinischen Untersuchungen häufig Mäuse mit festen Tumoren wie die in Beispiel 2 verwendeten eingesetzt. Die Erfinder haben solche im Stand der Technik akzeptierten Mäusemodelle zur Festlegung von Arbeitsbereichen von Mitteln wie Tetrathiomolybdat eingesetzt, die vorteilhafte Antitumorwirkungen mit minimaler Toxizität liefern.
Zusätzlich zu den für eine parenterale Verabreichung wie intravenöse oder intramuskuläre Injektion formulierten Verbindungen werden auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Formen in Betracht gezogen, z. B. Tabletten oder andere Feststoffe für eine orale Verabreichung, Kapseln mit zeitlich gesteuerter Freisetzung, liposomale Formen und dergleichen. Je nachdem welches Leiden behandelt wird, kann man auch andere pharmazeutische Formulierungen anwenden. Topische Formulierungen beispielsweise könnten für die Behandlung pathologischer Zustände wie Dermatitis und Psoriasis geeignet sein, und ophthalmische Formulierungen könnten für Leiden wie diabetische Retinopathie geeignet sein. Methoden zur Bestimmung optimaler Dosierungen für Leiden wie diese sollten dem Fachmann angesichts der in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Methodologie zur Dosisoptimierung und seines Fachwissens natürlich einleuchten.
Wie hier ausführlich beschrieben wird in Betracht gezogen, daß sich bestimmte Vorteile erzielen lassen, indem man die Mittel der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, so behandelt, daß sie eine längere in-vivo-Halbwertszeit haben. Retard- Formulierungen sind im allgemeinen so ausgelegt, daß sie über eine längere Zeitspanne konstante Arzneimittelkonzentrationen liefern. Der Zweck einer Verlängerung der Halbwertszeit eines Arzneimittels wie z. B. von Mitteln der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, ist es, mit der Verabreichung hohe Plasmakonzentrationen zu erzielen, die über eine längere Zeit aufrechterhalten werden, wobei jedoch die Konzentrationen im allgemeinen in Abhängigkeit der pharmakokinetischen Eigenschaften des Konstrukts abfallen. Wenngleich gegenwärtig nicht bevorzugt, so sind Retard- Formulierungen der vorliegenden Zusammensetzungen und Kombinationen davon keinesfalls von einer Anwendung in der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.

B. Therapeutische Kits

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin therapeutische Kits bereit, die die hier beschriebenen Mittel der vorliegenden Erfindung, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, enthalten. Diese Kits enthalten im allgemeinen in einem geeigneten Behältnis eine pharmazeutisch unbedenkliche Formulierung wenigstens eines erfindungsgemäßen Mittels, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat. Das Kit kann darüber hinaus andere pharmazeutisch unbedenkliche Formulierungen wie z. B. eines oder mehrere einer Reihe chemotherapeutischer Arzneimittel enthalten.
Die Kits können ein einzelnes Behältnis umfassen, das das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat, mit oder ohne irgendwelchen zusätzlichen Komponenten enthält, oder es kann jeweils unterschiedliche Behältnisse für die einzelnen gewünschten Mittel umfassen. Bestimmte bevorzugte Kits der vorliegenden Erfindung umfassen ein Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat, das in einem Kit für die Verwendung in Kombination mit der begleitenden Verabreichung eines zweiten Antikrebsmittels wie z. B. eines chemotherapeutischen Mittels, eines radiotherapeutischen Mittels, eines anderen kupferchelierenden Mittels, eines antiangiogenen Mittels oder eines apoptoseinduzierenden Mittels verpackt ist. In diesen Kits können die Komponenten vorkomplexiert sein, entweder in einer molar äquivalenten Kombination, oder mit einem Überschuß einer der Komponenten, oder die Komponenten des Kits können vor der Verabreichung an einen Patienten jeweils getrennt in unterschiedlichen Behältern aufbewahrt werden.
Werden die Komponenten des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen bereitgestellt, so handelt es sich bei der flüssigen Lösung um eine wäßrige Lösung, wobei eine sterile wäßrige Lösung besonders bevorzugt ist. Die Komponenten des Kits können jedoch auch als Trockenpulver bereitgestellt werden. Werden Reagentien bzw. Kompo nenten als Trockenpulver bereitgestellt, so kann das Pulver durch Zusatz eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden. Es wird in Betracht gezogen, daß das Lösungsmittel ebenfalls in einem weiteren Behältnis bereitgestellt wird. Eine der Komponenten des Kits kann in Kapseln zur oralen Verabreichung bereitgestellt werden.
Das Behältnis des Kits enthält im allgemeinen wenigstens eine Ampulle, ein Reagensglas, einen Kolben, eine Rasche, eine Spritze oder ein anderes Behältnis, in das das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat, und irgendein anderes gewünschtes Mittel gegeben werden können, vorzugsweise in geeigneten Aliquots. Werden zusätzliche Komponenten beigefügt, so enthält das Kit im allgemeinen eine zweite Ampulle oder einen anderen Behälter, in den diese gegeben werden, wodurch es möglich ist, getrennte bestimmte Dosen zu verabreichen. Die Kits können auch ein zweites/drittes Behältnis umfassen, daß einen sterilen, pharmazeutisch unbedenklichen Puffer oder ein anderes Verdünnungsmittel enthält.
Die Kits können weiterhin eine Vorrichtung enthalten, mit der das Mittel, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, wie z. B. Tetrathiomolybdat, an ein Tier oder einen Patienten verabreicht werden kann, z. B. eine oder mehrere Nadeln oder Spritzen, oder sogar einen Augentropfer, eine Pipette oder einen anderen solchen Apparat, aus dem die Formulierung in das Tier injiziert oder auf die erkrankte Region des Körpers aufgetragen werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung enthalten weiter typischerweise eine Vorrichtung, die die Ampullen oder dergleichen und die anderen Komponenten für den Vertrieb im Handel eng umschlossen hält, z. B. durch Spritzguß oder Blasformen gebildete Kunststoffbehälter, die zur Aufnahme und Sicherung der gewünschten Ampullen und anderen Apparate dienen.

V. Krebs und Behandlung

Die durch die vorliegenden Erfindung bereitgestellten Zusammensetzungen können allgemein zur Behandlung von allen malignen Tumoren mit einer vaskulären Kompo nente angewendet werden. Typische vaskularisierte Tumore sind die festen Tumore, insbesondere Karzinome und Sarkome, die für die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen eine vaskuläre Komponente benötigen. Hämatologische Malignitäten scheinen ebenfalls für ihre Entwicklung auf Angiogenese angewiesen zu sein und sind daher potentiell auch einer Behandlung mit den vorliegenden kupfersenkenden Mitteln zugänglich. Zu den festen Tumoren, die unter Anwendung der Erfindung behandelt werden können, gehören beispielsweise primäre Karzinome der Lunge, der Brust, der Eierstöcke, des Magens, der Pankreas, des Kehlkopfs, der Speiseröhre, der Hoden, der Leber, der Parotis, der Gallenwege, des Kolons, des Rektums, des Gebärmutterhalses, der Gebärmutter, des Endometriums, der Nieren, der Blase, der Prostata und der Schilddrüse, Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome, kleinzellige Karzinome, Melanome, Gliome, Neuroblastome, Sarkome wie Angiosarkome und Chondrosarkome, und dergleichen, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Mit den Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lassen sich auch metastatische Tumore behandeln.
Die vorliegende Erfindung wird zur Anwendung bei der Behandlung aller Patienten mit festen Tumoren in Betracht gezogen. Da die vorliegende Erfindung jedoch bei der Behandlung fester Tumore mittlerer bis großer Größe besonders erfolgreich ist, ist es wahrscheinlich, daß Patienten aus diesen Kategonen von Behandlungen gemäß der hier bereitgestellten Methoden und Zusammensetzungen mehr profitieren. Im allgemeinen kann die Erfindung zur Behandlung von Tumoren einer Größe von etwa 0,3-0,5 cm und größer eingesetzt werden, obwohl es möglich ist, Tumore bis zu einschließlich den größten in Menschen vorkommenden Tumoren zu behandeln.
Bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung sind die Mittel wie z. B. Tetrathiomolybdat für die präventive und prophylaktische Behandlung und als Mittel für die Erhaltungstherapie bestimmt. Es gibt viele Gründe, die diesem Aspekt des Umfangs der Erfindung zugrundeliegen. So können beispielsweise bei einem Patienten mit einem Primärtumor mittlerer Größe oder darüber auch verschiedene andere metastatische Tumore vorhanden sein, die als klein anzusehen sind oder sich sogar erst im Frühstadium der metastatischen Ausbreitung des Tumors befinden. Da TM und die erfindungsgemäßen Kombinationen im allgemeinen oral oder in den systemischen Kreislauf des Patienten verabreicht werden, wirken sie natürlich auch auf die sekundären, kleineren und metastatischen Tumore, auch wenn dies nicht der Hauptzweck der Behandlung sein sollte. Weiterhin lassen sich selbst in Situationen, in denen die Tumormasse als Ganzes ein einzelner kleiner Tumor ist, bestimmte vorteilhafte Antitumorwirkungen durch die Anwendung der vorliegenden Behandlungen erzielen.
Die hier gegebenen Richtlinien in bezug darauf, welche Patienten für eine mit der vorliegenden Erfindung zusammenhängenden Anwendung am geeignetsten sind, soll lehren, daß die Profile bestimmter Patienten bei der Auswahl von Patienten, die mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden können bzw. die vielleicht besser mit anderen Behandlungsstrategien gegen Krebs behandelt werden, hilfreich sein können. Die Tatsache, daß es in Zusammenhang mit einer bestimmten Patientenkategorie eine bevorzugte oder andersweitig wirksamere Behandlung zu geben scheint, spricht dem grundlegenden Nutzen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung aller Patienten mit einem vaskularisierten Tumor jedoch in keiner Weise entgegen. Weiterhin ist die Tatsache zu bedenken, daß der zunächst erfolgende Angriff auf einen Tumor, wie er durch die Therapie der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, in Hinsicht auf meßbare und unmittelbare Wirkungen klein sein kann, jedoch zu einer Sensibilisierung des Tumors gegenüber weiteren therapeutischen Behandlungen rühren oder diese verstärken kann, so daß die anschließende Behandlung in einer insgesamt synergistischen Wirkung oder sogar einer totalen Remission bzw. Heilung resultiert.
Es wird nicht angenommen, daß ein bestimmter Tumortyp von den Behandlungen unter Anwendung der vorliegenden Erfindung ausgenommen werden sollte. Es versteht sich, daß die vorliegende Methodologie weit oder allgemein auf die Behandlung aller festen Tumore anwendbar ist, unabhängig vom jeweiligen Phänotyp oder Genotyp der Tumorzellen selbst. Die Art von Tumor kann jedoch bei der Anwendung der Erfindung in Kombination mit sekundären therapeutischen Mitteln von Belang sein.
Dem Durchschnittsfachmann wird einleuchten, daß bestimmte Tumortypen gegenüber der Induktion von Tumorstasis, -regression und sogar -nekrose unter Anwendung der vorliegenden Erfindung zugänglicher sind. Dieses Phänomen wird bei Versuchstieren beobachtet und kann auch bei der Behandlung von Menschen auftreten. Solche Erwägungen werden bei der Durchführung sowohl der präklinischen Studien mit Versuchstieren als auch bei der Optimierung der Dosierung für den Einsatz bei der Behandlung eines bestimmten Patienten oder einer bestimmten Patientengruppe in Betracht gezogen.
Wie hier ausführlich aufgezeigt, gibt es realistische Ziele, die als Richtlinie in Zusammenhang mit den präklinischen Tests vor dem Fortschreiten zur klinischen Behandlung dienen können. Dies ist jedoch eher eine Frage des Kosten-Nutzen-Verhältnisses als der allgemeinen Nützlichkeit, und ein Mechanismus zur Auswahl der vorteilhaftesten Verbindungen und Dosierungen. Was den allgemeinen Nutzen betrifft, so wird jedes Konstrukt oder jede Kombination von Konstrukten, das/die zu beständigen Antitumorwirkungen führt, immer noch als eine nützliche Erfindung definiert. Es versteht sich, daß selbst unter Umständen, in denen die Antitumorwirkungen der vorliegenden Zusammensetzungen und der Kombinationen davon am unteren Ende des Bereichs liegen, es immer noch möglich ist, daß diese Therapie genauso wirksam oder sogar wirksamer ist als alle anderen bekannten Therapien für das betreffende Tumortarget. Es ist dem klinisch tätigen Arzt leider bewußt, daß bestimmte Tumore nicht mittelfristig oder längerfristig wirksam zu behandeln sind, dies widerlegt jedoch nicht den Nutzen der vorliegenden Therapie, insbesondere wenn sie ungefähr genauso wirksam ist wie die anderen im allgemeinen vorgeschlagenen Therapien, oder wenn sie wirksam ist, nachdem alle herkömmlichen Strategien versagt haben. Es wird nicht davon ausgegangen, daß sich gegen diese Therapie eine Resistenz entwickeln kann.
Bei der Festlegung geeigneter Dosierungen der Mittel, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, und deren Kombinationen kann man einfach die hier beschriebenen Tierversuche extrapolieren, wodurch man zu für eine Verabreichung in der Klinik geeigneten Dosierungen kommt. Für diese Umrech nung würde man die Masse der verabreichten Mittel pro Masseneinheit des Versuchstiers berücksichtigen und weiterhin die Unterschiede zwischen der Körperoberfläche des Versuchstiers und des menschlichen Patienten berücksichtigen. Alle diese Berechnungen sind dem Durchschnittsfachmann gut geläufig und können routinemäßig von ihm durchgerührt werden. Dementsprechend ziehen die Erfinder unter Anwendung der hier bereitgestellten Informationen in Betracht, daß nützliche Tagesdosen der Mittel, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, wie z. B. Tetrathiomolybdat, bei einer Verabreichung an Menschen zwischen 20 Milligramm und 200 Milligramm pro Patient pro Tag liegen würden. Trotz dieses angegebenen Bereichs versteht sich, daß gemäß den oben aufgerührten Parametern und den ausführlichen Anweisungen weitere Variationen bei den wirksamen Bereichen bzw. optimalen Bereichen dennoch in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen würden.
Die in Betracht gezogenen Tagesdosen liegen daher im allgemeinen zwischen 20 mg und 180 Milligramm, zwischen 130 mg und 200 Milligramm, zwischen 25 und 160 Milligramm, zwischen 50 und 150 Milligramm, zwischen 150 und 180 Milligramm, zwischen 30 und 125 Milligramm, zwischen 40 und 100 Milligramm, zwischen 35 und 80 Milligramm, zwischen 140 und 190 Milligramm, zwischen 20 und 65 Milligramm, zwischen 125 und 195 Milligramm, zwischen 30 und 50 Milligramm, zwischen 150 und 200 Milligramm, oder in einem bestimmten Bereich eines der oben aufgeführten beispielhaften Dosen oder einem Zwischenwert zwischen den bestimmten angegebenen Bereichen.
Wenngleich Dosen im Bereich von etwa 60-120 mg gegenwärtig für bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind und Dosen im Bereich von etwa 125-200 mg gegenwärtig für andere Ausrührungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, versteht sich, daß niedrigere Dosen besser für Kombinationen mit anderen Mitteln oder unter Erhaltungsbedingungen geeignet sein könnten, und daß auch höhere Dosen vertragen werden können, insbesondere angesichts der Tatsache, daß die für eine Verwendung in der Erfindung vorgesehenen Mittel, die Kupfer binden und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bilden, selbst nicht cytotoxisch sind, und selbst wenn gewisse Nebenwirkungen auftreten sollten, so sollte dies nicht zwingend zu einer Toxizität führen, der nicht durch normale homeostatische Mechanismen entgegengewirkt werden kann, wobei davon ausgegangen wird, daß dies das Risiko einer signifikanten Toxizität in gesunden Geweben senken sollte.
Bei bestimmten bevorzugten Ausrührungsformen der vorliegenden Erfindung werden den Patienten etwa 2 Wochen lang tägliche Initialdosen zwischen 130 mg oder 150 mg bis 180 mg oder 200 mg verabreicht, gefolgt von täglichen Erhaltungsdosen zwischen 30 mg oder 40 mg und 60 mg oder 70 mg, oder Werten, die zwischen den bestimmten angegebenen Bereichen liegen. So wird von den Erfindern bei bestimmten Aspekten der Erfindung die Verabreichung von Initialdosen von mehr als etwa 125 mg, mehr als etwa 130 mg, mehr als etwa 140 mg, mehr als etwa 150 mg, mehr als etwa 155 mg, mehr als etwa 160 mg, mehr als etwa 170 mg, mehr als etwa 175 mg, mehr als etwa 180 mg, mehr als etwa 190 mg oder mehr als etwa 200 mg bis zu den hier beschriebenen Maximaldosen etwa 1 Woche, etwa 2 Wochen, etwa 3 Wochen oder etwa 4 Wochen lang oder so als beispielhafte tägliche Initialdosen in Betracht gezogen, gefolgt von Erhaltungsdosen von etwa 20 mg, etwa 25 mg, etwa 35 mg, etwa 40 mg, etwa 50 mg, etwa 55 mg, etwa 65 mg, etwa 75 mg, etwa 80 mg oder etwa 90 mg.
Im allgemeinen wird beabsichtigt, mit den Therapieprotokollen der vorliegenden Erfindung eine maximale Antitumorwirkung zu bewerkstelligen und gleichzeitig die Dosis unter den mit einer unannehmbaren Toxizität assoziierten Konzentrationen zu halten. Zusätzlich zum Variieren der Dosis selbst kann man das Verabreichungsprotokoll auch anpassen, um die Behandlungsstrategie zu optimieren. Bei einer gegenwärtig bevorzugten Behandlungsstrategie verabreicht man zwischen 20 Milligramm und 200 Milligramm des Mittels, das Kupfer bindet und einen Dreierkomplex aus Mittel, Kupfer und Protein bildet, oder einer Kombination davon, etwa 3-, etwa 4-, etwa 5- bis etwa 6mal täglich oder häufiger, ungefähr bei der Hälfte mit den Mahlzeiten und ungefähr bei der Hälfte zwischen den Mahlzeiten. Bei der Verabreichung der bestimmten Dosen selbst würde man dem Patienten eine pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung vor zugsweise systemisch zur Verfügung stellen. Eine orale Verabreichung wird im allgemeinen bevorzugt.

