DE69900406T2

DE69900406T2 - Verfahren zu Isolierung von 14-b Hydroxy-10-desacetyl Baccatin III

Info

Publication number: DE69900406T2
Application number: DE69900406T
Authority: DE
Inventors: Dr. Ramadoss; Dr. Vardhan
Original assignee: Dabur Research Foundation
Current assignee: Dabur Research Foundation
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2019-08-06
Also published as: KR100561111B1; CN1150179C; AU753086B2; WO2000035896A1; EP1010697B1; JP2002532485A; EP1010697A2; CA2354847C; CA2354847A1; BR9916805A; ES2167999T3; ATE207912T1; US6002024A; EP1010697A3; CN1329604A; KR20010093159A; DE69900406D1; AU2000000A; JP4435988B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Phytochemie. Genauer schafft die Erfindung eine einfache und kostengünstige Methode zum Isolieren der Verbindung 14β- Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III (14β-OH-10-DAB) aus den Blättern von Taxus baccata. 14β-OH-DAB ist eine wichtige, bei der Herstellung von 14β-OH-Paclitaxel und dessen Analoga nützliche Zwischenverbindung.
14β-Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III (14β-OH-DAB) ist eine sehr wichtige, bei der Synthese von 14β-Hydroxypaclitaxel-Analoga nützliche Zwischenverbindung, welche eine ausgezeichnete Cytotoxizität gegenüber Krebszellenanhäufungen der menschlichen Eierstöcke, der Lungen, des Dickdarms und der Brust aufweist [siehe J. Med. chem. 1977, 40, 267-278]. Mehrere Derivate zeigen eine bessere Aktivität als jene von Paclitaxel und Docetaxel.
14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III ist durch folgende strukturelle Formel dargestellt:
Die Verbindung 10-Desacetylbaccatin-III ist in höchster Konzentration hauptsächlich im Stamm und in den Blättern der Pflanzen der Taxus-Spezies zu finden. Obwohl die anderen Teile der Pflanze diese Verbindung ebenfalls enthalten, ist die Konzentration geringer. Weiters ist es einfacher, 14β-Hydroxy-10-DAB aus anderen Pflanzenteilen als den Blättern zu extrahieren.
Die meisten gebräuchlichen Methoden zum Isolieren von 14β-Hydroxy-10-DAB umfassen die Extraktion von Biomasse mit Alkohol oder dessen Gemisch mit weniger polarem Lösungsmittel, um einen Extrakt zu ergeben, der zwecks Gewinnung von 14β-Hydroxy-10- DAB durch Laugung in einem Lösungsmittel und schließlich Chromatographie halb gereinigt wird. Einige der im Stand der Technik zur Extraktion von 14β-Hydroxy-10-DAB angewendeten gebräuchlichen Methoden sind untenstehend angeführt.

Verweise auf den Stand der Technik:

Die WO-A-94/07882 offenbart eine Methode zum Erhalten von 10-Desacetylbaccatin-III aus verschiedenen Teilen des Eibenbaums (Taxus-Sp.) mittels Extraktion und selektiver Kristallisation aus dem Methanolextrakt der Pflanzenmasse. Obwohl dies die gleiche Methode zum Isolieren von 10-Desacetylbaccatin-III ohne Anwendung jeglicher chromatographischer Trennung ist, führt sie nicht weiter zur Isolierung des 14β-OH- Desacetylbaccatin-III.
Das europäische Patent Nr. 0 559 019 A1 offenbart ein Verfahren zum Isolieren von 14β- Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III. Obiges Verfahren beinhaltet jedoch einen langwierigen Chromatographie-Schritt, welcher insbesondere bei Anwendung in kommerziellem Umfang die Kosten des Verfahrens erhöht.
Das U. S.-Patent Nr. 5,453,520 offenbart eine weitere Methode zur Isolierung von 14β- Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III und dessen Derivaten als Antitumor-Wirkstoffe. Dieses Patent offenbart wiederun die alkoholische Extraktion aus Blättern des Taxus Wallichiana und die Isolierung von 14β-Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III unter Anwendung von Chromatographie-Techniken.
Das Patent Nr. WO 9629321 A1 offenbart 10-Desacetylbaccatin III- und 14β-Hydroxy-10- desacetylbaccatin-III-Derivate und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. Dieses Patent zielt ab auf die Synthese von Analoga von 14β-Hydroxy-10-DAB & 10-DAB. Ein anderes Verfahren zum Extrahieren von 14β-Hydroxy-10-DAB ist im Journal of Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, S. 2925 publiziert. Das Verfahren lehrt die Lösungsmittel- Extraktion von 14β-Hydroxy-10-DAB aus den Blättern des T. Wallichiana unter Verwendung von Methanol, gefolgt von einer Kieselgel-Chromatographie und anschließender Kristallisation, um 14β-Hydroxy-10-DAB als weißes Pulver zu gewinnen. Im Allgemeinen machen die bei der Isolierung von 14β-Hydroxy-10-DAB angewendeten, oben angeführten bekannten Methoden lange, langwierige und kostspielige Chromatographie-Techniken erforderlich. Bei diesen Verfahren werden die halb gereinigten Extrakte aus Taxan-Spezien der langwierigen Technik der Absorptionschromatographie unterzogen, was zu einer schwachen Ausbeute von 10-DAB und 14β-Hydroxy-10-DAB führt.
Folglich besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines Verfahrens, welches die Nachteile der herkömmlichen Methoden vermeidet und auch eine bessere Ausbeute von 14β-Hydroxy-10- DAB liefert.

