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TECHNISCHER
BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft duale Selektionskassetten und diese
enthaltende Plasmide und die Verwendung derartiger Plasmide in der
Konstruktion von eukaryotischen viralen Vektoren und dergleichen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Aufgrund
ihrer großen
Größe werden
viele rekombinante eukaryotische Viren über homologe Rekombination
hergestellt. Konventionell hat diese homologe Rekombination bisher
in einer eukaryotischen Wirtszelle stattgefunden, die für das Wachstum
des rekombinanten Virus permissiv ist (siehe z.B. Berkner, BioTechniques,
6, 616-628 (1988)). Die homologe Rekombination in eukaryotischen
Zellen birgt jedoch mindestens zwei größere Nachteile. Der Prozess
ist zeitaufwändig,
und viele bevorzugte rekombinante eukaryotische virale Konstruktionen
haben einen selektiven Nachteil relativ zu den eukaryotischen Vorgängerviren,
aus denen sie erhalten worden sind. Wenn also ein Fachmann versucht,
ein neues rekombinantes Virus durch den langwierigen Prozess der
homologen Rekombination in einer eukaryotischen Zelle herzustellen,
und schlägt
sein Versuch, das gewünschte
Virus herzustellen, fehl, dann wird der Fachmann nicht leicht unterscheiden
können,
ob es einer Modifikation der Konstruktionstechnik bedarf, oder ob
das angestrebte Virus in der betreffen den Zelle möglicherweise
nicht lebensfähig
ist. Es besteht also ein Bedarf nach neuen Methoden der Herstellung
eukaryotischer Gentransfervektoren.
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Frühere Verbesserungen
in der Herstellung von Gentransfervektoren umfassten die Verwendung
von hefebasierten Systemen (Ketner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA,
91, 6186-6190 (1994)), plasmidbasierten Systemen (Chartier et al.,
J. Virol., 70, 4805-4810 (1996); Internationale Patentanmeldung
WO 96/25506 (Crouzet et al.)) und cosmidbasierten Systemen (Miyake
et al., Proc. Nat'l.
Acad. Sci. (USA, 93, 1320-1324 (1996)).
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Das
von Chartier et al. entwickelte System umfasst ein Plasmid, welches
ein komplettes adenovirales Vektorgenom trägt, das von Pac I-Restriktionsstellen
flankiert ist, die in dem adenoviralen Genom normalerweise nicht
vorkommen. Bei der Methode nach Chartier et al. werden auf einer
linearen DNA enthaltene adenovirale Sequenzen in vivo zu einem linearisierten
Vektor, der ein rechtes und ein linkes ITR umfasst, homolog rekombiniert.
Der resultierende Vektor wird propagiert, isoliert und mit Pac I
verdaut, und das den adenoviralen Vektor tragende Restriktionsfragment
wird in eine Säugerzelle
transfiziert, die für
die Replikation des Virus permissiv ist. Die Methode nach Chartier
et al. stellt relativ reine Quellen für adenovirale Vektorsequenzen
bereit. Leider fehlt der Methode nach Chartier et al. ein starkes,
positives Mittel der Selbstselektion der gewünschten Produkte und Flexibilität in der
Art, wie neuartige Vektoren hergestellt werden können.
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Die
internationale Patentanmeldung WO 96/25506 (die Anmeldung '506, Crouzet et al.)
offenbart die Verwendung eines Zwei-Plasmid-Systems mit Selektionsdruckmechanismen,
welche zur Herstellung von Plasmiden befähigen, die von singulären Restriktionsstellen
flankierte adenovirale Vektoren umfassen. Verglichen mit anderen
Methoden nach dem Stand der Technik ist das Verfahren gemäß der Anmeldung '506 in mancher Hinsicht
besser geeignet für
die Herstellung von eukaryotischen viralen Vektoren. So verlangt
z.B. das Verfahren gemäß der Anmeldung '506 nicht, dass zwei
homologe Rekombinationsereignisse gleichzeitig oder praktisch gleichzeitig
auftreten (wie es das Verfahren nach Chartier et al. verlangt).
Diese zeitliche Trennung der Rekombinationsereignisse bietet eine
erhöhte
Möglichkeit,
beide Rekombina tionsschritte in dem Vektorherstellungsprozess zu
erhalten. Um jedoch den "Hintergrund" von unerwünschten
homologen Rekombinationsprodukten zu reduzieren, verlangt und verwendet
das System gemäß der Anmeldung '506 einen spezialisierten
Bakterienstamm. Dieser spezialisierte Stamm enthält einen DNA-Polymerasedefekt,
so dass normale Plasmid-Replikationsursprünge in dem Stamm nicht funktionieren
werden. Jedoch ist in der Anmeldung '506 nur ein derartiger Stamm beschrieben.
Die Verwendung des Verfahrens gemäß der Anmeldung '506 ohne den spezialisierten
Stamm und modifizierten Replikationsursprung überlässt dem Fachmann eine schwierige Screening-Aufgabe,
die so gewaltig ist, dass die gegenüber dem Verfahren nach Chartier
et al. erzielten Verbesserungen des Verfahrens wieder aufgehoben
werden. Dem Verfahren gemäß der Anmeldung '506 fehlt es also
an Flexibilität.
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Systeme,
welche im Stand der Technik beschrieben sind, können die Herstellung neuer
rekombinanter eukaryotischer Viren fördern; zusätzliche Flexibilität und Selektionsdrücke wären jedoch
erwünscht.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes
und flexibles Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen viralen
Vektoren sowie Vektoren, welche in der Umsetzung dieser Verfahren
Anwendung finden können,
bereit. Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie
zusätzliche
erfindungsgemäße Merkmale
ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine duale Selektionskassette (DSC)
nach Anspruch 1 bereit. Die Erfindung betrifft ferner eine DNA gemäß den Ansprüchen 4,
7 und 9, welche eine derartige duale Selektionskassette umfasst.
Bei einer Ausführungsform
der Erfindung umfasst die duale Selektionskassette ein erstes und
ein zweites DNA-Segment, welche Homologie zu einem eukaryotischen
viralen Vektor aufweisen, und ein positives und ein negatives Selektionsgen,
die jeweils funktionell an ihren eigenen Promotor gekoppelt sind. Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Plasmid, pN/P, bereit, umfassend
ein unabhängiges
positives Selektionsmarkergen, einen Replikationsursprung und eine
duale Selektionskassette oder DNA, gemäß Anspruch 16. Bei einer Ausführungsform
umfasst das Plasmid ferner mindestens einen Bestandteil, ausgewählt aus
Folgendem: eine oder mehr singuläre
Restriktionsenzymschnittstel len (URES), eine oder mehr flankierende
Stellen einer ortsspezifischen homologen Rekombination oder eine
Phagenverpackungsstelle. Die duale Selektionskassette und das pN/P-Plasmid
können
zur Herstellung von eukaryotischen Gentransfervektoren verwendet
werden, ohne die Notwendigkeit zeitlich gekoppelter doppelter Rekombinationsereignisse
oder der Verwendung spezialisierter Bakterienstämme, welche die Replikation
von Plasmiden erlauben, die konditionale Replikationsursprünge umfassen.
Dieses Verfahren erhöht
vorteilhaft das Verhältnis
von gewünschten
zu unerwünschten
Plasmid- und Vektorkonstrukten. Die vorliegende Erfindung stellt
ferner ein Verfahren nach Anspruch 18 bereit, welches Verwendung
finden kann für
die Konstruktion einer Bibliothek, umfassend oder bestehend aus
einer Vielzahl der Vektoren gemäß vorliegender
Erfindung, die eine Vielzahl von genetischen Elementen umfassen,
welche gleich oder verschieden sein können und in einer einzigen
Reaktion simultan zusammengebaut werden. Die Merkmale dieser Nucleinsäuren und
dieses Verfahrens erlauben die Herstellung und Verwendung von eukaryotischen
Expressionsbibliotheken im Studium der funktionellen Genomik und
dergleichen.
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Am
besten verdeutlicht wird die Erfindung anhand der beigefügten zeichnerischen
Darstellung und der folgenden Detailbeschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
eine Ausführungsform
des Plasmids pN/P.
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2 zeigt
eine Ausführungsform
des pN/P-Plasmids umfassend einige bevorzugte Elemente.
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3 illustriert
drei Prozesse, durch die pN/P benutzt werden kann, um ein Plasmid
(pDesired) herzustellen, welches einen gewünschten eukaryotischen viralen
Vektor umfasst.
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4 illustriert
einen Prozess, durch den pN/P hergestellt werden kann.
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5 zeigt
einen Prozess, durch den ein gewünschter
eukaryotischer viraler Vektor aus pDesired freigesetzt werden kann,
wenn pDesired zum Teil aus pN/P1 hergestellt wird (unten beschrieben).
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6 zeigt
einen alternativen Prozess, durch den ein gewünschter viraler Vektor aus
pDesired freigesetzt werden kann, wenn pDesired zum Teil aus pN/P1
hergestellt wird.
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7 zeigt
eine Methode nach dem Stand der Technik zur Herstellung von adenoviralen
Vektoren in Bakterien.