VI. Andere durch aberrante Angiogenese gekennzeichnete Krankheiten

Zusätzlich zur Prävention oder der Behandlung von Krebs und festen Tumoren kann man die hier offenbarten Thiomolybdatzusammensetzungen auch zur Prävention oder Behandlung anderer mit aberranter Vaskularisierung assoziierter Krankheiten einschließlich Arthritis, Diabetes, Arteriosklerose, arteriovenösen Fehlfunktionen, Neovaskularisierung bei Hornhautübertragungen, verzögerter Wundheilung, diabetischer Retinopathie, altersbedingter Makuladegeneration, Granulation, Verbrennungen, hämophilen Gelenken, rheumatoider Arthritis, hypertrophen Narben, neovaskulärem Glaukom, Brüchen mit Pseudoarthrosebildung, Osier-Weber-Syndrom, Psoriasis, Granuloma pyogenicum, retrolentaler Fibroplasie, Pterygium, Skleroderm, Trachom, vaskulärer Adhäsion, okularer Neovaskularisierung, durch Parasiten ausgelöster Krankheiten, Hypertrophie nach Operationen und der Inhibierung von Haarwachstum, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt, einsetzen.
Makuladegeneration ist der herkömmliche Name für die altersbedingte Krankheit, bei der die Pigmentepithelzellen der Makula der Netzhaut weniger gut als normal funktionieren. Als Ergebnis wird die Ausschleusung von Abfallprodukten aus den Zäpfchen und die Versorgung der Zäpfchen mit Nährstoffen beeinträchtigt, was zu einem Verlust der zentralen Sehkraft führt. Die Makuladegeneration kann weiter in zwei Varianten eingeteilt werden: die vom "trockenen Typ" und die vom "feuchten Typ". Makuladegeneration vom trockenen Typ tritt auf, wenn die äußeren Segmente der lichtempfindlichen Zäpfchen, die kontinuierlich abgestoßen werden, nicht mehr von der Pigmentepithelschicht der Makula abgebaut werden können. Als Folge schwillt die Pigmentepithelschicht an und stirbt ab, wenn sich zuviel unverdautes Material aus den Zäpfchen angesammelt hat. Unter der Netzhaut zwischen Aderhaut und Pigmentepithel bauen sich schrittweise gelbliche Ablagerungen dieser Abfallprodukte auf. Bei dieser Makuladegeneration vom "trockenen Typ" ist der Sehverlust durch ein schrittweises Eintrüben oder eine partielle Verdunkelung der zentralen Sehkraft als Resultat des beginnenden Absterbens von Teilen der Makula gekennzeichnet, wodurch Regionen entstehen, in denen die Zäpfchen nicht länger ihre Funktion erfüllen. Klinisch kann eine an diesem Typ der Krankheit leidende Person eine relativ geringfügige Verzerrung der zentralen Sehkraft erfahren, bei der gerade Linien gebogen oder wellenförmig erscheinen.
Beim zweiten Typ dieser Erkrankung, dem "feuchten" Typ, kann ein schwerwiegenderer und plötzlicher Verlust der Sehkraft erfolgen. Dies tritt ein, wenn aus der Aderhaut anormale neue Blutgefäße oder "neovaskuläre Membranen" durch das geschädigte Pigmentepithel und unterhalb der Makula wachsen. Diese neovaskulären Membranen sind brüchig und neigen dazu zu bluten, was eine schwere Verformung des Makulagewebes zur Folge hat. Im Ergebnis werden die lichtempfindlichen Zellen (die Zäpfchen) von ihrer Nährstoffquelle abgeschnitten und werden weiter geschädigt, da es aufgrund des langsamen Austritts von Blut zu einer Vernarbung kommt. Bei diesem Typ der Erkrankung kann es als Folge dieser mit den Blutungen verbundenen Änderungen schnell und ohne Vorwarnungen zu dunklen Flecken bzw. Löchern bei der zentralen Sehkraft kommen. Glücklicherweise kann ein frühes Eingreifen mittels Lasertherapie einen weiteren Verlust der Sehkraft verhindern.
Die altersbedingte Makuladegeneration (age-related macular degeneration, AMD) ist in den westlichen Ländern die Hauptursache des Verlusts der Sehkraft bei Erwachsenen mit einem Alter von 65 Jahren oder darüber. Obwohl die neovaskuläre AMD nur 10% aller Fälle ausmacht, sind 80 bis 90% aller Fälle von amtlich bestätigter Erblindung auf diese Krankheit zurückzuführen, und bei der Population dieses Alters ist es die häufigste Ursache einer Neovaskularisierung der Aderhaut (choroidal neovascularization, CNV). Die zu CNV rührenden pathologischen Veränderungen betreffen die komplexen Gewebe in der Choriocapillaris, der Bruch-Membran und des Pigmentepithels der Netzhaut (retinal pigment epithelium, RPE), wobei die neurosensorische Netzhaut sekundär betroffen ist. Im Grunde kann jede Erkrankung, die eine Veränderung des Pigmentepithels der Netzhaut und der Bruch-Membran herbeiführt, CNV verursachen.
Mit CNV sind neben AMD noch eine Reihe verschiedener anderer Erkrankungen in Zusammenhang gebracht worden, einschließlich okularem Histoplasmosesyndrom (POHS), pathologischer Kurzsichtigkeit, blutgefäßähnlichen Streifen und idiopathischen Ursachen. Die meisten histopathologischen Studien wurden an Augen mit AMD durchgerührt. Das histopathologische Merkmal, daß vielen Augen, in denen sich CNV entwickelt, gemein ist, ist ein Bruch in der Bruch-Membran. Die kapillarähnliche Neovaskularisierung geht von den Gefäßen der Aderhaut aus und dringt durch diese Brüche. Die altersbedingte Makuladegeneration ist für die größte Gruppe der Patienten mit CNV verantwortlich. Die meisten symptomatischen CNV sind subfoveal und zeigen eine extrem schlechte Prognose bei Nichtbehandlung. Subfoveale Neovaskularisierung ist definiert als Läsionen, die unter dem geometrischen Zentrum der fovealen avaskulären Zone (FAZ) liegen. Bei unbehandelten Augen, die 2 Jahre lang in einer Makulaphotokoagulationsstudie (MPS) untersucht wurden, hatten am Ende nur 5% eine Sehschärfe, die besser als 20/100 war, während 88% am Ende eine Sehschärfe von 20/200 oder schlechter aufwiesen.
Die Therapie der Neovaskularisierung der Aderhaut beruht hauptsächlich auf der Laserphotokoagulation. Mit einer Reihe von gut durchgeführten, randomisierten, prospektiven klinschen Studien wurde in der MPS festgestellt, daß bei verschiedenen Rahmenbedingungen eine Photokoagulation bei CNV der bloßen Beobachtung überlegen ist. Es wurde insbesondere gefunden, daß die Behandlung von extrafovealen und juxtafovealen neovaskulären Membranen bei AMD und anderen Erkrankungen durch Photokoagulation im Vergleich zur nicht behandelten Gruppe vorteilhaft war. Um jedoch die gesamte von CNV betroffene Region behandeln zu können, muß der Ophthalmologe dazu in der Lage sein, die Grenzen der neovaskulären Membran der Aderhaut zu definieren. Eine Behandlung ist daher nur angezeigt, wenn die Grenzen der CNV genau abgesteckt sind. Leider sind okkulte oder schlecht definierte neue Gefäße das bei der Untersuchung von exudativen Makulaläsionen bei AMD am häufigste Muster. Bei einer Studie lagen lediglich bei 23% der zur Behandlung vorgesehenen Augen sichtbare bzw. klassische neovaskuläre Membranen vor. Die von der MPS vor kurzem vorgelegten Ergebnisse für die Photokoagulation von subfovealen neovaskulären Läsionen bei AMD zeigten die Vorteile der Laserbehandlung, die Unterschiede zwischen den Behandlungs- und Beobachtungsgruppen waren jedoch gering und traten erst nach zwei bzw. fünf Jahren in Erscheinung. Weiterhin kam es, da die Laserenergie sowohl die Netzhaut als auch die unter der Netzhaut liegende Membran zerstört, zu einer behandlungsbedingten Abnahme der Sehschärfe. Diese Resultate unterstreichen sowohl die schlechte Prognose bei Nichtbehandlung als auch die Grenzen der Photokoagulation als Mittel zur Behandlung.
Andere Krankheiten, die mit einer Neovaskularisierung der Hornhaut assoziiert werden, schließen epidemische Keratokonjunktivitis, Vitamin-A-Mangel, zu langes Tragen von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, Keratitis des oberen Perikornealrings, Pterygium keratitis sicca, Sjögren-Syndrom, Acne rosacea, Phylectenulose, Syphilis, Infektionen durch Mycobakterien, Lipiddegeneration, chemische Verbrennungen, von Bakterien oder Pilzen verursachte Geschwüre, Herpes-simplex-Infektionen, Herpes-zoster- Infektionen, Infektionen durch Protozoan, Kaposi-Sarkom, Mooren-Ulkus, marginale Degeneration (Terrien), marginale Keratolyse, rheumatoide Arthritis, Lupus systemis, Polyarteritis, Trauma, Wegners-Sarkoidose, Skleritis, Steven-Johnson-Krankheit, periphigoide radiale Keratotomie und Abstoßung eines Hornhauttransplantats ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Mit einer Neovaskularisierung der Netz- und/oder Aderhaut assoziierte Krankheiten schließen diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, Sichelzellanämie, Sarkoid, Syphilis, Pseudoxanthoma elasticum, Morbus Paget, Venenverschluß, Arterienverschluß, Karotisstenose, chronische Uveitis/Vitritis, Infektionen durch Mycobakterien, Lyme-Borreliose, systemischer Lupus erythematodes, Frühgeborenenretinopathie, Eales-Krankheit, Bechets-Krankheit, retinitis- oder choroditisverursachende Krankheiten, Verdacht auf okulare Histoplasmose, Best-Krankheit, Kurzsichtigkeit, Augentrichter, Stargardt-Syndrom, Pars planitis, chronische Netzhautablösung, Hyperviskositätssyndrome, Toxoplasmose, Trauma und Komplikationen nach Lasereingriffen ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Zu anderen Krankheiten gehören Krankheiten, die mit Rubeosis (Neovaskularisierung des Winkels) verbunden sind, und Krankheiten, die durch die anormale Proliferation von fibrovaskulärem oder fibrösem Gewebe verursacht werden, einschließlich aller Formen proliferativer Vitreoretinopathie, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Eine andere Krankheit, von der man annimmt, daß dabei Angiogenese eine Rolle spielt, ist rheumatoide Arthritis. Rheumatoide Arthritis ist durch diffuse, noduläre Infiltration mononuklearer Zellen und eine massive Hyperplasie der stromalen Bindegewebe, die fibroblastenähnliche Zellen und neue Blutgefäße umfassen, gekennzeichnet. Die Blutgefäße in der synovialen Auskleidung der Gelenke durchlaufen eine Angiogenese. Zusätzlich zur Ausbildung neuer Gefäßnetzwerke setzen die Endothelzellen Faktoren und reaktive Sauerstoffspezies frei, die zum Wachstum des Unterhautfettgewebes und der Zerstörung des Knorpels führen. Die an der Angiogenese beteiligten Faktoren können aktiv zum chronisch entzündeten Zustand bei rheumatoider Arthritis beitragen und dessen Aufrechterhaltung unterstützen.
Auch bei Osteoarthritis können mit Angiogenese assoziierte Faktoren eine Rolle spielen. Die Aktivierung der Chondrozyten durch mit Angiogenese in Zusammenhang stehende Faktoren trägt mit zur Gelenkzerstörung bei. In einem späteren Stadium würden die angiogenen Faktoren die Knochenneubildung fördern. Weiterhin kann die chronische Entzündung mit einer pathologischen Angiogenese zusammenhängen. Bei Erkrankungen wie Colitis ulcerosa und Morbus Crohn zeigen sich histologische Veränderungen, bei denen neue Blutgefäße in die entzündeten Gewebe eindringen. Bei Bartonellose, einer in Südamerika vorkommenden bakteriellen Infektion, kann ein chronisches Stadium auftreten, daß durch die Proliferation vaskulärer Endothelzellen gekennzeichnet ist. Eine andere mit Angiogenese in Zusammenhang stehende pathologische Rolle findet man bei Atherosklerose. Es wurde gezeigt, daß die im Lumen der Blutgefäße gebildeten Plaques eine die Angiogenese stimulierende Wirkung haben.