Ziele der vorliegenden Erfindung:

Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines einfachen und kostengünstigen Verfahrens zur Isolierung von 14β-OH-10-DAB (14β-OH-10- Desacetylbaccatin-III), welches bei der Synthese von 14β-Hydroxypaclitaxel-Analoga als Zwischenprodukt von Nutzen ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens, das in keiner Stufe der Isolierung von 14β-OH-10-DAB einen langwierigen Isolierungsschritt durch Chromatographie-Techniken beinhaltet.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht noch in der Schaffung eines Verfahrens, in dem das in den verschiedenen Stufen verwendete Lösungsmittel wiederverwertet werden kann.
Es ist ebenso ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neuartiges Verfahren zu schaffen, welches zur Extraktion von 14β-OH-10-DAB aus jedem Teil der Pflanze der Taxus-Spezies angewendet werden kann.

Kurzfassung der Erfindung:

Gemäß den obigen und anderen Zielen schafft die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Isolierung von 14β-OH-10-DAB aus den Pflanzenteilen der Taxus-Spezies, umfassend die nachstehenden Schritte:
1) Herstellen eines alkoholischen Extrakts der getrockneten Blätter von Taxus baccata; dessen Behandlung mit aliphatischen Ketonen; Evaporation der Mutterlauge und selektive Kristallisation zur Isolierung von 10-DAB, und
2) weitere Behandlung der nach der 10-DAB-Kristallisation erhaltenen Mutterlauge mit Nitril-Lösungsmitteln, gefolgt von Lösungsmitteln aromatischer Kohlenwasserstoffe, und danach selektive Kristallisation und Isolierung von 14β-OH-10-DAB.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung schafft ein neuartiges Verfahren zur Isolierung von 14β- Hydroxy-10-desacetylbaccatin-III, einer zur Synthese von 14β-Hydroxypaclitaxel-Analoga verwendeten Verbindung.
Das Verfahren ist einfach, und 14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III kann aus dem regenerierbaren Teil einer Pflanze der Taxus-Spezies durch Kristallisation selektiv isoliert werden. Das vorliegende Verfahren beinhaltet die nachstehenden Schritte:
(a) Extrahieren der pulverisierten und gegebenenfalls getrockneten Teile einer Pflanze der Taxus-Spezies mit aliphatischem Alkohol,
(b) Herstellen eines teilweise konzentrierten alkoholischen Extrakts, der 10-DAB und eine geringe Menge an 14β-OH-10-DAB enthält,
(c) Behandeln des Extrakts mit aliphatischen Ketonen und Trennen der unlöslichen Substanzen von der Mutterlauge durch Zentrifugation oder Filtration,
(d) Behandeln des nach einer Evaporation der Mutterlauge nach Schritt (c) unter Vakuum erhaltenen Rests mit einer Mischung aus aliphatischen Ketonen und Wasser und Entfernen der unlöslichen Substanzen durch ein Kieselgur-Bett durch Filtration oder Zentrifugation,
(e) Extrahieren der wässerigen ketonischen Lösung mit aromatischen Kohlenwasserstoffen, um weniger polare Substanzen zu entfernen, gefolgt von einer Extraktion mit mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Estern oder chlorierten Lösungsmitteln,
(f) Evaporieren der organischen Schicht nach (e) bis zur Trockenheit, um einen halbfesten Rest zu erhalten, aus dem Roh-10-DAB durch selektive Kristallisationen erhalten wird,
