DE69813677T2 - Human serum glucocorticoid regulated kinase, a target for chronic kidney disease and diabetic nephropathy - Google Patents
Human serum glucocorticoid regulated kinase, a target for chronic kidney disease and diabetic nephropathyInfo
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Description
Das Gebiet der Erfindung ist die Behandlung des chronischen Nierenversagens und der diabetischen Nephropathie.The field of the invention is the treatment of chronic renal failure and diabetic nephropathy.
Die serumglucocorticoidregulierte Kinase (sgk) wurde in einem Brustkrebszelllinie der Ratte (Con8.hd6) als ein neues Mitglied der Familie der Serin/Threonin-Proteinkinasen entdeckt, deren Expression durch Glucocorticoide und Serum transkriptionell reguliert wird (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Sie wird in anderen Geweben der Ratte wie dem Eierstock, dem Thymus und der Lunge exprimiert, mit niedrigeren Spiegeln in den meisten anderen Geweben (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Die Sequenzanalyse der Vollängen-mRNA von sgk der Ratte sagt ein Protein mit 431 Aminosäuren von 49 kDa voraus. Das sgk-Protein enthält mutmaßlich eine katalytische Domäne von 270 Aminosäuren, die aus 11 verschiedenen Subdomänen aufgebaut ist, von denen eine die Phosphorylierung des Serin/Threonin-Substrats nahe legt. sgk hat in diesem Bereich Sequenzhomologie mit anderen Kinasen. Diese umfassen das humane rac a, die Rattenproteinkinase C-b, die ribosomale Protein-S6-Kinase der Ratte und die von cyclischem AMP abhängige Proteinkinase der Maus. Ungeachtet der Homologie mit anderen Kinasen muß von sgk noch gezeigt werden, daß sie eine funktionelle Kinase ist.Serum glucocorticoid-regulated kinase (sgk) was discovered in a rat breast cancer cell line (Con8.hd6) as a new member of the serine/threonine protein kinase family whose expression is transcriptionally regulated by glucocorticoids and serum (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). It is expressed in other rat tissues such as the ovary, thymus, and lung, with lower levels in most other tissues (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Sequence analysis of the full-length rat sgk mRNA predicts a 431-amino acid protein of 49 kDa. The sgk protein is thought to contain a catalytic domain of 270 amino acids composed of 11 different subdomains, one of which suggests phosphorylation of the serine/threonine substrate. sgk shares sequence homology with other kinases in this region. These include human rac a, rat protein kinase C-b, rat ribosomal protein S6 kinase, and mouse cyclic AMP-dependent protein kinase. Despite its homology with other kinases, sgk has yet to be demonstrated to be a functional kinase.
Der Promotorbereich des sgk-Gens der Ratte enthält ein funktionelles, auf Glucocorticoid ansprechendes Element (GRE) und die Induktion von sgk scheint eine Glucocorticoidrezeptor-spezifische Antwort zu sein (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Ein ähnliches Anwachsen der Spiegel an sgk-Transkript wird in Brustkrebszellen der Ratte nach Behandlung mit Dexamethison, Hydrocortison oder Corticosteron beobachtet, die alle den Glucocorticoidrezeptorweg verwenden, während Steroide, die einen alternativen Weg der Genaktivierung haben, wie Cholesterin, Progesteron, b-Östradiol und Testosteron, nicht in der Lage waren, die Expression der mRNA von sgk zu induzieren (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Auch Serum stimuliert die Expression der mRNA von sgk in diesen Zellen, obwohl der Weg der Aktivierung unklar ist. Kürzlich wurde bei p53, einem Tumorsuppressorprotein, gefunden, daß es die sgk- Promotoraktivität unterdrückt (Maiyar et al., 1997, Mol. Endocrin. 11: 312-329). Dies stellt das erste Beispiel eines hormonregulierten Kinasegens dar, das durch p53 reguliert wird (Maiyar et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 12414-12422).The promoter region of the rat sgk gene contains a functional glucocorticoid responsive element (GRE) and induction of sgk appears to be a glucocorticoid receptor-specific response (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). A similar increase in sgk transcript levels is observed in rat breast cancer cells after treatment with dexamethisone, hydrocortisone or Corticosterone, all of which use the glucocorticoid receptor pathway, while steroids that have an alternative pathway of gene activation, such as cholesterol, progesterone, b-estradiol, and testosterone, were unable to induce sgk mRNA expression (Webster et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 2031-2041). Serum also stimulates sgk mRNA expression in these cells, although the pathway of activation is unclear. Recently, p53, a tumor suppressor protein, was found to suppress sgk promoter activity (Maiyar et al., 1997, Mol. Endocrin. 11: 312-329). This represents the first example of a hormone-regulated kinase gene regulated by p53 (Maiyar et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 12414-12422).
Die Funktion von sgk in der Zelle ist unklar. Bei einigen Zellarten kann sgk beim Zellwachstum eine Rolle spielen. Bei Con8.hd6-Zellen erniedrigt die Behandlung mit Glucocorticoid, die die sgk-Expression erhöht, die Proliferation. Bei anderen Zelllinien jedoch erhöht Dexamethison die sgk-Spiegel, ohne das Zellwachstum zu beeinflussen. Einige Daten legen nahe, daß sie bei der mitogenen Antwort im G&sub0;-G&sub1;-Übergang bei ruhenden Rat2- Fibroblasten eine Rolle spielen könnte, da diese als Antwort auf Serumstimulierung induziert wird und, wie andere unmittelbar-frühe Responder-Gene, eine kurze Halbwertszeit hat (Webster et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 11482-11485). Eine Gruppe schlägt vor, daß sgk in die Wundheilung und die Regeneration im zentralen Nervensystem involviert ist. Es wurde gefunden, daß sgk in Glia-Zellen und Oligodendrocyten stark exprimiert wird, die Läsionen im verletzten Gehirn umgeben (Imaizumi et al., 1994, Mol. Brain Res. 26: 189-196). Kürzlich wurde gefunden, daß die sgk-Transkriptionsspiegel durch Veränderungen bei den anisotonischen und isotonischen Bedingungen beeinflußt werden, was anzeigt, daß sie bei der zellulären Antwort auf das Zellvolumen eine Rolle spielen könnte (Waldegger et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 4440-4445). Was immer ihre Rolle sein mag, ist sgk am wahrscheinlichsten in eine komplexe Abfolge von Phosphorylierungen/Dephosphorylierungen involviert, die separat und/oder gleichzeitig durch eine Anzahl an extrazellulären und intrazellulären Faktoren wie Glucocorticoide, Serum, Wachstumsfaktoren und p53 reguliert werden.The function of sgk in the cell is unclear. In some cell types, sgk may play a role in cell growth. In Con8.hd6 cells, glucocorticoid treatment, which increases sgk expression, decreases proliferation. However, in other cell lines, dexamethisone increases sgk levels without affecting cell growth. Some data suggest that it may play a role in the mitogenic response in the G0-G1 transition in resting Rat2 fibroblasts, since this is induced in response to serum stimulation and, like other immediate-early responder genes, has a short half-life (Webster et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 11482-11485). One group proposes that sgk is involved in wound healing and regeneration in the central nervous system. sgk has been found to be highly expressed in glial cells and oligodendrocytes surrounding lesions in the injured brain (Imaizumi et al., 1994, Mol. Brain Res. 26: 189-196). Recently, sgk transcription levels have been found to be affected by changes in anisotonic and isotonic conditions, indicating that it may play a role in the cellular response to cell volume (Waldegger et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 4440-4445). Whatever its role, sgk is most likely involved in a complex sequence of phosphorylations/dephosphorylations that are separately and/or simultaneously regulated by a number of extracellular and intracellular factors such as glucocorticoids, serum, growth factors, and p53.
Eine Reihe von Tiermodellsystemen wurden untersucht, um Hinweise auf die Ursache(n) des Nierenversagens zu geben. Moleküle, deren Expression in der erkrankten Niere dieser Modellsysteme erhöht oder erniedrigt war, können wichtige Mediatoren des Nierenversagens sein. PCR mit differentieller Darstellung wurde durchgeführt, um solche Gene in der Niere von mageren und fetten db/db-Mäusen zu identifizieren. Von einem dieser Gene, das in der Niere von fetten Mäusen erhöht war, wurde gefunden, daß es eine cDNA von 500 Basenpaaren war, die zu 91% mit der sgk der Ratte identisch war. Die Northern-Analyse zeigte, daß die Spiegel an sgk-mRNA in diabetischen, fetten Mäusen im Vergleich mit den mageren Wurfgenossen 5-fach erhöht waren. Bei den anderen untersuchten Geweben, dem Herz, dem Gehirn und der Leber, waren die Spiegel an sgk-mRNA bei den mageren und fetten Mäusen ähnlich. Somit ist die sgk-Induktion nierenspezifisch. Die weitere Analyse zeigte, daß die Expression an sgk-mRNA in der Niere von diabetischen Menschen im Vergleich mit Kontrollnieren ebenfalls 2-fach erhöht war. Dies ist die erste Veranschaulichung, daß sgk in Krankheitszustände involviert sein könnte, nämlich Nierenerkrankungen.A number of animal model systems have been investigated to provide clues to the cause(s) of renal failure. Molecules that were up- or down-regulated in the diseased kidney of these model systems may be important mediators of renal failure. Differential imaging PCR was performed to identify such genes in the kidney of lean and fat db/db mice. From one of these Gene that was increased in the kidney of fat mice was found to be a 500 base pair cDNA that was 91% identical to rat sgk. Northern analysis showed that sgk mRNA levels were increased 5-fold in diabetic fat mice compared to lean littermates. In the other tissues examined, heart, brain, and liver, sgk mRNA levels were similar in lean and fat mice. Thus, sgk induction is kidney specific. Further analysis showed that sgk mRNA expression was also increased 2-fold in the kidney of diabetic humans compared to control kidneys. This is the first illustration that sgk may be involved in disease states, namely kidney disease.