VII. Wilson-Krankheit

A. Hintergrund

Bei Wilson-Krankheit handelt es sich um eine autosomal rezessive Störung des Kupferstoffwechsels. Bei dieser Erkrankung scheint die Ausscheidung des Kupfers in die Galle gestört zu sein, und in der Leber kommt es zu einem verminderten Einbau von Kupfer in Ceruloplasmin, was eine Kupferanreicherung im Plasma und in den meisten Körpergeweben zur Folge hat. Wilson-Krankheit führt gewöhnlich zu einer hepatischen oder neurologischen Dysfunktion.
Die Therapie von Wilson-Krankheit läßt sich in zwei breite Kategonen einteilen (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a). Hierbei handelt es sich um die Initialtherapie bei akut erkrankten Patienten und die Erhaltungstherapie. Die Initialtherapie ist die Zeitspanne, während der ein sich neu zur Behandlung eingefundener Patient noch an akuter Kupfertoxizität leidet, im allgemeinen die ersten Wochen bis Monate der Therapie. Die Erhaltungstherapie ist im wesentlichen der Rest des Lebens des Patienten bzw. die Zeitspanne, nachdem die Kupferkonzentrationen auf Werte unter dem Schwellenwert für Toxizität abgesenkt wurden und der Patient lediglich behandelt wird, um ein Wiederauftreten von Kupferanreicherung und Kupfertoxizität zu verhindern.
Zur Erhaltungstherapie von Wilson-Krankheit stehen gegenwärtig drei Arzneimittel zur Verfügung. Dies sind das am längsten zur Verfügung stehende Arzneimittel, Penicillamin (Walshe, 1956), ein als Trien bzw. Trientin bezeichnetes Arzneimittel, das für Penicillamin-intolerante Patienten entwickelt wurde (Walshe, 1982), und Zinkacetat (Brewer und Yuzbasiyan-Gurkan, 1992a, b; Brewer et al., 1983; Hill et al., 1987; Hill et al., 1986; Brewer et al., 1987b, c, d; Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1989; Brewer et al., 1989; Lee et al., 1989; Brewer et al., 1990; Brewer et al., 1991b; Brewer und Yuzbasiyan- Gurkan, 1989; Brewer et al., 1992a, b; Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1992; Brewer et al., 1993a, b, c, d; Brewer, 1993; Hoogenraad et al., 1978; Hoogenraad et al., 1979; Hoo genraad et al., 1987). Zink sorgt für eine wirksame Erhaltungstherapie mit einer sehr geringen Toxozität.
Etwa 2/3 der Patienten mit Wilson-Krankheit zeigen Symptome, die mit dem Hirn verbunden sind (Brewer et al., 1992a; Scheinberg und Sternlieb, 1984; Danks, 1989). Hierbei kann es sich um neurologische Symptome, die anfangs psychiatrischer Natur und später neurologisch sind, handeln. Die Therapie dieser Patienten ist keineswegs so klar wie bei Patienten in der Erhaltungsphase. Die Erfinder haben gefunden, daß sich bei ungefähr 50% dieser Patienten bei einer Behandlung mit Penicillamin der Zustand verschlimmert und nicht verbessert (Brewer et al., 1987a). Die Hälfte dieser Patienten, bei denen sich der Zustand verschlimmert hat, d. h. etwa 25% der Originalstichprobe, erholen sich nie wieder auf den der Penicillaminbehandlung vorausgehenden Baselinewert. In anderen Worten, das Penicillamin hat eine zusätzliche Schädigung induziert.
Die Mechanismen dieser Verschlechterung sind nicht mit Sicherheit bekannt, wenngleich wahrscheinlich ist, daß es durch die Mobilisierung von Kupfer aus der Leber durch das Arzneimittel zu einer Erhöhung der Kupferspiegel im Hirn kommt. Die Erfinder haben gezeigt, daß dies im Rattenmodell vorkommen kann. Unabhängig davon, welcher Mechanismus letztendlich verantwortlich ist: Patienten mit neurologischen Symptomen stehen nach einer Initialbehandlung mit Penicillamin häufig wesentlich schlechter da. In der Tat ist es sogar so, daß es bei Patienten, die noch keine Symptome zeigen, nach einer Initialbehandlung mit Penicillamin zur Entwicklung einer neurologischen Erkrankung kommen kann (Glass et al., 1990; Brewer et al., 1994a). Es ist nicht bekannt, ob bei Trientin bei einer Verwendung als Initialtherapie das Phänomen einer Verschlechterung des neurologischen Zustands auftritt, da es in dieser Art von Situation nicht sehr häufig eingesetzt wird. Es würde nicht überraschen, wenn es in gewissem Grade zum Auftreten dieses Problems kommt, da sein Wirkungsmechanismus dem von Penicillamin ähnelt, es könnte jedoch sehr viel weniger stark ausgeprägt sein, da seine Wirkungen auf Kupfer etwas geringer auszufallen scheinen.
Zink ist für die Initialbehandlung dieses Typs von Patienten kein ideales Mittel. Die Wirkung von Zink setzt relativ langsam ein, und es bewirkt nur eine mäßige negative Kupferbilanz. Während der mehreren Monate, die Zink zum Absenken des Kupfers auf einen Wert unter dem Schwellenwert für Toxizität braucht, könnten die Patienten dem Risiko einer weiteren Kupfertoxizität und einer Verschlimmerung ihrer Krankheit ausgesetzt sein.

B. Ergebnisse der TM-Therapie

Die Erfinder haben über die letzten Jahre eine offene Studie zur Anwendung von TM bei der Initialtherapie von Patienten mit Wilson-Krankheit, die neurologische Symptome zeigen, durchgeführt. Zur Abschätzung der Stabilität und um sicherzustellen, daß das verabreichte Arzneimittel wirksam ist, haben die Erfinder sowohl spektrophotometrische als auch biologische Assays entwickelt (Brewer et al., 1991a; Brewer et al., 1994b). Das Arzneimittel verliert an der Luft langsam an Wirkung. Der Schwefel wird gegen Sauerstoff ausgetauscht, wodurch die Wirkung des Arzneimittels verlorengeht.
Mit den für den ersten untersuchten Patienten erhaltenen Ergebnissen können mehrere Punkte veranschaulicht werden. Die ersten sieben Tage lang erhielt der Patient TM ausschließlich mit Mahlzeiten (dreimal täglich mit den Mahlzeiten). Dies ergab die sofortige negative Kupferbilanz, die man vom ersten Wirkmechanismus (Blockade der Kupferresorption bei Verabreichung mit Mahlzeiten) erwarten würde. Nach den ersten sieben Tagen wurde TM auch zwischen den Mahlzeiten verabreicht (dreimal täglich mit den Mahlzeiten und dreimal täglich zwischen den Mahlzeiten). Dies rührte zu einem sofortigen Anstieg der Kupferkonzentration im Plasma, die man von dem Übergang von TM ins Blut erwarten würde, und der Bildung eines Komplexes aus Kupfer, TM und Albumin. Das mit TM und Albumin komplexierte Kupfer kann nicht von den Zellen aufgenommen werden und ist daher nicht toxisch (Gooneratne et al., 1981b). Das stöchiometrische Verhältnis von Molybdän und Kupfer in diesem Komplex ist 1 : 1. Wenn die Molybdänkonzentration im Blut und der Ceruloplasminspiegel (Ceruloplasmin enthält ebenfalls nichttoxisches Kupfer) bekannt sind, läßt sich berechnen, wieviel des Kupfers im Plasma weder an das eine noch an das andere gebunden ist. Dieses sogenannte "freie Kupfer" (das Nichtceruloplasminkupfer im Plasma) ist das potentiell toxische Kupfer. Ist der Wert auf Null reduziert, so ist die Kupfer-Molybdän-"Lücke" im Plasma geschlossen. Beim ersten Patienten wurden hierfür 16 Tage benötigt (9 Tage, nachdem mit der zusätzlichen Verabreichung von Dosen zwischen den Mahlzeiten begonnen worden war). Da das freie Kupfer im Hirn (und den anderen Organen) im Gleichgewicht mit dem Blut steht, wird durch die Absenkung des freien Kupfers im Blut auf ein niedriges Niveau der Prozeß der Absenkung des freien (toxischen) Kupfers im Hirn in Gang gebracht.
Mittlerweile sind von den Erfindern insgesamt 51 Patienten mit Wilson-Krankheit, die alle jeweils neurologische oder psychiatrische Krankheitssymptome zeigten, in einer offenen Studie mit TM behandelt worden. Die Diagnose aller dieser Patienten wurde jeweils nach Standardkriterien gestellt. Die Patienten hatten diagnostisch erhöhte Kupferkonzentrationen in der Leber oder im Urin, gewöhnlich beides. Einige waren vor dieser Untersuchung für kurze Zeit mit anderen Mitteln behandelt worden. Zwei Patienten zeigten psychiatrische, jedoch keine neurologischen Symptome.
Mit drei Ausnahmen zu Beginn der Studie erhielten alle Patienten eine Dosis von 20 mg dreimal täglich mit den Mahlzeiten, oder viermal täglich mit drei Mahlzeiten und einem Snack. Der einzige Unterschied zwischen einem Patienten, der 120 mg als Gesamtdosis erhielt, und einem, der 140 mg als Gesamtdosis erhielt, war also, daß der erstere dreimal täglich jeweils 20 mg, also 60 mg, mit den Mahlzeiten erhielt und der letztere viermal täglich jeweils 20 mg, also 80 mg, mit den Mahlzeiten und einem Snack erhielt. Der Rest der Tagesgesamtdosis wurde in drei gleiche Dosen aufgeteilt und zwischen den Mahlzeiten verabreicht.
Die Gesamttagesdosis schwankte zwischen den einzelnen Patienten beträchtlich von einem Maximalwert von 410 mg bis zu einem Minimalwert von 120 mg. Letztendlich war es den Erfindern nicht möglich, eine dosisabhängige Korrelation festzustellen, we der mit den Kupfervariablen noch mit den entweder während der Studie oder zu Zeitpunkten ein bzw. zwei Jahre nach der Studie gemessenen funktionellen Variablen.
Diesen Patienten wurde auch Zink verabreicht. Wann mit der Verabreichung von Zink begonnen wurde, schwankte stark und korrelierte nicht mit den Kupfervariablen, den Ergebnisvariablen oder der Toxizität. Eine früh einsetzende Zinktherapie sollte theoretisch dabei helfen, die Leberfunktion zu erhalten. Bei diesen Patienten war die Leberfunktion nach Jahr 1 wieder normal, da bei diesen Tests jedoch nicht das Ausmaß der Konservierung von Gewebe gemessen wurde, scheint es wahrscheinlich, daß das Zink in gewissem Grade von Nutzen war.
Zum Abschätzen der Auswirkung einer TM-Therapie auf den Kupferstoffwechsel bei Wilson-Krankheit ist es in gewissem Grade von Nutzen, das in Trichloressigsäure (TCE) lösliche Kupfer im Plasma zu bestimmen. Im allgemeinen ist bei diesen Patienten ein hoher Anteil des Plasmakupfers in TCE löslich (bei den Patienten durchschnittlich 56% - das entspricht 27 ug/dl). Das gesamte Nichtceruloplasminkupfer im Plasma ist TCE löslich, und eine in gewissem Grade schwankende Fraktion des Ceruloplasminkupfers ist ebenfalls TCE löslich. Da die Ceruloplasminspiegel bei Wilson-Krankheit gewöhnlich recht niedrig sind, ist das meiste Kupfer im Plasma TCE löslich. Das Kupfer im TM/Albumin/Kupfer-Komplex im Blut ist TCE-unlöslich. Mit dem Fortschreiten der Therapie nimmt die TCE-lösliche Fraktion des Kupfers im Plasma also ab. Während der letzten Stadien der TM-Therapie war der Durchschnittswert für die TCE-lösliche Fraktion des Kupfers im Plasma 15 ug/dl, eine signifikante Absenkung vom Ausgangswert von 27. Die TCE-lösliche Fraktion kann nicht als absoluter Endpunkt verwendet werden, beispielsweise bei Versuchen, sie auf Null zu bringen, da aufgrund des Plasmaceruloplasmins gewöhnlich eine kleine und in gewissem Grade schwankende lösliche Fraktion vorhanden ist. Die beträchtliche mittlere Absenkung von 27 auf 15 ug/dl zeigt jedoch die vorteilhafte Wirkung auf, die eine TM-Therapie auf den Status von potentiell toxischem Plasmakupfer bei diesen Patienten hat. Ein weiterer Beleg für die wünschenswerte Wirkung einer TM-Therapie auf den Kupfermetabolismus zeigt sich in der Absenkung der mittleren Kupferwerte im Urin während des späteren Teils der TM- Therapie, verglichen mit den Ausgangswerten.
TM hat eine schnelle und günstige Wirkung auf den Kupferstoffwechsel, wobei das potentiell toxische Kupfer im Blut und theoretisch auch im restlichen Körper abgesenkt wird. Das klinische Primärziel ist es, die Kupfertoxizität in den Griff zu bekommen, ohne daß dies zu einer klinischen Verschlimmerung führt. In anderen Worten, das Primärziel ist es, alle der zu Beginn der Therapie vorhandenen neurologischen Funktionen zu erhalten. Dies wurde wöchentlich durch quantitative neurologische Tests und Sprachprüfungen kontrolliert. Die Methodologie und das System für die neurologische Bewertungsskala wurden veröffentlicht (Young et al., 1986). In den Wochen, in denen eine Verabreichung von TM erfolgte und der Kupferstoffwechsel überwacht wurde, ist die neurologische Funktion, bewertet durch quantitative neurologische Prüfung, geschützt. Nur bei zwei Patienten (4% der Stichprobe) zeigte sich eine Veränderung von mehr als 5 Einheiten, dem Kriterium für eine signifikante Verschlimmerung.
Während der folgenden Jahre, in denen die Patienten der Erhaltungstherapie unterzogen wurden, wurde der zuvor durch Kupfer induzierte Hirnschaden zumindest teilweise repariert. Dies ist beispielsweise aus der partiellen Verbesserung der bei den Nachuntersuchungen in jährlichen Abständen gemessenen neurologischen Testergebnisse ersichtlich. Es ist klar, daß die langfristige Erholung bei der Initialtherapie mit TM ausgezeichnet ist und bei den meisten Patienten eine entscheidende neurologische Erholung beobachtet werden kann. Diese herausragenden Ergebnisse stehen im Gegensatz zur Penicillamintherapie. Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß bei etwa 50% der Patienten bei Behandlung mit Penicillamin zunächst eine Verschlimmerung eintritt, und daß bei der Hälfte von diesen, d. h. bei 25% der Originalstichprobe, der Baselinewert vor der Verabreichung von Penicillamin niemals wieder erreicht wird.
Die Tests während der ersten 8 Wochen der TM-Therapie durch quantitative Sprachprüfungen werden wie beschrieben (Brewer et al., 1996) durchgeführt. Während der Wochen, in denen TM verabreicht wird und der Kupferstoffwechsel überwacht wird, wird die durch quantitative Sprachprüfüngen gemessene neurologische Funktion kontrolliert. Bei keinem der Patienten kam es zu einer signifikanten Verschlechterung (um mehr als 2,0 Einheiten) der Testergebnisse. Während der folgenden Jahre, während der die Patienten einer Erhaltungstherapie unterzogen werden, wird der zuvor durch Kupfer induzierte Hirnschaden zum Teil wieder repariert. Dies wird beispielsweise durch die teilweise Erholung der Sprachtestergebnisse in den Jahren der Nachuntersuchung belegt. Die langfristige Erholung ist ausgezeichnet. Keiner der Patienten zeigte eine signifikant (mehr als 2,0 Einheiten) geringere Langzeitfunktion als zum Zeitpunkt des Therapiebeginns, und die meisten zeigten eine deutliche Verbesserung.
Bei diesen Patienten wurden zwei unerwünschte Wirkungen der TM-Therapie beobachtet. Bei der einen handelt es sich um eine reversible Anämie/Knochenmarkdepression, die bei sieben Patienten auftrat. Bei allen diesen Patienten kam es zu einem beträchtlichen Hämoglobinabfall, im Durchschnitt 3,4 g%. Bei drei der Patienten zeigte sich eine Abnahme der Thrombozytenzahl und bei vier der Patienten eine Abnahme der Leukozytenzahl, die beträchtlich hätte sein können. In allen sieben Fällen wurde TM abgesetzt. Von zwei der Patienten abgesehen erfolgte das Absetzen spät im 56tägigen TM- Behandlungregime.
Beim Einsetzen der Anämie hatten alle diese Patienten einen Plasma- Nichtceruloplasminkupferwert von Null und einen extrem niedrigen Wert an TCE- löslichem Kupfer. Letzerer betrug bei diesen Patienten 2,7, während der Durchschnittswert für diese Variable in der gesamten Patientengruppe am Anfang 27 und während des Höhepunkts der Therapie 15 betrug. Es wurde geschlußfolgert, daß die Ursache für die Anämie/Knochenmarkdepression der Mangel von Kupfer im Knochenmark war. Da Kupfer für die Hämsynthese und andere Schritte der Zellproliferation erforderlich ist, ist zu erwarten, daß Anämie und Auswirkungen auf das Knochenmark die ersten Anzeichen eines Kupfermangels wären. Diese Folge von Kupfermangel ist ein gut bekanntes Phänomen.
Diese unerwünschte Reaktion auf TM ist keine Nebenwirkung, sondern vielmehr eine Folge einer Überbehandlung. Es mag vielleicht überraschend sein, daß es möglich ist, selbst einen lokalisierten Kupfermangel im Knochenmark innerhalb einer solch kurzen Zeitspanne bei Wilson-Krankheit, einer Krankheit, bei der der Körper mit Kupfer überladen ist, zu bewirken. Diese Reaktion auf TM ist einzigartig. Keines der anderen Arzneimittel gegen Kupfer ist dazu in der Lage, diese Wirkung im Frühstadium der Therapie hervorzurufen. Dies spricht für die Wirksamkeit von TM und die Schnelligkeit, mit der es möglich ist, die Kupferspiegel unter Kontrolle zu bringen. Es scheint weiterhin wahrscheinlich, daß das Knochenmark in besonderer Weise auf Plasmakupfer angewiesen ist, und daß dies der erste Pool ist, der auf ein sehr niedriges Niveau abgesenkt wird. Bei einer Dosis von 180 mg/Tag oder mehr kam es bei 6 von 37 Patienten zu einer Überbehandlung. Bei einer Dosis von 150 oder darunter zeigte nur 1 von 13 Patienten eine Überbehandlung, und dies trat sehr spät auf (an Tag 53 im 56-Tage-Protokoll).
Die zweite unerwünschte Wirkung der TM-Therapie bei diesen Patienten ist eine Erhöhung der Transaminasewerte bei vier der Patienten. Die AST- und ALT-Werte im Serum waren erhöht. Aufgrund dieser erhöhten Werte wurde die TM-Therapie bei einem Patienten abgebrochen. Während dieser erhöhten Werte ist im Gegensatz zum allgemeinen Trend in anderen Patienten, bei denen sie abnimmt, die Kupferkonzentration im Urin erhöht. Diese Daten stützen das Konzept, daß eine Hepatitis auftritt, wobei aus den geschädigten Hepatozyten Kupfer freigesetzt wird. Es ist nicht klar, warum diese Hepatitis auftritt. Bei Patienten mit Wilson-Krankheit, die nicht behandelt werden, findet man in der Anamnese jedoch Hepatitisepisoden. Da kaum Beobachtungsergebnisse von unbehandelten Patienten nach Stellen der Diagnose vorliegen, gibt es keine guten Informationen darüber, wie häufig Episoden mit erhöhten Transaminasewerten beim unbehandelten Verlauf der Krankheit auftreten.
Alternativ dazu könnte es sein, daß TM in einigen Fällen das Kupfer aus der Leber schneller mobilisiert, als es wieder entfernt werden kann, wobei in diesem Fall die Patienten so einzustufen sind, daß sie Nebenwirkungen der Behandlung zeigen. Hiergegen spricht die Beobachtung in Schafen mit Kupfervergiftung, bei denen akute Hepatitis, Lebernekrose und hämolytische Anämie schnell durch hochdosiertes TM korrigiert werden können. Alle dieser vier Patienten wurden mit 150 mg TM/Tag oder mehr behandelt. Keiner der mit 150 mg oder weniger behandelten Patienten zeigte diese Reaktion. Andere Nebenwirkungen von TM wurden nicht beobachtet.
Mit den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufgezeigt.