(g) Isolierung und Reinigung von 10-DAB,
(h) Evaporation der Mutterlauge nach (g), gefolgt von einer Behandlung des Rests mit einem Nitril-Lösungsmittel und einem Lösungsmittel eines aromatischen Kohlenwasserstoffs, und
(i) Isolierung und Reinigung von 14β-OH-10-DAB durch Lösungsmittel- Kristallisation aus dem Rest, der nach der Behandlung mit Nitril- Lösungmittel, gefolgt von Lösungmitteln aromatischer Kohlenwasserstoffe, erhalten wurde.
In einer Ausführungsform wird der zur Herstellung des alkoholischen Extrakts verwendete aliphatische Alkohol aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und tertiärem Butanol ausgewählt.
In einem Kennzeichen ist der aliphatische Alkohol Methanol.
In einer weiteren Ausführungsform wird der alkoholische Extrakt durch Rühren der pulverisierten und gegebenenfalls getrockneten Teile der Pflanze der Taxus-Spezies in Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol erhalten.
In einem weiteren Kennzeichen der Erfindung wird die Kristallisation von 10-DAB durchgeführt durch die Behandlung des Rests mit aliphatischen Nitril-Lösungsmitteln, die gegebenenfalls mit aliphatischen Alkoholen vermischt sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Isopropanol, Butanol, oder aliphatischen Estern, die ausgewählt sind aus Ethylacetat, Propionylacetat und Isoamylacetat. Die aliphatischen Nitrile können aus Acetonitril und Propionitril ausgewählt sein.
In wiederum einem weiteren Kennzeichen werden 10-DAB und 14β-OH-10-DAB aus einem beliebigen Teil einer beliebigen Pflanzenspezies der Gattung Taxus extrahiert.
In einem Kennzeichen wird 14β-OH-10-DAB durch Filtration und Kristallisation isoliert. In einem weiteren Kennzeichen wird 10-DAB durch eine Kristallisation, gefolgt von einer Zentrifugation, isoliert.
In wiederum einem weiteren Kennzeichen ist die Pflanze Taxus baccata.
In einem weiteren Kennzeichen sind die Teile der Pflanze die Blätter.
Das obenstehend dargelegte Verfahren zur Isolierung von 14β-Hydroxy-10- desacetylbaccatin-III beinhaltet in keiner Stufe eine Chromatographie-Technik.
Das bevorzugte Verfahren umfasst folgende Schritte:
1. Die Blätter von Taxus baccata werden pulverisiert und gegebenenfalls getrocknet. Mit Wasser mischbarer aliphatischer Alkohol; der ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, wird den zerstoßenen Blättern zugegeben, und das Gemisch wird 12 Stunden lang gerührt. Der im vorliegenden Verfahren bevorzugt verwendete aliphatische Alkohol ist Methanol.
2. Der derart erhaltene halbkonzentrierte Alkoholextrakt enthält 10-DAB, 14β-OH-10- DAB und andere Taxane. Dieser Extrakt wird mit einem aliphatischen Keton eine Stunde lang gerührt. Das unlösliche Material wird dann durch Filtration durch ein Kieselgur-Bett oder durch Zentrifugation herausgetrennt. Die zurückgelassene Flüssigkeit ist die Mutterlauge, welche danach bei der weiteren Verarbeitung verwendet wird.
3. Die Mutterlauge aus Schritt (2) wird unter Vakuum evaporiert, um einen Rest zu ergeben, der mit einem Gemisch aus wässrigen ketonischen Lösungsmitteln behandelt wird, und die unlöslichen Substanzen werden durch Filtration oder Zentrifugation durch ein Kieselgur-Bett entfernt. Eine klare wässrige ketonische Lösung kann für die weitere Verarbeitung verwendet werden.