Es besteht ein Bedarf an Zusammensetzungen für die Behandlung des chronischen Nierenversagens, die dazu dienen, die Erkrankung zu verringern oder zu beseitigen, die zum Nierenversagen und zum Tod oder zur Abhängigkeit von der Dialyse führt.There is a need for compositions for the treatment of chronic renal failure that serve to reduce or eliminate the condition that leads to renal failure and death or dependence on dialysis.
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung des Nierenversagens und der diabetischen Nephropathie.The invention relates to the manufacture of a medicament for use in the treatment of renal failure and diabetic nephropathy.
Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis gewisser Ausdrücke zu erleichtern, die hier häufig verwendet werden.The following definitions are provided to facilitate understanding of certain terms frequently used herein.
"Humane sgk" oder "Humanes sgk-Polypeptid" betrifft unter anderem im allgemeinen ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist, oder eine allelische Variante davon."Human sgk" or "human sgk polypeptide" refers, among other things, generally to a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an allelic variant thereof.
"Humane sgk-Aktivität oder humane sgk-Polypeptidaktivität" oder "biologische Aktivität von humaner sgk oder humanem sgk-Polypeptid" betrifft die metabolische oder physiologische Funktion der humanen sgk, einschließlich ähnlicher Aktivitäten oder verbesserter Aktivitäten dieser Aktivitäten mit weniger unerwünschten Nebenwirkungen. Ebenfalls eingeschlossen sind antigene und immunogene Aktivitäten von humaner sgk."Human sgk activity or human sgk polypeptide activity" or "biological activity of human sgk or human sgk polypeptide" refers to the metabolic or physiological function of human sgk, including similar activities or enhanced activities of these activities with fewer undesirable side effects. Also included are antigenic and immunogenic activities of human sgk.
"Humanes sgk-Gen" betrifft ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, oder allelische Varianten davon und/oder ihre Komplementären."Human sgk gene" refers to a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or allelic variants thereof and/or their complements.
"Antikörper", wie hier verwendet, umfassen polyclonale und monoclonale Antikörper, chimäre, Einzelketten und humanisierte Antikörper, ebenso wie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab- oder einer anderen Immunglobulin- Expressionsbibliothek."Antibodies" as used herein include polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric, single chain and humanized antibodies, as well as Fab fragments, including the products of a Fab or other immunoglobulin expression library.
"Isoliert" bedeutet verändert aus dem natürlichen Zustand "durch die Hand des Menschen". Wenn eine "isolierte" Zusammensetzung oder Verbindung in der Natur vorkommt, ist sie verändert worden oder ist aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt worden, oder beides. Zum Beispiel ist ein Polynucleotid oder ein Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Tier vorkommt, nicht "isoliert", aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von den co-existierenden Materialien seiner natürlichen Umgebung getrennt ist, ist "isoliert", so wie der Ausdruck hier verwendet wird."Isolated" means altered from the natural state "by the hand of man." When an "isolated" compound or compound occurs in nature, it has been altered or has been removed from its natural environment, or both. For example, a polynucleotide or polypeptide occurring naturally in a living animal is not "isolated," but the same polynucleotide or polypeptide separated from the coexisting materials of its natural environment is "isolated," as the term is used here.
"Polynucleotid" bezieht sich im allgemeinen auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxiribonucleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA sein kann oder modifizierte RNA oder DNA. "Polynucleotide" umfassen ohne Beschränkung einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen ist, einzel- und doppelsträngige RNA, und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen ist, hybride Moleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig sein können oder typischer doppelsträngig oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen. Außerdem betrifft "Polynucleotid" Dreifachstrang-Bereiche, die RNA oder DNA betreffen oder RNA und DNA. Der Ausdruck Polynucleotid umfaßt auch DNAs oder RNAs, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten und DNAs oder RNAs mit modifiziertem Rückgrat, wegen der Stabilität oder aus anderen Gründen. "Modifizierte" Basen umfassen zum Beispiel tritylierte Basen und ungewöhnliche Basen wie Inosin. Eine Vielzahl von Modifikationen sind bei DNA und RNA gemacht worden; somit umfaßt "Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynucleotiden, wie sie typischerweise in der Natur gefunden werden, ebenso wie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen charakteristisch sind. "Polynucleotid" umfaßt auch relativ kurze Polynucleotide, die häufig als Oligonucleotide bezeichnet werden."Polynucleotide" generally refers to any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA, or modified RNA or DNA. "Polynucleotides" include, without limitation, single- and double-stranded DNA, DNA that is a mixture of single- and double-stranded regions, single- and double-stranded RNA, and RNA that is a mixture of single- and double-stranded regions, hybrid molecules comprising DNA and RNA, which may be single-stranded or more typically double-stranded, or a mixture of single- and double-stranded regions. In addition, "polynucleotide" refers to triple-stranded regions involving RNA or DNA, or RNA and DNA. The term polynucleotide also includes DNAs or RNAs containing one or more modified bases and DNAs or RNAs with a modified backbone, for stability or other reasons. "Modified" bases include, for example, tritylated bases and unusual bases such as inosine. A variety of modifications have been made to DNA and RNA; thus, "polynucleotide" includes chemically, enzymatically, or metabolically modified forms of polynucleotides typically found in nature, as well as the chemical forms of DNA and RNA characteristic of viruses and cells. "Polynucleotide" also includes relatively short polynucleotides, often referred to as oligonucleotides.
"Polypeptid" bezieht sich auf jedes Peptid oder Protein, das zwei oder mehr Aminosäuren enthält, die über Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen, d. h. Peptidisostere, miteinander verknüpft sind. "Polypeptid" bezieht sich auf kurze Ketten, üblicherweise als Peptide bezeichnet, Oligopeptide oder Oligomere, und längere Ketten, üblicherweise als Proteine bezeichnet. Polypeptide können andere Aminosäuren enthalten als die 20 Gencodierten Aminosäuren. "Polypeptide" umfassen Aminosäuresequenzen, die entweder durch natürliche Verfahren modifiziert sind, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Modifikationsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten gut beschrieben und in detaillierten Monographien, ebenso wie in der umfangreichen Forschungsliteratur. Modifikationen können überall in einem Polypeptid auftreten, einschließlich des Peptidrückgrats, der Aminosäureseitenketten und der Amino- oder Carboxylenden. Es sollte erkannt werden, daß dieselbe Art an Modifikation in demselben oder in verschiedenem Maß an mehreren Stellen in einem vorgegebenen Polypeptid vorhanden sein kann. Ebenso kann ein vorgegebenes Polypeptid viele Arten an Modifikationen enthalten. Polypeptide können als Ergebnis einer Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können cyclisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Cyclische, verzweigte und verzweigt cyclische Polypeptide können das Ergebnis posttranslationaler natürlicher Verfahren sein oder mittels synthetischer Verfahren hergestellt worden sein. Die Modifikationen umfassen die Acetylierung, die Acylierung, die ADP- Ribosylierung, die Amidierung, die kovalente Anheftung von Flavin, die kovalente Anheftung einer Häm-Gruppe, die kovalente Anheftung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, die kovalente Anheftung eines Lipids oder Lipidderivats, die kovalente Anheftung von Phophotidylinositol, Verknüpfungen, Cyclisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Verknüpfungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Jodierung, Methylierung, Myrostoylisierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phophorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylisierung, Sulfatisierung, durch Transfer-RNA vermittelten Zusatz von Aminosäuren zu Proteinen, wie Arginylisierung und Ubiquitinierung. Vgl. zum Beispiel PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2te Ausg., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors"; Meth Enzymol (1990) 182 : 626-646 und Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62."Polypeptide" refers to any peptide or protein containing two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds, i.e., peptide isosteres. "Polypeptide" refers to short chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers, and longer chains, commonly referred to as proteins. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 amino acids encoded by genes. "Polypeptides" include amino acid sequences that are either modified by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical modification methods known in the art. Such modifications are well described in basic texts and in detailed monographs, as well as in the extensive research literature. Modifications can occur anywhere in a polypeptide, including the peptide backbone, the amino acid side chains, and the amino or carboxyl termini. It should be recognized that the same type of modification can be present in the same or different degrees at multiple sites in a given polypeptide. Likewise, a given polypeptide can contain many types of modifications. Polypeptides can be branched as a result of ubiquitination, and they can be cyclic, with or without branching. Cyclic, branched, and branched-cyclic polypeptides can be the result of post-translational natural processes or can be produced by synthetic methods. The modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, covalent attachment of a heme group, covalent attachment of a nucleotide or nucleotide derivative, covalent attachment of a lipid or lipid derivative, covalent attachment of phosphotidylinositol, linkages, cyclization, formation of disulfide bonds, demethylation, formation of covalent linkages, formation of cystine, formation of pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, methylation, myrostoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfatization, transfer RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as Arginylization and ubiquitination. See, for example, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd edition, TE Creighton, WH Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, BC Johnson, ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”; Meth Enzymol (1990) 182: 626-646 and Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62.
