DE69903800T2

DE69903800T2 - Vaskularisierte perfundierte anordnungen für mikrogewebe und mikroorgane

Info

Publication number: DE69903800T2
Application number: DE69903800T
Authority: DE
Inventors: Karel Domansky; G. Griffith; J. Powers; R. Tannenbaum; D. Thompson
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2003-10-02
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: CA2324208C; DE69903800D1; EP1064353A2; CA2324208A1; EP1064353B1; WO1999047922A2; ATE227338T1; US6197575B1; WO1999047922A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Gewebe-Arrays im Mikromaßstab und deren Konstruktion, wobei der Gewebe-Array im Mikromaßstab aus einer Mikromatrix konstruiert ist, die mit Zellen besät ist und ein Mikrogewebe und/oder ein Mikroorgan bildet, sowie Verfahren zur Verwendung der Gewebe-Arrays im Mikromaßstab für eine Vielzahl von Systemen und Tests, beispielsweise für die Bestimmung der Wirkung biologischer und/oder chemischer Agenzien auf die Gewebe-Arrays im Mikromaßstab oder für den Nachweis der Anwesenheit biologischer und/oder chemischer Agenzien mittels Gewebe-Arrays im Mikromaßstab.
Das Tissue-Engineering hat sich als ein Wissenschaftsgebiet entwickelt, das das Potenzial besitzt, die Humantherapie durch das Erzeugen anatomischer Gewebe und Organe für die rekonstruktive Chirurgie und die Transplantation voran zu bringen. Es vereinigt die Wissenschaftsgebiete der Materialwissenschaft, der Zell- und Molekularbiologie sowie der Medizin, um neue Vorrichtungen für den Ersatz, die Reparatur und die Rekonstruktion von Geweben und Strukturen im Körper zu liefern. Während der letzten zehn Jahre wurden viele Ansätze vorgeschlagen. Ein Ansatz besteht darin, gewebsspezifische Zellen mit offenen, porösen, polymeren Gerüsten zu kombinieren, die dann implantiert werden können. Große Zellzahlen können zur Polymervorrichtung in Zellkultur gegeben und über eine Diffusion am Leben erhalten werden. Nach der Implantation erfolgt ein Einwachsen von Gefäßen, die Zellen remodellieren, und es wird ein neues, stabiles Gewebe gebildet, während sich das Polymer durch Hydrolyse zersetzt.
Es wurden verschiedene Ansätze für die Herstellung von Vorrichtungen zur Gewebsregeneration über das Wachstum von Zellen entweder in vitro oder in vivo beschrieben. Polymere Vorrichtungen wurden für den Ersatz der Organfunktion oder für die Bereitstellung einer stützenden Struktur beschrieben. Über derartige Verfahren wurde von Vacanti et al., Arch. Surg. 123: 545-49 (1988), im US-Patent Nr. 4060081 an Yannas et al., im US Patent Nr. 4 485 097 an Bell und im US-Patent Nr. 4 520 821 an Schmidt et al. berichtet. Im allgemeinen können die Verfahren, die von Vacanti et al. und Schmidt et al. eingesetzt wurden, durchgeführt werden, indem existierende Polymerfaser-Zusammensetzungen für eine Implantation und eine Besiedelung mit Zellen ausgewählt und adaptiert werden, während die Verfahren von Yannas und Bell sehr spezifische, schwammartige Strukturen aus modifiziertem Collagen erzeugen.
Vorrichtungen für eine Gewebsregeneration müssen porös mit untereinander verbundenen Poren sein, um die Penetration durch Zellen und Gewebe zu ermöglichen, wenn die Vorrichtung eine nennenswerte Dicke aufweist. Faktoren wie die Porengröße, die Form und der Krümmungsreichtum können alle das Einwachsen von Gewebe beeinflussen, aber sie sind mit den üblichen Verarbeitungstechniken schwer zu steuern. Das US-Patent Nr. 5 518 680 an Cima & Cima beschreibt die Verwendung von Herstellungstechniken für frei gestaltete feste Formen, insbesondere das dreidimensionale Drucken von Polymerpulvern, zur Erzeugung von Matrices, die mit dissoziierten Zellen besät und zur Bildung neuer Strukturen implantiert werden können. Die Vorteile der Verfahren zur Herstellung frei gestalteter fester Formen für die Konstruktion spezifischer Strukturen aus biokompatiblen synthetischen oder natürlichen Polymeren, anorganischen Materialien oder Komposit-Strukturen aus anorganischen Materialien und Polymeren, wobei die resultierende Struktur definierte Porengrößen, Formen und Orientierungen aufweist, insbesondere unterschiedliche Porengrößen und Orientierungen innerhalb derselben Vorrichtung, mit einer oder unterschiedlicher Oberflächenchemie oder Textur an verschiedenen spezifischen Stellen innerhalb der Vorrichtung, liegen auf der Hand. Allerdings haben die Vorrichtungen noch eine wesentliche Limitierung: das Einwachsen von neuem Gewebe unter Bildung von Blutgefäßen, die die implantierten Zellen am Leben erhalten, muss zum richtigen Zeitpunkt bezüglich der Zunahme der Zelldichte innerhalb der Matrix erfolgen, damit die implantierten Zellen versorgt werden, und andere Gewebe dürfen die Matrix nicht einschließen oder infiltrieren, damit die implantierten Zellen nicht erstickt oder auf andere Weise zerstört werden.
WO-A-96/40002 an das Massachusetts Institute of Technology und die Children's Medical Center Corporation beschreiben die Verwendung von Herstellungsverfahren für frei gestaltete feste Formen (solid free-form fabrication (SFF) methods) zur Herstellung von Vorrichtungen zur Ermöglichung einer Gewebsregeneration und für das Einsäen und Implantieren von Zellen unter Bildung von Organkomponenten und Bauelementen, wobei die Vorrichtungen außerdem eine gesteuerte Freisetzung biologisch aktiver Agenzien bereit stellen können, wobei die Matrix durch ein Netzwerk von Hohlräumen gekennzeichnet ist, das funktionell dem natürlich vorkommenden Gefäßsystem des Gewebes, das von den implantierten Zellen gebildet wird, äquivalent ist und das mit Endothelzellen ausgekleidet und zum Zeitpunkt der Implantation an Blutgefäße oder andere Gänge gekoppelt werden kann, wobei ein Netzwerk aus Gefäßen oder Gängen in der gesamten Matrix gebildet wird.
PCT WO 90/04645 an Molecular Devices Corporation offenbart ein Verfahren und eine Apparatur für den Nachweis der Wirkung verschiedener Agenzien auf lebende Zellen mittels einer Mikro-Durchflusskammer. Allerdings ermöglicht die Kammer nur einen Flüssigkeitsstrom in einer Ebene über die Oberseite der Zellen, die in einer Schicht auf der Unterseite der Kammer wachsen. Die Apparatur stellt kein Mittel zur Aufrechtherhaltung der Vitalität von Zellen bereit, die längs der Wände der Kammer gehalten werden.
WO/A-95/24464 offenbart einen Durchfluss-Bioreaktor für die Haltung von Zellkulturen in Perfusionsmedien, der aus einem Gefäß besteht, dessen untere innere Wand mit Rillen für die Förderung des Absetzens und des Anheftens von Zellen versehen ist. Die Zellen proliferieren und differenzieren im Inneren der Rillen, ohne dass sie mit dem Hauptstrom des Mediums in Berührung kommen. EP-A-0 363 262 offenbart einen Zellinkubator, der aus einer Kulturkammer besteht, die sandwichartig zwischen zwei Flüssigkeitskanälen mit Medium eingeschlossen ist. Zumindest ein Abschnitt der Wände, die die genannten Kanäle von der Kammer trennen, besteht aus einer Membran, über die Substanzen ausgetauscht werden können.
Keine dieser Techniken stellt jedoch ein Verfahren zur Aufrechterhaltung von Gewebe in vitro bereit oder zur Verwendung des Gewebes als ein diagnostisches oder Screening- Werkzeug.
Zellen, die in eine typische In-vitro-Kultur gebracht werden, verlieren im allgemeinen wenigstens einige differenzierte physiologische Schlüsselfunktionen, die sie normalerweise als Bestandteil organisierter Gewebe im Körper ausüben. So können kultivierte Zellen zwar für bestimmte Anwendungen angemessen sein, beispielsweise für den Nachweis von Toxinen und Pathogenen, aber mit Sicherheit versagen sie bei anderen Anwendungen, beispielsweise beim Screening von Arzneimitteln, die durch die Gewebe metabolisiert werden, oder von Arzneimitteln, die durch die Wechselwirkung mit einem komplexen Organ und nicht nur mit einem einzelnen isolierten Zelltyp ausgeschieden werden. Beispielsweise existiert kein In-vitro- Modell für die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) oder dem Hepatitis-C-Virus (HCV), wahrscheinlich deshalb, weil primäre Hepatozyten in einer typischen Kultur schnell aufhören, Oberflächenrezeptoren zu exprimieren, die die Viren zum Eindringen in die Zelle verwenden. Man kann aus diesem Beispiel für ein bekanntes Pathogen, das derzeit nicht mit kultivierten Zellen gescreent werden kann, schließen, dass unbekannte Pathogene (oder Toxine), die oft rezeptorvermittelt aufgenommen werden, ganz ähnlich einem Nachweis mit kultivierten Zellen entgehen könnten. Ganz ähnlich können Arzneimittel, die von zellspezifischen Rezeptoren gebunden werden müssen, damit sie von den Zellen aufgenommen und aktiv sein können, ebenfalls nicht in derartigen Systemen getestet werden. Der Fremdstoffmetabolismus, der primär durch ein Enzym-Set in der Leber durchgeführt wird, ist eine weitere Funktion, die in kultivierten Hepatozyten schnell verloren geht. Zwar machen die hepatischen Enzyme die meisten exogenen Verbindungen weniger toxisch, aber andere Moleküle (ein bekanntes Beispiel ist das Schmerzmittel Acetaminophen) können auch toxischer werden, wenn sie durch die Leber metabolisiert werden. Es ist deshalb kritisch, ein System für das Screening von Arzneimitteln zu haben, das die In-vivo-Bedingungen nachahmen kann.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Apparatur für In-vitro-Analysen bereit zu stellen, die wirkungsvoll physiologische Reaktionen von Geweben und/oder Organen, wie auf eine Virusinfektion, sowie den Metabolismus von Fremdstoffen modellieren können.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurden Systeme entwickelt, die aufweisen (1) eine Mikromatrix und eine Perfusionsanordnung, die geeignet sind für das Aussäen und das Anheften von Zellen auf und in der gesamten Matrix und für die Morphogenese der ausgesäten Zellen zu einem komplexen hierarchischen Gewebe oder zu Organstrukturen, wobei die Matrix Kanäle oder Gefäße aufweist, durch die Kulturmedium, Blut, Gase und andere Nährstoffe oder Körperflüssigkeiten perfundiert werden können, während gleichzeitig die Gradienten von Nährstoffen und exogenen Metaboliten über den gesamten Perfusionsweg unabhängig von der Perfusionsgeschwindigkeit gesteuert werden können, und (2) Sensoreinrichtungen zum Nachweis von Veränderungen, entweder in Zellen, die auf der oder an die Matrix angeheftet sind, oder von Materialien, gegen die die Zellen auf oder in der Matrix exponiert sind. Die Mikromatrices werden mittels herkömmlicher Techniken der Silicium-Verarbeitung hergestellt, beispielsweise durch Photolithographie, Nassätzen oder tiefes reaktives Ionenätzen, Mikro-Materialbearbeitung, elektrochemische Abtragung, reaktives Spritzgießen, thermoplastisches Spritzgießen, Mikroformen, Ausstanzen, einer beliebigen der Techniken zur Herstellung frei gestalteter fester Formen, wie dreidimensionales Drucken, oder mittels anderer Herstellungsverfahren, die Mikrolöcher in Materialbögen erzeugen können, insbesondere von Verarbeitungstechnologien für Kunststoffe, wie Mikroformen, Prägen, Laserbohren, Laserablation oder elektrochemische Abtragung. Die Zellen können eines Typs oder unterschiedlichen Typs sein, entweder differenzierte Zellen, wie Endothelzellen oder Parenchymzellen, einschließlich von Nervenzellen, oder undifferenzierte Zellen, wie Stammzellen oder embryonale Zellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix mit einer Mischung von Zellen besät, zu denen Endothelzellen gehören, oder mit totipotenten/pluripotenten Stammzellen, die zu Zellen ausdifferenzieren können, zu denen Endothelzellen gehören, die die Kanäle unter Bildung von "Blutgefäßen" auskleiden, sowie wenigstens einem Typ von Parenchymzellen, beispielsweise Hepatozyten, Pankreaszellen oder anderen Organzellen.
Die funktionelle Einheit in diesen Mikromatrices ist der Kanal, der die Zellen und ihre Exsudate (beispielsweise Moleküle der extrazellulären Matrix) in der gewünschten morphologischen Struktur enthält. Der Begriff "Kanal" bezieht sich auf ein Loch mit konstantem oder systematisch variiertem Querschnitt durch einen Bogen eines Materials, der ungefähr 50 bis 500 um dick ist, vorzugsweise zwischen 150 und 400 um, mit einer definierten Form des Querschnittes, die rechteckig, oval oder rund oder eine dieser Formen mit einer Feinstruktur sein kann, beispielsweise mit Einbogungen von der Größe der Zelle oder noch kleiner, mit einer definierten Oberflächenchemie und mit definierten Abmessungen, typischerweise im Bereich von 75 bis 1000 um im Querschnitt, wobei die Abmessungen für jedes einzelne Gewebe oder jeden einzelnen Organtyp optimiert sind. (Beispielsweise sind die bevorzugten Abmessungen eines Kanals in rechteckiger oder ovaler Form für die Leber 100 bis 200 um längs der einen Achse und wenigstens 100 um längs der anderen Achse. Embryonale Stammzellen bevorzugen Kanäle mit Abmessungen zwischen 200 und 1200 um.) Die Merkmale der Kanäle sind so konstruiert, dass eine Wirkung auf das Zellverhalten, beispielsweise die Organisation der Zellen, ausgeübt wird. Das Zellverhalten ist nicht einfach die Folge der Vorhandenseins irgendeines Loches. Der Kanal ist so konstruiert, dass er die Zellen dazu bringt, sich im Kanal unter Ausbildung von Gewebe zu organisieren, entweder in fester Form mit darin integrierten Blutgefäßen, oder in Form von Aggregaten oder Sphäroiden. Die Induktion der Struktur kann unter statischen Bedingungen (keine Perfusion) erfolgen, oder es kann während der Morphogenese Flüssigkeit durch die Kanäle perfundiert werden, um die Bildung einer histotypischen Struktur zu unterstützen, in Abhängigkeit vom Gewebe. Man kann sowohl die Perfusionsgeschwindigkeit durch den Array als auch die Konzentrationen der Nährstoffe/Metaboliten/Testverbindungen auf jeder Seite des Kanals mit beliebigen Mitteln unabhängig voneinander steuern.
Ein "Mikrogewebe" bezieht sich auf eine synthetisch gebildete Masse von Zellen, die eine Gewebestruktur oder eine Struktur bilden, die Gewebefunktionen ausübt. Der Begriff "Gewebe", wie hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Aggregat von Zellen, die morphologisch und funktionell mehr oder weniger ähnlich sind. Dagegen enthält ein "Mikroorgan" Zellen unterschiedlicher Morphologie und/oder Funktion, beispielsweise Hepatozyten und Endothelzellen. Die Einheit des Mikrogewebes oder -organs, die in einem einzelnen Kanal enthalten ist, besteht vorzugsweise aus weniger als ungefähr 10000 Zellen, bevorzugter aus weniger als ungefähr 5000 Zellen, und am bevorzugtesten aus weniger als ungefähr 2000 Zellen. Die Einheit des Mikrogewebes oder -organs, die in einem einzelnen Kanal enthalten ist, besteht vorzugsweise aus wenigstens ungefähr 150 Zellen. Mikrogewebe (oder Mikroorgane, falls sie aus verschiedenen Zelltypen bestehen) können kombiniert werden, um Gewebe-Arrays aus mehreren Einheiten zu bilden. Die Dichte der Kanäle im Array hängt von den Nachweisgrenzen des Tests, der durchgeführt, wird ab, von der Größe der Kanäle und den Materialien, die zur Konstruktion verwendet wurden. Vorzugsweise liegen die Dichten bei wenigstens 10 bis 100 Gewebe/cm², wobei die Gesamtzahl der Kanäle durch die Masse oder die Zahl der Zellen bestimmt wird, die für den jeweiligen Test benötigt wird. Ein "Mikrogewebe- Array" bezieht sich auf einen Array aus synthetisch erzeugten Mikrogeweben. Der Array enthält vorzugsweise wenigstens ungefähr 4 Mikrogewebe, bevorzugter wenigstens ungefähr 50 Mikrogewebe, aber er kann auch nur einen Kanal enthalten, wenn der Messwert mit der Zahl von Zellen, die in einem einzigen Kanal enthalten sind, ermittelt werden kann.
Das System kann dazu verwendet werden, um Materialien bezüglich einer Wirkung auf die Zellen zu screenen, um Zellen bezüglich eines Effektes auf die Materialien (beispielsweise auf eine Weise, die dem Gewebemetabolismus eines Arzneimittels äquivalent ist) zu screenen, um ein Material oder ein biologisches Agens zu testen, das zuerst Zellen oder Gewebe infizieren muss, beispielsweise Viren, um eine biologische oder nur einmal vorkommende Zellpopulation zu vermehren, beispielsweise Stammzellen, oder um eine Umgebung für eine Gentherapie bereit zu stellen. Die Mikrogewebe-Arrays sind besonders nützlich für die Untersuchung vieler Phänomene, einschließlich der Ausscheidung, des Metabolismus, der Aktivierung, des Transports und der Bioverfügbarkeit von Fremdstoffen, einschließlich von Arzneimittelkandidaten. Die Mikrogewebe-Arrays können auch dazu verwendet werden, die Toxizität, Teratogenität, Genotoxizität, Kanzerogenität und Mutagenität bezüglich der basalen, lokalen und/oder organspezifischen Auswirkungen zu untersuchen, und zwar unter Bedingungen einer akuten oder chronischen Exposition. Die Mikrogewebe-Arrays können dazu verwendet werden, Krankheitsmodelle zu konstruieren, die für Studien über die Auswirkungen chemischer und/oder biologischer Agenzien auf den Verlauf der Erkrankung eingesetzt werden können. Die Mikrogewebe-Arrays können dazu verwendet werden, die Anwesenheit infektiöser Agenzien sowie chemischer und biologischer Waffen nachzuweisen. Die Mikrogewebe-Arrays können auch für Dosisfindungsstudien für Arzneimittelkandidaten verwendet werden.
Die Ergebnisse dieser Studien können in mathematische Modelle eingegeben werden, um die Reaktion von Organen in vivo vorherzusagen. Die Ergebnisse können auch in mathematische Modelle eingegeben werden, um die Pharmakokinetik und/oder Pharmakodynamik chemischer und biologischer Agenzien vorherzusagen. Die Systeme, die die Mikrogewebe-Arrays einsetzen, können mit anderen Testsystemen integriert werden, beispielsweise solchen, die Genomics, die Gen-Transkription, die Protein-Expression sowie andere interessante biologische Phänomene betreffen. Im Vergleich zu Testsystemen, die ganze Organe einsetzen, führen die Testsysteme unter Verwendung von Mikrogewebe-Arrays zu Ergebnissen, die pro Test bei weitem kostengünstiger erhalten werden. Im Vergleich zu Testsystemen mit Gewebeschnitten oder mit Zellen liefern die Testsysteme, die Mikrogewebe- Arrays einsetzen, Ergebnisse, die pro Test ähnlich viel kosten. Allerdings sind die Ergebnisse für die menschliche Gesundheit relevanter, da die Zellen im Mikrogewebe-Array eine hohe Vitalität sowie ihren Phänotyp und ihre differenzierten Funktionen bewahren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines Mikro-Arrays mit Gewebeeinheiten von der Größe eines Kapillarbettes, mit einem spektroskopischen optischen Sensorsystem für den Nachweis von Veränderungen der Fluoreszenzintensität/des Fluoreszenzspektrums endogener oder exogener Fluorophore im Gewebe nach einer Verletzung.
Fig. 2A-2C sind schematische Darstellungen der Konfiguration des Reaktor-Prototyps II, die den Reaktor während der Aussaat der Zellen (Fig. 2A), den Reaktor, wie er im Querstrom-Modus arbeitet (Fig. 2B), und den Reaktor, wie er im Modus des erzwungenen Flusses arbeitet (Fig. 2C), zeigen.
Fig. 3A und 3B sind schematische Darstellungen der Herstellung einer Vorrichtung auf Silicium-Basis. Fig. 3A ist das Maskenmuster für die Herstellung von Kanälen mit zylindrischen Kerben in den Wänden; die Kanäle werden den gezeigten Querschnitt haben. Der Durchmesser der Kerben kann maßgeschneidert werden, damit er dem Durchmesser der Parenchymzellen entspricht (beispielsweise 25 um für ES-Zellen). Fig. 3B ist eine Darstellung der vorgeschlagenen selektiven Modifikation der Oberflächenchemie des Kanals. Das Innere der Kanäle bleibt nicht-modifiziertes Silicium oder Silicium, das mit einem Fluor-Polymer beschichtet ist, während die exponierten Oberflächen mit einer Silanschicht auf PEG-Basis beschichtet sind, um die anfängliche Zelladhäsion zu hemmen. Die Innenseiten der Kerben sind mit ECM- Proteinen oder anderen Stoffen, die eine Adhäsion fördern, beschichtet, um die Zelladhäsion zu fördern: die exponierten silanisierten Abschnitte verhindern die Adhäsion von Proteinen.
Fig. 4A und 4B sind schematische Darstellungen der Reorganisation von Zellmischungen in Kanälen mit einer Oberflächentextur und einer selektiv modifizierten Oberflächenchemie, und zwar in einer frühen Phase (Fig. 4A) und nach der Reorganisation (Fig. 4B).
Fig. 5A und 5B sind schematische Darstellungen einer Apparatur zur Verwendung von Mikrogewebe-Arrays als Teil eines High-Throughput-Batchsystems für die chemische und biologische Testung, wobei ein Mikrogewebe-Array in jeder Vertiefung einer Multiwell-Platte angeordnet ist (Fig. 5A), und wobei die Multiwell-Platte auf der Oberseite einer Vakuumkammer angeordnet ist (Fig. 5B).
Fig. 6A und 6B sind schematische Darstellungen einer Apparatur zur Verwendung von Mikrogewebe-Arrays als Teil eines High-Throughput-Batchsystems für die chemische und biologische Testung, wobei die Multiwell-Platte auf der Oberseite einer Vakuumkammer angeordnet ist und ein Verteilersystem zur wiederholten Zuführung von Flüssigkeit zu jedem Well verwendet wird (Fig. 6A), und wobei die Verteilerplatte auf der Oberseite einer Vakuumkammer angeordnet ist, ein Verteilersystem zur wiederholten Zuführung von Flüssigkeit zu jedem Well verwendet wird und ein Sensor-Array zum Nachweis von Veränderungen in jedem Well verwendet wird (Fig. 6B).
Fig. 7 ist das Flussdiagramm eines Prozesses, das eine Apparatur für die Verwendung eines Mikrogewebe-Arrays als Teil eines Systems mit einem kontinuierlichen Fluss für die chemische und biologische Testung zeigt.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die ein Konzentrationsprofil eines Arzneimittels in einem Test-Target in Abhängigkeit von der Zeit zeigt, wie es über die Verwendung des Systems mit dem kontinuierlichen Fluss, das in der Fig. 7 dargestellt ist, erhalten werden kann.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die den Korrelationskoeffizienten zwischen einem In-vivo-Test und der Vorhersage aus einem Mikroorgan-Test veranschaulicht.
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung eines Arrays aus Mikrogewebe-Arrays.
Fig. 11 ist ein Flussdiagramm eines Prozesses eines differenziellen Bioreaktors.
Fig. 12A und 12B sind schematische Darstellungen der Konstruktion einer epithelialen Sperrschicht unter Verwendung von zwei Chips, eines unteren Chips mit vaskularisierten Gewebekanälen (Fig. 12A) sowie Querschnittsansichten des oberen und des unteren Chips, die die Verbindungen zwischen den offenen Kanälen und der epithelialen Sperrschicht zeigen (Fig. 12B).
Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, die die Daten bezüglich der metabolischen Aktivität zeigt, die im Labor mittels eines Mikroorgan-Arrays erhalten wurden, der aus Hepatozyten und Endothelzellen bestand, die in den Kanälen eines Silicium-Wafers enthalten waren, wobei die maximale metabolische Aktivität gegen die Dauer der Perfusion des Mikroorgans in Minuten aufgetragen ist. Die metabolische Aktivität wurde durch das Quantifizieren der im Perfusat des Mikroorgan-Arrays vorhandenen Metaboliten bestimmt. Der Mikroorgan-Array wurde mit Medium perfundiert, das ein Sondensubstrat für die enzymatische Aktivität in Abwesenheit von Inhibitoren der enzymatischen Aktivität (t = 0-240 Minuten), in Anwesenheit des Inhibitors (t = 240-385 Minuten) und dann wieder in Abwesenheit des Inhibitors (t = 385-585 Minuten) enthielt.
Fig. 14A-14C sind Illustrationen, die die Konstruktion einer Gewebematrix durch das Mischen von 100 000 Hepatozyten und Endothelzellen/ml (Fig. 14A) zeigen, das Injizieren der Hepatozyten und Endothelzellen (ungefähr 0,5 bis 1 ml) in die Matrix (Fig. 14B) und die Inkubation der mit den Zellen besäten Matrix in 5% CO&sub2; bei 37ºC (Fig. 14C).
Fig. 15A und 15B sind graphische Darstellungen, die die Albumin-Sekretion aus perfundierten Konstrukten aus Zellen und Gerüst in Abhängigkeit von der Zeit zeigen. Die Fig. 15A zeigt die Albumin-Sekretion (pg/Zelle/h) aus perfundierten Konstrukten aus Zellen und Gerüst (Kreise) nach 24 oder 48 Stunden statischer Kultur. Die Gerüste wurden mit Kulturmedium 90 Minuten lang perfundiert, und das Effluat wurde auf Rattenalbumin untersucht. Die Quadrate zeigen die Sekretionsdaten für Platten, die mit 3 ug/ml Collagen beschichtet waren. Die Fig. 15b zeigt die Albumin-Sekretion (ng/min) in Abhängigkeit von der Perfusionszeit (Stunden) aus drei getrennten perfundierten Konstrukten aus Zellen und Gerüst (Kanäle von 200 um · 400 um) nach 48 h statischer Kultur. Die Gerüste wurden mit Kulturmedium perfundiert, und das Effluat wurde jede Stunde, beginnend 30 Minuten nach dem Start der Perfusion, gesammelt.
Fig. 16 ist eine Aufsicht auf eine Probenkammer.
Fig. 17 ist eine graphische Darstellung der EROD-Aktivität des perfundierten Bioreaktors, wobei der Prozentsatz der maximalen Resorufin-Bildung in Abhängigkeit von der Perfusionszeit in Minuten dargestellt ist.
Fig. 18 ist eine schematische Darstellung eines Systems zur Probenahme.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1. Mikromatrix-Systeme