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8 zeigt
eine Ausführungsform
von pN/P, wobei das negative Selektionsgen konditional gesilenct wird.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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DAS pN/P-PLASMID
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Plasmid, pN/P, bereit (1),
welches in der Konstruktion eukaryotischer viraler Vektoren und
dergleichen Anwendung finden kann. Das Plasmid pN/P ist eine zirkuläre DNA enthaltend
ein erstes unabhängiges
positives Selektionsmarkergen, einen Replikationsursprung, eine
duale Selektionskassette (DSC) und ein Element, welches aus der
Gruppe ausgewählt
ist, die aus Folgendem besteht: (a) eine oder mehr (z.B. zwei) DNA-Bindungsstellen
eines ortsspezifischen homologen Rekombinationssystems (z.B. ψRec-Stellen;
liegen in pN/P1 vor), (b) eine oder mehr (z.B. zwei) Restriktionsenzymschnittstellen
(z.B. pRESs; liegen pN/P2 vor) distinkt von denen der dualen Selektionskassette
(wenn die DSC eine URES umfasst) und (c) mindestens eine Phagenverpackungsstelle
(siehe z.B. pN/Pϕ). Das pN/P-Plasmid kann verwendet werden,
um rasch einen großen
Satz verwandter viraler Vektoren herzustellen, wobei jeder Vektor
des Satzes ein neues virales oder Passagier-Gen umfasst, welches
die DSC eines von pN/P getragenen viralen Vektors ersetzt.
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DAS POSITIVE
SELEKTIONSMARKERGEN
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Das
erste unabhängige
positive Selektionsmarkergen von pN/P (im Folgenden "erstes Markergen" genannt) ist ein
beliebiges von einer zirkulären
DNA getra genes Gen, das einem Bakterium, welches ein das Gen umfassendes
Plasmid trägt,
unter einer besonderen und bekannten Bedingung einen Wachstumsvorteil
verleiht. Das erste Markergen ist distinkt von dem positiven Selektionsgen
der DSC (im Folgenden "positives
Selektionsgen" genannt),
wie unten beschrieben, und wird benutzt, um pN/P in einem replizierenden
bakteriellen Wirt aufrechtzuerhalten. Übliche Beispiele für Gene,
welche zur Verwendung als erstes Markergen geeignet sind, umfassen
Auxotrophie-komplementierende Gene und Antibiotika-Resistenz-Gene,
wie z.B. das beta-Lactamase-Gen (welches Resistenz gegen Ampicillin
verleiht), das Chloramphenicol-Acetyl-transferase-Gen (welches Resistenz gegen
Chloramphenicol verleiht) und das Kanamycin-Resistenz-Gen (in 2 illustriert).
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DER REPLIKATIONSURSPRUNG
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Der
Replikationsursprung von pN/P kann ein beliebiger Replikationsursprung
sein. Wenn pN/P ein besonders großes Plasmid ist oder hochtoxische
Sequenzen umfasst, dann kann es zu bevorzugen sein, dass der Replikationsursprung
eine geringe Kopienzahl des Plasmids in der Zelle unterstützt, um
die Aufrechterhaltung des pN/P-Plasmids in der Zelle zu begünstigen.
Ferner kann pN/P in einem homologen Rekombinationsereignis mit einem
zweiten Plasmid (d.h. einer zweiten DNA) verwendet werden. Das homologe
Rekombinationsereignis ist darauf ausgerichtet, das negative Selektionsgen
von der DSC auf die zweite DNA zu transferieren, wodurch ein zweites
DNA-Nebenprodukt sowie das Produkt pDesired hergestellt werden.
Es ist notwendig für
mindestens eine Zelle, welche pDesired umfasst, das zweite DNA-Nebenprodukt
nicht aufzuweisen, so dass, wenn die negative Selektion im Wesentlichen
aktiv ist, pDesired-enthaltende Zellen produziert werden. Deshalb
sollte der Replikationsursprung von pN/P identisch oder sonstwie
inkompatibel sein mit einem von der zweiten DNA getragenen Replikationsursprung
bei der Methode II oder III (wie in 3 dargestellt und
unten im Detail erörtert).
Alternativ kann der Replikationsursprung des Donor-Plasmids ein
konditionaler Replikationsursprung sein.
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DIE DUALE
SELEKTIONSKASSETTE
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Die
duale Selektionskassette (DSC) enthält mindestens sechs genetische
Elemente (oder funktionelle DNA-Segmente), die einander überlappen
können
(aber nicht müssen)
und umfassen: (i) eine erste und (ii) eine zweite Region mit Homologie
zu einem viralen Vektor, (iii) eine ein negatives Selektionsgenprodukt
codierende DNA, welche funktionell gekoppelt ist an (iv) einen negativen
Selektionsgenpromotor, und (v) ein positives Selektionsgen, welches
funktionell gekoppelt ist an (vi) einen positiven Selektionsgenpromotor.
Eine ein Selektionsgenprodukt codierende DNA in funktioneller Kopplung
mit ihrem Selektionspromotor wird als Selektionsgen bezeichnet (zum
Zwecke der vorliegenden Erfindung).
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Die
Identitäten
der ersten und der zweiten Homologieregion werden unabhängig voneinander
ausgewählt
und weisen eine ausreichende Größe und Homologie
auf, um ein homologes Rekombinationsereignis mit einem eukaryotischen
viralen Vektor oder einem Analogon hiervon zu ermöglichen,
derart, dass eine gewünschte
Region eines Virus, viralen Vektors oder Analogons hiervon als eine
Folge des homologen Rekombinationsereignisses ersetzt (oder modifiziert)
wird, wie unten beschrieben. Die erste und die zweite Homologieregion
sind durch das negative und das positive Selektionsgen der DSC getrennt.
Weiter: wenn pN/P ein oder mehrere virale ITRs umfasst, kann eine
oder beide Homologieregionen ein ITR oder einen Teil hiervon umfassen.
Bei dem Virus, viralen Vektor oder Analogon hiervon, welches mit
der DSC rekombinieren wird, kann die DNA, die homolog zu der ersten
und der zweiten Homologieregion ist, angrenzend sein oder durch ein
intervenierendes DNA-Segment getrennt sein. (Es versteht sich ferner,
dass zahlreiche Ausführungsformen
von viralen Vektoren heterologe Passagier-Gene oder heterologe DNA-Segmente umfassen
und dass diese heterologen Passagier-Gene oder DNA-Segmente in der homologen
Rekombinationsreaktion, wie im vorliegenden Absatz beschrieben,
verwendet werden können.)
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein negatives Selektionsgenprodukt
eine beliebige RNA oder ein Protein, welches unter geeigneten Bedingungen
einem es exprimierenden Wirt einen starken Wachstumsnachsteil verleihen,
bevorzugt den Tod eines es exprimierenden Wirtes verursachen kann.
Das ne gative Selektionsgen wird dazu verwendet, den Reaktionsprozess
vorwärts
zu "treiben" (d.h. auf gewünschte Vektorkonstrukte
zu selektionieren und die Eliminierung unerwünschter Vektorkonstrukte zu
verursachen). Geeignete negative Selektionsgene umfassen, ohne jedoch
hierauf beschränkt
zu sein, NP-1, sacB, ccd-Gene (z.B. ccdB), ein Tetracyclin-Resistenz-Gen
(tetR), par-Gene (z.B. parD) und Kid. Geeignete
negative Selektionsgene umfassen ferner Fusionsproteine dieser Gene
(z.B. Gene umfassend Bereiche dieser Gene, welche fusioniert sind
mit Bereichen der Gene, die Thioredoxin, β-Galactosidase, die OmpA-Signalsequenz,
Luciferase, Protein A oder einen beliebigen anderen geeigneten Fusionspartner
codieren). Geeignete negative Selektionsgene umfassen ferner aktive
Varianten der vorstehend erwähnten
Gene, welche Deletionen, Mutationen oder andere Modifikationen umfassen
können.
Kurz gesagt: ein geeignetes negatives Selektionsgen sorgt für den Tod oder
eine wesentliche Verminderung der Wachstumsrate eines es exprimierenden
Bakteriums. Eine Diskussion negativer Selektionsgene kann in Escherichia
coli and Salmonella, ch. 22, S. 2317, 2318 (Niedhardt ed., 2d ed.
1996) gefunden werden.
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Zur
weiteren Illustration, aber nicht Limitierung, sei vermerkt, dass
die ein OmpA FLAG/NP-1-Fusionsprotein codierende DNA ein Beispiel
für ein
negatives Selektionsgen darstellt, welches für die vorliegende Erfindung
Anwendung finden kann. Das OmpA FLAG/NP-1-Genprodukt ist ein Ratten-Defensin-Fusionsprotein, dem
seine kognate Signalsequenz fehlt und das ferner die OmpA-Signalsequenz
umfasst. Die Herstellung eines OmpA FLAG/NP-1-Fusionsproteins in
einem Bakterium macht das betreffende Bakterium lebensunfähig. Ohne
Beschränkung
auf eine bestimmte Theorie ist eine Erklärung für die negative Selektionswirkung
von OmpA FLAG/NP-1, dass das OmpA-Signal den NP-1-Bereich des Proteins
in oder proximal zu einer Bakterienmembran lokalisiert, so dass
der NP-1-Bereich des Proteins Poren in dieser Membran bildet und
die Lebensfähigkeit
der Wirtszelle zerstört.
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Das
sacB-Gen, obschon für
die vorliegende Erfindung nicht bevorzugt, steht als Beispiel für ein weiteres
negatives Selektionsgen. Das sacB-Genprodukt wandelt Sucrose (wenn
in dem Wachstumsmedium vorhanden) in Levan um, das für Bakterien
hoch toxisch ist. Das sacB-Negativselektionsgen kann regu liegt werden,
indem einem Bakterienwirt, der sacB konstitutiv exprimiert, Sucrose
bereitgestellt oder vorenthalten wird.