BEISPIEL 1

Wirkung von TM auf die zelluläre Toxizität

Normale und neoplastische Zellen in Kultur erhalten ihre Nährstoffe durch den Transport und die Verwendung von Molekülen aus den Medien in das Innere der Zelle. Dieser Vorgang läuft unabhängig vom Wachstum der Blutgefäße ab, und daher sollte TM über einen weiten Konzentrationsbereich keine Wirkung auf die Zellwachstumsraten und die Lebensfähigkeit der Zellen haben, bis eine TM-Konzentration erreicht wird, die für die meisten Zellen toxisch ist. Einer der zur Toxizität führenden Mechanismen ist die Absenkung der Konzentrationen an freiem Kupfer auf Werte unter denen, die für die Grundfunktionen der Zelle benötigt werden. Bei TM-Konzentrationen über dieser toxischen Konzentration können aufgrund der zellulären Toxizität von TM weder normale noch neoplastische Zellen überleben.
Dies wurde in einem Zytotoxizitätsassay mit MML-Zellen (Prostatakrebs) und Brustkrebszellen bestätigt. Nach dem Ausplattieren gleicher Anzahlen der Zellen in Medien mit verschiedenen Konzentrationen an TM im Bereich von 0,001 uM bis 1 mM wurde bei dem in vivo angewandten Konzentrationsbereich keine Toxizität beobachtet. Wurde die TM-Konzentration von 1 ug/ml auf 10 ug/ml erhöht, so nahm der Anteil lebensfähiger Zellen steil von 100% auf 15% ab. TM wird daher nicht für eine Verwendung als direktes zytotoxisches Mittel in Betracht gezogen, da klar ist, daß es bei den für eine zytotoxische Wirkung erforderlichen sehr hohen Dosen zu einem Absterben sowohl der Tumorzellen als auch normaler Zellen kommen würde. Die Serum-TM- Konzentrationen, die benötigt werden, um wirksame Entkupferungskonzentrationen zu erhalten, liegen um einen Faktor von 100 bis 500 unter den Schwellwerten, die lethal auf Zellen wirken. Bei Anwendung von Dosierungen, die in Mäusen und Menschen mit Wilson-Krankheit eine Entkupferung bewirkten, verursachte TM keine klinisch in Erscheinung tretende direkte Zelltoxizität.

BEISPIEL 2

Einsatz von TM in präklinischen Antikrebsstudien mit Mäusen

Die Erfinder machen geltend, daß es, um die Angiogenese in signifikanter Weise zu hemmen und das Tumorwachstum anzuhalten, erforderlich ist, ein größeres Ausmaß an Kupfermangel zu erzielen als zuvor. Dies bedeutet, daß man zusätzlich zu einer Abnahme der Tumormasse auch ein längeres Überleben oder eine Regression des Tumors beobachten würde. Bei den unten beschriebenen Studien, bei denen gegen Kupfer gerichtete Ansätze zur Inhibierung von Tumorwachstum in Nagetieren angewendet wurden, wurden die von Spurenelementstudien an Menschen und Tieren im allgemeinen und von Studien mit Kupfer insbesondere abgeleiteten Richtlinien (Dick und Bull, 1945; Miller und Engel, 1960; Macilese Ammennan et al., 1969; Mills et al., 1958; Cox et al., 1960; Dick et al., 1975; Mason, 1990; McQuaid und Mason, 1991; Mills et al., 1981a; Mills et al., 1981b; Bremner et al., 1982; Gooneratne et al., 1981a, b; Jacob et al., 1981) nicht voll berücksichtigt.
Im Gegensatz dazu wurde bei der vorliegenden Erfindung TM eingesetzt, das wirksamste bekannte Mittel gegen Kupfer. Bei der Aufstellung von Algorithmen, mit denen die Kupferkonzentrationen wirksam gesenkt werden konnten, kamen die umfassenden Erfahrungen der Erfinder mit der Anwendung von Zink zur Behandlung von Sichelzellanämie (wobei von den Erfindern die ersten Fälle in Menschen mit zinkinduziertem Kupfermangel beschrieben wurden; Brewer et al., 1983), mit Zink als gegen Kupfer gerichtete Behandlung bei Wilson-Krankheit (Brewer et al., 1989; Brewer, 1995a) und mit TM bei der gegen Kupfer gerichteten Initialbehandlung von Wilson-Krankheit (Brewer et al., 1983; Brewer, 1992; Brewer et al., 1994b; Brewer et al., 1995b) zum Tragen. Als diejenigen, die TM für eine klinische Entwicklung entwickelten, haben die Erfinder beträchtliche Erfahrungen mit TM sowohl in Tieren als auch Menschen erworben.

A. Injektion von Tumorzellen in C567B1/C6-Mäuse

Gemäß diesen Richtlinien wurden therapeutische Antiangiogenesestudien mit TM in einem Mäusetumormodell durchgeführt. Bei dieser Studie wurden Tumorzellen subkutan oder intramuskulär in junge erwachsene C57B1/6 J-Mäuse injiziert. Es wurden zwei Tumore verwendet, ein Mäusesarkom (MCA205) und ein Mäusemelanom (B16B16). Die MCA205-Tumorzellensuspension wurde subkutan in C57B16-Mäuse injiziert. Sobald die Tumore tastbar waren, wurde bei der Hälfte der Tiere mit TM ein Kupfermangel induziert, wobei über die Cp-Konzentrationen der Kupferstatus verfolgt wurde. Die andere Hälfte wurde scheinbehandelt. Das Tumorwachstum zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und Mäusen, die mit ausreichend TM behandelt worden waren, um die Cp-Konzentration auf etwa 10% der normalen Kontrollen zu senken, wurde verglichen.
Mit TM wurde eine signifikante Wirkung bei der Verminderung der Wachstumsrate der Tumore und der Verminderung der Tumorendgröße und des Tumorendgewichts erzielt. Während des relativ kurzen Beobachtungszeitraums (16 Tage) war das Tumorwachstum durch die Behandlung verlangsamt, wenn auch nicht angehalten. Die Tumore in den TM-behandelten Mäusen wogen signifikant weniger als die Tumore in den Kontrollmäusen, standardisiert auf das Gesamtgewicht des Tieres. Die Ergebnisse für die beiden Tumortypen waren ähnlich. TM reduziert somit das Tumorwachstum und die Tumormasse, vermutlich über seinen Antiangiogenesemechanismus, da bei den angewendeten Dosierungen keine zytotoxischen Wirkungen auftreten.
Dieser experimentelle Ansatz läßt sich jedoch aus den folgenden Gründen zur Bewertung der potentiellen Wirksamkeit von TM als Antitumormittel noch weiter verbessern: 1) In der Maus können Tumore über 1 cm zu einer lebensbedrohenden Last werden und fangen häufig an zu eitern. Sowohl in Mäusen als auch in Menschen sind es jedoch Tumore dieser Größe und größer, die für ein weiteres Wachstum am meisten auf Angiogenese angewiesen sind; und 2) bei der Maus ist die Zeitspanne vom Nachweis eines Tumors mit einer Größe von 2-3 mm bis zu dem Zeitpunkt, wenn der Tumor eine Größe von 1,5 cm erreicht hat, relativ kurz - lediglich einige Tage. Weil Zeit benötigt wird, um der Tumormasse das Kupfer zu entziehen (insbesondere da die meisten Tumore hohe Mengen an Kupfer speichern), könnte der Tumor, bevor ein nahezu vollständiger Kupfermangel erreicht wird, eine beträchtliche Angiogenese aus seinen eigenen Speichern unterstützen.

B. Transgene HER2-neu-Mäuse

Es wurde daher ein Tierprotokoll entworfen, mit dem die Wirksamkeit von TM bei der Verzögerung bzw. Prävention klinisch evidenter Tumore in krebsanfälligen weiblichen transgenen HER2-neu-Mäusen (Guy et al., 1992; Muller et al., 1988) getestet werden sollte. Diese Mäuse sind bei der Geburt und in ihrer Kindheit normal, aufgrund des Transgens entwickeln jedoch einhundert Prozent dieser Mäuse im Alter von 4 bis 8 Monaten (Medianwert 205 Tage) Brusttumore (Guy et al., 1992). Ein Hauptgrund für die Wahl dieses Modells ist, daß der natürliche Verlauf bei diesen Mäuse-Brusttumoren dem klinischen Verhalten von unbehandeltem Brustkrebs bei Menschen erstaunlich ähnlich ist. Die Tumore in den HER2-neu-Mäusen entwickeln sich nach einer langen Latenzzeit (von der nun bekannt ist, daß sie wahrscheinlich auf eine Mutagenese des Transgens und nicht auf Überexprimierung zurückzuführen ist), und sie verbleiben primär lokal-regional, bis sie eine beträchtliche Größe (häufig > 2,5 cm) erreicht haben, und metastasieren dann vor allem in die Lunge. Es wurden der Zeitpunkt des Auftretens der Tumore und die Qualität und Quantität der Tumorgefäße zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppen verglichen.
Nachdem 3 weibliche transgene Stammäuse mit 3 männlichen transgenen Mäusen gekreuzt worden waren, wurde die weibliche Nachkommenschaft in 2 Gruppen eingeteilt: die eine Gruppe bestand aus 15 Mäusen, die behandelt wurden, und die andere Gruppe aus 22 Kontrolltieren. Es wurde der Prozentsatz der krankheitsfreien Mäuse in der nicht behandelten Kontrollgruppe mit einer Gruppe der gleichen transgenen Mäuse verglichen, die über eine Schlundsonde täglich mit 0,5-1,0 mg TM behandelt wurden, wobei mit dieser Behandlung im Alter von 100 Tagen begonnen wurde. Die Behandlung mit TM wurde ungefähr 80-100 Tage, bevor die Tumore klinisch in Erscheinung getreten wären, begonnen, so daß die Tiere während der gesamten Hauptentwicklungsperiode des Tumors, wenn eine Angiogenese erstmals erforderlich wäre, an Kupfermangel leiden. Hierdurch hindert man die Tumore daran, große Mengen an Kupfer zu speichern, mit denen dann eine Angiogenese selbst bei fallendem Gesamtkörperkupfer aufrechterhalten werden könnte.
Bei einer medianen Nachuntersuchungsperiode von 260 Tagen hatten sich bei keiner der TM-behandelten Mäuse klinisch offensichtliche Tumore entwickelt, während im Verlauf der gleichen Nachuntersuchungsperiode bei 70% der Kontrolltiere Tumore in Erscheinung getreten waren (Abb. 1). Im Alter von 218 Tagen hatten sich bei fünfzig Prozent der Kontrollmäuse klinisch offensichtliche Tumore entwickelt (p < 0,02). Während die Kontrolltiere ab einem Alter von 153 Tagen begannen, Tumore zu zeigen, zeigten die mit TM behandelten Tiere, bis die TM-Therapie abgebrochen und die Kupferkonzentrationen wieder ansteigen gelassen wurden, keine Tumore (p < 0,0146). Die Kontrolle der Kupferspiegel im Blut der Behandlungsgruppe mittels des Ersatzindikators Ceruloplasmin (Cp) zeigte, daß das Cp auf unter 40% des Ausgangswertes abgenommen hatte (Abb. 2). Bei diesem Mäusestamm wurde keine Anämie beobachtet, wenn das Kupfer auf dieses Niveau abgesenkt wurde. Einer separaten Gruppe von 4 Behandlungstieren wurden 2-4 Wochen lang höhere Dosen an TM von 1,0-1,5 mg verabreicht. Tiere, denen 1,25-1,5 mg verabreicht wurden, starben nach 1-3 Wochen Therapie. Die Autopsien zeigten, daß ein Tier an Aspirationspneumonie (die einem Unfall mit der Schlundsonde zugeschrieben wurde) starb, während 2 Tiere an Nekrose der Nierentubuli und Lungenblutungen starben, wobei die Nekropsie klare Belege für Gefäß verletzungen in diesen Geweben lieferte. Diese Untersuchungen legen nahe, daß 1,0 mg/Tag die maximal tolerierte Dosis (MTD) für TM in erwachsenen Mäusen (Durchschnittsgewicht 32 Gramm) ist, wenn eine längerfristige Behandlung beabsichtigt ist.
Um zu testen, ob die Größe der Brusttumore in den Kontrollmäusen mit TM verkleinert werden kann, wurden 3 Kontrolltiere behandelt, nachdem sich die Tumore gut etabliert hatten (größte Dimension > 1,5 cm). In 2/3 der Fälle schrumpften die Tumore signifikant auf 25% bzw. 50%.
Als nächstes wurde untersucht, ob die lange TM-Therapie in irgendeiner Weise das Brustgewebe so geschädigt hatte, daß es bei den Behandlungstieren aufgrund eines fehlenden Ziels nicht zur Entstehung von Tumoren kommen konnte. Nachdem sich bei 80% der Kontrolltiere und keinem der Behandlungstiere Tumore entwickelt hatten, wurde bei Kontrolltieren die Behandlung abgesetzt. In dieser Crossover-Gruppe von Mäusen (die zuvor krankheitsfrei gewesen waren) begannen sich innerhalb von 18 Tagen klinisch offensichtliche Brusttumore zu entwickeln, was nahelegt, daß das Ereignis der Tumorinitiation im Zielgewebe stattgefunden hatte, daß aber im Zustand des Kupfermangels eine Ausdehnung des Tumors auf eine klinisch detektierbare Masse nicht möglich war.
Mikroskopische Analysen der Brustdrüsen der mit TM behandelten Mäuse zeigten eine Reihe (1-8) kleiner "Mikrotumore" mit einer Dicke von ungefähr 3-10 Zellschichten, bei denen es nicht zu einer Vaskularisierung kam. Nach dem Absetzen der TM-Therapie wuchsen diese Mikrotumore jedoch sehr schnell zu tastbaren Massen heran, die schnell vaskularisiert wurden. Wenngleich noch nicht alle zellulären und molekularen Einzelheiten geklärt sind, ist klar, daß bei diesem wichtigen Karzinogenesemodell der Angiogeneseschalter oder ein Schritt unmittelbar davor durch den Kupfermangel gehemmt wurde, da keiner der Mikrotumore in den behandelten Mäusen vaskularisiert war.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß man durch eine Verminderung der Verfügbarkeit von Kupfer das Wachstum von festen Tumoren einschließlich des Wachstums von Metastasen verlangsamen und letztendlich ganz zum Stillstand bringen kann. Die zur Verlangsamung des Tumorwachstums in Menschen, die nicht an Wilson-Krankheit leiden, erforderliche Verminderung der Verfügbarkeit von Kupfer wurde wie unten beschrieben festgestellt. Der Erfolg von TM als Antitumormittel beruht wenigstens teilweise auf der Beziehung zwischen dem zur Erzielung von Wirksamkeit erforderlichen Grad an Kupfermangel und der Toxizität dieses Grads an Kupfermangel. Da die Tumorangiogenese aufgehoben wird, wenn sich ein leichtes Kupferdefizit einstellt, ist TM ein bemerkenswert wirksames Mittel für eine Reihe verschiedener onkologischer Anwendungen. Andere Szenarien, bei denen eine TM-Therapie in Betracht kommen könnte, schließen eine Erhaltungstherapie nach Chemotherapie oder Knochenmarktranplantation, bei älteren Patienten oder Patienten, bei denen aus anderen Gründen keine Chemotherapie in Frage kommt, oder als Zytostatikum bei Hochrisikopatienten (entzündlicher Krebs, multiple positive Knoten) ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.