Matrices

Es wird ein System beschrieben, zu dem eine Matrix gehört, Zellen, die der Matrix anhaften und organisierte Gewebe- oder Organstrukturen im Inneren der Matrix bilden, eine Quelle für Nährstoffe und Sauerstoff zum Aufrechterhalten der Zellvitalität, ein Mittel zur Steuerung von Gradienten von Nährstoffen oder anderen Molekülen über den Perfusionsweg in der Matrix unabhängig von der Geschwindigkeit des Stromes der Flüssigkeit sowie Sensoreinrichtungen für den Nachweis von Veränderungen in den Zellen oder der Agenzien, die den Zellen zugeführt werden.
Die funktionelle Einheit der Matrix ist der Kanal. Die Kanäle haben typischerweise Durchmesser zwischen 75 und 400 um. Bei den bevorzugten Ausführungsformen ist die Matrix eine Mikromatrix, auch wenn die Abmessungen von Nanometern bis Millimetern reichen können. Der Array hat typischerweise eine Querschnittsfläche von wenigen Quadratzentimetern oder weniger, vorzugsweise von 1 cm² oder weniger. Die Tiefe des Arrays liegt typischerweise bei weniger als 1 cm, vorzugsweise 1 mm oder weniger. Die gleichen Überlegungen bezüglich der Größe gelten für Arrays von Mikrogeweben für Testzwecke.
Die Kanäle werden mit Zellen besät, die im Kanal ein Gewebe bilden, oder die Aggregate oder Sphäroide bilden, die in den Kanälen suspendiert sind oder dort gehalten werden. Jede Matrixschicht, die Kanäle innerhalb einer einzigen Ebene enthält, wird als Mikrogewebe bezeichnet. Diese "Mikrogewebe" können entweder Gewebe sein, d. h. aus funktionell ähnlichen Zellen bestehen, oder Gewebe, d. h. aus einer Mischung von Zellen bestehen, die unterschiedliche Funktionen und/oder Phänotypen aufweisen. Der Einfachheit halber werden beide Begriffe als "Mikrogewebe" bezeichnet, es sei denn, es wird etwas anderes festgestellt. Die Mikrogewebe werden zusammengeschichtet, um Mikrogewebe oder Mikroorgan-Arrays zu bilden. Die Arrays können aus Geweben bestehen, die aufeinander gestapelt sind, nebeneinander gestapelt sind oder beides. Sie können miteinander verbunden oder isoliert sein. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird in jedem Kanal ein Organ gebildet, wobei jeder Kanal verschiedene Zelltypen mit unterschiedlichen Funktionen enthält. Der primäre Grund dafür, dass sie sich in einzelnen Kanälen befinden, ist der, dass sie über große Strecken keine entsprechenden Gewebestrukturen ausbilden. Die Zahl der Zellen, die eine Gewebe-/Organstruktur bilden, ist fest, und somit wird die Zahl der Zellen, die für einen bestimmten Test benötigt werden, dadurch erhalten, dass die Zahl der einzelnen Mikroorgane im Gesamt-Array entsprechend gewählt wird. Das Mikrogewebe wurde vorzugsweise von weniger als ungefähr 10 000 Zellen gebildet, bevorzugter von weniger als ungefähr 5 000 Zellen, und am bevorzugtesten von weniger als ungefähr 2 000 Zellen. Das Mikrogewebe wird vorzugsweise von mindestens ungefähr 150 Zellen gebildet, obwohl die Mikromatrix mit lediglich 25 bis 50 Zellen besät werden kann. Ein Mikrogewebe-Array bezieht sich auf einen Array aus synthetisch erzeugten Mikrogeweben, vorzugsweise von wenigstens ungefähr 4 Mikrogeweben, bevorzugter von wenigstens ungefähr 50 Mikrogeweben.
Der Zelltyp bzw. die Zelltypen bestimmt bzw. bestimmen die Funktion des Gewebes. Der Begriff "Gewebe", wie er hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Aggregat aus Zellen mit mehr oder weniger ähnlicher Morphologie und Funktion. Bei einer Ausführungsform wird die Matrix mit einer Mischung aus Zellen besät, die Endothelzellen und wenigstens einen Typ von Parenchymzellen enthält, beispielsweise Hepatozyten, Pankreaszellen oder Zellen eines anderen Organs, oder die Matrix wird mit totipotenten/pluripotenten Stammzellen besät, die zu Zellen ausdifferenzieren können, einschließlich von Endothelzellen, wodurch ein Mikroorgan gebildet wird. Mischungen von Zellen mit unterschiedlicher Funktion werden als Mikroorgane bezeichnet. Bei beiden Ansätzen bilden die Endothelzellen (und in einigen Fällen andere Zellen, wie Perizyten oder Sternzellen) "Blutgefäße" im ganzen Gewebe. Ein Organ ist eine differenzierte Struktur eines Organismus, die aus verschiedenen Zellen oder Geweben zusammengesetzt und an eine spezifische Funktion adaptiert ist (McGraw-Hill Dictionary of Bioscience). Der Begriff "Mikroorgan", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Mikrogewebe oder eine Kombination von Mikrogeweben, das bzw. die wenigstens eine Funktion oder ein Charakteristikum eines bestimmten Organs zeigt bzw. zeigen, und zwar in einem repräsentativen, spezifischen Ausmaß. "Spezifisches Ausmaß" bezieht sich auf ein absolutes Ausmaß pro Maßeinheit, beispielsweise Ausmaß pro Zellzahl, Volumen, Masse oder Oberfläche, wobei lediglich die Zellkompartimente und nicht das Substrat berücksichtigt werden.
Die Querschnittsfläche liegt typischerweise unter 1 cm², und die Tiefe liegt typischerweise unter 0,5 cm. Beispielsweise würde im Hinblick auf die Funktion der Biotransformation eines Fremdstoffes eine Mikroleber einen Fremdstoff mit einer spezifischen Geschwindigkeit, die repräsentativ für eine ganze Leber wäre, umwandeln, wobei die spezifische Geschwindigkeit als Mole pro Zeiteinheit und Zellvolumen gemessen werden könnte. Bezüglich des Charakteristikums einer Suszeptibilität gegenüber einer Virushepatitis-Infektion würde eine Mikroleber einen Zeitverlauf der Infektion zeigen, der für eine ganze Leber repräsentativ wäre, wenn sie mit der gleichen Zahl an Viruspartikeln pro Zelle oder pro Zelloberfläche infiziert würde. Das erforderliche Ausmaß der Repräsentativität der Zellen hängt von den jeweiligen Bedürfnissen des Anwenders ab. In bestimmten Fällen kann ein spezifisches Ausmaß, das innerhalb einer Größenordnung für das wirkliche Organ repräsentativ ist, ausreichend genau sein. In anderen Fällen kann es sein, dass das spezifische Ausmaß innerhalb von 10% oder weniger des tatsächlichen Ausmaßes des Organs liegen muss. Eine ausreichende Genauigkeit über eine längere Testdauer ist für bestimmte Tests kritisch. Eignungsstudien werden im allgemeinen mit Arrays aus Mikrogewebe durchgeführt werden. Wenn die Verbindungen mit den Arrays die gewünschten Ergebnisse liefern, werden sie anschließend unter Verwendung von Arrays aus Mikroorganen gescreent.
Ein Mikroorgan, das die Funktion der Leber oder ihre Charakteristika nachahmt, ist nützlich für das Verfolgen der Arzneimittelausscheidung, der Bildung von Metaboliten, der Aktivierung von Arzneimittelvorläufern, des Fangens von Asialo-Proteinen und der Suszeptibilität gegenüber Toxinen oder einer akuten oder chronischen Infektion.
Es kann ein High-Throughput-Screening durchgeführt werden, indem Multiwell-Platten hergestellt und Mikroorgane in jeden Well eingeführt werden. Verschiedene Arzneimittel können gleichzeitig untersucht werden, indem unterschiedliche Arzneimittel zu jedem Well gegeben werden. Die Mikroorgane können auch in einem System eines differenziellen Bioreaktors verwendet werden. Der Reaktor beinhaltet ein Mikroorgan oder mehrere Mikroorgane sowie Einrichtungen für das Aufrechterhalten der Vitalität der Organe, beispielsweise eine Zufuhr für Sauerstoff und Nährstoffe. Sensoren für das Verfolgen des Metabolismus des Agens können vorhanden sein. Vorzugsweise kann der Reaktor mit einem Computer für die Steuerung z. B. der Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen sowie der Sammlung, der Analyse und der Reinigung von Proben ausgerüstet sein. Es können Metaboliten der Agenzien hergestellt und isoliert werden, indem verschiedene Agenzien dem Bioreaktor zugeführt werden. Bei einer Ausführungsform ist das Mikroorgan sandwichartig zwischen Filtern eingeschlossen, die ein Durchtreten des Organs verhindern, ein Durchtreten von Metaboliten aber ermöglichen. Ein ständiger Flüssigkeitsstrom, beispielsweise von Blut, durch das Organ kann die Metaboliten kontinuierlich entfernen. Der Metabolit kann aus der Flüssigkeit extrahiert werden, und die Flüssigkeit kann wieder durch das Organ rezyklisiert werden. Das stellt einen kontinuierlichen Prozess für die Gewinnung von Metaboliten unter Verwendung der Mikroorgane dar. Der Reaktor kann in Form eines einzigen Durchgangs oder in einem rezirkulierenden Durchgang oder in Form einer Kombination der beiden Verfahren betrieben werden.
Mikroorgane können eingesetzt werden, um die Wirkung einer Exposition der Organe gegen unterschiedliche therapeutische Mittel zu verfolgen. Wenn das Organ so beansprucht wird, dass es auf eine wirksame Dosis eines therapeutischen Mittels reagieren kann, dann kann die minimale wirksame Dosis berechnet werden. Außerdem kann man, wenn die Dosis erhöht wird, die maximal tolerierte Dosis bestimmen. Demgemäß können sowohl die Dosierung als auch die Wirksamkeit mit den hier beschriebenen Mikroorganen gemessen werden.
Die potenziellen Vorteile der Bestimmung der Exposition der Mikroorgane gegen verschiedene therapeutische Agenzien liegen darin, dass schnellere, billigere sekundäre Screens entwickelt werden können, die wirkliche menschliche Organe repräsentieren und die in neuen Krankheitsmodellen eingesetzt werden können. Das ermöglicht eine potenzielle Verminderung von Tierversuchen und ermöglicht auch die Testung an echtem menschlichem Gewebe, ohne dass Testpersonen nicht-getesteten Arzneimitteln ausgesetzt werden. Die Mikroorgane bieten auch die Möglichkeit, Arzneimittel zu testen, für die es kein geeignetes Tiermodell gibt.
Die Ergebnisse aus Tests mit Mikroorganen können in geeignete Modelle größeren Maßstabs eingegeben werden, um die Reaktion ganzer Organe in vivo vorherzusagen. Die Tests können darüber hinaus unter Verwendung einer Reihe von Mikroorgan-Arrays durchgeführt werden, die so arrangiert sind, dass ein verkleinertes Modell eines Organsystems bereit gestellt wird. Die Ergebnisse können dann auf einen größeren Maßstab übertragen werden, um die Reaktion des Organsystems in vivo oder eines ganzen Organismus, beispielsweise eines Menschen, vorherzusagen.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Apparatur für In-vitro-Analysen eingesetzt, beispielsweise für das High-Throughput-Screening chemischer oder biologischer Mittel. Bei anderen Ausführungsformen wird die Apparatur als Bioreaktor zur Erzeugung chemischer oder biologischer Agenzien verwendet. Bei anderen Ausführungsformen wird die Apparatur zur Erzeugung von Zellen und Gewebe, die schwer herzustellen sind, beispielsweise von Stammzellen, eingesetzt. Bei noch anderen Ausführungsformen wird die Apparatur dazu eingesetzt, Zellen für eine Implantation zu erzeugen, gegebenenfalls nachdem die Zellen transfiziert wurden. Zu Beispielen für die Apparaturen gehören Mikrogewebevorrichtungen, Mikroorgane, Bioreaktoren und Systeme für ein High-Throughput-Screening.
Die Apparaturen modellieren wirkungsvoll physiologische Reaktionen von Geweben, beispielsweise auf Virusinfektionen, sowie den Metabolismus von Fremdstoffen.
Testsysteme unter Verwendung von Mikrogewebe-Arrays haben viele Anwendungen, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, Studien zur Biotransformation gehören, zur Ausscheidung, zum Metabolismus und zur Aktivierung von Fremdstoffen, Studien zur Bioverfügbarkeit und zum Transport chemischer Agenzien durch Epithelschichten, Studien zur Bioverfügbarkeit und zum Transport biologischer Agenzien durch Epithelschichten, Studien zum Transport biologischer oder chemischer Agenzien durch die Blut-Hirn-Schranke, Studien zur akuten basalen Toxizität chemischer Agenzien, Studien zur akuten lokalen oder akuten organspezifischen Toxizität chemischer Agenzien, Studien zur chronischen basalen Toxizität chemischer Agenzien, Studien zur chronischen lokalen oder chronischen organspezifischen Toxizität chemischer Agenzien, Studien zur Teratogenität chemischer Agenzien, Studien zur Genotoxizität, Kanzerogenität und Mutagenität chemischer Agenzien, zum Nachweis infektiöser biologischer Agenzien und biologischer Waffen, zum Nachweis schädlicher chemischer Agenzien und chemischer Waffen, Studien zu Infektionskrankheiten, Studien zur Wirksamkeit chemischer Agenzien zur Krankheitsbehandlung, Studien zur Wirksamkeit biologischer Agenzien zur Krankheitsbehandlung, Studien über den optimalen Dosisbereich von Agenzien zur Krankheitsbehandlung, zur Vorhersage der Reaktion von Organen auf biologische Agenzien in vivo, zur Vorhersage der Pharmakokinetik chemischer oder biologischer Agenzien, zur Vorhersage der Pharmakodynamik chemischer oder biologischer Agenzien, Studien bezüglich der Bedeutung der genetischen Konstitution hinsichtlich der Reaktion auf Agenzien. Es kann ein Filter oder ein poröses Material unterhalb des Mikrogewebes gewählt oder konstruiert werden, so dass denaturierte einzelsträngige DNA gebunden wird; Studien zur Gen-Transkription als Reaktion auf chemische oder biologische Agenzien, Studien zur Proteinexpression als Reaktion auf chemische oder biologische Agenzien, Studien zu Veränderungen des Metabolismus als Reaktion auf chemische oder biologische Agenzien, Vorhersage der Wirkung des Agens über Datenbanksysteme und assoziierte Modelle, Vorhersage der Wirkung eines Agens über Expertensysteme und Vorhersage der Wirkung eines Agens über strukturbasierte Modelle.
Die Apparatur zielt auf Anwendungen ab, die derzeit nicht durch existierende Systeme kultivierter Zellen ausgefüllt werden können, d. h. Anwendungen, bei denen die grundlegende biologische Reaktion die integrierte physiologische Punktion von wenigstens zwei Zelltypen erfordert, die innerhalb einer normalen Gewebestruktur zusammenwirken. Der Ausdruck "normale Gewebestruktur" bedeutet Ansammlungen wenigstens einer Zelle vom epithelialen oder mesenchymalen Typ, d. h. einer "Gewebezelle", in einer dreidimensionalen Struktur, die von Blutkapillaren durchzogen ist, wobei die Kapillaren kontinuierlich mit einer Flüssigkeit perfundiert werden, so wie sie im Körper im allgemeinen mit Blut perfundiert würden. Diese Art der Organisation stellt das vielversprechendste Mittel zur Aufrechterhaltung differenzierter physiologischer Zellfunktionen und Gewebefunktionen außerhalb des Körpers bereit und somit das vielversprechendste Mittel zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit gegenüber einem sehr weiten Bereich pathogener und toxischer Agenzien.
Während bekannte Pathogene, Xenobiotika, Arzneimittel und Toxine potenziell über molekulare Tests nachgewiesen werden können, könnten unbekannte Pathogene und Toxine in Zellen über einen noch nicht identifizierten Rezeptor eindringen und über bis jetzt unbekannte enzymatische Wege wirken, was molekulare Tests oder sogar zellbasierte Tests ausschließt, wenn die kultivierten Zellen den relevanten Rezeptor oder die relevante Enzymfunktion verloren haben. Von besonderem Interesse bei der Entwicklung von Pharmazeutika ist die Spezifität vieler Rezeptor- und Enzymwege für menschliche Gewebe, was ein Screening oder eine Analyse von Funktionen in Tieren oder tierischem Gewebe ausschließt. Ein Sensor, bei dem die Kombination von Zellen, die das Gewebe bilden, ihre physiologische Fähigkeit zur Reaktion auf Pathogene und Toxine vollständig beibehält, in Kombination mit einem Verfahren zum Nachweis einer Gewebeschädigung oder -infektion bietet somit die breiteste Möglichkeit zum Nachweis neuer Agenzien.
In den Beispielen werden bekannte virale und chemische Toxine eingesetzt, die auf zwei verschiedene Gewebe, die Leber und embryonale Stammzellen, wirken, um die Notwendigkeit einer organisierten Gewebsstruktur anstelle isolierter Zellen für den Nachweis von Pathogenen zu illustrieren, die unbekannt sowie bekannt sein können.

Systeme

Der Ansatz wird beispielhaft durch das System veranschaulicht, das schematisch in der Fig. 1 gezeigt ist, bei dem ein einzigartiger Durchfluss-Mikro-Array aus Gewebeeinheiten von der Größe eines Kapillarbetts mit einem optischen spektroskopischen Nachweissystem kombiniert wird, um Veränderungen der Intensität/des Spektrums der Fluoreszenz endogener oder exogener Fluorophore im Gewebe als Reaktion auf eine Verletzung nachzuweisen. Die Technologie kombiniert ein Chip-basiertes Mikrogewebe-Arrangement mit Sensoren für den Nachweis der Veränderungen im Verhalten des Gewebes, das aus der Infektion oder einer toxischen Schädigung resultiert. Die einzelnen Komponenten des Systems werden im Folgenden einzeln diskutiert.
Die Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht eines gewebebasierten Biosensor-Systems 10, mit einer Ansicht des Gerüsts 112 (Silicium-Chip mit einem Array offener Kanäle 14, die sich durch ihn hindurch erstrecken), das gewebeartige Strukturen 16 enthält, die von perfundierten Mikrogefäß-Netzwerken 18 durchdrungen sind, durch die Kulturmedium 20 strömt. Das Herz des Systems ist ein Array aus winzigen "Gewebe"-Einheiten, beispielsweise von jeweils 300 · 300 · 300 um, die in einem Array von Kanälen 14 enthalten sind, die durch einen Silicium-Chip 12 geätzt sind, wie in der Fig. 1 gezeigt ist. Die Fig. 2A-2C illustrieren ein Reaktorsystem, in dem der Array kultiviert werden kann. Das Reaktorsystem kann in einem Querstrommodus betrieben werden (Fig. 2B), wobei die Perfusion des Mediums durch die Arrays vom Druckunterschied zwischen zwei unabhängigen tangentialen Perfusionskreisläufen (einer auf jeder Seite des Gerüsts) getrieben wird. Andere Parameter der Perfusionskreisläufe, wie die Flussgeschwindigkeit oder die Nährstoffkonzentration, können ebenfalls unabhängig voneinander gesteuert werden, was eine genaue Kontrolle von Gradienten, die im System vorliegen, ermöglicht. Das Reaktorsystem kann auch in einem Modus des erzwungenen Flusses betrieben werden (Fig. 2C), wobei der gesamte Fluss aus einem einzelnen Perfusionskreislauf durch den Array gelenkt wird. Bei dieser Konfiguration diktiert die Flussgeschwindigkeit den Druckabfall, die Gradienten etc. innerhalb des Systems. Kulturmedium, das die Probe enthält, fließt normal durch den Chip 12 und durch die Gewebeeinheiten 16. Wenn eine Probe zugesetzt wird, dann erfolgen metabolische Veränderungen im Gewebe, die über eine Veränderung der Fluoreszenzintensität bzw. des Fluoreszenzspektrums verschiedener endogener oder exogener fluoreszierender Marker nachgewiesen werden können. Es wird ein miniaturisiertes faseroptisches System 22 für die Bereitstellung einer Einzel- oder Multi-Photonenanregung einzelner Kanäle und den Nachweis der Fluoreszenzintensität verwendet. Ein Nährmedium wird aus einem gerührten Reservoir in einer Rückkehrschleife zirkuliert, wobei im Reservoir kontinuierlich Medium nachgeliefert wird.

Materialien für Mikromatrices und ihre Herstellung

Die Matrices können aus einem inerten Material wie Silicium hergestellt werden, das vorzugsweise mit einem Material beschichtet ist, um die Biokompatibilität und die Zelladhäsion zu erhöhen, oder aus einem biokompatiblen Polymer, vorzugsweise einem, das nicht biologisch abbaubar ist.
Es werden verschiedene Ebenen hinsichtlich der Komplexität der Oberflächenchemie des Gerüsts benötigt. Auf einer einfachen Ebene muss man grob kontrollieren, wo die Zellen, die auf den Chip ausgesät wurden, anhaften und wandern. Auf einer höheren Ebene muss man den Oberflächen der Kanäle Muster verleihen, um die Zellorganisation in drei Dimensionen ("3D") zu beeinflussen. Schließlich kann man die Oberflächen der Kanäle modifizieren, um den Zellen spezifische Signale für ein Wachstum und eine Differenzierung bereit zu stellen. Es wurden Verfahren entwickelt, mit denen Wachstumsfaktoren an Silicium-Substraten befestigt werden können.
Die anfängliche Konstruktion des Gerüsts durch zwei Anforderungen eingeschränkt: (1) die Zellzahl - jedes Gerüst muss genügend Zellen enthalten (ungefähr 150 bis 500 000), damit die Arten der chemischen, biochemischen und molekularbiologischen Tests durchgeführt werden können, die für die Interpretation der Fluoreszenzmessungen benötigt werden; und (2) die Kanalabmessungen - die Tiefe des Kanals ist auf ungefähr 300 um beschränkt, weil eine Nährstofferschöpfung verhindert werden muss (obwohl diese Beschränkung durch die Verwendung eines Perfusionsmediums gelockert werden kann, das Bestandteile von künstlichem Blut enthält; d. h., das mehr Sauerstoff pro Volumeneinheit transportiert als Kulturmedium), während die Form des Querschnittes und seine Abmessungen durch das Erfordernis einer Optimierung der Morphogenese bestimmt werden, und beispielsweise bei Abmessungen (100-600 um) mit unterschiedlichen Formen liegen.
Bei repräsentativen Kanalabmessungen von 300 · 300 · 300 um und der Bildung einer gewebeähnlichen Zelldichte (2 · 10&sup8; Zellen/cm³) werden ungefähr 100 Kanäle (ungefähr 1 cm²) benötigt. Ein Array aus vielen Kanälen ist auch für die Bestimmung der statistischen Schwankung der Leistungsfähigkeit des Gewebes im Inneren jedes Kanals und zur Ermöglichung kombinatorischer Ansätze für die Optimierung der Kanalabmessungen und -formen wünschenswert.

Silicium-Matrices

Die Wahl von Silicium-Wafern für die Bildung der Sensorplattform bietet mehrere Vorteile. Die Dicke eines Wafers ist gleich der gewünschten Tiefe des Gewebes, und es können Arrays von Kanälen im Wafer leicht mittels einer Ätz-Technologie, die beispielsweise im Microsystems Technology Lab (MTL) am MIT vorhandenen ist, erzeugt werden. Silicium- Matrices können auch mittels Techniken der elektrochemischen Abtragung (EDM) erzeugt werden, wie der Gravur-EDM und der Draht-EDM. Silicium-Wafer vereinigen die Leichtigkeit der Herstellung - sowohl vieler verschiedener Kanalformen während der Studien zur Optimierung als auch bei der Herstellung im großen Maßstab - mit einer Plattform für die genaue Steuerung der Oberflächenchemie zur Erzielung eines spezifischen Zellverhaltens. Silicium kann auch Vorteile bezüglich der Eigenschaften hinsichtlich eines Wärmetransfers bieten, die für eine schnelle Kryopräservierung von Gewebestrukturen erforderlich sind.
Die Gerüste können durch das Ätzen einseitig polierter Silicium-Wafer von Standarddicken, gefolgt von einem Schleifen und Polieren zur Verminderung der Wafer-Dicke auf 150 bis 400 um, erzeugt werden. Alternativ können durchgeätzte Mikrokanäle in dünnen, doppelseitig polierten Wafern von gewünschter Targetdicke erzeugt werden. In diesem Falle ist kein weiteres Schleifen und Polieren erforderlich. Während des Ätzens können die aktiven dünnen Wafer mit Photoresist auf Stützwafer aus Quarz montiert werden, was die Bestimmung des Endpunktes des Ätzens erleichtert. Der Photoresist kann auf die gesamte Oberfläche des Stützwafers oder nur auf seinen Umfang aufgetragen werden. Es können Scheiben von 1,5 bis 2 cm Durchmesser mit dem geeigneten Array von Kanälen erzeugt werden; mit den derzeit verfügbaren Designs können sieben Gerüste aus jedem Wafer produziert werden, mit relativ großen Elementen im Vergleich zur Standard-Si-Mikroherstellung. Das ermöglicht die Herstellung von Photolithographie-Masken durch das Drucken von Designs auf photographischen Film hoher Auflösung (3386 dpi). Diese Flexibilität bei der Maskenerzeugung ermöglicht es uns, Masken viel billiger und schneller als beim Standard-Chrom-auf-Glas-Ansatz zu erzeugen und somit viele unterschiedliche Kanalabmessungen zu testen.
Es gibt wenigstens zwei durchführbare Tiefätz-Ansätze, um einen durch einen Silicium- Chip geätzten Array von Kanälen zu erreichen. Der bevorzugte Ansatz besteht in der Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasma-Ätzers (ICP). Eine Maschine zur Erzeugung von Merkmalen mit hohem Längenverhältnis in Silicium, der Si-Tiefätzer von Surface Technology Systems (STS), kann zur Ätzung von durchgehenden Löchern in Silicium unter Verwendung von Photoresist oder Si-Dioxid als Maske eingesetzt werden. Der reaktive Ionen- Tiefätzer von STS verwendet SF&sub6; für das Ätzen und C&sub4;F&sub8; für die Passivierung. Dementsprechend enthält das Polymer, das die Oberflächen bedeckt, hauptsächlich Kohlenstoff und Fluor, möglicherweise mit gewissen Schwefelspuren. Die Kanäle, die durch den STS-Ätzer gebildet werden, haben senkrechte Wände, wobei die Abmessungen des Querschnittes durch die Maske bestimmt werden. Die Kanäle können somit Merkmale wie parallele Kerben in der Wand aufweisen, wenn solche Merkmale für die Induktion einer geeigneten Gewebemorphogenese gewünscht werden. Während des Ätzens reagieren Ätzgase auf den exponierten Si-Ätzflüssigkeit-Oberflächen unter Bildung oligomerer/polymerer Fluorkohlenwasserstoff-Species, wie C(HF)xC(F&sub2;)yC(H&sub2;)z, die hydrophob sind und nach der Entfernung des Photoresist zurück bleiben. Dieses "Polymer" kann zwar durch eine Kombination aus einer O&sub2;-Plasmaätzung, gefolgt von Waschungen in entweder HF oder Pirhana-Lösung, entfernt werden, aber seine Anwesenheit ist für anfängliche Studien aus zwei Gründen vorteilhaft: der hydrophobe Charakter ermöglicht es, die Adhäsion der Zellen an die Wände der Kanäle über die Adsorption von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) maßzuschneidern; und er stellt eine natürliche Maske zur Ermöglichung einer selektiven Modifikation der oberen und der unteren Oberfläche des Wafers bereit, da das Polymer gegenüber vielen Standard-Silanchemien nicht reaktiv ist.
Der zweite Ansatz zur Erzeugung der Kanäle besteht aus dem nassen chemischen Ätzen mit KOH. Vor der Verfügbarkeit der Plasma-Tiefätzer war das Ätzen mit KOH der vorherrschende Ansatz des Tiefätzens von Si. Das Ätzen mit KOH ist sehr anisotrop - bestimmte Kristallflächen werden vorzugsweise unter Erzeugung von Si(III)-Oberflächen geätzt - was zu Kanälen mit geneigten Wänden führt. Die Kristallorientierung bestimmt die Neigung der Wände, und die Form des Querschnittes wird auch durch die Kristallstruktur bestimmt. Es können negative und positive Wandneigungen durch die sorgfältige Auswahl der Orientierung des Musters relativ zum Kristall erhalten werden. Kanäle mit divergierendem Fluss können bezüglich einer physiologischen Funktion gewisse Vorteile bieten. Eine Facettierung ist ein ernsthafteres Problem beim KOH-Ätzen und kann somit seine Verwendung einschränken.
Nach dem Ätzen, Säubern und Polieren des Si-Wafers wird ein makroporöser Filter, beispielsweise ein Filter aus PDVF, auf der Rückseite des Gerüsts angebracht. Die Filteroberfläche wurde durch eine Exposition gegen ein Sauerstoffplasma hydrophil gemacht. Durch das Anordnen des Filters auf einer sauberen Oxid-Oberfläche des geätzten Silicium- Wafers bildet die hochenergetische Oberfläche des Filters chemische Bindungen mit der Siliciumoxid-Oberfläche aus, was zu einer stark aneinander haftenden Anordnung führt. Die Anwesenheit einer dünnen Wasserschicht an der Grenzfläche wurde von uns zusammen mit dem Einsatz von Wärme zur Erzeugung dieser Verbundstruktur eingesetzt.
Um sicher zu stellen, dass die Zelladhäsion vorzugsweise in den Kanälen erfolgt, kann die obere Oberfläche des Silicium-Trägers mit einem Film auf Ethylenoxid-Basis mittels der Silan-Chemie beschichtet werden, um das organische Material an die Oxid-Oberfläche zu koppeln. Es können auch andere Behandlungen eingesetzt werden, um eine Bindung eines zweiten Wafers an den ersten Wafer zu ermöglichen. Diese Derivatisierung kann selektiv auf der äußeren Oberfläche des Wafers durchgeführt werden, da das Vorhandensein der Fluorpolymermaterialien auf den Wänden des Kanals eine Anheftung an dieser Stelle verhindert. Eine Umsetzung zwischen chemisch synthetisiertem CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3; und der Oxidoberfläche kann zur Erzeugung sich selbst anordnender Monolayer-Filme eingesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie Silicium- Träger gegen die Adsorption vieler Typen von Verbindungen passivieren. Mit diesem Silan läuft die Reaktion so ab, dass ein orientierter molekularer Film auf der Oxidoberfläche verankert wird und Ethylenoxid-Gruppen der Umgebung ausgesetzt werden. Bei Kanälen, die mittels KOH als Ätzmittel erzeugt werden, können die Kanäle und die obere Oberfläche zunächst mit CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub7;SiCl&sub3; behandelt werden, um die Kanäle und die äußere Oberfläche mit Alkylketten zu beschichten, damit die Oberfläche hydrophob gemacht wird. Die äußere Oberfläche kann selektiv durch Behandlung mit UV und O&sub2; unter einem Glanzwinkel gesäubert werden, um einen Abbau beschichteter Bereiche im Kanal zu minimieren, oder durch die Verwendung wässriger Reinigungslösungen, die aufgrund von Kapillarkräften, die das Penetrieren der wässrigen Lösung in die hydrophoben Kanäle verhindern, am Eindringen in die Kanäle gehindert werden. Für diese Fälle kann die exponierte gesäuberte Oberfläche in einen nichtadsorbierenden Zustand überführt werden durch die Umsetzung mit CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3;, das wiederum eine Schicht selektiv auf der äußeren Oberfläche bildet, und zwar aufgrund der Anwesenheit des hydrophoben Films im Gebiet der Kanäle.
Nach der Silanisierung können Materialien, die eine Adhäsion fördern, beispielsweise Materialien der extrazellulären Matrix ("ECM"), RGD-Peptide oder Wachstumsfaktoren aus einem wässrigen Puffer an die Scheiben adsorbiert werden, um sicher zu stellen, dass die Zellen vorzugsweise in den Kanälen anhaften. Aufgrund der Unterschiede der Oberflächenchemie im Inneren der Kanäle und auf den äußeren Oberflächen adsorbieren die Proteine vorzugsweise an die Wände der Kanäle, da weder die von CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3; abstammende obere Oberfläche noch der Filter die Adhäsion von Proteinen unterstützen. Eine Verifizierung der Oberflächenchemien und ihrer Fähigkeit zur Steuerung der Adsorption von Proteinen und Zellen kann mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie sowie verschiedener spektroskopischer Verfahren zur Oberflächencharakterisierung sowohl an ganzen als auch an gespaltenen Proben erfolgen.
Das Ausbilden eines Musters auf den Kanalwänden kann die Morphogenese und die Funktion der Gewebe verbessern. Beispiele der Typen geometrischer Muster, die ausgebildet werden können, sind in dem Kanalquerschnitt dargestellt, der in den Fig. 3A und 3B gezeigt ist. Die Oberflächenchemie der zurückliegenden und der vorspringenden Teile der Elemente kann selektiv modifiziert werden, um ein Zellmuster längs spezifischer Bereiche der Kanalwände hervorzurufen. Adsorbierende Bereiche werden mit einem hydrophoben Alkyltrichlorsilan, CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub7;SiCl&sub3;, gemustert, um die Bindung der Proteine und Zellen zu steuern, während nicht-adsorbierende Bereiche innerhalb des Kanals und auf der oberen Oberfläche unter Verwendung eines Ethylenoxid-terminierten Trichlorsilans, CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;)2,3O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3;, ausgebildet werden, um die Anheftung von Proteinen und Zellen an diese Bereiche zu verhindern. Diese Ausbildung von Mustern der adsorbierten Agenzien und die daraus resultierenden Bereiche mit spezifischen Oberflächenchemien können gesteuert werden, um zu ermöglichen, dass bestimmte innere Bereiche der Kanalwände adsorptiv gemacht werden, wobei gleichzeitig Trennbereiche erzeugt werden, die nichtadsorptiv sind. Der Ansatz setzt eine Modifikation des Mikrokontaktdruckens ein, um die gewünschten Reagenzien in die Ecken der Kanäle einzubringen. Es wird, um das ganze kurze zusammenzufassen, ein Stempel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) mittels eines Urmodells hergestellt, das mittels der obigen Verfahren in Silicium eingeätzt ist, um die Orte, an denen Reagenzien aufgetragen werden (und somit ihre Oberflächenchemie) innerhalb des Kanals festzulegen. Das Urmodell erzeugt einen gemusterten Stempel aus PDMS, der die periodischen Abstände der Kanäle kopiert; seine Größe ist jedoch geringer als die Größe des Kanals. Eine wahrscheinliche Geometrie ist ein Speichendesign, so dass der PDMS-Stempel nur mit einem begrenzten Bereich der verfügbaren Fläche innerhalb der Kanalwände in Kontakt kommt und Silan nur in diesen Bereichen ablagert. Nach dem Stempeln dieses Musters aus Silan in den Kanal kann eine Exposition der Probe gegen eine Silan-Lösung dazu verwendet werden, die offenen Bereiche des Kanals, die nicht durch den Stempel derivatisiert wurden, mit einem Silan zu füllen, um in diesen Bereichen eine andere Oberflächenchemie und eine andere Absorptionscharakteristik zu erhalten. Das letztere Silan kann CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3; für die Erzeugung nicht-adsorbierender Oberflächen in spezifischen Bereichen des Kanals (denjenigen, die nicht durch das Stempeln mit dem ersten Silan derivatisiert wurden) und auf der oberen Oberfläche sein.
Der Kanal kann für die Präsentation spezifischer Liganden, beispielsweise des verankerten Epidermal Growth Factor ("EGF"), maßgeschneidert sein. Das Verfahren, das kürzlich für die Befestigung von EGF an der Oberfläche eingesetzt wurde, verwendet Silan- Reagenzien, um die Oberfläche vorzubehandeln, sowie eine sich anschließende Reaktion unter Einsatz einer Tresylchlorid-Chemie zur Befestigung des EGF-Materials an der Oberfläche. Da die Oberfläche aus dem Methoxy-terminierten Ethylenglycol und der Filter inert gegenüber der Tresylchlorid-Chemie sind, die für die Befestigung des EGF an Bindungsstellen auf der Oberfläche eingesetzt wird, können gemusterte Bereiche aus EGF im Inneren der Kanäle erzeugt werden, indem ein gemustertes Kanalsystem Reaktionslösungen zur Konstruktion von EGF-Domänen im Inneren der Kanäle exponiert wird.