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Der
negative Selektionsgenpromotor kann stark regulierbar sein (d.h.
induzierbar, supprimierbar oder sowohl induzierbar als auch supprimierbar),
um eine Kontrolle über
den negativen Selektionsdruck, den das negative Selektionsgen ausübt, bereitzustellen.
Alternativ, wenn der negative Selektionsgenpromotor nicht regulierbar
ist, dann muss ein geeignetes Mittel zur Verhinderung der Funktion
des negativen Selektionsgens eingesetzt werden. Geeignete Mittel
zum Kontrollieren der Funktion des negativen Selektionsgens umfassen, ohne
jedoch hierauf beschränkt
zu sein, Vorenthalten oder Bereitstellen eines Substrates, welches
das negative Selektionsgen in ein toxisches Produkt umwandelt (z.B.
Sucrose für
das sacB-Gen) oder in trans-Bereitstellen eines starken Regulators
des negativen Selektionsgenproduktes. Der Tac-Promotor (ein Trp-
und lac-Hybrid-Promotor), welcher durch das lac I-Protein reprimierbar
und durch IPTG induzierbar ist, ist ein Beispiel für einen
geeigneten negativen Selektionsgenpromotor im Kontext der vorliegenden
Erfindung. Um ein ausreichendes Maß an Kontrolle über den
Tac-Promotor zu erzielen, ist es bevorzugt, diesen Promotor in Kombination
mit einem Bakterienstamm zu benutzen, der das Repressor-Protein
exprimiert, z.B. ein lac-Stamm, bevorzugt ein lac IQ-Stamm, oder einem
Bakterienstamm mit einem Plasmid, welches das lac-Repressor-Protein
exprimiert. Die Einbeziehung eines lac IQ-Gens
in pN/P erleichtert die Insertion der DSC in den Regionen E3 und
E4.
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Das
positive Selektionsgen der DSC ist bevorzugt distinkt von dem ersten
Markergen; jedoch sind Gene, die zur Verwendung als erstes Markergen
geeignet sind, auch zur Verwendung als positives Selektionsgen der
dualen Selektionskassette geeignet. Das Zeocin-Resistenz-Gen, ble,
ist in 2 als positives Selektionsgen der DSC gezeigt.
Das positive Selektionsgen liegt physisch nahe (d.h. proximal) bei
dem negativen Selektionsgen. Somit sind diese Gene genetisch gekoppelt
und der Selektionsdruck zur Retention des positiven Selektionsgens
wird dazu neigen, einen Selektionsdruck gegen den Verlust des negativen
Selektionsgens auszuüben
(natürlich
nur, wenn das negative Selektionsgen inaktiv ist).
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Der
positive Selektionsgenpromotor kann ein beliebiger geeigneter Promotor
sein, es wird jedoch erkennbar sein, dass ein konstitutiver Promotor
für viele
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, mindestens insofern, als
der Fachmann der Funktion des positiven Selektionsgenpromotors dann
keine Aufmerksamkeit schenken muss.
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Der
positive Selektionsgenpromotor ist bevorzugt so positioniert und/oder
orientiert, dass er die Transkription einer RNA, welche das negative
Selektionsgenprodukt codiert, nicht promotiert (d.h. dass er die
Transkription einer sense-Strang-RNA des negativen Selektionsgens
nicht promotiert). Wie in 1 gezeigt,
kann dies dadurch erreicht werden, dass der positive und der negative
Genpromotor in einer 5'-zu-5'- (oder Rücken-gegen-Rücken-)Orientierung
platziert werden, so dass Transkription an jedem Promotor startet
und in entgegengesetzter Richtung fortschreitet.
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Optional
kann ein einziges Gen – in
Abhängigkeit
vom Promotor – sowohl
als positives als auch als negatives Selektionsgen wirken. So kann
z.B. eine DSC, welche einen EM-7-Promotor umfasst und ein Zeocin-Resistenz-Protein
codiert oder ein lacZ-Zeocin-Resistenz-Fusionsprotein codiert, in
den Vektor gemäß vorliegender
Erfindung inkorporiert werden. Das DNA-Fragment, das den EM-7-Promotor
umfasst, enthält
tatsächlich
zwei Promotoren. Ein Promotor ist ein konstitutiver Promotor, der
von bakteriellen Wirtszellpolymerasen erkannt wird. Eingebettet
in das DNA-Fragment, welches den EM-7-Promotor umfasst, befindet
sich ein T7-Promotor, der nur von T7-RNA-Polymerase erkannt wird.
In einer Zelle, der T7-RNA-Polymerase fehlt, herrscht ein starker
positiver Selektionsdruck in Anwesenheit von Zeocin oder Zeocin-Analoga.
Das Gen funktioniert also als positives Selektionsgen. Dagegen wächst im
Falle einer Zelle, welche T7-RNA-Polymerase exprimiert, die Zelle
sehr langsam oder stirbt. T7-Polymerase kann konstitutiv oder induktiv
aus dem bakteriellen Genom oder einem Plasmid in der Zelle exprimiert
werden, oder sie kann durch Superinfektion mit einem Phagen bereitgestellt
werden. In Anwesenheit von T7-Polymerase funktioniert das Gen als
negatives Selektionsgen. Somit kann diese DSC zur Selektionierung
auf Zellen verwendet werden, indem Zeocin oder ein Zeocin-Analogon
zu dem Wachstumsmedium hinzugegeben wird, und sie kann zur Antiselektionierung
auf Zellen verwendet werden, indem man sicherstellt, dass T7-RNA-Polymerase
in den Zellen exprimiert wird.
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Ohne
Beschränkung
auf eine bestimmte Theorie geht man davon aus, dass stringente RNA-Polymerasen
(z.B. T7) eine wesentlich höhere
Affinität
zu Nucleotiden haben als Wirts-RNA-Polymerasen. Wenn die T7-RNA-Polymerase
die Expression der DSC dirigiert, werden die metabolischen Prozesse
der Wirtszelle so depletiert, dass die Wachstumsrate der Zelle stark
abgeschwächt
wird. Diese Wirkung erscheint umso stärker, wenn das RNA-Transkript
der T7-Polymerase die Translation eines substantiellen offenen Leserahmens (ORF)
(mindestens ca. 15 Aminosäuren
lang, bevorzugt aber mehr als ca. 30 oder 100 Aminosäuren lang)
dirigiert und wenn dem ORF eine Shine-Dalgarno-Sequenz vorangestellt ist.
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Die
duale Selektionskassette umfasst optimal ferner eine singuläre Restriktionsenzymschnittstelle (URES).
Spaltung der DNA an der URES resultiert in einer starken Abschwächung oder
Eliminierung des negativen Selektionsdrucks, der von dem negativen
Selektionsgen bereitgestellt wird (wenn das die DSC enthaltende
Bakterium in Zustände
gebracht wird, in denen das negative Selektionsgen oder Genprodukt
aktiv ist). Diese Modifikation des pN/P-Plasmids erlaubt dem Fachmann,
die homologe Rekombination zu nutzen, um rasch einen eukaryotischen
viralen Gentransfervektor herzustellen, ohne sich auf Bakterienstämme zu stützen, die
Mutationen in ihren DNA-Polymerasen umfassen (wie es bei dem in 7 dargestellten
Verfahren nach dem Stand der Technik notwendig ist). Vielmehr ermöglicht es
die Verwendung des pN/P-Plasmids,
welches eine URES in der DSC umfasst, dass sich der Fachmann praktisch
jeden beliebigen Bakterienstamm und die spezialisierten genetischen
Merkmale, die jeder dieser Stämme
zu bieten hat, zunutze machen kann.
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Eine
bevorzugte Platzierung der URES in der DSC liegt zwischen dem negativen
Selektionsgenpromotor und dem negativen Selektionsgen, so dass,
wenn pN/P an der in der dualen Selektionskassette enthaltenen singulären Restriktionsstelle
geschnitten wird, das negative Selektionsgen von seinem Promotor
funktionell getrennt wird. Wenn OmpA/NP-1 als negatives Selektionsgen
verwendet wird, kann die singuläre
Restriktionsstelle auch zwischen die DNA, welche die OmpA-Signalsequenz
codiert, und die DNA, welche das NP-1-Polypeptid oder -Protein codiert,
platziert werden, so dass beim Schneiden der Restriktionsstelle
das resultierende Genprodukt keinen negativen Selektionsdruck auf
das Wirtsbakterium ausübt.
Für den
Fachmann wird erkennbar sein, dass eine breite Vielfalt geeigneter äquivalenter
URES-Platzierungen existiert, und er wird ohne weiteres viele von
diesen identifizieren können
basierend auf dem Kontext des in der jeweiligen Ausführungsform
tatsächlich
verwendeten negativen Selektionsgens. Ferner ist es zulässig, mehr
als ein Auftreten der URES in der DSC für die jeweilige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung vorzusehen (z.B. sowohl vor als auch
hinter dem negativen Selektionsgenpromotor).
