DE69900847T2

DE69900847T2 - Map kinase-inhibitoren zur behandlung von durch tnf-alpha induzierte lipolyse- verursachte krankheiten

Info

Publication number: DE69900847T2
Application number: DE69900847T
Authority: DE
Inventors: S Greenberg
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2019-04-17
Also published as: EP1071429B1; WO1999053927A1; DE69900847D1; EP1071429A1; ATE212552T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diabetes ist weltweit eine der am meisten verbreiteten chronischen Erkrankungen mit erheblichem personellen Aufwand und finanziellen Kosten, sowohl für die Patienten und ihre Familien, als auch für die Gesellschaft. Diabetes kann plötzlich auftreten oder auf Jahre hin undiagnostiziert vorliegen, während die Erkrankung Blutgefäße und Nerven angreift. Diabetiker sind als Gruppe weitaus häufiger von Blindheit, Erkrankungen des Herzens, Schlaganfall, Nierenerkrankungen, Gehörverlust, Wundbrand und Impotenz betroffen. Ein Drittel aller Arztbesucher sind von dieser Erkrankung und ihren Komplikationen betroffen, und Diabetes und seine Komplikationen sind eine Hauptursache für ein verfrühtes Eintreten des Todes in den USA und in der westlichen Welt.
Diabetes beeinflusst durch schädigenden Einfluß die Art und Weise, wie der Körper Zucker und Stärke verarbeitet, welche während der Verdauung in Glucose umgewandelt werden. Insulin, ein Hormon, welches vom Pankreas hergestellt wird, stellt den Körperzellen die Glucose als Energiequelle bereit. Im Muskel, Fett- und Bindegewebe erleichtert Insulin durch eine Wirkung an der Zellmembran den Eintritt von Glucose in die Zellen. Die aufgenommene Glucose wird normalerweise in der Leber zu 002 und WO (50%); zu Glycogen (5%); und zu Fett (30-40%) umgewandelt, wobei letzteres in Fett-Depots gespeichert wird. Die Fettsäuren aus den Fettgeweben zirkulieren, kehren zur Resynthese von Triacylglycerin zur Leber zurück und werden zur Verwertung durch diese Gewebe zu Ketonkörpern metabolisiert. Die Fettsäuren werden auch durch andere Organe metabolisiert. Die Fettbildung ist einer der Haupt-Stoffwechselwege für die Kohlenhydrat-Verwertung.
Die Insulin-Defizienz ist ein häufiger und ernsthafter pathologischer Zustand im Menschen. Im Insulin-abhängigen (insulin dependent Diabetes Mellitus; IDDM oder Typ I) Diabetes produziert der Pankreas wenig oder gar kein Insulin und das Insulin muss für das Überleben des Diabetikers täglich injiziert werden. Bei dem zweiten Haupt-Typ Diabetes, d. h. beim nicht Insulin-abhängigen (NIDDM oder Typ II) Diabetes behält der Pankreas die Fähigkeit, Insulin herzustellen und kann eigentlich größere Mengen Insulin als normal herstellen, doch ist die relative Menge an Insulin, aufgrund von zellulärer Resistenz für Insulin, nicht ausreichend oder weniger als vollständig wirksam (Kosaka J., "The classification of disease based on the concept of Diabetes Mellitus", Nippon Rinsho 1990 Extraausgabe, Diabetes Mellitus, Nippon Rinsho Press, Osaka, 1990, S. 161-168).
Die Anzahl von Patienten mit NIDDM ist groß und man sagt, dass z. B. in Japan mehr als 90% der Patienten, die an Diabetes leiden, NIDDM aufweisen. Das entspricht etwa 2 Mio. Patienten, nur in Japan, welche NIDDM haben.
In den meisten von NIDDM Betroffenen sind die grundlegenden Defekte, auf welche die Abnormalitäten zurückzuführen sind (1) ein verringerter Eintritt von Glucose in verschiedene "periphere" Gewebe und (2) eine erhöhte Freisetzung von Glucose von der Leber in den Blutkreislauf. Deshalb gibt es einen extrazellulären Glucose-Überschuss und ein intrazelluläres Glucose-Defizit. Es gibt auch eine Abnahme bezüglich des Eintritts von Aminosäuren in den Muskel und einen Anstieg an Lipolyse. Eine Hyperlipoproteinämie ist ebenfalls eine Komplikation von Diabetes. Die kumulativen Auswirkungen dieser Diabetes-assoziierten Abnormalitäten sind schwere Blutgefäß- und Nervenschädigungen.
Die Wichtigkeit, NIDDM und andere Zustände, welche mit der Insulin-Resistenz assoziiert sind, zu verzögern oder zu verhindern, kann nicht genug hervorgehoben werden. Unbehandelte NIDDM kann zum Tod aufgrund von Herzerkrankung und anderer diabetischer Komplikationen wie Retinopathie, Nephropathie und periphere Neuropathie führen. Insulin- Resistenz kann auch Bluthochdruck, Fettleibigkeit, Alterung und Koronararterienerkrankungen verursachen.
In den vergangenen Jahren ist die Bedeutung der Insulin- Resistenz bei NIDDM erkannt worden, und dies hat den Wunsch nach Entwicklung einer medikamentösen Behandlung erzeugt, welche eine anti-diabetische Wirkung zeigt ohne die Insulin- Sekretion zu stimulieren, indem die Insulin-Resistenz in den Ziel-Geweben des Insulin verringert wird. Thiazolidin-Derivate wie Troglitazon und Pioglitazon sind als Stoffe entwickelt worden, welche eine solche Wirkung besitzen (Japanische offengelegte Patentanmeldungen Nr. 22636/1980, Nr. 51189/1985 und Nr. 157522/1994). Einige andere Thiazolidin-Derivate mit einer bicyclischen Lactam-Struktur oder einer cyclischen Urethan-Struktur sind beschrieben worden (WO 92/07838, WO 92/07839 und WO092/07850), welche ähnliche Wirkungen zeigen. Andere therapeutische Mittel für NIDDM beinhalten (1) Stimulatoren zur Synthese von Insulin und Regulatoren seiner Sekretion als Mittel für Störungen bei der Sekretion und der Herstellung, (2) Mittel für die Absorption von Zucker, Stimulatoren für die Verwertung, Mittel für Glucose- Transporter, oder Hemmstoffe der Gluconeogenese in der Leber als Mittel zur Regulation von Hyperglykämie, (3) Stimulatoren für die Wirkung von Insulin oder Glucose-senkende Mittel als Hemmstoffe für Schäden, die durch Hyperglykämie verursacht wurden, und Mittel, welche gegen andere Komplikationen gerichtet sind, sind entwickelt worden. Die Wirkung dieser Stoffe mit Insulin-Resistenz-verringernder Aktivität zum Herabsetzen von Glucose oder Fetten im Blut ist nicht ausreichend. Die Entwicklung eines Stoffes, welcher eine stärkere anti-diabetische Wirkung zeigt, ist erwünscht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors des MAPK-Signalwegs in einem Verfahren zur Vorbeugung vor oder Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands, die/der hervorgerufen wird durch TNF-α-induzierte Lipolyse in einem Patienten oder zu der TNF-α-induzierte Lipolyse in einem Patienten beiträgt. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Verwendung die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Stoffes an einen Patienten, welcher einen oder mehrere MAP-Kinase-Wege moduliert, um die Lipolyse zu reduzieren, um somit die/der Erkrankung oder den/dem Zustand in dem Patienten zu behandeln oder vorzubeugen. In einer sogar mehr bevorzugten Ausführungsform ist der Stoff ein Inhibitor des ERK1-, ERK2- und/oder des JNK-Wegs. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Inhibitor ein direkter Inhibitor. Der Inhibitor kann z. B. die Proteinmenge an ERK1/2 und/oder JNK erniedrigen, oder die Expression eines Gens erniedrigen, welches ERK1/2 und/oder JNK codiert. In einer bestimmten Ausführungsform kann der Inhibitor mit einem ERK1/2- und/oder JNK-Gen interagieren und kann z. B. ein Antisense-Molekül, ein Triplex-Molekül oder ein Ribozym sein. Andere erfindungsgemäße MAP-Kinase-Inhibitoren beinhalten diejenigen, welche die ERK1/2- und/oder die JNK- Phosphorylierung hemmen.
Die Erfindung ist wirksam zur Vorbeugung vor oder Behandlung von Insulin-Resistenz in einem Patienten, oder irgendeiner Erkrankung oder eines Zustandes, der damit assoziiert ist. Bevorzugte Erkrankungen oder Zustände, welche gemäß der Erfindung behandelt werden können, beinhalten auch Diabetes, insbesondere NIDDM, prädiabetische Zustände, das Stein-Leventhal-Syndrom (polycystic ovary syndrom; PCOS), Kardiovaskular-Erkrankungen, Koronararterien-Erkrankungen und Hyperinsulinämie.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum eine Krankheit oder einen Zustand entwickelt hat, die/der hervorgerufen wird durch Lipolyse oder zu der/dem Lipolyse beiträgt, oder ob die Entwicklung einer solchen Krankheit oder eines solchen Zustands in einem Individuum wahrscheinlich ist, welches die Bestimmung der Aktivität einer JNK in dem Individuum umfasst, wobei eine abnormal erhöhte JNK-Aktivität anzeigt, dass das Individuum eine Krankheit oder ein Zustand hat, die/der hervorgerufen ist durch Lipolyse oder zu der/dem Lipolyse beiträgt, oder dass die Entwicklung einer solchen Krankheit oder eines solchen Zustands in dem Individuum wahrscheinlich ist. In einer veranschaulichenden Ausführungsform umfasst die Bestimmung der Aktivität einer JNK die Bestimmung der JNK- Proteinmenge, wobei eine abnormal erhöhte JNK-Proteinmenge einer abnormal erhöhten JNK-Aktivität entspricht oder die Bestimmung, ob das JNK-Protein ein mutiertes JNK-Protein ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Wirkstoff-Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die TNF-α induzierte Lipolyse vermindert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Durchmusterungsverfahren (i) Isolieren einer Verbindung, die ein ERK1/2- und/oder JNK-Inhibitor ist; und (ii) Inkontaktbringen eines Adipocyten mit der Verbindung von Schritt (i) und TNF-α und Bestimmung des Lipolysespiegels, wobei ein niedriger Lipolysespiegel bei Anwesenheit der Verbindung von Schritt (i) im Vergleich zum Lipolysespiegel in Abwesenheit der Verbindung von Schritt (i) anzeigt, dass die Verbindung Lipolyse vermindert.
Andere Aspekte der Erfindung sind nachfolgend beschrieben oder sind für den Durchschnitts-Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1, die Teile A und B zeigen die Mengen an Glycerin, welche von 3T3-L1-Adipocyten hergestellt wurden, die für 24 Stunden mit oder ohne Natriumsalicylat (NaSal), BRL, PGJ2 und 2 ng/ml (Teil A) oder 10 ng/ml (Teil B) TNF-α behandelt wurden.
Fig. 1, Teil C zeigt die Menge an freien Fettsäuren (free fatty acids; FFA), welche von 3T3-L1-Adipocyten hergestellt wurden, die für 24 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml TNF-α und BRL behandelt wurden.
Fig. 1, Teil D zeigt die Menge an Glycerin, welche von 3T3-L1-Adipocyten hergestellt wurde, die mit oder ohne TNF-α, BRL und PGJ2 behandelt wurden, während der letzten 24 Stunden einer 5-Tage-Inkubation.
Fig. 1, Teil E zeigt die Menge an Glycerin, welche von 3T3-L1-Zellen hergestellt wurde, welche für 24 Stunden mit TNF-α vorbehandelt wurden und dann mit TNF-α alleine oder gemeinsam mit BRL behandelt wurden.
Fig. 2 stellt ein Foto eines Western-Blots dar, welcher die Aktivität von JNK-1 zeigt, gemessen in einem Kinase-Test in 3T3-L1-Adipocyten, welche für 24 Stunden mit oder ohne 20 mM Natriumsalicylat (NaSal), 100 uM PD98059 und 10 ng/ml TNF-α behandelt wurden (oberer Bereich) und die Gesamtmenge an JNK- 1, welche unter Verwendung eines Anti-JNK-1-Antikörpers durch Western Blot-Analyse bestimmt wurde (unterer Bereich).
Fig. 3 stellt die Fotografie eines Western-Blots dar, welcher die Kinaseaktivität von ERK1/2 (oberer Bereich) und die Menge an phosphoryliertem ERK1/2 (mittlerer Bereich) in 3T3-L1-Adipocyten zeigt, welche für 24 Stunden mit oder ohne 20 mM Natriumsalicylat (NaSal), 100 uM PD98059 und 10 ng/ml TNF-α behandelt wurden, in Relation zu der Aktivität der ERK1/2 in nicht behandelten 3T3-L1-Adipocyten. Der untere Bereich zeigt die Gesamtmenge an ERK1/2 in diesen Zellen an.
Fig. 4 zeigt die Menge an Glycerin, welche von 3T3-L1- Adipocyten hergestellt wurde, die für 24 Stunden mit oder ohne 2 ng/ml TNF-α (Teil A), 10 ng/ml TNF-α (Teil B), BRL, PGJ2 und 100 uM PD98059 behandelt wurden.
Fig. 5 zeigt die Menge an Glycerin, welche in 3T3-L1- Adipocyten hergestellt wurde, die für 24 Stunden mit oder ohne TNF-α und ansteigenden Mengen von SB203580 behandelt wurden.
Fig. 6 stellt eine Fotografie eines Western-Blots dar, der die Aktivität von ERK1/2- und JNK-1-Kinasen zeigt, welche in einem Kinase-Test bestimmt wurde, mit Zellen, welche für 3 Stunden mit oder ohne 20 nM Natriumsalicylat (NaSal) oder 100 uM PD98059 vorinkubiert wurden und dann für 15 Minuten mit oder ohne BRL und TNF-α behandelt wurden.
Fig. 7 repräsentiert eine Fotografie eines Western-Blots, der die Menge an phosphorylierten ERK1/2-, JNK-1- und p38- Kinasen (Teil A) und die Gesamtmenge an ERK1/2-, JNK-1- und p38-Kinasen (Teil B) in 3T3-L1-Adipocyten zeigt, welche für 3 Tage mit 17 uM PGJ2 oder 10 uM BRL vorbehandelt wurden und dann für 15 Minuten mit oder ohne 10 ng/ml TNF-α inkubiert wurden. Die Teile C und D zeigen die Ergebnisse von ERK1/2- bzw. JNK-1-Kinase-Tests von Kinasen aus Adipocyten, welche wie für die Teile A und B beschrieben, behandelt wurden.
Fig. 8 repräsentiert eine Fotografie eines Western-Blots, der die Menge an HSL- und Perilipin A-Proteinen in 3T3-L1- Adipocyten zeigt, welche für 24 Stunden mit oder ohne TNF-α und BRL behandelt wurden.
Fig. 9 repräsentiert eine Fotografie eines Western-Blots, der die Mengen an HSL, Perilipin A- und Perilipin B-Proteinen in Kontroll-BT3-L1-Adipocyten (kein Ad.), 3T3-L1-Adipocyten, welche mit einem Kontroll-adenoviralen Vektor infiziert wurden (Ad.-Kontrolle), mit einem adenoviralen Vektor infiziert wurden, der Perilipin A codiert (Ad. Peri A), oder mit einem adenoviralen Vektor infiziert wurden, der Perilipin B codiert (Ad. Peri B), und weiterhin mit oder ohne TNF-α und Isoproterenol behandelt wurden.
Fig. 10 zeigt die Menge Glycerin, die nach 24 Stunden (Teil A) oder während der letzten 3 Stunden (Teil B) einer 24- Stunden-Inkubation von 3T3-L1-Adipocyten angereichert wurde, mit oder ohne TNF-α, nach Infektion der Zellen mit oder ohne einen adenoviralen Vektor, der Perilpin A (Ad. Peri A) und Perilipin B (Ad. Peri B) codiert oder nicht.
Fig. 11 A-C sind Graphen, welche den Logarithmus des Wertes von zirkulierendem Leptin (Teil A), TNF-α (Teil B) und IL-6 (Teil C) als eine Funktion des prozentualen Anteils an Körperfett eines Patienten zeigen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1. Allgemeiner Überblick

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors des MAPK-Wegs in Verfahren zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die hervorgerufen werden durch Lipolyse, wie TNF-α- induzierte Lipolyse, oder zu denen Lipolyse beiträgt. Beispiele für solche Erkrankungen oder Zustände beinhalten diejenigen, die hervorgehen aus Hyperlipidämie, Hyperglykämie, Fettsucht, gestörte Glucosetoleranz (impaired glucose tolerance; IGT), Insulin-resistente nicht-IGT (NGT), nicht- diagnostische Glucosetoleranz, Insulin-Resistenz, diabetische Komplikationen, Fettleber, polycystisches Ovar-Syndrom (PCOS), Schwangerschafts-Diabetes mellitus (gestational Diabetes Mellitus; GDM) und Bluthochdruck. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Erkrankung nicht- Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (NIDDM). In einer sogar mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verabreichung eines Inhibitors des JNK-Signalwegs und/oder eines Inhibitors des ERK/MAP-Kinase-Signalwegs an einen Patienten. Die Erfindung kann sich weiter auf die Verabreichung einer Verbindung beziehen, welche den p38- Signalweg stimuliert. In einer anderen Ausführungsform betrifft sie die Verabreichung eines Agonisten von PPAR-γ, wie Prostaglandin-Derivate oder BRL 49653.
Die Erfindung begründet sich zumindestens teilweise in der Beobachtung, dass TNF-α Lipolyse induziert, was mit verschiedenen Erkrankungen oder Zuständen in Verbindung gebracht wurde, die durch Insulin-Resistenz charakterisiert sind, wie NIDDM und Fettsucht, welche durch Natriumsalicylat (NaSal) gehemmt werden, was, wie hierin gezeigt, wesentlich die Aktivität von JNK erniedrigt und auch, jedoch in geringerem Umfang, die Aktivität der ERK/MAP-Kinase. Darüberhinaus wurde von einem Prostaglandin-Derivat ebenfalls gezeigt, dass es TNF-α-induzierte Lipolyse hemmen kann und ERK1/2- und JNK-1-Aktivierung hemmen kann. Darüberhinaus erniedrigt, wie hierin gezeigt, ein Inhibitor der ERK/MAP- Kinase TNF-α-induzierte Lipolyse. Zusätzlich stimuliert im Gegensatz zu JNK- und ERK/MAP-Kinasen die Hemmung des pSB-Wegs TNF-α-induzierte Lipolyse. Damit geben die hierin beschriebenen Beispiele an, dass die Hemmung des JNK-Wegs und des ERK/MAP-Kinase-Wegs TNF-α-induzierte Lipolyse inhibiert, wohingegen die Hemmung des p38-Wegs TNF-α-induzierte Lipolyse erhöht.