Polymere Matrices

Zusätzlich zu Silicium können die Matrices aus Polymeren wie Polycarbonat, Polystyrol, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polymethylmethacrylat, Polyester und Polytetrafluorethylen (TEFLONTM) mittels bestimmter Herstellungsverfahren, wie der Techniken zur Erzeugung frei gestalteter fester Formen oder Standardverfahren der Polymerverarbeitung, wie einer Mikroformung, hergestellt werden. In Abhängigkeit vom Verarbeitungsverfahren kann das Material, das die Matrix bildet, entweder in Lösung vorliegen, wie im Falle von SLA, oder in Form von Teilchen, wie im Falle von SLS, BPM, FDM und 3DP. Bei einer bevorzugten Ausführungsform unter Einsatz von SSF ist das Material ein Polymer. Beim ersten Verfahren muss das Polymer durch Licht polymerisiert werden können. Bei den letzteren Verfahren liegt das Material vorzugsweise in Form von Teilchen vor, und es wird durch die Anwendung von Wärme, eines Lösemittels oder eines Bindemittels (Klebstoffs) verfestigt. Im Falle von SLS und FDM wird es bevorzugt, Polymere auszuwählen, die relativ niedrige Schmelzpunkte aufweisen, um das inkorporierte, biologisch aktive Mittel nicht erhöhten Temperaturen auszusetzen.
Im Falle von 3DP wird ein biokompatibles Material, vorzugsweise in Form von Teilchen oder in Form eines porösen Bogens, auf eine feste Plattform auf einem bewegbaren Kolben aufgetragen, damit es dort fest werden und/oder ein biologisch aktives Mittel inkorporieren kann. Eine Walze verteilt die Teilchen gleichmäßig über dem Bett auf der Plattform. Dann wird Lösemittel und/oder Bindemittel selektiv auf die polymeren Teilchen gedruckt. Nachdem die Schicht "gedruckt" worden ist, senkt der Kolben das polymere Material ab, so dass der Prozess unter Bildung der nächsten Schicht wiederholt werden kann. Die Teilchen können jede beliebige Form haben, auch die Form von Fasern oder Stäbchen, obwohl ein runderes Teilchen typischerweise gleichmäßiger fließt. Die Teilchen liegen vorzugsweise im Bereich eines Durchmessers von 10 um oder darüber, obwohl kleinere Teilchen verwendet werden können, wenn sie in einem flüssigen Medium verteilt sind und man sie zwischen den Druckvorgängen trocknen lässt.
Außerdem können polymere Mikromatrices durch reaktives Spritzformen, thermoplastisches Spritzformen, Mikroformen und Stanzen hergestellt werden. Formen für einige dieser Prozesse können beispielsweise durch den Einsatz der Lithographie und der Mikroherstellung, der elektrochemischen Abtragung sowie der Galvanotechnik hergestellt werden.
Verschiedene Materialien werden üblicherweise für die Bildung einer Matrix verwendet. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird der Begriff "Polymer" so verwendet, dass er alle beliebigen Materialien, die zur Bildung der Matrix verwendet werden, einschließt, einschließlich von Polymeren und Monomeren, die polymerisiert oder miteinander verbunden werden können, so dass sie eine integrale Einheit bilden, sowie von anorganischen und organischen Materialien, wie unten diskutiert wird. Bei einer Ausführungsform bestehen die Teilchen aus einem Polymer, das in einem organischen Lösemittel gelöst und durch die Entfernung des Lösmittels verfestigt werden kann, und zu diesen Polymeren gehören z. B. ein synthetisches thermoplastisches Polymer, vorzugsweise nicht biologisch abbaubar, wie Polyester, Polyurethane, Polystyrol und Polycarbonate, obwohl biologisch abbaubare Polymere für einige Anwendungen nützlich sein können. Beispiele sind Ethylenvinylacetat, Poly(anhydride), Polyorthoester, Polymere von Milchsäure und Glycolsäure und anderen α-Hydroxysäuren, sowie Polyphosphazene, Proteinpolymere, beispielsweise Albumin oder Collagen, oder Polysaccharide. Das Polymer kann nicht biologisch abbaubar oder biologisch abbaubar sein, typischerweise über eine Hydrolyse oder enzymatische Spaltung. Beispiele für nicht-polymere Materialien, die zur Bildung der Matrix verwendet werden können, sind organische und anorganische Materialien wie Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Puffersubstanzen und Lactose sowie weitere übliche Hilfsstoffe, die in Arzneimitteln eingesetzt werden, und die durch den Einsatz eines Klebemittels oder Bindemittels und nicht eines Lösemittels verfestigt werden. Im Falle der Verwendung von Polymeren für die Herstellung von Vorrichtungen für die Anhaftung von Zellen und das Zellwachstum werden Polymere auf der Basis der Fähigkeit des Polymers ausgewählt, die geeignete biologische Reaktion der Zellen zu bewirken, beispielsweise eine Anheftung, eine Wanderung, eine Proliferation und eine Gen-Expression.
Zu photopolymerisierbaren, biokompatiblen, wasserlöslichen Polymeren gehört Polyethylenglycoltetraacrylat (MG 18500), das mittels eines Argonlasers unter biologisch verträglichen Bedingungen unter Einsatz eines Initiators wie Triethanolamin, N-Vinylpyrrolidon und Eosin Y photopolymerisiert werden kann. Es können ähnliche, photopolymerisierbare Makromere mit einem zentralen Block aus Poly(ethylenglycol), der mit hydrolysierbaren Oligomeren wie Oligo(D,L-milchsäure) oder Oligo(glycolsäure) verlängert und durch Acrylat- Gruppen terminiert ist, verwendet werden.
Beispiele für biokompatible Polymere mit niedrigen Schmelztemperaturen sind Polyethylenglycol 400 (PEG), das bei 4-8ºC schmilzt, PEG 600, das bei 20-25ºC schmilzt, und PEG 1500, das bei 44-48ºC schmilzt. Ein weiteres niedrig schmelzendes Material ist Stearinsäure, die bei 70ºC schmilzt.
Andere geeignete Polymere können durch Bezugnahme auf The Polymer Handbook, 3. Auflage (Wiley, New York, 1989) erhalten werden.
Für Mikrostrukturen, die für Knochen maßgeschneidert sind, erhöhen anorganische Pulver in der fertigen Vorrichtung die Stabilität der Vorrichtung, und sie stellen eine Quelle an Mineralien für das sich regenerierende Gewebe bereit. Die Anforderungen weicher Gewebe, wie der Leber, bezüglich der Stabilität sind erheblich geringer als diejenigen von Knochen, und somit können höhere Anteile an Hohlräumen in den fertigen Vorrichtungen toleriert werden.
Die polymeren Matrices können mittels Prozessen zur Herstellung frei gestalteter fester Formen, durch reaktives Spritzformen, thermoplastisches Spritzformen, Mikroformen und Stanzen hergestellt werden.

b. Prozesse zur Herstellung frei gestalteter fester Formen

Dreidimensionales Drucken (3DP)

3DP wird beschrieben bei Sachs et al., "CAD-Casting: Direct Fabrication of Ceramic Shells and Cores by Three Dimensional Printing", Manufacturing Review 5(2): 117-126 (1992), sowie im US-Patent Nr. 5 204 055 an Sachs et al. Zu geeigneten Vorrichtungen gehören sowohl diejenigen mit einem kontinuierlichen Düsenstrahl-Druckkopf als auch solche mit einem Dropon-Demano-Druckkopf.
3DP wird zu Erzeugung eines festen Gegenstandes über das Tintenstrahldrucken eines Bindemittels in ausgewählte Bereiche sequenziell abgelagerter Schichten oder Pulver verwendet. Jede Schicht wird durch das Ausbreiten einer dünnen Pulverschicht über der Oberfläche eines Pulverbettes erzeugt. Das Pulverbett wird von einem Kolben getragen, der sich nach dem Ausbreiten und Drucken einer jeden Schicht absenkt (oder, umgekehrt, die Tintendüsen und der Ausbreiter werden nach dem Drucken jeder Schicht angehoben, und das Bett bleibt stationär). Die Anleitungen für jede Schicht stammen direkt von einer Darstellung aus der rechnergestützten Konstruktion (CAD) der Komponenten. Die Fläche, die gedruckt werden soll, wird durch die computergestützte Berechnung der Schnittfläche der gewünschten Ebene mit der CAD-Darstellung des Objekts erhalten. Der einzelnen scheibenförmigen Segmente oder Schichten werden unter Bildung der dreidimensionalen Struktur miteinander verbunden. Das nicht-gebundene Pulver stützt temporär nicht-verbundene Abschnitte der Komponente, während die Struktur aufgebaut wird, wird aber nach dem Abschluss des Drückens entfernt. Der Prozess der Bildung der Schicht aus dem Pulver und dem Bindemittel wird wiederholt, so dass die Vorrichtung Schicht für Schicht aufgebaut wird.
Wenn die Schichten hart oder wenigstens teilweise hart werden, während die einzelnen Schichten abgelagert werden, kann es bei einigen Anwendungen, sobald die gewünschte fertige Konfiguration des Teils erzielt worden ist und der Vorgang der Schichtenbildung abgeschlossen ist, wünschenswert sein, die Form und ihren Inhalt bei einer geeignet gewählten Temperatur zu erhitzen oder zu härten, um eine Bindung der Pulverteilchen weiter zu fördern. Unabhängig davon, ob eine weitere Härtung gewünscht ist oder nicht, werden die lockeren nicht-gebundenen Pulverteilchen mittels geeigneter Techniken entfernt, beispielsweise durch Reinigen mit Ultraschall, wodurch eine fertig bearbeitete Vorrichtung zurück bleibt. Feinere Größen werden auch erzielt, wenn Polymerlösungen anstelle reiner Lösemittel gedruckt werden. Beispielsweise führt eine Lösung von 10% PLC in Chloroform unter den gleichen Bedingungen wie oben zu Linien von 200 um. Die höhere Viskosität der Lösung verhindert oder verlangsamt die Wanderung des Lösemittels aus dem Zentrum des Grundelements, d. h. des Strukturelements, das aus dem Drucken einzelner Tröpfchen des Bindemittels resultiert.

Stereolithographie (SLA) und Selektives Lasersintering (SLS)

SFF-Verfahren sind besonders wegen ihrer Fähigkeit zur Steuerung der Zusammensetzung und der Mikrostruktur im kleinen Maßstab für die Konstruktion dieser medizinischen Vorrichtungen nützlich. Die SFF-Verfahren, die zusätzlich zu 3DP in einem gewissen Umfang wie hier beschrieben eingesetzt werden können, sind die Stereolithographie (SLA), das Selektive Lasersintering (SLS), die ballistische Teilchenherstellung (BPM) und das Fused Deposition Modeling (FDM).
Die Stereolithographie basiert auf der Verwendung eines fokussierten ultravioletten (UV) Lasers, der die Oberseite eines Bades aus einem photopolymerisierbaren, flüssigen Polymermaterial vektoriell scannt. Der UV-Laser führt dazu, dass das Bad dort polymerisiert, wo der Laserstrahl die Oberfläche des Bades trifft, was zur Erzeugung einer ersten festen Kunststoffschicht an der und gerade unterhalb der Oberfläche führt. Die feste Schicht wird dann in das Bad abgesenkt, und der über den Laser erzeugte Polymerisationsprozess wird für die Erzeugung der nächsten Schicht wiederholt usw., bis eine Vielzahl übereinander liegender Schichten, die die gewünschte Vorrichtung bilden, erhalten wird. Die zuletzt erzeugte Schicht wird für die Erzeugung der nächsten Schicht in jedem Falle immer auf eine Position knapp unterhalb der Oberfläche des flüssigen Bades abgesenkt. Ein Stereolithographiesystem, das leicht an die Verwendung mit biokompatiblen polymeren Materialien adaptiert werden kann, wird von SD-Systems Inc. (Valencia, Kalifornien, USA) hergestellt und verkauft.
SLS setzt ebenfalls einen fokussierten Laserstrahl ein, jedoch für die Sinterung von Gebieten locker kompaktierter Plastikpulver, wobei das Pulver Schicht für Schicht aufgetragen wird. Bei diesem Verfahren wird eine dünne Pulverschicht gleichmäßig mittels eines Walzmechanismus auf einer flachen Oberfläche verteilt. Das Pulver wird dann rasterförmig mit einem hochenergetischen Laserstrahl gescannt. Das Pulvermaterial, das vom Laser getroffen wird, wird verschmolzen, während die anderen Bereiche des Pulvers locker bleiben. Es werden aufeinander folgende Pulverschichten abgelagert und rasterförmig gescannt, eine über der anderen, bis ein ganzes Bauteil vollendet ist. Jede Schicht wird tief genug gesintert, um sie an die voraus gehende Schicht zu binden. Ein geeignetes System, das an die Herstellung medizinischer Vorrichtungen adaptiert werden kann, kann von DTM-Corporation (Austin, Texas, USA) bezogen werden.

Ballistische Teilchenherstellung (BPM) und Fused Deposition Modeling (FDM)

BPM setzt eine Tintenstrahl-Druckvorrichtung ein, bei der ein Tintenstrahl aus einem flüssigen Polymer oder einem polymeren Kompositmaterial zur Erzeugung dreidimensionaler Gegenstände unter der Steuerung eines Computers verwendet wird, auf ähnliche Weise, wie in Tintenstrahldrucker einen zweidimensionalen graphischen Druck erzeugt. Die Vorrichtung wird durch das Drucken aufeinander folgender Querschnitte, eine Schicht nach der anderen, auf ein Target mittels einer Technik des Kaltschweißens oder der schnellen Verfestigung gebildet, die zu einer Bindung zwischen den Teilchen und den aufeinander folgenden Schichten führt. Dieser Ansatz, wie er für Metall oder Metall-Kompositmaterialien verwendet wird, wurde von Automated Dynamic Corporation (Troy, New York, USA) vorgeschlagen.
FDM setzt einen x-y-Plotter ein, wobei eine Bewegung in z-Richtung ein extrudierbares Filament positioniert, das aus einem polymeren Material besteht und durch Hitze oder die Anwesenheit eines Lösemittels verflüssigt wird. Ein geeignetes System ist bei Stratasys Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA) erhältlich.

Andere Variable der Vorrichtungen

Die Textureffekte können vorteilhaft für die Konstruktion von Vorrichtungen sein, um optimale Wachstumsgeschwindigkeiten des Gewebes zu erzielen. Ein einzelner Kanal mit einem rechteckigen Querschnitt kann auf einer oder zwei Seite(n) glatte Oberflächen aufweisen, und auf den anderen Seiten Oberflächen mit Textur. Glatte Oberflächen können eine schnelle Zellwanderung ermöglichen, während Oberflächen mit Textur einen Ort darstellen können, wo Zellen differenzieren können.
Komposit-Vorrichtungen können durch das Kombinieren anorganischer und organischer Komponenten hergestellt werden. Insbesondere kann es erwünscht sein, die Menge des Matrixmaterials in der Vorrichtung über den Wert zu erhöhen, der durch das Drucken einer Lösung eines Matrixmaterials in ein Bett aus einem anorganischen Pulver in einem Durchgang erhalten werden kann, beispielsweise dadurch, dass ein Polymerlatex der Drucklösung zugesetzt wird. Ein anderes Verfahren besteht aus dem Vermischen eines Polymerpulvers mit einem anorganischen Pulver. Noch ein weiteres Verfahren besteht darin, nur das Polymerpulver im Bett zu verteilen und eine Dispersion anorganischer Teilchen (von bis zu 30 Vol.-%) in einem Lösemittel zu drucken, das das Polymerpulver zusammen bindet.

Steuerung der Porosität der Vorrichtungen

Porosität kann in dreidimensional gedruckten Vorrichtungen entweder auf der Ebene der Größe des Bauteils (zwischen 10 und 20 um oder darüber) oder auf einer Ebene, die unter dieser Größe liegt, erzeugt werden. Auf der Ebene der Bauteilgröße kann die Porosität über die Lokalisation der Bauteile gesteuert werden, und somit können die Porengröße und die Form in drei Dimensionen variieren.
Die Porosität auf der Ebene unterhalb der Größe der Bauteile kann auf verschiedene Weise erzeugt werden.
(1) Drucken einer Polymerlösung auf ein Bett aus Teilchen, die nicht im Polymer löslich sind, das anschließend mit einem Mittel, das kein Lösemittel für das Polymer darstellt, ausgelaugt werden kann. In diesem Falle wird das Polymer, das die Vorrichtung bildet, auf ein Bett aus Teilchen wie Salz, Zucker oder Polyethylenoxid gedruckt. Nach dem vollständigen Ablauf des Druckvorganges wird die Vorrichtung aus dem pulverförmigen Bett genommen und in ein Mittel, das kein Lösemittel für das Polymer ist und die Teilchen auflöst, gegeben. Beispielsweise könnte Polymilchsäure in Chloroform auf ein Bett aus Zuckerteilchen gedruckt werden, und der Zucker kann anschließend mit Wasser ausgelaugt werden.
(2) Drucken einer Polymerlösung auf ein Bett aus Teilchen, die teilweise im gedruckten Lösemittel löslich sind. Ein Beispiel ist das Drucken einer Lösung von Polymilchsäure auf ein Bett aus Teilchen aus Polyethylenoxid (PEO). Diese Prozedur kann die Penetration von PEO in die Oberfläche des PE ermöglichen und die Oberflächeneigenschaften der fertigen Vorrichtung verbessern. Nach dem Drucken kann das PEO mit Wasser heraus gelöst werden.
(3) Drucken einer Polymerlösung auf ein erwärmtes Bett eines Polymers. Ein Beispiel ist das Drucken von PE in Chloroform auf ein Bett aus PE-Teilchen, die auf 100ºC erhitzt sind. Der Siedepunkt des Chloroforms liegt bei 60ºC, und es wird deshalb beim Auftreffen auf das Bett aus den Teilchen sieden, was zur Bildung eines Schaums führt.
(4) Drucken einer Polymerlösung auf ein Bett, das ein Schäummittel enthält.
(5) Drucken mit Lösemitteln, die nur eine geringe Löslichkeit für das Pulver aufweisen. Auf diese Weise wird nur eine geringe Menge des Polymers an den Berührungspunkten zwischen den Teilchen abgelagert, wodurch ein großer Teil der ursprünglichen Porosität des Pulverbettes zurück bleibt.
Das Modifizieren von Oberflächeneigenschaften in ausgewählten Bereichen der Vorrichtung ist ebenfalls wichtig und kann durch das Drucken einer Lösung, die oberflächenaktive Agenzien enthält, in die Bereiche oder Linien zwischen den Stellen, wo das Bindemittel gedruckt wurde, erzielt werden. Wie der Begriff hier verwendet wird kann ein "oberflächenaktives Agens" ein Agens sein, das die Zelladhäsion fördert, beispielsweise ein RGD-Peptid, oder ein Material, das die Zelladhäsion hemmt, beispielsweise ein Tensid, z. B. Polyethylenglycol oder ein PLURONICTM (Block-Copolymere aus Polypropylenoxid und Polyethylenoxid). Das oberflächenaktive Agens sollte im allgemeinen in einem Lösemittel enthalten sein, das mit dem Lösemittel, das zum Drucken des Bindemittels verwendet wird, nicht mischbar ist.
Beispielsweise kann es wünschenswert sein, Adhäsionspeptide, wie das RGD- Adsorptionspeptid, in bestimmte Kanäle (z. B. solche für das Einwachsen von Blutgefäßen) zu inkorporieren. Ein Adhäsionspeptid, beispielsweise das Peptid mit einem hydrophoben Schwanz, das von Telios (LaHoya, Kalifornien) als PEPTITETM vermarktet wird, kann in Wasser gelöst und unter Verwendung eines zweiten Sets von Druckdüsen in die "Hohlräume" gedruckt werden. Der Zusatz von Wasser, eines relativ unflüchtigen Lösemittels, kann die Kinetik der Entfernung des Lösemittels aus den Bereichen, die mit dem Bindemittel gedruckt werden, verändern. Beispielsweise kann der Zusatz von Wasser die Entfernung des Lösemittels über eine Blockierung der Oberfläche für die Verdampfung verlangsamen und dazu beitragen, eine Verzerrung zu verhindern. Beim Kontakt mit der Oberfläche des Polymers wird das Peptid aus der Lösung an die Oberfläche des Polymers adsorbiert.
Die Oberfläche kann auch zur Verhinderung der Zelladhäsion modifiziert werden. Das kann erwünscht sein, um ein exzessives Einwachsen von weichem Bindegewebe in die Vorrichtung aus dem umgebenden Gewebe zu verhindern, und es kann beispielsweise durch das Drucken einer wässrigen Losung von PLURONICTM (BASF) oder POLOXAMERTM in die Hohlräume erreicht werden. Der hydrophobe Block derartiger Copolymere adsorbiert an die Oberfläche der Kanäle, wobei der hydrophile Block sich in die wässrige Phase erstreckt. Oberflächen mit adsorbierten PLURONICSTM verhindern eine Adsorption von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Andere Materialien, die eine Adhäsion verhindern, werden bei Lee et al., J. Biomed. Mat. Res. 23: 351-368 (1989), beschrieben.
Das Drucken der Vorrichtung mit oberflächenaktiven Agenzien, solange die "Wände" der Vorrichtung noch "feucht" vom organischen Lösemittel (beispielsweise Chloroform) sind, kann die Adsorption des Materials, das die Adhäsion verhindert, an die Wände verbessern und sogar ermöglichen, dass der hydrophobe Block in die Oberfläche inkorporiert wird, wodurch die Stabilität der resultierenden Oberflächenmodifikation verbessert wird.
Zellen können in spezifischen Bereichen der Matrix angeordnet werden, indem lokal eine selektive Oberflächenchemie eingesetzt wird. Zellen können, unter Bezugnahme auf die Fig. 3A und 3B, mittels einer beliebigen von mehreren Techniken gezielt in bestimmte Stellen der Matrix eingebracht werden:
(1) Der Bereich A eines Kanals aus einem Polymer wird mit einem generellen Zelladhäsionsmolekül, wie Fibronectin, Collagen oder Laminin, bedruckt, um die Zelladhäsion zu verbessern, während der Bereich B mit einem grenzflächenaktiven Stoff, wie PLURONICTM 68 (Block-Copolymere aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid) zur Verhinderung der Zelladhäsion bedruckt wird. Das Drucken der oberflächenmodifizierenden Substanzen kann über das Drucken einer wässrigen Lösung der gewünschten oberflächenmodifizierenden Substanz in einer Linie neben der Linie aus einem Bindemittel, die zur Bildung des Kanals gedruckt wurde, erzielt werden. Das Protein oder der grenzflächenaktiven Stoff wird aus der wässrigen Lösung an die Oberfläche des Polymers adsorbiert. Alternativ kann die Substanz, die die Oberfläche modifiziert, dem Bindemittel selbst zugegeben werden. Tenside, einschließlich von Proteinen, können die Oberflächeneigenschaften modifizieren, wenn sie dem Bindemittel in sehr niedrigen Konzentrationen von 0,1 bis 1 Gew.-% zugegeben werden. Bei diesen Konzentrationen sind die Veränderungen der Eigenschaften der Gesamtmasse gering. Am Anfang werden parenchymale Zellen ausgesät, und sie haften im Bereich A an, während keine Zellen im Bereich B anhaften. Nach ungefähr einer Woche bis zwei Wochen in Kultur können Endothelzellen oder kann ein anderer Zelltyp auf die Parenchymzellen ausgesät werden. Der Bereich B kann vor dem Aussäen des zweiten Zelltyps durch das Behandeln mit einer wässrigen Lösung eines Adhäsionsproteins wie Fibronectin modifiziert werden, das den grenzflächenaktiven Stoff verdrängen kann und somit die Zelladhäsion in Bereichen ermöglicht, wo sie zuvor gehemmt war, um auf allen inneren Oberflächen der Matrix eine vollständige Beschichtung mit Endothelzellen zu ermöglichen.
(2) Der Bereich A kann mit einem Molekül bedruckt werden, das für einen bestimmten Zelltyp selektiv ist, und der Bereich B mit einem Molekül, das für einen anderen Zelltyp selektiv ist. Derartige Moleküle enthalten generell einen hoch spezifischen kleinen Liganden, beispielsweise REDV für Endothelzellen oder Galactose für Hepatozyten, der mit einer stark hydrophoben Gruppe (wie derjenigen in Cell-Tak, einer kommerziell erhältlichen Verbindung), die fest an die Oberfläche von PLLA und Poly(milchsäure-glycolsäure) (PLGA) adsorbiert, verknüpft ist. Das ermöglicht eine räumliche Trennung, wenn zu Beginn mehr als ein Zelltyp ausgesät wird.

Biologisch aktive Mittel, die inkorporiert werden können

Es gibt im wesentlichen keine Beschränkungen bezüglich der biologisch aktiven Mittel, die in die Vorrichtungen inkorporiert werden können, obwohl diejenigen Materialien bevorzugt werden, die mittels Sprühtrocknen, Atomisieren, Mahlen oder anderer Standardverfahren zu Teilchen ausgebildet werden können, oder diejenigen Materialien, die zu Emulsionen, Mikroteilchen, Liposomen oder anderen kleinen Teilchen ausgebildet werden können oder als eine Beschichtung aufgetragen werden können, und die chemisch stabil bleiben und ihre biologische Aktivität in einer polymeren Matrix beibehalten.
Zu biologisch aktiven Agenzien gehören auch Verbindungen, die im Prinzip eine stützende Funktion haben, beispielsweise Hydroxylapatit-Kristalle in einer Matrix für die Knochenregeneration. Die Teilchen können eine Größe haben, die größer ist oder kleiner ist als die Teilchengröße der Polymerteilchen, die zur Herstellung der Matrix verwendet werden. Beispiele sind ganz allgemein Proteine und Peptide, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide sowie organische Verbindungen, die keine Proteine sind, und anorganische Verbindungen, die hier als "biologisch aktive Mittel" bezeichnet werden, es sei denn, es wird etwas anderes festgestellt. Diese Materialien haben biologische Wirkungen, und zu ihnen gehören, ohne auf sie beschränkt zu sein, entzündungshemmende Mittel, antimikrobielle Mittel, Mittel gegen Krebs, antivirale Mittel, Hormone, Antioxidanzien, Kanalblocker und Impfstoffe. Es ist auch möglich, Materialien zu inkorporieren, die keine biologische Wirkung ausüben, beispielsweise Luft, radioopake Materialien wie Barium oder andere Mittel für eine Bilddarstellung.
Bei einer Ausführungsform werden Modulatoren des Zellwachstums, der Differenzierung und/oder der Zellwanderung in spezifische Bereiche der Vorrichtung auf der Ebene der gleichen Auflösung wie der der Poren und Kanäle inkorporiert. Diese Materialien können kommerziell von Lieferanten wie Sigma Chemical Company bezogen werden, und sie sind in der Literatur ausführlich beschrieben worden.
Es gibt zwei prinzipielle Verfahren für die Inkorporation biologisch aktiver Mittel: in Form einer Dispersion innerhalb einer polymeren Matrix und als diskrete Einheiten innerhalb einer diskreten polymeren Matrix. Im ersten Falle wird das biologisch aktive Mittel vorzugsweise im Bindemittel für die Polymerteilchen eingesetzt. Im zweiten Falle wird das biologisch aktive Mittel in einem Stoff, der kein Lösemittel für die Polymerteilchen ist, eingesetzt.
Die Vorrichtungen können Teilchen aus einem biologisch aktiven Mittel aufweisen, die in einer Matrix aus einem abbaubaren Polymer, beispielsweise PLA, PGA oder deren Copolymeren (PLGAs), verteilt oder in diese eingebettet sind. Die Freisetzungsgeschwindigkeit des biologisch aktiven Mittels wird durch die Geschwindigkeit der Erosion des Polymers und nicht einfach durch die Diffusion bestimmt. Somit kann die Geschwindigkeit der Freisetzung des Arzneimittels über die Verteilung des Arzneimittels in der Matrix oder durch das Variieren der Mikrostruktur des Polymers so gesteuert werden, dass die Erosionsgeschwindigkeit von der Position in der Vorrichtung abhängt. Ein Profil einer Arzneimittelkonzentration, die sich mit der Entfernung von der Oberfläche periodisch ändert, wird beispielsweise zu einer Geschwindigkeit der Freisetzung des Arzneimittels führen, die sich bei der Zersetzung des Polymers periodisch mit der Zeit ändert. Die gleiche Wirkung kann über eine periodische Veränderung der Polymerzusammensetzung oder -porosität erzielt werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann ein biologisch aktives Mittel über eine Adsorption an die Oberfläche des stützenden Polymers während dessen Herstellung auf die folgende Weise inkorporiert werden; Drucken einer Linie des Bindemittels (beispielsweise Chloroform für Poly(L-milchsäure) (PLLA)), dann neben dieser Linie Drucken einer Linie aus einer wässrigen Lösung einer Mischung aus dem Fibroblast Growth Factor (FGF) und dem Heparin Angiogenic Factor. Das FGF-Heparin wird aus der Lösung an die Oberfläche des Polymers adsorbiert und dadurch lokal die angiogenen Faktoren bereit stellen.