4. Eine erhaltene klare wässrige ketonische Lösung wird mit aromatischem Kohlenwasserstoff extrahiert, um weniger polare Substanzen, die nicht 10-DAB sind, zu entfernen. Danach wird die verbliebene wässrige ketonische Phase mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise einem aliphatischen Ester oder chlorierten Lösungsmittel, behandelt, um zusammen mit 14β-Hydroxy-10-DAB 10-DAB zu extrahieren.
5. Danach wird der Extrakt aus organischem Lösungsmittel bei 80º-90ºC unter Vakuum bis zur Trockenheit evaporiert, um einen halbfesten Rest zu ergeben. In der Folge wird 10-DAB selektiv aus dem obenstehend erhaltenen Rest kristallisiert, indem es mit einem aliphatischen Nitril-Lösungsmittel wie Acetonitril, Propionitril, gegebenenfalls gemischt mit einem aliphatischen Alkohol wie Methanol, Isopropanol, n-Butanol oder einem aliphatischem Ester wie Aceton, Ethylacetat, Butylacetat, behandelt wird. Es ist vorteilhaft, die selektive Kristallisation in Acetonitril, gegebenenfalls in Gegenwart von Ethanol, Methanol oder Ethylacetat und/oder Butylacetat, durchzuführen. Das 10-DAB wird durch eine beliebige herkömmliche Methode wie eine Kristallisation, gefolgt von einer Zentrifugation, gereinigt.
6. Nach der Kristallisation und der Isolierung von 10-DAB wird die Mutterlauge an 14β-OH-10-DAB leicht angereichert. Die Lauge wird bis zur Trockenheit evaporiert und mit einem Nitril-Lösungsmittel, gefolgt von einem aromatischen Kohlenwasserstoff, bei 80ºC 1-2 Stunden lang behandelt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die unlöslichen Substanzen werden entfernt, und die Lauge wird mit aliphatischem Alkohol oder alipatischem Ester oder chloriertem Lösungsmittel behandelt, um ROH-14β-OH-10-DAB (vorzugsweise ein alkoholisches Lösungsmittel) zu ergeben. Das reine 14β-OH-10-DAB wird durch Lösungsmittel- Kristallisation unter Verwendung aliphatischer alkoholischer oder Ester- Lösungsmittel erhalten.
Das obenstehende neuartige Verfahren zur Isolierung von 14β-OH-10-DAB kann zur Extraktion aus einem beliebigen Teil der Pflanze der Taxus-Sp., insbesondere der T. baccata, T. brevifolia, T. cannadensis, T. cuspidata, T. floridara, T. media oder T. wallichiana, angewendet werden. Das obenstehend beschriebene Verfahren ist einfach und beinhaltet in keiner Stufe eine Chromatographie, und 14β-OH-10-DAB ist unter alleiniger Verwendung von Lösungsmitteln zu erhalten.
Der andere Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht darin, dass die in verschiedenen Schritten verwendeten Lösungsmittel wiederverwendet werden können. Zusätzlich erkannte der Anmelder, dass trotz der Tatsache, dass das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Rohmaterial 10-DAB in größerer Menge als 14-β-OH-10-DAB enthält, die Isolierung von letzterem ohne Durchführung chromatographischer Vorgänge zu erzielen war. Das obenstehende neuartige Verfahren ist im Detail anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die rein der Erläuterung dienen und nicht zur Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden sollten.