2. Definitionen

Zum besseren Verständnis sind nachfolgend die Bedeutungen bestimmter Begriffe und Ausdrücke bereitgestellt, welche in der Beschreibung, den Beispielen und den anhängigen Ansprüchen verwendet werden.
Der Begriff "Aktivierung von PPAR-γ" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Verbindung, selektiv PPAR-γ-abhängige Genexpression z. B. durch Erhöhen PPAR-γ-abhängiger Transkription eines Gens zu aktivieren.
Der Begriff "Wirkstoff" wird hierin verwendet, um eine chemische Verbindung zu bezeichnen, ein Gemisch chemischer Verbindungen, ein biologisches Makromolekül oder einen Extrakt, welcher aus biologischem Material wie Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder tierischen (insbesondere Säuger-)Zellen oder Geweben hergestellt wurde. Wirkstoffe können auf die potenzielle Aktivität, antiproliferative Wirkstoffe zu sein bewertet werden, indem sie Durchmusterungstests unterzogen werden, wie z. B. hierin nachfolgend beschrieben,.
Ein "direkter Inhibitor" einer Kinase ist ein Inhibitor, welcher mit der Kinase oder einem Bindungspartner davon oder mit einer Nucleinsäure, welche die Kinase codiert, wechselwirkt.
Eine/ein "Erkrankung oder Zustand, welche/welcher mit TNFα-induzierter Lipolyse assoziiert ist", bezieht sich auf eine Erkrankung oder einen Zustand, welche/welcher durch Lipolyse in Fettzellen als Antwort auf TNF-α verursacht wird, oder zu der/dem Lipolyse in Fettzellen als Antwort auf TNF-α beiträgt. Typisch werden solche Erkrankungen oder Zustände durch überschüssige freie Fettsäure- und/oder Glycerin-Spiegel verursacht oder tragen überschüssige freie Fettsäuren und/oder Glycerin-Spiegel dazu bei.
Der Begriff "ERK1/2" bezieht sich auf ERK1 und/oder ERK2.
Der Begriff "Hyperinsulinämie" bezieht sich auf ein Stadium in einem Patienten, in welchem der Insulinspiegel im Blut höher ist als normal.
Der Begriff "Insulin-Resistenz" bezieht sich auf ein Stadium, in welchem eine normale Menge an Insulin eine subnormale biologische Antwort produziert.
"Gestörte Glucosetoleranz" oder "IGT" ist ein Zwischenzustand zwischen manifester, NIDDM- und normaler Glucosetoleranz.
Ein "indirekter Inhibitor" einer Kinase ist ein Inhibitor, welcher stromaufwärts oder stromabwärts der Kinase in Bezug auf den regulatorischen Signalweg wechselwirkt, und welcher nicht mit der Kinase oder einem Bindungspartner davon oder mit einer Nucleinsäure, welche die Kinase codiert, wechselwirkt. Somit kann z. B. ein indirekter Inhibitor von JNK ein Inhibitor von MEKK1 sein.
Die Begriffe "induzieren", "hemmen", "vervielfachen", "erheben", "erhöhen", "erniedrigen" oder ähnliches, welche z. B. quantitative Unterschiede zwischen zwei Stadien bezeichnen, beziehen sich zumindest auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Stadien. "Eine Menge, welche wirkungsvoll ist, um die Aktivierung einer MAP- Kinase zu hemmen" zum Beispiel bedeutet, dass das Aktivierungsstadium der MAP-Kinase mindestens statistisch signifikant verschieden von demjenigen in unbehandelten Zellen ist.
Ein "Inhibitor" einer Kinase ist jedes Molekül, welches die Aktivität der Kinase erniedrigt oder die Proteinmenge der Kinase erniedrigt. Damit kann ein Kinase-Inhibitor ein kleines Molekül sein, welches die Aktivität der Kinase z. B. durch Stören der Wechselwirkung der Kinase mit einem anderen Molekül, z. B. seinem Substrat, erniedrigt. Es kann auch ein kleines Molekül seine, welches die Expression des Gens erniedrigt, welches die Kinase codiert. Ein Inhibitor kann auch eine Antisense-Nucleinsäure, ein Ribozym, ein Antikörper, eine dominant-negative Mutante der Kinase oder eine Phosphatase sein.
Der Begriff "JNK" oder "JNK-Isoformen" beinhaltet sowohl JNK-1 als auch JNK-2.
Der Begriff "Lipolyse" bezieht sich auf den Abbau von Triacylglycerin in Glycerin und Fettsäuren, was zur Freisetzung von Glycerin und freien Fettsäuren aus der Zelle führt.
Die Begriffe "mitogen-aktivierte Proteinkinase", "MAP- Kinase" und "MAPK" beziehen sich auf Proteinkinasen, welche durch duale Phosphorylierung an Threonin und Tyrosin aktiviert werden und beinhalten unter anderem: ERK1, ERK2, JNK-1, JNK-2, SAPK, p38, SMK1, HOG1, MPK1, FUS3/KSS1 und spk1.
Der Begriff "MAPK-Phosphatase"-Aktivität oder -Funktion ist die Fähigkeit, einen oder vorzugsweise beide der Reste Threonin und Tyrosin der MAP-Kinase, welches Reste sind, die bei der Aktivierung der MAP-Kinase phosphoryliert werden, zu dephosphorylieren.
Der Begriff "MKK" bezieht sich auf MAPK-Kinase.
Der Begriff "MKK-Substrat", wie er hierin verwendet wird, beinhaltet MKK-Substrate sowie MKK-Substrat-Substrate, z. B. p38, JNK, ATF2 und c-jun.
Der Begriff "PPAR-γ" bezieht sich auf die Mitglieder der Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-Familie, welche u. a. in Fett- und hämatopoietischen Zellen exprimiert werden (Braissant, O. et al. Endocrinology 137 (1): 354-66) und welche als Schlüssel-Regulatoren der Differenzierung wirken. Innerhalb dieser Definition enthalten sind Varianten davon wie z. B. PPAR-γ1 und PPAR-γ2, welche zwei Isoformen sind, die unterschiedliche N-terminale Enden haben, welche durch alternatives Spleißen eines primären RNA-Transkripts entstanden sind (Tontonoz, P. et al. (1994), Genes & Dev. 8: 1224-34; Zhu et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 26817-20).
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "PPAR-γ-Agonist", der für das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßig ist, auf einen Wirkstoff, welcher die transkriptionelle Aktivität eines PPAR-Rezeptors einer neoplastischen Zelle vervielfacht, induziert oder andersartig verstärkt. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Agonist die Aktivierung der Transkription durch PPAR-γ-Transkriptionskomplexe induzieren, z. B. durch Nachahmen eines natürlichen Liganden für den Rezeptor. In anderen Ausführungsformen vervielfacht der Agonist die Sensitivität des Rezeptors für einen PPAR-γ- Liganden, z. B. erniedrigt die Behandlung mit dem Agonisten die Konzentration des Liganden, die erforderlich ist, um einen bestimmten Spiegel an Rezeptor-abhängiger Genaktivität zu induzieren.
Wie hierin verwendet beinhaltet der Begriff "PPAR-γ- Ligand", welcher für das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßig ist, jeden natürlich auftretenden oder nicht natürlich auftretenden Wirkstoff, welcher selektiv und spezifisch an ein PPAR-γ-Protein bindet und nach der Bindung die Transkription von Genen aktiviert, welche ein PPAR-γ-responsives Element enthalten. Beispiele für solche Liganden beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Thiazolidinedion-Verbindungen, z. B. Pioglitazon, Troglitazon, BRL49653 und Derivate davon oder Prostaglandin (PG)-Metabolite, z. B. Prostaglandin 15- Desoxy-Δ12,14PGJ&sub2; und Derivate davon.
Die "Signaltransduktion eines PPAR-γ-Rezeptorproteins" ist die intrazelluläre Weiterverarbeitung chemischer Signale, die als Konsequenz der Aktivierung des nucleären Rezeptors auftreten, und kann durch einen oder mehrere verschiedene Mechanismen erfolgen, wie Ligandenbindung, Heterodimer- Komplexbildung, DNA-Bindung und/oder direkte oder indirekte Aktivierung von Transkription. Veränderungen innerhalb des Signalweges werden letztendlich durch die erhöhte Expression differenzierungsspezifischer Gene und/oder dem Austritt aus dem Zellzyklus nachgewiesen.
Der Begriff "TNF-α-induzierte Lipolyse" betrifft den TNF- α-induzierten Triacylglycerol-Abbau in einer Fettzelle, wobei die Herstellung von Glycerin und von freien Fettsäuren in der Zelle resultieren, welche sekretiert werden können.

3. Verbindungen, welche TNF-α-induzierte Lipolyse hemmen

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Hemmung oder Blockierung der Lipolyse von Adipocyten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lipolyse eine durch TNF-α-induzierte Lipolyse. In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Modulatoren von MAP-Kinase-Wegen. Die Modulatoren der Erfindung beinhalten auch Natriumsalicylat und Mittel, welche an den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-γ (PPAR-γ) binden.

1. Modulatoren der MAP-Kinase-Wege

Innerhalb der Klasse von MAP-Kinase-Weg-Modulatoren, d. h. Aktivatoren und Inhibitoren, beinhalten bevorzugte Verbindungen Inhibitoren des JNK-Wegs, Inhibitoren des MAP/ERK-Wegs und Stimulatoren des p38-Wegs. Diese Verbindungen können direkte Modulatoren sein, wie Mittel, welche direkt mit einer Kinase in dem MAP-Kinase-Weg oder einer Nucleinsäure, die eine solche codiert, wechselwirken, oder ein Mittel, welches mit einem Molekül (z. B. einem Protein) wechselwirkt, welches mit der Kinase interagiert. In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung indirekte Modulatoren von MAP-Kinase-Signalwegen sein. Ein indirekter Modulator einer spezifischen Kinase ist ein Mittel, welches nicht mit der Kinase oder einem Protein, welches damit wechselwirkt, oder einer Nucleinsäure, welche eine solche codiert, interagiert. Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen sind direkte Inhibitoren von JNK-1, MAP-Kinasen, ERK1 oder ERK2 und Aktivatoren von p38.
Im nachfolgenden ist eine kurze Beschreibung der drei MAP- Kinase-Wege und den daran beteiligten Kinasen offenbart. Verfahren, um jeden dieser Signalwege zu modulieren, sind nach diesem Abschnitt offenbart. Proteine, welche diese Signalwege in Zellen modulieren, werden andauernd identifiziert, und die Modulation solcher Proteine für die erfindungsgemäßen Verfahren befinden sich ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Mitogen-aktivierte Protein (MAP)-Kinasen sind eine Familie von Enzymen, welche intrazelluläre Signalwege regulieren. MAP- Kinasen sind wichtige Mediatoren für Signalübermittlung von Zelloberflächen zu Kernen über Phosphorylierungskaskaden. Einige Untergruppen von MAP-Kinasen sind bestimmt worden und jede offenbart unterschiedliche Substrat-Spezifitäten und antwortet auf viele verschiedene extrazelluläre Stimulatoren. Damit repräsentieren die MAP-Kinase-Signalwege allgemeine Mechanismen für Signalübermittlung, durch welche verschiedene extrazelluläre Stimulatoren innerhalb von Zellen unterschiedliche physiologische Antworten generieren (Egan SE and Weinberg RA (1993) Nature 365: 781-783).
Verschiedene MAP-Kinase-Signalwege sind in Säugerzellen und in Hefe bestimmt worden. In Säugerzellen beinhalten die extrazellulären Stimulatoren, welche die MAP-Kinase-Signalwege aktivieren, den epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor; EGF), ultraviolettes Licht, hyperosmolares Medium, Hitzeschock, endotoxisches Lipopolysaccharid (LPS) und proinflammatorische Cytokine, wie Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-1 (IL-1). In der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden durch Aussetzung mit Paarungs-Pheromon oder hyperosmolarer Umgebung und während der Zellwand-Konstruktion, Sporulation und Mitose verschiedene MAP-Kinase-Signalwege aktiviert. Es gibt mindestens drei Untergruppen von MAP- Kinasen in Säugerzellen (Derijard B et al (1995) Science 267: 682-5) und jede Untergruppe wird durch ein Tripeptid- Sequenzmotiv unterschieden. Die Untergruppen sind extrazelluläres Signal-regulierte Proteinkinase (ERK), welche durch Thr-Glu-Tyr charakterisiert ist, c-Jun-aminoterminale Kinase (JNK), welche durch Thr-Pro-Tyr charakterisiert ist und p38-Kinase, welche durch Thr-Gly-Tyr charakterisiert ist. Die Untergruppen werden durch die doppelte Phosphorylierung von Threonin und Tyrosin durch MAP-Kinase-Kinasen (MKK) aktiviert, welche stromaufwärts der Phosphorylierungskaskade lokalisiert sind. Aktivierte MAP-Kinasen phosphorylieren andere Effektoren weiter stromaufwärts, was letztendlich zur Veränderungen innerhalb der Zellen führt.
c-Jun-aminoterminale Kinasen (JNKs), oder Stress- aktivierte Proteinkinasen (SAPKs) sind Mitglieder der mitogen- aktivierten Protein (MAP)-Kinasegruppe, welche als Antwort auf Cytokine wie TNF, z. B. TNF-α und IL-1, und dem Aussetzen von Umgebungsstress, einschließlich ultraviolettes Licht, Hitzeschock und osmotischen Stress, aktiviert werden (U.S. Pat. Nr. 5605808; B. Derijard et al., Cell 176,1025 (1994); J. M. Kyriakis et al., Nature 369, 156 (1994)). Die Ras-Proteine können den JNK-Signaltransduktionsweg teilweise aktivieren. Eine Analyse einer abgeleiteten primären Sequenz der beiden Isoformen von JNK, JNK-1, welche ein 46 kDa-Protein ist, und JNK-2, welche ein 55 kDa-Protein ist, zeigt, dass sie weitläufig mit der ELK-Untergruppe verwandt sind.
Substrate der JNK-Proteinkinase beinhalten die Transkriptionsfaktoren ATF2, Elk-1 und c-Jun (A. J. Whitmarsh and R. J. Davis, J. Mol. Med. 74, 589 (1996)). JNK phosphoryliert jeden dieser Transkriptionsfaktoren innerhalb der Aktivierungsdomäne und erhöht die Transkriptionsaktivität (A. J. Whitmarsh, siehe oben). Die JNKs phosphorylieren z. B. Ser63 und Ser73 in der aminoterminalen Domäne des Transkriptionsfaktors c-Jun, was zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität führt.
Genetische Studien über JNK zeigen, dass dieser Signalweg in multiple zelluläre Prozesse involviert ist (K. H. Sluss, Z. Han, T. Barrett, R. J. Davis, T., Genes Dev. 10, 2745 (1996); J. R. Riesgo-Escovar, M. Jenni, A. Fritz, E. Hafen, Genes Dev., S. 2759).
JNKs werden durch doppelte Phosphorylierung an Thrl83 und Tyr185 innerhalb der Motive Thr-Glu-Tyr bzw. Thr-Pro-Tyr durch MKK4 (einschließend MKK4-α, -β, und -γ) und MAP-Kinase-Kinasen aktiviert (Davis, R. (1994) TIBS 19: 470-473 und PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 96/36642 von Davis et al.).
Obwohl JNK sowohl im Cytoplasma als auch im Kern von ruhenden Zellen lokalisiert ist, geht die Aktivierung von JNK mit der Anreicherung von JNK im Zellkern einher (M. Cavigelli, F. Dolfi, F.-X. Claret, M. Karin, EMBO J. 14, 5957 (1995)). Ein murines cytoplasmatisches Protein, welches spezifisch an JNK bindet [das JNK-interagierende Protein-1 (JIP-1)] wurde charakterisiert und cloniert (Dickens et al. (1997) Science 227: 693). JIP-1 verursachte die cytoplasmatische Zurückhaltung von JNK, was durch Überexpression von JIP-1 gezeigt wurde, wobei die Zurückhaltung von JNK im Cytoplasma verursacht wurde. JIP-1 verursachte auch die Hemmung von JNK-regulierter Genexpression. Zusätzlich hemmte JIP-1 die Wirkung des JNK- Signalwegs auf die zelluläre Proliferation.
Der ERK-Signaltransduktionsweg wird über Tyrosinkinase- Rezeptoren auf der Plasmamembran der Zelle aktiviert. Wenn EGF oder andere Wachstumsfaktoren an die Tyrosin-Rezeptoren binden, binden diese ihrerseits an nicht-katalytische src- Homologie (SH)-Adapter-Proteine (SH2-SH3-SH2) und ein Guanin- Nucleotid-freisetzendes Protein. Letzteres reduziert GTP und aktiviert Ras-Proteine, Mitglieder der großen Familie von Guanin-Nucleotid-bindenden Proteinen (G-Proteine). Die aktivierten Ras-Proteine binden an eine Proteinkinase c-Raf-1 und aktivieren die Raf-1-Proteine. Die aktivierte Raf-1-Kinase phosphoryliert anschließend MAP-Kinase-Kinasen, welche ihrerseits MAP-Kinase-ERKs durch Phosphorylierung der Threonin- und Tyrosinreste der ERKs aktivieren.
ERKs sind auf Prolin-ausgerichtete Proteinkinasen, welche Ser/Thr-Pro-Motive phosphorylieren. In der Tat sind die cytoplasmatische Phospholipase A2 (cPLA2) und der Transkriptionsfaktor Elk-1 Substrate der ERKs. Die ERKs phosphorylieren Ser505 der cPLA2 und verursachen einen Anstieg in deren enzymatischen Aktivität, was zu einem Anstieg der Freisetzung von Arachidonsäure und der Bildung von Lysophospholipiden aus Membran-Phospholipiden führt. Gleichermaßen führt die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors Elk-1 durch ERK letztendlich zu erhöhter Transkriptionsaktivität.
ERK-1 ist ein 44 kDa-Protein und ERK-2 ist ein 42 kDa- Protein. Die Aktivierung dieser MAP-Kinasen erfordert eine geordnete Phosphorylierung eines Threonin und eines Tyrosin, welche innerhalb der konservierten Kinase-Subdomäne 8 (T183 und Y185) lokalisiert sind.
ERK-Aktivität wird durch die Mitogen-induzierten Phosphatasen MKP1 und PAC1 mit dualer Spezifität reguliert (Ward et al. (1994) Nature 367: 651). Eine andere Phosphatase, welche sowohl Serin/Threonin als auch Tyrosin-Reste dephosphoryliert und von welcher erk2 ein Substrat ist, wird durch das menschliche Gen CL100 und sein murines Gegenstück 3CH134 codiert (Charles et al. (1992) Oncogene 7: 187). Es konnte gezeigt werden, dass dieses Gen, wenn es in vitro exprimiert wird, sehr spezifisch für MAP-Kinase ist und zur Dephosphorylierung und Inaktivierung von MAP-Kinase führt (Charles et al. (1993) PNAS 90: 5292). Die WO 95/21923 von Ashworth et al. offenbart auch die Clonierung von MAP-Kinase- Phosphatasen, welche in der Lage sind, erk2 zu dephosphorylieren.
p38 ist ein 360 Aminosäuren enthaltendes 41 kD-Protein, welches durch Hitzeschock, hyperosmolares Medium, IL-1 oder LPS-Endotoxin, welches durch eindringende Gram-negative Bakterien produziert wird, aktiviert wird (Han J et al (1994) Science 265: 808-811). p38 wird durch duale Phosphorylierung am Thr180 und Tyr182 innerhalb des Motivs Thr-Gly-Tyr aktiviert und nach Aktivierung phosphoryliert p38 MBP und EGF-R und zu einem geringeren Anteil IκB, jedoch nicht die cytoplasmatische Phospholipase A2, c-Myc noch C-Jun (Davis et al. a.a.O.).
p38 wird durch MKK phosphoryliert, welche in den Isoformen MKK3, MKK6 und MKK4 (umfassend MKK4-α, -β und -γ) vorliegt. Diese Kinasen haben Serin-, Threonin- und Tyrosin-Kinase- Aktivität und phosphorylieren spezifisch die menschliche MAP- Kinase p38 an den Resten Thr180 und Tyr182. Die Aminosäure- und Nucleotid-Sequenz von MKK3, MKK4 und MKK6 sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung von Davis et al. offenbart, welche die Veröffentlichungs-Nr. WO 96/36642 hat. P38- Aktivität wird durch die Mitogen-induzierten Phosphatasen MKP1 und PAC1 mit zweifacher Spezifität reguliert (Davis et al., siehe oben).
In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein Inhibitor des JNK- oder ERK/MAP-Kinase-Wegs eine Verbindung, welche die Aktivität einer Kinase innerhalb dieser Wege oder die Aktivität eines Proteins, welches die Kinasen reguliert, blockiert, reduziert oder vermindert. Die Verbindung kann z. B. die Aktivität der Kinase durch Hemmung der Phosphorylierung der Kinase inhibieren, wie durch Inhibieren der Wechselwirkung zwischen der Kinase und der Kinase, welche diese phosphdryliert. Tatsächlich sind Kinasen der MAP-Kinase-Wege, wie sie hierin beschrieben sind, nur aktiv, wenn sie phosphoryliert sind, im Allgemeinen an zwei Resten. Damit ist die erfindungsgemäße Verbindung in einer Ausführungsform eine Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen JNK und MKK4 behindert. Die Verbindung kann ein kleines Molekül sein. In einer anderen Ausführungsform kann die Verbindung eine dominant-negative Form von JNK oder MKK4 sein. Ein katalytisch inaktives JNK-1-Molekül, welches als ein dominanter Inhibitor des Wildtyp JNK-1-Moleküls wirkt, ist in Beispiel 13 der PCT- Anmeldung von Davis et al. beschrieben, welche die Veröffentlichungs Nr. WO 96/36642 hat. Diese Mutante wurde konstruiert, indem die Stellen für die aktivierende Thr181- und Tyr185-Phosphorylierung durch Ala bzw. Phe ersetzt wurden. Wie von Davis et al. gezeigt, blockierte diese dominant- negative Mutante wirkungsvoll die Phosphorylierung des Substrats ATF2 durch Wildtyp-JNK-1.
Die Aktivität einer Kinase kann auch verringert werden, indem man die Wechselwirkung zwischen der Kinase und einem Substrat der Kinase inhibiert oder reduziert. Die Aktivität von JNK kann z. B. durch eine Verbindung inhibiert werden, welche die Wechselwirkung zwischen einer JNK und c-Jun behindert. Die Verbindung kann ein kleines Molekül sein. Die Verbindung kann auch eine dominant-negative Form von JNK oder c-Jun sein.
In einer anderen Ausführungsform wird die Aktivität einer Kinase durch Dephosphorylierung der Kinase inhibiert. Dephosphorylierung kann z. B. durch Phosphatasen erreicht werden. Damit wird in einer Ausführungsform der Erfindung eine Phosphatase in eine Zielzelle eingebracht, z. B. durch Expression einer Nucleinsäure in der Zielzelle, welche die Phosphatase codiert. Die Expression einer Phosphatase kann auf spezifische Gewebe beschränkt sein, z. B. durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors, oder durch Verwenden eines Vehikels, wodurch das Gen zielgerichtet in ein spezifisches Gewebe eingebracht wird. MAP-Kinase-spezifische Phosphatasen sind beschrieben worden. Zum Beispiel sind MKP1 und PAC1 Phosphatasen, welche spezifisch Erk2 und p38 inaktivieren (Ward et al. (1994) Nature 367: 651)(siehe oben). Wie vorstehend dargestellt, dephosphoryliert und inaktiviert CL100 spezifisch Erk2.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität einer Kinase in einer Zelle moduliert, z. B. inhibiert, indem die Expression des Gens moduliert wird, welches die Kinase codiert. In einer exemplarischen Ausführungsform wird die Expression des Gens durch Modulation der Transkription des Gens moduliert, z. B. mit Verbindungen, welche ein regulatorisches Element innerhalb des Gens beeinflussen. Solche Verbindungen sind in der Literatur beschrieben. Gen- Transkription eines spezifischen Gens, welches eine MAP-Kinase codiert, z. B. eine JNK, kann auch unter Verwendung der Triplex-Technologie inhibiert werden, welche nachfolgend weiter beschrieben ist.
In einer anderen Ausführungsform wird die Menge einer MAP- Kinase oder eines Proteins, welches eine MAP-Kinase reguliert, in einer Zelle durch Antikörper moduliert, z. B. durch intrazelluläre Antikörper, z. B. Einzelketten-Antikörper. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind hierin weiter beschrieben.
Die Expression eines MAP-Kinase-Gens kann auch durch Verwendung von Antisense-Nucleinsäuren inhibiert werden. Solche Nucleinsäuren sind für einige MAP-Kinasen kommerziell erhältlich. Ein Antisense-Oligonucleotid, welches z. B. die Herstellung von ERK1 und ERK2 inhibiert, ist bei BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA; Katalog #) erhältlich. Das Antisense-Oligonucleotid ist ein 17-mer- Oligodesoxynucleotid mit allen Phosphothioat-Verknüpfungen. Es ist gegen eine Sequenz gerichtet, welche in den p42 und p44 MAP-Kinase-Isoformen (ERK2, ERK1) identisch und in Mensch, Maus und Ratte konserviert ist (E. M. Sale et al. EMBO J. 1995 14 674). Es gab keine Wirkung auf die Expression der MAP- Kinase-Homologen p38 und JNK und keine Wirkung auf MEK- Aktivierung (C. J. M. Robinson et al. Biochem. J. 1996 320 123). Wie hierin weiter beschrieben, können Antisense- Nucleinsäuren auch hergestellt werden. In noch einer anderen Ausführungsform wird die mRNA, welche die MAP-Kinase codiert, durch Verwendung eines Ribozyms abgebaut, wie hierin weiter beschrieben.
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Aktivität einer Kinase dadurch reguliert, dass ihre zelluläre Lokalisation reguliert wird. So ist gezeigt worden, dass ein cytoplasmatisches Protein, welches spezifisch an JNK bindet (JIP-1), die cytoplasmatische Zurückhaltung von JNK verursachte, was zu einer Inhibierung der JNK-regulierten Genexpression führte. Damit kann die Aktivität von JNK in einer Zelle dadurch inhibiert werden, dass die Zelle mit einem Mittel in Kontakt gebracht wird, welches die Zurückhaltung von JNK im Zytoplasma verursacht. Dieses kann z. B. durch Expression von JIP-1 in einer Zelle erreicht werden.
Die Nucleinsäure-Sequenzen der MAP-Kinasen sind in der Literatur sowie in GenBank erhältlich. Darüberhinaus sind rekombinant hergestellte MAP-Kinasen und Substrate kommerziell erhältlich. Diese können z. B. verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von MAP- Kinasen modulieren. Rekombinante JNK (Ratte) z. B. ist von BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA; Katalog # SE-150) erhältlich. Ein GST-Fusionsprotein der c-jun (1-79) Aktivierungsdomäne ist von BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA; Katalog # SE-151) kommerziell erhältlich.
Antikörper gegen Mitglieder der MAP-Kinase-Familien sind kommerziell erhältlich, z. B. von BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (La Jolla) und Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Antikörper gegen Erk- Kinasen sind z. B. in der europäischen Patentanmeldung EP 0 735 370 von Takeda Chemical Industries, Ltd. beschrieben.
In einer spezifischen Ausführungsform, in welcher der Modulator durch eine Nucleinsäure codiert wird, welche einer Zielzelle verabreicht wird, ist es wünschenswert die Nucleinsäure, welche den Inhibitor codiert, funktionell mit regulatorischen Elementen zu koppeln, welche die Transkription der Nucleinsäure unter angemessenen Bedingungen erlauben. Es ist beabsichtigt, dass regulatorische Elemente Promotoren, Enhancer, Silencer und Polyadenylierungs-Sequenzen beinhalten. Die Nucleinsäure, welche den Inhibitor codiert, wird vorzugsweise ebenfalls in ein Plasmid inseriert, um dabei einen Expressionsvektor herzustellen. Expressionsvektoren, welche angemessene regulatorische Elemente zur Expression in eukaryotischen Zellen enthalten, sind kommerziell erhältlich.