Zellen

Die Herstellung von Schnitten aus Spenderorganen ist für die Gewinnung von Gewebe unpraktisch. Die Gewebestücke, die durch ein Schneiden erhalten werden, haben an ihrer Oberfläche eine Schicht toter Zellen, und die Gefäßarchitektur des Gewebes ist so, dass ein kleiner Schnitt nicht ohne weiteres mit einer Testflüssigkeit perfundiert werden kann. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird das Spendergewebe in einzelne Zellen dissoziiert, die Zelltypen werden getrennt und gereinigt und im Inneren der Kanäle auf eine Weise wieder kombiniert, die es ermöglicht, dass sich die histotypische Architektur des Gewebes wieder ausbildet. Es werden Standardverfahren eingesetzt, um die Zellen zu gewinnen und zu dissoziieren. Beispielsweise könne primäre Ratten-Hepatozyten und nicht-parenchymale Zellen mittels einer Standard-Collagenaseperfusion isoliert werden (Griffith et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 831 (1997); Cima et al., Biotech. Bioeng. 38: 145-58 (1991)). Menschliche Hepatozyten können durch eine Collagenase-Perfusion von Gewebe, das über eine Leberresektion erhalten wurde, oder aus Leberbiopsien, die über die New England Organ Bank (Fontaine et al., J. Ped. Surg. 30: 56-60 (1995)) erhalten wurden, gewonnen werden. Mikrovaskuläre Endothelzellen der Ratte können durch die Collagenase-Perfusion von Fett gewonnen werden. Humane mikrovaskuläre Endothelzellen können von Clonetics bezogen werden. Es ist unwahrscheinlich, dass für ein mikrovaskuläres Endothel eine Abstimmung der Gewebetypen erforderlich ist, das das Endothel eine große Plastizität bezüglich der Anpassung an neue Umgebungen zeigt. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) können im totipotenten Stadium mittels Standardtechniken und einer Induktion der Differenzierung, beispielsweise durch den Ersatz von LIF durch verschiedene Cytokine, kultiviert werden.
Es werden dann Zellen auf und innerhalb der Matrix zur Bildung von Gewebe oder Organen ausgesät. Die Zellen können als eine Mischung in die Matrix eingeführt werden, da sie sich entsprechend ihrer natürlichen Funktion trennen und auf Oberflächen anhaften werden. Zu Zellen, die verwendet werden können, gehören Parenchymzellen, die eine metabolische Funktion oder die Organfunktion bereit stellen, Endothelzellen, die Auskleidungen in Gefäßen oder Kanälen, die Blutgefäßen äquivalent sind, bilden, Nerven oder Nervengewebe, Bindegewebe (einschließlich von Knochen, Knorpel oder Zellen, die zu knochenbildenden Zellen und Chondrozyten differenzieren) sowie undifferenzierte Zellen, wie embryonale Zellen, Stammzellen und andere Vorläuferzellen. Zellen können auch bezüglich eines Gens oder mehrerer Gene transgen sein. Beispielsweise können Zellen genetisch so verändert sein, dass sie CD4 exprimieren, so dass die Zellen bezüglich einer Infektion mit einem Virus untersucht werden können, das an das CD4-Molekül bindet.
Bei einer Ausführungsform wird die Matrix mit einer Mischung von Zellen besät, die Endothelzellen enthält, die "Blutgefäße" bilden, sowie wenigstens einen Typ von Parenchymzellen, beispielsweise Hepatozyten, Pankreaszellen oder andere Organzellen. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Matrix mit Stammzellen besät, die dann vermehrt werden. Leber ist als ein prototypisches Gewebe nützlich, da es zwei äußerst relevante Beispiele für den Bedarf an spezifischen Eigenschaften gewebebasierter Systeme bietet.
ES-Zellen, die von Zellen aus dem sehr frühen Stadium des Embryo stammen, behalten das Potenzial zur Differenzierung in fast jedes beliebige Gewebe in vitro, und sie werden in vivo häufig als Basis zur Erzeugung transgener Mäuse verwendet. Sie können in einem sehr undifferenzierten Zustand in Gegenwart von Proteinen vermehrt werden, die die Differenzierung hemmen, und dann in Gegenwart von Differenzierungsfaktoren dazu gebracht werden, sich zu Gewebestrukturen zu differenzieren, auch wenn derzeit keine gute Steuerung des Differenzierungsprozesses möglich ist. Da ES-Zellen aus dem sehr frühen Embryo erhalten werden, können sie eine beträchtlich längere Lebensdauer in vitro als andere Zelltypen bieten, und sie können bezüglich der Präservierung und des Transportes robuster sein. Sie bieten auch die Möglichkeit zur Erzeugung multipler Gewebetypen aus einer einzigen Quelle innerhalb eines einzelnen Gerüsts.

Medien für die Kultur oder die Perfusion

Die Zusammensetzung des Kulturmediums muss aus zwei Blickwinkeln betrachtet werden, grundlegende Nährstoffe (Zucker, Aminosäuren) und Wachstumsfaktoren/Cytokine. Die Kokultivierung von Zellen ermöglicht oft eine Verminderung der Serumkonzentration oder eine Eliminierung des Serums aus dem Medium, und zwar aufgrund der Bildung regulatorischer Makromoleküle durch die Zellen selbst. Die Möglichkeit, derartige makromolekulare regulatorische Faktoren auf physiologische Weise bereit zu stellen, ist ein Hauptgrund für die Verwendung von perfundierten dreidimensionalen Kokulturen. Es wurde ein serumfreies Medium, das mit verschiedenen Wachstumsfaktoren supplementiert und für die Langzeitkultur primärer differenzierter Hepatozyten geeignet war (Block et at., J. Cell Biol. 132: 1133-49 (1996)), getestet, und es zeigte sich, dass es die Kokultur von Hepatozyten mit Endothelzellen unterstützte. ES-Zellen werden routinemäßig im totipotenten Zustand in Anwesenheit des Leukemia Inhibitory Factor (LIF) kultiviert (Williams et al., Nature 336: 684-87 (1988)), der Signalwege über gp130 aktiviert (Saito et al., J. Immunol. 148: 4066-71 (1992)). Verschiedene Medienzusammensetzungen können die Differenzierung von ES-Zellen unterstützen, wobei unterschiedliche Mischungen von Cytokinen unterschiedlicher Differenzierungsmuster erzeugen (Millauer et al., Cell 42: 835-46 (1993); Gendron et al., Dev. Biol. 177: 332-46 (1996); Bain et al., Dev. Biol. 168: 342-57 (1995)). Die Geschwindigkeiten des Medienersatzes werden durch die Bestimmung des Verschwindens von Schlüsselzuckern und -aminosäuren sowie von Schlüsselwachstumsfaktoren/Cytokinen bestimmt. Die Erschöpfung von Wachstumsfaktoren ist ein selten erkannter limitierender Faktor, der die Geschwindigkeiten des Medienersatzes bestimmt (Reddy et al., Biotechnol. Prog. 10: 377-84 (1994)).

Sensoren

Es können Sensoren eingesetzt werden, um Veränderungen des pH, der Sauerstoffspiegel, spezifischer Metaboliten wie Glucose, die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Indikator-Moleküls, wie eines Virus-Proteins, oder beliebige andere Indizien für einen Effekt auf die Gewebe oder ein Material, das den Geweben in der Apparatur ausgesetzt ist, nachzuweisen.
Bei einer Ausführungsform basieren die Messungen bezüglich einer Verletzung oder Infektion auf Veränderungen der Fluoreszenz des Gewebes, wie sie mittels einer miniaturisierten Faseroptik nachgewiesen werden, die die Fluoreszenz entweder über eine Einzelphotonen- oder eine Multiphotonen-Vorrichtung anregt. Die Art der Anregung ist ein kritischer Parameter, der bei der Technikentwicklung berücksichtigt werden muss. Eine Multiphotonenanregung bietet gegenüber der Einzelphotonenanregung mehrere Vorteile bezüglich der Auflösung sowie der Verhinderung eines Gewebeschadens.
Es sind viele Arten einer Fluoreszenzmessung möglich. Veränderungen grundlegender metabolischer Parameter des Gewebes können über die Messung der Veränderung der NAD(P)H-Spiegel über die Eigenfuoreszenz dieser Moleküle bestimmt werden. Die Zellen können auch mit einem Farbstoff vorbeladen werden, der im Falle eines Membranschadens austritt, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt. Alternativ oder zusätzlich können Reportergene unter der Kontrolle eines stressabhängigen Promotors, der im Falle eines Gewebeschadens aktiviert wird und zur Produktion eines fluoreszierenden Produktes führt, in die Zellen transfiziert werden. Der letztere Ansatz ist besonders für den Nachweis von Virusinfektionen innerhalb kurzer Zeit von besonderem Interesse.
Das Ziel des Nachweisschemas besteht in der Bereitstellung einer schnellen, empfindlichen, an die Praxis adaptierbaren und minimal invasiven Messung eines Gewebeschadens über fluoreszenzspektroskopische Verfahren. Es sind verschiedene potenzielle Indikatoren identifiziert worden, die sich bezüglich ihrer Fluoreszenzintensität und/oder ihres Spektrums verändern. Das die Reaktionen eine Bestimmung zellulärer biologischer Zustände innerhalb einer normalen Gewebestruktur erfordern können, ist es möglicherweise nicht ausreichend, nur die oberflächliche Zellschicht im Gewebe zu untersuchen, sondern es müssen die zellulären Schichten, die sich mehrere Zelllagen tief im Inneren des Kanals befinden, selektiv vermessen werden. Diese Anforderungen können zu vier Konstruktionskriterien für das optische Nachweissystem zusammengefasst werden: (1) Auswahl der Tiefe für den Nachweis in dickem (300 um) Gewebe, (2) flexibles Anregungs- und Nachweisschema zur bildlichen Darstellung einer Vielzahl von Indikatoren, (3) minimale Invasivität bezüglich der lebenden Gewebekultur in der Vorrichtung, (4) schneller Signalnachweis mit hoher Empfindlichkeit, (5) Adaptierbarkeit an schwierige Bedingungen in der Praxis.
Beim Einsatz der Einzelphotonenanregung ist ein konfokaler Nachweis erforderlich, um die Fluoreszenz, die aus dem Kanalinneren resultiert, von der Fluoreszenz der Oberfläche zu trennen. Ein konfokales Mikroskop ist ein gut entwickeltes Instrument, das zur Gewinnung optischer Schnitte durch dicke Proben geeignet ist. Zwei Öffnungen oder feine Löcher sind in paarweisen Ebenen angeordnet; eine vor der Lichtquelle und eine vor dem Detektor. Diese Konstruktion kann vereinfacht und für den Online-Nachweis durch die Verwendung einer Einzelmodus-Faseroptik robuster gemacht werden. Durch einen dichroitischen Strahlenteiler wird das Anregungslicht einer Faser im Einzelmodus zugeführt (Fig. 1; Strahlenteiler nicht dargestellt). Das aus der Faser emittierte Licht kann durch eine Linse parallel gerichtet werden. Eine zweite Linse kann das gesammelte Licht auf den Kanal des Gewebechips fokussieren. Eine hohe Auflösung ist bei dieser Anwendung nicht kritisch - es ist keine Bilddarstellung erforderlich - und somit steht Platz für die hydraulische Konstruktion der Durchflusskammer zur Verfügung. Die Fluoreszenz der Probe wird durch zwei Zwischenlinsen gesammelt und in die Einzelmodus-Faser zurück reflektiert. Die Faser, die einen kleinen Durchmesser hat, fungiert gleichzeitig als die feine Exzitations- und die Emissionsöffnung im System. Die Fluoreszenz, die von einem Ort außerhalb der fokalen Region stammt, kann nicht durch die Zwischenlinsen auf die Faseroptik refokussiert werden und wird zurückgewiesen. Dieser Prozess stellt uns eine Tiefendiskriminierung bereit. Es können verschiedene Chromophore mit Anregungswellenlängen, die vom nahen UV-Bereich bis in den blaugrünen Bereich des Spektrums reichen, für dieses Projekt in Betracht gezogen werden. Fluoreszenzindikatoren, die besonders interessant sind, sind bestimmte endogene Chromophore, die Pyridin-Nukleotide. Die Pyridin-Nukleotide NAD(P)H werden im Bereich von 365 nm angeregt und fluoreszieren im Bereich von 400 bis 500 nm. Ein weiterer interessanter Indikator ist das Green Fluorescent Protein (GFP), das entweder in nahen UV-Bereich oder im blauen Bereich des Spektrums angeregt werden kann und typischerweise bei ungefähr 510 nm emittiert. Um diesen großen Bereich von Chromophoren anregen zu können, kann ein abstimmbarer UV-Argonionen-Laser für diese Studie erworben werden. Dieser Laser ist zwar nicht ausreichend robust für eine Anwendung in der Praxis, aber er stellt die Flexibilität für die Testung einer großen Zahl von Fluorophoren bereit. Nach der Identifizierung einer geeigneten Gruppe von Chromophoren können weniger flexible, aber robustere und kompaktere Lasersysteme leicht inkorporiert werden. Diese konfokale Faseroptik-Konstruktion ist eine ausgereifte Technologie und kann schnell in den Gewebesensor eingearbeitet werden, um die Änderungen der zellulären Biochemie unter einem Toxinstress im Inneren des Gewebe-Chips zu untersuchen.
Es kann zwar ein Toxin-empfindlicher Gewebe-Chip auf der Basis des Ansatzes eines konfokalen Einzelphotonen-Verfahrens gebaut werden, aber der Einsatz eines Zwei-Photonen- Ansatzes kann das System über eine Erhöhung des Verhältnisses zwischen dem Fluoreszenzsignal und dem Fluoreszenzrauschen und über eine Erniedrigung der Gewebeschädigung verbessern. Dieser neue Untersuchungsansatz basiert auf der Zwei- Photonen-Mikroskopie, die von Denk et al. entwickelt wurde (Denk et al., Science 248: 73-77 (1990)). Chromophore können durch die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen angeregt werden, die jeweils die Hälfte der Energie aufweisen, die für den Exzitationsübergang benötigt wird. Die Zwei-Photonen-Anregung erfolgt nur im Fokussierungspunkt eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur, einem Bereich mit hoher zeitlicher und räumlicher Konzentration von Photonen. Mittels der Zwei-Photonen-Anregung kommen für ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,25 80% der Gesamtfluoreszenz-Intensität aus einem 1 um dicken Bereich um den Fokussierungspunkt herum. Diese Tiefendiskriminierungs-Wirkung der Zwei-Photonen- Anregung beruht auf der quadratischen Abhängigkeit der Intensität der Zwei-Photonen- Fluoreszenz vom Photonenfluss der Anregung, der von der Fokusebene entfernt schnell abnimmt. Die Tiefendiskriminierung ist ein Ergebnis der Physik des Anregungsverfahrens, und es wird keine feine konfokale Öffnung für den Nachweis benötigt. Diese Ortsabhängigkeit der Zwei-Photonen-Anregung kann am besten in einem einfachen Bleichungsexperiment dargestellt werden.
Um die Wirkung der Zwei-Photonen-Anregung zu demonstrieren, wurde ein Zwei- Photonen-Anregungsvolumen auf das Zentrum eines fluoreszierenden Latexteilchens von 15 um fokussiert. Das Anregungsvolumen wurden wiederholt längs der X-Achse gescannt, bis es zu einer Photobleichung kam. Es wurde ein dreidimensionaler Bilderstapel des Latexkügelchens aufgenommen, wobei eine Reihe der Bilder aus den x-y-Ebenen des Kügelchens mit zunehmender Entfernung vom Zentrum besteht. Oberhalb von 1 um wurde keine Photobleichung beobachtet.
Die Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht die selektive Bestimmung des physiologischen Zustands des Gewebes an jedem beliebigen Punkt im Inneren des Kanals des Gewebe-Chips.
Der Multi-Photonen-Ansatz hat gegenüber dem konfokalen Ansatz eine Reihe von Vorteilen, wenn der Absorptionskoeffizient und der Streukoeffizient der Probe hoch sind, wie beispielsweise diejenigen in Geweben: (1) Die typische Streuung und Absorption im infraroten Spektralbereich ist um über eine Größenordnung geringer als im nahen UV-Bereich oder im blaugrünen Bereich. Durch den Einsatz der Infrarot-Anregung im Zwei-Photonen-Mikroskop wird die Abschwächung des Anregungssignals minimiert. (2) Die konfokale Mikroskopie setzt die feine Emissionsöffnung ein, um Licht, das nicht fokussiert ist, abzuweisen. Tief im Inneren des Gewebes ist eine Streuung der Signalphotonen unvermeidbar. Die daraus resultierende Abweichung vom Weg führt zu einem signifikanten Verlust dieser Photonen bei der feinen konfokalen Öffnung. Die Geometrie der Sammlung der Fluoreszenz-Photonen ist im Zweiphotonen-Fall, bei dem ein Detektor mit großer Fläche und ohne eine feine Öffnung verwendet werden kann, weniger kritisch. Die meisten der vorwärts gestreuten Photonen können erhalten bleiben. (3) Die Zwei-Photonen-Anregung minimiert den Schaden des Gewebes durch Licht. Herkömmliche konfokale Techniken führen zu einer dreidimensionalen Auflösung, indem sie das Beobachtungsvolumen begrenzen, aber die Fluoreszenzanregung erfolgt im ganzen Uhrglas-förmigen Lichtweg. Im Gegensatz dazu begrenzt die Zwei-Photonen-Anregung den Bereich der Wechselwirkung mit dem Licht auf ein Volumen von weniger als einem Femtoliter im Fokuspunkt. (4) Die Wellenlängen der Zwei-Photonen-Anregung sind typischerweise auf das Doppelte der Einzelphotonen-Anregungswellenlängen rotverschoben. Diese große Trennung zwischen dem Anregungsspektrum und dem Emissionsspektrum stellt sicher, dass das Anregungslicht und die Raman-Streuung ausgeschlossen werden können, wobei nur ein Minimum an Fluoreszenzphotonen ausgefiltert wird. (5) Von vielen Fluorophoren wurde gefunden, dass sie ein sehr breites Zwei-Photonen-Absorptionsspektrum zeigen. Eine einzige gut ausgewählte Anregungswellenlänge kann einen großen Bereich von Fluorophoren anregen, deren Emissionsbanden vom nahen UV-Bereich bis zum nahen infraroten Bereich reichen.
Diese Vorteile des Zweiphotonen-Ansatzes machen ihn zu einer attraktiven Alternative zum Einzelphotonen-Ansatz. Allerdings erfordert die Miniaturisierung eines Zwei-Photonen- Systems noch umfangreiche Forschungsarbeit. Es müssen noch Probleme wie die Pulsdispersion im Fasersystem gelöst werden. Deshalb ist ein zweiter zentraler Punkt bei der Entwicklung optischer Systeme für den Gewebe-Chip die Entwicklung einer Miniaturisierungstechnologie für die Zwei-Photonen-Anregungsspektroskopie. Es können Zwei- Photonen-Mikroskope konstruiert werden, um die Reaktion eines Gewebes auf ein Toxin als Funktion der Gewebetiefe im Chip-Kanal zu bestimmen und um die Konfiguration der Optik zu optimieren, damit die Nachweiseffizienz für die spezielle Geometrie des Gewebe-Chips maximiert wird. Falls sich der Zwei-Photonen-Ansatz als vorteilhaft gegenüber dem konfokalen Einzelphotonen-Verfahren herausstellt, kann ein letztendliches miniaturisiertes Fluoreszenz- Nachweissystem, das auf der Zwei-Photonen-Anregung basiert, konstruiert werden.
Es sind miniaturisierte, faseroptische Fluoreszenzspektrometer verfügbar, die verwendet werden können. Ein System basiert auf einer Einzelphotonen-Anregung und auf einem konfokalen Nachweisschema. Ein zweites System beinhaltet die Verwendung einer Zwei- Photonen-Anregung. Zu den Vorteilen dieses Systems gehören eine geringere Gewebeschädigung, ein höherer Durchsatz und eine ausgeprägtere Vielseitigkeit bezüglich der gleichzeitigen Verfolgung multipler Indikatoren.
Es können auch andere Sensoren als Fluoreszenz-Sensoren verwendet werden. Beispielsweise können Proben mittels Infrarot-Spektralphotometern, UV-Spektralphotometern, Gaschromatographen, Systemen der High Performance Liquid Chromotography (HPLC) und anderen Nachweisverfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, analysiert werden. Sie können eingesetzt werden, um Nährstoff, Gase, Metaboliten, den pH sowie andere Indikatoren der Zellaktivität, einer Infektion und des Metabolismus zu messen.

II. Bildung und Vermehrung von Geweben in den Mikromatrices

Das letztendliche Ziel besteht darin, stabile Gewebestrukturen innerhalb einer Gerüstkonfiguarion zu erhalten, die für den Nachweis von Ereignissen, die eine Zellschädigung durch Toxine oder Pathogene anzeigen, zugänglich ist. Der Ansatz basiert auf der Beobachtung, dass Mischungen der verschiedenen Zelltypen aus einem reifen Gewebe unter geeigneten Bedingungen spontan erneut gewebeartige Strukturen bilden, und dass Kulturen embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) spontan transiente Mikrokapillarstrukturen bilden, wenn sie zu einer Aggregation angeregt werden. Der besondere Aspekt des hier beschriebenen Ansatzes besteht darin, dass der Schwerpunkt auf der Bildung perfundierter Kapillarstrukturen im interessierenden Gewebe liegt, um eine stabile Differenzierung der Zellen zu induzieren und eine Langzeitkultur zu ermöglichen.
Die Größe der Gewebeeinheiten orientiert sich an derjenigen, die der Größe eines normalen Kapillarbettes, der kleinsten Einheit des funktionellen Gewebes, vergleichbar ist. Diese Größe stellt sicher, dass genügend Zellen für die Bereitstellung der korrekten Mikroumgebung des Gewebes vorhanden sind, wobei sie noch klein genug ist, dass die Flüssigkeit, die hindurchfließt, nicht an Nährstoffen verarmt. Ein Ziel besteht darin, reproduzierbare Strukturen zu erhalten, die fest an den Wänden des Kanals haften, so dass eine gleichmäßige Passage der Testflüssigkeit durch das Gewebe bereit gestellt wird.
Der Ansatz basiert auf der rationalen Manipulation der inhärenten Fähigkeit dissoziierter Zellen zur erneuten Bildung nativer Gewebestrukturen. Eine histotypische Zell-Reaggregation wurde in verschiedenen einfachen Systemen in vitro beobachtet, z. B. die Bildung (nicht perfundierter) dreidimensionaler Kapillarnetzwerke in Protein-Gelen und die Bildung von Epithelschichten aus dispergierten Keratinozyten. Biophysikalische Analysen der beobachteten Phänomene liefern Einsichten, wie die Morphogenese über die Manipulation messbarer Faktoren, wie der Stärken der Zell-Zell-Adhäsion und der Zell-Substrat-Adhäsion, gesteuert werden kann, und in gewissen Umfange sind nun Vorhersagen möglich, wenn auch nicht auf dem Niveau einer A-priori-Konstruktion eines perfundierten Kapillarnetzwerks innerhalb eines Gewebes. Auf der Basis biophysikalischer Prinzipien und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Biophysik teilweise durch die zugrunde liegende Chemie determiniert ist (d. h. die Fähigkeit von Zellen, Bindungen miteinander und an das Substrat auszubilden), kann man dann eine Gruppe von Parametern identifizieren, die systematisch variiert werden können, um die Gewebemorphogenese und die Funktion in den Kanälen unabhängig vom Gewebetyp zu beeinflussen. Zu diesen Parametern gehören die Oberflächenchemie des Gerüsts, die Mikroabmessungen des Kanals (die Abmessungen des Kanals und die Konfiguration in Richtung des normalen Flüssigkeitsstromes), das Ausmaß der Zellaggregation während des Aussäens sowie das Aussaatprotokoll, die Dicke des Gerüsts, die Perfusionsgeschwindigkeiten und die Zusammensetzung des Kulturmediums (Zucker, Aminosäuren, Wachstumsfaktoren und Cytokine) sowie der Zeitplan seines Wechsels.
Die Oberflächenchemie des Gerüsts übt Effekte in erster Linie über die Einstellung des Gleichgewichtes der Adhäsionskräfte zwischen den Zellen und dem Träger und zwischen den Zellen aus, wobei sowohl die Morphogenese als auch die Gewebefunktion über multiple Wirkungen beeinflusst wird. Es wird wenigstens ein gewisses Ausmaß einer Adhäsion der Zellen an die Oberfläche gewünscht, damit eine Stütze für das Gewebe unter den Bedingungen des Flusses bereit steht. Wenn jedoch die Oberfläche sehr adhäsiv ist, dann tendieren Zellen, die an die Oberfläche angrenzen, dazu, sich auszubreiten und längs der Oberfläche abzuflachen. Eine starke Zellausbreitung ist bei vielen Zelltypen mit einem Funktionsverlust assoziiert (Mooney et al., J. Cell. Phys. 151: 497-505 (1992)) und kann die Funktion des Gewebes beeinträchtigen. Eine bevorzugte Adhäsion von Endothelzellen an die Wände der Kanäle könnte zu einem überschüssigem Wachstum der Endothelzellen führen, da sie ein höheres proliferatives Potenzial als die Hepatozyten aufweisen und maximale Wachstumsgeschwindigkeiten bei einer starken Ausbreitung zeigen (Ingber et al., J. Cell. Biol. 109: 317-30 (1989)). Die Adhäsion und die Ausbreitung der Zellen kann über die Menge der extrazellulären Matrix, die an eine ansonsten schlecht adhäsive Oberfläche adsorbiert ist, gesteuert werden. Sowohl das Silicium als auch das Polymer, das während der ICP-Ätzung auf den Kanälen abgelagert wird, sind für Zellen in Abwesenheit von Serum oder anderen Proteinen relativ wenig adhäsiv. Somit bewirkt die Adsorption von ECM-Proteinen, wie Collagen oder Fibronectin, bei relativ niedrigen, mittleren oder hohen Beschichtungsdichten eine relativ niedrige, mittlere oder hohe Stärke der Zelladhäsion und entsprechende Ausmaße einer Zellausbreitung, bezogen auf die Konzentration des Proteins (DiMilla et al., J. Cell Biol. 122: 729-37 (1993); Mooney et al., J. Cell. Phys. 151: 497-505 (1992)), und somit kann man ein Protein der extrazellulären Matrix, wie Collagen vom Typ I, in den meisten Studien dazu verwenden, die Zelladhäsion zu modulieren.
Die Mikrogeometrie der Kanäle kann ebenfalls so manipuliert werden, dass sie sowohl die Morphogenese als auch die Funktion beeinflusst. Die Fähigkeit zur Manipulation der Geometrie der Kanalwände ist eine der stärksten Motivationen für den Einsatz der Silicium- Mikrofabrikationstechnologie. Kerben oder Ausbogungen in den Wänden (Fig. 3A und 3B) mit Elementgrößen, die den Zelldurchmessern (10 bis 20 um) vergleichbar sind, können zur Bereitstellung einer Matrize für die Zellorganisation in Richtung des Flusses während des Prozesses der statischen Aussäung verwendet werden. Derartige Merkmale können auch ein Mittel zur Bereitstellung eines relativ hohen Ausmaßes an Zelladhäsion an die Oberfläche ohne gleichzeitige Zellausbreitung bereit stellen. Die Elemente zwingen die Zelle in eine abgerundete Form, wobei sie gleichzeitig eine ausreichende Oberfläche für eine starke Zellanheftung bereit stellen. Es kann auch wünschenswert sein, die Oberflächenchemie der vorspringenden und zurück versetzten Elemente selektiv zu steuern, um die Morphogenese und die Differenzierung zu unterstützen. Beispielsweise wird es, wenn die exponierten Oberflächen des Kanals zwischen den Kerben widerstandsfähig gegen eine anfängliche Zelladhäsion gemacht werden (Fig. 3A und 3B), möglich, dass eine Flüssigkeit unmittelbar nach dem Aussäen an der Grenzfläche strömen kann, aber man kann erwarten, dass im Laufe mehrerer Tage aufgrund der natürlichen Wanderung/Sortierung von Endothelzellen in Richtung der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Gewebe eine Kapillarbildung induziert wird (Fig. 4A und 4B). Der Querschnittsdurchmesser der Kanäle muss wenigstens 5 Zelldurchmesser (ungefähr 80 bis 100 um in Abhängigkeit vom Zelltyp) aufweisen, damit eine ausreichende Zellmasse ohne gleichzeitige Wandeffekte bereit gestellt wird.
Das Ausmaß der Zellaggregation während des Aussäens und das Aussaatprotokoll können die Morphogenese beeinflussen, und die Protokolle können gewebespezifisch sein. Aggregate von Hepatozyten und Endothelzellen in freier Lösung bilden Kugeln aus, wobei die Endothelzellen die äußere Oberfläche bedecken (die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und dem Gewebe) (Ammann et al., Toxicol. in Vitro 11: 43-56 (1997)), während kugelförmige Aggregate von ES-Zellen in freier Lösung spontane, aber transiente Netzwerke aus Mikrokapillaren im gesamten Netzwerk 4 bis 5 Tage nach der Aggregation bilden (Doetschman er al., J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45 (1985); Kennedy et al.. Nature 386: 488-93 (1997)). Man kann es deshalb vorziehen, eine Aggregation von Hepatozyten und Endothelzellen innerhalb der Kanäle während einer statischen Periode von wenigen Stunden nach der Aussaat zu ermöglichen. Es kann jedoch bevorzugt sein, dass man es ES-Zellen und möglicherweise Hepatozyten ermöglicht, in freier Lösung Aggregate zu bilden, die dann in das Gerüst ausgesät werden. Es werden keine schädlichen Effekte auf Zellen erwartet, die über mehrere Stunden nach der Aussaat in den Kanälen bei hoher Dichte ohne eine Perfusion gehalten werden, da die Diffusionsstrecke des Sauerstoffs in dichtes Gewebe aus Kulturmedium, das mit atmosphärischen Sauerstoff äquilibriert ist, bei ungefähr 200 um liegt (Cima et al., Bioprocess Eng. 5: 19-30 (1990); Cima et al., J. Biomech. Eng. 113: 143-51 (1991)). Die Diffusion aus den beiden offenen Enden des Kanals reicht somit aus, die 300 um dicken Zellaggregate während statischer Perioden zu versorgen.
Eine andere potenziell bevorzugte Form des Aussäens beinhaltet die Zufuhr in verschiedenen Stufen. Beispielsweise könnten zunächst Hepatozyten in die Kanäle gesät werden; nach eine Kulturdauer von Stunden bis Tagen könnten dann Endothelzellen in einer oder mehreren Schichten auf den Hepatozyten eingebracht werden. Über den Betrieb des Bioreaktors im Querstrom-Modus (Fig. 2B) kann man innerhalb der Kanäle Sauerstoffgradienten hervorrufen, indem die Sauerstoffspannung im unteren Perfusionskreislauf vermindert wird. Man würde dann erwarten, dass die Endothelzellen eine angiogene Reaktion auf diesen chemotaktischen Sauerstoffgradienten zeigen, in Richtung der Gebiete mit niedriger Sauerstoffspannung wandern und Kapillaren ausbilden, die dann die aggregierten Hepatozyten durchdringen.
Die Dicke des Gerüsts begrenzt die erforderlichen Perfusionsgeschwindigkeiten, die zur Aufrechterhaltung von Nährstoffen in geeigneten Mengen über die gesamte Länge des Kanals benötigt werden, nach unten. Eine grobe Schätzung bezüglich der annehmbaren Länge hinsichtlich der Tiefe des Kanals kann durch die Betrachtung der Länge von Kapillaren im Gewebe, die typischerweise zwischen 400 und 1000 um liegen, erhalten werden. Die Fähigkeit von Kulturmedium zum Tragen von Sauerstoff ist geringer als diejenige von Blut, und deshalb werden kürzere Kanäle (250-350 um) benötigt, um eine Nährstofferschöpfung zu verhindern und gleichzeitig vergleichbare Flussgeschwindigkeiten durch die Kapillaren sowie das gleiche Kapillarvolumen pro Volumeneinheit des Gewebes aufrecht zu erhalten. Detaillierte Berechnungen, die auf den Geschwindigkeiten basieren, mit denen Gewebe Nährstoffe verbrauchen, finden sich bei Griffith et al., "In vitro organogenesis of vascularized liver tissue", Ann. N. Y. Acad. Sci. 831: 382-97 (1997). Der Sauerstoff-Partialdruck am Einlass und am Auslass des Gerüsts kann mit innen liegenden Sauerstoff-Mikroelektroden verfolgt werden. Die Bestimmung des Ausmaßes der NAD(P)H-Fluoreszenz als Funktion der Position im Kanal kann zur Bestimmung der metabolischen Vitalität verwendet werden.
Die Perfusionsgeschwindigkeiten beeinflussen die Morphogenese und die Funktion sowohl auf mechanischem als auch auf chemischem Wege. Ein durch die Perfusion induzierter Scherstress auf Zellen aktiviert Signalwege, die in Abhängigkeit vom Ausmaß der Scherung sowohl eine Schädigung als auch eine Homöostase signalisieren können. Eine Flüssigkeitsscherung kann die differenzierte Funktion von Epithelzellen wie Hepatozyten negativ beeinflussen, aber sie kann für die Aufrechterhaltung der normalen Phänotyp-Funktion von Zellen, die normalerweise in Umgebungen mit Scherkräften vorkommen, beispielsweise von Endothelzellen, benötigt werden, obwohl exzessive Scherkräfte zu einer abnormalen Funktion sogar dieser Zellen führen können. Das Ausmaß der Scherkräfte auf Gewebe kann über eine mathematische Modellierung unter Verwendung bekannter durchschnittlicher volumetrischer Flussraten in jedem Kanal sowie der Information über die Gewebestrukturen (Abmessungen und Zahlen der Kapillaren), die aus einer Kombination aus Immunfärbung/Multiphotonenspektroskopie und Histologie/Immunfärbung erhalten werden, abgeschätzt werden. Die minimale Perfusionsgeschwindigkeit wird durch die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs des Gewebes bestimmt. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird die Sauerstoff-Konzentration am Auslass des Gewebes ungefähr bei den Konzentrationen im venösen Blut gehalten.
Die Perfusionsgeschwindigkeiten durch die Gewebe-Arrays werden über die Verwendung eines Querstrom-Bioreaktorsystems (Fig. 2A-2C) gesteuert. Die Fig. 2A zeigt, dass getrennte Perfusionskreisläufe einen tangentialen Fluss von Kulturmedium über die Oberseile und die Unterseite des Chips bereit stellen. Zellen können in das Gerüst ausgesät werden, indem man eine Zellsuspension durch den oberen Kreislauf strömen lässt. Der Reaktor kann dann unter Querstrombedingungen betrieben werden, wobei der Druckunterschied den Fluss aus dem oberen Kreislauf durch die Kanäle in den unteren Kreislauf treibt (Fig. 2B). Alternativ kann der Reaktor im Modus des erzwungenen Flusses betrieben werden, wobei der Fluss des oberen Kreislaufs durch die Kanäle und aus dem Auslass der unteren Kammer geleitet wird (Fig. 2C).
Bei der Querstromanordnung (Fig. 2B) werden zwei getrennte Perfusionskreisläufe aufrecht erhalten, wobei ein Fluss über die Oberseite des Gerüsts fließt und der andere über die Unterseite. Der hydrostatische Gesamtdruck in jedem Kreislauf kann unabhängig davon aufrecht erhalten werden (beispielsweise über die Verwendung von Druckventilen oder Drosselventilen), und der Perfusionsfluss durch die Zellen in den Kanälen wird über diesen Druckunterschied angetrieben. Bei dieser Anordnung kann eine "statische" Periode ohne eine Perfusion nach dem Aussäen aufrecht erhalten werden, wobei der Sauerstoff und die Konzentration anderer Nährstoffe auf der Oberseite und der Unterseite des Chips bei gut definierten Werten gehalten werden. Während der "statischen" Periode sind die Flussgeschwindigkeiten im oberen und im unteren Kreislauf vorzugsweise gleich. Der Sauerstoffpartialdruck in diesen Kreisläufen kann gleich sein, muss es aber nicht, was von der Art des jeweiligen Experiments abhängt. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, die Sauerstoffspannung im unteren Perfusionskreislauf zu erniedrigen, um einen Sauerstoffgradienten in den Kanälen einzuführen. Während des Routinebetriebes wird die Gesamtflussgeschwindigkeit durch den oberen Kreislauf (d. h. tangential zur Oberfläche des Chips) ungefähr 10-fach größer gehalten als die Flussgeschwindigkeit der Perfusion durch den Chip, was sicher stellt, dass sich keine signifikanten Sauerstoffgradienten längs der Oberfläche der Chips ausbilden. Während des Routinebetriebes wird die gesamte Flussrate durch den unteren Kreislauf (d. h. tangential zur Oberfläche des Chips) ebenfalls wenigstens 10-fach höher als die Perfusionsgeschwindigkeit durch den Chip gehalten, aber das ist nicht unbedingt erforderlich, da die Flussgeschwindigkeit im unteren Kreislauf niedriger sein kann.
Der in der Fig. 2 gezeigte Reaktor ermöglicht das Anbringen eines Filters stromabwärts vom Gerüst. Das ermöglicht es, die Zellen in der lokalen Umgebung der Kanäle zu kultivieren, ohne dass sie durch die Perfusion mit dem Medium aus dem Gerüst weg gewaschen oder entfernt werden. Bei diesem Verfahren wird ein einzelnes Gerüst an einer Seite von einem Filter mit einer Porengröße von 5 um im trockenen Zustand bedeckt. Die Porengröße des Filters muss kleiner als 10 um sein, um die Endothelzellen daran zu hindern, durch die Poren zu schlüpfen. Sie liegt vorzugsweise zwischen 1 und 5 um. Die Porengröße liegt vorzugsweise bei mehr als 0,1 um. Der Filter kann an Ort und Stelle gehalten werden, indem er an das Gerüst gebunden wird oder indem er "sandwichartig" durch ein anderes Silicium-Gerüst, das identisch mit dem ersten ist, an Ort und Stelle gehalten wird, wobei darauf geachtet wird, die Kanäle der beiden Gerüste auszurichten. Beim letzteren Verfahren stützt das zweite Gerüst den Filter und macht es unnötig, den Filter direkt an das Gerüst zu binden. Das Konstrukt kann dann in den Reaktor gegeben und dort befestigt werden.
Die Fig. 4A und 4B sind schematische Darstellungen der Reorganisation von Zellmischungen in Kanälen mit einer Oberflächentextur und einer selektiv modifizierten Oberflächenchemie, und zwar zu einer anfänglichen Zeit (Fig. 4A) und nach der Umorganisation (Fig. 4B). Es kann auch ein gerichtetes Wachstum von Kapillaren in ES- Kulturen, die spontane mikrovaskuläre Netzwerke ausbilden, aufgrund der bevorzugten Anheftung von Zellen an die Kerben erfolgen.
Die Modellierung der Verteilung des Flusses ist ein wichtiger Teil bei der Konstruktion des Gerüsts, da sie es einem ermöglicht, die Wechselwirkung zwischen der Gewebemechanik und den Flüssigkeitsbewegungen bei der Morphogenese der Struktur zu interpretieren, und da sie angibt, wie man experimentelle Parameter, wie die Zelladhäsion an die Kanalwände, variieren kann, um geeignete Strukturen zu erhalten. Simulationen, die eine Vorhersage erlauben, sind aufgrund einer Netzwerk-Compliance und der Tendenz zur biologischen Remodellierung kompliziert, zu denen es als Ergebnis der Spannungen, die auf das Gefäßendothel wirken, kommen kann. Das Modell basiert auf einem, das von Kamm et al. entwickelt wurde, um den Blutfluss durch das pulmonäre Mikrogefäßbett zu beschreiben (Dhadwal et al., J. Appl. Physiol. 83: 1711-20 (1997)). Das Modell wird dazu verwendet, die Auswirkungen der physiologisch relevanten Variabilität bezüglich der Gefäßabmessungen und der Compliance auf den Blutfluss durch Segmente und auf Perfusionsmuster innerhalb des Kapillarbettes als ganzem zu untersuchen. Es sollte modifiziert werden, damit die entsprechenden Grenzbedingungen des Kanals widergespiegelt werden.
Die Gewebeorganisation kann sowohl durch lichtmikroskopische als auch durch elektronenmikroskopische Gewebehistologie untersucht werden. Für Lebergewebe können Endothelzellen und Hepatozyten selektiv markiert und auch mittels konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Es kann eine Immunfärbung bezüglich Endothelmarkern und Parenchymmarkern eingesetzt werden, um die Organisation von Blutgefäßen in histologischen Schnitten zu untersuchen. Es kann auch eine Tinteninfiltration eingesetzt werden. Eine Bildanalyse kann dazu verwendet werden, die Abmessungen von Gefäßen und ihre Dichte als Eingabegrößen für die mathematische Modellierung zu bestimmen.
Das Ausmaß der Hepatozytendifferenzierung kann anhand der Sekretion von Serumalbumin bestimmt werden (Cima et al., Biotech. Bioeng. 38: 145-58 (1991)), und die Stabilität von P450-Enzymen kann anhand der Erzeugung von Metaboliten aus Standard- Sondensubstraten bestimmt werden. Diese Tests können nichtinvasiv mit Langzeitperfusionskulturen durchgeführt werden. Die Differenzierung von ES-Zellen kann primär mittels invasiver Techniken untersucht werden. Es kann jedoch ein Nachweis hämatopoetischer Funktionen erreichbar sein, wenn eine Wanderung der Zellen, die im Gewebe gebildet werden, in das zirkulierende Medium erfolgt.
Die hier beschriebene Technologie kann auch in einem Bioreaktor eingesetzt werden, der so konstruiert ist, dass er die Vermehrung schwer kultivierbarer Zellen, wie Stammzellen, Inselzellen des Pankreas und differenzierter Nervenzellen, ermöglicht. Diese Zellen können direkt in therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden, beispielsweise bei der Bildung eines künstlichen Pankreas zur Behandlung von Diabetes. Alternativ können die Zellen mit genetischem Material transfiziert werden, während sie sich im Bioreaktor befinden, und dann entweder direkt für eine Therapie eingesetzt oder dazu verwendet werden, verschiedene Proteine zu erzeugen, die dann verabreicht werden.
Ein Problem beim Tissue-Engineering hämatopoetischer Stammzellen nach dem bisherigen Stande der Technik besteht darin, dass sich die Stammzellvermehrung in vitro als problematisch heraus gestellt hat. Die bisherigen Verfahren haben zu frühen Vorläuferzellen geführt, aber nicht zu Stammzellen. Wenn ein Gentransfer in vitro versucht wird, dann werden die Gene in die Vorläuferzellen eingeführt, aber nicht in Stammzellen. Dementsprechend ist der Gentransfer transient und nicht permanent.
Durch das Aufrechterhalten der normalen Gewebearchitektur, beispielsweise der von Endothel ausgekleideten Gefäße durch das Gewebe, und durch eine geeignete Konstruktion der Kanalarchitektur zur Lokalisierung bestimmter Zellen an bestimmten Orten kann man eine markähnliche Umgebung erhalten, die die Vermehrung von Stammzellen in vivo stimuliert. Die Zellen können geerntet werden, beispielsweise dadurch, dass eine lösliche Verbindung dem Medium zugesetzt wird (beispielsweise ein Chemotherapeutikum), die dazu führt, dass die Stammzellen in den "vaskulären" Raum austreten, wie sie es im Körper tun. Die Zellen können geerntet werden, indem die Flussrichtung umgekehrt wird und der Fluss in Richtung eines Sammelfilters gelenkt wird. Das ist dem Verfahren analog, nach dem Stammzellen von Patienten gesammelt werden, wobei die Zellen dabei aus dem peripheren Blut geerntet werden, indem die Zellen zuerst dazu stimuliert werden, aus dem Mark in das Blut zu wandern, indem dem Patienten ein Chemotherapeutikum gegeben wird.
Ein Weg zur Vermehrung von Stammzellen besteht darin, die Mikroorganversion einer menschlichen Leber mit einer Protease zu perfundieren, beispielsweise Collagenase, die das Lebergewebe empfindlich gegenüber Mitogenen wie dem Epidermal Growth Factor (EGF) macht.