"Variante", so wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist ein Polynucleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenzpolynucleotid oder Referenzpolypeptid unterscheidet, aber essentielle Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynucleotids unterscheidet sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen Referenzpolynucleotid."Variant," as used herein, is a polynucleotide or polypeptide that differs from a reference polynucleotide or reference polypeptide, but retains essential properties. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from another reference polynucleotide.
Veränderungen bei der Nucleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von dem Referenzpolynucleotid codiert wird, verändern oder auch nicht. Nucleotidveränderungen können in Aminosäuressubstitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen bei dem Polypeptid, das von der Referenzsequenz codiert wird, resultieren, wie nachstehend diskutiert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Im allgemeinen sind die Unterschiede beschränkt, so daß die Sequenzen des Referenzpolypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich sind und in vielen Bereichen identisch. Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich bei der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Eine substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann durch den genetischen Code codiert sein oder auch nicht. Eine Variante eines Polynucleotids oder Polypeptids kann natürlicherweise vorkommen, so wie eine allelische Variante, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlicherweise vorkommt. Nicht natürlicherweise vorkommende Varianten von Polynucleotiden und Polypeptiden können mittels Mutageneseverfahren oder durch direkte Synthese hergestellt werden.Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not alter the amino acid sequence of a polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes may result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence, as discussed below. A typical variant polypeptide differs in amino acid sequence from another reference polypeptide. In general, the differences are limited, so that the sequences of the reference polypeptide and the variant are very similar overall and identical in many areas. A variant and a reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions, deletions in any combination. A substituted or inserted amino acid residue may or may not be encoded by the genetic code. A variant of a polynucleotide or polypeptide may be naturally occurring, such as an allelic variant, or it may be a variant not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides may be prepared by mutagenesis techniques or by direct synthesis.
"Identität" ist ein Maß für die Identität von Nucleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen. Im allgemeinen werden die Sequenzen so aneinandergelegt, daß eine Übereinstimmung der höchsten Ordnung erzielt wird. "Identität" per se hat eine im Fachgebiet anerkannte Bedeutung und kann unter Verwendung publizierter Verfahren berechnet werden. Vgl. z. B.: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTNG: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskow, M. und Devereux, J., Hrsg., M Stockton Press, New York, 1991). Während eine Anzahl von Verfahren bestehen, um die Identität zwischen zwei Polynucleotidsequenzen oder Polypeptidsequenzen zu messen, ist der Ausdruck "Identität" dem Durchschnittsfachmann bekannt (Carillo, H., und Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073). Verfahren, die üblicherweise verwendet werden, um die Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diejenigen, die in dem Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, Hrsg., Academic Press, San Diego, 1994 und von Carillo, H., und Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073, beschrieben sind. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in Computerprogrammen codifiziert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, das GCS Programmpaket (Devereux, J., et al.; Nuleic Acids Research (1984) 12(1): 87, BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J Molec Biol (1990) 215: 403)."Identity" is a measure of the identity of nucleotide sequences or amino acid sequences. In general, the sequences are aligned so as to achieve a highest order match. "Identity" per se has an art-recognized meaning and can be calculated using published procedures. See, for example, E.g.: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTNG: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, AM and Griffin, HG, eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskow, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). While a number of methods exist to measure the identity between two polynucleotide sequences or polypeptide sequences, the term "identity" is known to those of ordinary skill in the art (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073). Methods commonly used to determine the identity or similarity between two sequences include, but are not limited to, those described in the Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 and by Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073. Methods for determining identity and similarity are codified in computer programs. Preferred computer program methods for determining identity and similarity between two sequences include, but are not limited to, the GCS program package (Devereux, J., et al.; Nuleic Acids Research (1984) 12(1): 87, BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, SF et al., J Molec Biol (1990) 215: 403).
"Chronisches Nierenversagen" ist der fortschreitende Verlust an funktioneller Nierenmasse, begleitet von kompensatorischem Wachstum und Umbildung. Die molekularen und zellulären Ereignisse, die während des chronischen Nierenversagens auftreten, umfassen die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die Proliferation von glomerulären mesangialen Zellen und die Expansion von extrazellulärer Matrix (Klahr et al., 1988, New Engl. J. Med 318: 1657-1666; Striker et al., 1989, in: Klahr, (Hrsg.) Seminars in Nephrology, S. 318, Philadelphia, (W. B. Saunders); Ebihara et al., 1993, J. Am. Soc. Nephrol. 3: 1387-1397. Tabelle 1a "Chronic renal failure" is the progressive loss of functional renal mass accompanied by compensatory growth and remodeling. The molecular and cellular events that occur during chronic renal failure include the release of growth factors, the proliferation of glomerular mesangial cells, and the expansion of extracellular matrix (Klahr et al., 1988, New Engl. J. Med 318: 1657-1666; Striker et al., 1989, in: Klahr, (ed.) Seminars in Nephrology, p. 318, Philadelphia, (WB Saunders); Ebihara et al., 1993, J. Am. Soc. Nephrol. 3: 1387-1397. Table 1a
a Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von einer humanen sgk. SEQ ID NR: 1 und 2.a Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a human sgk. SEQ ID NO: 1 and 2.
Humane sgk-Polypeptide können bei einem Durchmusterungsverfahren für Verbindungen verwendet werden, die die Aktivierung von humanem sgk-Polypeptid aktivieren (Agonist) oder inhibieren (Antagonisten, oder sonst Inhibitoren genannt). Somit kann das humane sgk-Polypeptid auch verwendet werden, um die Identifizierung von Antagonisten von zum Beispiel Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Gemischen von Produkten zu ermöglichen. Diese Antagonisten können natürliche Substrate, Liganden, Rezeptoren usw., wie der Fall sein kann, des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sein; oder können strukturelle oder funktionelle Nachahmer des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sein. Vgl. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991).Human sgk polypeptides can be used in a screening process for compounds that activate (agonist) or inhibit (antagonists, or otherwise called inhibitors) the activation of human sgk polypeptide. Thus, the human sgk polypeptide can also be used to facilitate the identification of antagonists from, for example, cells, cell-free preparations, chemical libraries, and natural mixtures of products. These antagonists can be natural substrates, ligands, receptors, etc., as the case may be, of the polypeptide of the present invention; or can be structural or functional mimics of the polypeptide of the present invention. See Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991).
Im allgemeinen können solche Durchmusterungsverfahren die Verwendung der geeigneten Zellen umfassen, die das humane sgk-Polypeptid exprimieren oder auf humanes sgk-Polypeptid reagieren. Solche Zellen umfassen Zellen von Säugern, Hefe, Drosophila oder E. coli. Zellen, die das humane sgk-Polypeptid exprimieren (oder Zellmembranen, die das exprimierte Polypeptid enthalten) oder auf das humane sgk-Polypeptid reagieren werden dann mit der Testverbindung in Kontakt gebracht, um Bindung, oder Stimulierung oder Inhibition einer funktionellen Antwort zu beobachten. Die Fähigkeit der Zellen zur humanen sgk- Aktivität, die mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurden, wird verglichen mit denselben Zellen, die nicht in Kontakt gebracht wurden.In general, such screening methods may involve the use of appropriate cells that express or respond to the human sgk polypeptide. Such cells include mammalian cells, yeast, Drosophila, or E. coli. Cells that express the human sgk polypeptide (or cell membranes containing the expressed polypeptide) or respond to the human sgk polypeptide will then contacted with the test compound to observe binding, or stimulation or inhibition of a functional response. The ability of cells contacted with the candidate compound to express human sgk activity is compared to the same cells not contacted.