II. Andere erfindungsgemäße Verbindungen

Andere erfindungsgemäße Verbindungen beinhalten Verbindungen, welche TNF-α inhibieren. Solche Verbindungen beinhalten diejenigen, welche die Herstellung von TNF-α inhibieren, sowie diejenigen, welche spezifisch dessen Aktivität inhibieren, z. B. durch Behindern dessen Wechselwirkung mit einem Rezeptor. Ein Inhibitor kann z. B. ein Antikörper sein, welcher spezifisch an TNF-α bindet und die Aktivität von TNF-α inhibiert. Noch andere inhibitorische Verbindungen beinhalten Inhibitoren eines TNF-α-Rezeptors oder eines Moleküls, welches damit wechselwirkt, wie das MADD- Protein (Schievella et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 12069). Damit sind Antisense- und Triplex-Moleküle, welche die Expression von TNF-α, eines TNF-α-Rezeptors oder eines Moleküls, welches mit TNF-α oder seinem Rezeptor wechselwirkt, wie MADD, inhibieren, innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Eine andere bevorzugte Verbindung zur Verwendung für die erfindungsgemäßen Verfahren umfasst Natriumsalicylat (NaSal) und Derivate davon. Wie in den Beispielen beschrieben, wurde hierin in der Tat gezeigt, dass NaSal die JNK-Aktivierung durch TNF-α in Adipocyten inhibiert und TNF-α-induzierte Lipolyse in Adipocyten inhibiert. Es wurde auch beschrieben, dass NaSal in der Lage ist, TNF-induzierte Aktivierung von JNR und p42/p44 MAP-Kinasen in FS4-Fibroblasten zu inhibieren (Schwenger et al. (1997) P. N. A. S. USA 94: 2869) bzw. Schwenger et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 8089).
Ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung sind Verbindungen, welche natürlich auftretende oder nicht natürlich auftretende Agonisten des Peroxisom-Proliferatoraktivierten Rezeptors-γ (PPAR-γ) sind. Diese Mittel sind häufig in der Lage, die Differenzierung von Adipocyten zu verstärken. Bevorzugte PPAR-γ-Agonisten umfassen Prostaglandine, Thiazolidinedione, Prostaglandin-Derivate, einschließlich Prostanoide wie 15-Desoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2 (als "PGJ2" bezeichnet) und eine Vielzahl nicht-steroidaler antiinflammatorischer Wirkstoffe (non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)(Lechmann et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 3406).
Spezielle Beispiele nicht natürlich auftretender PPAR-γ- Liganden umfassen Thiazolidin (TZD)-Derivate, welche als Thiazolidinedione bekannt sind, z. B. Proglitazon (auch als AD-4833 und U-72107E bekannt), Troglitazon (auch als CS-045 bekannt)(Sankyo) und C1-991 (Parke-Davis), BRL 49653, Ciglitazon, Englitazon und chemische Derivate davon. Siehe z. B. die U.S.-Patente Nr. 4.812.570; 4.775.687; 4.725.610; 4.582.839 und 4.572.912 als exemplarische Quellen solcher Verbindungen. Die U.S.-Patente 5.521.201 und die europäischen Patentanmeldungen 0008203, 0139421, 0155845, 0177353, 0193256, 0207581 und 0208420 und das Chem. Pharm. Bull 30 (10) 3580- 3600 beziehen sich auf Thiazolidinedion-Derivate und beschreiben kommerzielle Quellen/synthetische Schemata für eine Vielzahl von TZD- und TZD-ähnlichen Analogen, welche für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wertvoll sein können.
Spezielle Beispiele für natürlich auftretende PPAR-γ- Liganden umfassen Arachidonsäure-Metabolite, z. B. Prostaglandin J&sub2; (PGJ&sub2;)-Metabolite, z. B. 15-Desoxy-Δ12,14-Prostaglandin J&sub2;. Prostaglandin J&sub2;-Dehydrierungs- und Isomerisierungs- Produkte, umfassend Δ12,14-PGJ&sub2; und 15-Desoxy-Δ12,14-PGJ&sub2; konnten nachweislich durch Inkubation von Prostaglandin D&sub2; (PGD&sub2;) in Anwesenheit von menschlichem Plasma oder menschlichem Serum- Albumin auftreten (Fitzpatrick and Wyvalda (1983) J. Biol. Chem. 258: 11713-18). Es konnte gezeigt werden, dass Δ12,14-PGJ&sub2; ein wichtiger PGD&sub2;-Metabolit ist, welcher in menschlichem und Affen-Urin anwesend ist, was darauf hinweist, dass PGJ&sub2;- Metabolite auch in vivo gefunden werden (Hirata et al. (1994) PNAS USA 91: 11192-96).
Beispiele für PPAR-γ-Agonisten sind auch in den PCT- Veröffentlichungen WO 91/07107; WO 92/02520; WO 94/01433; WO 89/08651; WO 95/18533; WO 95/35108; der japanischen Patent- Veröffentlichung 69383/92 und den U.S.-Patenten 5.523.314; 5.521.202; 5.510.360; 5.498.621; 5.496.621; 5.494.927; 5.480.896; 5.478.852; 5.468.762; 5.464.856; 5.457.109; 4.287.200; 4.340.605; 4.438.141; 4.444.779; 4.461.902; 4.572.912; 4.687.777; 4.703.052; 4.725.610; 4.873.255; 4.897.393; 4.897.405; 4.918.091; 4.948.900; 5.002.953; 5.061.717; 5.120.754; 5.132.317; 5.194.443; 5.223.522; und 5.260.445 offenbart.
Beispielhafte PPAR-γ-Agonisten können unter solchen Verbindungen ausgewählt werden wie 5-[4-[2-(5-Ethylpyridin-2- yl)ethoxyl]benzyl]thiadiazolidin-2,4-dion: (Pioglitazon); 5- [4-[(1-Methylcyclohexyl)methoxy]benzyl]thiadiazolidin-2,4- dion: (Ciglitazone); 5-[(2-Benzyl-2,3-Dihydrobenzopyran)-5- ylmethyl]thiadiazolin-2,4-dion: (Englitazon); 5-[(2-Alkoxy-5- pyridyl)methyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[(substituiertes-3- pyridyl)methyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-(2-Methyl-2-phenylpropoxy)benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[3-(4-Methoxyphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]-methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(3,4-Difluorophenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]-methoxyl]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-Chloro-2-fluorophenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-Trifluoromethoxyphenyl)-2-oxooxazolidin-5- yl]methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[2-[3-(4-trifluoromethylphenyl)-2- oxooxazolidin-5-yl]ethoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4- [2-[3-(4-Chloro-2-fluorophenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]ethoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-Pyridyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]-benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[[4-[(3,4- Dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzpyran-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidindion: (Troglitazon); 4-(2- Naphthylmethyl)-1,2,3,5-oxathiadiazol-2-oxid; 5-[4-[2-[N- (Benzoxazol-2-yl)-N-methylamino]ethoxy]benzyl]-5-methylthiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-[2,4-Dioxo-5-phenylthiazolidin-3- yl)ethoxy]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-[N-Methyl-N- (phenoxycarbonyl)amino]ethoxy]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5- [4-(2-phenoxyethoxy)benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-(4- Chlorophenyl)ethylsulfonyl]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4- [3-(5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)propionyl]benzyl]thiazolidin- 2,4-dion; 5-[[4-(3-Hydroxy-1-methylcyclohexyl)methoxy]benzyl] thiadiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-(5-Methyl-2-phenyloxazol-4- yl)ethoxyl]benzyl]thiadiazolidin-2,4-dion; 5-[[2-(2- Naphthylmethyl)benzoxazol]-5-ylmethyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[2-(3-Phenylureido)ethoxyl]benzyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[2-[N-(Benzoxazol-2-yl)-N-methylamino]ethoxy]benzy]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[3-(5-Methyl-2-phenyloxazol-4- yl)propionyl]benzyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[2-(5-Methyl-2- phenyloxazol-4-ylmethyl)benzfuran-5-ylmethyl]-oxazolidin-2,4- dion; 5-[4-[2-[N-Methyl-N-(2-pyridyl)amino]ethoxy]benzyl]- thiazolidin-2,4-dion; und 5-[4-[2-[N-(Benzoxazol-2-yl)-Nmethylamino]ethoxy]benzyl]-oxazolidin-2,4-dion.
Andere PPAR-γ-Agonisten können durch Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden. Solche Verfahren können insbesondere dafür verwendet werden, um Bibliotheken von Verbindungen zu durchmustern.
In einer anderen Ausführungsform kombinieren die erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung von PPAR-γ-Agonisten in Verbindung mit einem oder mehreren Modulatoren von MAP- Kinase-Wegen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren durch gemeinsame Behandlung praktiziert werden, wobei ein PPAR-γ-Agonist wie vorstehend beschrieben und ein Inhibitor von JNK-1 verwendet werden. Der Begriff "in Kombination" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Wirkstoffe im Wesentlichen gleichzeitig verabreicht werden, entweder simultan oder aufeinanderfolgend. Wenn sie aufeinanderfolgend verabreicht werden, ist zu Beginn der Verabreichung der zweiten Verbindung die erste der beiden Verbindungen vorzugsweise noch in wirkungsvollen Konzentrationen an der zu behandelnden Stelle nachweisbar.
Auch in Betracht gezogen sind Chemikalien, welche die endogene Herstellung von Arachidonsäure-Metaboliten stimulieren, wenn sie systemisch oder in vitro verabreicht werden. Eine verstärkte Herstellung von endogenen Arachidonsäure-Metaboliten kann durch Stimulation von mindestens einem der nachfolgenden Vorgänge auftreten, nämlich die Freisetzung von Arachidonsäure von Vorläufer- Glycerophospholipiden, die Oxygenierung von freier Arachidonsäure durch ein Cyclo-Oxygenase-Enzym und die Verstoffwechslung von Prostaglandin H&sub2; zu einem spezifischen biologisch aktiven Prostaglandin-Metaboliten (siehe Übersichtsartikel Smith, W. (1989) Biochem. J., 259: 315-24).
Im Allgemeinen wird es bevorzugt werden, einen PPAR-γ- Agonisten auszuwählen, der spezifisch die PPAR-γ-Isoform bezüglich von z. B. PPAR-α und/oder PPAR-δ aktiviert. Gemäß dieser hier vorliegenden Erfindung kann die Spezifität für die PPAR-γ-Isoform unerwünschte Nebeneffekte reduzieren, wie die PPAR-α-vermittelte Hepatokarzinogenese. Im Besonderen aktiviert der PPAR-γ-Agonist des vorliegenden Verfahrens vorzugsweise PPAR-γ-abhängige Transkription in einer Konzentration von mindestens einer Größenordnung geringer als diejenige, welche PPAR-γ-abhängige Transkription aktiviert, und sogar mehr bevorzugt in einer Konzentration von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Größenordnungen geringer.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. JNK-1-Inhibitoren, Zelltyp-spezifisch. So kann z. B. eine Verbindung zielgerichtet an eine Stelle gebracht werden, wo Lipolyse auftritt. Das zielgerichtete Verabreichen kann dadurch erreicht werden, dass die Verbindung in einem Vehikel gegeben wird, welches bestimmte Zelltypen spezifisch erkennt. Das Verabreichungs-Vehikel kann z. B. an einen Antikörper gekoppelt sein, welcher an ein Antigen auf der Oberfläche der Zielzelle bindet. Alternativ dazu kann die Verbindung selbst an ein Zielmolekül, z. B. einen Antikörper, gekoppelt sein. Dort wo der Inhibitor ein Protein ist, welches von einer Nucleinsäure codiert wird, die einer Zelle verabreicht wurde, kann die Spezifität dadurch erreicht werden, dass ein Zelltyp- spezifisches regulatorisches Element verwendet wird, um damit die Expression auf spezifische Zelltypen einzugrenzen. Solche regulatorischen Elemente sind im Stand der Technik gut bekannt.