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pN/P
enthält
bevorzugt mindestens ein, mehr bevorzugt mindestens zwei eukaryotische
virale ITRs (wie in 1 gezeigt). Ein oder beide ITRs
können,
müssen
aber nicht, Teil der dualen Selektionskassette bilden. Eine Ausführungsform
von pN/P ist pN/P1. pN/P1 umfasst eine oder mehr ψRec-Stellen,
lokalisiert an den Enden der DSC, und weitere, in pN/P vorliegende
virale Vektorelemente, welche letztlich in dem Produkt-Gentransfervektor
repräsentiert
sein werden.
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Der
Einfachheit halber gelten die folgenden Definitionen für pN/P-Plasmide
inklusive pN/P1 und pN/P2 (zum Zwecke der vorliegenden Erfindung).
Ein DNA-Segment
ist als auf dem Plasmid-Segment von pN/P enthalten definiert, wenn
es sich auf dem Bereich der DNA befindet, der den Replikationsursprung
und den unabhängigen
ersten positiven Selektionsgenmarker enthält. Ein DNA-Segment ist als auf dem viralen Segment von
pN/P befindlich definiert, wenn es auf dem verbleibenden DNA-Segment
liegt. Von den oben zitierten Elementen werden nur das erste Markergen
und der Replikationsursprung auf dem Plasmid-Fragment getragen, die
anderen Elemente befinden sich auf dem viralen Fragment von pN/P.
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Die ψRec-Stellen
von pN/P1 können
in beliebiger Orientierung platziert werden. Bei Vorhandensein von
zwei ψRec-Stellen,
die parallel sind, wird dann, wenn die zirkuläre DNA mit einer geeigneten
ortsspezifischen homologen Re kombination kontaktiert wird, eine
zweite und eine dritte (kleinere) zirkuläre DNA aus pN/P oder einer
geeigneten Variante von pN/P erhalten.
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GESILENCTE
DUALE SELEKTIONSKASSETTEN
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Bei
einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, die Funktion des negativen
Selektionsgens der DSC konditional zu verhindern durch ein Verfahren,
welches von einer Entfernung eines essentiellen Elementes des negativen
Gens oder der Entkopplung (z.B. durch Restriktionsverdau) des Promotors
und der das Genprodukt codierenden DNA verschieden ist. Eine duale
Selektionskassette, welche ein konditional gesilenctes negatives
Selektionsgen enthält,
ist eine konditional gesilencte DSC. Wenn es wünschenswert ist, Manipulationen
eines eine DSC umfassenden Plasmids in einer Zelle durchzuführen, die unfähig oder
temporär
unfähig
ist, den negativen Selektionsgenpromotor adäquat zu supprimieren, dann
ist die Verwendung einer konditional gesilencten DSC vorteilhaft.
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Eine
konditional gesilencte DSC kann u.a. hergestellt werden durch Inserieren
einer Transkriptions-Blockierungssequenz oder einer translationalen
Missense-Generierungssequenz
zwischen einem Paar von URESs, welche in der DSC zwischen dem negativen
Selektionsgenpromotor und der DNA, die das negative Selektionsgenprodukt
codiert, lokalisiert sind (siehe z.B. 8). Beispielsweise
kann eine DSC eine translationale Missense-Generierungsblockierungssequenz
aufweisen, welche von einer ersten und einer zweiten singulären Restriktionsenzymschnittstelle
flankiert ist (die erste und die zweite URES gemäß dieser Ausführungsform
können,
müssen
aber nicht identisch oder Isoschizomere sein). In diesem Fall ist
die Blockierungssequenz stromabwärts
der Shine-Dalgarno-Sequenz (oder deren Äquivalent) und stromaufwärts des
Translations-Initiations-Codons der DNA, die das negative Selektionsgenprodukt
codiert, platziert, so dass die Translation (Proteinsynthese) in
der Blockierungssequenz initiiert wird, und befindet sich in einem
alternativen Leserahmen, der von dem offenen Leserahmen der DNA,
die das negative Selektionsgenprodukt codiert, verschieden ist.
Bevorzugt wird der Leserahmen der Blockierungssequenz so ausgewählt, dass
ein Translations-Terminations-Codon der kognaten Translations-Initiationsstelle
der DNA, die das negative Selektionsgenprodukt codiert, nicht vorangestellt
ist. Somit resultiert eine unge wollte Transkription von dem negativen
Selektionsgenpromotor aus in einem Proteinprodukt, welches von dem
negativen Selektionsgenprodukt verschieden ist.
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Eine
alternative Blockierungssequenz ist eine Rho-abhängige (oder andere) Transkriptions-Terminationssequenz.
Somit wird ein angemessener Level an von dem negativen Selektionsgenpromotor
ausgehender Transkriptionsinitiation terminiert, bevor das negative
Selektionsgenprodukt produziert wird, so dass die Zelle, die die
gesilencte DSC beherbergt, vor den letalen Effekten des negativen
Selektionsgens geschützt
ist.
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Es
ist bevorzugt, wenn die URESs, welche die Blockierungssequenz flankieren,
kompatible kohäsive Enden
erzeugen, so dass die gesilencte DSC leicht durch Restriktionsverdau
und Religation in eine aktive DSC konvertiert werden kann, was den
Verlust der Blockierungssequenz zur Folge hat. Selbstverständlich wird
für den
Fachmann erkennbar sein, dass eine Vielzahl von Silencing-Sequenzen
in die DSC inseriert werden können,
so dass das negative Selektionsgen durch einen zweiten Mechanismus
gesilenct werden kann, der unabhängig
ist von dem Mechanismus, welcher zum Regulieren der DSC verwendet
wird, und der keine Blockierungssequenz umfasst.
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Wenn
die Blockierungssequenz der gesilencten DSC entfernt ist, kann das
negative Selektionsgen aktiv werden. Das heißt, das negative Selektionsgenprodukt
kann produziert werden. Es versteht sich, dass das Entfernen der
Blockierungssequenz eine Regulation des negativen Selektionsgenpromotors,
Nicht-Zuführung eines
Substrates für
das negative Selektionsgenprodukt oder andere Mittel zum Kontrollieren
des negativen Selektionsgens nicht ausschließt.
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ψRec-STELLEN
VON pN/P1
-
Die ψRec-Stellen
sind beliebige geeignete DNA-Bindungsstellen einer ortsspezifischen
homologen Rekombination. Die ψRec-Stellen sind bevorzugt
lox-Stellen. Andere
geeignete ψRec-Stellen
umfassen z.B. die FRT-Stellen des FLP-FRT-Systems und die Rs-Stellen
des R-Rs-Systems.
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RESTRIKTIONSENZYMSCHNITTSTELLEN
VON pN/P2
-
Eine
weitere Ausführungsform
von pN/P ist pN/P2, welches ein pN/P-Plasmid ist, worin die ψRec-Stellen
von pN/P1 durch eine oder mehr Restriktionsenzymschnittstellen (pRESs)
ersetzt sind, die bevorzugt verschieden von der URES der DSC sind,
wenn die DSC eine URES umfasst, und bevorzugt nicht in dem viralen Fragment
von pDesired enthalten sind. Wenn zwei Restriktionsstellen (d.h.
ein Paar) vorhanden sind, dann können
diese vorteilhaft gleich sein, so dass ein einziges Restriktionsenzym
den viralen Vektor vollständig
aus einem aus pN/P2 hergestellten pDesired-Plasmid freisetzen kann,
obschon es ohne weiteres erkennbar sein wird, dass diese Stellen
auch verschieden sein können.
Pac I ist ein Beispiel für
eine Art von URES, die häufig zur
Verwendung in pN/P2 geeignet ist. Der Einfachheit halber wird pN/P
so verwendet, dass es sich sowohl auf pN/P1 als auch auf pN/P2 bezieht,
wenn nicht ausdrücklich
anders angegeben.
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Das
Plasmid pN/P2B ist eine weitere Ausführungsform von pN/P2. In pN/P2B
umfasst die erste und/oder die zweite Homologieregion der DSC ein
ITR. Ferner ist eine Restriktionsenzymschnittstelle (d.h. eine URES),
die durch ein Restriktionsenzym gespalten werden kann, welches nicht
innerhalb der DSC oder innerhalb des viralen Fragmentes eines bestimmten,
mittels pN/P2B hergestellten pDesired-Plasmids schneidet, in einer
Position lokalisiert, die geeignet proximal zu dem ITR der ersten
oder der zweiten Homologieregion an gegenüberliegenden Enden der DSC
liegt. Bei dieser Ausführungsform
kann ein pDesired-Plasmid gemäß der in 3 dargelegten
Methodik hergestellt, mit einem für die URES spezifischen Enzym
geschnitten und in eine eukaryotische Zelle transfiziert werden,
die für
das Wachstum des in pDesired enthaltenen viralen Vektor permissiv
ist. Weil der Restriktionsverdau das ITR geeignet proximal (d.h.
innerhalb von ca. 2000 bp, bevorzugt innerhalb ca. 300 bp, mehr
bevorzugt innerhalb ca. 100 bp, am meisten bevorzugt innerhalb ca.
35 bp) zu dem Ende der DNA bringt, ist der virale Vektor in der
Lage zu replizieren.