Die Assays können einfach Testbindung einer Kandidatenverbindung sein, wobei die Adhärenz an die Zellen, die das humane sgk-Polypeptid tragen, mittels einer Markierung nachgewiesen wird, die direkt oder indirekt mit der Kandidatenverbindung assoziiert ist, oder in einem Assay, der Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten beinhaltet. Weiterhin können diese Assays testen, ob die Kandidatenverbindung in einem Signal resultiert, das durch die Aktivierung des humane sgk-Polypeptid erzeugt wird, unter Verwendung von Nachweissystemen, die für Zellen geeignet sind, die das humane sgk-Polypeptid tragen. Inhibitoren der Aktivierung werden im allgemeinen in der Gegenwart von bekannten Agonisten getestet und die Wirkung auf die Aktivierung durch den Agonisten durch die Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird beobachtet.The assays may simply test binding of a candidate compound, where adherence to cells bearing the human sgk polypeptide is detected using a label directly or indirectly associated with the candidate compound, or in an assay involving competition with a labeled competitor. Furthermore, these assays may test whether the candidate compound results in a signal generated by activation of the human sgk polypeptide using detection systems suitable for cells bearing the human sgk polypeptide. Inhibitors of activation are generally tested in the presence of known agonists and the effect on activation by the agonist by the presence of the candidate compound is observed.
Die cDNA der humanen sgk, das Protein und Antikörper gegen das Protein können auch verwendet werden, um Assays zum Nachweis der Wirkung von zugegebenen Verbindungen auf die Produktion mRNA und Protein von humanen rin Zellen zu entwerfen. Zum Beispiel kann ein ELISA zur Messung von sezernierten oder Zell-assoziierten Spiegeln von humanem sgk-Polypeptid unter Verwendung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern mittels im Fachgebiet bekannter Standardverfahren konstruiert werden, und dieser kann verwendet werden, um Mittel nachzuweisen, die die Produktion von humaner sgk in in geeigneter Weise manipulierten Zellen oder Geweben inhibieren oder erhöhen (auch Antagonisten oder Agonisten genannt).The human sgk cDNA, protein, and antibodies to the protein can also be used to design assays to detect the effect of added compounds on the production of mRNA and protein by human cells. For example, an ELISA can be constructed to measure secreted or cell-associated levels of human sgk polypeptide using monoclonal and polyclonal antibodies by standard procedures known in the art, and can be used to detect agents that inhibit or increase the production of human sgk in appropriately engineered cells or tissues (also called antagonists or agonists).
Das humane sgk-Polypeptid kann auch verwendet werden, um membrangebundene oder lösliche Rezeptren, wenn vorhanden, mittels auf dem Fachgebiet bekannter Standardrezeptorbindungsverfahren zu identifizieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Ligandenbindungs- oder Verknüpfungsassays, bei denen die humane sgk mit einem radioaktiven Isotop (z. B. 125I) markiert ist, chemisch modifiziert ist (z. B. biotinyliert) oder mit einer Peptidsequenz verbunden ist, die für den Nachweis oder die Reinigung geeignet ist, und mit der Quelle eines vermutlichen Rezeptors (Zellen, Zellmembranen, Zellüberstände, Gewebeextrakte, Körperflüssigkeiten) inkubiert wird. Andere Verfahren umfassen biophysikalische Verfahren wie die Oberflächenplamonenresonanz und die Spektroskopie. Zusätzlich zur Verwendung für die Reinigung und Clonierung des Rezeptors können diese Bindungsassays auch für die Identifizierung von gegebenenfalls vorhandenen Agonisten und Antagonisten der humanen sgk verwendet werden, die mit der Bindung der humanen sgk an seine Rezeptoren konkurrieren. Standardverfahren für die Durchführung von Durchmusterungssassays sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt.The human sgk polypeptide can also be used to identify membrane-bound or soluble receptors, if present, using standard receptor binding methods known in the art. These include, but are not limited to, ligand binding or linkage assays in which the human sgk is labeled with a radioactive isotope (e.g., 125I), chemically modified (e.g., biotinylated), or linked to a peptide sequence suitable for detection or purification and incubated with the source of a putative receptor (cells, cell membranes, cell supernatants, tissue extracts, body fluids). Other methods include biophysical methods such as surface plasmon resonance and spectroscopy. In addition to use for purification and cloning of the receptor, these Binding assays can also be used to identify agonists and antagonists of human sgk, if any, that compete with the binding of human sgk to its receptors. Standard procedures for performing screening assays are well known in the art.
Beispiele von potentiellen Antagonisten für das humane sgk-Polypeptid umfassen Peptide, die spezifische Teile von humaner sgk umfassen; Peptidnachahmer, die anti-sgk- Aktivität haben; Antikörper; oder in einigen Fällen Oligonucleotide oder Proteine, die eng verwandt sind mit den Liganden, Substraten, Rezeptoren usw., was gerade zutrifft, des humanen sgk-Polypeptids, z. B. ein Fragment von Liganden, Substraten, Rezeptoren; oder kleine chemische Moleküle, die an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden, aber keine Antwort hervorrufen, so daß die Aktivität des Polypeptids verhindert wird.Examples of potential antagonists for the human sgk polypeptide include peptides comprising specific portions of human sgk; peptide mimics having anti-sgk activity; antibodies; or in some cases, oligonucleotides or proteins closely related to the ligands, substrates, receptors, etc., as applicable, of the human sgk polypeptide, e.g., a fragment of ligands, substrates, receptors; or small chemical molecules that bind to the polypeptide of the present invention but do not elicit a response, thereby preventing the activity of the polypeptide.
Die humane sgk kann mittels einer Vielzahl rekombinanter Gentechnikverfahren hergestellt werden. Die isolierten Nukleinsäuren, insbesondere die DNAs, können durch operative Verknüpfung der DNA mit den erforderlichen Expressionskontrollbereichen (d. h. regulatorischen Bereichen), die für die Genexpression erforderlich sind, in Expressionsvektoren eingebracht werden. Diese Vektoren können in die geeigneten Wirtszellen, wie prokaryontische (z. B. bakterielle) oder eukaryontische (z. B. Hefe oder Säuger), mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren eingebracht werden (Ausubel et al., vorstehend). Nachdem die codierenden Sequenzen für die gewünschten Proteine hergestellt oder isoliert wurden, können in jeden geeigneten Vektor oder jedes geeignete Replicon cloniert werden. Dem Durchschnittsfachmann im Fachgebiet sind zahlreiche Clonierungsvektoren bekannt und die Auswahl eines geeigneten Clonierungsvektors ist eine Frage der Wahl. Das Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (für die bakterielle Expression) und ggf. eines Operators gestellt werden (hier insgesamt als "Kontroll"elemente bezeichnet), so daß die DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein codiert, in der Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert wurde, der das Expressionskonstrukt enthält, in RNA transkribiert wird. Die codierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz enthalten, oder auch nicht. Die Untereinheitsantigene der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von zum Beispiel dem tac-Promotor von E. coli oder dem Promotor des Protein A-Gens (spa) und der Signalsequenz exprimiert werden. Bei einer post-translationalen Prozessierung könne Leadersequenzen durch den bakteriellen Wirt entfernt werden. Vgl. z. B. U.S. Patent Nr. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.The human sgk can be produced using a variety of recombinant genetic engineering techniques. The isolated nucleic acids, particularly the DNAs, can be introduced into expression vectors by operatively linking the DNA to the required expression control regions (i.e., regulatory regions) required for gene expression. These vectors can be introduced into the appropriate host cells, such as prokaryotic (e.g., bacterial) or eukaryotic (e.g., yeast or mammalian), using methods known in the art (Ausubel et al., supra). After the coding sequences for the desired proteins have been produced or isolated, they can be cloned into any suitable vector or replicon. Numerous cloning vectors are known to those of ordinary skill in the art, and the selection of an appropriate cloning vector is a matter of choice. The gene can be placed under the control of a promoter, a ribosome binding site (for bacterial expression) and optionally an operator (collectively referred to herein as "control" elements) so that the DNA sequence encoding the desired protein is transcribed into RNA in the host cell transformed with a vector containing the expression construct. The coding sequence may or may not contain a signal peptide or leader sequence. The subunit antigens of the present invention can be expressed using, for example, the tac promoter of E. coli or the promoter of the protein A gene (spa) and the signal sequence. In post-translational processing, leader sequences can be removed by the bacterial host. See, e.g., U.S. Patent Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.
Zusätzlich zu den Kontrollsequenzen kann es wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulierung der Expression der Proteinsequenzen im Verhältnis zum Wachstum der Wirtszelle zulassen. Regulatorische Sequenzen sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt, und Beispiele umfassen diejenigen, die die Expression eines Gens erlauben, das in Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus angestellt oder abgestellt werden kann, einschließlich der Anwesenheit einer regulatorische Verbindung. Andere Arten von regulatorischen Elementen können in dem Vektor ebenfalls anwesend sein, zum Beispiel Enhancersequenzen.In addition to the control sequences, it may be desirable to add regulatory sequences that allow for the regulation of the expression of the protein sequences in relation to the growth of the host cell. Regulatory sequences are known to those of ordinary skill in the art, and examples include those that allow for the expression of a gene that can be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Other types of regulatory elements may also be present in the vector, for example, enhancer sequences.