4. Antisense-Ribozym- und Triplex-Verfahren

Nachfolgend offenbart ist eine Beschreibung, wie Antisense-Moleküle und Ribozyme entworfen und hergestellt werden, um die Aktivität von MAP-Kinase-Wegen zu modulieren, im Besonderen die JNK- und MAP/ERK-Kinase-Wege zu inhibieren und/oder den p38-Weg zu stimulieren. Die Erfindung betrifft auch Antisense-Moleküle und Ribozyme zur Blockade der Expression von negativen Regulatoren von PPAR-γ. Die Nucleotid- und Aminosäure-Sequenzen der entsprechenden Kinasen sind vorstehend dargestellt und die nachfolgend dargestellte Lehre bezieht sich im Allgemeinen auf diese Nucleinsäuren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Antisense"-Therapie auf die Verabreichung oder in situ-Herstellung von Oligonucleotid-Molekülen oder deren Derivate, welche unter zellulären Bedingungen spezifisch mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA hybridisieren (z. B. binden), welche ein Mitglied der MAP-Kinase-Wege oder ein Protein, welches solche reguliert, codieren, um auf diese Art und Weise die Expression des Mitglieds des MAP-Kinase-Wegs oder eines Proteins, welches ein solches reguliert, zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren der Transkription und/oder der Translation. Das Protein, gegen welches ein Antisense-Molekül hergestellt wird, wird hierin als "Zielprotein" bezeichnet und das Gen, welches das Zielprotein codiert, wird als das "Zielgen" bezeichnet. Das Antisense-Oligonucleotid wird ausgewählt, um die JNK- und/oder die ERK/MAP-Kinase-Wege zu inhibieren oder den p38-Weg zu stimulieren. Die Bindung des Antisense-Moleküls kann durch herkömmliche Basenpaar-Komplementarität oder, zum Beispiel im Falle der Bindung an Doppelstrang-DNA, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der DNA erfolgen. Im Allgemeinen bezieht sich "Antisense"-Therapie auf den Bereich von Verfahren, welche im Allgemeinen im Stand der Technik verwendet werden, und umfasst jede beliebige Therapie, welche sich auf spezifische Bindung an Oligonucleotid-Sequenzen stützt.
Ein erfindungsgemäßes Antisense-Konstrukt kann zum Beispiel als ein Expressionsplasmid verabreicht werden, welches, wenn es in der Zelle transkribiert wird, RNA produziert, welche zumindestens zu einem einzigartigen Teil der zellulären mRNA komplementär ist, die ein Ziel-Protein codiert. In einer anderen Ausführungsform ist das Antisense- Konstrukt eine Oligonucleotid-Sonde, welche ex vivo hergestellt wird und welche, wenn sie in die Zelle eingebracht wird, die Inhibierung der Expression durch Hybridisierung mit der mRNA und/oder der genomischen Sequenz des Zielgens verursacht. Solche Oligonucleotid-Sonden sind vorzugsweise modifizierte Oligonucleotide, welche gegen endogene Nucleasen resistent sind, z. B. Exonucleasen und/oder Endonucleasen, und sind deshalb in vivo stabil. Exemplarische Nucleinsäure-Moleküle für die Verwendung als Antisense-Oligonucleotide sind Phosphoamidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-Analoge von DNA (siehe auch die U.S.-Patente 5.176.998; 5.264.564 und 5.256.775). Zusätzlich sind allgemeine Ansätze zur Herstellung von Oligomeren, welche für die Antisense-Therapie zweckmäßig sind, als Übersicht zusammengefasst worden, zum Beispiel von Van der Krol et al. (1988) BioTechniques 6: 958-976; und Stein et al. (1988) Cancer Res. 48: 2659-2668. Im Hinblick auf Antisense-DNA werden Oligodesoxyribonucleotide bevorzugt, welche von der Translations-Initiationsstelle abstammen, z. B. zwischen der -10- und +10-Region der interessierenden Ziel- Nucleotidsequenz.
Antisense-Ansätze beinhalten das Entwerfen von Oligonucleotiden (entweder DNA oder RNA), welche zu einer ZielmRNA komplementär sind. Die Antisense-Oligonucleotide werden an die Ziel-mRNA-Transkripte gebunden und dadurch die Translation verhindert. Absolute Komplementarität ist nicht erforderlich, obwohl sie bevorzugt wird. Im Falle von doppelsträngigen Antisense-Nucleinsäuren kann ein Einzelstrang der Doppelstrang-DNA auf diese Art getestet werden, oder Triplex- Bildung kann getestet werden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird sowohl vom Grad der Komplementarität als auch der Länge der Antisense-Nucleinsäuren abhängen. Im Allgemeinen gilt, je länger die hybridisierende Nucleinsäure ist, um so mehr Basen- Fehlpaarungen mit einer RNA kann diese enthalten und noch immer einen stabilen Doppelstrang ausbilden (oder Triplex, wie es der Fall sein kann). Ein Fachmann kann unter Verwendung von Standardverfahren einen tolerierbaren Grad an Fehlpaarungen feststellen, um den Schmelzpunkt des hybridisierten Komplexes zu bestimmen.
Oligonucleotide, welche zu dem 5'-Ende der mRNA komplementär sind, z. B. die 5'-nicht translatierte Sequenz bis zum und umfassend das AUG-Initiationscodon, sollte am wirkungsvollsten funktionieren, um die Translation zu inhibieren. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass Sequenzen, welche zu den 3'-nicht translatierten Bereichen der mRNAs komplementär sind, ebenfalls bei der Inhibierung der Translation von mRNAs wirkungsvoll sind (Wagner, R. 1994. Nature 372: 333). Deshalb könnten Oligonucleotide, welche entweder zu den 5'- oder 3'- nicht translatierten, nicht- codierten Regionen eines interessierenden Gens komplementär sind, in einem Antisense-Ansatz verwendet werden, um die Translation der interessierenden endogenen mRNA zu inhibieren. Oligonucleotide, welche zu der 5'- nicht translatierten Region der mRNA komplementär sind, sollten vorzugsweise das Komplement des AUG-Startcodons umfassen. Antisense- Oligonucleotide, welche zu den codierenden Bereichen der mRNA komplementär sind, sind weniger wirkungsvolle Inhibitoren der Translation, können aber auch gemäß der Erfindung verwendet werden. Gleich ob sie entworfen wurden, um mit dem 5'-, 3'- oder mit der codierenden Region der Ziel-mRNA zu hybridisieren, sollten die Antisense-Nucleinsäuren mindestens 6 Nucleotide lang sein und sind vorzugsweise weniger als etwa 100 und mehr bevorzugt weniger als etwa 50, 25, 17 oder 10 Nucleotide lang.
Unabhängig von der Wahl der Zielsequenz wird bevorzugt, dass zuerst in vitro-Studien durchgeführt werden, um die Fähigkeit der Antisense-Oligonucleotide Gen-Expression zu inhibieren zu quantifizieren. Es wird bevorzugt, dass diese Studien Kontrollen verwenden, welche zwischen Antisense-Gen- Inhibition und unspezifischen biologischen Wirkungen von Oligonucleotiden unterscheiden. Es wird auch bevorzugt, dass diese Studien die Mengen an Ziel-RNA oder -Protein mit denjenigen einer internen Kontroll-RNA oder einem Kontroll- Protein vergleichen. Zusätzlich ist vorgesehen, dass die Ergebnisse, die mit dem Antisense-Oligonucleotid erhalten werden, mit denjenigen verglichen werden, die unter Verwendung eines Kontroll-Oligonucleotids erhalten werden. Es wird bevorzugt, dass das Kontroll-Oligonucleotid von ungefähr der gleichen Länge wie das Test-Oligonucleotid ist und dass die Nucleotid-Sequenz des Oligonucleotids sich von der Antisense- Sequenz nicht mehr unterscheidet, als notwendig ist, um die spezifische Hybridisierung an die Ziel-Sequenz zu verhindern. Die Oligonucleotide können DNA oder RNA oder chimäre Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen davon, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Das Oligonucleotid kann an der Basen-Einheit, der Zucker-Einheit oder dem Phosphat-Rückgrat modifiziert sein, zum Beispiel um die Stabilität des Moleküls, die Hybridisierung, etc. zu verbessern. Das Oligonucleotid kann andere angehängte Gruppen wie Peptide (z. B. für die zielgerichtete Verabreichung an Rezeptoren auf Wirtszellen), oder Mittel, welche den Transport durch die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; die PCT- Veröffentlichung Nr. WO 88/09810, veröffentlicht am 15. Dezember 1988), oder durch die Blut-Hirnschranke (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134, veröffentlicht am 25. April 1988) erleichtern, Hybridisierungs-gesteuerte Spaltungsmittel (siehe z. B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) oder interkalierende Mittel (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549), umfassen. Zu diesem Zweck können die Oligonucleotide mit einem anderen Molekül gepaart sein, z. B. einem Peptid, einem Hybridisierungs-gesteuerten Vernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem Hybridisierungs-gesteuerten Spaltungsmittel, etc.
Das Antisense-Oligonucleotid kann mindestens eine modifizierte Basen-Einheit umfassen, welche ausgewählt ist aus, jedoch nicht eingeschränkt ist auf, der/die Gruppe, welche 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5- Joduracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcystosin, 5-(Carboxyhydroxy-tiethyl)-uracil, 5-Carboxy-methylamino-methyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethyl-aminomethyl-uracil, Dihydro-uracil, β- D-Galactosyl-queosin, Inosin, N6-Isopentenyl-adenin, 1- Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2- Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5- Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyl-uracil, 5-Methoxy-aminomethyl-2-thio-uracil, β-D- Mannosyl-queosin, 5-Methoxy-carboxymethyl-uracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure(v), Wybutoxosin, Pseudo-uracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thio-uracil, 2-Thio-uracil, 4-Thio-uracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxy-essigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thio-uracil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)-uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin umfasst.
Das Antisense-Oligonucleotid kann auch mindestens eine modifizierte Zucker-Einheit umfassen, welche ausgewählt ist aus der, jedoch nicht eingeschränkt ist auf die Gruppe, welche Arabinose, 2-Fluor-arabinose, Xylulose und Hexose umfasst.
Das Antisense-Oligonucleotid kann auch ein neutrales Peptid-ähnliches Rückgrat enthalten. Solche Moleküle werden als Peptid-Nucleinsäure (peptide nucleic acid; PNA)-Oligomere bezeichnet und sind z. B. in Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670 und in Eglom et al. (1993) Nature 356: 566, beschrieben. Ein Vorteil von PNA-Oligomeren ist ihre Fähigkeit, aufgrund des neutralen Rückgrats der DNA im Wesentlichen unabhängig von der Ionenstärke des Mediums an komplementäre DNA zu binden. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonucleotid mindestens ein modifiziertes Phosphat-Rückgrat, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, welche ein Phosphothioat, ein Phosphodithioat, ein Phosphoamidothioat, ein Phosphoamidat, ein Phosphodiamidat, ein Methylphosphonat, einen Alkylphosphotriester und ein Formacetal oder ein Analoges davon umfasst.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense- Oligonucleotid ein αanomerisches Oligonucleotid. Ein α- anomerisches Oligonucleotid bildet spezifische Doppelstrang- Hybride mit komplementärer RNA aus, in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen (3-Untereinheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al. 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641). Das Oligonucleotid ist ein 2'-0-Methylribonucleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA- Analoges (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können anhand von Standardverfahren hergestellt werden, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. durch Verwendung eines automatischen DNA- Syntheseautomaten (z. B. kommerziell erhältliche von Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Als Beispiele können Phosphothioat- Oligonucleotide nach dem Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) synthetisiert werden, Methylphosphonat- Oligonucleotide können unter Verwendung von Glas-Polymer-Trägern mit kontrollierter Porengröße (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 7448-7451) hergestellt werden, etc.
In einer anderen Ausführungsform wird das Antisense-Molekül durch die Zugabe von flankierenden Sequenzen von Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden an das 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls stabilisiert.
Während Antisense-Nucleotide verwendet werden können, welche komplementär zu der codierenden Region des Ziel-Gens sind, werden diejenigen, welche zu der transkribierten nicht translatierten Region und zu der Region, welche das Initiations-Methionin umfasst, gehören, am meisten bevorzugt.
Die Antisense-Moleküle können an Zellen verabreicht werden, welche das Ziel-Gen in vivo exprimieren. Eine Reihe von Verfahren sind entwickelt worden, um Antisense-DNA oder -RNA an Zellen zu verabreichen; z. B. können Antisense-Moleküle direkt in den Gewebeort injiziert werden oder modifizierte Antisense-Moleküle, welche entworfen wurden, um zielgerichtet die gewünschten Zellen zu erreichen (z. B. Antisense-Oligonucleotide, gekoppelt an Peptide oder Antikörper, welche spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf der Oberfläche der Ziel-Zelle exprimiert werden) können systemisch verabreicht werden.
Es kann jedoch unter bestimmten Umständen schwierig sein, intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Oligonucleotide zu erhalten, welche ausreichend sind, die Translation der endogenen mRNA-Moleküle zu supprimieren. Deshalb verwendet ein bevorzugter Ansatz ein rekombinantes DNA-Konstrukt, in welchem das Antisense- Oligonucleotid unter die Kontrolle eines starken Pol III- oder Pol II-Promotors gebracht wurde. Die Verwendung eines solchen Konstrukts zur Transfektion von Ziel-Zellen in dem Patienten wird in der Transkription ausreichender Mengen einzelsträngiger RNA- Moleküle resultieren, welche komplementäre Basenpaarungen mit den endogenen Ziel-Transkripten ausbilden werden und dadurch die Translation der Ziel-mRNA verhindern. Es kann zum Beispiel ein Vektor in vivo derart eingebracht werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird und die Transkription einer Antisense-RNA regelt. Ein solcher Vektor kann episomal verbleiben oder chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA herzustellen. Solche Vektoren können durch rekombinante DNA-Technologie-Verfahren konstruiert werden, welche zum Standard auf dem Fachgebiet gehören. Vektoren können Plasmide, Viren oder andere auf dem Fachgebiet bekannte sein, welche für Replikation und Expression in Säugerzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, welche die Antisense-RNA codiert, kann durch jeden beliebigen Promotor erfolgen, von dem auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass er in Säuger-, vorzugsweise menschlichen Zellen wirkt. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist and Chambon 1981, Nature 290: 304-310), den Promotor, welcher in der 3'-langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarcoma-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), den Herpes-Thymidin- Kinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), die regulatorische Sequenz des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42), etc. Jeder Typ von Plasmid, Cosmid, YAC oder viralem Vektor kann verwendet werden, um das rekombinante DNA-Konstrukt herzustellen, welches direkt in den Gewebsort eingebracht werden kann. Alternativ können virale Vektoren verwendet werden, welche selektiv das gewünschte Gewebe infizieren, in welchem Fall die Verabreichung auf einem anderen Weg ausgeführt werden kann (z. B. systemisch).
Ribozym-Moleküle, welche entworfen wurden, um mRNA-Transkripte von Interesse katalytisch zu spalten, z. B. MAPK-mRNA-Transkripte, können ebenfalls verwendet werden, um die Translation von Ziel-mRNA und die Expression von Ziel-Proteinen zu verhindern (siehe z. B. PCT Internationale Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225 und das US-Patent Nr. 5.093.246). Während Ribozyme, welche mRNA an spezifischen Erkennungssequenzen spalten, verwendet werden können, um Ziel-mRNA-Moleküle zu zerstören, wird die Verwendung von Hammerhead-Ribozymen bevorzugt. Hammerhead-Ribozyme spalten mRNA- Moleküle an Stellen, welche durch flankierende Regionen vorbestimmt sind, die komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA ausbilden. Die einzige Bedingung ist, dass die Ziel-mRNA die folgende Sequenz von zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Herstellung von Hammerhead-Ribozymen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und ist in Haseloff and Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591 vollständiger beschrieben. Es gibt eine Anzahl potenzieller Hammerhead-Ribozym- Spaltstellen innerhalb der Nucleotidsequenz menschlicher Ziel-Gene. Das Ribozym wird vorzugsweise so entworfen, dass die Spaltungs- Erkennungsstelle nahe dem 5'-Ende der Ziel-mPKA lokalisiert ist; d. h. um die Wirksamkeit zu erhöhen und die intrazelluläre Anreicherung nicht-funktioneller mBKA-Transkripte zu minimieren.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung beinhalten auch RNA- Endoribonucleasen (hierin nachfolgend als "Cech-Typ-Ribozyme" bezeichnet), wie die eine, welche natürlicherweise in Tetrahymena thermophila vorkommt (bekannt als die IVS, oder L-19 IVS RNA) und welche ausführlich von Thomas Cech und Mitarbeitern beschrieben wurde (Zaug et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug et al., 1986, Nature, 324: 429-433; veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO 88/04300 von University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216). Die Cech-Typ-Ribozyme haben einen aktiven Bereich von 8 Basenpaaren, welcher an eine Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA stattfindet. Die Erfindung umfasst diese Cech-Typ-Ribozyme, welche auf die 8 Basenpaar-aktiver Bereich- Sequenzen gerichtet sind, die in einem MAPK-Gen vorliegen.
Wie in dem Antisense-Ansatz, können die Ribozyme aus modifizierten Oligonucleotiden zusammengesetzt sein (z. B. für eine verbesserte Stabilität, zielgerichtete Verabreichung, etc.) und sollten für Zellen verabreichbar sein, welche die Ziel-Gene in vivo exprimieren. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung beinhaltet die Verwendung eines DNA-Konstruktes, welches das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Pol III- oder Pol II- Promotors "codiert", derart dass transfizierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms herstellen werden, um die endogenen Ziel-RNA- Moleküle zu zerstören und die Translation zu hemmen. Da Ribozyme anders als Antisense-Moleküle katalytisch sind, ist für die Wirksamkeit eine niedrigere intrazelluläre Konzentration erforderlich.
Endogene Ziel-Gen-Expression kann auch durch Inaktivierung oder "knock-out" des Ziel-Gens oder seines Promotors reduziert werden, indem man eine gerichtete homologe Rekombination verwendet. (siehe z. B. Smithies et al., 1985, Nature 317: 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al., 1989, Cell 5: 313- 321; wovon jede hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Es kann zum Beispiel ein mutiertes, nicht- funktionelles Ziel-Gen (oder eine vollständig andersartige DNA- Sequenz) flankiert durch DNA, welche zu dem endogenen Ziel-Gen homolog ist (entweder den codierenden Regionen oder den regulatorischen Regionen des Ziel-Gens) verwendet werden, zusammen mit oder ohne einen selektierbaren Marker und/oder einen negativen selektierbaren Marker, um Zellen zu transfizieren, die das Ziel-Gen in vivo exprimieren. Die Insertion des DNA-Konstrukts mittels gezielter homologer Rekombination resultiert in der Inaktivierung des Ziel-Gens. Solche Ansätze sind besonders geeignet im landwirtschaftlichen Bereich, wo Modifikationen von Es (embryonalen Stamm)-Zellen verwendet werden können, um tierische Nachkommen mit einer inaktiven MAPK zu erzeugen (siehe z. B. Thomas & Capecchi 1987 und Thompson 1989, oben). Dieser Ansatz kann jedoch zur Verwendung in Menschen angepasst werden, vorausgesetzt dass die rekombinanten DNA-Konstrukte unter Verwendung geeigneter viraler Vektoren direkt verabreicht werden oder in vivo an die erforderliche Stelle zielgerichtet bereitgestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die Expression des endogenen Ziel-Gens durch zielgerichtete Desoxyribonucleotid- Sequenzen verringert werden, welche komplementär zu der regulatorischen Region des Ziel-Gens sind (d. h. den Ziel-Promotor und/oder -Enhancer), wobei Tripelhelix-Strukturen ausgebildet werden, welche die Transkription des Ziel-Gens in den Ziel-Zellen im Körper verhindern. (siehe im Allgemeinen Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6): 569-84; Helene, C. et al., 1992, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 27-36; und Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12): 807-15).
Nucleinsäure-Moleküle, welche zur Tripelhelix-Ausbildung zum Zweck der Hemmung von Transkription verwendet werden, sind vorzugsweise einzelsträngig und aus Desoxyribonucleotiden zusammengesetzt. Die Basenverbindung dieser Oligonucleotide sollte die Tripelhelix-Ausbildung gemäß den Hoogsteen Basenpaarungs-Regeln fördern, welche im Allgemeinen große Abschnitte von entweder Purinen oder Pyrimidinen erfordern, welche auf einem Strang einer Doppelhelix vorliegen. Nucleotid-Sequenzen können Pyrimidin- basierend sein, was in TAT- und CGC-Triplets zwischen den drei assoziierten Strängen der resultierenden Tripelhelix resultieren wird. Die Pyrimidin-reichen Moleküle stellen Basen-Komplementarität zu einem Purin-reichen Bereich eines einzelnen Strangs der Doppelhelix in einer parallelen Orientierung zu dem Strang bereit. Zusätzlich können Nucleinsäuremoleküle ausgewählt werden, welche Purin-reich sind, welche zum Beispiel einen Strang von G-Resten enthalten. Diese Moleküle werden eine Tripelhelix mit einer DNA- Doppelhelix ausbilden, welche reich ist an GC-Paarungen, in welcher die Mehrzahl der Purin-Reste auf einem einzelnen Strang der zielgerechten Doppelhelix lokalisiert sind, wobei CGC-Triplets zwischen den drei Strängen in der Tripelhelix resultieren.
In einer anderen Ausführungsform können die potenziellen Sequenzen, auf welche die Tripelhelix-Bildung ausgerichtet ist, durch Ausbildung eines sogenannten "switchback"- Nucleinsäuremoleküls erhöht werden. Switchback-Moleküle werden in einer alternativen 5'-3', 3'-5' Art und Weise synthetisiert, derart dass sie zunächst mit einem Strang einer Doppelhelix Basenpaarungen ausbilden und dann mit dem anderen, wodurch die Notwendigkeit eliminiert wird, dass an einem Strang einer Doppelhelix ein großer Bereich von entweder Purinen oder Pyrimidinen anwesend ist.
Erfindungsgemäße Ribozyme und Tripelhelix-Moleküle können durch jedes beliebige Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen hergestellt werden. Diese beinhalten Verfahren zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden und Oligoribonucleotiden, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie zum Beispiel die chemische Festphasen-Phosphoamidit-Synthese. In einer anderen Ausführungsform können Ribozyme und Triplex-Moleküle durch in vitro und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen, welche die Antisense-BKA-Moleküle codieren, hergestellt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine große Vielzahl Von Vektoren eingebracht werden, welche geeignete RNA-Polymerase-Promotoren, wie die T7- oder SP6-Polymerase- Promotoren, enthalten. Alternativ können Ribozym- und Triplex- Molekül-Konstrukte, welche Ribozyme oder Triplex-Moleküle codieren, konstitutiv oder induzierbar, in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor, stabil in Zelllinien eingebracht werden. Diese Verfahren sind hierin in Bezug auf Antisense-Moleküle weiter beschrieben.
Darüberhinaus können zahlreiche gut bekannte Modifikationen von Nucleinsäure-Molekülen als ein Mittel eingeführt werden, die intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Zugabe flankierender Sequenzen von Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden zu dem 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder die Verwendung von Phosphothioat- oder 2' O-Methyl- anstelle von Phsophodiesterase-Kopplungen innerhalb des Oligodesoxyribonucleotid-Rückgrats.

5. Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung

Antikörper, welche spezifisch an bestimmte MAP-Kinasen binden, können verwendet werden, um die Aktivierung von MAP- Kinasen erfindungsgemäß zu hemmen. Antikörper können ebenfalls verwendet werden, um MAP-Kinasen nachzuweisen und zum Einsatz in Tests zur Isolierung von Verbindungen, welche die Aktivität von MAP-Kinasen hemmen. Andere Antikörper innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung sind Antikörper, welche an den PPAR-γ-Rezeptor binden und diesen aktivieren.
Anti-MAP-Kinase-Antikörper sind kommerziell erhältlich. Antikörper, einschließlich Anti-PPAR-γ-Antikörper können jedoch auch nach Verfahren hergestellt werden, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Antikörper können z. B. unter Verwendung von Immunogenen, welche von einem MAP-Kinase- Protein oder einem PPAR-γ-Rezeptor abstammen, nach Standardverfahren hergestellt werden, zum Beispiel solchen, die auf cDNA-Sequenzen, anti-Protein/anti-Peptid-Antiseren oder monoclonalen Antikörpern beruhen (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory Manual Hrsg. Harlow and Lane (Cold Spring Harbour Press: 1988)). Ein Säuger, wie eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen, kann mit einer immunogenen Form des Peptids (z. B. ein Säuger-Ziel-Polypeptid oder einem antigenen Fragment, welches in der Lage ist, eine Antikörper-Antwort hervorzurufen, oder einem Fusionsprotein wie vorstehend beschrieben) immunisiert werden. Verfahren, welche einem Protein oder Peptid Immunogenität verleihen, beinhalten die Konjugation an Träger oder andere Verfahren, welche im Fachgebiet gut bekannt sind. Ein immunogener Bereich eines Ziel-Proteins kann in Anwesenheit von Adjuvans verabreicht werden. Das Fortschreiten der Immunisierung kann durch Nachweis von Antikörper-Titern im Plasma oder Serum überprüft werden. Standard-ELISAs oder andere Immuntests können mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden, um Antikörperspiegel zu bewerten. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antikörper immunspezifisch für antigene Determinanten einer JNK eines Säugers.
Nach der Immunisierung eines Säugers mit einer antigenen Präparation eines Ziel-Polypeptids kann ein Anti-Ziel- Polypeptid-Antiserum erhalten werden und, falls erwünscht, können Anti-Ziel-Polypeptid-Antikörper aus dem Serum isoliert werden. Um monoclonale Antikörper herzustellen, können Antikörper-produzierende Zellen (Lymphocyten) von einem immunisierten Tier gewonnen werden und unter Verwendung von standardmäßigen somatischen Zellfusions-Verfahren mit immortalisierenden Zellen wie Myelom-Zellen fusioniert werden, wobei Hybridom-Zellen erhalten werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt und beinhalten z. B. die Hybridom- Technik (ursprünglich entwickelt von Köhler und Milstein (1975), Nature, 256: 495-497), die menschliche B-Zell-Hybridom- Technik (Kutzba et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), und die EBV-Hybridom-Technik, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, LNR. Liss, Inc. S. 77-96) Hybridom-Zellen können immunchemisch auf die Produktion von Antikörpern, welche mit einem erfindungsgemäßen Säuger-Ziel- Polypeptid reagieren, und monoclonale Antikörper, welche aus einer Kultur isoliert wurden, die solche Hybridom-Zellen umfasst, durchmustert werden.
Es ist beabsichtigt, dass der Begriff Antikörper, wie er hierin verwendet wird, Fragmente davon unfasst, welche ebenfalls spezifisch mit einer Säuger-MAP-Kinase oder einem PPAR-γ reaktiv sind. Antikörper können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren fragmentiert werden und die Fragmente auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend für vollständige Antikörper beschrieben, auf ihren Nutzen durchmustert werden. F(ab)&sub2;-Fragmente können z. B. durch Behandeln der Antikörper mit Pepsin hergestellt werden. Das resultierende F(ab)&sub2;- Fragment kann behandelt werden, um Disulfid-Brücken zu reduzieren, wobei F(ab)-Fragmente hergestellt werden. Der erfindungsgemäße Antikörper soll weiterhin bispezifische Einzelketten-, und chimäre-, und humanisierte Moleküle umfassen, welche Affinität für eine MAP-Kinase haben, die durch mindestens eine CDR-Region des Antikörpers vermittelt wird.