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PHAGENVERPACKUNGSSTELLEN
pN/Pϕ
-
Eine
weitere Ausführungsform
von pN/P ist pN/Pϕ. pN/Pϕ umfasst eine Phagenverpackungsstelle (z.B.
eine Lambda-cos-Stelle oder eine Phagen-P1-Ver packungsstelle) auf
dem Plasmid-Fragment von pN/P, was die Herstellung von Cosmid-Bibliotheken
und dergleichen erlaubt. Viele Phagen-Verpackungsprozesse linearisieren
die DNA, welche encapsidiert werden soll, an oder sehr nahe bei
der Phagenverpackungssequenz. Ferner: wenn ein ITR eines viralen
Genoms (z.B. eines adenoviralen Genoms) geeignet proximal (d.h.
innerhalb von ca. 2000 bp, bevorzugt innerhalb ca. 300 bp, mehr
bevorzugt innerhalb ca. 100 bp, am meisten bevorzugt innerhalb ca.
35 bp) zu einem Ende der betreffenden DNA liegt, kann es die Replikationsinitiation
dieses viralen Genoms (oder dieser viralen Vektor-DNA) in einer
permissiven Zelle vermitteln, selbst wenn das gegenüberliegende
ITR nicht geeignet proximal zu einem Ende liegt. Deshalb liegt die
Phagenverpackungsstelle bevorzugt (geeignet) proximal zu einem ITR
eines viralen Vektors, welcher in pN/Pϕ enthalten ist.
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pN/Pϕ kann
zu pDesired prozessiert werden (siehe 3), und
dieses pDesired-Plasmid (der Einfachheit halber als pDesired-ϕ bezeichnet)
kann in einer Zelle oder in einem Extrakt inkubiert werden, die
bzw. der in der Lage ist, geeignet große DNAs in ein Phagencapsid
zu encapsidieren. Das encapsidierte pDesired-ϕ kann dann
direkt in eukaryotische Zellen transfiziert werden, insbesondere
in vitro. Selbstverständlich
können die
phagenartigen Partikel, welche das linearisierte pDesired-ϕ enthalten,
auch extrahiert werden, um "uncoated" pDesired-ϕ zu
erhalten, und dieses "uncoated" pDesired-ϕ kann
ferner dazu verwendet werden, Zielzellen in beliebiger geeigneter,
auf dem Fachgebiet bekannter Weise zu transfizieren. Somit erlaubt
die Verwendung einer Encapsidierungsstelle, welche in pN/Pϕ vorliegt,
die rasche Herstellung eukaryotischer viraler Vektoren in pDesired,
die direkt einsetzbar sind, insbesondere in vitro.
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pDesired-ϕ kann
ferner in ein Phagencapsid verpackt werden, welches ein modifiziertes
Coat-Protein umfasst. Modifizierte Coat-Proteine ähnlich den
in US-Patent Nr.
5 559 099 (Wickham et al.), US-Patent Nr. 5 712 136 (Wickham et
al.), der internationalen Patentanmeldung WO 98/07877 (GenVec, Inc.),
der internationalen Patentanmeldung WO 98/07865 (GenVec, Inc.) und
der internationalen Patentanmeldung WO 97/20051 (GenVec, Inc.) beschriebenen
können
das Targeting des pDesired/Phagen-Partikels auf eine Zielzelle richten (d.h.
eine in einem eukaryotischen (z.B. dem menschlichen) Organismus
vorkommende oder aus demselben gewonnene Zielzelle).
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So
kann beispielsweise das Gen, welches das D-Protein von Lambda codiert,
modifiziert werden durch Insertion von DNA, die für eine Aminosäuresequenz
codiert, welche für
eine Zelloberflächenstruktur,
einen Rezeptor (einschließlich
Zelloberflächen-Liposacchariden
und dergleichen), einen Antikörper
oder ein Epitop am Amino- und/oder Carboxyl-Terminus (d.h. innerhalb
von ca. 10, bevorzugt innerhalb von ca. 3 Aminosäuren von einem Ende) spezifisch
ist. Alternativ kann das Lambda-D-Coat-Protein chemisch (d.h. kovalent) oder
transient (d.h. nicht-kovalent) modifiziert werden durch ein bispezifisches
Molekül
mit Affinität
zu einem Lambda-Coat-Protein und (i) einer Zelloberflächenstruktur,
(ii) einem Rezeptor (einschließlich
Zelloberflächen-Liposacchariden
und dergleichen), (iii) einem Antikörper oder (iv) einem Epitop.
Diese modifizierte D-Protein kann dann zur Herstellung eines in
einem "re-targeted" Lambda-Capsid encapsidierten
pDesired-ϕ verwendet werden.
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Im
Kontext der Erfindung kann ferner die Modifikation eines T7-Verpackungssystems
Anwendung finden. Bei diesem Beispiel kann das Proteinprodukt eines
rekombinanten T7-Gens 10, welches ein carboxyterminal modifiziertes
Protein 10 oder ein carboxyterminal modifiziertes Wildtyp-Protein
10 codiert, in einem T7-Verpackungsextrakt verwendet werden, um
ein in einem "retargeted" T7-Capsid encapsidiertes
pDesired-ϕ herzustellen.
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In
Wildtyp- oder modifizierten Phagencapsiden verpacktes pDesired-ϕ kann
dazu benutzt werden, Zielzellen Transgene zu liefern. Das verpackte
pDesired-ϕ wird mit einer eukaryotischen Zelle in Kontakt
gebracht. Die eukaryotische Zelle internalisiert das encapsidierte
pDesired-ϕ. Durch diesen Internalisierungsprozess wird
die encapsidierte DNA im Wesentlichen frei von den sie umgebenden
Capsidproteinen, so dass jedes Gen von pDesired-ϕ, welches
dazu befähigt
ist, in der Ziel-Eukaryotenzelle exprimiert zu werden, transkribiert
und translatiert werden kann und der virale Vektor replizieren kann.
Bevorzugt wird der "targeted" pDesired-ϕ-Phage
mit einem endosomolytischen Agens internalisiert, so dass das endosomolytische
Agens die Endo somen zum Platzen bringt, welche das Agens und pDesired-ϕ enthalten.
Es ist bekannt, dass ein derartiges Platzen die Expressionseffizienz
des Gentransfervektors beträchtlich
erhöht.
Beispiele für
endosomolytische Agenzien, welche im Kontext der vorliegenden Erfindung
zur Verwendung kommen können,
umfassen Chloroquin, Calciumphosphat-Partikel, adenovirale Coat-Proteine
(inklusive adenoviraler Virionen) und adenoassoziierte virale Coat-Proteine
(einschließlich
AAV-Virione).
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SYNTHESE VON pN/P-PLASMIDEN
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pN/P
kann auf beliebige geeignete Weise hergestellt werden. Ein Verfahren
zur Herstellung von pN/P nutzt eine Doppel-Rekombination zwischen
einem sogenannten viralen Rezeptor-Plasmid und einem sogenannten
Dualselektionskassetten-Donor-Plasmid (siehe 4). Das
virale Rezeptor-Plasmid umfasst ein erstes Markergen, ψRec-
oder URES-Stellen und ein oder mehrere DNA-Segmente mit hoher Homologie zu einem eukaryotischen
Virus. Wenn das pN/P-Produktplasmid auch die optionalen eukaryotischen
viralen ITRs enthalten soll, dann enthält häufig auch das virale Rezeptor-Plasmid
diese ITRs. Die optionalen ITRs und die DNA mit Homologie zu einem
eukaryotischen Virus sind in dem viralen Rezeptor-Plasmid auf dem
DNA-Segment positioniert, welches durch die ψRec-Stellen
definiert ist und gegenüber
dem unabhängigen
positiven Selektionsmarkergen liegt.
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Das
Dualselektionskassetten-Donor-Plasmid umfasst eine duale Selektionskassette,
welche optimal jedes der oben definierten sechs genetischen Elemente
umfasst. Häufig
ist die duale Selektionskassette identisch mit der dualen Selektionskassette,
die letztlich in dem gewünschten
pN/P-Plasmid residieren wird. Ein bevorzugtes Verfahren besteht
darin, dass das virale Rezeptor-Plasmid zirkulär ist, während das DSC-Donor-Plasmid
linear ist.
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Nach
Transfektion und einem dualen Rekombinationsereignis können Kolonien,
welche das gewünschte
pN/P-Plasmid umfassen, anhand ihrer Resistenz gegenüber sowohl
dem unabhängigen
positiven Selektionsmarkergen von pN/P als auch dem positiven Selektionsgen
der dualen Selektionskassette selektioniert werden. Somit können Bakterienkolonien,
welche das gewünschte
pN/P-Plasmid umfassen,
leicht identifiziert werden, um die Verwendung des Pro dukt-pN/P-Plasmids
zu erlauben. Ferner wird erkennbar sein, dass zahlreiche andere
Wege existieren, um weitere Ausführungsformen
des pN/P-Plasmids herzustellen, z.B. durch die homologe Rekombination
von zwei bereits existierenden pN/P-Plasmid-Ausführungsformen oder dergleichen
und durch molekularbiologische Routinemethoden, einschließlich Ligation
von Restriktionsverdauungsprodukten und ortsspezifischer oder regionalspezifischer
Mutagenese von pN/P-Plasmiden oder anderen Plasmiden.
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Natürlich wird
der Fachmann erkennen, dass eine Vielzahl von Techniken existiert,
um ein besonderes, gewünschtes
pN/P-Plasmid zu erhalten. Die vorstehende Diskussion der Synthese
eines pN/P-Plasmids ist deshalb so zu verstehen, dass sie die Erfindung
beispielhaft erläutern
soll, ohne den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen
zu wollen.