Ein Expressionsvektor wird so konstruiert, daß die spezielle codierende Sequenz in dem Vektor mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen liegt, wobei die Lage und die Orientierung der codierenden Sequenzen in Bezug auf die Kontrollsequenzen so ist, daß die codierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d. h. die RNA-Polymerase, die an der Kontrollsequenz an das DNA-Molekül bindet, transkribiert die codierende Sequenz). Eine Modifikation der Sequenzen, die das spezielle Protein von Interesse codieren, kann für die Erreichung dieses Ziels wünschenswert sein. Zum Beispiel kann es in einigen Fällen erforderlich sein, die Sequenz so zu modifizieren, daß sie in der geeigneten Orientierung an die Kontrollsequenzen bindet; d. h., um den Leserahmen beizubehalten. Die Kontrollsequenzen und die anderen regulatorischen Sequenzen können vor der Insertion in einen Clonierungsvektor mit der codierenden Sequenz ligiert werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor cloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält.An expression vector is constructed so that the specific coding sequence is located in the vector with the appropriate regulatory sequences, the location and orientation of the coding sequences with respect to the control sequences being such that the coding sequence is transcribed under the "control" of the control sequences (i.e., the RNA polymerase that binds to the DNA molecule at the control sequence transcribes the coding sequence). Modification of the sequences encoding the specific protein of interest may be desirable to achieve this goal. For example, in some cases it may be necessary to modify the sequence so that it binds to the control sequences in the appropriate orientation; i.e., to maintain the reading frame. The control sequences and the other regulatory sequences may be ligated to the coding sequence prior to insertion into a cloning vector. Alternatively, the coding sequence can be cloned directly into an expression vector that already contains the control sequences and a suitable restriction site.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Sequenzen hinzuzufügen, die die Sezernierung des Polypeptids von dem Wirtsorganismus verursachen, mit einer anschließenden Abspaltung des sekretorischen Signals. Alternativ können Genfusionen geschaffen werden, wobei das Gen, das das Bindungsprotein von Interesse codiert, mit einem Gen fusioniert wird, das ein Protein mit anderen wünschenswerten Eigenschaften codiert. Zum Beispiel könnte ein Fusionspartner eine bekannte nachweisbare Aktivität (z. B. enzymatisch) bereitstellen, die als alternatives Mittel für die Auswahl des Bindungsproteins verwendet werden könnte. Der Fusionspartner könnte ein strukturelles Element sein, wie ein Zelloberflächenelement, so daß das Bindungsprotein (normalerweise eine cytosolische Komponente) auf der Zelloberfläche in der Form eines Fusionsproteins gezeigt werden könnte. Das Fusionsprotein (z. B. fusioniert mit einem FLAG-Peptid) wird so hergestellt, daß die Reinigung des exprimierten Proteins nach der Expression in der Wirtszelle möglich ist. Es kann auch wünschenswert Wert sein, Mutanten oder Analoga des Proteins von Interesse herzustellen. Mutanten der Analoga können hergestellt werden durch Deletion eines Teils der Sequenz, die das Protein codiert, durch Inserierung einer Sequenz und/oder durch Substitution eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb der Sequenz. Verfahren für die Modifikation von Nucleotidsequenzen, wie die stellenspezifische Mutagenese und die Bildung von Fusionsproteinen, sind dem Durchschnittsfachmann im Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. T. Maniatis et al., vorstehend; DNA Cloning, Bände I und II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization, vorstehend.In some cases, it may be desirable to add sequences that cause secretion of the polypeptide from the host organism, with subsequent cleavage of the secretory signal. Alternatively, gene fusions can be created, wherein the gene encoding the binding protein of interest is fused to a gene encoding a protein with other desirable properties. For example, a fusion partner could provide a known detectable activity (e.g., enzymatic) that could be used as an alternative means for selecting the binding protein. The fusion partner could be a structural element, such as a cell surface element, so that the binding protein (usually a cytosolic component) could be displayed on the cell surface in the form of a fusion protein. The fusion protein (e.g., fused to a FLAG peptide) is prepared so as to allow purification of the expressed protein after expression in the host cell. It It may also be desirable to prepare mutants or analogs of the protein of interest. Mutants of the analogs may be prepared by deleting a portion of the sequence encoding the protein, by inserting a sequence, and/or by substituting one or more nucleotides within the sequence. Methods for modifying nucleotide sequences, such as site-directed mutagenesis and the formation of fusion proteins, are known to those of ordinary skill in the art. See, e.g., BT Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Volumes I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Im Fachbebiet; sind eine Reihe von prokaryontischen Expressionsvektoren bekannt. Vgl. z. B. U.S. Patent Nr. 4,578,355; 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; vgl. auch U.K.-Patentanmeldungen GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; und die Europäische Patentanmeldung 103,395. Im Fachbebiet sind auch Hefeexpressionsvektoren bekannt. Vgl. z. B. U. S. Patent Nr. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; vgl. auch die Europäischen Patentanmeldungen 103,409; 100,561; 96,491. pSV2neo (wie beschrieben in J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341), das den späten SV40-Promotor verwendet, um die Expression in Säugerzellen anzutreiben, oder pCDNA1neo, ein Vektor, der von pCDNA1 (Mol. Cell Biol. 7: 4125-29) abgeleitet ist, der den CMV-Promotor verwendet, um die Expression anzutreiben. Diese beiden letzteren Vektoren können für die transiente oder stabile (z. B. unter Verwendung von G418- oder Hygromycin- Resistenz) Expression in Säugerzellen verwendet werden. Insektenzellenexpressionssysteme, z. B. Drosophila, sind auch von Nutzen, vgl. z. B. die PCT-Anmeldungen US 89/05155 und US 91/06838, ebenso wie die EP-Anmeldung 88/304093.3 und Baculovirus-Expressionssysteme.A number of prokaryotic expression vectors are known in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 4,578,355; 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; see also U.K. patent applications GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; and European Patent Application 103,395. Yeast expression vectors are also known in the art. See, for example, E.g., U.S. Patent Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; see also European Patent Applications 103,409; 100,561; 96,491. pSV2neo (as described in J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341), which uses the SV40 late promoter to drive expression in mammalian cells, or pCDNA1neo, a vector derived from pCDNA1 (Mol. Cell Biol. 7:4125-29), which uses the CMV promoter to drive expression. These latter two vectors can be used for transient or stable (e.g., using G418 or hygromycin resistance) expression in mammalian cells. Insect cell expression systems, e.g. Drosophila, are also useful, see e.g. PCT applications US 89/05155 and US 91/06838, as well as EP application 88/304093.3 and baculovirus expression systems.
In Abhängigkeit von dem ausgewählten Expressionssystem und Wirt werden die Proteine der vorliegenden Erfindung durch wachsende Wirtszellen produziert, die mit einem vorstehend beschriebenen Expressionsvektor transformiert wurden, unter Bedingungen, bei denen das Protein von Interesse exprimiert wird. Das Protein wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem das Protein in das Wachstumsmedium sezerniert, kann das Protein direkt aus dem Medium gereinigt werden. Wenn das Protein nicht sezerniert wird, wird es aus Zelllysaten isoliert oder aus der Zellmembranfraktion gewonnen. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Gewinnungsverfahren sind im Fachgebiet bekannt.Depending on the expression system and host selected, the proteins of the present invention are produced by growing host cells transformed with an expression vector described above under conditions in which the protein of interest is expressed. The protein is then isolated from the host cells and purified. If the expression system secretes the protein into the growth medium, the protein can be purified directly from the medium. If the protein is not secreted, it is isolated from cell lysates or recovered from the cell membrane fraction. The selection of appropriate growth conditions and recovery methods are known in the art.