C. Nacktmäuse mit verpflanzten Tumoren

In dieser Studie wurde untersucht, inwieweit Tetrathiomolybdat (TM) dazu in der Lage ist, das Wachstum von Tumoren in den Brustwülsten von Nacktmäusen nach orthotoper Injektion von humanen Brustkrebszellen anzuhalten oder zu verzögern. Für diese Studie wurde die hochangiogene entzündliche Brustkrebszellinie namens SUM 149 ausgewählt. Aufgrund ihrer starken Neigung zur Bildung von tastbaren Tumoren innerhalb von 2 Wochen nach der Injektion in die Brust bei 80-100% der injizierten Nacktmäuse lieferte diese Zellinie den striktesten Test darauf, ob TM dazu in der Lage ist, die Weiterentwicklung von Tumoren aufzuhalten.
Drei Gruppen von jeweils 5 Nacktmäusen wurden in getrennten Käfigen eingerichtet. Die Gruppen 2 und 3 erhielten TM mit dem Trinkwasser beginnend an Tag-7, so daß die durchschnittliche Aufnahme 1,2 mg/Tag/Maus betrug. Den Gruppen 1, 2 und 3 wurden am Tag 0 10&sup6; SUM149-Bnistkrebszellen in die zweite Brustfettwulst des Thorax injiziert. An Tag 34, an dem bei keiner der Mäuse in den Behandlungsgruppen tastbare Tumore feststellbar waren, wurde in den Gruppen 2 und 3 das TM abgesetzt, und dann wurde in Gruppe 2 mit der neuerlichen Verabreichung von TM mit einer Dosis von 0,6 mg/Tag/Maus begonnen, während in Gruppe 3 mit der vollen Dosis (1,2 mg/Tag/Maus) fortgefahren wurde.
Die sich entwickelnden Tumore wurden ungefähr zweimal wöchentlich gemessen, und in Abb. 3 wurde für jede Gruppe der Durchschnittswert des Produkts der zweidimensionalen, senkrecht zueinander angeordneten Durchmesser aufgetragen. Die Tumore in der Kontrollgruppe wuchsen relativ schnell, und bei allen Tieren entwickelten sich Tumore. Im Gegensatz dazu waren bei den Behandlungsgruppen bis zum Absetzen des TM an Tag 34 keine Tumore tastbar. Im Anschluß daran wuchsen die Tumore in der Gruppe, die die Hälfte der ursprünglichen TM-Dosis erhielt, wobei man weiß, daß hierdurch die Kupferkonzentration lediglich auf 50% verringert wird, schneller. Im Gegensatz hierzu wuchsen in der mit der vollen TM-Dosis, die als 1,2 mg/Tag/Maus definiert ist, behandelten Gruppe nur sehr kleine Tumore. Bei dieser Dosis ist das Kupfer auf ungefähr 10-20% des Ausgangsniveaus abgesenkt. Es ist dieser sowohl von Mäusen als auch von Menschen gut vertragene Grad an Kupfermangel, der zur Inhibierung der Tumorangiogenese erforderlich zu sein scheint.
Diese Studie stützt die Hypothese, daß TM die Angiogenese wahrscheinlich auf wenigstens 2 Weisen hemmt: einmal durch Inhibierung des "angiogenen Schalters" und andererseits durch Inhibierung der Angiogenese in der Tumormasse. Dadurch, daß an Tag 34 das TM weggelassen wurde, konnte der angiogene Schalter aktiviert werden und ein Gefäß zum Tumorcluster ausgebildet werden, der in die Nacktmäuse mit Kupferdefizit injiziert worden war. Durch diese Aktivierung des Schalters war ein gewisses Wachstum des Tumors möglich, wenngleich klar ist, daß das Tumorwachstum in der mit TM behandelten Gruppe sehr viel langsamer ist und ein Plateau zu erreichen scheint. Mit dieser Studie wird weiterhin die orale Verabreichung von TM über das Trinkwasser der Nacktmäuse validiert.

BEISPIEL 3

Klinische Phase-I/II-Studie mit TM als Antikrebsmittel

6 Einführung

Aufgrund der kumulativen Toxizität von zytoreduktiver Chemotherapie und Arzneimittelresistenz stehen Patienten mit metastatischen festen Tumoren häufig nur sehr begrenzte Behandlungsmethoden zur Wahl. Nach den oben ausführlich beschriebenen präklinischen Arbeiten, bei denen sich die Wirksamkeit des gegen Kupfer gerichteten Ansatzes in Mäusetumormodellen zeigte, wurde eine klinische Phase-I-Studie mit 18 an metastatischem Krebs leidenden Patienten durchgerührt, denen 3 verschiedene Dosierungen an oralem Tetrathiomolybdat (TM; 90,105 bzw. 120 mg/Tag) in 6 Einzeldosen mit und zwischen den Mahlzeiten verabreicht wurden. Serumceruloplasmin (Cp) wurde als Ersatzmarker für Gesamtkörperkupfer verwendet. Da Anämie das erste klinische Zeichen eines Kupfermangels ist, war es das Ziel der Studie, Cp auf 20% des Ausgangswertes zu reduzieren, ohne den Hämatokrit um mehr als 80% des Ausgangswertes herabzusetzen. Cp ist ein verläßlicher und empfindlicher Maßstab für den Kupferstatus, und bei einer Absenkung von Cp auf 15-20% des Ausgangswertes war TM nichttoxisch. Mit der in Stufe III verwendeten TM-Dosis von 120 mg/Tag ließ sich der Cp-Zielwert ohne zusätzliche Toxizität erreichen. Mit dem durch TM induzierten leichten Kupferdefizit konnte die Krankheit bei 5 von 6 Patienten, die wenigstens 90 Tage lang einen Kupfermangel im Zielbereich zeigten, stabilisiert werden.

1. Toxizität

Die pharmakologischen Wirkungen von TM sind ausschließlich kupferspezifisch. Da es keine nachweisbaren Wirkungen auf andere Mineralien hat, hängt also seine Toxizität direkt mit dem Kupfermangel zusammen. Vom Kupfermangel abgesehen wurde für die verwendeten Dosierungen keine Toxizität in Tieren beschrieben. Was den Menschen betrifft, so liegen zwei Berichte über reversible Anämien bei Patienten mit Wilson- Krankheit vor, die TM als Erhaltungstherapie in Dosen von 30-40 mg 6mal täglich einnahmen. Als 45 Patienten mit Wilson-Krankheit acht Wochen lang mit TM als Initialtherapie für Wilson-Krankheit behandelt wurden, beobachtete man fünf Fälle (11,1%) einer reversiblen Anämie. Die Anämie ist auf eine verminderte Hämsynthese als Resultat des Kupfermangels im Knochenmark zurückzuführen. Diese Anämie zeigte sich bei den Patienten, in deren Blut die Cu-Konzentrationen am meisten abgesenkt worden waren.
Wie oben erwähnt läßt sich der Kupferstatus eines Tieres oder eines Menschen in der TM-Therapie nicht alleine über das Serumkupfer kontrollieren, da der Komplex aus TM, Kupfer und Albumin bis zum Erreichen eines Fließgleichgewichts mit hohen Kupferwerten langsamer aus dem Blut entfernt wird, als er sich anreichert. Dieses komplexierte Kupfer steht jedoch nicht für eine Aufnahme in Zellen zur Verfügung und wird über Urin und Galle langsam aus dem Körper entfernt, ohne an irgendwelchen zellulären kupferabhängigen Prozessen wie Angiogenese beteiligt zu sein. Die Erfinder haben Richtlinien für die Kontrolle der Kupferbilanz in Menschen während der TM-Therapie aufgestellt, gemäß den drei Stadien des Kupfermangels (Brewer, 1992; Brewer et al., 1991a), wie folgt.

Erstes Stadium - Chemischer Kupfermangel

Während dieses Stadiums ist die Serumceruloplasmin-(Cp-)Aktivität auf etwa 5-10% des Ausgangswertes vermindert. Cp, ein kupferhaltiges Protein, wird in der Leber synthetisiert, und bei Kupfermangel ist die Cp-Synthese reduziert. Bei diesem Stadium des Kupfermangels treten, obwohl der Mangel im Labor meßbar ist, keine klinischen Zeichen bzw. Symptome auf. Vor dem Eintreten eines frühen klinischen Kupfermangels muß der Cp unter einigen Prozent des Normalwertes liegen.

Zweites Stadium - Leichter klinischer Kupfermangel

Nachdem das Cp über einen Zeitraum von 5-10 Tagen auf 0-5% gehalten wurde, können die ersten klinischen Anzeichen eines Kupfermangels auftreten. Hierbei handelt es sich um eine leichte Neutropenie und hypochrome mikrozytische Veränderungen bei den roten Blutkörperchen. Sowohl die Zahl an Leukozyten als auch der Hämatokrit fallen auf ungefähr 75-85% der Ausgangswertes. Kupfer wird für die Hämsynthese benötigt, so daß die im periphären Abstach auftretenden morphologischen Veränderungen ähnlich den für Eisenmangel charakteristischen Veränderungen sind. Die Anisozytose und Poikilozytose verschärfen sich bei schwerwiegender werdendem Kupfermangel. Die Entstehung dieser leichten Anämie und Neutropenie ist graduell und häufig vollkommen asymptomatisch.

Drittes Stadium - Mäßiger bis schwerer klinischer Kupfermangel

Typischerweise wenn der Hct-Wert < 70% des Ausgangswertes erreicht, treten ernstere, von der unzureichenden Hämatopoiese herrührende klinische Anzeichen bzw. Symptome auf. Hierbei handelt es sich um Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust, Durchfall, gestörte Melanogenese mit anschließendem Verlust der Haarfarbe und in seltenen Fällen Herzrhythmusstörungen.
Die Erfinder schlußfolgerten, daß ein leichter chemischer Kupfermangel (ein Zustand, der von Menschen offensichtlich über lange Zeiträume außerordentlich gut vertragen wird) bei einer Strategie zur Inhibierung der Angiogenese fester Tumore wirksam ist. Bei diesem Ansatz sind die Modulation und die sorgfältige Kontrolle des Ausmaßes des Kupfermangels zur Etablierung von Ersatzendpunkten für die Wirksamkeit von TM daher ein wichtiges Element.
Die Erfinder verfügen über ein sehr gutes, auf Beweisen basierendes Wissen über die verschiedenen Stadien des relativen Kupfermangels, der Trennlinie zwischen chemischem und klinischem Kupfermangel und geeigneten Protokollen darüber, was zur Be stimmung des Kupferstatus zu messen ist. Da die Patienten gut überwacht werden, hat sich die Phase-I-Studie bislang als recht sicher erwiesen. Die wichtigste abzuklärende therapeutische Frage ist, ob die Kupferkonzentrationen, die der Tumor für die Angiogenese benötigt, signifikant höher sind als die Kupferkonzentrationen, die für essentielle Bedürfnisse des Zellhaushalts benötigt werden.

2. Pharmakodynamik

TM wird oral mit und ohne Mahlzeiten verabreicht und wird unter letzteren Bedingungen gut resorbiert. TM bildet einen Dreierkomplex mit Kupfer und Protein, wodurch das Kupfer in der Nahrung bei der Verabreichung mit den Mahlzeiten gebunden wird, was die Resorption von Kupfer verhindert, oder im Blutkreislauf (TM-Cu-Albumin) nach der Resorption gebunden wird, was die Aufnahme von Kupfer durch die Zellen verhindert. Bei Patienten mit einem normalen Kupfermetabolismus würde man eüi stöchiometrisches 1 : 1-Verhältnis zwischen Nichtceruloplasminkupfer im Plasma (das potentiell für eine Angiogenese verfügbar ist) und Plasmamolybdän erwarten, bei 6 täglichen Dosen von jeweils 10-20 mg. Das Dosierungsniveau von TM führt zu einem Fließgleichgewicht mit einem leichten Kupfermangel, der bei den meisten Individuen im Bereich von 40-90 mg pro Tag liegt. Der TM-Cu-Protein-Komplex wird langsam vorwiegend mit der Galle ausgeschieden, wobei eine kleine Menge auch mit dem Urin ausgeschieden wird. Die Eliminierungsgeschwindigkeit des Dreierkomplexes läßt sich mit Hilfe von Mo- und Cu-Messungen im 24-Stunden-Ham bestimmen.