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VERWENDUNG VON pN/P-PLASMIDEN
-
Es
kann ein beliebiger besonderer pN/P-Vektor gemäß vorliegender Erfindung nach
einer oder mehreren der folgenden generellen Methoden verwendet
werden (siehe 3).
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Die
erste Methode ("Methode
I" von 3)
umfasst das Linearisieren von pN/P mit einem Restriktionsenzym,
welches die singuläre
Restriktionsenzymschnittstelle innerhalb der dualen Selektionskassette schneidet.
Eine zweite DNA (linear oder zirkulär) umfassend DNA-Segmente mit
hoher Homologie zu der ersten und der zweiten Homologieregion wird
mit dem linearisierten pN/P-Vektor
in einen bakteriellen Wirt cotransformiert. Bei einer Ausführungsform
wird pN/P nicht dem Restriktionsverdau unterworfen; sondern vielmehr
als zirkuläres
Plasmid belassen, während
die zweite DNA linear ist. Nach Transfektion der DNAs in den bakteriellen
Wirt vermitteln von dem Wirt bereitgestellte Enzyme zwei homologe
Rekombinationsereignisse. Bei einer anderen Ausführungsform ist die zweite DNA
linear und wird an einer singulären
Restriktionsstelle in pN/P ligiert, anstatt homolog in das Plasmid
rekombiniert zu werden.
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Der
Wirt wird dann für
einen geeigneten Zeitabschnitt (z.B. 2-24 Stunden) unter Bedingungen
gehalten, die für
das erste positive Selektionsmarkergen der dualen Selektionskassette
selektiv sind. Sodann wird der transformierte bakterielle Wirt unter
solchen Bedingungen wachsen gelassen, dass der negative Selektionsgenpromotor
aktiv wird (d.h. der negative Selektionsgenpromotor wird induziert
und/oder dereprimiert oder, alternativ, wenn ein konstitutiver Promotor
für den
negativen Selektionsgenpromotor verwendet wird, wird ein Substrat
für das
negative Selektionsgenprodukt zu dem Wachstumsmedium oder Substrat
hinzugefügt).
Sodann werden einzelne lebensfähige
Zellen isoliert, propagiert und auf den gewünschten Vektor, pDesired, gescreent.
Das Plasmid pDesired ist im Wesentlichen ein pN/P-Vektor, der mit
der zweiten DNA homolog rekombiniert hat, derart, dass es ein gewünschtes
eukaryotisches virales Konstrukt enthält. Die Identifizierung von Einzelzellisolaten,
welche pDesired umfassen, mittels Standardtechniken wird beträchtlich
vereinfacht im Vergleich zu Techniken nach dem Stand der Technik
(zum Konstruieren und Identifizieren eines gewünschten Konstruktes), da bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
die resultierenden Bakterienkolonien das positive Selektionsgen
beherbergen müssen
und das negative Selektionsgen der dualen Selektionskassette nicht
beherbergen dürfen.
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Die
zweite und die dritte generelle Methode ("Methode II" bzw. "Methode III" von 3) zur Benutzung von
pN/P beginnen auf ähnlichen
Wegen und umfassen die Transfektion von pN/P zusammen mit einer
zweiten DNA (bei der zweiten Methode kann die zweite DNA linear
sein, ist aber bevorzugt zirkulär).
Die zweite DNA (wie in 3 dargestellt) umfasst ein zweites
positives Selektionsmarkergen (z.B. ein Ampicillin-Resistenz-Gen),
distinkt von dem von pN/P getragenen und dem positiven Selektionsgen
der DSC. Ein bakterieller Wirt wird durch die zwei Plasmide cotransformiert
und unter Bedingungen propagiert, die sowohl für das erste als auch für das zweite
positive Selektionsmarkergen (von pN/P bzw. dem zweiten DNA-Vektor)
selektiv sind (z.B. in Anwesenheit von Kanamycin und Ampicillin).
Zwei Rekombinationsprodukte resultieren höchstwahrscheinlich aus der
Vielzahl von möglichen
Rekombinationsereignissen, die an diesem Punkt möglich sind. Zum einen kann
ein relativ seltenes doppeltes Rekombinationsereignis auftreten,
welches sowohl die erste als auch die zweite Homologieregion verwendet,
um den gewünschten
Vektor herzustellen. Zweitens, und dies ist wahrscheinlicher, kann
ein einfaches Rekombinationsereignis auftreten, welches einen einzigen
Vektor entstehen lässt, der
beide Start-Vektoren umfasst. Ohne direktes Screening auf das gewünschte Konstrukt
umfassende Kolonien (z.B. durch PCR-Analyse oder Kolonie-Lift) können diejenigen
Bakterien, welche das gewünschte Konstrukt
umfassen, durch die Verwendung geeigneter Wachstumsbedingungen selektioniert
werden. Eine transformierte Kultur wird dann für einen geeigneten Zeitabschnitt
inkubieren gelassen, während
dem Mitose- und Rekombinationsereignisse auftreten. An diesem Punkt
divergieren die zweite und die dritte generelle Methode.
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Die
zweite Methode stützt
sich hauptsächlich
auf ein doppeltes Rekombinationsereignis, um pDesired herzustellen.
Die resultierenden Plasmidprodukte des doppelten Rekombinationsereignisses
umfassen pDesired und ein neues Plasmid, welches den negativen Selektionsgenpromotor
und das negative Selektionsgen umfasst. Dementsprechend wird die
Bakterienkultur um eine geeignete Zahl von Generationen expandiert (oder
verdoppelt), so dass pDesired in einer Zelle residieren oder in
eine Zelle segregieren wird, die kein Plasmid umfasst, welches einen
aktiven negativen Selektionsgenpromotor und ein aktives negatives
Selektionsgen umfasst. Diese Expansion wird unter Bedingungen durchgeführt, die
auf das erste positive Selektionsmarkergen selektionieren (d.h.
Selektion auf pN/P und pDesired), nicht aber auf das zweite positive
Selektionsmarkergen (nicht auf das Donor-Plasmid) selektionieren.
Die Mindestzahl an durchschnittlichen Verdoppelungen, welche zur
Segregation der Plasmide verwendet werden, kann so gering wie ca.
1 sein, beträgt
bevorzugt aber ca. 20. Die maximale Zahl an Verdoppelungen beträgt bevorzugt
ca. 40, kann aber bis zu 200 oder mehr betragen. Sobald pDesired
in Zellen segregieren gelassen worden ist, die frei sind von Plasmiden,
welche einen negativen Selektionsgenpromotor und ein negatives Selektionsgen
umfassen, wird das negative Selektionsgen induziert und überlebende
Zellen isoliert (z.B. durch Plattieren auf Koloniebildung). Bei
den Isolaten, die unter diesen Bedingungen heranwachsen, besteht
eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass sie den gewünschten Produktvektor (pDesired)
enthalten und somit leicht und effizient auf die Anwesenheit von
pDesired gescreent werden können.
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Die
dritte Methode stützt
sich nicht darauf, zu Beginn ein doppeltes Rekombinationsereignis
zu erhalten, sondern macht sich den Vorteil des häufiger ent stehenden
einfachen Rekombinationsereignisses zunutze. Das Plasmid-Intermediat
dieses einfachen Rekombinationsereignisses (sowie andere Plasmide)
wird ohne das Erfordernis eines Screening propagiert. Die propagierten
Vektoren, inklusive des gewünschten
intermediären
Vektors, werden dann an der singulären Restriktionsenzymerkennungsstelle,
welche in der dualen Selektionskassette enthalten ist, linearisiert.
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Der
Restriktionsverdau kann entweder in vivo oder in vitro stattfinden
(in welchem Falle die Möglichkeit besteht,
den Vektor ferner einer Behandlung mit Phosphatase zu unterwerfen,
um eine Religation zu hemmen). Wenn eine in vivo-Restriktonsverdauungsreaktion
verwendet wird, können
die Plasmide in eine Zelle cotransformiert werden, die das singuläre Restriktionsenzym
konstitutiv exprimiert; alternativ kann ein bakterieller Wirt verwendet
werden, der das Enzym, welches die singuläre Restriktionsstelle schneidet,
regulierbar exprimiert.
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Nach
Schneiden der URES wird die dritte Methode fortgesetzt durch Inkubieren
des linearisierten Plasmids in einer Bakterienzelle unter Bedingungen,
welche für
das erste positive Selektionsmarkergen selektiv sind und das negative
Selektionsgen aktiv machen. Es wird erkennbar sein, dass eine Bakterienzelle
unter diesen Bedingungen nicht überleben
wird, wenn sie nicht ein zirkularisiertes Plasmid umfasst, welches
das erste positive Selektionsmarkergen umfasst, und keinen aktiven
negativen Selektionsgenpromotor und kein aktives negatives Selektionsgen
enthält.
Dies wird am häufigsten
erzielt durch das zweite homologe Rekombinationsereignis, welches
erforderlich ist, um pDesired herzustellen.
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Zwar
wird eine wesentliche Fraktion des linearisierten pN/P-Plasmids
durch bakterielle Enzyme religiert, doch werden Zellen, welche diese "Kontaminanten" umfassen, eliminiert,
weil sie den in den negativen Selektionsgenpromotor und das negative
Selektionsgen durch den Restriktionsverdau eingeführten Defekt
reparieren.