III. Zusammenstellung von Testsystemen

Die Fig. 5A ist eine schematische Darstellung einer Apparatur zur Verwendung von Mikrogewebe-Arrays als Teil eines High-Throughput-Batchsystems für die chemische und die biologische Testung. Ein Mikrogewebe-Array 101 wird in jeden Well 102 einer Multiwell-Platte 103 gegeben. Die Mikrogewebe-Arrays können über Stege oder Schlitze in jedem Well oberhalb des Bodens des Wells gehalten werden. Der Boden 104 eines jeden Wells kann aus einem festen Material bestehen, beispielsweise Glas oder Kunststoff, einem Filtermaterial wie Nylon, Cellulose, Nitrocellulose oder PVDF, oder aus einem porösen Material, wie porösem Glas oder porösem Silicium. Kulturmedium oder eine Testflüssigkeit befindet sich in direktem Kontakt mit der Oberseite des Mikrogewebe-Arrays und permeiert den Gewebe-Array.
105 befindet sich in direktem Kontakt mit der Oberseite des Mikrogewebe-Arrays und permeiert den Gewebe-Array. Wenn der Mikrogewebe-Array entfernt vom Boden des Wells gehalten wird, dann besetzt ein bestimmtes Volumen an Kulturmedium oder Testflüssigkeit 105a den Raum zwischen dem Mikrogewebe-Array und dem Boden des Wells. Die Zusammensetzungen der Gasphase über der Multiwell-Platte können so eingestellt werden, dass die geeignete Sauerstoff-Konzentration, der geeignete pH und die geeignete Kohlendioxid- Konzentration im gesamten Mikriogewebe-Array bereit gestellt werden.
Fig. 5B ist eine schematische Darstellung einer Apparatur zur Verwendung von Mikrogewebe-Arrays als Teil eines High-Throughput-Batchsystems für die chemische und biologische Testung, wobei die Multiwell-Platte 115 auf der Oberseite einer Vakuumkammer 114 angeordnet ist. Ein Mikrogewebe-Array 101 wird in jeden Well 102 einer Multiwell-Platte 103 gegeben. Die Mikrogewebe-Arrays können über Stege oder Schlitze in jedem Well oberhalb des Bodens des Wells gehalten werden. Der Boden 117 eines jeden Wells kann aus einem Filtermaterial bestehen, wie Nylon, Cellulose, Nitrocellulose oder PVDF, oder aus einem porösen Material, wie porösem Glas oder porösem Silicium. Wie in der Fig. 5A befindet sich Kulturmedium oder eine Testflüssigkeit in direktem Kontakt mit der Oberseite des Mikrogewebe- Arrays und permeiert den Gewebe-Array. Wenn der Mikrogewebe-Array entfernt vom Boden des Wells gehalten wird, dann besetzt ein bestimmtes Volumen an Kulturmedium oder Testflüssigkeit den Raum zwischen dem Mikrogewebe-Array und dem Boden des Wells.
In der Fig. 5B enthält die Vakuumkammer einen Gaseinlass 111 und einen Gasauslass 112. Ein Vakuum kann am Gasauslass angelegt werden, so dass die Flüssigkeit, die jeden Mikrogewebe-Array umgibt, durch die Unterseite aller Wells geleitet wird, abwärts durch einen Trichter 118 und in die entsprechenden Wells 119 einer Multiwell-Sammelplatte 113. Anschließend kann Gas durch den Gaseinlass 111 in die Vakuumkammer eingeleitet werden, wodurch eine angestrebte Gasphasenzusammensetzung und ein Druck in der Kammer bereit gestellt werden. Die Zusammensetzung und der Druck der Gasphase können sich von derjenigen bzw. demjenigen der Gasphase über der Multiwell-Platte mit den Mikrogewebe- Arrays unterscheiden. Die Zusammensetzungen der Gasphase können so eingestellt werden, dass die geeignete Sauerstoff-Konzentration, der geeignete pH und die geeignete Kohlendioxid- Konzentration in allen Mikrogewebe-Arrays bereit gestellt werden.
Die Fig. 6A ist eine schematische Darstellung einer Apparatur zur Verwendung von Mikrogewebe-Arrays als Teil eines High-Throughput-Durchflusssystems für die chemische und die biologische Testung, wobei die Multiwell-Platte 142 auf der Oberseite einer Vakuumkammer 144 angeordnet ist und ein Verteilersystem 140 dazu verwendet wird, Flüssigkeit jedem Well in gewissen Abständen zuzuführen. Ein Mikrogewebe-Array 101 wird in jeden Well der Multiwell- Platte gegeben. Die Mikrogewebe-Arrays können über Stege, Schlitze oder einen Klebstoff in jedem Well oberhalb des Bodens des Wells gehalten werden. Es kann ein Filtermaterial, wie Nylon, Cellulose, Nitrocellulose oder PVDF, ein poröses Material, wie poröses Glas oder poröses Silicium, oder Siebe, wie Metallsiebe, oberhalb von 146 und unterhalb von 147 in jedem Mikrogewebe-Array angeordnet werden. Wie in der Fig. 5A befindet sich Kulturmedium oder eine Testflüssigkeit in direktem Kontakt mit der Oberseite des Mikrogewebe-Arrays und permeiert den Gewebe-Array. Wenn der Mikrogewebe-Array entfernt vom Boden des Wells gehalten wird, dann besetzt ein bestimmtes Volumen an Kulturmedium oder Testflüssigkeit den Raum zwischen dem Mikrogewebe-Array und dem Boden des Wells.
In der Fig. 6A enthält die Vakuumkammer einen Gaseinlass 155 und einen Gasauslass 145. Ein Vakuum kann am Gasauslass angelegt werden, so dass die Flüssigkeit, die jeden Mikrogewebe-Array umgibt, durch die Unterseite aller Wells geleitet wird, abwärts durch einen Trichter 148 und in die entsprechenden Wells 149 einer Multiwell-Sammelplatte 143. Anschließend kann Gas in die Vakuumkammer eingeleitet werden, wodurch eine angestrebte Gasphasenzusammensetzung und ein Druck in der Kammer bereit gestellt werden. Die Zusammensetzung und der Druck der Gasphase können sich von derjenigen bzw. demjenigen der Gasphase über der Multiwell-Platte mit den Mikrogewebe-Arrays unterscheiden. Die Zusammensetzungen der Gasphase können so eingestellt werden, dass die geeignete Sauerstoff-Konzentration, der geeignete pH und die geeignete Kohlendioxid-Konzentration in allen Mikrogewebe-Arrays bereit gestellt werden.
In der Fig. 6A wird ein Verteilersystem 140 dazu verwendet, Kulturmedium oder eine Testflüssigkeit jedem Well in gewissen Abständen zuzuführen. Die Flüssigkeit wird jedem Well über ein kleines Röhrchen oder eine Pipettenspitze 141 zugeführt. Das System zur Flüssigkeitszufuhr kann zusammen mit einem Vakuumsystem so betrieben werden, dass das Flüssigkeitsvolumen in jedem Well der Multiwellplatte 142 konstant oder innerhalb eines annehmbaren Bereichs gehalten wird. Die Flüssigkeit kann in sehr unterschiedlichen Abständen zugeführt werden, beispielsweise zwischen einmal pro Tag und bis zu mehrmals pro Sekunde.
Geeignete Flussbedingungen können erhalten werden über die Konstruktion der Abmessungen der Multiwell-Platte 142, über die Auswahl der Materialien oberhalb von 146 und unterhalb von 147 des Mikrogewebe-Arrays, basierend auf ihren Eigenschaften bezüglich der Flusswiderstände, über die Konstruktion der Mikrogewebevorrichtungen, basierend auf ihren Eigenschaften bezüglich der Flusswiderstände, und über die Konstruktion der Verteiler- und der Vakuumsysteme.
In der Fig. 6A kann die Multiwell-Sammelplatte 143 von der Vakuumkammer abgenommen werden, nachdem die Flüssigkeit, die die Mikrogewebe-Arrays umgibt, gesammelt worden ist. Die Flüssigkeit in der Sammelplatte kann dann untersucht und/oder durch die Verwendung des Verteilersystems wieder durch das Mikrogewebe-Array, von wo es kam, zurück geführt werden. Wenn eine Sammelplatte mit Flüssigkeit von der Vakuumkammer abgenommen wird, kann eine leere Sammelplatte in die entsprechende Position der Kammer gebracht werden, bereit für die Sammlung von Flüssigkeit aus dem nächsten Flusszyklus.
Die Fig. 6B ist identisch mit der Fig. 6A, außer dass ein Array von Sensoren 151 dazu verwendet wird, Ereignisse in jedem Well nachzuweisen. Das Signal von jedem Sensor wird durch die Informationsleitungen 1152 einer Vorrichtung 150 zur Darstellung und Verarbeitung der Information, beispielsweise einem Computer, zugesandt. Jeder Sensor kann aus einem miniaturisierten faseroptischen System bestehen, das eine Einzelphotonenanregung oder eine Multiphotonenanregung jedes Mikrogewebes bereit stellt und die resultierende Fluoreszenzintensität des Mikrogewebe-Arrays nachweist. Es können andere Sensoren eingesetzt werden, beispielsweise solche, die Fluoreszenz, Lumineszenz oder eine Lichtabsorption nachweisen. Materialien mit geeigneten optischen Eigenschaften können für die Verwendung oberhalb 146 und unterhalb 147 des Mikrogewebe-Arrays ausgewählt werden. Es kann eine große Lichtquelle, ein Array von Mikrolichtquellen, innerhalb oder unterhalb der Vakuumkammer angeordnet werden, so dass jeder Mikrogewebe-Array Licht von unten ausgesetzt ist. Die Spitze eines jeden Sensors kann in die Flüssigkeit oberhalb jedes Mikrogewebe-Arrays hinein ragen. Es können dann Sensoren, die Sauerstoff, den pH, CO&sub2; oder eine andere chemische Einheit nachweisen, verwendet werden. Es können auch Sensoren in der Flüssigkeit oberhalb jedes Mikrogewebe-Arrays, die den Widerstand bezüglich eines Elektronenflusses durch den Mikrogewebe-Array nachweisen, verwendet werden. In diesem Fall kann eine Miniatur-Kathode oder -Anode in die Flüssigkeit unterhalb jedes Mikrogewebe- Arrays ragen, so dass ein Kreislauf mit dem entsprechenden Sensor oberhalb des Arrays geschlossen wird.
Bei den Fig. 5A, 5B, 6A und 6B sollte die Zusammensetzung des Filters, der porösen Materialien oder der Siebmaterialien oberhalb oder unterhalb des Mikrogewebe-Arrays so gewählt werden, dass keine bestimmten chemischen Verbindungen oder Klassen von Verbindungen gebunden werden. Die Materialien sollten keine Testverbindungen, die untersucht werden, ihre resultierenden Metaboliten oder Schlüsselkomponenten des Kulturmediums, wie Wachstumsfaktoren, binden. Unter zahlreichen Bedingungen erfüllt ein Filter aus PVDF-Material diese Anforderungen. Die Materialien brauchen nicht mit bestimmten Verbindungen, wie Albumin oder Collagen, vorbeschichtet sein.
In den Fig. 5A, 5B, 6A und 6B können Filter, poröse Materialien oder Siebmaterialien unterhalb des Mikrogewebe-Arrays verwendet werden, die bestimmte chemische Verbindungen oder Klassen von Verbindungen binden. Die Materialien können so ausgewählt oder konstruiert sein, dass sie DNA-Moleküle, DNA-Moleküle mit einer bestimmten Sequenz oder mit bestimmten Sequenzen, RNA-Moleküle, RNA-Moleküle mit einer bestimmten Sequenz oder bestimmten Sequenzen, Protein-Moleküle, Protein-Moleküle mit einer bestimmten Zusammensetzung oder Bindungsaktivität sowie andere biologische Moleküle von Interesse binden. Diese Moleküle können dann aus der Flüssigkeit, die die Mikrogewebe-Arrays umgibt, abgefangen werden, wenn sie über den Einsatz des Vakuums in die Sammelplatte abgesaugt wird. Alternativ oder zusätzlich können diese Moleküle aus jedem Well des Mikrogewebe-Arrays extrahiert werden, und zwar mittels Standardextraktionsverfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, und dann aus der Extraktionslösung, wenn sie durch die Sammelplatte über den Einsatz des Vakuums abgesaugt wird, isoliert werden. Es können dann Tests durchgeführt werden, um die gefangenen Moleküle zu quantifizieren und zu charakterisieren.
Die Fig. 7 ist eine schematische Darstellung einer Apparatur zur Verwendung eines Mikrogewebe-Arrays 101 als Teil eines kontinuierlichen Durchflusssystems für die chemische und/oder die biologische Testung. Kulturmedium, das eine Testsubstanz enthält, wird mittels einer Pumpe 186 durch einen Mikrogewebe-Array 101, der in einem Reaktorgehäuse 181 enthalten ist, zirkuliert. Die Zirkulationsgeschwindigkeit kann mittels eines Computers 183, der mit der Zirkulationspumpe verbunden ist, gesteuert werden. Die Flüssigkeit rezirkuliert in einer kontinuierlichen Flussschleife 201, die, wenn es für den Gasaustausch erforderlich ist, einen Durchflussoxygenator 187 enthalten kann, der Sauerstoff zuführt und Kohlendioxid entfernt. Unter bestimmten Umständen kann der Gasaustausch durch die Wände der Schläuche der Schleife ausreichend sein und einen Oxygenator überflüssig machen. Der Oxygenator enthält gasdurchlässige Schläuche, und zwar in ausreichender Menge, so dass sich das benötigte Gas mit dem Gas des Oxygenatoreinlasses 190 austauschen kann. Sauerstoff geht vom Gas in das Medium über, während Kohlendioxid vom Medium in das Gas übergeht und als Bestandteil des austretenden Gases 191 entfernt wird. Die Flussgeschwindigkeit des eintretenden Gases kann über die Verwendung eines Steuerventils 192, das mit einem Computer-Kontrollsystem 183 verbunden ist, gesteuert werden.
In der Fig. 7 kann die Zusammensetzung des zirkulierenden Mediums durch die Verwendung von Sensoren stromaufwärts 192 und/oder stromabwärts 194 des Mikrogewebe- Arrays gemessen werden. Es können zahlreiche Sensoren in jeder Position eingesetzt werden, einschließlich von Sensoren, die Sauerstoff, den pH, Glucose, Kohlendioxid, Testsubstanzen, Metaboliten von Testsubstanzen oder andere kritische biologische Parameter messen. Es kann ein Reaktorsensor 193 verwendet werden, der sich durch das Reaktorgehäuse erstreckt. Der Reaktorsensor kann aus einem miniaturisierten faseroptischen System bestehen, das eine Einzel- oder eine Multiphotonenanregung jedes Mikrogewebes bereit stellt und die resultierende Fluoreszenzintensität des Mikrogewebe-Arrays nachweist. Es können andere Sensoren eingesetzt werden, beispielsweise solche, die eine Fluoreszenz, Lumineszenz, Lichtabsorption oder den Widerstand bezüglich eines Elektronenflusses durch den Mikrogewebe-Array nachweisen.
In der Fig. 7 wird die Testprobe 188 mit Kulturmedium 189 in einem Zufuhrreservoir 185 in solchen Verhältnissen gemischt, dass eine geeignete Probenkonzentration bereitgestellt wird. Die Verhältnisse können online mittels des Computers 183, und zwar potenziell als Teil eines Feedback-Steuerungssystems, gesteuert werden. Die resultierende Mischung aus Medium und Probe wird über eine Förder-/Entnahmepumpe 184 in die Zirkulationsschleife eingespeist. Flüssigkeit kann gleichzeitig über einen zweiten Kopf der Förder-/Entnahmepumpe aus der Zirkulationsschleife entnommen werden, so dass das Volumen der Flüssigkeit in der Zirkulationsschleife im wesentlichen konstant gehalten wird. Die entnommene Flüssigkeit kann dem Abfall oder einer Probensammelvorrichtung 182 zugeführt werden. Die Vorrichtung zur Probensammlung kann aus einem Fraktionssammler des Typs, der allgemein in chromatographischen Systemen eingesetzt wird, und der unter der Steuerung eines Computers und/oder seines internen Steuerungsprogramms betrieben wird, bestehen. Mit einem Fraktionssammler können Proben, die innerhalb bestimmter Zeitabstände gesammelt werden, in getrennte Sammelröhrchen gegeben werden. Die Proben können anschließend bezüglich der Testverbindung oder anderer Chemikalien analysiert werden.
In der Fig. 7 kann der Betrieb des gesamten kontinuierlichen Durchfluss-Testsystems mittels eines Computers 183 gesteuert werden. Es können Feedback-Steuerungsschemata basierend auf den Messungen der Sensoren oder den Ergebnissen von Tests, die mit den Proben durchgeführt werden, eingesetzt werden. Es kann ein Kontrollschema implementiert werden, um ein Targetprofil der Konzentration in Abhängigkeit von Zeit, wie es beispielsweise in der Fig. 8 gezeigt ist, für eine Testchemikalie oder ein biologisches Agens bereit zu stellen.
Alternativ kann ein Steuerungsschema implementiert werden, um ein Targetprofil der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Zeit für eine Reaktion bereit zu stellen, die im Mikrogewebe-Array abläuft. Die Geschwindigkeit könnte kontinuierlich über der Verwendung der stromaufwärts und stromabwärts liegenden Sensoren bestimmt werden. Das in der Fig. 7 dargestellte kontinuierliche Durchflusssystem ist äußerst flexibel und kann gemäß einer großen Vielzahl von Steuerungsschemata betrieben werden.
Die Fig. 9 veranschaulicht eine Gruppe von Ergebnissen aus einer Validierungsstudie, die die Eignung eines Mikrogewebe-Arrays für einen Mikroorgan-Array zeigt. In einer derartigen Studie wird die Wirkung eines chemischen oder biologischen Mittels auf ein bestimmtes Charakteristikum des Mikrogewebe-Arrays über den Einsatz eines geeigneten Testsystems, beispielsweise den in den Fig. 5A, 5B, 6A, 6B oder 7 dargestellten, bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests werden einem geeigneten Modell größeren Maßstabs zugeführt, um die Wirkung des Mittels auf ein Organ in vivo vorherzusagen. Die Vorhersage wird dann mit dem Ergebnis einer separaten Studie verglichen, die die Wirkung des Mittels auf das jeweilige Charakteristikum eines isolierten Organs, das in vivo perfundiert wird, bestimmt. Der Test mit dem Mikrogewebe, die entsprechende Vorhersage und die entsprechende In-vivo- Untersuchung werden über einen Bereich von Konzentrationen und/oder Zusammensetzungen des Mittels durchgeführt. Die Ergebnisse werden in einer graphischen Darstellung aufgetragen, wie es in der Fig. 9 gezeigt ist, und es wird der Korrelationskoeffizient der Übereinstimmung bestimmt. Wenn der Korrelationskoeffizient der Übereinstimmung nahe 1 oder zumindest oberhalb eines akzeptablen unteren Wertes liegt, dann hat sich der Mikrogewebe-Array, der im jeweiligen Testsystem eingesetzt wurde, als ein Mikroorgan-Array für das jeweils getestete Charakteristikum erwiesen.
Die Fig. 10 ist ein Array von Mikrogewebe-Arrays. Es wurde eine Reihe von Mikrogewebe-Arrays aus einem einzigen Stück des Trägers 300, der aus Silicium, einem polymeren Material oder anderen geeigneten Materialien bestehen kann, ohne auf diese Materialien beschränkt zu sein, konstruiert. Die resultierende Fertigung kann dann mit geeigneten Dichtungen so in ein Gehäuse mit mehreren Kammern gegeben werden, dass jeder Mikrogewebe-Array 101 in einem Well enthalten ist. Es kann ein Filtermaterial, ein poröses Material oder ein Sieb in das Gehäuse inkorporiert sein, so dass eine Position oberhalb und/oder unterhalb eines jeden Mikrogewebe-Arrays besetzt ist. Die resultierende Vorrichtung ist einer Multiwell-Platte analog und kann in Systemen wie denjenigen, die in den Fig. 5A, 5B, 6A oder 6B gezeigt sind, verwendet werden.
Die Fig. 12 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion einer epithelialen Sperrschicht unter Verwendung von zwei Chips. Die Fig. 12A zeigt den unteren Chip 200, der sechs Kanäle 202 für die Bildung von vaskularisierten Geweben 204, die von epithelialem Gewebe 206 umgeben sind, im Kern der Kanäle 202 aufweist. Wie in der Querschnittsansicht der Fig. 12B gezeigt ist, wird die Probe über den Probenkanal 208 in den unteren Chip 200 eingeführt, der mit dem oberen Chip 210 in Verbindung steht. Die epitheliale Sperrschicht 206 trennt die Probe vom vaskularisierten Kanal 202, was dem Einbringen einer Probe in ein vaskularisiertes Gewebe entspricht.