B. Methoden

1. Patienten

Es wurden achtzehn Erwachsene mit metastasenbildenden festen Tumoren einbezogen, die die Krankheit deutlich zeigten, eine Lebenserwartung von drei oder mehr Monaten und wenigstens einen 60%igen Karnofsky-Leistungsstatus (Tabelle 2) aufwiesen. Patienten, deren einzige Erscheinungsform der Krankheit Ergüsse oder Beteiligung des Knochenmarks waren und solche, die schwere interkurente Krankheiten, welche eine intensive Behandlung erfordern oder transfusionsabhängig waren, wurden ausgeschlossen. Die Patienten mußten sich von vorherigen Toxizitäten erholt haben und hatten die folgenden Voraussetzungen für die Laborparameter: WBC ≥ 3.000/mm³, ANC ≥ 1.200/mm³, Hct ≥ 27%, Hgb ≥ 8,0 gm/dl, Thrombozyten Zahl ≥ 80.000/mm³, Bilirubin < 2,0 mg/dl, AST/ALT < 4 mal der Obergrenze der Institutionsnorm, Kreatmin Serum < 1,8 mg/dl oder berechneter Kreatininabstand ≥ 55 ml/min. Kalzium < 11,0, Albumin ≥ 2,5 gm/dl, PT < 13 Sek. und PTT < 35 Sek. Zusätzliche Erfordernisse waren das nachweisliche Fortschreiten der Krankheit in den vorherigen drei Monaten nach der Standardbehandlung wie beispielsweise Operation, Chemotherapie, Strahlenbehandlung und/oder Immunotherapie oder fortschreitende Krankheit nach rückläufigen konventionellen Behandlungsmodalitäten. Tabelle 2 Karnofsky und die Merkmale der ECOG-Leistung

2. Behandlungsschema: Dosis und Eskalierung

Es wurden drei Dosisregime ausgeweitet. Alle Dosis-Nievaus bestanden aus 20 mg TM, verabreicht dreimal täglich mit den Mahlzeiten zuzüglich eines Eskalats (Stufe I, II und III) dreimal täglich zwischen den Mahlzeitdosierungen, mit einer Gesamtheit von sechs Dosen pro Tag. Die Behandlungsdosenwerte I, II und III wurden bereitgestellt durch TM mit 10 mg, 15 mg und 20 mg, dreimal täglich zwischen den Mahlzeiten, jeweils zusätzlich zu den drei jeweils 20 mg Dosen die mit den Mahlzeiten verabreicht wurden.
Der Basis Cp war der nächstliegende Cp-Meßwert am Tag 1 der Behandlung für alle Patienten, einschließlich Tag 1, da das abgenommene Blut pre-TM war. Die anvisierte Cp-Verringerung wurde mit 20% des Basis Cp definiert. Aufgrund der Variabilität der Cp-Untersuchung von ca. 2% wurde eine Änderung des Cp auf 22% des Basiswertes als erreichen der erwünschten Verringerung des Kupfers betrachtet. Außerdem wurde der Patient als den Ziel-Cp-Wert erreichend betrachtet, wenn der absolute Cp geringer als 5 mg/dl war. Kein Patient erreichte das Ziel aufgrund eines absoluten Cp von weniger als 5 mg/dl, ohne auch mindestens 78% unter der Basislinie zu liegen. Nach Erreichen des anvisierten Kupfermangelstadiums wurden die TM Dosen individuell darauf zugeschnitten, den Cp-Wert innerhalb des Zielfensters von 70-90% Verringerung vom Basiswert zu halten.
Sechs Patienten wurden bei jeden Dosis-Wert einbezogen. Wenn ein Patient dosislimitierende Toxizität (DLT) erfuhr (definiert als Hct < 80% des Basiswertes) nachdem vier Patienten in die Stufen I einbezogen wurden, wurden zwei weitere Patienten in die Stufe I einbezogen. Wurde keine DLT beobachtet, wurden die Patienten in die nächste Dosisstufe einbezogen. Die Behandlung wurde über die Induktion des anvisierten Kupfermangels hinaus erlaubt fortzusetzen, wenn der Patient eine teilweise oder vollständige klinische Reaktion erfuhr oder eine klinisch stabile Krankheit folgender Definitionen erreichte. Eine vollständige Re aktion ist als das Verschwinden aller klinischer Anzeichen und Symptome der aktiven Krankheit definiert. Eine teilweise Antwort ist definiert als eine 50%ige oder größere Verringerung der Größe der meßbaren Läsionen, definiert mittels der Summe der Produkte des längsten senkrechten Durchmessers der Läsionen, ohne neuen Läsionen oder Läsionen die an Größe zunehmen. Eine geringe Antwort ist definiert als 25-49%ige Verringerung in der Summe der Produkte des längsten senkrechten Durchmesser eines oder mehrerer meßbarer Läsionen, keine Größenzunahme irgendwelcher Läsionen und keine neuen Läsionen; eine stabile Krankheit ist irgendeine Veränderung in der Tumorgröße, die nicht von den Kriterien für die Antwort oder die fortschreitende Krankheit erfaßt wird, welche definiert ist als 25%ige oder größere Erhöhung in der Summe aller Produkte des längsten senkrechten Durchmessers irgendwelcher meßbarer Indikatorläsionen im Vergleich zu der geringsten vorherigen Größe oder Erscheinungsform einer neuen Läsion. Da der Kupfermangel keine Modalität der zelltoxischen Behandlung ist, sind die Patienten, welche die Information über die Wirksamkeit der TM in der langfristigen Therapie liefern aus der Population der Patienten mit fortgeschrittenen Krebs, in erster Linie die, welche in den anvisierten Cp-Fenster von (20 ± 10)% der Basislinie für über 90 Tage blieben ohne daß die Krankheit fortschritt.

3. Beobachtung des Kupferstatus

Es war eine Methode erforderlich, welche es erlaubt, den Kupferstatus mühelos und zuverlässig zu überwachen, damit die TM Dosis in dieser Untersuchung entsprechend eingestellt werden kann. Mit der TM-Verabreichung ist Serumkupfer kein brauchbares Maß für das Gesamtkörperkupfer, da der TM-Kupfer- Albumin-Komplex nicht rasch freigesetzt wird und das Gesamtserumkupfer (einschließlich der an den TM-Protein-Komplex gebundenen Fraktion) sich eigentlich während der TM-Behandlung erhöht (Brewer et al., 1991a; 1994b, 1996). Der Serumceruloplasmingrad wurde wöchentlich erhalten und als Ersatzmaß für den Gesamtkörper-Kupfer-Status verwendet. Der Serumceru loplasmingrad wird durch die Cp-Synthese der Leber geregelt, welche wiederum durch den für die Leber verfügbaren Kupfer geregelt wird (Linder et al., 1979). Folglich ist, wenn der Gesamtkörper-Kupfergehalt verringert ist, das Serum Cp- Niveau proportional verringert. Das Serum Cp-Niveau liegt im Bereich von 20- 35 mg/dl und 30-65 mg/dl jeweils für die normalen Kontrollen und Krebspatienten. Das Ziel der Untersuchung war den Cp-Wert auf oder unter 20% des Basiswertes zu verringern und dieses Niveau innerhalb eines Fensters von (20 ± 10)% des Basislinien Cp mit typischen Cp-Werten in dem Bereich von 7-12 mg/dl zu halten. Da es scheint, daß keine nachteiligen klinischen Effekte von diesem Grad an Kupfermangel ausgehen, wurde dieses Niveau an Kupfermangel als "chemischer Kupfermangel" bezeichnet. Das erste Anzeichen von tatsächlichen klinischen Kupfermangel ist die Abnahme der Blutzellenzahlen, hauptsächlich Anämie, da Kupfer für die Häm-Synthese als auch die Zellproliferation benötigt wird (Brewer et al., 1996). Demnach war das Ziel in dieser Untersuchung den Kupfermangel auf 20% des Cp-Basiswertes oder darunter zu verringern, ohne das Hämatokrit oder WBC des Patienten von 80% des Basiswertes bei Beginn zu unterschreiten.

4. Toxizität, Wiedervorlage und Beurteilung der Krankheit

In den ersten 16 Wochen wöchentlich, und dann zweiwöchentlich wurden vollständige Blutbilder erstellt und Leber und Nierenfunktionstests, Harnuntersuchungen und Cp-Niveauuntersuchungen (mittels der Oxidase-Methode) durchgerührt. Körperliche Untersuchungen und Bewertungen der Toxizität wurden für acht Wochen alle zwei Wochen durchgeführt, danach alle vier Wochen während der Dauer der Therapie. Die Toxizität wurde unter Verwendung der allgemeinen Toxizitätskriterien des nationalen Krebsinstitutes (Tabelle 3) bewertet. Da TM in den verwendeten Dosen kein cytotoxisches Arzneimittel darstellt und dem Menschen bereits verabreicht wurde ohne daß irgendwelche anderen Toxizitäten als die oben bereits im Detail beschriebenen auftraten, sollten die Mehrzahl der in Tabelle 3 aufgeführten Toxizitäten, sofern sie auftreten, nicht auf TM zurück zuführen sein. Dennoch würde die Therapie abgebrochen und der Patient aus der Studie genommen werden, wenn Toxizität der Klasse 3 oder höher irgendeines Typs beobachtet werden, egal welche wahrscheinliche Ätiologie gestellt wird. Für Toxizitäten der Klasse 2 wird versucht deren Ätiologie aufzustellen. Wenn routinemäßige Hilfsbehandlungsmaßnahmen die Bedingungen nicht mildern wird das Arzneimittel abgebrochen und der Patient aus der Studie genommen.
Die Schwere der Krankheit wurde am Beginn, zum Zeitpunkt der Einstellung des Kupfermangels, definiert als Cp bei oder unter 20% der Basislinie sowie alle 10-12 Wochen danach bewertet. Die Computergestützte Tomographie oder bildgebende Kernspintomographie dienten zur konventionellen Messung der Krankheit an allen bekannten Stellen und zur Einschätzung von irgendwelchen potentiellen neuen Krankheitsstellen. Angiogenese-empfindlicher Ultraschall mit dreidimensionaler Doppier-Analyse wurde in bestimmten Fällen eingesetzt, als Zusatz zum konventionellen Tomographie-Verfahren, um den Blutfluß zu den Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten zu beurteilen. Tabelle 3 Toxizitätskriterien

5. Die Bereitstellung und Aufbewahrung von TM

TM, geeignet zur Verarbreichung an Menschen, wurde in großen Mengen gekauft (Aldrich Chemical Company, Milwaukee,WI). Da TM langsam an der Luft durch Sauerstoff, der den Schwefel im Molekül ersetzt und es inaktiviert (Brewer et al., 1991a; 1994b; 1996), abgebaut wird, wurde es in 100 Gramm Mengen unter Argon aufbewahrt. Zu dem Zeitpunkt, als die Verschreibung verschrieben wurde, wurde die entsprechende Dosis an TM in Gelantinekapseln gebracht. Vorher wurde durch die Erfinder gezeigt, daß TM, welches in derartigen Kapseln verabreicht wrude, mindestens 90% seiner Wirksamkeit für acht Wochen erhielt (Brewer, et al., 1991a). Auf diese Weise wurde jedem Patienten in 8-Wochen-Raten während des Versuches TM verabreicht.

6. Messung der Durchblutung

Die Durchblutung wurde mittels Ultraschall bei bestimmten Patienten mit zugänglichen Läsionen zu dem Zeitpunkt gemessen, als sie den Kupfermangel aufwiesen sowie in verschiedenen Intervallen von 8-16 Wochen danach. Die 3D Scanierung wurde an einem GE Logiq 700 Ultraschallsystem mit 739 L, 7,5 MHz linear array Scankopf durchgeführt. Die Scanierung und vaskuläre Mengenbestimmungstechnik entsprach der bereits vorher beschriebenen (Carson et al., 1998; LeCarpentier et al" 1999).

B. Ergebnisse

1. Die Merkmale der Patienten

Achtzehn geeignete Patienten, zehn Männer und acht Frauen, mit elf verschiedenen Typen von metastasenbildenden Krebs, welche andere Behandlungsmöglichkeiten durchlaufen oder (in einem Falle) abgelehnt hatten, wurden in die Untersuchung einbezogen in der Ordnung in der sie zugeteilt wurden. 6,5 und 7 Pa tienten wurde das 90,105 und 120 mg/Tag Medikamentenniveau entsprechend den Protokoll-Dosen-Eskalations-Schema verschrieben. Ein Patient, der ursprünglich für das 105 mg Niveau vorgesehen war, wurde zeitig zur Durchführung einer cytotoxischen Chemotherapie, wegen dem schnellen Fortschreiten der Krankheit, herausgenommen. Der selbe Patient wurde später erneut beim 120 mg Niveau über einen längeren Zeitraum behandelt, weshalb für die Analyse nur das 120 mg Medikamentenniveau berücksichtigt wurde. Das Durchschnittsalter betrug 59; der Durchschnitts-Basislinien Cp betrug 47,8 mg/dl, welcher erhöht ist in Bezug zum üblichen, was den Krankheitsstatus der Patienten wiederspiegelt. Tabelle 4 faßt die Merkmale der Patienten für jedes Dosisniveau zusammen. Tabelle 4 Merkmal der Patienten

2. Toxizität

Es wurden keine Herz-, Lungen-, GI, Nieren-, hepatische, hämatologische, infektiöse, Haut-, Schleimhaut- oder neurologische Toxizitäten bei einem Cp- Niveau bei oder oberhalb von 20% der Basislinie beobachtet. Milde (größer als 80% des Basislinien Hct) reversible Anämie wurde bei vier Patienten mit einem Cp-Niveau zwischen 10-20% der Basislinie beobachtet. Zwei dieser Patienten wurden mittels zytotoxischer Chemotherapie behandelt und zwei Patienten hatten Anzeichen umfangreicher Beteiligung des Knochenmarks in ihrer Krankheit zum Zeitpunkt des Beginns der Untersuchung. Obgleich in den letzten beiden dieser Fälle die Anämie höchstwahrscheinlich mit anderen Gründen als der Behandlung zu tun hatte, wurde TM zeitweise abgesetzt bis sich Hct bis zu einem akzeptablen Niveau durch Transfusion von zwei Einheiten abgepackten RBC wieder hergestellt hatte. Bei einem Patienten ist es sehr wahrscheinlich, daß der durch TM hervorgerufene Kupfermangel die Anämie hervorrief. Das Absetzen des Medikaments ermöglichte der Hämatrokrit sich innerhalb von 5-7 Tagen, ohne daß eine Transfusion nötig war, wieder zu erholen; auf die Bitte des Patienten hin, wurde TM erneut in geringer Dosis, ohne weiteren Komplikationen der Anämie verabreicht. Mehrere Patienten zeigten kurzzeitiges, gelegentliches nach Schwefel riechendes Rülpsen während der dreißig minütigen TM Nahrungsaufnahme. Es wurden keine weiteren Toxizitäten irgendeines Typs beobachtet während der langfristigen Aufrechterhaltung des milden klinischen Kupfermangels über 8-15 Monate. Von Interesse ist, daß keine Anzeichen von GI oder anderen Schleimhautblutungen oder eine beeinträchtigte Heilung kleiner Wunder in der langfristigen Therapie beobachtet wurden. Ein Pre-menopausaler Patient mit umfangreichen metastasenbildenden Nierenkrebs hatte normale Menstruationsregelblutungen während der TM Therapie, einschließlich eines 2,5 monatigen Beobachtungszeitraumes während der Kupfermangel einen Cp-Wert < 20% der Basislinie aufwies.

3. Ceruloplasmin als Ersatzmaß für den Kupferstatus

Die Abbildungen Fig. 4A, Fig. 4B und Fig. 4C zeigen die Antwort von Cp als eine Funktion der Zeit der TM Therapie, angegeben als das Verhältnis Cp zur Zeit zu den Basislinien Cp-Niveau jedes einzelnen Patienten einbezogen in das 90 mg/Tag (Fig. 4A), 105 mg/Tag (Fig. 4B) und 120 mg/Tag (Fig. 4C) Dosisniveau. Die Erhöhung der Zwischenmahlzeitdosis von 10 mg 3 · täglich auf 15 oder 20 mg dreimal täglich hat keinen signifikanten Effekt auf den Minderungsgrad des Cp-Niveaus, der durchschnittlich nach dreißig Tagen (der Durchschnittswert = 28 Tage) ein Niveau von 50% der Basislinie erreicht. Die Antwort des Cp auf die TM Therapie als Zeitfunktion weist nur geringe Schwankungen auf; sobald TM abgesetzt wurde, war ein schneller Anstieg des Cp innerhalb von 48 Stunden zu beobachten.
Vier Patienten wurden wegen dem Fortschreiten der Krankheit noch bevor der anvisierte Ziel Cp von 20% der Basislinie erreicht wurde aus der Studie genommen, während die übrigen 14 Patienten das Ziel Cp-Niveau erreichten. Da alle 14 Patienten, die das Ziel Cp-Niveau erreicht hatten, wünschten, in der Studie zu verbleiben, wurde ihnen dies entsprechend dem Protokoll so lange erlaubt, wie sie kein Fortschreiten der Krankheit oder Toxizität zeigten. Die TM Dosen wurden für diese Patienten so eingestellt, daß der Cp zwischen 10-20% der Basislinie erhalten blieb. Diese Patienten dienen als vorläufiger Beleg für die Wirksamkeit und langfristige Toleranz dieser Methode.