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Homologe
Rekombinationsreaktionen haben eine relativ geringe Häufigkeit
des Auftretens und führen zu
einer Vielzahl von Reaktionsprodukten. Die dritte Methode mindert
vorteilhaft diese Ineffizienz durch zeitliches Voneinander trennen
der beiden, zur Herstellung von pDesired erforderlichen Rekombinationsereignisse. Ferner
ist homologe Rekombination ein reversibler Prozess, der zur Akkumulation
von Reaktanten zu Lasten von Produkten führen kann. Alle drei Methoden
selektionieren gegen Zellen, welche Plasmide beherbergen, die aus
reverser homologer Rekombination resultieren, oder unreagierte Plasmide
beherbergen, indem sie die Anwesenheit des ersten positiven Selektionsmarkergens
zeitgleich mit der Abwesenheit eines aktiven negativen Selektionsgenpromotors
und eines aktiven negativen Selektionsgens fordern.
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SELEKTION VON ZWEITEN
DNAs ZUR VERWENDUNG MIT pN/P
-
Bei
jeder der drei vorstehenden Methoden wird eine zweite DNA in einen
besonderen pN/P-Vektor inseriert. Bei einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
umfasst pN/P einen eukaryotischen viralen Vektor, der ferner die
duale Selektionskassette umfasst. Diese Ausführungsform sieht vor, ein Passagier-Gen oder ein neues
virales Gen in den Teil des Vektors einzubauen, der von der dualen
Selektionskassette belegt ist. Um dieses Resultat zu erzielen, kann
die zweite DNA einen Promotor umfassen, der in einer angestrebten
Zielzelle des eukaryotischen viralen Vektors, welcher aus pDesired
gewonnen wird, funktionell ist. Der funktionelle Promotor ist an
das Passagier-Gen oder das neue virale Gen funktionell gekoppelt.
Alternativ kann das Passagier-Gen so in den Vektor inseriert werden,
dass es unter die Kontrolle eines solchen Promotors gelangt, der in
dem viralen Vektor bereits vorhanden ist (siehe z.B. die Ausführungsform,
bei der eine der beiden Homologieregionen der DSC ein Promotor ist
oder einen Teil eines funktionellen Promotors umfasst). Es versteht
sich, dass das Passagier-Gen ein beliebiges Gen sein kann, welches
eine RNA oder ein Protein von Interesse für den Fachmann codiert. Therapeutische
Gene, Gene, die ein Protein codieren, welches in vitro und/oder
in vivo studiert werden soll, Gene, die katalytische RNAs codieren,
Gene, die Antisense-RNAs codieren, und modifizierte virale Gene
sind Beispiele für
mögliche
Passagier-Gene von
Interesse.
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Ferner
kann eine Virusvektor-Bibliothek erhalten werden, welche eine Vielzahl
von Passagier-Genen enthält.
Ferner kann die Bibliothek durch die Verwendung von Cosmid-Klonierung
eines über
homologe Rekombination erzeugten intermediären Vektors hergestellt werden.
Die Bibliothek besteht aus einer Vielzahl von genetischen Elementen,
die gleich oder verschieden sein können und in einer einzigen
Reaktion simultan zusammengebaut werden. Es wird erkennbar sein,
dass diese Bibliotheken vielfältigen
Nutzen haben, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf das Studium der funktionellen Genomik (d.h.
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Identifizieren
der Funktionen und Identitäten
genomischer und komplementärer
DNA-Sequenzen), Virusvektor-Designs, Struktur-Funktions-Studien
von einzelnen Genen oder Genprodukten.
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Bei
der zweiten DNA ist das Passagier-Gen mit oder ohne Promotor von
einer ersten und einer zweiten Homologieregion flankiert, welche
gemäß dem gewünschten
Design des eukaryotischen viralen Vektors ausgewählt sind. Das heißt, die
erste Homologieregion ist homolog zu einer Region des eukaryotischen
viralen Vektors links von dem Passagier-Gen, und die zweite Homologieregion
ist homolog zu einer Region rechts von dem Passagier-Gen. Somit
werden nach Doppel-Rekombination der zweiten DNA mit dem pN/P-Plasmid
an der ersten und zweiten Homologieregion alle viralen Vektorsequenzen
zwischen der ersten und der zweiten homologen Rekombinationsregion
aus dem Vektor entfernt, einschließlich der dualen Selektionskassette,
welche das negative Selektionsgen umfasst.
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Es
wird erkennbar sein, dass Teile des negativen und (insbesondere)
des positiven Selektionsgens einen Teil der ersten und/oder zweiten
Homologieregion bilden können.
Es muss also nicht unbedingt bei der Herstellung von pDesired die
komplette duale Selektionskassette über Rekombination aus pN/P
entfernt werden. Ferner wird erkennbar sein, dass zu der dualen
Selektionskassette distale DNA-Segmente als erste und/oder zweite
Homologieregion verwendet werden können (z.B. können die
ITRs eines Adenovirus als erste und zweite Homologieregion für eine homologe
Rekombination mit einem pN/P-Plasmid dienen, welches einen adenoviralen
Vektor umfasst, der ferner eine duale Selektionskassette in der
E2A-Region des adenoviralen Genoms umfasst). Bei dieser Ausführungsform
wird ein eukaryotisches virales Replicon hergestellt, wobei alle viralen
Sequenzen, die die ITRs nicht umfassen, aus dem Vektor über Rekombination
mit der zweiten DNA eliminiert werden. Es versteht sich, dass das
Replicon so hergestellt werden kann, dass es ferner eine virale Verpackungsstelle
umfasst, so dass das Replicon in einer Lösung (in vitro) oder Zelle
(in vivo), welche die notwendigen Verpackungselemente umfasst, verpackt
werden kann. Somit kann die homologe Rekombination zwischen pN/P
und der zweiten DNA ferner dazu verwendet werden, simultan Sequenzen
in einen eukaryotischen Vektor zu inserieren und eine Deletion in
dem eukaryotischen viralen Vektor zu erzeugen.
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VERWENDUNG
VON pDesired
-
Das
gewünschte
Plasmid, pDesired, kann nach einer beliebigen geeigneten Methode
erhalten werden, z.B. nach einer der obigen drei Methoden, welche
pN/P verwenden, oder einer beliebigen geeigneten Variante dieser
generellen Methoden. Die in diesen Plasmiden enthaltenen eukaryotischen
viralen Vektoren können
in einer permissiven eukaryotischen Zelle replizieren, wenn mindestens
eines der ITRs geeignet proximal (innerhalb ca. 2000 bp, bevorzugt
ca. 300 bp, mehr bevorzugt innerhalb ca. 100 bp, am meisten bevorzugt
innerhalb ca. 35 bp) zu einem freien Ende der DNA liegt. Ein derartiges
freies Ende kann durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym erzeugt
werden, wenn eine geeignete Restriktionsstelle verfügbar ist
und der Kontakt mit dem Restriktionsenzym den viralen Vektor nicht
völlig
zerstört
(wie dies dort der Fall ist, wo pN/P2 verwendet wird, um pDesired
zu bilden). Alternativ können
funktionelle eukaryotische virale Genome aus pDesired isoliert werden
durch Einbringen von pDesired in eine Lösung (in vitro) oder eine Zelle
(in vivo), welche eine geeignete Rekombinase (z.B. Cre) und Oligonucleotide
umfasst, die mindestens eine geeignete ψRec-Stelle
(z.B. eine lox-Stelle) aufweisen. Die Rekombinase-Reaktion (z.B.
Cre-lox) ergibt einen eukaryotischen viralen Vektor mit proximal
zu den Enden liegenden ITRs (d.h. innerhalb von ca. 2000 bp von
einem Ende, bevorzugt ca. 300 bp, mehr bevorzugt innerhalb ca. 100
bp, am meisten bevorzugt innerhalb ca. 35 bp); siehe 5).
Die Rekombinase-Reaktion kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden.
Das System kann mit weiterer Flexibilität ausgestattet werden, wenn
die zwei gezeigten ψRec-Stellen beide funktionell,
jedoch inkompatibel sind (derartige Stellen sind auf dem Fachgebiet
bekannt; siehe auch 6). Der so hergestellte rekombinante
eukaryotische virale Vektor kann in eine permissive eukaryotische
Zelle transfiziert werden und ist dazu befähigt, in derartigen Zellen
zu replizieren. Die von pDesired umfassten eukaryotischen viralen
Vektoren sind in der Lage, Passagier-Gene in vivo oder in vitro
in Zielzellen zu transferieren.
-
Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung noch näher erläutern, ohne
jedoch ihren Bereich in irgendeiner Weise zu begrenzen.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1
-
Dieses
Beispiel illustriert ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung von
pN/P. Dieses Verfahren ist bevorzugt, weil es eine relativ große Zahl
von pN/P enthaltenden Kolonien erzeugt.
-
Dieses
Verfahren verwendet eine doppelte homologe Rekombination zwischen
dem viralen Rezeptor-Plasmid und dem Dualselektionskassetten-Donor-Plasmid.
Das virale Rezeptor-Plasmid enthielt ein geeignetes positives Selektionsgen,
d.h. ein Kanamycin-Resistenz-Gen, und einen geeigneten Replikationsursprung,
d.h. einen p15-Replikationsursprung. Ferner enthielt das Rezeptor-Plasmid zwei Segmente
mit Homologie zu den beiden Regionen der DSC, welche hohe Homologie
zu einem eukaryotischen Virus haben. Das DSC-Donor-Plasmid enthielt
ein distinktes positives Selektionsgen, d.h. ein Ampicillin-Resistenz-Gen,
und die duale Selektionskassette.