6. Verfahren zur Identifikation von Modulatoren der Kinase- Wege

Modulatoren von Kinase-Wegen können in auf Zellenbasierenden Tests oder in in vitro-Tests identifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Modulator durch Durchmusterung nach Verbindungen identifiziert, welche in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen einer Kinase, z. B. JNK-1 und einem Protein, welches mit dieser wechselwirkt (als "Bindungspartner" bezeichnet), wie ein Substrat eines Proteins, welches stromabwärts der Kinase wirkt und welches z. B. die Kinase phosphoryliert oder dephosphoryliert, zu hemmen. In einer anderen Ausführungsform kann ein in vitro-Kinase-Test durchgeführt werden, umfassend eine Kinase und ein Substrat oder eine Stromaufwärts-Kinase und Test-Verbindungen können zu der Umsetzung hinzugegeben werden. Eine solche Umsetzung kann wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt werden.
Zusätzlich können Zell-freie Tests verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche in der Lage sind, mit einer Kinase oder einem Bindungspartner zu wechselwirken, um dabei die Aktivität der Kinase oder des Bindungspartners zu modifizieren. Eine solche Verbindung kann z. B. die Struktur einer Kinase oder eines Bindungspartners modifizieren und dadurch deren Aktivität beeinflussen.
Demgemäß beinhaltet ein exemplarischer erfindungsgemäßer Durchmusterungstest die Schritte des Inkontaktbringens einer Kinase oder eines funktionellen Fragments davon oder eines Kinase-Bindungspartners mit einer Test-Verbindung oder Bibliothek von Test-Verbindungen und des Nachweises der Ausbildung von Komplexen. Für Nachweiszwecke können die Moleküle mit einem spezifischen Marker markiert sein und die Test-Verbindung oder Bibliothek von Test-Verbindungen mit einem davon verschiedenen Marker markiert sein. Die Wechselwirkung einer Test-Verbindung mit einer Kinase oder einem Fragment davon oder einem Kinase-Bindungspartner kann dann durch Bestimmung der Spiegel der beiden Markierungen nach einem Inkubationsschritt und einem Waschschritt bestimmt werden. Die Anwesenheit der beiden Markierungen nach dem Waschschritt ist hinweisend für eine Wechselwirkung.
Eine Wechselwirkung zwischen Molekülen kann auch unter Verwendung von Echtzeit-BIA (Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB) nachgewiesen werden, welche Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR), ein optisches Phänomen, nachweist. Der Nachweis hängt von Veränderungen der Massenkonzentrationen von Makromolekülen an der biospezifischen Grenzfläche ab und erfordert keine Markierung der miteinander wechselwirkenden Partner. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von Test-Verbindungen auf einer Sensor-Oberfläche immobilisiert werden, welche z. B. eine Wand einer Mikro-Durchfluss-Zelle bildet. Eine Lösung, welche die Kinase, ein funktionelles Fragment davon oder einen Bindungspartner enthält, wird dann fortlaufend über die Sensor-Oberfläche gespült. Eine Veränderung in dem Resonanzwinkel, welcher in einer Signalaufzeichnung gezeigt ist, zeigt an, dass eine Wechselwirkung aufgetreten ist. Dieses Verfahren ist z. B. im BIAtechnology-Handbuch von Pharmacia näher beschrieben.
Ein anderer exemplarischer erfindungsgemäßer Durchmusterungstest beinhaltet die Schritte (a) Bildung eines Rektionsgemischs umfassend: (i) eine Kinase oder einen Teil davon, (ii) einen Kinase-Bindungspartner (z. B. ein Substrat oder eine unmittelbare Stromaufwärts-Kinase) und (iii) eine Test-Verbindung; und (b) Nachweis der Wechselwirkung der Kinase und des Kinase-Bindungsproteins. Die Kinase und der Kinase-Bindungspartner können rekombinant hergestellt werden, von einer Quelle, z. B. Plasma, aufgereinigt werden oder chemisch synthetisiert werden, wie hierin beschrieben. Eine statistisch signifikante Veränderung (Steigerung oder Hemmung) der Wechselwirkung der Kinase und des Kinase-Bindungsproteins in Anwesenheit der Test-Verbindung in Bezug auf die Wechselwirkung in Abwesenheit der Test-Verbindung zeigt einen potenziellen Agonisten (Nachahmer oder Verstärker) oder Antagonisten (Inhibitor) von Kinase-Bioaktivität für die Test- Verbindung an. Die Verbindungen dieses Tests können gleichzeitig in Kontakt kommen. In einer anderen Ausführungsform kann eine Kinase zuerst für einen geeigneten Zeitraum mit einer Test-Verbindung in Kontakt kommen, wonach der Kinase-Bindungspartner zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wird. Die Wirksamkeit der Verbindung kann getestet werden, indem Dosis-Antwort-Kurven aus Daten erstellt werden, welche unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Test- Verbindung erhalten wurden. Darüberhinaus kann auch ein Kontroll-Test durchgeführt werden, um eine Basislinie zum Vergleich bereitzustellen. In dem Kontroll-Test wird eine isolierte und gereinigte Kinase oder ein Bindungspartner zu einer Verbindung zugegeben, welche den Kinase-Bindungspartner oder die Kinase enthält, und die Bildung eines Komplexes wird in Anwesenheit der Test-Verbindung quantifiziert.
Die Komplex-Bildung zwischen einer Kinase und einem Bindungspartner kann durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden. Die Modulation der Ausbildung von Komplexen kann unter Verwendung von z. B. nachweisbar markierten Proteinen, wie radioaktiv markiert, fluoreszenz- markiert oder enzymatisch markierte Kinasen oder Bindungspartner, durch Immuntests oder durch chromatographischen Nachweis quantifiziert werden.
Typischerweise wird es wünschenswert sein, entweder die Kinase oder deren Bindungspartner zu immobilisieren, um die Abtrennung der Komplexe von nicht-komplexierten Formen von einem oder beiden Proteinen zu erleichtern, sowie um die Automatisierung des Tests zu gewährleisten. Die Bindung der Kinase an einen Bindungspartner kann in jedem beliebigen Gefäß durchgeführt werden, welches dafür geeignet ist, die Reaktionspartner zu enthalten. Beispiele beinhalten Platten mit Mikro-Vertiefungen (Mikrotiterplatten), Teströhrchen und Mikro-Zentrifugen-Röhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, welches eine Domäne hinzufügt, die dem Protein erlaubt, an eine Matrix gebunden zu werden. Glutathion-S-Transferase/Kinase (GST/Kinase)- Fusionsproteine können z. B. an Glutathion-Sepharose-Kügelchen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiter-Platten adsorbiert werden, welche dann mit dem Bindungspartner, z. B. einem ³&sup5;S-markierten Bindungspartner und der Testverbindung kombiniert werden und das Gemisch wird unter Bedingungen, welche für Komplexbildung förderlich sind, z. B. bei physiologischen Bedingungen für Salz- und pH-Wert, obwohl ein wenig stringentere Bedingungen wünschenswert sein können, inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kügelchen gewaschen, um alles an ungebundener Markierung zu entfernen und die Matrix wird immobilisiert und die radioaktive Markierung direkt bestimmt (z. B. werden die Kügelchen in eine Szintillationsflüssigkeit gegeben) oder im Überstand, nachdem die Komplexe nachfolgend dissoziiert sind. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden, durch SDS-PAGE aufgetrennt werden und die Menge an Kinase oder Bindungspartner, welche in der Kügelchen-Fraktion gefunden wird, anhand des Gels unter Verwendung von Standard- Elektrophorese-Techniken, wie in den anhängigen Beispielen beschrieben, quantifiziert werden.
Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrices für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Test sind ebenfalls erhältlich. Beispielsweise kann entweder die Kinase oder deren verwandter Bindungspartner unter Verwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Beispielsweise können biotinylierte Kinase-Moleküle aus Biotin-NHS (N-Hydroxy-Succinimid) unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet gut bekannt sind (z. B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) hergestellt werden und in den Vertiefungen von Streptavidinbeschichteten Platten mit 96 Vertiefungen (well) immobilisiert werden (Pierce Chemical). In einer anderen Ausführungsform können Antikörper, welche mit der Kinase reagieren, an die Vertiefungen der Platte derivatisiert werden und die Kinase kann durch Antikörper-Konjugation in den Vertiefungen festgehalten werden. Wie vorstehend werden Präparationen eines Bindungsproteins und eine Test-Verbindung in den Kinasepräsentierenden Vertiefungen der Platte inkubiert und die Menge an Komplexen, welche in der Vertiefung zurückgehalten wird, kann quantifiziert werden. Exemplarische Verfahren zum Nachweis solcher Komplexe, zusätzlich zu denjenigen, welche vorstehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, beinhalten Immunnachweis von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, welche mit dem Bindungspartner reagieren oder welche mit der Kinase reagieren und mit dem Bindungspartner konkurrieren; sowie Enzym-gekoppelte Tests, welche sich auf den Nachweis an enzymatischer Aktivität stützen, die mit dem Bindungspartner assoziiert ist, entweder intrinsische oder extrinsische Aktivität. Für den letzteren Fall können die Enzyme chemisch konjugiert sein oder als ein Fusionsprotein mit dem Bindungspartner bereitgestellt werden. Zur Veranschaulichung kann der Bindungspartner chemisch verknüpft sein oder mit Meerrettich-Peroxidase genetisch fusioniert sein und die Menge an Polypeptid, welche in dem Komplex zurückgehalten wird, kann mit einem chromogenen Substrat des Enzyms, z. B. 3,3'-Diamino-benzadintetrahydrochlorid oder 4-Chlor-1-naphtol, bewertet werden. Gleichermaßen kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, welches das Polypeptid und Glutathion-S-Transferase umfasst, und die Komplexbildung kann durch Nachweis der GST-Aktivität unter Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol quantifiziert werden (Habig et al (1974) J. Biol. Chem. 249: 7130).
Für Prozesse, welche auf dem Immunnachweis zur Quantifizierung eines der Proteine, die in dem Komplex zurückgehalten werden, beruhen, können Antikörper gegen das Protein, wie Anti-JNK-1-Antikörper, verwendet werden.
Alternativ dazu kann dem Protein, welches in dem Komplex nachgewiesen werden soll, ein Epitop in der Form eines Fusionsproteins angehängt sein, welches zusätzlich zu der Kinase-Sequenz ein zweites Polypeptid beinhaltet, für welches Antikörper leicht erhältlich sind (z. B. aus kommerziellen Quellen). Beispielsweise können die vorstehend beschriebenen GST-Fusionsproteine auch für die Quantifizierung der Bindung verwendet werden, indem Antikörper gegen die GST-Einheit (Untereinheit) benutzt werden. Andere zweckmäßige angehängte Epitope beinhalten Myc-Epitope (siehe z. B. Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266: 21150-21157), welche eine Sequenz aus 10 Resten von c-Myc beinhalten, sowie das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.) oder das pEZZ-Protein A- System (Pharmacia, NJ).
Andere Tests zur Identifikation von MAP-Kinase-Modulatoren beinhalten auf Zellen basierende Tests. In einer exemplarischen Ausführungsform wird eine Zelle, welche eine interessierende Kinase exprimiert, z. B. JNK-1, mit einer Test-Verbindung inkubiert und die Aktivität der Kinase wird gemessen, z. B. durch Messen der JNK-1-Phosphorylierung oder der Phosphorylierung eines JNK-1-Substrats. Der Nachweis kann mit isoliertem Protein oder auf der Zelle durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen sind die Kinase-Inhibitoren Derivate von MAP-Kinasen, wie dominant-negative Mutanten. Solche Mutanten können durch Durchmustern von Bibliotheken aus MAP-Kinaseanalogen, wie MAP-Kinasen, welche Aminosäure- Substitutionen enthalten, erhalten werden. In einer Ausführungsform wird die vielfältige Bibliothek von Kinase- Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nucleinsäure- Ebene hergestellt und durch eine vielfältige Gen-Bibliothek codiert. Beispielsweise kann ein Gemisch von synthetischen Oligonucleotiden derart enzymatisch in Gen-Sequenzen ligiert werden, dass der degenerierte Satz von potenziellen Kinase- Sequenzen als individuelle Polypeptide exprimierbar sind oder in einer anderen Ausführungsform als ein Satz großer Fusionsproteine (z. B. für Phagendarstellung ("phage display")), welche den Satz von Kinase-Sequenzen darin enthalten.
Es gibt zahlreiche Wege, durch welche solche Bibliotheken von potenziellen Kinase-Homologen aus einer degenerierten Oligonucleotid-Sequenz hergestellt werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann mit einem automatischen DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden und die synthetischen Gene können dann in einen angemessenen Expressionsvektor ligiert werden. Der Zweck eines degenerierten Satzes von Genen ist, in einem Gemisch all diejenigen Sequenzen bereitzustellen, welche den gewünschten Satz von potenziellen Kinase-Sequenzen codieren. Die Synthese von degenerierten Oligonucleotiden ist im Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Hrsg. AG Walton, Amsterdam: Elsevier 5273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477. Solche Verfahren sind für die gerichtete Entwicklung anderer Proteine verwendet worden (siehe z. B. Scott et al. (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; sowie die U.S. Patente Nr. 5.223.409, 5.198.346 und 5.096.815). Gleichfalls kann eine Bibliothek von codierenden Sequenz- Fragmenten für einen Kinase-Clon bereitgestellt werden, um eine vielfältige Population von Kinase-Fragmenten, zur Durchmusterung und nachfolgenden Selektionen von Inhibitoren wie dominant-negative Formen der Kinase, herzustellen. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Verfahren bekannt, um solche Bibliotheken herzustellen, einschließlich die chemische Synthese. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von codierenden Sequenz-Fragmenten hergestellt werden durch (i) Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer Kinasecodierenden Sequenz mit einer Nuclease unter Bedingungen, in denen Einzelstrangbrüche nur etwa ein Mal pro Molekül auftreten; (ii) Denaturierung der doppelsträngigen DNA; (iii) Renaturieren der DNA, um Doppel-Strang-DNA zu bilden, welche Sense/Antisense-Paare aus unterschiedlich gespaltenen (genickten) Produkten beinhalten kann; (iv) Entfernen der Einzelstrang-Bereiche der zurückgebildeten Doppelstränge durch Behandlung mit S1-Nuclease; und (v) Ligierung der resultierenden Fragment-Bibliothek in einen Expressionsvektor. Durch dieses exemplarische Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, welche N-terminale, C-terminale und interne Fragmente verschiedener Größe codiert.
Eine große Auswahl von Verfahren zur Durchmusterung von Genprodukten von kombinatorischen Bibliotheken, welche durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt wurden, und zur Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten, welche eine bestimmte Eigenschaft haben, sind im Fachgebiet bekannt. Solche Verfahren werden im Allgemeinen für das schnelle Durchmustern der Gen-Bibliotheken, welche durch die kombinatorische Mutagenese hergestellt wurden, anpassbar sein. Die am weitesten verbreiteten Verfahren zur Durchmusterung von großen Gen-Bibliotheken umfassen typischerweise das Clonieren der Gen-Bibliothek in replizierbare Expressionvektoren, die Transformation geeigneter Zellen mit der resultierenden Bibliothek von Vektoren und die Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter welchen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die relativ leichte Isolierung des Vektors, welcher das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, vereinfacht. Jeder der vorstehend beschriebenen veranschaulichenden Tests ist für Hochdurchsatz- Analysen zugänglich, was notwendig ist, um große Zahlen degenerierter Kinase-Sequenzen zu durchmustern, welche durch kombinatorische Mutagenese-Verfahren hergestellt wurden.
Kombinatorische Mutagenese hat ein Potenzial, um sehr große Bibliotheken von mutierten Proteinen herzustellen, z. B. in der Größenordnung von 10²&sup6; Molekülen. Kombinatorische Bibliotheken dieser Größe können technisch sehr schwierig zu durchmustern sein, sogar mit Hochdurchsatz-Durchmusterungstests. Um dieses Problem zu überwinden, sind kürzlich neue Verfahren entwickelt worden, wie rekrusive Ensemble-Mutagenese (REM), welche erlaubt, den sehr hohen Anteil an nicht- funktionierenden Proteinen in einer zufälligen Bibliothek zu vermeiden und dadurch einfach die Frequenz funktioneller Proteine erhöht, wobei die Komplexität erniedrigt wird, um Sequenz-Raum für ein zweckmäßiges Sampling zu erhalten. REM ist ein Algorithmus, welcher die Frequenz von funktionellen Mutanten in einer Bibliothek erhöht, wenn ein geeignetes Selektions- oder Durchmusterungs-Verfahren angewendet wird (Arkin and Yourvan, 1992, PNAS USA 89: 7811-7815; Yourvan et al., 1992, Parallel Problem Solving from Nature, 2., in Maenner and Manderick, Hrsg., Elsevier Publishing Co., Amsterdam, S. 401-410; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3): 327-331).
Die Erfindung stellt zur Verringerung der Kinase-Proteine auch Nachahmung bereit, z. B. Peptide oder Nicht-Peptid- Reagenzien, wie kleine Moleküle, welche in der Lage sind, die Bindung einer erfindungsgemäßen Kinase mit einem Molekül, einem Substrat zu zerstören. Damit sind solche mutagenen Verfahren wie vorstehend beschrieben auch zweckmäßig, um diejenigen Determinanten der Kinasen zu kartieren, welche an Protein-Protein-Wechselwirkungen mitwirken, die z. B. an der Bindung der erfindungsgemäßen Kinasen an ein Substrat beteiligt sind. Um dies zu veranschaulichen, können die kritischen Reste von erfindungsgemäßen Kinasen, welche an der molekularen Erkennung ihrer Bindungspartner, z. B. Substrat, beteiligt sind, bestimmt werden und verwendet werden, um von der Kinase abstammende Peptidnachahmungen oder kleine Moleküle herzustellen, welche die Bindung der authentischen Kinase mit dieser Einheit kompetitiv hemmen. Durch Anwendung von z. B. Abtastungs-Mutagenese zur Kartierung von Aminosäure-Resten der erfindungsgemäßen Kinase-Proteine, welche an der Bindung mit anderen Proteinen beteiligt sind, können Peptid-Nachahmungs- Verbindungen hergestellt werden, welche diejenigen Reste der Kinase nachahmen, die die Interaktion erleichtern. Solche Nachahmungen können dann verwendet werden, um die normale Funktion einer Kinase zu behindern. Nicht-hydrolysierbare Peptid-Analoge solcher Reste können beispielsweise unter Verwendung von Benzodiazepin (siehe z. B. Freisinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Verlegerer: Leiden, Netherlands, 1988), Azepin (siehe z. B. Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), substituierten Gamma-Lactam-Ringen (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., EXCOM Publisher: Leiden, Netherlands 1988), Keto-methylen-Pseudopeptiden (Ewenson et al. (1986) J. Med. Chem. 29: 295; und Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), b-Schleife-Dipeptid-Kerne (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; und Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231) und b-Aminoalkoholen (Gordon et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 419; und Dann et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 134: 71) hergestellt werden. Tests zum Überprüfen der Aktivität der Verbindungen der verschiedenen kombinatorischen Bibliotheken, einschließlich Kinase-Tests, sind hierin beschrieben.
Diejenigen Verbindungen, die als Modulatoren von Kinase- Signalwegen identifiziert wurden, z. B. JNK-1-Inhibitoren, können dann in Lipolyse-Tests getestet werden. In einer anderen Ausführungsform können Verbindungen in einem Lipolyse- Test erst direkt identifiziert werden. Tests zur Bestimmung, ob eine Verbindung in der Lage ist, Lipolyse zu inhibieren oder um Bibliotheken von Verbindungen nach denjenigen zu durchmustern, die in der Lage sind, Lipolyse zu inhibieren, sind hierin in den Beispielen beschrieben. Kurz, Adipocyten, z. B. 3T3-L1-Fibroblasten, welche induziert wurden, sich zu Adipocyten zu differenzieren, werden mit einer Test-Verbindung für eine bestimmte Anzahl von Stunden vorbehandelt, bevor sie für eine bestimmte Anzahl von Stunden mit einem Mittel in Kontakt gebracht werden, welches Lipolyse induziert, z. B. TNF-α. Dann wird, wie in den Beispielen beschrieben, die Menge an Glycerin von FFA in dem Zellmedium gemessen.
Nachfolgend sind andere Lipolyse-Tests offenbart, welche verwendet werden können. Tests können unter Verwendung von 3T3-L1-Fibroblasten durchgeführt werden, welche dazu induziert werden können, sich zu Adipocyten zu differenzieren (ATCC Nr. CL-173; und beschrieben im U.S. Patent Nr. 4.003.789 und in Cell 3: 127(1974)). In einer anderen Ausführungsform können unter Verwendung frisch isolierter Adipocyten Tests durchgeführt werden, z. B. wie im U.S. Patent Nr. 5.652.366 beschrieben, welches die Isolierung von Ratten-Adipocyten aus epididymalen Fettpolstern beschreibt. Gemäß diesem Verfahren wird von den anästhesierten Ratten Fettgewebe entnommen und zweimal in Inkubationsmedium (2,09 g Natriumbicarbonat und 0,4 g EDTA, Dinatriumsalz in 1 l Krebs-Puffer) gespült. Man erhält von jeder Ratte (300-350 g) ungefähr 4 ml Fettgewebe. Das Fettgewebe (35 ml) wird mit einer Schere in kleine Teile geschnitten und mit Inkubationsmedium (50 ml) gewaschen. Das Gemisch wird in den Zylinder einer 50 ml-Spritze gegossen, an welche ein kurzes Stück eines abgeklemmten Schlauchs anstatt einer Nadel angebracht ist. Die wässrige Phase wird trocknen gelassen. Inkubationsmedium für einen zweiten Waschschritt wird durch die Spritze geschickt. Das Gewebe wird zu 50 ml Kollagenase-Lösung (Kollagenase (90 mg), Rinderserumalbumin (BSA)(500 mg) und 0,1 M Calciumchloridlösung (1 ml) in Inkubationsmedium (50 ml)) in einer 1 l-Flasche zugegeben. Das Gemisch wird in einer Umgebung von 37ºC für etwa 60 Minuten in einer Atmosphäre von 95% Sauerstoff/5% Kohlendioxid geschüttelt, um die Verdauung des Gewebes zu bewirken. Die dispergierten Zellen werden durch zwei Schichten von Gaze in einen 100 ml Plastikbecher gegossen. Die unverdauten Klumpen in dem Stoff werden einmal mit Inkubationsmedium (20 ml) gewaschen. Die Zellen in dem Becher werden in zwei Plastik- Röhrchen für 30 Sekunden bei Raumtemperatur bei 300 UpM zentrifugiert. Die wässrige Phase wird von unterhalb der locker gepackten Schicht schwimmender Fettzellen abgesaugt und verworfen. Die Adipocyten werden vorsichtig in einen 250 ml Plastik-Becher gekippt, welcher 100 ml einer Spüllösung (1 g BSA pro 100 ml Inkubationsmedium) enthält. Nach vorsichtigem Rühren wird der Zentrifugationsschritt wiederholt. Es folgt ein weiterer Waschschritt mit Spüllösung. Die Zellen werden vereint und ihr Volumen wird mit einem graduierten Zylinder bestimmt. Die Adipocyten werden mit der zweifachen Menge ihres Volumens an Test-Puffer (Tnkubationsmedium (120 ml), BSA (1,2 g), Brenztraubensäure (13 mg)) verdünnt.
Ein in vitro-Lipolyse-Test, welcher diese frisch isolierten Adipocyten verwendet, kann wie folgt durchgeführt werden (wie im U.S. Patent Nr. 5.652.366 beschrieben). Der Test wird in 20 ml Plastik-Szintillationsröhrchen durchgeführt und das Gesamt-Testvolumen beträgt 4,2 ml. Testpuffer (2,5 ml), verdünnte Adipocyten (1,5 ml) und eine Lösung der zu testenden Verbindung (12,3 muL) Adenosin-Agonist (12,3 mul; variable Konzentration) wird in dem Umgebungsschüttler für 15 Minuten inkubiert, dann wird die Umsetzung mit Norepinephrin- Lösung (41,2 muL)(10 nM, in einer Träger-Lösung, welche Wasser (100 ml), BSA (4 mg) und 0,1 M EDTA (20 I. LL) enthält) und Adenosin-Desaminase (1 mu g/ml, 41,2 mul) gestartet. Nach 60 Minuten in dem Schüttler wird die Umsetzung beendet, indem die Röhrchen auf Eis gestellt werden. Der Inhalt von jedem Röhrchen wird in ein 12 · 75 mm Glasröhrchen übertragen und bei 8-10ºC bei 3600 UpM für 20 Minuten zentrifugiert. Die harte Fettschicht wird durch Absaugen entfernt und die flüssige Schicht wird auf Glycerin getestet (440 mu 1 Probe).