Das Wissen, daß die humane sgk eine Proteinkinase codieren könnte, legt nahe, daß die vorstehend beschriebenen rekombinanten Formen verwendet werden können, um eine Proteinkinaseaktivität festzustellen. Dies würde typischerweise die direkte Inkubation von gereinigter humaner sgk mit einem Protein- oder Peptidsubstrat in der Gegenwart von γ-32P- ATP umfassen, gefolgt von der Messung der in das Substrat eingebauten Radioaktivität durch Abtrennung und Zählen, Trennverfahren umfassen die Immunpräzipitation, die Konjugation von Substrat an ein Kügelchen, was die Abtrennung mittels Zentrifugation erlaubt, oder die Bestimmung des Einbaus durch einen Scintillationsnachbarschaftsassay, SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie oder Biosensoranalyse. Während die spezifischen Substrate noch nicht bekannt sind, umfassen die Kandidaten humaner sgk selbst (Autophosphorylierung), basisches Myelinprotein, Casein, Histon und HSP27. Andere Substanzen könnten durch Inkubation von humaner sgk mit Zufallspeptiden entdeckt werden, die mit einem festen Träger verbunden sind oder auf der Oberfläche eines Phagen gezeigt werden, oder durch Inkubation von humaner sgk mit Säugerzelllysaten und γ-32P-ATP, gefolgt von Abtrennung des markierten Zielproteins und Sequenzierung. Die Proteinkinaseaktivität von humaner sgk kann die Inkubation mit einem spezifischen stromaufwärts liegenden Effektor erfordern. Dies kann durch prä- Inkubation von humaner sgk mit Lysaten von einer Vielzahl von stimulierten eukaryontischen Zellen und ATP erreicht werden.The knowledge that human sgk may encode a protein kinase suggests that the recombinant forms described above can be used to detect protein kinase activity. This would typically involve direct incubation of purified human sgk with a protein or peptide substrate in the presence of γ-32P-ATP followed by measurement of radioactivity incorporated into the substrate by separation and counting. Separation methods include immunoprecipitation, conjugation of substrate to a bead allowing separation by centrifugation, or determination of incorporation by scintillation proximity assay, SDS-PAGE followed by autoradiography or biosensor analysis. While the specific substrates are not yet known, candidates include human sgk itself (autophosphorylation), myelin basic protein, casein, histone and HSP27. Other substances could be discovered by incubation of human sgk with random peptides linked to a solid support or displayed on the surface of a phage, or by incubation of human sgk with mammalian cell lysates and γ-32P-ATP, followed by separation of the labeled target protein and sequencing. The protein kinase activity of human sgk may require incubation with a specific upstream effector. This can be achieved by pre-incubation of human sgk with lysates from a variety of stimulated eukaryotic cells and ATP.
Ohne an eine, spezielle Theorie über die Funktion der humanen sgk dieser Erfindung gebunden sein, wird geglaubt, daß unter den nützlichen Inhibitoren der Funktion von humaner sgk diejenigen Verbindungen sind, die die Kinaseaktivität von humaner sgk inhibieren. Andere Stellen der Inhibition sind selbstverständlich aufgrund ihrer Position in einer Signaltransduktionskaskade möglich. Somit wird auch die Inhibition der Wechselwirkung von humaner sgk mit einem oder mehreren der stromaufwärts oder stromabwärts liegenden Modulatoren/Substrate von dieser Erfindung in Betracht gezogen. Inhibitoren von Protein- Protein-Wechselwirkungen zwischen humaner sgk und anderen Faktoren könnte zur Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln für die Modulation der Aktivität von humaner sgk führen.Without being bound to any particular theory of the function of the human sgk of this invention, it is believed that among the useful inhibitors of the function of human sgk are those compounds that inhibit the kinase activity of human sgk. Other sites of inhibition are of course possible based on their position in a signal transduction cascade. Thus, inhibition of the interaction of human sgk with one or more of the upstream or downstream modulators/substrates is also contemplated by this invention. Inhibitors of protein-protein interactions between human sgk and other factors could lead to the development of pharmaceutical agents for the modulation of the activity of human sgk.
In einer spezifischen Ausführungsform wird hier ein Verfahren zur Identifizierung von möglichen Inhibitoren von sgk beschrieben. Das Peptidsubstrat von sgk wird a einem Ende biotinyliert. Dann wird es zu einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit 96 Mulden zugegeben. Die hohe Affinitätsbindung des Biotin an das Streptavidin in den Mulden wird das Peptid in der Mulde verankern und zulassen, daß der Rest der Phosphorylierung zugänglich wird. Gereinigte aktive sgk, ³³P-gamma-ATP und Verbindungen werden dann bei einer geeigneten Temperatur mit dem Peptid inkubiert, damit die Kinaseaktivität eintreten kann. Die Platten werden gewaschen und die Menge an phosphoryliertem Peptid wird bestimmt. Jene Mulden mit der geringsten Radioaktivitätsmenge könnten einen möglichen Inhibitor enthalten.In a specific embodiment, a method for identifying potential inhibitors of sgk is described herein. The peptide substrate of sgk is biotinylated at one end. It is then added to a streptavidin-coated 96-well plate. The high affinity binding of the biotin to the streptavidin in the wells will anchor the peptide in the well and allow the remainder to be accessible for phosphorylation. Purified active sgk, ³³P-gamma-ATP and compounds are then incubated with the peptide at an appropriate temperature to allow kinase activity to occur. The plates are washed and the amount of phosphorylated peptide is determined. Those wells with the least amount of radioactivity could contain a possible inhibitor.
Humane sgk könnte verwendet werden, um Proteine zu isolieren, die mit ihr interagieren und diese Wechselwirkung könnte ein Ziel des Eingreifens sein. Inhibitoren der Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen humaner sgk und anderen Faktoren könnten zur Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln für die Modulation der Aktivität von humaner sgk führen. Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "modulieren" die Beeinflussung der Funktion von humaner sgk.Human sgk could be used to isolate proteins that interact with it, and this interaction could be a target for intervention. Inhibitors of protein-protein interactions between human sgk and other factors could lead to the development of pharmaceutical agents for modulating the activity of human sgk. As used herein, the term "modulate" refers to influencing the function of human sgk.
Gene, die Proteine für Bindungsmoleküle für humane sgk codieren, können mittels zahlreicher Verfahren identifiziert werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel Liganden-Panning und FACS-Sortierung. Solche Verfahren sind in vielen Laborhandbüchern beschrieben, so wie zum Beispiel bei Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (Rivett, A. J. Biochem. J. 291: 1-10 (1993)): Kapitel 5 (1991).Genes encoding proteins for binding molecules for human sgk can be identified by numerous methods known to those of ordinary skill in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Such methods are described in many laboratory manuals, such as Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (Rivett, A. J. Biochem. J. 291: 1-10 (1993)): Chapter 5 (1991).
Zum Beispiel stellt das zwei-Hybrid-System der Hefe unter Verwendung der Wiederherstellung dei Aktivität eines transkriptionellen Aktivators Verfahren für den Nachweis der Wechselwirkung zwischen einem ersten Testprotein und einem zweiten Testprotein in vivo bereit. Das Verfahren wird im U.S.-Patent Nr. 5,283,173 offenbart; die Reagentien sind bei Clontech und Stratagene erhältlich. Kurz gesagt, wird die cDNA von humaner sgk mit der DNA bindenden Domäne des Gal4 Transkriptionsfaktors fusioniert und in Hefezellen exprimiert. Mitglieder einer cDNA-Bibliothek, die von Zellen von Interesse erhalten wurde, werden mit der Transaktivierungsdomäne von Gal4 fusioniert. cDNA-Clone, die Proteine exprimieren, die mit humaner sgk wechselwirken können, werden zu einer Wiederherstellung der Gal4-Aktivität führen und zur Transaktivierung der Expression eines Reportergens wie Gal1-lacZ. Die sgk-cDNA, die mit der DNA bindenden Domäne des Gal4 Transkriptionsfaktors fusioniert ist, kann bei einer oder mehreren Aminosäuren mutiert sein, die Verfahren dafür sind vorstehend beschrienen, um die Wechselwirkung zwischen Kinase und Substrat zu verbessern.For example, the yeast two-hybrid system using the restoration of the activity of a transcriptional activator provides methods for detecting the interaction between a first test protein and a second test protein in vivo. The method is disclosed in U.S. Patent No. 5,283,173; the reagents are available from Clontech and Stratagene. Briefly, the cDNA of human sgk is fused to the DNA binding domain of the Gal4 transcription factor and expressed in yeast cells. Members of a cDNA library obtained from cells of interest are fused to the transactivation domain of Gal4. cDNA clones expressing proteins that can interact with human sgk will result in restoration of Gal4 activity and transactivation of expression of a reporter gene such as Gal1-lacZ. The sgk cDNA fused to the DNA binding domain of the Gal4 transcription factor can be mutated at one or more amino acids, the methods for which are described above, to improve the interaction between kinase and substrate.