Beispiel I

Die Blätter von Taxus baccata werden pulverisiert und gegebenenfalls getrocknet. Vorzugsweise liegt die mittlere Partikelgröße der Blätter nahe bei 0,6 mm bis 0,8 mm. Ein alkoholischer Extrakt wird durch 12-stündiges Rühren von 1000 l Methanol mit 100 kg der zerstoßenen Blätter (58 Umdrehungen pro Minute) bei Umgebungstemperatur im Reaktor hergestellt. Die nach der Zentrifugation gesammelte methanolische Lösung wird unter reduziertem Druck (150 mbar) bei 40-50ºC in einem Evaporationsreaktor evaporiert, um einen halbkonzentrierten Extrakt, dessen Gewicht zwischen 20-30% des Gewichts der Blätter beträgt, zu ergeben.
25 kg halbkonzentrierter methanolischer Extrakt, enhaltend 0,12% 10-Desacetylbaccatin-III, 20% Wasser und 10% Methanol (hergestellt unter den obenstehend beschriebenen Bedingungen), werden mit 175 l (Liter) Aceton bei Umgebungstemperatur 1 bis 2 Stunden lang gerührt (58 upm). Der unlösliche Feststoff, welcher auftritt, wird durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Das in Mutterlauge lösliche Aceton, welches 35% des Gewichts des halbkonzentrierten Extrakts bildet, wird bei 40-50ºC unter Vakuum (150 mbar) bis zur Trockenheit abdestilliert.
8,75 kg des erhaltenen trockenen Rests werden mit 43,75 l des Gemisches aus Aceton und entmineralisiertem Wasser (DM) (Verhältnis vorzugsweise 2 : 8) 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur bei hoher upm (72 Umdrehungen pro Minute) gerührt. Das unlösliche Material wird durch Filtration oder Zentrifugation auf einem Kieselgur-Bett entfernt. Die gesammelte wässrige ketonische Mutterlauge ist klar dunkelrot.
Die wässrige ketonische Schicht wird zweimal mit 17,51 und einmal mit 8,75 l (Liter) Toluol extrahiert, indem jede Extraktion 1 Stunde lang gerührt wird (40 Umdrehungen pro Minute).
Die nach der Toluolextraktion erhaltene wässrige ketonische Schicht wird dann mit Methylenchlorid (4 · 16,5 l) bei Umgebungstemperatur extrahiert, indem jede Extraktion 30 Minüten lang gerührt wird (40 Umdrehungen pro Minute). Die Methylenchloridschichten werden verbunden, über Natriumsulfat getrocknet und danach unter Vakuum (150 mbar) bei 25º bis 65ºC in einem Abdampfkolben bis zur Trockenheit evaporiert. Das Gewicht des Methylenchlorid-Rests liegt üblicherweise bei zwischen 1,5 bis 1,8 W/W% des halbkonzentrierten Methanol-Extrakts, enthaltend 4,5 bis 6% 10-Desacetylbaccatin-III.

Beispiel 11

468,7 g trockener Extrakt, enthaltend 5,1% 10-Desacetylbaccatin-III, wird unter den in Beispiel I beschriebenen Bedingungen erhalten. Der Extrakt wird bei 50-60ºC mit 40 Umdrehungen pro Minute mit 975 ml Acetonitril gerührt. Nach vollständiger Auflösung des Extrakts wird das Gemisch bei 0-5ºC 12-16 Stunden lang gekühlt und bei sehr niedriger upm (20) gerührt. Die feste, unlösliche Substanz wird durch Filtration oder Zentrifugation herausgetrennt und mit 50 ml Acetonitril gewaschen. Ein Rohfeststoff (29,43 g) wird nach 12-stündiger Trocknung unter reduziertem Druck (0,5 mbar) bei 60-70ºC erhalten, wobei dieser 76,1% 10-Desacetylbaccatin-III aufweist.

Beispiel III

29,43 g des unter den in Beispiel 11 beschriebenen Bedingungen erhaltenen Rohfeststoffs werden in 735,5 ml Methanol durch einstündiges Refluxieren bei 70ºC unter Rühren (upm- 58) aufgelöst. Die Lösung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt und danach durch ein Kieselgur-Bett gefiltert, um eine klare Lösung zu ergeben. Das Filtrat wird bei sehr niedriger upm (20) gerührt, und 295 ml Acetonitril werden langsam beigefügt. Das Gemisch wird danach auf 0-5ºC abgekühlt und 12-15 Stunden lang beibehalten. Der Niederschlag wird durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt und mit 10 ml eines Methanol-Acetonitril- Gemisches (1 : 1) gewaschen. Das Produkt wird unter reduziertem Druck (0,5 mbar) bei 90- 95ºC 20-30 Stunden lang getrocknet. Somit wird 22,2 g gebrochen weißes Endprodukt, enthaltend 94,1% 10-Desacetylbaccatin-III, erhalten.
Die nach der letzten Kristallisation erhaltene Mutterlauge wird bis zur Trockenheit evaporiert und zwecks Reinigung von 10-Desacetylbaccatin-III wiederverwertet.