7. Exemplarische erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegen Erkrankungen

Die Erfindung basiert zumindest zum Teil auf der Entdeckung, dass die JNK- und die ERK/MAP-Kinase-Wege an der TNF-α-induzierten Lipolyse beteiligt sind, und dass die Hemmung dieser Kinase-Signalwege TNF-α-induzierte Lipolyse verringert oder inhibiert. Es ist auch gezeigt worden, dass PPAR-γ-Agonisten die TNF-α-induzierte Lipolyse inhibieren. Damit betrifft die Erfindung jede beliebige Erkrankung oder Schädigung, welche assoziiert ist mit, d. h. die hervorgerufen wird durch Lipolyse in Adipocyten, wie TNF-α-induzierte Lipolyse oder zu der Lipolyse in Adipocyten, wie TNF-α- induzierte Lipolyse, beiträgt. Darüberhinaus, da Lipolyse in der Freisetzung von freien Fettsäuren (free fatty acids; FFA) resultiert, betrifft die Erfindung allgemeiner Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, welche zu einem Anstieg an freien Fettsäuren in Bezug stehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Insulin-Resistenz, d. h. eine subnormale biologische Antwort auf Insulin und Erkrankungen oder Zustände, welche daraus resultieren oder damit in Verbindung stehen. Es ist tatsächlich gezeigt worden, dass erhöhte Blutspiegel von FFAs die Insulin-stimulierte Glucoseaufnahme inhibieren, d. h. Insulin-Resistenz induzieren, sowohl in gesunden Probanden wie auch in fettleibigen Individuen und in Patienten mit NIDDM (Boden and Chen (1995) J. Clin. Invest. 96: 1261); Boden G. (1997) Diabetes 46: 3). Es gibt auch starke Hinweise darauf, dass in normalen wie in diabetischen Probanden, ansteigende physiologische Plasmaspiegel von FFA die periphere Insulin- Sensitivität dosisabhängig erniedrigen.
Ansteigende FFA-Spiegel resultieren zumindest teilweise aus übermäßiger Lipolyse. In der Tat ist gezeigt worden, dass übermäßige Lipolyse für NIDDM charakteristisch ist und möglicherweise zu Insulin-Resistenz und Hyperglykämie beiträgt (Swislocki, A. L., Horm. Metab. Res. 1993 (25), 90-95). In ähnlicher Weise ist übermäßige Fett-Ansammlung, wie sie bei Fettsucht beobachtet wird, mit erhöhten Plasmaspiegeln an FFA assoziiert. Damit werden zumindest teilweise erhöhte FFA- Plasmaspiegel durch einen Anstieg der Lipolyse-Rate durch eine ausgedehnte Fettzell-Masse produziert (Jensen et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 1168). Demgemäß kann Insulin-Resistenz aus einem Anstieg an Lipolyse resultieren.
Übermäßige Lipolyse resultiert häufig von einem Anstieg an TNF-α. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass TNF-α Lipolyse erhöht (siehe z. B. Beispiele hierin). Darüberhinaus gibt es, wie hierin gezeigt ist, eine direkte Beziehung zwischen der Menge an TNF-α im Serum und der prozentualen Menge an Körperfett im Menschen (siehe Beispiel 10). Zusätzlich ist beobachtet worden, dass TNF-α in dem Fettgewebe von fettleibigen Insulin-resistenten Nagern und Menschen überexprimiert ist und dass die Neutralisierung von TNF-α in fa/fa-Zucker-Ratten zu erniedrigtem FFA-Spiegel, erniedrigter Insulin-Resistenz und erhöhter Insulin-Rezeptor-Tyrosin- Kinase-Aktivität in Fettgewebe und Muskel führt (Hotamisligil and Spiegelman (1994) Diabetes 43: 1271). Darüberhinaus erhöhte die Infusion von TNF-α in Menschen die Plasma-Werte für FFAs (Van der Poll et al. (1991) Am J. Physiol. 24: E457). Somit können Insulin-Resistenz und Zustände, welche daraus resultieren, aus erhöhten FFA-Spiegel im Plasma resultieren, welche durch erhöhte Lipolyse und im Besonderen durch erhöhte TNF-α-induzierte Lipolyse verursacht werden. Demgemäß stellt die Erfindung, indem sie ein Verfahren bereitstellt, um Lipolyse zu reduzieren, therapeutische Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen bereit, welche aus übermäßiger Lipolyse und erhöhten Plasma-FFA-Spiegeln resultieren, wie Insulin-Resistenz und Zustände, die davon abstammen. Insulin-Resistenz kann z. B. behandelt werden durch Verabreichung einer Verbindung, welche die biologische Funktion von TNF-α inhibiert, z. B. durch Inhibierung der TNF- α-Produktion oder der TNF-α-Wirkung auf Zellen, wie mit Inhibitoren der ERK/MAP-Kinase- und/oder JNK-Signalwege.
Eine Folge der Resistenz ist, dass die Glucose- Konzentrationen ansteigen. Dies wiederum führt zu einer erhöhten Freisetzung von Insulin. Hyperinsulinämie ist sowohl im Hungerstadium als auch im Stadium nach der Nahrungsaufnahme ein Kennzeichen der Insulinresistenz. Hyperinsulinämie wird auch durch Stimulation von Gluconeogenese verursacht, welche wiederum durch erhöhte FFA-Spiegel verursacht wird. Somit induzieren erhöhte Plasma-FFA-Spiegel erhöhte Plasma-Insulin- Spiegel, um die FFA-induzierte Insulin-Resistenz und die FFA- Stimulation der Gluconeogenese zu kompensieren. Epidemologische Studien haben gezeigt, dass Hyperinsulinämie ein Risikofaktor im Hinblick auf die Erkrankungsziffer und die Sterblichkeit von Kardiovaskular-Erkrankungen ist (Smith U. (1994) Am. J. Clin. Nutr. 59, Suppl. 6865). Demgemäß betrifft die Erfindung auch die Therapeutik und Verfahren zur Verringerung oder Veränderung der Hypersekretion von Insulin und von Störungen oder Zuständen, welche daraus resultieren.
Insulin-Resistenz ist assoziiert mit NIDDM oder trägt zu NIDDM bei. Demgemäß betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von NIDDM in einem Patienten und von Komplikationen von NIDDM, durch Verhinderung oder Inhibierung übermäßiger Plasma-FFA-Spiegel. NIDDM kann definiert werden als ein Stadium, in welchem eine normale Menge an Insulin eine subnormale biologische Antwort bewirkt. Dies ist ein Zustand, in welchem verfügbares Insulin, welches aus dem Pankreas sekretiert wird und im Blutstrom zirkuliert, es nicht schafft, ausreichend Glucoseaufnahme und Verwendung im Insulinsensitivem Gewebe zu stimulieren. Diese Unfähigkeit bestimmter Gewebe einschließlich Leber, Muskel und Fett, deren metabolische Maschinerie normalerweise sensitiv für Insulin ist, Glucose wirkungsvoll zu verwerten oder die endogene Glucosesynthese und Glycogenolyse zu kontrollieren, resultiert in erhöhter Blut-Glucose. In Insulin-behandelten Patienten mit Diabetes geht man davon aus, dass Insulin-Resistenz immer dann vorliegt, wenn die therapeutische Dosis an Insulin die sekretorische Rate von Insulin in normalen Personen übertrifft.
NIDDM ist mit verschiedenen Komplikationen assoziiert. Wie hierin definiert bezieht sich "Komplikationen von NIDDM" auf kardiovaskuläre Komplikationen oder einige der metabolischen und zirkulatorischen Störungen, welche mit Hyperglykämie assoziiert sind, z. B. Insulin-Resistenz, Hyperinsulinämie und/oder Hyperproinsulinämie, verzögerte Insulin-Freisetzung, Dyslipidämie, Retinopathie, periphere Neuropathie, Nephropathie, Bluthochdruck und andere Koronararterien-Erkrankungen (coronary artery diseases; CADs). CAD ist eine Hauptursache für Erkrankungsrate und Sterblichkeit in Patienten mit NIDDM. Damit stellt die Erfindung therapeutische Ansätze und Verfahren zur Behandlung und Verhinderung von NIDDM und Folgeerscheinungen davon bereit, indem sie therapeutische Ansätze und Verfahren zur Verringerung von Lipolyse und übermäßigen FFA-Spiegel bereitstellt.
Die Erfindung betrifft auch therapeutische Ansätze zur Behandlung und Verhinderung von beeinträchtigter Glucose- Toleranz (impaired glucose tolerance; IGT). Die gewöhnliche Bedeutung von beeinträchtigter Glucose-Toleranz ist diejenige, dass es sich um einen Zustand handelt, welcher mit Insulin- Resistenz assoziiert ist und welcher zwischen manifester, NIDDM und normaler Glucose-Toleranz (NGT) liegt. Es ist bekannt, dass in Bezug auf Personen mit normaler Glucose- Toleranz ein hoher Prozentsatz der IGT-Population sich zu NIDDM weiterentwickelt (Saad et al., New Engl. J. Med. 1988; 319: 1500-6). Somit kann durch die Bereitstellung von therapeutischen Ansätzen und Verfahren zur Verringerung oder Verhinderung von IGT, d. h. um Insulin-Resistenz zu normalisieren, das Fortschreiten zu NIDDM verzögert oder verhindert werden.
IGT wird durch ein Verfahren diagnostiziert, in welchem die Glucose-Antwort nach der Nahrungsaufnahme bei einer betroffenen Person als abnormal bestimmt wird, was durch die Plasma-Glucose-Spiegel zwei Stunden nach Nahrungsaufnahme bestimmt wird. In diesem Test wird dem Patienten eine definierte Menge Glucose verabreicht und in regelmäßigen Intervallen werden die Blut-Glucose-Spiegel gemessen, gewöhnlich jede halbe Stunde während der ersten beiden Stunden und danach jede Stunde. In einer "normalen" oder nicht-IGT- Person steigen die Glucose-Spiegel während der ersten beiden Stunden auf Spiegel von weniger als 140 mg/dl an und fallen dann rasch ab. In einem IGT-Patienten sind die Blut-Glucose- Spiegel höher und das Abfallen des Spiegels erfolgt in einer langsameren Rate.
Resistenz gegen Insulin-stimulierte Glucose-Aufnahme in Personen, welche nicht manifest hyperglykämisch werden, erhöht trotzdem die Wahrscheinlichkeit, dass diese Personen zahlreiche andere Erkrankungen entwickeln. Im Besonderen setzt ein Versuch Insulin-Resistenz zu kompensieren eine Reihe von Ereignissen in Gang, die eine wichtige Rolle für die Entwicklung von sowohl Bluthochdruck als auch Koronararterienerkrankung (CAD), wie die vorzeitige (frühe) arterosklerotische Gefäßerkrankung, spielen. Diese Anhäufung von Abnormalitäten wird im Allgemeinen das "metabolische Syndrom" oder das "Insulin-Resistenz-Syndrom" oder "Syndrom X" genannt. Erhöhte Plasma-Triglyceride und erniedrigte HDL- Cholesterin-Konzentrationen, Zustände, welche bekannterweise mit CAD assoziiert sind, sind, wie berichtet wurde, auch mit Insulin-Resistenz assoziiert. Damit stellt die Erfindung Verfahren bereit, um das Auftreten des Insulin-Resistenz- Syndroms zu verringern und/oder zu verhindern, indem sie therapeutische Ansätze und Verfahren zur Verringerung oder Verhinderung von Insulin-Resistenz bereitstellt.
Noch andere Erkrankungen sind mit Insulin-Resistenz assoziiert und somit gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu behandeln oder zu verhindern. Fettsucht z. B., welche das Ergebnis eines Ungleichgewichts zwischen Kalorienaufnahme und Energieaufwand ist, ist sehr eng mit Insulin-Resistenz und Diabetes assoziiert (Hotamisligil, Spiegelman et al., Science, 1993, 259: 87-91). In Menschen kann Fettsucht definiert werden als ein Körpergewicht, welches das wünschenswerte Körpergewicht für Individuen desselben Geschlechts, derselben Größe und Statur um 20% überschreitet (Salans, L. B., in Endocrinology & Metabolism, 2. Ausgabe, McGraw-Hill, New York 1987, S. 1203-1244; siehe auch R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, S. 904-916). In anderen Tieren (oder auch in Menschen) kann die Fettsucht durch Korrelation des Körpergewicht-Musters mit den Prolactin-Profilen bestimmt werden, in Anbetracht, dass Mitglieder einer Art, welche jung, schlank und "gesund" sind (d. h. frei von irgendwelchen Störungen, nicht einfach metabolische Störungen), tägliche Plasma-Prolactinspiegel-Profile haben, welche einem geregelten Muster folgen, welches mit einer kleinen Standardabweichung gut reproduzierbar ist. Fettsucht oder überschüssige Fettablagerungen korrelieren mit dem Beginn verschiedener Lipidmetabolismus-Störungen, wie Bluthochdruck, Typ II-Diabetes (NIDDM), Atherosklerose, Kardiovaskular-Erkrankung, etc. und können diese auslösen. Sogar in Abwesenheit klinischer Fettsucht (gemäß der vorstehenden Definition) wäre die Reduktion von Fettspeichern im Körper (insbesondere viszerale Fettspeicher) beim Menschen, insbesondere auf einer langfristigen oder dauerhaften Basis von wesentlichem Nutzen, sowohl kosmetisch wie auch physiologisch. Somit werden die erfindungsgemäßen Verfahren durch Verhinderung oder Behandlung von Fettsucht einer Person erlauben, ein angenehmeres Leben zu haben und den Beginn veschiedener Erkrankungen zu verhindern, welche durch Fettsucht verursacht werden.
Im Besonderen können erhöhte Spiegel von Plasminogen- Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) ein Risikofaktor für Fettsucht/NIDDM-verwandte Kardiovaskular-Erkrankungen sein. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass erhöhte Mengen PAI-1 hauptsächlich von der Fettzelle als Antwort auf chronisch erhöhte Spiegel von TNF-α, Insulin und transforming growth factor-β (TGF-β) stammen (Samad et al. (1997) J. Clin. Invest. 97: 37). Somit kann die Behandlung eines Patienten, z. B. eines Fettsucht-Patienten oder eines Patienten, der an NIDDM leidet, entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren, z. B. durch Verabreichung einer Verbindung, welche die Wirkung von TNF-α inhibiert, die Kardiovaskular-Erkrankung verhindern.
Darüberhinaus kann die Erfindung auch verwendet werden, um Kardiovaskular-Erkrankungen wie Atherosklerose im Allgemeinen, zusätzlich zu denjenigen, welche durch Fettsucht und/oder NIDDM verursacht werden, zu verhindern oder zu behandeln. In der Tat ist es wahrscheinlich, dass mindestens eine wesentliche Prozentzahl von Kardiovaskular-Erkrankungen durch einen abnormalen Spiegel an TNF-α, wie TNF-α, welches von Zellen sekretiert wird, z. B. monocytischen Zellen, während einer Entzündungsreaktion verursacht wird oder dass diese dazu beitragen. Somit kann man durch Inhibieren der Herstellung und/oder Wirkung von TNF-α die Wahrscheinlichkeit verringern, Kardiovaskular-Erkrankungen zu entwickeln oder sie reduzieren.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung das polycystische Ovar-Syndrom (PCOS). PCOS gehört zu den am meisten verbreiteten Störungen bei Frauen vor den Wechseljahren, wobei 5-10% dieser Population betroffen sind. Es handelt sich um ein Syndrom von unbekannter Ätiologie, welches durch Hyper-Androgenismus, chronische Anovulation, Defekte in der Insulinwirkung, Insulin-Sekretion, ovarialen Genese der Steroide und der Fibrinolyse charakterisiert ist. Frauen mit PCOS sind häufig Insulin-resistent und besitzen ein erhöhtes Risiko in der dritten oder vierten Lebensdekade Glucose-Intoleranz oder NIDDM zu entwickeln (Dunaif et al. (1996) J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 3299). Hyperandrogenismus ist auch ein Merkmal einer Vielzahl von verschiedenen Insulin-resistenten Stadien, vom Typ A-Syndrom über Leprechaunismus und lipatrophischem Diabetes, bis zum Typ B-Syndrom, falls diese Zustände in Frauen vor den Wechseljahren auftreten. Es ist vorgeschlagen worden, dass Hyperinsulinämie per se Hyperandrogenismus verursacht. Insulin-sensibilisierende Mittel, z. B. Troglitazon, können, wie gezeigt wurde, wirksam sein bei PCOS und im Besonderen die Defekte in der Insulin-Wirkung, der Insulin-Sekretion, der ovarialen Steroid-Genese und Fibrinolyse verbessern (Ehrmann et al. (1997) J. Clin. Endocrinol. Metabolism 82: 2108). Basierend auf zumindest der Tatsache, dass das erfindungsgemäße Verfahren für die Behandlung Insulin- resitenter Zustände zweckmäßig ist, kann das Verfahren sofort zur Behandlung von PCOS verwendet werden.
Erhöhte zirkulierende FFA-Spiegel können, wie gezeigt wurde, die Endothel-Funktion beeinträchtigen, insbesondere die Endothel-abhängige Erweiterung der Blutgefäße ((Steinberg et al. (1997) J. Clin. Invest. 100: 1230), wie in Insulin- resistenten Menschen. Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren zur Normalisierung der Endothel-Funktion bereit.
Insulin-Resistenz ist auch häufig mit Infektionen und einer Krebserkrankung assoziiert. Somit kann die Verhinderung oder Reduzierung von Insulin-Resistenz entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahren Infektionen und eine Krebserkrankung verhindern oder abschwächen.
Insulin-Resistenz kann mit verschiedenen Verfahren diagnostiziert werden, wie durch den intravenösen Glucose- Toleranz-Test oder durch Messen des Insulin-Spiegels im Hungerzustand. Es ist gut bekannt, dass es eine ausgezeichnete Korrelation gibt zwischen der Höhe der Insulin-Spiegel im Hungerzustand und dem Grad an Insulin-Resistenz. Deshalb könnte man erhöhte Insulin-Spiegel im Hungerzustand als einen Ersatz-Marker für Insulin-Resistenz zum Zweck der Identifikation normaler Glucose-Toleranz (NGT)-Personen, welche Insulin-Resistenz haben, verwenden. Eine andere Art dieses durchzuführen, ist es, dem Ansatz zu folgen, welcher in dem New England Journal of Medicine, Nr. 3, S. 1188 (1994) offenbart ist, d. h. Patienten mit Fettsucht auszuwählen als Ausgangskriterium zu Beginn der Behandlung einer Gruppe von Probanden. Einige Fettsucht-Patienten haben eine gestörte Glucose-Toleranz (IGT), während andere normale Glucose- Toleranz besitzen (NGT). Da nahezu alle Fettsucht-Patienten Insulin-resistent sind, d. h. sogar die NGT-Fettsucht- Patienten sind Insulin-resistent, haben sie im Hungerzustand Hyperinsulinämie. Deshalb kann die Zielgruppe der erfindungsgemäßen Behandlung definiert werden als NGT- Individuen, welche fettsüchtig sind oder welche Hyperinsulinämie im Hungerzustand haben, oder welche beides haben.
Insulin-Resistenz kann auch durch den euglykämischen Glucose-Klemmtest ("glucose clamptest") diagnostiziert werden. Dieser Test umfasst die gleichzeitige Verabreichung einer konstanten Insulin-Infusion und einer variablen Rate an Glucose-Infusion. Während dem Test, der 3-4 Stunden dauert, wird die Plasma-Glucose-Konzentration konstant auf euglykämischen Spiegeln gehalten, indem der Glucose-Spiegel alle 5-10 Minuten gemessen wird und dann die variable Rate an Glucose-Infusion angepasst wird, um die Plasma-Glucose-Spiegel unverändert zu belassen. Unter diesen Umständen entspricht die Rate an Glucose-Zufuhr in den Blutstrom der Gesamtrate an Glucose-Verfügbarkeit im Körper. Der Unterschied zwischen der Rate an Glucose-Verfügbarkeit im Ausgangsstadium (keine Insulin-Infusion) und dem Insulin-infundierten Stadium repräsentiert die Insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme. In normalen Personen verursacht Insulin einen raschen und hohen Anstieg der gesamten Körper-Glucose-Verfügbarkeit, wohingegen in NIDDM-Personen diese Wirkung von Insulin weitestgehend abgestumpft ist und nur 20-30% des Normalzustands entspricht. In Insulin-resistenten Patienten mit entweder IGT oder NGT liegt die Rate an Insulin-stimulierter Glucose-Verfügbarkeit etwa in der Mitte zwischen normalen und NIDDM-Personen. In einem stabilen Zustand einer Plasma-Insulin-Konzentration von etwa 100 uU/ml (ein physiologischer Spiegel) zum Beispiel, ist die Glucose-Verfügbarkeitsrate in normalen Personen etwa 7 mg/kg/Min. In NIDDM-Patienten beträgt dieser Werte etwa 2,5 mg/kg/Min. und in Patienten mit IGT (oder Insulin-resistenten Patienten mit NGT) beträgt er etwa 4-5 mg/kg/Min. Dies ist ein sehr gut reproduzierbarer und genauer Test und er kann Patienten innerhalb dieser Kategorien unterscheiden. Es ist auch bekannt, dass die Insulin-Spiegel im Hungerzustand ansteigen, wenn Personen zunehmend Insulin-resistent werden. Es gibt eine ausgezeichnete positive Korrelation zwischen der Höhe des Insulin-Spiegels im Hungerzustand und dem Ausmaß an Insulin-Resistenz, wie er mit Hilfe des euglykämischen Glucose-Klemmtests gemessen wird, und deshalb stellt dies das Grundprinzip für die Verwendung von Insulin-Spiegeln im Hungerzustand als Ersatzmessung der Insulin-Resistenz bereit.
Damit kann jeder der vorstehend beschriebenen Tests oder andere Tests, welche im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, um zu bestimmen, dass ein Patient Insulinresistent ist, wobei dieser Patient dann entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden kann, um die Insulin-Resistenz zu verringern oder zu heilen. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren auch verwendet werden, um die Entwicklung von Insulin- Resistenz in einem Patienten zu verhindern, z. B. bei denjenigen, von denen bekannt ist, dass sie ein erhöhtes Risiko haben, Insulin-Resistenz zu entwickeln.
In einer besonderen Ausführungsform wird Insulin-Resistenz oder eine andere Erkrankung oder ein anderer Zustand, welcher mit einem abnormalen FFA-Spiegel assoziiert ist, reduziert, eliminiert oder inhibiert, indem die Wirkung von TNF-α blockiert wird, z. B. durch Neutralisation von TNF-α im Serum (d. h. zirkulierendes TNF-α) oder in dem Fettgewebe. In einer anderen Ausführungsform kann Insulin-Resistenz mit Mitteln behandelt werden, welche die Herstellung von TNF-α in Zellen, z. B. Adipocyten, aber auch in anderen Typen von Zellen wie Makrophagen, inhibieren. In noch einer anderen Ausführungsform wird die Wirkung von TNF-α durch Behandlung mit Mitteln inhibiert, welche den Weg beeinflussen, der durch die Bindung von TNF-α an seinen Rezeptor induziert wird. Solche Inhibitoren umfassen Verbindungen, welche den ERK/MAP-Kinase- und/oder JNK-Signalweg inhibieren. In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird NIDDM durch Verabreichung eines Arzneimittels, umfassend eine Verbindung, welche die biologische Aktivität von TNF-α inhibiert, an einen bedürftigen Patienten, behandelt oder inhibiert.