-
Die
Rekombination wurde unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt: (1)
4 ng geschnittenes virales Rezeptor-Plasmid wurden mit 3 ng geschnittenem
DSC-Donor-Plasmid kombiniert; (2) 40 ng geschnittenes Rezeptor-Plasmid
wurden mit 30 ng geschnittenem Donor-Plasmid kombiniert; (3) 4 ng
ungeschnittenes Rezeptor-Plasmid wurden mit 3 ng geschnittenem Donor-Plasmid
kombiniert; (4) 4 ng ungeschnittenes Rezeptor-Plasmid wurden mit
30 ng geschnittenem Donor-Plasmid kombiniert; (5) 4 ng ungeschnittenes
Rezeptor-Plasmid
wurden mit 6 ng ungeschnittenem Donor-Plasmid kombiniert und (6)
4 ng ungeschnittenes Rezeptor-Plasmid wurden mit 60 ng ungeschnittenem
Donor-Plasmid kombiniert. Jede Rekombination wurde in einem Transformationsvolumen
von 50 μl
durchgeführt.
Die Resultate der verschiedenen Rekombinationen sind in Tabelle
1 unten aufgeführt.
-
-
Wie
aus den Daten von Tabelle 1 ersichtlich, erzeugten niedrige Konzentrationen
an geschnittenem oder ungeschnittenem Rezeptor-Plasmid in Verbindung
mit niedrigen Konzentrationen an geschnittenem oder ungeschnittenem
Donor-Plasmid keine Kolonien (siehe Rekombinationsreaktionen 1,
3 und 5). Im Gegensatz dazu erzeugte eine hohe Konzentration an
geschnittenem Rezeptor-Plasmid, ebenso wie eine niedrige Konzentration
an ungeschnittenem Rezeptor-Plasmid in Verbindung mit einer hohen
Konzentration an geschnittenem Donor-Plasmid 2 bzw. 26 Kolonien,
von denen einige positiv, d.h. pN/P enthaltende Kolonien waren (siehe Rekombinationsreaktionen
2 und 4). Während
eine niedrige Konzentration an ungeschnittenem Rezeptor-Plasmid
in Verbindung mit einer hohen Konzentration an ungeschnittenem Donor-Plasmid
29 Kolonien erzeugte, war keine dieser Kolonien positiv, d.h. keine
dieser Kolonien enthielt pN/P (siehe Rekombinationsreaktion 6).
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Die
bevorzugten Bedingungen zur Herstellung von pN/P sind eine niedrige
Konzentration an ungeschnittenem viralem Rezeptor-Plasmid und eine
hohe Konzentration an geschnittenem DSC-Donor-Plasmid. Unter diesen
Bedingungen wurden insgesamt 26 Kolonien hergestellt. Von diesen
Kolonien waren 85 % positiv, was insgesamt 22 pN/P enthaltende Kolonien
ergibt (siehe Rekombinationsreaktion 4). Die anderen Kombinationen
von Rezeptor- und Donor-Plasmid führten zu keiner wesentlichen
Anzahl an positiven Kolonien.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel illustriert die Verwendung einer Ausführungsform von pN/P zur Herstellung
von adenoviralen Vektoren, welche in einer oder mehreren essentiellen
Genfunktionen der E1- und der E4-Region des adenoviralen Genoms
defizient sind. Der in dem vorliegenden Beispiel erzeugte adenovirale
Vektor ist ferner in der E3-Region des adenoviralen Genoms defizient.
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Eine
Variante eines Serotyp-5-Adenovirus, AdE1/IX(B/N)E3(10)E4(BgGus),
wird in das öffentlich
zugängliche
pACYC177 (New England BioLabs) zwischen der Ban I- und der Drd I-Stelle
einkloniert, was das Ampicillin-Resistenz-Gen zerstört, jedoch
den p15-Replikationsursprung und die Kanamycin-Resistenz-Gene intakt lässt. AdE1/IX(B/N)E3(10)E4(BgGus)
umfasst die Wildtyp-Sequenzen von Ad5 mit Ausnahme der Sequenzen
356-4120 (E1-IX; was die E1- und
die pIX-Region des adenoviralen Genoms deletiert), 28592-30470 (E3;
das Ergebnis eines Xba I-Verdaus, was die Expression von Region
E3-Genprodukten ausschließt)
und 32832-35564 (E4). Eine duale Selektionskassette, umfassend ein
konstitutiv exprimiertes (d.h. ein EM-7-Promotor-)ble-Gen (Zeocin-Resistenz)
und einen Tac-Promotor (d.h. einen Trp/lac-Hybrid-Promotor, der
IPTG-regulierbar ist), treibt die Expression eines chimären OmpA/Flag/NP-1-Gens
in der zu dem ble-Gen gegenläufigen
Richtung. Eine singuläre
Swa I-Stelle residiert zwischen dem Tac-Promotor und dem chimären Gen.
Die deletierten Sequenzen in der E4-Region werden ersetzt (von rechts
nach links) durch die humane beta-Globin-Polyadenylierungssequenz,
die Codierungssequenz für β-Glucuronidase
und die SV40 frühe
Polyadenylierungssequenz. Das β-Glucuronidase-Gen
ist 3'-5' orientiert bezogen
auf das Adenovirus-Genom. Dadurch, dass die zwei Polyadenylierungssequenzen
das β-Glucuronidase-Gen
flankieren, wird die Expression des β-Glucuronidase-Gens ausgeschlossen.
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Das
pN/P-Konstrukt kann dann so modifiziert werden, dass es ein beliebiges
gewünschtes
Passagier-Gen enthält.
Zwei geeignete Passagier-Gene sind die VEGF121-
oder iNOS-cDNAs unter der Kontrolle eines Immediate-Early-CMV-Promotors und einer
SV40-Polyadenylierungssequenz.
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Um
dieses Resultat zu ermöglichen,
wurden die VEGF121- und iNOS-codierenden
Sequenzen zwischen den CMV-Promotor und das SV40 frühe Polyadenylierungssignal
in ein Plasmid kloniert, welches ferner die Ad5-Sequenzen 1-355
und 3333-5792 auf gegenüberliegenden
Seiten der Expressionssignale enthält. Der CMV-Promotor liegt
benachbart zu der Ad5-Koordinate 3333 und treibt die Expression
nach links, relativ zu den Ad5-Sequenzen, so dass die Expressionskassetten
nach links weisen, bezogen auf den wie unten beschrieben hergestellten
adenoviralen Vektor. Das Plasmid wird ferner modifiziert, falls
erforderlich (wie bei pGEM2), so dass es geeignete Restriktionsstellen
enthält,
wie Asc I und Pac I, und umfasst ein Ampicillin-Resistenz-Gen.
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Das
oben beschriebene pN/P-Plasmid und mindestens eines der VEGF121 oder iNOS umfassenden Plasmide, wie oben
beschrieben, werden in einen geeigneten Bakterienstamm transformiert,
z.B. BJ5183 (freundlicherweise von Dr. Douglas Hanahan, University
of California, San Francisco, zur Verfügung gestellt), wobei BJ5183
als ein RecBC sbc, laq IQ-Bakterienstamm
beschrieben wird. Der transformierte BJ5183-Stamm wird auf einem
Glucose, Kanamycin und Zeocin enthaltenden Medium wachsen gelassen.
Eine Plasmid-Präparation
in kleinem Maßstab
(z.B. eine Minipräp)
wird durchgeführt.
Die resultierende kombinierte Plasmid-Präparation wird mit Swa I verdaut,
wodurch der Tac-Promotor
von dem chimären
NP-1-Gen getrennt wird. Die linearisierte DNA wird in einen zweiten
Bakterienstamm transformiert (der von dem ersten Stamm verschieden
sein kann, aber nicht muss) und auf einem Kanamycin und Glucose
enthaltenden Medium über Nacht
bei geeigneter Temperatur und geeignetem Maß an Belüftung wachsen gelassen. Am
folgenden Tag werden die Zellen durch leichtes Zentrifugieren konzentriert
und in glucose- und antibiotikafreiem Wachstumsmedium gewaschen
und auf ein drittes Wachstumsmedium (Festphase) plattiert, dem Glucose
fehlt und das IPTG und Kanamycin umfasst. Die resultierenden Kolonien
werden mittels Standardtechniken auf das gewünschte Konstrukt gescreent.
Das Plasmid aus mindestens einer Kolonie, die ein gewünschtes
Konstrukt umfasst, wird isoliert. Die DNA wird linearisiert, so
dass mindestens eines der beiden adenoviralen ITRs proximal zu einem
Ende der DNA liegt, und in 293/ORF6-Zellen transfiziert. Die transfizierten
Zellen werden in 100 mm-Gewebekulturschalen plattiert.
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Die
Transfektion wird auf 293/ORF6-Zellen passagiert, um den adenoviralen
Vektor zu amplifizieren. Der amplifizierte adenovirale Vektor wird
dann aus den Zellen durch Zelldisruption (z.B. Lyse durch Eifnrieren und
Auftauen) freigesetzt und der Zelldebris durch Zentrifugation pelletiert.
Das resultierende überstehende Fluid
bildet einen neuen adenoviralen Vektor, umfassend ein gewünschtes
Transgen in der E1-Region des adenoviralen Genoms und Defizienzen
in der E3-Region und allen essentiellen Genfunktionen der E1- und
der E4-Region.