Beispiel IV

30 g des unter den in Beispiel 11 beschriebenen Bedingungen erhaltenen Rohfeststoffs werden in 750 ml Aceton durch ein- bis zweistündiges Refluxieren bei 65º C aufgelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und danach durch ein Kieselgur-Bett gefiltert. Das Filtrat wird bei sehr niedriger upm (20) gerührt, und Acetonitril (200 ml) wird langsam beigefügt. Die Temperatur der Lösung wird auf 0-5ºC abgesenkt und bis zu 15-20 Stunden gehalten. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren und Waschen des Feststoffs mit einem 1 : 1-Gemisch aus Aceton und Acetonitril abgetrennt. Das Endprodukt wird unter Vakuum (0,5 mbar) bei einer Temperatur von 80-90ºC 12-20 Stunden lang getrocknet. Somit wird das Endprodukt (23,1 g), enthaltend 93,5% 10-Desacetylbaccatin-III, erhalten.

Beispiel V

Nach der Reinigung von 10-Desacetylbaccatin-III wird die obenstehend erhaltene Mutterlauge unter Vakuum (75 mbar) bei 70-80ºC bis zur Trockenheit evaporiert. Der erhaltene Rest (35 g) wird dann mit Acetonitril (350 ml) bei 70-80ºC eine Stunde lang gerührt. Die Lösung wird 10 Stunden lang bei 0-5ºC erkalten gelassen, und danach wird unlösliches Material per Pumpe gefiltert. Die erhaltene Mutterlauge wird unter reduziertem Druck (150 mbar) bei 70-80ºC bis zur Trockenheit evaporiert. Der erhaltene Rest (25 g) wird danach bei 80ºC mit 75 ml Toluol eine Stunde lang bei 58 upm gerührt. Die Temperatur des Gemisches wird auf Raumtemperatur abgesenkt, der Toluol-lösliche Anteil wird vom Toluol-unlöslichen Rest getrennt, welcher zwecks Entfernung von restlichem Lösungsmittel unter Vakuum bei 80ºC erhitzt wird. Der Toluol-unlösliche Rest wird danach durch Rühren bei 70ºC in einem Äquivalent Methanol aufgelöst. Die Lösung wird für das Erkalten 24-48 Stunden lang bei 0-5ºC gelassen. Ein Rohfeststoff wird abfiltriert und bei 70- 90ºC 12 Stunden lang vakuumgetrocknet, um 1,9 g festes 14β-OH-10-DAB zu ergeben.

Beispiel VI

1,9 g Rohfeststoff 14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III (hergestellt unter den in Beispiel V beschriebenen Bedingungen) wird in 47,5 ml Ethylacetat durch ein- bis zweistündiges Refluxieren aufgelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt und danach durch ein Kieselgur-Bett gefiltert. Das erhaltene klare Filtrat wird zwecks Reduzierung des Volumens auf bis zu 24 ml bei 40-60ºC unter Vakuum (150 mbar) vom Lösungsmittel mittels Destillation befreit und danach bis zu 12-24 Stunden lang bei 0-5ºC gehalten. Der kristallisierte Feststoff wird per Pumpe flitriert, mit gekühltem Ethylacetat (2 ml) gewaschen und bei 90ºC 12 Stunden lang vakuumgetrocknet, wobei 1.28 g fertiges 14β-OH-10- Desacetylbaccatin-III erhalten wird.

Beispiel VII

1,9 g Rohfeststoff 14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III (hergestellt unter denselben, in Beispiel V beschriebenen Bedingungen) wird in 41,8 ml Methanol durch einstündiges Refluxieren unter Rühren aufgelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt und danach durch ein Kieselgur-Bett filtriert. Das klare Filtrat wird für das Erkalten 12 Stunden lang bei 0-5ºC gelassen. Kristallisierter Feststoff wird filtriert und 12 Stunden lang bei 75-90ºC vakuumgetrocknet, wobei 1.12 g fertiges 14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III erhalten wird.