8. Formulierungen und Verwendung

Arzneimittel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Einsatz von einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern oder Exzipienten formuliert werden. Somit können die Verbindungen und ihre physiologisch verträglichen Salze und Solvate für die Verabreichung durch z. B. Injektion, Inhalation oder Insufflation (entweder über den Mund oder die Nase) oder als orale, buccale, parenterale oder rektale Verabreichung formuliert werden.
Für eine solche Therapie können die erfindungsgemäßen Verbindungen für eine Vielzahl von Verabreichungsmöglichkeiten formuliert werden, umfassend systemische und topische oder lokale Verabreichung. Verfahren und Formulierungen können im Allgemeinen in Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, P. A. gefunden werden. Für die systemische Verabreichung wird die Injektion bevorzugt, umfassend intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale und subcutane Injektion. Zur Injektion können die erfindungsgemäßen Verbindungen in flüssigen Lösungen formuliert sein, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern wie Hank's Lösung oder Ringers Lösung. Zusätzlich können die Verbindungen in fester Form formuliert sein und unmittelbar vor der Verwendung wieder aufgelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind ebenfalls eingeschlossen.
Zur oralen Verabreichung können die Arzneimittel zum Beispiel die Form von Tabletten oder Kapseln haben, welche durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Trägern wie Bindemitteln (z. B. vor-gelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z. B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselerde); auflösende Mittel (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat); oder Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt wurden. Die Tabletten können durch Verfahren beschichtet werden, welche im Fachgebiet gut bekannt sind. Flüssige Präparationen zur oralen Verabreichung können zum Beispiel die Form von Lösungen, Sirups oder Suspensionen haben, oder sie können als ein trockenes Produkt zur Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Präparationen können mit herkömmlichen Mitteln unter Verwendung von pharmazeutisch verträglichen Zusätzen wie Suspensionsmittel (z. B. Sorbit-Sirup, Cellulose- Derivate oder hydrierte Speisefette); Emulgatoren (z. B. Lecithin oder Gummi arabicum); nicht-wässrige Vehikel (z. B. Ationd-Öl, Öl-Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsmittel (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Präparate können auch geeignete Puffersalze, Geschmacksmittel, Färbemittel und Süßungsmittel enthalten.
Präparationen zur oralen Verabreichung können in geeigneter Weise formuliert sein, dass sie die kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs bereitstellen. Für die buccale Verabreichung können die Mittel die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, welche auf herkömmliche Art und Weise hergestellt werden. Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für die erfindungsgemäße Verwendung auf herkömmliche Art und Weise in Form eines Aerosol-Sprays bereitgestellt, welches aus einer unter Druck stehenden Verpackung oder einem Zerstäuber freigesetzt wird, wobei ein geeigneter Treibstoff, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder andere geeignete Gase verwendet werden. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellung eines Ventils gewährleistet werden, welches eine abgemessene Menge freisetzt. Kapseln und Kartuschen aus z. B. Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können derart formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, z. B. durch Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Form einer Einheits-Dosierung bereitgestellt werden, z. B. in Ampullen oder in Vielfach- Dosis-Behältern mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel. Die Verbindungen können Formen annehmen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Öl oder wässrige Vehikel, und können Formulierungsmittel wie suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel enthalten. In einer anderen Ausführungsform kann der aktive Wirkstoff in Pulverform zur Rekonstitution vor der Verwendung mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vorliegen.
Die Verbindungen können auch als rektale Mittel formuliert sein wie als Zäpfchen oder Klistiere, enthaltend z. B. herkömmliche Zäpfchen-Grundstoffe wie Kakaobutter oder andere Glyceride.
Zusätzlich zu den vorhergehend beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als eine Depot- Präparation formuliert werden. Solche lange wirkenden Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (zum Beispiel subcutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion. Somit können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustausch-Harzen, oder als ein wenig lösliches Derivat, zum Beispiel als ein wenig lösliches Salz, formuliert werden.
Die systemische Verabreichung kann auch auf transmukosalem oder transdermalem Weg erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden in der Formulierung für die zu durchdringenden Schranken geeignete Penetrationsmittel verwendet. Solche Penetrationsmittel sind im Allgemeinen im Fachgebiet bekannt und beinhalten für die transmukosale Verabreichung zum Beispiel Gallensäure-Salze und Fusidinsäure- Derivate. Zusätzlich können Detergenzien verwendet werden, um die Permeation zu erleichtern. Die transmukosale Verabreichung kann anhand von Nasen-Sprays oder unter Verwendung von Zäpfchen erfolgen. Zur topischen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Oligomere als Einreibemittel, Salben, Gele oder Cremes, wie allgemein im Fachgebiet bekannt, formuliert werden. Eine Waschlösung kann lokal verwendet werden, um eine Verletzung oder Entzündung zu behandeln, um den Heilungsprozess zu beschleunigen.
In klinischen Einrichtungen kann durch irgendeines aus einer Vielzahl von Verfahren, von welchen alle im Stand der Technik bekannt sind, ein Gen-Verabreichungssystem für ein therapeutisches Gen von Interesse, z. B. ein Gen, welches ein Ribozym oder ein Antisense-Molekül codiert, in einen Patienten eingebracht werden. Ein Arzneimittel aus dem Gen- Verabreichungssystem beispielsweise kann systemisch, z. B. durch intravenöse Injektion eingebracht werden und die spezifische Transduktion des Proteins in die Zielzellen erfolgt überwiegend durch die Spezifität der Transfektion, welche durch das Gen-Verabreichungsvehikel bereitgestellt wird, der Zell-Typ- oder Gewebe-Typ-spezifischen Expression aufgrund der Transkription-regulatorischen Sequenzen, welche die Expression des Rezeptor-Gens kontrollieren oder einer Kombination daraus. In anderen Ausführungsformen ist die anfängliche Verabreichung des rekombinanten Gens weiter eingeschränkt durch die Einbringung in das Tier, welche örtlich ziemlich begrenzt ist. Das Gen-Verabreichungs-Vehikel kann zum Beispiel mit einem Katheter (siehe das U.S.-Patent 5.328.470) oder durch stereotaktische Injektion (z. B. Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057) eingebracht werden. Ein Gen von Interesse kann unter Verwendung von Verfahren, welche zum Beispiel von Dev et al. ((1994) Cancer Treat Rev 20: 105-115) beschrieben sind, in einem Konstrukt für Gentherapie durch Elektroporation verabreicht werden.
Das Arzneimittel aus dem Gen-Therapie-Konstrukt oder der erfindungsgemäßen Verbindung kann im Wesentlichen aus dem Gen- Verabreichungssystem in einem verträglichen Verdünnungsmittel bestehen oder kann eine langsame Freisetzungsmatrix umfassen, in welche das Gen-Verabreichungs-Vehikel oder die Verbindung eingebettet ist. In einer anderen Ausführungsform, in der das vollständige Gen-Verabreichungssystem von rekombinanten Zellen intakt hergestellt werden kann, z. B. durch retrovirale Vektoren, kann das Arzneimittel eine oder mehrere Zellen umfassen, welche das Gen-Verabreichungssystem herstellen.
Die Mittel können, falls erwünscht, in einer Packung oder Zerstäubungsvorrichtung bereitgestellt werden, welche eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen enthalten, in welchen der aktive Bestandteil enthalten ist. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Plastik-Folie umfassen, wie eine Blisterpackung. Die Packung oder Zerstäubungs-Vorrichtung kann von Anleitungen zur Verabreichung begleitet sein.

9. Erfindungsgemässe diagnostische Verfahren

Die Erfindung betrifft weiter diagnostische Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient sich in einem Zustand befindet, oder wahrscheinlich einen Zustand entwickeln wird, welcher mit überhöhter Lipolyse assoziiert ist, z. B. TNF-α-induzierter Lipolyse und/oder erhöhten Plasma-FFA-Spiegel. In einer Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren die Bestimmung, ob eine MAP-Kinase, z. B. ERK1/2 und JNK, - Aktivität normal ist. Tatsächlich geht man davon aus, da die Hemmung von TNF-α-induzierter Lipolyse mit der Hemmung des ERK1/2- und des JNK-Wegs assoziiert ist, dass eine erhöhte Aktivität des ERK1/2- und/oder des JNK-Wegs und insbesondere die erhöhte Aktivität von JNK-1 in erhöhter Lipolyse und der Freisetzung von FFA resultieren kann. Somit ist es möglich, durch Bestimmung der Aktivitätsspiegel einer MAP-Kinase, z. B. ERK1/2 und JNK-1, in Zellen eines Patienten vorherzusagen, ob der Patient sich in einem Zustand befindet oder wahrscheinlich einen Zustand entwickeln wird, welcher mit überhöhter Lipolyse assoziiert ist, z. B. Insulin-Resistenz und Folgen davon.
Die Bestimmung des Aktivitätsspiegels einer MAP-Kinase, z. B. ERK1/2 und JNK-1, kann durch jedes beliebige, aus einer Vielzahl ausgewählte Verfahren durchgeführt werden, welche(s) im Fachgebiet bekannt sind (ist). In einer Ausführungsform wird die Aktivität der MAP-Kinase durch Bestimmung der Menge an MAP-Kinase oder mRNA in einer Zelle des Patienten bestimmt.
Die Messung der mRNA-Spiegel kann z. B. durch Northern Blot- Hybridisierung, Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) oder in situ-Hybridisierung erfolgen. Die Messung der Protein-Spiegel kann durch Immunpraezipitation und/oder Western-Blot oder durch Immunhistochemie erfolgen. Antikörper sind kommerziell erhältlich oder können wie hierin beschrieben hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Phosphorylierungsstadium der MAP-Kinase bestimmt werden, z. B. unter Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch die phosphorylierte Form des Proteins erkennen. In einer anderen Ausführungsform wird die Kinase-Aktivität der MAP-Kinase bestimmt. Dies kann z. B. wie in den Beispielen beschrieben erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform kann das diagnostische Verfahren die Bestimmung umfassen, ob das MAP-Kinase-Gen, z. B. das Gen, welches ein ERK- oder JNK-Protein codiert, eine Mutation umfasst. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Mutation in einem Gen können die Sequenzierung des Gens oder eines Teiles davon, Allel-spezifische Hybridisierung, Allel-spezifische Amplifikation, Einzelstrang-Konformations- Polymorphismus (single strand conformation polymorphism; SSCP)-Analysen und andere im Fachgebiet bekannte Verfahren umfassen. Eine potenzielle Mutation ist wahrscheinlich in einer Region des Gens lokalisiert, welche entweder Transkription, Translation, Spleißen, die Stabilität der Gen- oder der Aminosäure-Sequenz des Proteins, welches von dem Gen codiert wird, betrifft.
In anderen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren die Bestimmung der Aktivität des PPAR-γ-Rezeptors. In der Tat kann ein fehlerhafter PPAR-γ in erhöhter TNF-α-induzierter Lipolyse resultieren, da die Bindung eines Liganden an einen PPAR-γ-Rezeptor die TNF-α- induzierte Lipolyse inhibiert. Die Bestimmung der Aktivität eines PPAR-γ-Rezeptors kann die Bestimmung der Expressions- Spiegel des Rezeptors oder die Bindungsaffinität eines Liganden an den Rezeptor umfassen. In einer anderen Ausführungsform kann sie die Bestimmung der Signal- Transduktions-Spiegel vom Rezeptor oder die Bestimmung ob das Gen, welches PPAR-γ codiert, eine Mutation enthält umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche nicht so interpretiert werden sollten, auf irgendeine Art und Weise eingrenzend zu sein. Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, falls nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren aus Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, transgener Biologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Immunologie einsetzen, welche einem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z. B. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausg., Hrsg.: Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Bd. I and II (D. N. Glover Hrsg., 1985) Oligonucleotid-Synthese (M. J. Gait Hrsg., 1984); Mullis et al. U.S.-Patent Nr.: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins Hrsg. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins Hrsg. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Abhandlung, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Vol. 154 and 155 (Wu et al., Hrsg.) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Hrsg., Academic Press, London, 1987): Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Hrsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

Beispiele

Beispiel 1: Sowohl Natriumsalicylat als auch die PPAR-γ- Agonisten BRL und PGJ2 blockieren TNF-α-induzierte Lipolyse

Dieses Beispiel zeigt, dass Salicylsäure sowie die PPAR-γ- Agonisten BRL und PGJ2 in der Lage sind, TNF-α-induzierte Lipolyse zu blockieren.
3T3-L1-Adipocyten, welche in diesem Beispiel verwendet werden, wurden wie folgt aus 3T3-L1-Fibroblasten erhalten. 3T3-L1-Fibroblasten (ATCC Hinterlegungsnr. CL-173, beschrieben im US. Pat. 4.003.789) wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% Kälberserum, gezüchtet und unter Verwendung von Standard-Protokollen wie z. B. in Kohanski et al. (1996) J. Biol. Chem. 261: 12272 beschrieben, induziert, um zu Adipocyten zu differenzieren. Die Adipocyten wurden 10-15 Tage, nachdem das Differenzierungs-Protokoll initiiert wurde, verwendet.
Differenzierte 3T3-L1-Adipocyten, welche in Platten mit 12 Vertiefungen gezüchtet wurden, wurden über Nacht in DMEM + 0,5% BSA in Abwesenheit von Serum inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 mM oder 20 mM Natriumsalicylat (NaSal) inkubiert und mit rekombinantem Maus-TNF-α (mTNF-α; Genzyme; Cambridge, MA) mit oder ohne 17 uM 15-Desoxy-Δ-12,14-PGJ&sub2; ("PGJ2"; Cayman Chemical; Ann Arbor, MI) oder 10 uM BRL 49653 ("BRL", Smith Kine Beecham (Hamish Ross)(King of Prussia, PA)) für 24 Stunden behandelt. Der Glycerin-Gehalt in dem Kulturmedium wurde unter Verwendung eines colorimetrischen Tests (GPO-Trinder, Sigma, St. Louis, MI) bestimmt. Der Protein-Gehalt wurde unter Verwendung des BCA (bicinchonic acid; Bi-Cinchoninsäure)-Protein-Test (Pierce, Rockford, III.) bestimmt. Die Ergebnisse werden als nmol Glycerin pro mg Protein angegeben.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Diese zeigt an, dass die Lipolyse, welche in den Adipocyten durch 2 ng/ml (Teil A) oder 20 ng/ml (Teil B) TNF-α induziert wurde, durch die Zugabe von 2 oder 20 mM NaSal bedeutsam inhibiert wird. Tatsächlich inhibiert NaSal die Glycerin-Produktion von 3T3- L1-Adipocyten, welche durch 2 ng/ml TNF-α induziert wurde, um einen Faktor von 3-4. Darüberhinaus inhibierten nur 2 mM NaSal die Glycerin-Produktion, welche durch 10 ng/ml TNF-α induziert wurde, um etwa einen Faktor 2.
Lipolyse, welche durch TNF-α induziert wurde, wurde auch durch die PPAR-γ-Agonisten BRL und PGL2 bedeutsam inhibiert. Diese Wirkung war bei einer TNF-α-Dosis von 2 ng/ml im Gegensatz zu 10 ng/ml viel stärker. Die Zugabe von BRL oder PGJ2 zu Zellen, welche mit 20 mM NaSal inkubiert wurden, verringerte die Lipolyse im Vergleich mit Zellen, welche mit 20 mM NaSal alleine inkubiert wurden, nicht weiter. In den Zellkulturen, welche nur mit 2 mM NaSal inkubiert wurden, verringerte die Zugabe von BRL oder PGJ2 die Glycerin- Produktion geringfügig (weniger als ein Faktor 2). Somit blockierten 20 mM NaSal vollständig die Fähigkeit von TNF-α, die Lipolyse in Adipocyten zu erhöhen und nur 2 mM NaSal verringerte diesen Prozess teilweise. Darüberhinaus inhibieren auch BRL und PGJ2 die TNF-α-induzierte Lipolyse.
In einem anderen Beispiel wurde die schützende Wirkung der BRL-Konzentration auf TNF-α-induzierte Lipolyse analysiert. Demgemäß wurden 3T3-L1-Adipocyten mit BRL in Konzentrationen von 10 uM, 1uM oder 1 nM wie vorstehend beschrieben behandelt und die Menge an Glycerin wurde nach 24 Stunden bestimmt. Die BRL-Behandlung mit 1 uM BRL war so wirkungsvoll wie mit 10 uM, wohingegen 1 nM für den Schutz der Zellen gegen Lipolyse durch TNF-α nicht wirksam war.
Wie vorstehend gezeigt, verringerte BRL die Anreicherung von Glycerin in TNF-α-behandelten Zellen im Vergleich zu ausschließlich TNF-α-behandelten Zellen um etwa 58%. Wie in Fig. 1C gezeigt, verringerte BRL auch die TNF-α-induzierte Freisetzung von FFA dramatisch um etwa 90%, wohingegen BRL alleine keinen Effekt auf die TNF-α-induzierte FFA-Freisetzung hatte. In diesem Beispiel wurden die Zellen für 24 Stunden wie vorstehend beschrieben behandelt und die FFA-Spiegel in dem Kulturmedium wurden unter Verwendung eines colorimetrischen Kits bestimmt (NEFA-C, WAKO Pure Chemicals, Osaka, Japan).
Anhaltende Behandlung mit PPAR-γ2-Agonisten zeigte eine sogar noch wichtigere Blockade der Glycerin-Freisetzung aus TNF-α-behandelten Adipocyten. 3T3-L1-Adipocyten wurden für 5 Tage mit TNF-α (2 oder 10 ng/ml), TNF-α + 10 uM BRL, TNF-α + 15 uM PGJ2 oder BRL oder PGJ2 alleine behandelt. Die Medien wurden jeden Tag ersetzt und am Tag 5 gesammelt, um die Anreicherung von Glycerin zu messen. Wie in Fig. 1D gezeigt, resultierte die andauernde Behandlung mit 2 ng/ml TNF-α in einem ungefähr 10-fachen Anstieg an Glycerin-Ansammlung während der letzten 24 Stunden der 5 Tage langen Behandlung, verglichen mit unbehandelten Kontrollen, während 10 ng/ml TNFα einen ungefähr 13-fachen Anstieg verursachten. Bedeutend ist, dass jeder der PPAR-γ2-Agonisten ungefähr 100% des Anstiegs an Glycerin-Freisetzung aufgrund der TNF-α-Behandlung blockierte. Die Glyerin-Ansammlung in Adipocyten, welche entweder mit BRL oder PGJ2 alleine inkubiert wurden, unterschied sich nicht von den Spiegeln, welche in Kontroll (unbehandelten)-Zellen gemessen wurden. Somit ist eine anhaltende Behandlung (5 Tage) mit PPAR-γ2-Agonisten wirkungsvoller als eine 24 Stunden-Behandlung, um TNF-α- induzierte Glycerin-Freisetzung zu blockieren.
Um zu bestimmen ob die PPAR-γ2-Agonisten auch für die Verringerung der Lipolyse in Zellen wirksam sind, welche mit TNF-α vorbehandelt wurden, wurden 3T3-L1-Adipocyten für 24 Stunden mit 2 oder 10 ng/ml TNF-α inkubiert, gefolgt von einer weiteren 24 Stunden-Inkubation mit TNF-α in Abwesenheit oder Anwesenheit von BRL (1 uM). Wie in Fig. 1E gezeigt, verringerte BRL den Anstieg an Glycerin-Freisetzung, welcher mit TNF-α (2 oder 10 ng/ml) assoziiert ist, um etwa 65% bzw. 50%. Der früheste Zeitpunkt, an welchem BRL damit begann, die Wirkung von TNF-α auf Glycerin-Freisetzung umzukehren, war 6 Stunden nach Zugabe von BRL. Somit antagonisierten PPAR-γ- Agonisten die TNF-α-induzierte Lipolyse, wenn Adipocyten mit TNF-α vorbehandelt wurden und wenn sie zu Beginn gemeinsam inkubiert wurden. Im Gegensatz dazu waren weder BRL noch PGJ2 in der Lage, die Catecholamin (Isoproterenol)-induzierte Glycerin-Freisetzung zu blockieren, was zeigt, dass der Mechanismus der Wirkung von TNF-α und von Catecholaminen bei der Induktion der Adipocyten-Lipolyse verschieden ist.
Demgemäß stellt dieses Beispiel den ersten direkten Nachweis bereit, dass einer der Mechanismen, durch welche PPAR-γ2-Agonisten wie TZDs die systemische Insulin-Sensitivität erhöhen können, das Blockieren der TNF-α-vermittelten FFA- Freisetzung aus Adipocyten ist.