IV. Testung von Materialien in den Mikrogewebe- oder Mikroorgan-Systemen

Es können viele verschiedene Materialien mittels dieser Vorrichtungen getestet werden. Sie können den Zellen direkt oder indirekt über eine Perfusion verabreicht werden. Die Materialien können Verbindungen sein, die die Zellen beeinflussen oder die Zellen potenziell beeinflussen (beispielsweise kann ein Arzneimittel, das gewünschte Wirkungen hat, zunächst in diesen Vorrichtungen bezüglich seiner Toxizität getestet werden), um zu sehen, ob die Zellen die Materialien abbauen (um beispielsweise Halbwertszeiten in vivo vorherzusagen), oder sie können mit einem Virus, Bakterium oder einem anderem Pathogen infiziert und dann mit dem Material behandelt werden, um dessen Wirkung zu untersuchen.
Testsysteme unter Einsatz von Mikrogewebe-Arrays können in einer Vielzahl von In- vitro-ssays eingesetzt werden. Mittels der Arrays kann man die Biotransformation, die Ausscheidung, den Metabolismus und die Aktivierung von Fremdstoffen untersuchen. Es können die Bioverfügbarkeit und der Transport chemischer und biologischer Mittel durch Epithelschichten und durch die Blut-Hirn-Schranke untersucht werden. Es können auch die akute basale Toxizität, die akute lokale Toxizität oder die akute organspezifische Toxizität, die Teratogenität, Genotoxizität, Kanzerogenität und Mutagenität chemischer Agenzien untersucht werden. Es können infektiöse biologische Agenzien, biologische Waffen, schädliche chemische Agenzien und chemische Warfen nachgewiesen werden. Es können Infektionskrankheiten und die Wirksamkeit chemischer und biologischer Mittel zur Behandlung dieser Krankheiten sowie die optimalen Dosisbereiche dieser Agenzien untersucht werden. Es können die Reaktion von Organen in vivo auf chemische und biologische Agenzien sowie die Pharmakokinetik und die Pharmakodynamik dieser Agenzien vorhergesagt werden. Es kann die Auswirkung einer genetischen Prädisposition auf die Reaktion auf diese Agenzien untersucht werden.
Es kann das Ausmaß der Protein-Expression als Reaktion auf chemische oder biologische Agenzien bestimmt werden. Es können Veränderungen des Metabolismus als Reaktion auf chemische oder biologische Agenzien untersucht werden. Es kann der Einfluss von Agenzien über Datenbanken und assoziierte Modelle, über Expertensysteme oder strukturbasierte Modelle vorhergesagt werden.
Spezifische repräsentative Tests werden unten beschrieben.

1. Studien zur Gen-Transkription als Reaktion auf chemische und biologische Agenzien

Die Filter oder porösen Materialien unter dem Mikrogewebe können so gewählt oder konstruiert werden, dass sie denaturierte einzelsträngige DNA binden. Es können Nitrocellulose-Filter auf diese Weise verwendet werden. Die gebundene DNA kann dann über Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden charakterisiert werden. Alternativ kann der Filter oder das poröse Material immobilisierte Sonden enthalten, die denaturierte einzelsträngige DNA mit spezifischen Sequenzen fangen. Die gefangene DNA kann an Ort und Stelle oder nach einer sich anschließenden Freisetzung analysiert werden, und sie kann mittels PCR oder anderer ähnlicher Techniken amplifiziert werden. Alternativ kann das Mikrogewebe in jedem Probenwell eines Durchfluss-Genosensors enthalten sein. Diese Genosensoren sind auf der Seite 218 bei Doktycz et al., "Genosensors and Model Hybridization Studies" in Automation Technologies for Genome Characterization, T. J. Beugelsdijk, Hrsg. (John Wiley & Sons, New York 11997) dargestellt.
Der Filter oder das poröse Material unterhalb des Mikrogewebes kann so ausgewählt oder konstruiert werden, dass er bzw. es RNA bindet. Chemisch behandelte Cellulose-Filter, Nylon-Filter und, unter bestimmten Umständen, Nitrocellulose-Filter erfüllen diese Anforderung. Die gebundene RNA kann dann mittels Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden charakterisiert werden. Alternativ kann der Filter oder das poröse Material immobilisierte Sonden enthalten, die denaturierte einzelsträngige RNA mit spezifischen Sequenzen fangen. Die gefangene RNA kann an Ort und Stelle oder nach einer sich anschließenden Freisetzung analysiert werden, und sie kann mittels PCR oder anderer ähnlicher Techniken amplifiziert werden. Alternativ kann das Mikrogewebe in jedem Probenwell eines Durchfluss-Genosensors enthalten sein. Diese Genosensoren sind auf der Seite 218 bei Doktycz et al., "Genosensors and Model Hybridization Studies" in Automation Technologies for Genome Characterization, T. J. Beugelsdijk, Hrsg. (John Wiley & Sons, New York 1997) dargestellt.

2. Analyse von Metaboliten

Es können auch toxische Substanzen, einschließlich von Verbindungen, die als solche toxisch für alle Zellen sind (beispielsweise Cyanid), und von solchen, die metabolisch durch Parenchymzellen in toxische Metaboliten (üblicherweise Elektrophile) umgewandelt werden, mittels eines umfassenden Ansatzes zum Nachweis eines Ereignisses, das zum Zelltod führt, nachgewiesen werden. Dieses kann allgemein und unspezifisch sein; d. h. nicht-spezifisch für ein bestimmtes Toxin, aber für die gesamte Klasse allgemein. Zu Beispielen gehören Mitochondrien-Gifte, DNA-schädigende Agenzien und Membran-schädigende Agenzien.
Der Nachweis von Metaboliten kann dadurch erreicht werden, dass das Effluat aus dem Mikroorgan mittels Inline-Nachweisverfahren, wie Detektoren für UV, sichtbares Licht oder Fluoreszenz und/oder mittels Massenspektrometrie, analysiert werden. Außerdem kann das Effluat aus dem Mikroorganen in regelmäßigen Abständen gesammelt und bezüglich der Anwesenheit von Metaboliten offline mittels analytischer Standardverfahren analysiert werden.
Der Filter oder das poröse Material unterhalb des Mikroorgans kann so konstruiert sein, dass er bindende Mittel und/oder Substrate als Mittel für den Nachweis von Metaboliten enthält. Diese bindenden Mittel (d. h. Peptide oder nukleophile organische Species) würden gegen die Flüssigkeit, die aus den Mikroorganen austritt, exponiert, und sie würden die reaktiven Metaboliten, die durch die Mikroorgane erzeugt und in das Perfusat abgegeben werden, kovalent binden. Der durch die kovalente Verknüpfung des bindenden Mittels mit dem reaktiven Metaboliten erzeugte Komplex könnte dann in situ nachgewiesen werden, oder er könnte durch die Spaltung einer labilen Bindung, die das bindende Mittel mit dem Filter oder dem porösen Material verbindet, vom Filter oder dem porösen Material frei gesetzt werden. Diese labile Bindung könnte mittels chemischer Verfahren, über die Aktivität eines Enzyms oder die Exposition gegenüber Licht spezifischer Wellenlängen, gespalten werden.

3. Nachweis einer Infektion mit einem Virus oder einem anderen Pathogen

Der Nachweis der Infektion mit einem Virus oder einem anderen Pathogen stellt eine größere Herausforderung dar, da der Zeitverlauf der Infektion relativ lang ist und die zellulären Veränderungen subtil sein können. Die Tatsache, dass man das Hepatitis-B-Virus (HBV) und das Hepatitis-C-Virus (HCV) nicht auf andere Labortiere als Schimpansen übertragen oder das Virus nicht in Zelllinien vermehren kann, hat Bemühungen, den Lebenszyklus des HBV und des HCV zu verstehen, stark behindert. Die Haupthypothese besagt, dass HBV und HCV primäre humane Hepatozyten infizieren und sich in diesen vermehren, wenn die Hepatozyten ausreichend differenziert sind, so dass sie Oberflächenrezeptoren für die Viren sowie Transkriptionsfaktoren behalten, die für die Initiation des vollständigen viralen Replikationszyklus innerhalb der Zelle erforderlich sind. Somit stellen das HBV und das HCV sehr gute allgemeine Modelle für potenzielle Pathogene dar, die Gewebefunktionen höherer Ordnung benötigen, damit ihre Pathogenität nachgewiesen werden kann, unabhängig davon, ob das Pathogen bekannt oder unbekannt ist.
Drei potenzielle Parameter einer Infektion, die mit einer Fluoreszenzänderung verbunden sind, und zwar jeweils als Funktion des zeitlichen Verlaufes, sind das Austreten zytosolischer Enzyme, die Verminderung des zytosolischen NAD(P)H sowie die Expression von Stress-induzierbaren, mit GFP verknüpften Promotoren, entweder in Endothelzellen oder in Hepatozyten.
Das Hepatitis-B-Virus ist der prototypische Vertreter der Familie der Hepadnaviren, einer Gruppe von DNA-Viren mit einer Hülle, die primär die Leber infizieren (Moradpour et al., New Engt. J. Med. 332: 1092-93 (1995)). Das HBV-Genom besteht aus einem teilweise doppelsträngigen DNA-Molekül von 3,2 kb, das in einer entspannten ringförmigen Konformation vorliegt. Die Sequenzanalyse des Genoms zeigt, dass das HBV für vier teilweise überlappende offene Leserahmen (ORF) codiert, die die Synthese von wenigstens sieben viralen Gen- Produkten steuern. Die Expression der viralen RNA, DNA und Proteins kann in primären humanen Hepatozyten-Kulturen, die mit HBV infiziert oder transfiziert wurden, untersucht werden (Li et al., J. Virol. 70: 6029-35 (1996); Scaglioni et al., J. Virol. 71: 345-353 (1997); Melegari et al., J. Virol. 71: 5449-54 (1997)). Die molekulare Bestätigung einer HBV-Replikation und -Vermehrung kann auf den folgenden Messungen basieren:
a) RT-PCR des Plus-Stranges und des Minus-Stranges der HBV-DNA;
b) RNAase Protection Assays der prägenomischen RNA-Species 2,1 und 3,5;
c) Verkapselung prägenomischer RNA in Core-Partikel und
d) Sekretion des Hepatitis B-Oberflächenantigens (HBsAg), des Hepatitis-B-Core- Antigens (HBcAg) und des Hepatitis-B-e-Antigens (HBeAg) in das Kulturmedium mittels Radioimmunoassay und Nachweis viraler Proteine in Zellen durch Immunhistochemie.
Es werden, um das ganze kurz zusammenzufassen, Kulturen humaner Hepatozyten mit HBV-Partikeln 24 Stunden lang inkubiert. Es werden dann zu verschiedenen Zeiten über einen Zeitraum von bis zu zwei Monaten Proben des Kulturmediums und der Zellen abgenommen. Es können mittels kationischer Liposomen Transfektionsstudien mit einem HBV-DNA-Klon voller Länge durchgeführt werden um sicher zu stellen, dass die humanen Hepatozyten die HBV- Replikation unterstützen, wobei Methoden eingesetzt werden, die von Moradpour et al., Hepatology 22: 1527-37 (1995), beschrieben wurden. Die Virusreplikation kann über die Bindung an monoklonale Anti-HBV-Antikörper, gefolgt von einer PCR-Analyse, nachgewiesen werden. Intakte Virionen werden mittels eines monoklonalen Antikörpers hoher Affinität gebunden, der gegen das Hüllprotein gerichtet und mit einem festen Träger verknüpft ist, woran sich eine Hitzedenaturierung zur Freisetzung der Virus-DNA anschließt. Die Virus-DNA wird über eine PCR-Analyse unter Verwendung von Primern, die von den Genbereichen der Hülle, des Core und der Polymerase stammen (Liang et al., J. Clin. Invest. 84: 1367-71 (1989)), nachgewiesen. Die Virusinfektion und die Replikation können zwei bis drei Wochen nach der Inokulation einsetzen. Es können die frühen Schritte des Lebenszyklus des Virus untersucht werden, was bisher nicht in einem Zellkultursystem mit primären Zellen möglich war (Li et al., J. Virol. 70: 6029-35).
Das Hepatitis-C-Virus ist ein RNA-Virus vom Typ des positiven Stranges mit einer Genomlänge von ungefähr 9,5 kb. Ein großer offener Leserahmen codiert für einen Polyprotein- Vorläufer von ungefähr 3000 Aminosäuren, der durch eine Kombination von Proteasen des Wirtes und des Virus zu mindestens 10 verschiedenen Strukturproteinen sowie anderen Proteinen prozessiert wird (Wakita et al., J. Biol. Chem. 269: 14205-10 (1994)). Es wurden monoklonale Antikörper gegen die nicht-strukturellen Proteine NS3 (virale spezifische Serin- Protease) und NS5 (RNA-Polymerase) des HCV gewonnen (Geissler et al., J. Immunol. 158: 1231-37 (1997); Encke et al., J. Immunol. 161(9): 4917-23 (1998)). Alle der strukturellen sowie nicht-strukturellen Gene wurden in geeignete Expressionsvektoren eingefügt, um Sonden für eine In-situ-Hybridisierung infizierter Zellen zu erzeugen. Die molekulare Bestätigung der HCV-Replikation und -Vermehrung kann auf den folgenden Messungen basieren:
a) RT-PCR-Analyse des Plus- und des Minus-Stranges der viralen RNA unter Verwendung von Primern, die aus den hochkonservierten 5'-nicht-codierenden und den Core- Bereichen des Genoms gewonnen wurden.
b) Nachweis der Gen-Expression durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die von den Core- und den NS3- und NS5-Genbereichen stammen.
c) Untersuchung der Proteinexpression durch Immunhistochemie unter Verwendung von molekularen Antikörpern gegen rekombinante Core-, NS3- und NS5-Proteine.
Primäre humane Hepatozytenkulturen können mit 1 · 10&sup6; HCV-Genomen, wie sie mittels semiquantitativer PCR bestimmt wurden, inkubiert werden. Das Zellkulturmedium und die Hepatozyten können bezüglich einer HCV-Replikation durch die Analyse des positiven und des negativen Stranges der Virus-RNA mittels RT-PCR analysiert werden. Hepatozyten können bezüglich der Gen-Expression der Virus-RNA durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für Strukturgene und für Nicht-Strukturgene sind, untersucht werden. Die Expression sowohl von Strukturproteinen als auch von anderen Proteinen kann über eine Immunhistochemie infizierter Zellen nachgewiesen werden. Das Hepatozyten-Kultursystem kann eine HCV-Replikation in niedrigem Ausmaß gewährleisten, und der replikative Lebenszyklus des HCV kann zumindest teilweise charakterisiert werden.

Infektionsnachweis über Fluoreszenzmessungen

Eine Hepatitisinfektion ist mit einer Erhöhung von Leberenzymen im Blut aufgrund ihres Austretens aus dem Cytosol von Hepatozyten assoziiert. Somit können die beiden Ansätze, die für die Untersuchung der Wirkung von Toxinen beschrieben wurden, die NAD(P)H-Spiegel und die Membranschädigung, auch Messparameter für eine Virusinfektion bereit stellen.
Sehr frühe Ereignisse bei einer Virusinfektion können zu einer erhöhten Expression stressinduzierbarer Promotoren, entweder in Hepatozyten oder Endothelzellen, führen. Diese Ereignisse können dadurch nachgewiesen werden, dass diese Promotoren mit GFP oder einem neuen, empfindlicheren Reporter, der β-Lactamase (Zlokarnik etal., Science 279: 84-87 (1998)) verknüpft werden. Lee et al. haben den Egr-1-Promotor 5' an das Gen des Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) in einem Expressionsplasmid Moniert, und sie haben gezeigt, dass primäre Endothelzellen, die mit diesem Konstrukt transfiziert wurden, nach mechanischer Stimulierung eine schnelle Geninduktion bei der eGFP-Wellenlänge zeigen. Der Egr-1-Promotor ist zwar im allgemeinen mit mechanischem Stress assoziiert, aber seine Expression wird auch während einer aktiven Virusinfektion stimuliert (Tatarowicz er al., J. Neurovirol. 3: 212-24 (1997)). Insbesondere wurde gezeigt, dass das Egr-1-Protein mit dem X-Protein des Hepatitis- B-Virus (HBx) assoziiert, was es dem HBx ermöglicht, an der Regulation früher Gene zu partizipieren (Yoo et al., J. Clin. Invest. 97: 388-95 (1996)).
Eine Infektion über stressinduzierbare Promotoren kann mit wenigstens zwei Verfahren nachgewiesen werden. Das existierende, von Lee entwickelte System, bei dem Konstrukte aus Erg-1/GFP und Erg-1/β-Lactamase in primäre Endothelzellen transfiziert werden, kann dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob eine Virusinfektion in dreidimensionalen perfundierten Leberkulturen über einen Stress auf die sinusoidalen Endothelzellen nachgewiesen werden kann. Die gleichen Erg-1-Konstrukte können in primäre humane Hepatozyten transfiziert werden. Die Transfektionseffizienz und die Expression können durch das Stressen der Zellen auf mechanischem oder osmotischem Wege mittels Standardkulturtechniken (in Petrischalen) gescreent werden. Niedrige Transfektionseffizienzen können toleriert werden, da jeder Sensor Tausende von Zellen enthält und das Messsignal die Veränderung der Gesamtfluoreszenz darstellt. Nachdem ein Transfektionsprotokoll für die primären Hepatozyten erstellt wurde, können die transfizierten Zellen im Gewebe-Perfusionssensor getestet werden. Es kann ein Messparameter bereit gestellt werden, der innerhalb weniger Minuten oder Stunden nach dem Einbringen der Probe zu einem Signal führt. In dem Fall, dass ein Erg-I-Messwert vorliegt, dass er aber beim Injektionsprozess relativ spät entsteht, können verschiedene andere bekannte stressinduzierbare Promotoren gescreent werden.

4. Tests aus Zytotoxizität

Biologische Toxine wirken über unterschiedliche Mechanismen, und sie können im Vergleich zu chemischen Toxinen andere Empfindlichkeiten und Zeitverläufe ihrer Wirkung zeigen. Biologische Toxine können bezüglich ihrer Wirkungen sowohl auf die Leber als auch auf die ES-Zellen untersucht werden. Repräsentative Beispiele sind das Shiga-artige Toxin (SLT oder Verotoxin), das durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) erzeugt wird, sowie Vac (Vakuolen-bildende Toxin), das von Helicobacter pylori erzeugt wird. Das SLT stoppt die Proteinsynthese der Wirtszelle, indem es die 60S-Untereinheit der Wirtszellribosomen inaktiviert (Tesh et al., Mol. Microbiol. 5: 1817-22 (1991)). Das Vac-Toxin bindet über einen unbekannten Rezeptor an die Zellen und bewirkt die Bildung von Vakuolen, wahrscheinlich über die Hemmung der Aktivität der Natrium-Kalium-ATPase.
Den technischen Herausforderungen, die mit dem Verfolgen der Zytotoxizität in Echtzeit in Zusammenhang mit diesem dynamischen Gewebesensor verbunden sind, kann man durch die Verwendung verschiedener Techniken der Laser-induzierten Fluoreszenz (LIF) begegnen. Die LIF hat Nachweisgrenzen im Bereich weniger Femtomole (10&supmin;¹&sup5; mol), und für ideale Analyten sind Nachweisgrenzen im Attomol-Bereich (10&supmin;¹&sup8; mol) möglich. Zwei primäre Endpunkte sind für das Verfolgen der Wirkung toxischer Schäden auf den Gewebesensor identifiziert worden: die Abnahme der NAD(P)H-Spiegel in den Zellen und der Verlust der Integrität zellulärer Membranen.
Eine Abnahme des intrazellulären NAD(P)H als Reaktion auf einen Exposition gegen ein Toxin wird im Falle von Mitochondriengiften (beispielsweise Menadion oder Cyanid) als Folge einer Störung der Atmungskette beobachtet. Die Spiegel des intrazellulären NADH und NAD(P)H werden auch als Reaktion auf nukleare Toxine (beispielsweise Stickstofflost) über den Prozess der Poly-ADP-Ribosylierung von Proteinen, die mit der DNA assoziiert sind, erschöpft. Der zelluläre Pool an NAD(P)H kann über eine In-situ-Fluoreszenzspektroskopie verfolgt werden, wie es oben für Schwankungen als Reaktion auf eine Exposition gegen Toxin oder Prätoxine beschrieben wurde.
Ein Verlust der Membranintegrität ist ein gemeinsamer Endpunkt aller zytotoxischen Wege (d. h. der Nekrose und der Apoptose) und kann nach jeder zytolethalen Exposition des gewebebasierten Sensors beobachtet werden. Der Verlust der Membranintegrität wird von einem Austreten intrazellulärer Bestandteile in das Perfusat begleitet. Ein Ansatz, wie man aus diesem Verlust der Membranintegrität Kapital schlagen kann, kann darin bestehen, die Zellen des Biosensors mit polyveresterten Fluorescein-Derivaten zu beladen (beispielsweise Calcein AM, Absorption 494, Emission 517). Diese nicht-fluoreszierenden Derivate dringen passiv in die Zellen ein, und danach hydrolysieren Esterasen sie zu polyanionischen fluoreszierenden Farbstoffen, die in den Zellen zurück gehalten werden. Eine Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran aufgrund einer toxischen Schädigung kann zum Verlust von Farbstoff in das Perfusat führen. Somit kann das Verfolgen der Abnahme der Fluoreszenz des Farbstoffes, der durch die Zellen zurück gehalten wird, einen Messparameter für die Zytotoxizität bereit stellen.
Ein weiterer Ansatz zur Quantifizierung der Zytotoxizität über einen Verlust der Membranintegrität kann darin bestehen, die Erhöhung einer Enzymaktivität (beispielsweise der alkalischen Phosphatase und der γ-Glutamyltranspeptidase), die ins Perfusat abgegeben wurde, zu beobachten. Das kann mittels der LIF-Spektroskopie über einen Inline- Enzymdetektor erreicht werden, der aus immobilisierten Profluorophor- oder Prochromophor- Enzymsubstraten besteht.
Beispielsweise könnte dieser Ansatz dafür eingesetzt werden, die Aktivität der γ-Glutamyltranspeptidase zu verfolgen, die nach einer toxischen Schädigung durch den Mikroorgan-Array in das Perfusat frei gesetzt wird. Es wurde ein Rhodamin-Derivat entwickelt, das nicht fluoresziert, bis die Wirkung der γ-Glutamyltranspeptidase das freie Amin frei setzt. Das resultierende Produkt ist stark fluoreszierend (Absorption 492, Emission 529) und bleibt auf dem festen Träger gebunden. Die Verwendung eines inline immobilisierten Substrats ermöglicht das Verfolgen eines kumulativen Signals und erhöht die Empfindlichkeit im Vergleich zum Nachweis des Signals eines lösliches Fluorophors, das im Perfusat zirkuliert, dramatisch. Eine ähnliche Strategie kann eingesetzt werden, um die Aktivität der alkalischen Phosphatase mittels eines immobilisierten Fluoresceindiphosphat-Derivats zu verfolgen.
Eine Konfiguration eines Inline-Detektors beinhaltet die Immobilisierung des Enzymsubstrats oder der Enzymsubstrate mit dem Profluorophor und/oder dem Prochromophor auf dem Filter oder dem porösen Material, der bzw. das unterhalb von jedem Mikroorgan angeordnet ist. Ein Mikroorgan-Array (wie er beispielsweise in den Fig. 5, 6 und 10 dargestellt ist) würde demnach einen Array auf Filtern immobilisierter Profluorophore/Prochromophore enthalten, die so maßgeschneidert sind, dass sie auf spezifische zelluläre Reaktionen eines jeden Mikroorgans reagieren. Ein derartiger Filter-Array kann so konstruiert sein, dass er Substrate enthält, die mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten auf die gleiche zelluläre Reaktion reagieren, sowie Substrate, die auf unterschiedliche zelluläre Reaktionen ansprechen. Außerdem kann eine Redundanz (d. h., das gleiche Profluorophor/Prochromophor liegt in mehr als einem Mikroorgan innerhalb eines Arrays vor) im gesamten Mikroorgan-Array enthalten sein. Die Profluorophore/Prochromophore sind so konstruiert, dass sie auf zahlreiche zelluläre Reaktionen ansprechen, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, das Austreten von Enzymen aus Zellen, Fluktuationen des pH-Wertes des Effluats und die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies gehören.
Das von jedem Filter oder porösen Material produzierte Fluoreszenzsignal ist proportional zum Ausmaß der zellulären Antwort. Der Array aus Filtern oder porösen Materialien zeigt ein charakteristisches Muster der Fluoreszenzintensität, das den Status des Mikroorgan- Arrays anzeigt. Das Fluoreszenzsignal des Arrays kann bei Bedarf in regelmäßigen Abständen aufgezeichnet werden, wobei die instrumentelle Ausrüstung verwendet wird, die oben im Abschnitt, der die Sensoren beschreibt, dargelegt wurde. Die aus dem Array der Fluorophore erhaltenen Daten können mittels einer Software zur Mustererkennung interpretiert werden, um das Muster des Fluoreszenzsignals mit dem Status des Mikroorgan-Arrays zu korrelieren.

V. Verwendung des Systems als Bioreaktor

Ein Beispiel für einen geeigneten Bioreaktor ist in der Fig. 11 gezeigt. Im Bioreaktor 300 wird ein Mikroorgan 302 bereit gestellt, zusammen mit einem Oxygenator 304, einem Reservoir 306, der das Nährmedium 308 bereit stellt, sowie einer Probe eines Agens 310, das vom Organ verarbeitet werden soll. Das Medium und das Agens werden durch das Organ gepumpt, und es werden nach Bedarf Proben genommen. Verschiedene Sensoren 312 sind in verschiedenen Teilen der Schleife enthalten. Das System wird über einen Computer 314 gesteuert.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden, nichteinschränkenden Beispiele deutlicher werden.

Beispiel 1

Konstruktion und Herstellung der Gerüste

Es wurde zunächst eine Ausgangsgruppe von Gerüsten mittels der ICP-Tiefätzung hergestellt, um die geeigneten Ätzzeiten, die Eigenschaften des Photoresists und das Aussehen der resultierenden Kanäle zu definieren. Kleine Kanäle werden langsamer geätzt als große Kanäle, und somit bestimmen die kleinen Kanäle die Ätzzeit. Da die für die Erzeugung von Gewebe optimalen Kanalabmessungen unbekannt sind, wurde ein kombinatorischer Ansatz für die Entwicklung des Arrays gewählt. Es wurden zwei Kanalformen in Betracht gezogen (Kanäle mit rechtwinkligen Ecken und Kanäle mit runden Ecken), und die Kanalabmessungen wurden für jede Form über den Bereich von 75 bis 600 um systematisch variiert.
Die Scheiben wurden geätzt und dann auf eine letztendliche Dicke von 300 um poliert. Die Kanäle in den Gerüsten wurden mittels SEM sichtbar gemacht, und es zeigte sich, dass die Querschnitte der Kanäle dem Muster der Maske entsprachen, dass die Wände senkrecht waren und nur eine sehr geringe Textur (von weniger als 1 um) auf der Oberfläche der Kanäle vorhanden ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Arten komplexer Muster, die in den Fig. 3A und 3B dargestellt sind, mittels der ICP-Ätztechnik hergestellt werden können, und dass eine Facettierung nicht in nachweisbarem Ausmaß erfolgt. Die Scheiben wurden mit Säure gereinigt, und es wurden makroporöse Filter (plasmabehandeltes PDVF, nominale Porengröße 5 um) mittels eines thermischen Prozesses, der die Struktur der Filterporen intakt lässt, an eine Seite der Scheibe gebunden. Die Filter blieben nach einem Standardprozess, bei dem das Gerüst in einen Filterhalter gegeben und eine Zellsuspension langsam aus einer Spritze in das Gerüst gedrückt wird, stabil befestigt.
Die Verwendung von PEG-Bürsten zur Hemmung der Protein-Adsorption und der Zelladhäsion ist in der Literatur über Biomaterialien generell akzeptiert. Die Beziehungen zwischen den Pfropfbedingungen und den erreichbaren Kettendichten und der resultierenden Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteinen wurden in mehreren, kürzlich erschienenen Studien beschrieben (Irvine et al., Macromolecules 29: 6037-43 (1996); Irvine et at., J. Biomed. Mat. Res. 40: 498-509 (1998); Walton et al., Macromolecules 30: 6947-56 (1997)). Laibinis et al. haben eine Familie neuer Organotrichlorsilane entwickelt, CH&sub3;(OCH&sub2;CH&sub2;O)2,3(CH&sub2;)&sub1;&sub1;SiCl&sub3;, die eine leichtere Behandlung von Si-Oberflächen zur Erzeugung stabiler, nicht-adsorbierender Oberflächenschichten ermöglichen, die die Zelladhäsion in serumhaltigem und serumfreiem Medium hemmen (Lee & Laibinis, Biomaterials 19: 1669-75 (1998)). Dass eine Befestigung von Wachstumsfaktoren an Siliciumträgern möglich ist, wurde für den Epidermal Growth Factor (EGF) als Prototyp gezeigt (Kühl et al., Nature Med. 2: 1022-27 (1996)). Der gebundene EGF behielt seine volle biologische Aktivität und konnte dazu verwendet werden, die Zellen in einer dosisabhängigen Weise zu stimulieren und Veränderungen der Zellmorphologie zu induzieren.