Vorteile des neuartigen Verfahrens:

a) Es ist einfach, kostengünstig und von kommerzieller Durchführbarkeit.
b) Es beinhaltet in keiner Stufe des Verfahrens den langwierigen Vorgang der Chromatographie-Technik.
c) In diesem Verfahren besteht in vielen Stufen die Wiederverwendbarkeit des Lösungsmittels.
d) Dieses Verfahren ist zur Extraktion eines beliebigen Pflanzenteils verschiedener Taxus-Spezien anwendbar.
e) Dieses Verfahren kann zur Trennung von im primären alkoholischen Extrakt vorhandenem Placitaxel angewendet werden.
f) In Abhängigkeit von der Qualität des Rohmaterials schwankt die Ausbeute von 10- Desacetylbaccatin-III von 60% bis 90% seines Anteils im Rohmaterial.
g) Obwohl 14β-OH-DAB in der Stufe des methanolischen Extrakts in kleiner Menge vorhanden ist, ist es möglich, diese Verbindung ohne Anwendung einer chromatographischen Technik in irgendeiner Stufe zu isolieren.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von 14β-OH-10-Desacetylbaccatin-III aus dem regenerierbaren Teil einer Pflanze der Taxus-Spezies durch Kristallisation, umfassend die nachstehenden Schritte:

(j) Extrahieren der pulverisierten und gegebenenfalls getrockneten Teile einer Pflanze der Taxus-Spezies mit aliphatischem Alkohol,

(k) Herstellen eines teilweise konzentrierten alkoholischen Extrakts, der 10-DAB und eine geringe Menge an 14β-OH-10-DAB enthält,

(l) Behandeln des Extrakts mit aliphatischen Ketonen und Trennen der unlöslichen Substanzen von der Mutterlauge durch Zentrifugation oder Filtration,

(m) Behandeln des nach einer Evaporation der Mutterlauge nach Schritt (c) unter Vakuum erhaltenen Rests mit einer Mischung aus Wasser und einem aliphatischen ketonischen Lösungsmittel und Entfernen der unlöslichen Substanzen durch ein Kieselgur-Bett durch Filtration oder Zentrifugation,

(n) Extrahieren der wässerigen ketonischen Lösung mit aromatischen Kohlenwasserstoffen, um weniger polare Substanzen zu entfernen, gefolgt von einer Extraktion mit mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Estern oder chlorierten Lösungsmitteln,

(o) Evaporieren der organischen Schicht nach (e) bis zur Trockenheit, um einen halbfesten Rest zu erhalten, aus dem ROH-10-DAB durch selektive Kristallisationen erhalten wird,

(p) Isolierung und Reinigung von 10-DAB,

(q) Evaporation der Mutterlauge nach (g), gefolgt von einer Behandlung des Rests mit einem Nitril-Lösungsmittel und einem Lösungsmittel eines aromatischen Kohlenwasserstoffs, und

(r) Isolierung und Reinigung von 14β-OH-10-DAB aus dem Rest, der nach der Behandlung mit Nitril-Lösungmitteln, gefolgt von Lösungmitteln aromatischer Kohlenwasserstoffe, erhalten wurde.

2. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der zur Herstellung des alkoholischen Extrakts verwendete aliphatische Alkohol aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Butanol ausgewählt ist.

3. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der verwendete aliphatische Alkohol Methanol ist.

4. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der alkoholische Extrakt durch Rühren der pulverisierten und gegebenenfalls getrockneten Teile der Pflanze der Taxus- Spezies in Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol erhalten wird.

5. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die selektive Kristallisation von 10- DAB durch ein Behandeln des halbfesten Rests mit einem aliphatischen Nitril- Lösungsmittel, das gegebenenfalls mit aliphatischen Alkoholen vermischt ist, durchgeführt wird.

6. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das aliphatische Nitril- Lösungsmittel aus Acetonitril oder Propionitril ausgewählt ist.

7. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Nitril-Lösungsmittel mit aliphatischen Alkoholen vermischt ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Isopropanol, Butanol, oder mit aliphatischen Estern, die ausgewählt sind aus Ethylacetat, Propionylacetat und Isoamylacetat.

8. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei 10-DAB und 14β-OH-10-DAB aus einem beliebigen Teil einer beliebigen Pflanze der Gattung Taxus extrahiert werden.

9. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei 14β-OH-10-DAB durch Filtration und Kristallisation isoliert wird.

10. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei 10-DAB durch eine Kristallisation, gefolgt von einer Zentrifugation, isoliert wird.

11. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Pflanze Taxus baccata ist.

12. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Teile der Pflanze die Blätter sind.