Beispiel 2: NaSal inhibiert TNF-α-induzierte JNK-1-Aktivierung in Adipocyten

Dieses Beispiel zeigt, dass NaSal die JNK-1-Aktivierung durch TNF-α in Adipocyten inhibiert. 3T3-L1-Adipocyten wurden für 3 Stunden mit oder ohne 20 mM NaSal, mit oder ohne 100 uM MAP-Kinase-Kinase (MEK)-Inhibitor PD98059 (Biomol; Cat. Nr. EI-360) und dann für 15 Minuten mit 10 ng/ml mTNF-α vorinkubiert. JNK-1-Kinase-Tests wurden dann mit Extrakten von jeder dieser Zellkulturen an einem N-terminalen Teil von cjun, wie in Derjarde et al. (1994) Cell 76: 1025 beschrieben, durchgeführt.
Diese Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass TNF-α die Aktivierung von JNK-1 induziert und dass diese Aktivierung durch NaSal, aber nicht durch den MAK- Kinase-Inhibitor PD98059 bedeutend verringert wird.
Somit spielt die JNK-1-Aktivierung wahrscheinlich eine bedeutende Rolle bei der Blockierung der Lipolyse, welche durch TNF-α induziert wird, da NaSal die TNF-α-induzierte Lipolyse inhibiert und NaSal die JNK-1-Aktivierung bedeutend verringert.

Beispiel 3: NaSal inhibiert teilweise die TNF-α-induzierte MAP-Kinase-Aktivierung

Dieses Beispiel zeigt, dass die Aktivierung von MAP- Kinasen durch TNF-α durch NaSal nicht bedeutend inhibiert wird, wohingegen die JNK-1-Aktivierung durch TNF-α durch NaSal bedeutend inhibiert wird.
In diesem Beispiel wurden 3T3-L1-Zellen wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt und Zell-Extrakte wurden in einem ERK1/2-Kinase-Test verwendet, wobei MBP (myelin basic protein) als ein Substrat verwendet wurde. Der verwendete Test ist in Boulton et al. (1991) Cell Reg. 2: 357 beschrieben.
Die Ergebnisse, welche in Fig. 3 gezeigt sind, zeigen, dass TNF-α ERK1/2-Aktivierung signifikant erhöht, wie durch die 7-fache Erhöhung der Phosphorylierungsrate des MBP- Substrats, welches in dem Test verwendet wurde, gezeigt ist. Wie erwartet inhibierte der MAP-Kinase-Inhibitor die ERK1/2- Aktivierung, was durch die Tatsache gezeigt wurde, dass die MBP-Phosphorylierung nur um einen Faktor von weniger als 2 in Anwesenheit von TNF-α und PD98059 erhöht wurde. Die ERK1/2- Aktivierung wurde jedoch nur etwa 2-fach durch NaSal inhibiert.
Somit ist die ERK1/2-Aktivierung durch TNF-α durch NaSal nicht so bedeutend inhibiert wie JNK-1, was zeigt, dass ERK1/2 keine entscheidende Rolle bei der TNF-α-induzierten Lipolyse zu spielen scheint und dass die TNF-α-induzierte Lipolyse größtenteils durch JNK-1-Aktivierung vermittelt wird.

Beispiel 4: MAB-Kinase-Inhibitor PD98059 erniedrigt TNF-α- induzierte Lipolyse

Dieses Beispiel zeigt, dass die Hemmung von ERK1/2 durch PD98059 die TNF-α-induzierte Lioplyse erniedrigt.
3T3-L1-Adipocyten, welche wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden für 24 Stunden mit oder ohne 100 uM MAP-Kinase- Inhibitor PD98059 inkubiert und dann mit oder ohne mTNF-α und mit oder ohne 17 uM PGJ2 oder 10 uM BRL für 24 Stunden inkubiert. Der Glycerin-Gehalt im Kulturmedium wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse, welche in Fig. 4 dargestellt sind, zeigen, dass PD98059 die TNF-α- induzierte Lipolyse um einen Faktor von weniger als 2 erniedrigt. Damit ist die MAP-Kinase-Aktivierung an der TNF-α- induzierten Lipolyse beteiligt. Jedoch hinsichtlich der Tatsache, dass der verwendete MAP-Kinase-Inhibitor für die Hemmung der MAP-Kinase-Aktivierung sehr wirksam ist (wie in Beispiel 3 gezeigt), und die Verringerung der TNF-α- induzierten Lipolyse höchstens etwa um etwa einen Faktor 2 erfolgt, scheint die MAP-Kinase-Aktivierung nicht der wichtigste Faktor bei der TNF-α-induzierten Lipolyse zu sein.

Beispiel 5: Hemmung der p38-Kinase stimuliert TNF-α- induzierte Lipolyse

Dieses Beispiel zeigt, dass im Gegensatz zu den JNK- und ERK1/2-Signalwegen, die Hemmung des p38-Signalwegs, die TNF-α- induzierte Lipolyse stimuliert.
3T3-L1-Adipocyten, welche wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, wurden mit verschiedenen Mengen (0-50 uM) des p38-Kinase-Inhibitors SB203580 vorinkubiert und dann mit 10 ng/ml TNF-α für 24 Stunden behandelt und die Menge an Glycerin im Kulturmedium wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse, welche in Fig. 5 gezeigt sind, zeigen, dass die Zugabe von SB203580 zu den Zellen die Freisetzung von Glycerin aus den Adipocyten erhöht. Darüberhinaus ist die Freisetzung von Glycerin bis zu Konzentrationen von 20 uM des SB203580 proportional zu der Menge an SB203580, welche zu den Zellen zugegeben wurde.
Somit stimuliert die Hemmung des p38-Signalwegs die TNF-α- induzierte Lipolyse im Gegensatz zu den JNK- und MAP/ERK- Wegen, deren Aktivität in Zellen inhibiert wird, in welchen die TNF-α-induzierte Lipolyse verringert wird.

Beispiel 6: Die BRL-abhängige Verringerung der Lipolyse wird weder durch JNK-1 noch durch MAP-Kinase-Aktivierung vemittelt.

Wie vorstehend in Fig. 1 gezeigt, ist BRL auch in der Lage, die TNF-α-induzierte Lipolyse zu erniedrigen. Dieses Beispiel zeigt jedoch, dass der Mechanismus der Wirkung von BRL und Salicylsäure für das Blockieren der TNF-α-induzierten Lipolyse verschieden ist.
3T3-L1-Adipocyten, welche wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden für 15 Minuten mit oder ohne 10 ng/ml mTNF-α und mit oder ohne 10 uM BRL behandelt. Dann wurden, wie vorstehend beschrieben, Zellextrakte hergestellt und für ERK1/2-Kinase- und JNK-1-Kinase-Tests verwendet.
Die Ergebnisse, welche in Fig. 6 gezeigt sind, zeigen, dass im Gegensatz zu NaSal, welches JNK-1-Kinase-Aktivität und zu einem geringeren Grad ERK1/2-Kinase-Aktivität verringert, BRL die Aktivität von JNK-1 und ERK1/2-Kinasen nicht bedeutend beeinflusst. Somit inhibiert BRL die TNF-α-induzierte Lipolyse nicht, indem es die Aktivität von JNK-1 und MAPK/ERK verringert.

Beispiel 7: PGJ2 inhibiert die TNF-α-induzierte Aktivierung von JNK-1 und ERK1/2

Dieses Beispiel zeigt, dass die TNF-α-induzierte Aktivierung von JNK-1 und ERK1/2 durch PGJ2 gehemmt werden kann.
3T3-L1-Zellen wurden für 3 Tage mit 17 uM PGJ2 oder mit 10 uM BRL und dann für 15 Minuten mit 10 ng/ml TNF-α vorbehandelt. Die Menge an phosphoryliertem (und somit aktiviertem) JNK-1, ERK1/2 und p38 wurde durch Western-Blot bestimmt, indem ein Antikörper verwendet wurde, welcher spezifisch die phosphorylierten Formen der Proteine erkennt. Als eine Kontrolle wurde die Gesamtmenge an JNK-1, ERK1/2 und p38-Protein durch Western-Blot bestimmt, indem ein Antikörper verwendet wurde, welcher die phosphorylierte und nicht- phosphorylierte Form des Proteins erkennt. Die Aktivität von ERK1/2- und JNK-Kinasen wurde auch in einem Kinase-Test unter Verwendung von MBP bzw. einem Teil von c-jun als Substrat bestimmt.
Die Ergebnisse, welche in Fig. 7, Teil A gezeigt sind, geben an, dass PGJ2 die Phosphorylierung von ERK1/2, JNK-1 und p38 verringert. Das gesamte Protein ist in Fig. 7, Teil B gezeigt. Darüberhinaus zeigen die Teile C und D von Fig. 7, dass PGJ2 den TNF-α-induzierten Anstieg an ERK1/2- und denjenigen von JNK-1-Kinase-Aktivität bedeutend inhibiert. Somit kann PGJ2, welches ein Agonist des PPAR-γ-Rezeptors ist, auf eine ähnliche Art und Weise wie NaSal funktionieren, um die TNF-α-induzierte Lipolyse zu inhibieren, d. h. durch Modulieren der MAP-Kinasen, z. B. ERK1/2 und JNK-1.

Beispiel 8: Hemmung von JNK-1 veringert die TNF-α-induzierte Lipolyse

Dieses Beispiel zeigt ein Experiment dafür, dass ein Fachmann ohne übermäßigen Aufwand zeigen kann, dass die Hemmung der JNK-1-Aktivität in Adipocyten die TNF-α-induzierte Lipolyse verringern wird.
3T3-L1-Fibroblasten können zum Beispiel mit einem Konstrukt transfiziert werden, welches eine Antisense- Nucleinsäure codiert, welches die JNK-1-Synthese inhibiert, und die transfizierten Fibroblasten können dann induziert werden, um sich in Adipocyten zu differenzieren. Nach der Differenzierung werden die transfizierten oder Anti-Adipocyten ebenso wie die nicht transfizierten oder Kontrolltransfizierten Adipocyten mit TNF-α behandelt und die Menge an Glycerin oder FFA wird wie vorstehend beschrieben bestimmt. Man kann auch ein Kontroll-Experiment durchführen, um zu bestätigen, dass die Spiegel an JNK-1-Kinase in den Adipocyten, welche die JNK-1-Antisense-Nucleinsäure exprimieren, niedriger sind als in den Kontroll-Adipocyten. Ein niedriger Spiegel an Lipolyse in Adipocyten, welche JNK-1- Antisense-Moleküle exprimieren, gibt an, dass die Hemmung der JNK-1-Aktivität in Adipocyten die TNF-α-induzierte Lipolyse verringert. Anstelle von transfizierten 3T3-L1-Fibroblasten kann man auch 3T3-L1-Adipozyten mit JNK-1-Antisense- Oligonucleotiden in Kontakt bringen.

Beispiel 9: BRL reduziert die TNF-α-abhängige Verringerung an Perilipin A und HSL in Adipocyten

Dieses Beispiel zeigt, dass die Abnahme an Perilipin A und Hormonsensitiver Lipase (HSL), welche durch TNF-α in Zellen induziert wird, durch BRL verringert wird.
3T3-L1-Adipocyten wurden mit TNF-α in einer Konzentration von 10 ng/ml, TNF-α + BRL (10 uM) oder BRL alleine für 24 Stunden behandelt, wobei nachfolgend Zelllysate gesammelt und durch Western-Blot unter Verwendung von Antikörpern gegen HSL- und Perilipin A-Proteine analysiert wurden. Perilipin- Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit einem Peptid, welches mit den Aminosäuren 9-23 des Perilipin- Proteins der Ratte identisch war (Greenberg et al. (1993) PNAS 90: 12035), erzeugt. Antikörper gegen HSL wurden durch Injektion eines Peptids, welches auf der Ratten-HSL-Sequenz (GeneBank) (KDLSFKGNSPEPSDSPEMC; SEQ ID NO: 1) beruht, in Kaninchen hergestellt. Die Antikörper wurden nachfolgend Affinitäts-gereinigt und in einer Verdünnung von 1 : 1.500 für Western-Blot-Analysen verwendet. Western-Blot-Analysen wurden wie folgt durchgeführt: Adipocyten werden kurz mit 1 ml Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen. Die Proteine werden durch Zugabe von 200 ul Lysepuffer, enthaltend 50 mM Hepes, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5% SDS, 0,1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 50 mM NaF, 1 mM Benzamidin, 100 uM AEBSF, zuzüglich 10 ug/ml Aprotinin, extrahiert. Gleiche Mengen Protein werden durch 10%-SDS-PAGE aufgetrennt, elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Membranen übertragen, mit primärem Antikörper und nachfolgend mit Esel-Anti-Kaninchen IgG, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase, inkubiert. Die Proteine werden mit dem verstärkten Chemiluminiszenz (ECL)- System (Amersham) nachgewiesen.
Die Ergebnisse, welche in Fig. 8 gezeigt sind, zeigen, dass TNF-α die Expression von Perilipin A-Protein merklich erniedrigte und die HSL-Protein-Expression verglichen mit unbehandelten Kontrollen kaum erniedrigte. BRL antagonisierte teilweise die Wirkung von TNF-α auf die Expression beider Proteine, was zeigt, dass BRL die Adipocyten-Lipolyse mindestens teilweise durch Veränderung der Adipocyten-Protein- Expression moduliert. Nuclear run-on-Tests zeigen, dass diese Wirkung von BRL auf die Perilipin-Expression auf der Transkriptionsebene erfolgt.

Beispiel 10: Uberexpression von Perilipin A blockiert die TNF-α-induzierte Lipolyse

Dieses Beispiel zeigt, dass die Überexpression von Perilipin A in Adipocyten diese Zellen gegen TNF-α-induzierte Lipolyse schützt.
3T3-L1 wurden für 24 Stunden mit oder ohne TNF-α in einer Konzentration von 10 ng/ml inkubiert und gleichzeitig mit oder ohne einen adenoviralen Vektor inkubiert, welcher Perilipin A oder Perilipin B exprimiert. Der adenovirale Vektor wurde wie folgt hergestellt. Nach 24 Stunden Inkubation wurde der Glycerin-Spiegel in dem Kulturmedium, wie vorstehend offenbart, bestimmt. Die Expression von Perilipin A und B wurde sichtbar gemacht, indem eine Western-Blot-Analyse durchgeführt wurde. Wie in Fig. 9 gezeigt, wurden bedeutende Mengen Perilipin A und B nachfolgend nach Infektion mit den Perilipin A- und Perilipin B-adenoviralen Vektoren in den Zellen exprimiert. Darüberhinaus inhibierte, wie in Fig. 10A gezeigt, die Inkubation der Zellen mit einem adenoviralen Vektor, welcher Perilipin A oder B exprimiert, nahezu vollständig die durch TNF-α-induzierte Lipolyse, wohingegen der adenovirale Vektor alleine keinen Effekt auf die TNF-α- induzierte Lipolyse zeigte. Wie in Fig. 10B gezeigt, wurde die TNF-α-induzierte Lipolyse noch während der letzten 3 Stunden der 24 Stunden-Behandlung inhibiert. Im Gegensatz dazu zeigte die Überexpression von Perilipin A oder B keine bedeutende Blockade der Isoprenol (10 uM)-induzierten Lipolyse. Wie in Fig. 8 gezeigt, erniedrigte Isoprenol auch nicht die Perilipin-Expression, was zeigt, dass Isoprenol die Lipolyse über einen Mechanismus induziert, der unterschiedlich ist von demjenigen von TNF-α.

Beispiel 11: Direkte Korrelation zwischen zirkulierenden TNF-α-Spiegel und der prozentualen Menge an Körperfett

Um eine Verknüpfung zwischen TNF-α-Spiegel und Fettsucht zu zeigen, wurde die Menge der Serum-Spiegel von TNF-α (zirkulierendes TNF-α) in Personen bestimmt, welche unterschiedliche prozentuale Mengen an Körperfett haben. Die Menge an zirkulierendem TNF-α, IL-6 und Leptin wurden durch ELISA bestimmt.
Die Ergebnisse, welche graphisch in Fig. 11 dargestellt sind, zeigen, dass es eine direkte Korrelation zwischen der prozentualen Menge an Körperfett in einer Person und der Menge an zirkulierendem TNF-α gibt. Eine direkte Korrelation zwischen zirkulierendem IL-6 und dem prozentualen Anteil an Körperfett wurde ebenfalls beobachtet, sowie eine direkte Korrelation zwischen zirkulierenden Leptin-Spiegeln und prozentualem Anteil an Körperfett.

Äquivalente

Die Durchschnittsfachleute werden erkennen oder in der Lage sein, unter Verwendung von nicht mehr als Routine- Experimenten viele Äquivalente der spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung zu erforschen. Es ist beabsichtigt, dass solche Äquivalente durch die nachfolgenden Ansprüche umfasst werden.

Claims

1. Verwendung eines Inhibitors eines MAPK-Signalweges zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung vor oder Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands, die/der hervorgerufen wird durch TNF-α-induzierte Lipolyse in einem Patienten oder zu der TNF-α-induzierte Lipolyse in einem Patienten beiträgt, durch Verminderung von Lipolyse.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor Natriumsalicylat ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor ein direkter Inhibitor ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor die Proteinmenge von ERK1/2 und/oder einem JNK vermindert.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor die Expression eines Gens vermindert, das ERK1/2 und/oder ein JNK codiert.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Inhibitor mit einem ERK1/2 und/oder JNK-Gen interagiert.

7. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor ein Antisense-Molekül, ein Triplex-Molekül oder ein Ribozym ist.

8. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor die Aktivität von ERK1/2 und/oder einem JNK vermindert.

9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Inhibitor mit ERK1/2 und/oder einem JNK-Protein interagiert.

10. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor ERK1/2- und/oder JNK- Phosphorylierung inhibiert.

11. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor des MAPK-Signalweges nicht mit einem PPR -Rezeptor interagiert.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Arzneimittel weiterhin einen Inhibitor des ERK/MAP-Kinase-Signalweges umfaßt.

13. Verwendung eines Inhibitors des ERK1/2- und/oder JNK-Signalweges zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Insulinresistenz durch Verminderung von TNF-α-induzierter Lipolyse.

14. Verwendung eines Inhibitors des ERK1/2- und/oder JNK-Signalweges zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von NIDDM durch Verminderung von TNF-α-induzierter Lipolyse.

15. In vitro-Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum eine Krankheit oder einen Zustand entwickelt hat, die/der hervorgerufen wird durch Lipolyse oder zu der/dem Lipolyse beiträgt, oder ob die Entwicklung einer solchen Krankheit oder eines solchen Zustands in einem Individuum wahrscheinlich ist, umfassend die Bestimmung der Aktivität eines ERK1/2 und/oder JNK in Zellen des Individuums, wobei eine abnormal erhöhte ERK1/2- und/oder JNK- Aktivität anzeigt, daß das Individuum eine Krankheit oder einen Zustand hat, die/der hervorgerufen ist durch Lipolyse oder zu der/dem Lipolyse beiträgt, oder daß die Entwicklung einer solchen Krankheit oder eines solchen Zustands in dem Individuum wahrscheinlich ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Bestimmung der Aktivität eines ERK1/2 und/oder JNK die Bestimmung der ERK1/2- und/oder JNK- Proteinmenge umfaßt, wobei eine abnormal erhöhte ERK1/2- und/oder JNK- Proteinmenge eine abnormal erhöhte ERK1/2- und/oder JNK-Aktivität ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Bestimmung der Aktivität eines ERK1/2 und/oder JNK die Bestimmung umfaßt, ob das ERK1/2- und/oder JNK-Protein ein mutiertes ERK1/2- und/oder JNK-Protein ist.

18. In vitro-Wirkstoffdurchmusterungsverfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die TNF-α-induzierte Lipolyse vermindert, umfassend

(i) Isolieren einer Verbindung, die ein ERK1/2- und/oder JNK-Inhibitor ist;

(ii) Inkontaktbringen einer Adipocyte mit dem Wirkstoff von Schritt (i) und TNF-α und Bestimmen des Lipolysegrades, wobei ein niedrigerer Lipolysegrad bei Anwesenheit der Verbindung von Schritt (i) im Vergleich zum Lipolysegrad in Abwesenheit des Wirkstoffs von Schritt (i) anzeigt, daß die Verbindung Lipolyse vermindert,

um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die Lipolyse vermindert.