4. Dosisanpassungen um den Ziel Cp zu erhalten

Um den Ziel Cp von 20% der Basislinie zu erhalten und absolute Cp-Werte unter 5 mg/dl zu verhindern, wurden die TM Dosen angepaßt. Aufgrund eines routinemäßigen 7-tägigen turn-around für den Cp Test, wurden diese Dosisveränderungen etwa 7-10 Tage nach der Blutentnahme für die Cp-Messung durchgeführt. Nachdem der Ziel Cp erreicht wurde, wurde die Zwischenmahlzeitdosis typischerweise bis zu 20 mg verringert. Weitere Verringerungen von 15-30 mg waren während der langfristigen Therapie notwendig. Ein Patient mit metastasenbildenden Chondrosarcoma hatte neben der Strahlenbehandlung gegen Brustkrebs in der langfristigen Therapie eine stabile Krankheit nach 12 Monaten Kupfermangel, mit stabiler Lebensqualität. Ein durch Biopsie nachgewiesener metastasenbildender Knoten am Mittelfinger war leicht zu messen und erwies sich als stabil. Interessanter Weise benötigte dieser Patient nur eine minimale Anpassung an die TM-Dosis der anfänglichen verabreichten Dosis um den Ziel Cp über diesen relativ langen Zeitraum zu erhalten.
Die Abb. 5A und 5B zeigen die Cp-Antwort auf die Dosisanpassung, die für zwei weitere repräsentative Patienten bei der ungefähr 100 tägigen Therapie notwendig war. Der Patient in Fig. 5A hat bis jetzt lediglich eine Verringerung der Dosis nach 60 Tagen benötigt. Die meisten Patienten benötigten beides, eine Dosiserhöhung und Verringerung während der langfristigen Therapie. So beispielsweise, wie in Fig. 5B gezeigt, wurde die TM Dosis nach dem Tag 100 erhöht um auf ein Erhöhen des Cp außerhalb des Zielbereiches zu reagieren. Im großen und ganzen war eine erhebliche individuelle Variabilität bei der Dosisanpassung erforderlich. Weitere erwartete Krankheitsstellen im Brustkorb verblieben ebenfalls stabil. Schließlich ist die Cp Antwort auf die TM Therapie, die wöchentlich bewertet wurde, nicht sehr anfällig oder Gegenstand einer weiten Schwankung.

5. Die Messung der Antwort des metastasenbildenen Krebses auf TM

A. Klinische Bewertung

Obwohl die Patienten verschiedene anfängliche Verabreichungsdosen von TM erhielten, wurde das Cp aufrechterhaltende Fenster von (20 ± 10)% der Basislinie in allen Gruppen ungeachtet der Verabreichungsdosis verwendet. Die Patienten, welche diesen Grad des Kupfermangels durch maßgeschneiderte Anpassungen der TM-Dosis über mehr als 90 Tage aufrechterhielten, spiegeln glaubhaft die anti-angiogene Wirkung des TM gegen ihre Tumore wieder. Der Zeitraum von 90 Tagen wurde aus zwei wichtigen Gründen ausgewählt. Erstens ist TM nicht cytotoxisch, weder gegenüber dem Krebs noch den Endotelzellen, und beeinträchtigt im wesentlichen die Endothelzellenfunktion sowie die Produktion des proangiogenen Faktors. Dieser Wirkungsmechanismus sollte erwartungsgemäß einen sehr geringen Effekt auf die Größe der Tumormassen haben. Zweitens, da Tumore Kupfer absondern, ist zu erwarten, daß die Mikroumgebung des Tumors eine längere Zeit braucht bis ein Kupfermangel vorliegt. Die Tabelle 5 faßt den klinischen Verlauf der 18 Patienten zusammen. Tabelle 5 Übersicht der Art und Dauer der Antwort auf die TM Therapie
*Patienten die die Therapie abbrachen; + in der Therapie
14 Patienten erlangten den Kupfermangel bevor die Krankheit fortschritt oder andere Krankheitskomplikationen eintraten. Von diesen setzten 8 Patienten entweder innerhalb von 30 Tagen fort den Kupfermangel zu erreichen oder hatten in weniger als 90 Tagen eine stabile Krankheit; es ist unwahrscheinlich, daß die meisten dieser Tumore lange genug einer anti-angiogenen Umgebung ausgesetzt waren um eine klinische Antwort auf diese Art der Therapie zu evaluieren. Bei allen Patienten, welche, wegen dem Fort schreiten der Krankheit oder eigenem Willen und bei einem Patienten wegen der Notwendigkeit einer Unterleibsoperation um eine kleinere Eingeweideblockierung zu beheben aus dem Protokoll genommen wurden, war nach dem Absetzen der TM Therapie ein wesentlich schnelleres Fortschreiten der Krankheit klinisch festzustellen.
Die übrigen 6 Patienten erfuhren eine stabile Krankheit (5/6) oder ein Fortschreiten der Krankheit an einer Stelle mit stabilen Krankheiten an anderen Stellen (1/6). Bei 2 Patienten, welche gemäß den Standart-Kriterien eine stabile Krankheit zeigten, verschwanden vollständig einige Lungenläsionen und es verringerte sich die Größe anderer Lungenläsionen während des Beobachtungszeitraums beim Ziel Cp von 120 und 49 Tagen. Die 5 Patienten der langfristigen (mehr als 90 Tage) Aufrechterhaltungstherapie mit stabiler Krankheit hatten Kupfermangel zwischen Tag 120 und 413 des Analysezeitraums.

b. Radiologische Bewertung

Fortlaufende Bewertungen der Tumormassen mit konventioneller Darstellung mittels CAT Scanner oder bildgebender Kernspintomographie offenbarte, daß sich das radiographische Erscheinungsbild verschiedener Massen über einen Zeitraum signifikant veränderte. Insbesondere Bereiche vermuteter zentraler Nekrose (entsprechend der geringer Abschwächung des Röntgenstrahlensignals) wurden in einer Vielfalt von Tumortypen, vor allen bei Nierenzellenkrebs, Angiosarcomen und Brustkrebs, gefunden. Um den Blutfluß zum Tumor als Zeitfunktion während des Kupfermangels bei der langfristigen TM Therapie bewerten zu können, wurden Läsionen, welche dem Ultraschall zugängig waren, zum Beginn des Kupfermangels und in 2-4 monatigen Intervallen danach, mittels Farbfluß-3-dimensionalen Ultraschalls, abgebildet.
Konventionelle CAT-Scanierungsbilder und blutflußsensitiver 3D Ultraschall wurden bei einer Rippenmetastase von einem Nierenzellcarzinom verglichen, nachdem der erwünschte Kupfermangel erreicht wurde, als auch acht Wochen danach. Die CAT- Scannierung zeigte, daß diese Läsion über den Zeitraum eine stabile Größe aufwies, obwohl ein ausgeprägter Bereich einer (vermuteten) zentralen Nekrose acht Wochen nach dem Erreichen des Kupfermangels festgestellt wurde. Vergleichsweise wurde mittels 3D Ultraschall eine 4,4-fache Verringerung des Blutflusses zu dieser Masse in diesen Zeitraum von etwa acht Wochen festgestellt. Außer den Massen, welche durch diese beiden Techniken untersucht wurden, hatte dieser Patient umfangreiche Krankheiten im Brustkorb, Becken und den Oberschenkeln.

c. TM in Verbindung mit anderen Behandlungen

Während der langfristigen Aufrechterhaltung des Kupfermangels wurden weitere Behandlungen der mit TM hinzugefügt, wie sie zur optimalen Versorgung des Patienten als dienlich erachtet wurden. Ein Patient mit vorher unbehandelten metastasenbildenen Brustkrebs geht es gut mit einer guten bis hervorragenden Lebensqualität nach 12 monatiger Behandlung. Der Patient hatte Metastasen im paratrachealen, hinteren Gebärmutterhals und retroperitonalen Lymphknotenketten, lehnte jedoch alle cytotoxischen Therapien ab. Der Patient hatte eine stabile Krankheit während mehr als sechs Monaten der TM Behandlung bis, aufgrund der leichten Erhöhung (weniger als 25% der Basislinie) der 2-dimensionalen Größe der paratrachealen und retropentonealen Knoten eine silmultane trastuzumab Therapie begonnen wurde, nachdem dieses Arzneimittel kommerziell erwerblich wurde. Der Patient zeigte an allen Stellen der Krankheit eine schnelle Antwort auf trastuzumab: Nach einem Zyklus gab es eine klinisch vollständige Anwort im Hals und nach drei Zyklen mit trastuzumab gab es eine radiologische Bestätigung einer vollständigen Antwort an allen vorherigen Krankheitsstellen. Der Patient blieb auf TM, jedoch wurde trastuzumab nach sechs Dosen abgesetzt. Der Patient verblieb drei Monate nach der Einstellung der trastuzumab Therapie weiterhin im Status eines vollständigen auf TM basierenden Antwortgebers. Da die vollständige Antwort nach dem Hinzufügen der trastuzumab Therapie eintrat, wurde der Patient in Tabelle 5 als TM abhängiger mit stabiler Krankheit klassifiziert.
Zwei Patienten mit umfangreichen Angiosarcoma des Gesichts und der Kopfhaut erreichten eine stabile Krankheit mittels TM. Bei einem Patienten mit schweren chroni schen Blutungen aus einer Okularläsion, die die Augenhöhle bedrohte, wurde dem TM Inteiferon-alpha 2 (IFN-α) zugefügt, um zu versuchen die Antwort des Tumors zu verstärken. Wenn man den, auf Studien über das Fortschreiten von Hemangiomen basierenden, Rat in Betracht zieht, könnte die Verwendung von geringen Dosen Interferon wirksam zur Behandlung von Hemangioma sein (Takahashi et al., 1994) weshalb diesen beiden Patienten eine Dosis von 500.000 Einheiten IFN-α 2 · täglich unter die Haut verabreicht wurde. Den beiden Patienten auf TM wurde ebenfalls eine Strahlenbehandlung zuteil um die blutenden (aber nicht fortschreitenden) Läsionen zu kontrollieren. Beide Patienten hatten eine Stabilisation der Krankheit über mehr als sechszig Tage, einer von ihnen eine Stabilität über mehr als fünf Monate bis die Therapie auf Wunsch des Patienten abgebrochen wurde. Durch das Hinzufügen irgendeiner dieser Behandlungen zu TM kam es zu keiner Verschlimmerung der Toxizität.
Dies ist der erste Versuch am Menschen mittels Tetrathiomolybdat als anti-angiogene Krebstherapie. Kupfermangel zu induzieren und aufrechtzuerhalten. An einer Patientengruppe mit fortgeschrittenen Krebs wurde gezeigt, daß TM bemerkenswerter Weise nicht toxisch ist, wenn der Cp auf 10-20% der Basislinie für bis zu 17 Behandlungsmonate abgesenkt ist. Einzige, mit dem Arzneimittel in Verbindung stehende, Toxizität war bei einem Patienten einer milde Anämie, welche problemlos durch Einstellung der TM Dosis, um das Cp-Niveau wieder in den gewünschten Bereich zu bringen, umgekehrt weiden konnte. Trotz der verschiedenen Rollen, die Kupfer in unterschiedlichen wesentlichen biologischen Prozessen, einschließlich der Häm-Synthese, der Superoxiddismutase- und Cytochromfunktion, spielt wurden keine nachteiligen signifikanten Effekte als Folge der Verringerung des Cp auf etwa 20% der Basislinie festgestellt. Dieses Niveau des Kupfermangels begründet die Untergrenze des chemischen Kupfermangels und den Beginn eines milden klinischen Kupfermangels, dessen erste Erscheinungsform eins milde Anämie ist.
Die Verwendung des Serum Cp-Niveaus, erhalten durch die Oxidase-Mefhode, welche eine billige und weitverfügbare Testmethode ist, wurde als ein empfindlicher und verläßlicher Ersatzmarker des Gesamtkörperkupferstatus während der TM-Therapie bestä tigt. Bei Anwendung des 6 · pro Tag Dosisregimes und einer TM-Anfangsdosis reichend von 90 bis 120 mg/Tag, wurde der Serum Cp zuverlässig auf 50% der Basislinie bei 17 der 18 behandelten Patienten und auf 20% der Basislinie bei 14 der 18 Patienten herabgesetzt. Die Verringerung auf 50% der Basislinie wurde durchschnittlich in 30 Tagen erreicht, eine weitere Verringerung des Cp-Niveaus von 5-10 mg/dl nahm 20-30 Tage in Anspruch. Obwohl diese Cp-Verringerungsrate angemessene ist für die anfängliche Behandlung früher bösartiger Läsionen oder bei der Hilfsmitteljustierung bei weitgehenden metastasenbildenden fortgeschrittenen Krebs, beschleunigt diese Rate das Verhindern des Fortschreitens einiger Krankheiten während der Induktion des Kupfermangels bei einer signifikanten Zahl der Patienten. Da die Abweichungen in der verabreichten Dosis von 90-120 mg/Tag die Rate der Cp-Verringerung scheinbar nicht beeinflussen und die Aufnahme des Kupfers mit der Nahrung typischerweise täglich erfolgt, sind höhere Dosen zwischen den Mahlzeiten erforderlich um die Induktionsrate des Kupfermangels zu fossieren.
Da die Cp Antwort auf den TM-induzierten Kupfermangel gleichbleibend ist und eine geringe interne Schwankung aufweist, besteht im wesentlichen keine Gefahr plötzlicher Veränderungen oder unvorhersehbarer Schwankungen was die Handhabung der Dosen schwierig machen könnte. Die Verfolgung des Cp-Niveaus einmal pro Woche oder alle zwei Wochen ist ausreichend um den Kupferstatus zu kontrollieren. Als logische Konsequenz ist eine zuweitgehende Behandlung leicht feststellbar und korrigierbar.
Als Ergebnis dieser Studie scheint es, daß mit dem vorliegenden TM-Dosenregimen ein beträchtlicher Zeitabstand zwischen dem Beginn der TM-Therapie und der Verringerung des Kupferniveaus in den Tumoren auf ein wahrscheinliches anti-angiogenes Niveau liegt. Die weitere Verzögerung der Fähigkeit das anti-angiogene Niveau zu erreichen beruht allen Anschein nach darauf, daß die meisten Tumore Kupfer absondern (Arnold and Sasse, 1961; Apelgold et al., 1986; Gullino et al., 1990; Fuchs and Sacerdothe de Lustig 1989). Deshalb kann weitere Zeit nötig sein, um die Mikroumgebung des Tumors auf ein wirksames geringes Kupferniveau, definiert als Niveau gering genug um Angiogenese zu unterdrücken, abzureichern. Patienten mit sehr schnell fort schreitenden großen Tumoren können deshalb weitere Behandlungen, wie sie hier beschrieben sind, zusätzlich zu der anti-angiogenese Therapie erfordern.
Des weiteren kann die zunächst wirksame anti-angiogenese eine Anregung der Tumornekrose verursachen mit dem Ergebnis, daß zusätzlich Kupfer von den sterbenden Zellen abgegeben wird. Im Falle eines Patienten wurde ein kurzzeitiger Anstieg an Cp zu etwa derselben Zeit beobachtet, als der Ultraschall aufgrund einer signifikanten Verringerung des Blutflusses einen Hinweis darauf gab, daß die große Tumormasse eine zentrale Nekrose durchmacht. Daher ist die Periode von 60-90 Tagen des Cp am Zielniveau von 20% der Basislinie ein sinnvoller Anfangspunkt zur Bewertung der Antwort auf die anti-Kupfer Therapie. Bei zwei Patienten, die einen teilweisen Rückgang von Lungenläsionen zeigten, hätte die Tumorkontrolle eher beginnen können. Es ist ebenfalls von Interesse, daß bei beiden dieser Patienten die Stellen der Tumorrückbildung die Matastasen des Lungenepithels waren. Möglicherweise schädigt der milde klinische Kupfermangel die Superoxiddismutasenfunktion (Culotta et al., 1997), so daß unter Bedingungen von hohen Oxidationsmittelstreß, wie er in den Lungen vorkommt, die metastasenbildenden Punkte anfälliger für oxidative Schäden sind.
Trotz individueller Unterschiede beweist die 3D Ultraschalluntersuchung, zum Feststellen des Gesamtblutflusses durch eine vorgegebene Masse, daß die Aufrechterhaltung eines milden Kupfermangels bei 20% der Basislinie, induziert für wenigstens 8 Wochen, scheinbar ausreicht um den Tumorblutfluß zu verändern. Wegen der relativen Unempfindlichkeit der computerbasierenden Tomographie bezüglich des Blutflusses oder metabolischen Status der Läsionen sind parallele Darstellungsverfahren, wie der hier vorgestellte 3D Ultraschall, bevorzugt um die funktionelle Antwort, zusätzlich zu der Tumorgröße, bewerten zu können.
Diese Studien zeigen, daß die Größe eines festen Tumors einer Vielzahl von Typen durch TM, welches ausreichend lange in einem Status eines milden Kupfermangels im Sinne eines Cp bei oder unter 20% der Basislinie wie in dieser Studie definiert verabreicht wird, stabilisiert oder verringert werden kann. Von den Patienten, bei denen das Cp Zielniveau über mehr als 90 Tage aufrechterhalten wurde, wurde ein signifikanter Anteil der Fälle (5/6) stabilisiert ohne Nachteile auf deren Lebensqualität. Bei dieser Patientenpopulation mit fortgeschrittener Krankheit waren 39% der Behandelten in der Lage den Ziel Cp über die Zeitdauer aufrechtzuerhalten.
Das Erscheinungsbild und die Geschwindigkeit des Fortschreitens, die an den Patienten beobachtet wurden stellten ebenfalls nützliche Informationen bereit. Bei einem Patienten stellte sich die Stabilität der Krankheit an allen Stellen bis auf eine ein und er entschied sich aufgrund der Krankheitsstabilisation bei den lebensbedrohlicheren Krankheitsstellen (Eingeweide- und Paratracheale Lymphknoten) in der TM Therapie zu verbleiben. Interessanter Weise ist die Stelle des Fortschreitens bei den Patienten mit einem Melanom eine große Nebennierenmetastase, die zur Zeit bestrahlt wird. Diese und weitere Beobachtungen in dieser Untersuchung legen nahe, daß, während Kupfermangel ein allgemeiner Inibitor der Angiogenese sein könnte, die Verschiedenartigkeit der Tumortypen und die speziellen Orte der Metastasen die Antwort auf diese therapeutische Behandlung moaulieren können. Da es scheint, daß Läsionen deutlich schneller bei einer Kupfersättigung fortschreiten als während der TM Therapie, können zusätzliche Behandlungen, entweder systemisch oder lokal-regional, angewandt werden um die speziellen Fortschreitungsstellen zu behandeln, während es dem Patienten möglich ist in dem Kupfermangelstatus zu verbleiben.
Diese Studien belegen desweiteren, daß die Kombination der TM Therapie mit der Strahlentherapie, trastuzumab und Interferon-α keine sichtbaren Verschlimmerungen der Toxizität der zusätzlichen Behandlungsmethoden bewirkt. Zusammengefaßt, die vorläufigen Ergebnisse zur Sicherheit und Wirksamkeit, welche aus diesem Versuch gewonnen werden konnten, tragen die Anwendung von TM alleine oder in Kombination zur Behandlung von frühen metastasenbildenden Krankheiten, Minimalkrankheiten und bei helfenden risikoreichen klinischen Einstellungen einschließlich Chemoprevention.