Ein alternatives Verfahren ist die Durchmusterung λgt11, λZAP (Stratagene) oder von äquivalenten cDNA-Expressionsbibliotheken mit rekombinanter, humaner sgk. Rekombinantes humanes sgk-Protein oder Fragmente davon werden mit kleinen Peptidenden wie FLAG, HSV oder GST fusioniert. Die Peptidenden können geeignete Phosphorylierungsstellen für eine Kinase wie Herzmuskel-Kreatinkinase besitzen oder sie können biotinyliert werden. Rekombinante humane sgk kann mit 32[P] phosphoryliert oder ohne Markierung verwendet werden und mit Streptavidin oder Antikörpern gegen die Enden nachgewiesen werden. λgt11cDNA-Expressionsbibliotheken werden aus Zellen von Interesse hergestellt und werden mit der rekombinanten humanen sgk inkubiert, gewaschen und die cDNA-Clone isoliert, die mit der humanen sgk wechselwirken, Vgl. z. B. T. Maniatis et al., vorstehend.An alternative method is to screen λgt11, λZAP (Stratagene) or equivalent cDNA expression libraries with recombinant human sgk. Recombinant human sgk protein or fragments thereof are fused to small peptide tails such as FLAG, HSV or GST. The peptide tails may have suitable phosphorylation sites for a kinase such as cardiac creatine kinase or they may be biotinylated. Recombinant human sgk may be phosphorylated with 32[P] or used without labeling and detected with streptavidin or antibodies against the tails. λgt11cDNA expression libraries are prepared from cells of interest and are incubated with the recombinant human sgk, washed and the cDNA clones that interact with the human sgk are isolated. See, e.g., T. Maniatis et al., supra.
Ein anderes Verfahren ist die Durchmusterung von Säugerexpressionsbibliotheken, bei denen die cDNAs in einen Vektor zwischen einen Säugerpromotor und eine Polyadenylierungsstelle cloniert und transient in COS- oder 293-Zellen transfiziert werden, gefolgt vom Nachweis des Bindungsproteins 48 Stunden später durch Inkubation von fixierten und gewaschenen Zellen mit einer markierten humanen sgk, vorzugsweise jodiert, und dem Nachweis von gebundener humaner sgk mittels Autoradiographie. Vgl. Sims et al., Science 241: 585-589 (1988) uni McMahan et aL, EMBO J. 10: 2821-2832 (1991). Auf diese Weise können Pools von c DNAs ausgewählt werden, die die cDNA enthalten, die das Bindungsproteins von Interesse codiert, und die cDNA von Interesse kann durch weitere Aufteilung von jedem Pool, gefolgt von Cyclen von transienter Transfektion, Bindung und Autoradiographie, isoliert werden. Alternativ kann die cDNA von Interesse durch Transfektion der gesamten cDNA-Bibliothek in Säugerzellen und Panning der Zellen auf einem Gefäß, das an die Platte gebundene humane sgk enthält, isoliert werden. Zellen, die nach dem Waschen haften, werden lysiert und die Plasmid-DNA wird isoliert, in Bakterien amplifiziert und der Cyclus von Transfektion und Panning wiederholt, bis ein einzelner cDNA-Clon erhalten wird. Vgl. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365 (1987) und Aruffo et al., EMBO J. 6: 3313 (1987). Wenn das Bindungsprotein sezerniert wird, kann seine cDNA durch eine ähnliche Pooling-Strategie erhalten werden, nachdem ein Bindungs- oder Neutralisierungsassay für die Testung der Überstände von transient transfizierten Zellen etabliert wurde. Allgemeine Verfahren für die Durchmusterung von Überständen sind bei Wong et al., Science 228: 810-815 (1985) offenbart.Another method is the screening of mammalian expression libraries, in which the cDNAs are cloned into a vector between a mammalian promoter and a polyadenylation site and transiently transfected into COS or 293 cells, followed by detection of the binding protein 48 hours later by incubation of fixed and washed cells with a labeled human sgk, preferably iodinated, and detection of bound human sgk by autoradiography. See Sims et al., Science 241: 585-589 (1988) and McMahan et al., EMBO J. 10: 2821-2832 (1991). In this way, pools of cDNAs can be selected that contain the cDNA encoding the binding protein of interest, and the cDNA of interest can be isolated by further partitioning from each pool, followed by cycles of transient transfection, binding, and autoradiography. Alternatively, the cDNA of interest can be isolated by transfecting the entire cDNA library into mammalian cells and panning the cells on a tube containing human sgk bound to the plate. Cells that adhere after washing are lysed and the plasmid DNA is isolated, amplified in bacteria, and the cycle of transfection and panning repeated until a single cDNA clone is obtained. See Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365 (1987) and Aruffo et al., EMBO J. 6:3313 (1987). If the binding protein is secreted, its cDNA can be obtained by a similar pooling strategy after establishing a binding or neutralization assay for testing supernatants from transiently transfected cells. General procedures for screening supernatants are disclosed in Wong et al., Science 228: 810-815 (1985).
Ein anderes alternatives Verfahren ist die Isolierung von Proteinen, die mit humaner sgk wechselwirken, direkt von Zellen. Fusionsproteine von humaner sgk mit GST oder kleinen Peptidenden werden hergestellt und an Kügelchen immobilisiert. Von den Zellen von Interesse werden biosynthetisch markierte oder nicht markierte Proteinextrakte gewonnen, mit den Kügelchen inkubiert uni mit Puffer gewaschen. Proteine, die mit humaner sgk wechselwirken, werden spezifisch von den Kügelchen eluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Primäre Aminosäuresequenzdaten der Bindungspartner werden mittels Mikrosequenzierung erhalten. Ggf. können die Zellen mit Mitteln behandelt werden, die eine funktionelle Antwort wie Tyrosinphosphorylierung zellulärer Proteine induzieren. Ein Beispiel für ein solches Mittel wäre ein Wachstumsfaktor oder ein Cytokin wie Interleukin-2.Another alternative method is to isolate proteins that interact with human sgk directly from cells. Fusion proteins of human sgk with GST or small peptide ends are prepared and immobilized on beads. Biosynthetically labeled or unlabeled protein extracts are obtained from the cells of interest, incubated with the beads and washed with buffer. Proteins that interact with human sgk are specifically eluted from the beads and analyzed by SDS-PAGE. Primary amino acid sequence data of the binding partners are obtained by microsequencing. If appropriate, the cells can be treated with agents that induce a functional response such as tyrosine phosphorylation of cellular proteins. An example of such an agent would be a growth factor or a cytokine such as interleukin-2.
Ein anderes alternatives Verfahren ist die Immunoaffinitätsreinigung. Rekombinante humane sgk wird mit markierten oder nicht markierten Zellextrakten inkubiert und mit anti- humanen sgk-Antikörpern immunpräzipitiert. Das Immunpräzipitat wird mit Protein A- Sepharose gewonnen und mittels SDS-PAGE analysiert. Nicht markierte Proteine werden Biotinylierung markiert und auf SDS-Gelen mit Streptavidin nachgewiesen. Bindungspartnerproteine werden mittels Mikrosequenzierung analysiert. Weiter biochemische Standardreinigungsschritte, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, könne vor der Mikrosequenzierung verwendet werden.Another alternative method is immunoaffinity purification. Recombinant human sgk is incubated with labeled or unlabeled cell extracts and immunoprecipitated with anti-human sgk antibodies. The immunoprecipitate is recovered with protein A-Sepharose and analyzed by SDS-PAGE. Unlabeled proteins are labeled with biotinylation and detected on SDS gels with streptavidin. Binding partner proteins are analyzed by microsequencing. Further standard biochemical purification steps known to those of ordinary skill in the art may be used prior to microsequencing.
Noch ein anderes alternatives Verfahren ist die Durchmusterung von Peptidbibliotheken nach Bindungspartnern. Rekombinantverlängerte oder -markierte, humane sgk wird verwendet, um Peptide aus einer Peptid- oder Phosphopeptidbibliothek auszuwählen, die mit humaner sgk wechselwirken. Die Sequenzierung der Peptide führt zur Identifikation von Consensuspeptidsequenzen, die in wechselwirkenden Proteinen gefunden werden könnten.Yet another alternative method is to screen peptide libraries for binding partners. Recombinantly extended or labeled human sgk is used to select peptides from a peptide or phosphopeptide library that interact with human sgk. Sequencing of the peptides leads to the identification of consensus peptide sequences that might be found in interacting proteins.
Bindungspartner für humane sgk, die nach einem dieser Verfahren oder nach anderen Verfahren identifiziert wurden, die den Durchschnittsfachleuten auf dem Fachgebiet bekannt wären, ebenso wie diejenigen vermutlichen Bindungspartner, die vorstehend diskutiert wurden, können bei den vorstehenden Testverfahren verwendet werden. Die Testung auf die Anwesenheit von Komplexen aus humaner sgk/Bindungspartner wird durch zum Beispiel das zwei-Hybrid-System der Hefe, ELISA oder Immungssays unter Verwendung von für den Komplex spezifischen Antikörpern durchgeführt. In der Gegenwart von Testverbindungen (d. h. Inhibitoren oder Antagonisten), die die Bildung der Wechselwirkung zwischen humaner sgk/Bindungspartner unterbinden oder inhibieren, wird eine verminderte Menge an Komplex nachgewiesen im Verglich mit einer Kontrolle, der die Testverbindung fehlt.Binding partners for human sgk identified by any of these methods or by other methods that would be known to those of ordinary skill in the art, as well as those putative binding partners discussed above, may be used in the above assays. Testing for the presence of human sgk/binding partner complexes is performed by, for example, the yeast two-hybrid system, ELISA, or immunoassays using antibodies specific for the complex. In the presence of test compounds (i.e., inhibitors or antagonists) that inhibit the formation of the interaction between human sgk/binding partner, a reduced amount of complex is detected compared to a control lacking the test compound.