Beispiel 2

Isolierung und Kultur von Leberzellen

Es wurde eine reproduzierbare und leicht verfügbare Quelle primärer (d. h. aus Gewebe stammenden) Zellen zur Bildung von Gewebe unter Verwendung von Leberzellen entwickelt. Das Leberparenchym umfasst die folgenden vier Haupttypen von Zellen: Hepatozyten, Endothelzellen, Makrophagen (Kupffer-Zellen) und Sternzellen (fibroblastenartige Zellen). Es wurden isolierte Suspensionen eines jeden Zelltyps präpariert und zur Erzeugung des Gewebes in definierten Verhältnissen zusammengegeben. Die minimalen beiden Zelltypen, Hepatozyten und Endothelzellen, standen zunächst im Mittelpunkt. Das Standardverfahren zur Isolierung von primären Hepatozyten (die Zweischritt-Perfusionsmethode nach Seglen) führt zu einer Zellpopulation, die 95-99% Hepatozyten aufweist, wobei die Reinigung primär auf dem beträchtlichen Größenunterschied zwischen den Hepatozyten (Durchmesser ungefähr 25 um) und den anderen Zelltypen (Durchmesser 10-12 um) beruht. Es kann eine gemischte Fraktion von Zellen, bei denen es sich nicht um Hepatozyten handelt (typischerweise bezeichnet als "nicht-parenchymale Zellen") aus der gleichen Isolierung erhalten werden, aber eine Reinigung der einzelnen Zelltypen aus dieser Mischung erfordert viele Schritte. Deshalb wurde die Verwendung einer leichter verfügbaren Quelle für primäre Endothelzellen, der Endothelzellen der Rinder-Aorta ("bovine aortic endothelial cells", BAECs), untersucht. Die unten beschriebenen Kulturexperimente wurden unter Verwendung von Mischungen primärer Ratten- Hepatozyten und BAECs durchgeführt. Alle Kulturexperimente, sowohl in einer Petrischalenkultur als auch in dreidimensionalen Reaktorkonfigurationen, wurden in serumfreiem Kulturmedium durchgeführt, das für Hepatozyten optimiert worden war, "HGM", und auf DMEM mit zugesetztem LGF, Transferrin, Selen, Insulin, Dexamethason, Galactose, Nicotinamid, Pyruvat und L-Glutamin beruht.
Im Hinblick auf die potenzielle Unverträglichkeit von primären Ratten-Hepatozyten und Rinder-Endothelzellen wurde das Verhalten der BAECs mit dem von zwei anderen Quellen primärer, mikrovaskulärer Endothelzellen der Ratte verglichen, wobei die Morphologie primärer Kokulturen von Ratten-Hepatozyten und den Test-Endothelzellen in einer Petrischalenkultur als Indikator für Unterschiede bezüglich der Leistungsfähigkeit der Endothelzelltypen herangezogen wurde. Mikrovaskuläre Endothelzellen der Rattenlunge sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich, beispielsweise von Vascular Endothelial Cell Technologies (Renssalear, New York, USA), und es wird berichtet, dass sie ihren Phänotyp über mehrere Subkultivierungen beibehalten. Es wurden Kokulturen primärer Ratten-Hepatozyten mit entweder Endothelzellen der Rinderaorta oder mit mikrovaskulären Endothelzellen der Rattenlunge hergestellt. Jeder Zelltyp wurde in einer Dichte von 3 · 10&sup4; Zellen/cm² ausgesät. Die Zellen wurden auf Petrischalen aus Polystyrol, die mit 3 ug/ml oder 0,03 ug/ml Collagen vom Typ I beschichtet worden waren, kultiviert. Nach 1, 3 oder 5 Tagen in Kultur wurden mikroskopische Phasenkontrastaufnahmen gemacht. Die Phasenkontrastbilder der Kokulturen zeigen, dass die Endothelzellen der Ratte viel besser zu den Hepatozyten passten und zur Bildung gewebeähnlicher Architekturen führen als die Kulturen aus Endothelzellen der Rinderaorta und von Hepatozyten.
Es wurden auch Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von Sinusoidalzellen der Ratte entwickelt, da Endothelzellen aus der Rattenlunge sogar in serumfreiem Medium, das für Hepatozyten optimiert wurde, sehr schnell proliferieren, und der für Lunge charakteristische Phänotyp kann, sogar wenn sie sich in Kontakt mit Hepatozyten befinden, erhalten bleiben. Es wurden sinusoidale Endothelzellen aus der Rattenleber aus dem Überstand der nichtparenchymalen Zellen über einen zweistufigen Percoll-Gradienten und eine selektive Zelladhäsion isoliert. Sinusoidale endotheliale Zellen aus der Rattenleber und Kupfferzellen wandern zusammen in den Bereich zwischen einem Percoll-Kissen von 1,037 g/ml und 1,066 g/ml. Da sich Kupfferzellen in 15 Minuten an Gewebekultur-Kunststoff anheften, während Endothelzellen 1-2 Stunden benötigen, ermöglicht es das Aussäen der gemischten Fraktion auf Gewebekultur-Kunststoff, die Fraktion der Endothelzellen zu reinigen. Nach der 15- minütigen Anheftung der Kupfferzellen wurde das Medium, das die nicht-angehefteten Endothelzellen enthielt, entfernt und auf separate Platten ausgesät.
Die Fraktion der Endothelzellen haftete nicht auf Gewebekulturkunststoff an, und so wurde die Anhaftung auf Platten, die mit extrazellulärer Matrix (ECM) beschichtet waren, getestet. Die Endothelzellen hafteten nicht an Platten an, die mit 5 ug/ml Fibronectin beschichtet waren, aber sie zeigten eine Anhaftung auf Oberflächen, die mit 5 ug/ml Amgel oder Matrigel beschichtet waren. Allerdings begannen sich die Zellen innerhalb von 36 Stunden abzulösen, und nach 72 Stunden hatten sich 90% abgelöst. Es könnte deshalb bevorzugt sein, die Zellen in Gelen statt auf Gelen zu halten.

Beispiel 3

Tissue-Engineering

Für Mischungen aus primären Ratten-Hepatozyten und Endothelzellen der Rinderaorta, die in die Kanäle biologisch abbaubarer polymerer Gerüste gesät wurden, wurde beobachtet, dass sie innerhalb der ersten beiden Tage in Kultur die histotypische Reorganisation der Zellen zeigen, wobei sich die Endothelzellen an der Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und dem Gewebe anreicherten, wie von Steinberg et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 91: 206-09 (1994) vorhergesagt wurde. Es wurde das makroskopische Erscheinungsbild eines "Stranges" aus Hepatozyten und Endothelzellen, die die Ecke eines, aus biologisch abbaubarem Polyester hergestellten, Kanals von 800 · 800 um überbrückten, untersucht, und die beobachtete Struktur ist derjenigen der nativen Stränge in der Leber ähnlich, wobei eine Platte aus Hepatozyten von sinusoidalem Endothel bedeckt ist. Zwar konnten gelegentlich Zelldichten wie im Gewebe erreicht werden, aber die Gesamt-Zelldichte im Gerüst war im allgemeinen niedriger als diejenige im Gewebe. Die Gerüste waren relativ groß (ungefähr 0,5 cm³, bezüglich des Volumens ungefähr 100-fach größer als die vorgeschlagenen Gerüste) und enthielten viele unterschiedliche Mikroumgebungen. Die in diesen Gerüsten gehaltenen Hepatozyten behielten unter Perfusionsbedingungen ihre metabolische Funktion während der zweiwöchigen Studien bei, wie anhand der Sekretion von Albumin ins Medium gezeigt wurde.
Die biophysikalischen Parameter, die die Gewebeorganisation beeinflussen, wurden definiert, indem die Biophysik der Hepatozyten, Endothelzellen und Kokulturen auf definierten zweidimensionalen Substraten untersucht wurde. Die Morphologie der Hepatozytenaggregate, die auf zweidimensionalen Trägem kultiviert wurden, war entweder sphäroidartig oder ausgebreitet ("Monolayer"), was zeigte, dass die Morphologie durch eine Balance der Adhäsionskräfte zwischen Zelle und Träger und der Kontraktionskraft der Zellen bestimmt wurde (Powers et al., Biotech. Bioeng. 53: 415-26 (1997)). Diese Studien wurden inzwischen auf Kokulturen aus Hepatozyten und Endothelzellen ausgeweitet. Das morphogenetische Verhalten und das Organisationsverhalten dieser Zellen in vitro kann auf vorhersagbare Weise durch eine Variation der adhäsiven Eigenschaften des Trägers (d. h. der Konzentration der adsorbierten extrazellulären Matrix) modifiziert werden. Die resultierenden Strukturen bestehen aus zwei Zelltypen, die sich voneinander als Monolayer (hohe Adhäsionsstärke), Multilayer (mittlere Adhäsionsstärke) oder Sphäroide (niedrige Adhäsionsstärke) trennen, und zwar in Abhängigkeit von den relativen differenziellen Affinitäten der Wechselwirkungen zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und dem Träger, die im Kultursystem vorliegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bildung von Strukturen aus Lebergewebe über eine einfache Modulierung der biophysikalischen Merkmale des Trägers möglich sein kann.
Vorläufige Arbeiten legen nahe, dass die Kanäle in Silicon-Wafern, die mittels ICP-Ätzen erzeugt wurden, ebenfalls eine histotypische Gewebeorganisation zulassen. Endothelzellen haften rasch an den Wänden dieser Kanäle an, und sie bilden Strukturen, die imstande sind, die Lumina der Kanäle zu überbrücken. Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn die Silicium-Wafer mit Hepatozyten besät werden.

Beispiel 4

Metabolische Aktivität des perfundierten Mikroorgans

Es wurde die metabolische Aktivität perfundierter Mikroorgane, die in den Kanälen von Silicium-Wafern etabliert wurden, mittels Sondensubstraten für die enzymatische Aktivität (insbesondere die Aktivität von Cytochrom-P450-Enzymen) untersucht. Diese Mikroorgane enthielten primäre Hepatozyten und Endothelzellen, die eine gewisse Zeit zur Reorganisation im Inneren der Kanäle der Silicium-Wafer zur Verfügung gehabt hatten. Der Test beinhaltete das Auflösen des Enzymsubstrats in chemisch definierten Medien und dessen Perfusion durch den Mikroorgan-Array, der in einer Konfiguration vorlag, wie er in der Fig. 7 dargestellt ist. Das Effluat aus dem perfundierten Mikroorgan-Array wurde in aufeinander folgenden Fraktionen gesammelt, und diese Fraktionen wurden fluorimetrisch bezüglich des Vorkommens von Metaboliten analysiert.
Fig. 13 zeigt repräsentative Ergebnisse für diese Art von Tests. In diesem Falle wurde der Mikroorgan-Array mit Medium perfundiert, das ein Sondensubstrat für die enzymatische Aktivität enthielt, und zwar in Abwesenheit irgendeines Inhibitors der Enzymaktivität (t = 0-240 Minuten), in Gegenwart des Inhibitors (t = 240-385 Minuten) und dann wieder in Abwesenheit des Inhibitors (t = 385-585 Minuten). Die metabolische Aktivität ging mit der Inhibitorkonzentration parallel.
Diese Experimente zeigen, dass die Mikroorgan-Arrays ohne weiteres Verbindungen metabolisieren, die in das Perfusionsmedium gegeben wurden, und dass sie bezüglich der enzymatischen Aktivität einen Steady-State-Zustand annehmen. Weiterhin wurde die Enzymaktivität durch den Zusatz eines reversiblen Inhibitors zum Perfusionsmedium gehemmt, und sie erholte sich, wenn der Inhibitor entfernt wurde. Es ist wichtig, dass die Zellen in den Mikroorgan-Arrays auf ihre Umgebung reagieren und aktiv Substrate, die dem Perfusionsmedium zugesetzt werden, metabolisieren.
Mikroorgan-Arrays wurden auch mit kleinen Molekülen behandelt, die dem Perfusionsmedium zugesetzt wurden und die die Transkription metabolischer Enzyme induzieren. Bei derartigen Behandlungen wurde eine höhere Bildung von Metaboliten aufgrund höherer Enzymspiegel beobachtet. Das zeigt ein hohes Ausmaß der Gewebe- und Zelldifferenzierung sowie die Aufrechterhaltung multipler zellulärer Funktionen an. Beispielsweise müssen die induzierten Enzyme, damit sie aktiv sind, mit der geeigneten prosthetischen Harn-Gruppe vereinigt werden, und die resultierenden Holoenzyme müssen dann in die geeigneten Bereiche der Zelle gelangen. Somit zeigt die beobachtete erhöhte Aktivität als Reaktion auf induzierende Agenzien, die dem Perfusionsmedium zugesetzt wurden, dass die Zellen in den Mikroorgan-Arrays intakte nukleare Rezeptoren, eine funktionelle Transkriptions- und Translationsmaschinerie sowie die biosynthetische Aktivität für die Harn- Produktion besitzen.

Beispiel 5

Zwei-Photonen-Bilddarstellung in tiefem Gewebe in vivo auf der Basis der NAD(P)H-Fluoreszenz

Die Leistungsfähigkeit der Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde durch die Bilddarstellung tiefer Gewebestrukturen menschlicher Haut in vivo demonstriert (Massters et al., Biophys. J. 72: 2405-12 (1996)). Ein Titan-Saphir-Laser wird auf 730 nm abgestimmt, mit einer durchschnittlichen Energie von ungefähr 10 bis 20 mW. Es ist keine externe Fluoreszenzmarkierung erforderlich. Der Fluoreszenzkontrast wird über die Anregung zellulärer endogener Chromophore erzielt, die in erster Linie aus β-Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NAD(P)H) bestehen. Die Produktion von NAD(P)H ist mit dem Metabolismus der Zelle und dem intrazellulären Redox-Zustand assoziiert. Typischerweise erzeugt eine höhere Metabolismusqeschwindigkeit eine höhere Konzentration an NAD(P)H und führt zu helleren Bildern,
Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde an menschlicher Haust in vivo durchgeführt. Es wurden die x-z- und y-z-Ebenen des rekonstruierten Volumens aus den Zwei-Photonen-Daten ausgewertet, und sie zeigten eine stark fluoreszierende Schicht auf der Oberseite, die dem Stratum corneum entsprach, und eine zweite helle Schicht, ungefähr 100 um unterhalb der Hautoberfläche, mit einer "eierkartonartigen" Morphologie, die höchstwahrscheinlich der Basalzellschicht am Übergang zwischen Dermis und Epidermis entsprach. Die höhere Fluoreszenz dieser Schicht korrelierte gut mit der hohen Aktivität der Basalzellen. Eine gute Korrelation zwischen den Zwei-Photonen-Ergebnissen und der bekannten Hautphysiologie wird sowohl mit der Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) als auch mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Beispiel 6

Verhalten dreidimensionaler Kokulturen im Prototyp 1 des Reaktors

Eine frühe Reaktorkonfiguration beinhaltete einen Perfusionskreislauf, bei dem Medium, das in einem einzigen Reservoir enthalten war, durch einen Oxygenator gepumpt wurde, dann durch den Chip/Mikro-Array und dann wieder zum Reservoir zurück geführt wurde. Chips wurden in Filterhalter aus rostfreiem Stahl gegeben (13 mm, Millipore). Eine frühe Chip- Konstruktion beinhaltete 73 rechteckige Kanäle mit abgerundeten Ecken mit Abmessungen von 200 um · 200 um, 100 um · 400 um oder 200 um · 400 um, und alle waren 150-200 um tief. Ein makroporöser PTFE-Filter wurde thermisch mit dem Chip-Array verbunden, um die Zellen in den Kanälen zurück zu halten. Das Kulturmedium wurde über eine peristaltische Pumpe durch einen Siliconschlauch gepumpt, um die Zellen zu perfundieren, und der gesamte Kreislauf wurde in einem Inkubator mit CO&sub2;-Atmosphäre für einen geeigneten Gasaustausch gehalten.
Das mit dieser Konfiguration eingesetzte Aussaat- und Kulturprotokoll ist in den Fig. 14A-14C gezeigt, die die Konfiguration der Durchflusskammer des Prototyps 1 zeigen. Die Zellen (Fig. 14A) werden in die Kammer unter Bedingungen einer erzwungenen Konvektion ausgesät (Fig. 14B). Der obere Teil der Kammer wird dann entfernt, so dass die Zellen in einer dreidimensionalen statischen Kultur in einem CO&sub2;-Inkubator 24 bis 48 Stunden gehalten werden können (Fig. 14C). Die Kammer wird dann für die Perfusionskultur wieder zusammengebaut.
In anfänglichen Experimenten wurde gefunden, dass der Beginn der Perfusion bei physiologischen Perfusionsgeschwindigkeiten (30-50 ul/min) unmittelbar nach dem Aussäen der Zellen die Zellen in den Kanälen komprimierte, wodurch ein beträchtlicher Gegendruck erzeugt wurde, der die Chips gelegentlich zum Springen brachte. Die Zellen wurden deshalb 24 bis 48 Stunden lang in statischer Kultur kultiviert, ehe mit der Perfusion begonnen wurde. Die statische Kultur ermöglichte eine Zellreorganisation und eine Morphogenese zu Strukturen, die leicht perfundiert werden konnten.
Die Geschwindigkeit der Albumin-Sekretion, eine spezifische differenzierte Funktion von Hepatozyten, die unter Standardkulturbedingungen (z. B. in Monolayerkulturen reiner Hepatozyten) schnell verloren geht, wurde als ein Mittel zur Bestimmung der geeigneten statischen Kulturdauer für diese Konstrukte aus Zellen/Gerüst verwendet. Primäre Ratten- Hepatozyten und Endothelzellen der Rinderaorta (jeweils 10&sup5;/ml Zellmedium) wurden über die Injektion mit einer Spritze in die Gerüste mit Kanalgrößen von 200 um · 200 um, 100 um · 400 um oder 200 um · 400 um (Fig. 14A) ausgesät. Nach einer statischen Kulturdauer von 24 bis 48 Stunden wurden die Konstrukte aus Zellen/Gerüst mit Kulturmedium in einer Geschwindigkeit von 30 ul/min perfundiert. Nach einer anfänglichen Perfusionsdauer von 30 min wurde das Effluat in zwei aufeinanderfolgenden Proben von 900 ul (30 min) gesammelt.
Für eine vergleichende Analyse wurden die Zellen auch auf Petrischalen von 35 mm, die mit 3 ug/ml Collagen vom Typ I beschichtet waren, ausgesät (jeweils 3 · 10&sup4;/cm² Oberfläche). Während der Dauer der Perfusion der Gerüste wurden diese Schalen mit 2 ml frischem Medium versehen und ungefähr 2 Stunden lang kultiviert, und anschließend wurde das Medium gesammelt.
Medienproben wurden bezüglich Rattenalbumin analysiert, und die Werte wurden auf die Zellzahl bezogen (die Zellzahl wurde über eine DNA-Analyse mit Bisbenzimid quantifiziert). Die Ergebnisse sind in der Fig. 15A gezeigt. Aus dieser Analyse geht klar hervor, dass die perfundierten Gerüste im Vergleich zu den ähnlichen Daten nach 24 Stunden statischer Kultur nach 48 Stunden statischer Kultur eine beträchtlich höhere Albuminsekretion zeigen. Außerdem sekretieren die statischen Kulturen nach 48 Stunden in den Gerüsten höhere Mengen an Albumin als die Kulturen in den Petrischalen. Diese Daten legen nahe, dass die für die zelluläre Organisation, die Strukturbildung etc. benötigte Zeit wahrscheinlich wenigstens zwei Tage beträgt, und dass ein derartiges Verhalten unter Standard-in-vitro-Bedingungen (d. h. in Petrischalen) nicht stattfindet.
Um die Fähigkeit dieser Gerüste zur Aufrechterhaltung der Albuminsekretion über längere Zeiträume in der Flusskonfiguration des Prototyps I zu bestimmen, wurden Zellen auf Gerüsten von 200 um · 400 um wie beschrieben ausgesät und unter statischen Bedingungen 48 Stunden lang kultiviert. Die Gerüste wurden dann mit Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 15 ul/min 330 min lang perfundiert. Nach 30-minütiger anfänglicher Perfusion wurde das Effluat aus jedem Gerüst in fünf aufeinander folgenden Proben von 900 ul (60 min) gesammelt.
Die Ergebnisse für drei verschiedene Gerüste sind in der Fig. 15B gezeigt, und sie legen nahe, dass diese Kultursysteme auch imstande sind, stabile Funktionen über mehrere Stunden aufrecht zu erhalten, aber dass es bezüglich der Aussaateffizienz eine beträchtliche Variabilität von Gerüst zu Gerüst gibt, wenn die Konfiguration des Prototyps I verwendet wird.

Beispiel 7

Querstrom-Bioreaktor

Es wurde ein Querstrom-Bioreaktor wie oben beschrieben entwickelt und getestet. Es wurden zwei Herstellungsverfahren verwendet. Beim ersten Herstellungsweg wurden die Mikrokanäle in Silicium erzeugt, während das Gehäuse des Bioreaktors mittels Standardverfahren der spanabhebenden Bearbeitung in rostfreiem Stahl ausgeführt wurde. Diese Konstruktion wurde für die anfängliche "Proof-of-Principle"-Testung im Labor verwendet. Der zweite Herstellungsweg, der eine anodische Bindung beinhaltete, stellte Mittel für die Herstellung von Bioreaktoren im großen Maßstab bereit.
Der Prototyp I war während des Betriebes mit verschiedenen Problemen behaftet. Eine gleichmäßige Aussaat war schwierig, und die Konzentrationen der Nährstoffe (insbesondere des Sauerstoffs) am Auslass konnten nicht unabhängig von der Perfusionsgeschwindigkeit gesteuert werden.
Die anfängliche Testung des Prototyp-II-Systems wurde mit verschiedenen Kanalgrößen (100 um · 250 um, 100 um · 400 um, 200 um · 200 um, 200 um · 400 um) durchgeführt. Kulturmedium (ohne Zellen) wurde mit Flussgeschwindigkeiten von 0,5 bis 5 ml/min unabhängig voneinander durch die obere und die untere Kammer rezirkuliert. In jedem Falle nahm das Volumen des Reservoirs, das die obere Kammer versorgte, allmählich ab, während das Volumen des Reservoirs, das die untere Kammer versorgte, allmählich zunahm. Diese Beobachtungen zeigen, dass der hydrostatische Druck, der durch den Unterschied in der Höhe zwischen der oberen und der unteren Kammer verursacht wurde, ausreicht, um den Fluss durch die Kanäle des Gerüsts zu treiben.
Anfängliche Studien zur Zellaussaat in diesen Reaktorsystemen befassten sich primär mit der Verwendung des vorhandenen hydrostatischen Druckes, um die Zellen in die Gerüste zu führen und einen Perfusionsfluss bereit zu stellen. Eine Suspension von 5 · 10&sup4; primären Ratten-Hepatozyten und mikrovaskulären Endothelzellen der Rattenlunge pro ml wurde mit einer peristaltischen Pumpe mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 1 ml/min durch die obere Kammer rezirkuliert. Die Zellen wurden mit ungefähr 60 Upm gerührt, um die Zellen in Suspension zu halten. Kulturmedium ohne Zellen wurde mit der gleichen Geschwindigkeit durch das untere Reservoir gepumpt. Nach einer 4-stündigen Aussaatperiode wurde das Reservoir der oberen Kammer durch ein zellfreies Kulturmedium ersetzt. Der gemessene Perfusionsfluss betrug 20 bis 40 ul/min während der Zellaussaat und weniger als 10 ul/min während der sich anschließenden Kulturdauer. Das System wurde dann für einen Zeitraum von 36 bis 72 Stunden aufrecht erhalten und mittels Phasenkontrast und Zwei-Photonen-Mikroskopie bezüglich der Zellanheftung untersucht. Diese Techniken zeigen, dass ein großer Prozentsatz der Kanäle durch die Verwendung dieser Aussaatverfahren eine "Gewebedichte" erreicht hatte. Um die Darstellung der Endothelzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu erleichtern, wurden die Zellen mit 5 uM Cell Tracker Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon) markiert.
Das Gerüst, das eine Stütze für die Zellanheftung und das Wachstum sowie eine Perfusion mit Nährstoffen und Sauerstoff bereit stellt, wird mittels einer hoch-anisotropen reaktiven tiefen Ionenätzung aus Silicium hergestellt. Der gleiche Durchätzprozess, der zur Bildung der Mikrokanäle eingesetzt wird, wird auch zum Zerschneiden des Silicium-Wafers in einzelne Scheiben verwendet, ohne dass es zu einer Erhöhung der Zahl der Verarbeitungsschritte kommt. Das Zerschneiden der Wafer in einzelne Vorrichtungen wird dadurch eliminiert. Dieser Ansatz bietet eine hohe Flexibilität, aber die spanabhebende Bearbeitung (ein serieller Prozess) ist teuer. Alternativ können die Kosten des Perfusionsbioreaktors durch die Verwendung von Batch-Verfahren zur Mikrofabrikation beträchtlich vermindert werden. Diese parallelen Techniken können kostengünstige Bioreaktoren, die Einweg-Kartuschen ähnlich sind, liefern. Bei einem Ansatz können diese Bioreaktoren aus Silicium- und Glas-Wafern, die miteinander verbunden werden, hergestellt werden. Beispielsweise können Gerüste mit Mikrokanälen und perforierten oder porösen Sieben in einem Silicium-Wafer mikrofabriziert werden. Die Mikrokanäle können eingekapselt werden, indem anodisch Wafer aus Pyrex-Borsilicat (beispielsweise 7740) an die obere und die untere Oberfläche des Silicium-Wafers gebunden werden (Wallis & Pomerantz, J. Appl. Physics 40: 3946 (1969)). Neben der Verkapselung stellt der obere Pyrex-Wafer die gleichen Funktionen wie die oben beschriebene, optisch transparente Scheibe bereit. Der untere Pyrex- Wafer ermöglicht die Beleuchtung der Mikrokanäle von hinten, wenn es erforderlich ist. Die Bindung kann auf einer heißen Platte in einer Vakuumatmosphäre bei Temperaturen und Spannungen, die typischerweise zwischen 180 und 500ºC bzw. 200 bis 1000 V liegen, erreicht werden (Madou, Fundamentals of Microfabrication (CRC Press 1997)). Üblicherweise wird Druck eingesetzt, um die Wafer während der Verbindung zusammenzupressen. Die Wärmeausdehnungskoeffizienten von Silicium und Pyrex sind sehr ähnlich. Das ist nicht nur für den Verbindungsprozess kritisch, sondern auch für die schnelle Kryopräservierung von Gewebestrukturen. Vor der anodischen Verbindung können große Leitkanäle parallel zur Oberfläche des Wafers in Pyrex geätzt werden, was beispielsweise mit einer HF-Lösung erfolgen kann. Diese Kanäle können mit der äußeren Umgebung über geätzte oder mittels Ultraschall (oder Laser) gebohrte Löcher verbunden werden. Die anodische Bindungstechnik bewahrt die Elemente sowohl in Silicium als auch in Pyrex. Da Bauelemente sowohl im Silicium als auch im Pyrex vorhanden sind, ist eine präzise Ausrichtung der Silicium- und der Pyrex- Wafer von größter Bedeutung. Diese Aufgabe kann beispielsweise mittels eines Electronic Visions/Aligner Bonder (erhältlich von Microtechnology Technology Laboratories am Massachusetts Instititue of Technology) geleistet werden. Nach der Verbindung kann der Stapel aus Pyrex- und Silcium-Wafern zu einzelnen Formen zerschnitten werden. In Abhängigkeit von der Anwendung kann die Form eine gewünschte Zahl vollständig isolierter Mikrokanal-Arrays enthalten, wobei jeder Array seinen eigenen Einlass und Auslass besitzt. Deshalb kann ein Array von Bioreaktoren auf einem einzigen Chip erzeugt werden.

Konstruktionsparameter

Die Parameter des Reaktorsystems wurden so gewählt, dass sie physiologisch relevant sind. In Abwesenheit eines konvektiven Transportes liegt die Diffusionsstrecke von Sauerstoff in einem in Zellmedium gebadeten Gewebe bei ungefähr 150 um. Eine Oxygenierung von zwei Seiten des Gewebes (wie im Querstromreaktor) ermöglicht die Durchdringung von wenigstens 300 um des Gewebes.
Der Blutfluss in der Leber liegt bei ungefähr 1 ml/min/g Gewebe (Arias et al., Hrsg., The Liver (Raven Press, New York, New York 1988)). Bei der Berechnung einer Sauerstoff- Massenbalance mit den Zellen im Reaktorsystem ergibt sich unter der Annahme, dass diese Zellen Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit verbrauchen, die derjenigen des Gewebes in vivo ähnlich ist, und unter Missachtung der Rolle der Sauerstoffdiffusion von der Oberfläche des Gewebes, dass diese Flussgeschwindigkeit bei ungefähr 9 · 10&supmin;&sup8; ml/Zelle/min liegt. Ein großer Teil dieser erhöhten Flussanforderung des perfundierten Gerüsts im Vergleich zu Leberzellen in vivo beruht wahrscheinlich auf der erniedrigten Fähigkeit des Zellmediums zum Transport von Sauerstoff im Vergleich zum Blut (ungefähr 1 : 4). Eine sorgfältige Bearbeitung der Diffusionsstrecke des Sauerstoffs von der Oberfläche des Gerüsts würde ebenfalls den berechneten Bedarf vermindern. Die Geschwindigkeit des Gesamtflusses des Mediums in den Sinusoiden, die im System vorliegen, kann trotzdem auf physiologischere Werte vermindert werden, indem die Dicke des Gerüsts erniedrigt wird (d. h. die Länge jedes "Azinus" vermindert wird), wenn es erforderlich ist. Für ein Gerüst von 300 um wird berechnet, dass die Anforderungen an die maximale Flussgeschwindigkeit im Bereich von 1 bis 10 ul/min liegen.
Der berichtete Druckabfall über die Sinusoide in vivo liegt typischerweise bei ungefähr 1 bis 2 mm Hg (Arias et al.; Lautt et al., Drug Metabolism Rev. 29: 369-95 (1997)). Unter der Annahme, dass jeder Kanal im perfundierten Gerüst wenigstens eine "Kapillare" hat, kann man den Druckabfall als Funktion der Flussgeschwindigkeit berechnen. Basierend auf der vorherigen Analyse würde man erwarten, dass der Druckabfall im System bei weniger als 0,2 bis 2 mm Hg liegt.