Beispiel 4

Phase II/III Klinische Untersuchung von TM als Anti-Krebs Therapie

A. Einleitung

Vier Gesichtspunkte fließen bei der Gestaltung der Arzneidosis und dem Terminplan dieser Untersuchung ein. Der erste ist, daß die vorher verwendeten Dosisregime, obwohl wirksam beim Verringern des Kupfers, zu lange brauchen um den Cp-Endpunkt zu erreichen damit eine richtige Wirksamkeit festgestellt werden kann. Da bekannt ist, daß Tumore Kupfer absondern (Apelgot et al., 1986; Arnold and Sasse, 1961) werden anti-angiogene Effekte wahrscheinlich so lange nicht feststellbar sein, bis der systemische Kupfermangel vielleicht nach mindestens einigen Wochen bis Monaten aufrechterhalten wird. Daher ist es wichtig den Endpunkt des systemischen Kupfermangels (0-20% Cp-Niveau) so schnell als möglich zu haben um das Wirksamkeitspotential zu maximieren. Deshalb wird bei der vorliegenden Untersuchung eine "Beladungs-"Dosis für zwei Wochen eingesetzt um das Cp-Kriterium zu erreichen, gefolgt von einer geringeren Aufrechterhaltungsdosis um auf den Ziel Cp von 0-20% der Basislinie zu verbleiben. Diese Ausrührung setzt das in der Untersuchungsphase 1 gewonnene Wissen ein und bestimmt die Wirksamkeit von TM für eine stabile Krankheit zu sorgen oder Tumore Zii verringern.
Zweitens wird die Untersuchung bewerten ob eine wirksame Antwort abhängig davon ist, wie streng die Cp-Niveaus kontrolliert werden. Deshalb werden in einer ersten Gruppe von Patienten die Cp-Niveaus zwischen 10 und 20% aufrechterhalten und in einer zweiten Gruppe die Cp-Niveaus zwischen 0 und 10%.
Drittens wird die Untersuchung bestimmen, ob die Aufrechterhaltung des niedrigen Kupferstatus leichter durch eine Zinktherapie aufrechtzuerhalten ist. Die Erfinder haben Zink als eine FDA geprüfte Therapie zur Behandlung der Wilson-Krankheit entdeckt. Es wirkt durch die Induktion von Metallothionien im Darm und blockiert die Absorbti on von Kupfer. Deshalb wird bei sechs Patienten der niedrige Kupferstatus, unter Verwendung von 25 mg Zink 3 · täglich sowie mit erforderliche Dosisanpassungen um das Cp-Kriterium beizubehalten, aufrechterhalten.

B. Phase II Untersuchung

1. Beladungsdosis

Die Erfinder haben herausgefunden, daß ein Dosisverabreichungsplan von 20 mg 3 · täglich mit den Mahlzeiten und eine 1 · Dosis von 60 mg zwischen den Mahlzeiten das Cp-Niveau schneller auf < 20% reduziert als 20 mg 3 · täglich mit den Mahlzeiten und 20 mg 3 · täglich zwischen den Mahlzeiten. Deshalb wird dieser Dosisverabreichungsplan in der Untersuchungsphase II untersucht. Drei andere TM Beladungsdosen werden ebenfalls untersucht: Stufe 1: 20 mg 3 · täglich zwischen den Mahlzeiten und 20 mg 3 · täglich mit den Mahlzeiten bis der Cp < 20% ist (10 Patienten); Stufe 2 : 25 mg 3 · täglich zwischen den Mahlzeiten und 25 mg 3x täglich mit den Mahlzeiten bis der Cp < 20% ist (10 Patienten); und Stufe 3 : 30 mg 3 · täglich zwischen den Mahlzeiten und 30 mg 3 · täglich mit den Mahlzeiten bis der Cp < 20% ist (10 Patienten).
Da Ziel der Beladungsdosisstudie ist beim gewünschten Cp-Niveau (< 20% der Basislinie) innerhalb von 2-3 Wochen anzukommen. Die Untersuchung beginnt mit der Stufe 1. Wenn die Stufe 1 das gewünschte Cp-Niveau erreicht, sind alle 30 Patienten mit der Dosisstufe 1 beladen. Wenn die Stufe 1 das gewünscht Cp- Niveau nicht erreicht, wird die Untersuchung in die Beladungsdosisstufe 2 überführt und wenn nötig in die Dosisstufe 3. Jede dieser Dosen ist für 2 Wochen bis einige Monate sicher.

2. Aufrechterhaltungsdosis von TM

Zwei Stufen von Aufrechterhaltungsdosen werden untersucht: Stufe 1: TM Dosen die wenn nötig angepaßt sind um den CP bei 10-20% der Basislinie aufrechtzuerhalten (12 Patienten); und Stufe 2: TM Dosen, die wenn nötig angepaßt sind um den Cp bei 0-10% der Basislinie aufrechtzuerhalten (12 Patienten).
Das Ziel des Vergleichs beider Aufrechterhaltungsdosen ist ein generelles Bild darüber zu erhalten, ob eine striktere Kupferkontrolle dazu neigt, die Wirksamkeit zu verstärken. Üblicherweise werden die Tumortypen auf die beiden Stufen zufällig verteilt.

3. Aufrechtserhaltungsdosis von Zink

2 Patienten von jeder Beladungsdosisgruppe, ingesamt 6 Patienten, werden mit der Zinktherapie zur Aufrechterhaltungskontrolle behandelt. Die Untersuchung beginnt mit 25 mg Zink 3 · täglich (nicht mit dem Essen) und einer Justierung der Dosis zur Aufrechterhaltung des CP unterhalb 20% der Basislinie.
Das Ziel der Zinkstudie besteht darin, zu sehen, ob es leichter ist mit Zink den Kupferstatus während der Aufrechterhaltung als mit TM zu kontrollieren und ein generelles Bild darüber erhalten, ob die Wirksamkeit von Zink generell vergleichbar mit der von TM ist.

4. Patientenauswahlkriterien

Die Patientenauswahlkriterien beinhalten: a) metastasenbildendes Adenokarzinom, schuppenartiges Karzinom oder Sarkom irgendeines Ursprungsorgangs; b) messbare Krankheit mittels Röntgenaufnahme des Brustraumes, CAT- Scannierung oder vollständiger Knochenbildschicht; c) fortschreitenden Krank heit, die mindestens einmal innerhalb von 3 Monaten vor dem Beginn dokumentiert wurde; d) die Möglichkeit eine Einverständniserklärung zu erhalten; e) einen ECOG Funktionsstatus von 0-1 und f) eine Lebenserwartung > 6 Monate.
Die Ausschlußkritenen beinhalten ein Hämatokrit weniger als 29, LFT mehr als 4 · des normalen oder schwere gleichzeitige medizinische Krankheiten die eine intensive Behandlung erfordern.

5. Die Parameter

Die Parameter, die bei den Patienten verfolgt werden, sind: 1) CBC Thrombozyten, wöchentlich; 2) Elektrolyte, BUN, Kreatinin, LFT wöchentlich; 3) Blut für Serum Kupfer, Molybdän, Ceruloplasmin wöchentlich; 4) Harnuntersuchung wöchentlich; 5) klinischer Zustand alle 2 Wochen; 6) Tumormessung alle 4 Wochen und 7) untersuchender angiogenese-sensitiver Ultraschall alle 8 Wochen.

6. Toxizitätsendpunkte

Wie zuvor wird das Arzneimittel abgesetzt, wenn entweder der Hämatokrit oder WBC unter 80% der Basislinie fällt. Das Arzneimittel wird ebenfalls abgesetzt, wenn es ein Anzeichen für eine mögliche systemische Toxozität gibt wie z. B. ein abnormaler Leber- oder Nierenfunktionstest oder irgendeine andere Toxizität mit einer Stufe von 3 oder höher gemäß dem NCI Kriterium.

7. Dauer der Untersuchung

Wenn innerhalb von 6 Monaten kein Anzeichen einer Krankheitsstabilisierung oder ein Rückgang beim Patienten eintritt, wird die Untersuchung bei diesem Patienten beendet. Andernfalls wird die Therapie so lange fortgesetzt, wie die Krankheit innerhalb von 25% der Ursprungsgröße an allen Stellen kontrollierbar ist, keine signifikante Toxizität auftritt und der Patient eine Weiterbehandlung wünscht.

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Claims

1. Zusammensetzung, enthaltend eine Thiomolybdatverbindung, die mit wenigstens einem ersten Kohlenhydratmolekül assoziiert ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Thiomolybdatverbindung wenigstens einen ersten Eisenrest enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Thiomolybdatverbindung wenigstens einen ersten Sauerstoffrest enthält.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Thiomolybdatverbindung um Dodecathiodimolybdat, Tetrathiomolybdat, Eisenoctathiodimolybdat, Trithiomolybdat, Dithiomolybdat oder Monothiomolybdat handelt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Thiomolybdatverbindung um Tetrathiomolybdat handelt.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem wenigstens einen ersten Kohlenhydratmolekül um ein Monosaccharid handelt.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem wenigstens einen ersten Kohlenhydratmolekül um ein Disaccharid handelt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem wenigstens einen ersten Kohlenhydratmolekül um Saccharose handelt.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem wenigstens einen ersten Kohlenhydratmolekül um ein Oligosaccharid handelt.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Thiomolybdatverbindung nicht kovalent an das wenigstens eine erste Kohlenhydratmolekül gebunden ist.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Thiomolybdatverbindung über Wasserstoffbrückenbindungen an das wenigstens eine erste Kohlenhydratmolekül gebunden ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Thiomolybdatverbindung kovalent an das wenigstens eine erste Kohlenhydratmolekül gebunden ist.

13. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von Kohlenhydratmolekülen zur Thiomolybdatverbindung zwischen 100 : 1 und 5 : 1 liegt.

14. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von Kohlenhydratmolekülen zur Thiomolybdatverbindung etwa 30 : 1 beträgt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche Tetrathiomolybdat assoziiert mit etwa 30 Saccharosemolekülen enthält.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Thiomolybdatverbindung mit wenigstens einem ersten und wenigstens einem zweiten, davon verschiedenen. Kohlenhydratmolekül assoziiert ist.

17. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dispergiert in einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.

18. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zur Verwendung bei der Behandlung bzw. Prävention einer durch aberrante Vaskularisierung gekennzeichneten Erkrankung.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, zur Verwendung bei der Behandlung bzw. Prävention von Krebs.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, welche weiterhin Zink enthält.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 19, welche weiterhin ein zweites Mittel gegen Krebs enthält.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem zweiten Mittel gegen Krebs um ein chemotherapeutisches Mittel, ein radiotherapeutisches Mittel, ein getrenntes, kupferbindendes Mittel, ein antiangiogenetisches Mittel oder ein apoptoseinduzierendes Mittel handelt.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung bei der Behandlung bzw. Prävention von feuchter Makuladegeneration.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 18, zur Verwendung bei der Behandlung bzw. Prävention von rheumatoider Arthritis.

25. Verwendung eines Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung bzw. Prävention einer Erkrankung, die durch aberrante Vaskularisierung in einem menschlichen Patienten gekennzeichnet ist.

26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel zur Behandlung bzw. Prävention von Krebs vorgesehen ist.

27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel zur Behandlung bzw. Prävention von feuchter Makuladegeneration oder rheumatoider Arthritis vorgesehen ist.

28. Therapeutisches Kit, enthaltend, in wenigstens einem ersten geeigneten Behältnis, eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 24.

29. Therapeutisches Kit nach Anspruch 28, welches weiterhin wenigstens ein zweites Mittel gegen Krebs enthält.