Tests auf freie, humane sgk oder Bindungspartner werden zum Beispiel mittels ELISA oder eines Immungssays unter Verwendung von spezifischen Antikörpern oder durch Inkubation von radiomarkierter humaner sgk mit Zellen oder Zellmembranen, gefolgt von Zentrifugation oder Filtertrennungsschritten durchgeführt. In der Anwesenheit von Testverbindungen, die die Bildung der Wechselwirkung zwischen humaner sgk/Bindungspartner unterbinden oder inhibieren (d. h. Inhibitoren oder Antagonisten), wird eine erhöhte Menge an freier humaner sgk oder freiem Bindungspartner nachgewiesen im Vergleich mit einer Kontrolle, der die Testverbindung fehlt.Assays for free human sgk or binding partners are performed, for example, by ELISA or an immunoassay using specific antibodies or by incubation of radiolabeled human sgk with cells or cell membranes followed by centrifugation or filter separation steps. In the presence of test compounds that prevent or inhibit the formation of the human sgk/binding partner interaction (i.e., inhibitors or antagonists), an increased amount of free human sgk or free binding partner is detected compared to a control lacking the test compound.
Humane sgk-Polypeptide können auch verwendet werden, um die Bindungskapazität für humane sgk von Bindungsmolekülen für humane sgk in Zellen oder zellfreien Präparationen zu testen.Human sgk polypeptides can also be used to test the binding capacity for human sgk of binding molecules for human sgk in cells or cell-free preparations.
Antagonisten von humanen sgk-Polypeptiden können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger formuliert werden. Solche Formulierungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Antagonisten und einen pharmazeutische akzeptablen Träger oder Excipienten. Solche Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte zu dem Verabreichungsweg passen und gehört zum Stand der Technik.Antagonists of human sgk polypeptides can be formulated in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such formulations comprise a therapeutically effective amount of the antagonist and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerin, ethanol, and combinations thereof. The formulation should be appropriate to the route of administration and is within the state of the art.
Polypeptide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie therapeutischen Verbindungen, angewendet werden.Polypeptides and other compounds of the present invention may be used alone or in conjunction with other compounds, such as therapeutic compounds.
Bevorzugte Formen von pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen diejenigen, die an die Verabreichung per Injektion angepaßt sind, typischerweise intravenöse Injektion. Andere Injektionswege wie subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal, können verwendet werden. Alternative Verfahren für die systemische Verabreichung umfassen die transmucosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Durchdringungsmitteln, wie Gallensalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergentien. Außerdem kann bei geeigneter Formulierung in enterischer oder verkapselter Formulierung auch die orale Verabreichung möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann auch topisch und/oder lokalisiert sein, in der Form von Silben, Pasten, Gelen und dergleichen.Preferred forms of pharmaceutical compositions include those adapted for administration by injection, typically intravenous injection. Other routes of injection such as subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal may be used. Alternative methods for systemic administration include transmucosal and transdermal administration using penetrants such as bile salts or fusidic acids or other detergents. In addition, when suitably formulated in enteric or encapsulated formulation, oral administration may also be possible. Administration of these compounds may also be topical and/or localized, in the form of suppositories, pastes, gels and the like.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von dem gewählten Peptid, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, den Bedingungen des Empfängers und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosen sind jedoch im Bereich 0,1-100 ug/kg des Empfängers. Angesichts der Vielzahl an verfügbaren Verbindungen und der verschiedenen Wirksamkeit der verschiedenen Verabreichungswege sind bei den benötigten Dosen jedoch weite Variationen zu erwarten. Man könnte zum Beispiel erwarten, daß die orale Verabreichung höhere Dosen erfordert als die Verabreichung durch intravenöse Injektion. Unter Verwendung von empirischer Standardroutine können die Variationen bei den Dosierungsspiegeln angepaßt werden, wie im Fachgebiet gut bekannt ist.The dosage range required will depend on the peptide chosen, the route of administration, the nature of the formulation, the conditions of the recipient and the judgment of the attending physician. However, suitable doses are in the range 0.1-100 ug/kg of recipient. However, given the variety of compounds available and the varying potency of the different routes of administration, wide variation in the doses required is to be expected. For example, oral administration might be expected to require higher doses than administration by intravenous injection. Using standard empirical routine, variations in dosage levels can be accommodated, as is well known in the art.
Für die Behandlung verwendete Polypeptide können auch endogen durch Behandlungsmodalitäten, die oft als "Gentherapie" bezeichnet werden, wie vorstehend beschrieben, in dem Individuum erzeugt werden. So können zum Beispiel Zellen eines Individuum mit einem Polynucleotid, wie einer DNA oder RNA, und, zum Beispiel durch die Verwendung eines retroviralen Plasmidvektors gentechnisch behandelt werden, um ex vivo ein Polypeptid zu codieren. Die Zellen werden dann in das Individuum eingebracht.Polypeptides used for treatment can also be produced endogenously in the individual by treatment modalities often referred to as "gene therapy" as described above. For example, cells of an individual can be treated with a polynucleotide, such as DNA or RNA, and, for example, through the use of a retroviral plasmid vector, genetically engineered to encode a polypeptide ex vivo. The cells are then introduced into the individual.
Die nachstehenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und Routine sind, außer wenn anderes im Detail beschrieben ist. Die Beispiele sind illustrativ, beschränken aber die Erfindung nicht.The following examples are carried out using standard procedures known and routine to those of ordinary skill in the art, unless otherwise described in detail. The examples are illustrative but do not limit the invention.
sgk-mRNA-Spiegel erhöhten sich in der Niere eines Mausmodells für chronisches Nierenversagen. Dies wird durch einen Northern-Blot mit 15 ug Gesamt-RNA gezeigt, die aus der Niere von mageren und diabetischen db/db-Mäusen extrahiert worden war und mit einer 500 Basenpaare langen und mit 32P markierten cDNA hybridisiert wurde, die die Maus-sgk codierte. Die für sgk-spezifische Botschaft ist 2,4 Kilobasen (kb) und wird in der Niere von diabetischen Mäusen im Vergleich mit den mageren Mäusen 5-6-fach induziert.sgk mRNA levels increased in the kidney of a mouse model of chronic renal failure. This is demonstrated by a Northern blot of 15 μg of total RNA extracted from the kidney of lean and diabetic db/db mice and hybridized to a 500 base pair 32P-labeled cDNA encoding mouse sgk. The sgk-specific message is 2.4 kilobases (kb) and is induced 5-6-fold in the kidney of diabetic mice compared to the lean mice.
Die erhöhte Expression von sgk in der Niere der diabetischen Mäuse ist spezifisch für die Niere. Dies wird durch einen Northern-Blot mit 10 ug Gesamt-RNA gezeigt, die aus der Leber, dem Gehirn, dem Herz und der Niere von mageren und diabetischen db/db-Mäusen extrahiert worden war. Die sgk-Botschaft von 2,4 kb wird im Gehirn, dem Herz und der Niere, aber nicht in der Leber dieser Tiere exprimiert. Im Vergleich mit den mageren Tieren wird die mRNA für sgk jedoch nur in der Niere der diabetischen Tiere induziert und nicht in anderen Geweben.The increased expression of sgk in the kidney of diabetic mice is specific to the kidney. This is demonstrated by a Northern blot with 10 ug total RNA extracted from the Liver, brain, heart and kidney of lean and diabetic db/db mice. The 2.4 kb sgk message is expressed in the brain, heart and kidney but not in the liver of these animals. However, compared with the lean animals, the mRNA for sgk is only induced in the kidney of the diabetic animals and not in other tissues.
Die sgk-Botschaft wird nicht nur in einem Nagermodell für chronisches Nierenversagen induziert, sondern ihre Spiegel sind auch in kranker, humaner Niere erhöht. Eirl Northern-Blot mit 15 ug Gesamt-RNA, die aus der Niere von normalen und diabetischen Patienten extrahiert worden war, wurde mit einer 500 Basenpaare langen und mit 32P markierten cDNA hybridisiert, die die Maus-sgk codierte. Im Vergleich mit normaler Niere ist die sgk-mRNA von 2,4 kb in der diabetischen Niere 2-3-fach induziert.The sgk message is not only induced in a rodent model of chronic renal failure, but its levels are also increased in diseased human kidney. Eirl Northern blot with 15 μg total RNA extracted from the kidney of normal and diabetic patients was hybridized with a 500 base pair 32P-labeled cDNA encoding mouse sgk. Compared with normal kidney, the 2.4 kb sgk mRNA is induced 2-3-fold in the diabetic kidney.
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