Beispiel 8

Tests auf chemische Toxine

Ein essentieller erster Schritt bei der Beurteilung der Reaktion auf Toxine besteht in der Bestimmung der Vitalität zellulärer metabolischer Wege. Bei vielen Fremdstofftoxinen ist eine Biotransformation erforderlich, damit die ultimalen toxischen Species erhalten werden. Häufig führt die gleiche Klasse metabolisierender Enzyme, die für den normalen Metabolismus endogener und exogener Verbindungen verantwortlich ist, diese "Bioaktivierung" von Fremdstoffen zu Toxinen durch. Die Reaktionen, die durch diese Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme katalysiert werden, werden herkömmlicherweise in zwei Gruppen eingeteilt: die der Phase-I-Biotransformation und die der Phase-II-Biotransformation. Die Phase-I-Reaktionen beinhalten die Freilegung oder Einführung funktioneller Gruppen, typischerweise durch Hydrolyse, Reduktion oder Oxidation. Die Biotransformationen der Phase II sind durch eine Konjugation des Fremdstoffes mit einem hydrophilen Kofaktor, wie einer Aminosäure oder einem Zucker, gekennzeichnet. Das Hepatotoxin Aflatoxin illustriert diesen Prozess, da es eine Epoxidierung durchläuft (Phase I), gefolgt von einer Konjugation mit dem Tripeptid Glutathion (Phase II). In diesem Falle erzeugt die Phase-I-Reaktion das bioaktivierte Toxin, und die Phase- II-Reaktion inaktiviert diese toxische Species.
Die bei weitem bedeutendsten Säugetierenzyme der Phase I sind die Cytochrome P450 (P450). Diese Enzyme stellen eine Familie konstitutiv exprimierter und/oder induzierbarer Hämoproteine dar, die sich von vielen Genen ableiten, und sie katalysieren die Hydroxylierung, Desalkylierung und/oder Oxidation der verschiedensten Substrate. Häufig ist ein P450 in den ersten Schritt der Bioaktivierung eines Fremdstoffes zu einer toxischen Species involviert (d. h. P450 3A4 ist das menschliche P450-Isoenzym, das für die Epoxidierung von Aflatoxin verantwortlich ist). Die Expressions- und die Aktivitätsspiegel der verschiedenen P450-Formen in Hepatozyten sind Schlüsselindikatoren für den differenzierten Status dieser Zellen in Primärkultur.
Es wurden Bioreaktor-Konstrukte, die einen Test einsetzen, der die Aktivität eines repräsentativen P450-Isoenzyms, des Cytochroms P450 1A1 bestimmt, untersucht. Dieses Enzym kommt in allen Säugetierspezies vor, und es ist durch polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe sowie andere Agenzien stark induzierbar. 7-Ethoxyresorufin ist ein selektives Substrat für das P450 1A1 der Ratte, das seine Deethylierung zum stark fluoreszierenden Resorufin katalysiert. Nach der P450-1A1-katalysierten Deethylierung kann Resorufin aus der Zelle exportiert werden oder eine Phase-II-Konjugation durchlaufen. Es gibt zwei mögliche Produkte der Phase-II-Konjugation, die aus der Enzym-katalysierten Addition von Sulfat oder von Glucuronsäure an die 7-Hydroxy-Gruppe des Resorufins resultieren. Somit kann man mittels dieses Tests die Aktivität des P450 1A1 und der konjugierenden Enzyme der Phase II quantitativ bestimmen. Man kann auch qualitativ die Zellvitalität, die Aufnahme der Verbindungen, die dem Perfusionsmedium zugesetzt wurden, durch die Hepatozyten sowie die Auswirkungen der Flussgeschwindigkeit oder der Reaktorvolumina auf die Geschwindigkeiten der Biotransformation des Fremdstoffes untersuchen.
Der Test auf die Desalkylierung von 7-Ethoxyresorufin (EROD) beinhaltete das Auflösung des Substrats im chemisch definiertem Medium (Endkonzentration 10-20 uM) und seine Perfusion durch den Gewebe-Array. Das Effluat wurde in aufeinander folgenden Fraktionen gesammelt, die dann über einen Fluoreszenznachweis bezüglich der Anwesenheit von Resorufin analysiert wurden. Die Gesamtumwandlung wurde für jede Fraktion durch die Inkubation eines Aliquots jeder Fraktion mit Enzymen bestimmt, die die Phase-II-Konjugate des Resorufins zum freien Alkohol zurück hydrolysieren. Ein Vergleich dieses Wertes mit dem Wert, der ohne Hydrolyse der Phase-II-Konjugate erhalten wurde, stellte ein Maß für die Menge des Resorufins bereit, das eine Phase-II-Konjugation durchläuft.
Die Experimente wurden in dem Prototyp-I-Reaktor mit erzwungenem Fluss durchgeführt. Nach einer statischen Kulturperiode bei 37ºC und 5% CO&sub2; wurde der Bioreaktor erneut zusammengebaut und inline mit dem Perfusionskreislauf geschaltet. Anfängliche Studien wurden 14-20 Stunden nach dem Besäen der Siliciumgerüste mit Hepatozyten und Endothelzellen durchgeführt. Zwar konnte eine gewisse EROD-Aktivität beobachtet werden, aber sie war viel geringer (ungefähr 1/10) als diejenige der Kontrollen (Hepatozyten und Endothelzellen, die auf Petrischalen, die mit Collagen vom Typ I beschichtet waren, ausplattiert worden waren). Außerdem kam es häufig zum Brechen der Chips, was auf den extremen Gegendruck zurück geführt werden konnte, der sich während der Perfusion entwickelte. Diese Beobachtungen legten nahe, dass eine signifikante Beladung der Kanäle mit Zellen im Silicium- Chip erhalten worden war (was auch durch Phasenkontrastmikroskopie und eine Analyse der Zellzahl nach der Entfernung der Chips aus dem Gehäuse bestätigt wurde), aber dass sich die Zellen noch nicht unter Erzeugung von Flusskanälen reorganisiert hatten. Deshalb wurde die Dauer der statischen Kultur vor dem Einführen der Chips in die Perfusionskultur verlängert.
Die Fig. 17 zeigt die Ergebnisse, die mit einem Bioreaktor-Chip erhalten wurden, der ungefähr 2,5 Tage vor seiner Einführung in die Perfusionskultur mit täglichem Mediumwechsel in statischer Kultur gehalten worden war. Die Perfusion des Bioreaktors wurde zum Zeitpunkt t = 0 min mit chemisch definiertem Medium begonnen, das Ethoxyresorufin (10 uM) enthielt. Zum Zeitpunkt t = 240 min wurde das Medium auf ein Medium umgestellt, das sowohl Ethoxyresorufin (10 uM) und den P450-1A1-Hemmstoff Naphthoflavon (20 uM) bis zum Zeitpunkt t = 385 min enthielt, und dann wurde wieder das Medium ohne den Inhibitor verwendet. Diese ausgedehnte Dauer der statischen Kultur stellte den Zellen mehr Zeit für eine Reorganisation und eine Kanalbildung bereit und führte zu einem Bioreaktor ohne einen beträchtlichen Gegendruck während der Perfusion und zu einer EROD-Aktivität, die derjenigen der Kontrollzellen in Petrischalen vergleichbar war. In diesem Falle wurde der Chip mit Medium perfundiert, das Ethoxyresorufin in Abwesenheit eines Hemmstoffs von P450 1A1 enthielt (t = 0-240 Minuten), in Gegenwart eines Inhibitors (t = 240-385 Minuten) und dann wieder in Abwesenheit des Inhibitors (t = 385-585 Minuten). Die zeitliche Verzögerung, die mit der Erreichung des Steady-State nach jeder Zugabe verbunden war, spiegelt den Zeitraum wider, der benötigt wurde, um die obere und die untere Kammer des Reaktorgehäuses zu spülen (Voben = 0,45 ml und Vunten = 0,15 ml).
Dieses Experiment zeigte, dass die Gewebe-Arrays im Bioreaktor ohne weiteres Verbindungen, die dem Perfusionsmedium zugesetzt wurden, metabolisieren, und dass sie einen Steady-State-Zustand der Metabolitenbildung erreichen. Weiterhin wurde die Enzymaktivität durch den Zusatz eines reversiblen Inhibitors zum Medium gehemmt, und sie erholte sich dann wieder, wenn der Inhibitor entfernt wurde (dieses Experiment wurde nicht weiter fortgesetzt, um die schließliche Rückkehr zu Steady-State-Werten der Resorufin-Bildung zu beobachten). Es ist wichtig, dass die Zellen in diesem Bioreaktor auf ihre Umgebung reagierten und über nahezu 10 Stunden, bis die Perfusion gestoppt wurde, Substrat aktiv metabolisierten.
Es wurde ein paralleles Experiment mit einem zweiten Bioreaktor durchgeführt, der mit Medium behandelt worden war, das während der letzten 24 Stunden in statischer Kultur 3-Methylcholanthren (einen bekannten Induktor von P450 1A1) enthielt. Dieser Bioreaktor zeigte eine ähnliche Reaktion wie die, die in der Fig. 17 gezeigt ist, aber das absolute Ausmaß der Resorufin-Bildung war ungefähr 5-fach erhöht (berechnet als Zahl der gebildeten Attomole Resorufin pro Minute und pro Hepatozyt), was der Erhöhung vergleichbar war, die mit Kontrollzellen beobachtet wurde (3- bis 4-facher Anstieg unter vergleichbaren Expositionsbedingungen). Da 3-Methylcholanthren ein transkriptioneller Induktor des P450 1A1 ist, zeigte die zelluläre Reaktion auf dieses Agens die Vitalität zahlreicher zellulärer Systeme an. Beispielsweise muss das induzierten Enzym, damit es aktiv ist, mit seiner prosthetischen Harn- Gruppe vereinigt werden, und das Holoenzym muss dann in das endoplasmatische Retikulum der Zelle gelangen. Somit zeigt die beobachtete erhöhte Aktivität, dass die Zellen in den Bioreaktoren intakte nukleare Rezeptoren, eine funktionelle Transkriptions- und Translationsmaschinerie sowie die biosynthetische Aktivität für die Harn-Produktion besitzen.

Beispiel 9

Entwicklung von Messparametern bezüglich einer Virusinfektion

EEs wurden Konstrukte für Fluoreszenzmessungen untersucht. Der in diesem Experiment untersuchte Fluoreszenzindikator war CCF-2/AM. CCF-2/AM wird in die Zelle aufgenommen, der Ester wird gespalten, so dass es die Zelle nicht verlassen kann, und sendet über FRET bei der Anregung bei 409 nm eine grün-fluoreszierende Farbe aus (Coumann-Fluorescein- Transfer). In Anwesenheit von beta-Lactamase wird CCF-2 in Fluorescein und ein Coumann gespalten, das bei einer Anregung bei 409 nm blau fluoresziert. Als Ergebnis davon kann die Anwesenheit von beta-Lactamase durch die Beladung einer Zelle mit CCF-2/AM und die Beobachtung des Verhältnisses von Blau zu Grün bei einer Anregung mit 409 nm bestimmt werden.
Diese Chemikalien wurden erfolgreich in CHO-Zellen (wegen der hohen Transfektionseffizienz) getestet, und es wurde auch verifiziert, dass die Zellen, die positiv für Topaz-GFP (Green Fluorescent Protein) sind und positiv für beta-Lactamase (die blauen Zellen nach der Beladung mit CCF-2/AM) sind, gut korreliert sind. Somit sollte es mit Techniken unter Verwendung kationischer Lipide zu einer guten Kotransfektion kommen.
Diese Chemikalien wurden auch an glatten Muskelzellen der humanen Aorta (Smooth Muscle Cells, SMCs) sowie Endothelzellen getestet. Die Expression des beta-Lactamase-Gens wurde vom viralen SV-40-Promotor getrieben. Die Zellen wurden mit CCF-2/AM beladen und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX60) und einem Triplepass-Emissionsfilter (RGB) bei einer Exzitation mit einem UV/Violett-Filter (400/15 nm) betrachtet. Die Anwesenheit von beta-Lactamase-Aktivität wurde anhand erhöhter Spiegel der blauen Fluoreszenz, wie sie mit dem Triplepass-Filter gesehen wurde, demonstriert.
Es wurden Zwei-Photonen-Techniken verwendet, um einen quantitativen Nachweis der Promotor-abhängigen Aktivität des fluoreszierenden Reporters zu etablieren. Das erforderte eine weitere Optimierung des Filters, aber es zeigte die Fähigkeit zum Nachweis der Spaltung des CCF2/AM-Substrats. Außerdem wurden Zellen mit Promotor-abhängigem Green Fluorescent Protein und nachgewiesener Promotoraktivität erfolgreich transfiziert. Diese Werkzeuge können an den Fluoreszenznachweis zur Quantifizierung der Genexpression adaptiert werden.

Beispiel 10

Wechselwirkungen von Biotoxinen mit hepatischen Zellen

Es wurden repräsentative Toxine untersucht, wobei der Schwerpunkt zunächst auf dem Toxin lag, das von Helicobacter-Species erzeugt wird. H. pylori, das Bakterium, das mit Magengeschwüren und Magenkrebs beim Menschen assoziiert ist, produziert ein Toxin, das in kultivierten Zellen Vakuolen hervorruft, und deshalb wird das Toxin das vakuolisierende (Vac) Toxin genannt. Man nimmt an, dass andere Helicobacter-Species, die in Nagetieren vorkommen, einschließlich von H. hepaticus, das Mäuse infiziert, und H. bilis, das Ratten infiziert, ähnliche Vac-Toxine bilden. Deshalb wurde die Wechselwirkung der Toxine, die von diesen Stämmen erzeugt werden, mit Hepatozyten der Maus und der Ratte charakterisiert. Es ist wichtig zu verstehen, wie diese Toxine mit Nagetierzellen in Wechselwirkung treten, und zwar nicht nur als Modelle für den Menschen, sondern weil man annimmt, dass diese Toxine endogen vorkommen und in Zellkulturen nicht erkannt werden, was die Ergebnisse auf subtile eine Arten, die nicht in der Literatur berichtet werden, beeinflusst.

Wechselwirkungen des Toxins mit der Mäuseleber-Zelllinie CCL9.1

H. hepaticus infiziert Mäuse und kommt im Gastrointestinaltrakt und der Leber vor. Es wurde ein Toxin-Extrakt von H.-hepaticus-Kulturen präpariert, indem H. hepaticus in einem Standardkulturmedium kultiviert wurde, die Kultur zur Bildung eines Pellets zentrifugiert wurde, die Zellen 3 Stunden bei 37ºC in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) resuspendiert wurden, woran sich eine Kultivierung über Nacht bei 4ºC anschloss, und dann wurden die Zellen abzentrifugiert, und der Überstand, der das Toxin enthielt, wurde entfernt. Dieses partiell gereinigte Material zeigt bei Monolayern kultivierten hepatischer Zelllinien zytotoxische Aktivität.
Die Mäuseleber-Zelllinie CCL9.1 besitzt, wie viele andere Zelltypen, typischerweise unter Standardkulturbedingungen Vakuolen. Diese Vakuolen sind als klare Bereiche im Cytoplasma sichtbar, wenn die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet werden. Ein Standardtest für den pH von Vakuolen ist die Färbung mit Neutralrot. Neutralrot ist ein membrangängiges Amin, das in den sauren Vakuolen akkumuliert, wo es protoniert wird, wodurch saure Vakuolen rot gefärbt werden. CCL9.1-Zellen, die unter Standardbedingungen kultiviert und mit Neutralrot inkubiert werden, zeigen keine Färbung von Vakuolen. Im Gegensalz dazu weisen CCL9.1-Zellen, die unter Standardbedingungen kultiviert und dem Toxinextrakt von H. hepaticus ausgesetzt werden, eine intensiv rote Färbung der Vakuolen auf, was anzeigt, dass das Toxin den pH der Vakuolen über irgendeinen Mechanismus erniedrigt.

Endogene Vakuolen und H.-hepaticus- und H.-bilis-induzierte Vakuolen in primären Ratten-Hepatozyten

Primäre Ratten-Hepatozyten zeigen unter Standard-Kulturbedingungen typischerweise zumindest ein gewisses Ausmaß einer Vakuolen-Bildung, obwohl die Zahl der Vakuolen pro Zelle stark von Isolierung zu Isolierung schwanken kann. Es wurde allgemein beobachtet, dass sich Kulturen mit einer ungewöhnlich großen Zahl von Vakuolen im allgemeinen anders verhalten - im allgemeinen schlechter - als Kulturen mit wenig Vakuolen. Um das zu untersuchen wurden Kulturen, die ungewöhnlich viele Vakuolen zeigten, am zweiten Tag der Kultur mit Neutralrot gefärbt. Diese Kulturen zeigten eine starke Färbung. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die primären Rattenzellen endogen mit einem Toxin-sekretierenden Helicobacter-Stamm infiziert sind. Um das genauer zu untersuchen wurden Hepatozyten aus zwei Ratten isoliert, es wurden Kot- und Caecumproben dieser Tiere untersucht, und es wurden Helicobacter-Kulturen isoliert und eine direkte DNA-Extraktion für eine PCR-Analyse spezifischer Helicobacter-Stämme mit diesen Proben durchgeführt. Die PCR-Analysen mit generellen Primern für Helicobacter ergaben für beide Ratten positive Resultate. Interessanterweise zeigten die Zellkulturen nur wenige Vakuolen, obwohl die PCR-Analyse der Proben des Gewebes des Gastrointestinaltrakts eine Infektion mit sowohl H. bilis als auch mit H. hepaticus anzeigte, und die vorhandenen Vakuolen färbten sich am 5. Kulturtag mit Neutralrot nicht. Die Zugabe von entweder 25 ul H.-hepaticus-Toxin oder H.-bilis-Toxin (präpariert wie es oben für das H.-hepaticus-Joxm beschrieben wurde) zu 2 ml des Kulturmediums (35-mm-Platten) führte zu einem gewissen beobachtbaren Zelltod und zur Bildung von Vakuolen, die mit Neutralrot anfärbbar waren, was mit den Ergebnissen für CCL9.1 übereinstimmte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Helicobacter-Toxine mit Mäusezelllinien und primären Hepatozyten auf ähnliche Weise in Wechselwirkung treten.
Auffälligerweise wurden die Kontrollkulturen, die am Tag 5 keine Färbung zeigten, am Tag 6 mäßig gefärbt, was nahe legte, dass eine latente Infektion über den Zeitraum der 6- tägigen Inkubation zum Ausbruch gekommen war. Dieser Befund steht in Übereinstimmung mit den PCR-Ergebnissen, die eine Infektion der Ratten, von denen die Zellen erhalten worden waren, sowohl mit H. bilis als auch mit H. hepaticus anzeigten. Der Mechanismus der Infektion der Kulturen kann über endogen in der Leber vorhandene Bakterien verlaufen, wie für H. hepaticus in Mäusen demonstriert wurde, oder er kann über eine Kontamination durch die Gastrointestinalflüssigkeit während der Zellisolierung verlaufen.

Beispiel 11

Instrumentelle Ausrüstung für die Spektroskopie und die Mikroskopie

Die Herstellung eines Prototyps des Gewebereaktors, mit dem der Gewebestatus direkt verfolgt werden kann, ist ein essentieller Schritt bei der Optimierung des Aussehens und der Züchtung von Zellen in den Kanälen. Die Entwicklung des Gewebesensors erfordert die Optimierung einer großen Zahl von Parametern, wie der Oberflächenchemie des Silicium- Gerüsts, der Abmessung der Kanäle im Gerüst sowie der hydrodynamischen Parameter bezüglich des Perfusionsmediums. Die Konstruktion des Gehäuses des Reaktorgerüsts wird durch drei Kriterien eingeschränkt. Erstens muss die Kammer mit verschiedenen Konstruktionen mikrofabrizierter Siliciumgerüste kompatibel sein. Zweitens muss die Kammer die leichte Steuerung der Perfusionsbedingungen ermöglichen. (Insbesondere müssen die Perfusionsgeschwindigkeiten des Mediums oberhalb und unterhalb des Silicium-Gerüsts getrennt einstellbar sein, und der hydrodynamische Druck und die Flussgeschwindigkeit durch das Gerüst müssen angegeben werden können). Drittens muss bei einem typischen Silicium- Gerüst mit einer Dicke in der Größenordnung von 100 bis 300 um die Kammer mit einer lichtmikroskopischen Beobachtung über die gesamte Dicke ihrer Kanäle kompatibel sein.
Basierend auf diesen drei Anforderungen wurde ein Querstromreaktor konstruiert, wie er schematisch in der Fig. 2 dargestellt ist und detailliert in der Fig. 16 gezeigt wird. Der Reaktor hat ein unteres und ein oberes Kompartiment. Nach dem vollständigen Zusammenbau sind diese beiden Kompartimente durch das Silicium-Gerüst getrennt. Die Konstruktion ist flexibel, und sie kann jeden beliebigen Silicium-Wafer von 1 Inch Durchmesser mit Dicken zwischen 100 und 300 um aufnehmen. Sowohl das obere als auch das untere Kompartiment weist unabhängige Einlasse und Auslässe für der Perfusionsmedium auf, was eine unabhängige Steuerung des Medienflusses in jedem Kompartiment ermöglich. Der Druckunterschied über das Kompartiment hängt von diesen Flussgeschwindigkeiten sowie von der Kanalkonstruktion des Silicium-Gerüsts ab. Und schließlich ist die Konstruktion der Kammer für eine lichtmikroskopische Beobachtung mit hoher Auflösung optimiert. Um eine Bilddarstellung mit einer Auflösung im Submikrometerbereich zu erhalten, werden Objektive mit hoher numerischer Apertur benötigt. Eine Haupteinschränkung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur sind ihre kurzen Arbeitsabstände. Das obere Fenster der Kammer ist ein Standarddeckglas. Die Kammer wurde für ein ausgewähltes Set an Objektiven konstruiert (Zeiss, Achroplan-Objektive, Wasserimmersion, 20X, 0,4 N. A, 1,2 mm W. D.; 63X, 0,9 N. A. 1,46 mm; 100X, 1,0 N. A., 0,97 mm), die so ausgewählt worden waren, dass gleichzeitig drei Einschränkungen optimiert wurden: hohe numerische Apertur, großes Blickfeld und langer Arbeitsabstand. Die Abmessungen des Reaktors waren so optimiert, dass diese Gruppe von Objektiven sowohl durch die obere Kammer als auch durch die volle Dicke des Silicium-Gerüsts sehen kann.

Optische Charakterisierung des Gewebekulturreaktors

Es wurde verifiziert, dass die Reaktorkonstruktion mit einer Lichtmikroskopie mit hoher Auflösung kompatibel ist. Die Eignung der Reaktorkonstruktion für die Lichtmikroskopie wurde mittels eines Zwei-Photonen-Mikroskops getestet. In einem ersten Experiment wurden Kokulturen aus Hepatozyten und Endothelzellen im Gewebekulturreaktor unter Verwendung eines Silicium-Wafers mit einer Dicke von 150 mm gezüchtet (die Details der Gewebekulturverfahren und die Ergebnisse sind woanders dargestellt). Die Hepatozyten waren nicht mit dem Farbstoff Cell Tracker Green markiert (Molecular Probes, Eugene, Oregon). Die Hepatozyten können leicht anhand ihrer Autofluoreszenz sichtbar gemacht werden, und zwar wegen ihres hohen NAD(P)H-Gehaltes. Die Kokultur wurde mittels eines Zwei-Photonen- Mikroskops unter Verwendung eines Zeiss-Achroplan-Objektivs 63X untersucht. Die Anregungswellenlänge war auf 780 nm eingestellt. Die Kokultur aus den Hepatozyten und den Epithelzellen war im Kanal des Silicium-Gerüsts deutlich sichtbar. Es zeigte sich, dass die Zellen im Kanal dreidimensional mit ausgezeichneter Tiefenauflösung sichtbar waren. Aufeinanderfolgende optische Schnitte (10 um) einer Brückenstruktur über einen Kanal von 100 · 400 um und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Bilder zeigen, dass die Zellen quer über die Kanäle Brücken bilden, aber dabei ein beträchtliches Volumen frei bleibt. Außerdem waren viele Hepatozyten nicht von Endothelzellen bedeckt, im Gegensatz zu früheren Ergebnissen aus zweidimensionalen und dreidimensionalen Kokulturen. In diesen vorläufigen Experimenten waren die meisten Kanäle nur mit 1 bis 2 Zellschichten gefüllt, aber die Zellen besetzten einen beträchtlichen Anteil der Querschnittsfläche.

Konstruktion eines dedizierten lichtspektroskopischen Systems zur Charakterisierung des Gewebestatus

Da der Gewebekanal bis zu einige 100 um dick sein kann, kann die Morphologie des Gewebes im allgemeinen nicht allein durch die Betrachtung von der Oberfläche aus aufgelöst werden. Auch kann die Verteilung der Metaboliten längs des Kanals unterschiedlich sein. Deshalb sollte der morphologische Zustand des Gewebes und der biochemische Zustand in unterschiedlichen Tiefen gemessen werden. Dieses Erfordernis legt fest, dass das optische Nachweissystem die Fähigkeit zur Tiefendiskriminierung haben muss. Deshalb wurde ein System zur konfokalen Mikroskopie und Spektroskopie für allgemeine Zwecke entwickelt, das eine schnelle Bestimmung der Gewebemorphologie und der Biochemie sowie eine Optimierung optischer Messwertsonden, wie fluoreszierender Reportergene, bereit stellen sollte. Eine Konstruktion aus dieser Generation konfokaler Nachweissysteme 400 ist in der Fig. 18 gezeigt, bei der S 402 die Probe ist, OBJ 404 das Objektiv ist, M 406 ein Spiegel ist, EXL 408 die Linse für die Anregung ist, SL 410 die Scan-Linse ist, XYS 412 der x-y-Scanner ist, DIC 314 der dichroistische Spiegel ist, FL416 die Pokussierungslinse ist, PH 418 die punktförmige Öffnung ist, PD 420 der Photodetektor ist, LAS 422 das Ti-Saphir-lasersystem ist und FD 424 der Frequenzverdoppler ist.
Die im Frequenz-verdoppelten Ausgangssignal eines Ti-Saphir-Lasersystems verwendete Lichtquelle (Spectra Physics, Mountain View, Kalifornien). Das vom Ti-Saphir-Laser emittierte Infrarotlicht wird mittels eines Frequenzverdopplers (Inrad, Northvale, New Jersey) in UV/blau/grünes Licht umgewandelt. Das Ti-Saphir-Lasersystem ist zwar nicht für einen Einsatz im Feld geeignet, aber seine Abstimmbarkeit ermöglicht eine ökonomische Erforschung von Wellenlängenbereichen zwischen 350 nm und 500 nm und deshalb die Optimierung der experimentellen Bedingungen für eine große Vielzahl fluoreszierender Reporter, wie NAD(P)H, Indo I, GFP und CCF2. Es wurde verifiziert, dass bis zu 100 mW einer Strahlung von 370 nm mittels des Frequenzverdopplers erzeugt werden können. Die räumliche Auflösung des Frequenz-verdoppelten Lichtes war ausgezeichnet, und es ist für eine konfokale Bilddarstellung mit hoher Auflösung gut geeignet.
Das Anregungslicht wurde von einem dichroistischen Spiegel auf ein von einem Galvanometer angetriebenen x-y-Scanner reflektiert (Cambridge Technology, Cambridge, Massachusetts). Die dichroistischen Spiegel waren spezialgefertigte langwellige Filter (Chroma Technology Inc., Brattleboro, Vermont). Die Mikroskopbilder wurden durch ein Rasterscanning der x-y-Spiegel erzeugt. Das Anregungslicht wurde durch den x-y-Scanner in einen modifizierten Epilumineszenz-Lichtweg eines High-Throughput-Lichtmikroskops (Axioscope I, Zeiss, Thornwood, New York) gelenkt. Die Scan-Linsen waren so angeordnet, dass sich der x- y-Scanner im Augenpunkt befand, während sich die Ebene der Feldöffnung im Fokussierungspunkt befand. Da die Objektive auf unendlich korrigiert sind, wurde eine Rohrlinse angebracht, um das Anregungslicht erneut parallel zu richten. Die Scan-Linsen und die Rohrlinse wirkten zusammen als ein Strahlexpander, der die rückwärtige Öffnung der Objektivlinse überfüllte. Dieses Anregungslicht wurde von einem Breitbandspiegel zum Objektiv reflektiert. Das Sichtfeld des Mikroskops hatte eine Seitenlänge von etwa 50 bis 100 mm, und die typische Frame-Geschwindigkeit lag bei ungefähr 2 Sekunden. Damit die verschiedenen Kanäle über das Silicium-Gerüst mit einem Durchmesser von 1,25 cm einzeln angezielt werden konnten, wurde die Gewebekammer auf einer x-y-Bühne montiert (Prior Systems, Rockland, Massachusetts), was eine Anordnung der Probe über einen Bereich von 5 cm mit einer Genauigkeit von mehr als 1 mm ermöglichte. Die axiale Bilddarstellungsebene wurde über zwei Positionierungssysteme, die gemeinsam arbeiteten, eingestellt. Ein piezoangetriebener Objekteinsteller mit einem Bereich von 100 um ermöglichte eine schnelle z-Positionierung (PI Inc., Auburn, Massachusetts), während ein über einen Schrittmotor angetriebener Objekttisch eine passende ungefähre Anordnung ermöglichte.
Die emittierte Fluoreszenz wurde durch das gleiche Objektiv gesammelt und rückwärts durch den Lichtweg der Anregung übertragen. Die Fluoreszenzemission wurde beim Verlassen des Mikroskopsystems durch den x-y-Scanner descannt. Die Fluoreszenz wurde durch den dichroistischen Spiegel in Richtung des Emissionsweges abgelenkt. Es wurde ein weiterer Sperrfilter verwendet, um das gestreute Anregungslicht weiter abzuschwächen. Das Fluoreszenzsignal bei jedem Pixel wurde mittels eines R5600-P PMT (Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey) nachgewiesen, bei dem es sich um ein kompaktes Modul mit hoher Quantenausbeute und geringem Rauschen handelt. Das Signal wurde mittels eines Vorverstärkers mit niedrigem Rauschen und eines Einzelphotonen-Diskriminators konditioniert. Das resultierende digitale Signal wurde mittels einer spezialgefertigten Interface-Karte aufgenommen und durch den Computer für die Datenaufnahme aufgezeichnet.

Claims

1. Vorrichtung, die umfasst

a) eine Matrix aus einem festen Träger aus einem inerten Material, die einen Kanal oder mehrere Kanäle aufweist,

b) Zellen in den Kanälen der Matrix,

c) eine Einrichtung für das Perfundieren der Zellen mittels eines Querstroms und

d) eine Einrichtung zum Nachweis von Veränderungen in den Zellen oder den Zellen ausgesetzten Verbindungen,

wobei die Kanäle an beiden Enden offen sind und durch die Matrix verlaufen,

wobei die Größe und die Orientierung der Kanäle in der Matrix die Perfusion der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff in einer Menge ermöglicht, die ausreicht, die Vitalität der Zeilen aufrecht zu erhalten.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix perfundierte mikrovaskuläre Netzwerke aufweist und wobei die Nährstoffe durch Kulturmedium bereit gestellt werden, das die mikrovaskulären Netzwerke durchströmt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix einen Silikon-Chip mit einer regelmäßigen Anordnung offener Kanäle aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Einrichtung zum Nachweis von Veränderungen in den Zellen oder den Zellen ausgesetzten Verbindungen ein miniaturisiertes faseroptisches System umfasst, das die Anregung einzelner oder mehrerer Photonen individuellen Kanälen zuführt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Kanäle eine Tiefe zwischen 150 und 400 Mikrometer haben.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Kanäle mit einer Substanz beschichtet sind, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteinen oder Peptiden besteht, die die Adhäsion von Zellen an biokompatible Polymere fördern.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix ein Polymer mit einer regelmäßigen Anordnung offener Kanäle aufweist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix durch ein Verfahren hergestellt wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Mikroformen, elektrolytischer Abscheidung und Strukturierung, Laserablation, Laserbohren, Mikro- Bearbeitungstechniken, Nassätzen, reaktivem Ionenätzen und Prägen.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix außerdem ein biologisch aktives Mittel aufweist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei das biologisch aktive Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Modulatoren des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung und der Zellmigration besteht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Einrichtung zum Nachweis von Veränderungen in den Zellen oder den Zellen ausgesetzten Verbindungen Sensoren aufweist, die Veränderungen des pH, der Sauerstoffspiegel, spezifischer Metaboliten oder die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Indikatormoleküls nachweisen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus parenchymalen Zellen, die eine metabolisierende Funktion oder eine Organfunktion bereit stellen, endothelialen Zellen, die Hohlräume bilden, die Blutgefäßen äquivalent sind, Nerven oder Nervengewebe, Bindegewebe und undifferenzierten Zellen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die undifferenzierten Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus embryonalen Zellen, Stammzellen und anderen Vorläuferzellen besteht.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zellen bezüglich eines Gens oder mehrerer Gene transgen sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Oberfläche der Wände der Kanäle zur Steuerung der Zelladhäsion, der Ausbreitung, der Morphogenese oder der Funktion der Zellen gerillt oder gewölbt ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 1, die für eine Kältekonservierung von Gewebestrukturen geeignet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Geschwindigkeit der Zellperfusion über den Strom des Perfusats gesteuert werden kann.

18. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Strom quer zu wenigstens einer Seite der Kanäle verläuft oder durch die Kanäle gezwungen wird.

19. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Matrix zwei oder mehr unabhängige Perfusionssysteme aufweist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei ein System oberhalb des Kanals liegt und ein System unterhalb des Kanals liegt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zellen im Kanal angeheftet sind.

22. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zellen Aggregate oder Sphäroide im Kanal bilden.

23. Verfahren zum Screenen einer Verbindung bezüglich wenigstens einer Aktivität unter physiologischen Bedingungen in einem Mikroarray, das das Exponieren der Zellen in einer Vorrichtung, wie sie durch einen beliebigen der Ansprüche 1-22 definiert ist, gegen eine Verbindung umfasst, die bezüglich wenigstens einer Wirkung der Verbindung auf die Zellen getestet und gescreent werden soll.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Verbindung ein Arzneimittel ist und das Screenen bezüglich einer biologischen Aktivität, einer Toxizität oder Teratogenität erfolgt.

25. Verfahrung zur Vermehrung von Stammzellen, das das Kultivieren der Stammzellen in der Vorrichtung nach einem beliebigen der Ansprüche 1-22 umfasst.

26. Verfahren nach Anspruch 25, das außerdem die Zugabe einer löslichen Verbindung, die bewirkt, dass die Stammzellen aus der Matrix austreten, zum Medium umfasst.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Verbindung ein Chemotherapeutikum ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, das außerdem das Ernten der Zellen umfasst.

29. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Zellen durch das Sammeln auf einem Filter geerntet werden.