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DE69736673T2 - Rifamycin biosynthese genkluster - Google Patents

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DE69736673T2
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DE
Germany
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region
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Thomas Schupp
Christiane Toupet
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Novartis AG
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Description

  • Rifamycine bilden eine wichtige Gruppe an makrocyclischen Antibiotika (Wehrli, Topics in Current Chemstry (1971), 72, 21-49). Sie bestehen aus einem Naphthochinonchromophor, das durch eine lange aliphatische Brücke gespannt ist. Rifamycine gehören zur Klasse der Ansamycinantibiotika, die von mehreren Gram-positiven Bodenbakterien der Actinomycetesgruppe und einigen wenigen Pflanzen gebildet werden.
  • Ansamycine sind durch einen flachen aromatischen Kern gekennzeichnet, der durch eine lange aliphatische Brücke gespannt ist, welche die gegenüberliegenden Positionen des Kern verbindet. Es können zwei unterschiedliche Gruppen von Ansamycinen durch die Struktur des aromatischen Kerns unterschieden werden. Eine Gruppe besitzt einen naphthoquinoiden Chromophor, wobei typische Vertreter Rifamycin, Streptovaricin, Tolypomycin und Naphthomycin sind. Die zweite Gruppe, die einen benzochinoiden Chromophor aufweist, ist durch Geldanamycin, Maytansine und Ansamitocine gekennzeichnet (Ghisalba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics, E.J. Vandamme, Herausgeber, Decker Inc. New York (1984) 281-327). Im Gegensatz zu Antibiotika vom Makrolidtyp enthalten die Ansamycine im aliphatischen Ringsystem keine Lactonbindung, sondern eine Amidbindung, die die Verbindung an den Chromophor bildet.
  • Die Auffindung der durch den Mikroorganismus Streptomyces mediterranei (wie der Organismus zu der Zeit genannt wurde, siehe später) gebildeten Rifamycine wurde das erste Mal 1959 beschrieben (Sensi et al., Farmaco Ed. Sci. (1959) 14, 146-147). Die Extraktion mit Ethylacetat der angesäuerten Kulturen von Streptomyces mediterranei führt zur Isolierung eines Gemisches aus antibiotisch wirksamen Komponenten, den Rifamycinen A, B, C, D und E. Rifamycin B, die stabilste Komponente, wurde von den anderen Komponenten abgetrennt und aufgrund der stark sauren Eigenschaften und der leichten Salzbildung von den anderen Komponenten abgetrennt.
  • Rifamycin B hat die Struktur der Formel (1)
    Figure 00010001
  • Rifamycin B ist die Hauptkomponente der Fermentation, wenn Barbiturat zum Fermentationsmedium gegeben wird und/oder verbesserte Produktionsmutanten von Streptomyces mediterranei verwendet werden.
  • Der Rifamycinproduktionsstamm wurde ursprünglich als Streptomyces mediterranei klassifiziert (Sensi et al., Farmaco Ed. Sci. (1959) 14, 146-147). Eine Analyse der Zellwand von Streptomyces mediterranei durch Thiermann et al. zeigte später, dass dieser Stamm eine Zellwand aufweist, die für Nocar dia typisch ist und der Stamm wurde als Nocardia mediterranei reklassifiziert (Thiemann et al., Arch. Microbiol. (1969), 67, 147-151). Nocardia mediterranei wurde erneut auf der Grundlage von neueren, akuraten morphologischen und biochemischen Kriterien reklassifiziert. Auf der Grundlage der exakten Zusammensetzung der Zellwand, dem Fehlen von Mycolsäure und der Unempfindlichkeit gegenüber Phagen von Nocardia und Rhodococcus wurde der Stamm der neuen Gattung Amycolatopsis als Amycolatopsis mediterranei zugeordnet (Lechevalier et al., Int. Syst. Bacteriol. (1986), 36, 29). Lab et al. (Crit. Rev. Microbiol. (1995), 21, 19-30) haben Verfahren zur Verbesserung der Rifamycinbildung durch Amycoplatopsis mediterranei zusammengefasst.
  • Rifamycine haben eine starke antibiotische Aktivität hauptsächlich gegen Gram-positive Bakterien, wie Mycobakterien, Neisseria und Staphylococci. Der bakterizide Effekt von Rifamycinen leitet sich von der spezifischen Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase ab, die die RNA Biosynthese unterbricht (Wehrli und Staehlin, Bacteriol. Rev. (1971), 35, 290-309). Das semisynthetische Rifamycin B Derivat Rifampin (Rifampicin) wird klinisch breit als Antibiotikum gegen den Erreger verwendet, der Tuberkulose verursacht, nämlich Mycobacterium tuberculosis.
  • Die naphthochinoiden Ansamycine der Streptovaricin- und Tolypomycingruppe zeigen, wie Rifamycin, einen antibakteriellen Effekt durch die Hemmung der bakteriellen RNA Polymerase. Im Gegensatz dazu hat Naphthomycin einen antibakteriellen Effekt ohne die Hemmung der bakteriellen RNA Polymerase. Die Benzochinoidansamycine zeigen keine Hemmung der bakteriellen RNA Polymerase und haben daher nur eine relativ schwache antibakterielle Aktivität, falls überhaupt. Andererseits haben einige Vertreter dieser Substanzklasse eine Wirkung auf eukaryontische Zellen. So wurden Antipilz-, Antiprotozoenund Antitumoreigenschaften für Geldanamycin beschrieben. Andererseits werden den Maytansinen antimitotische (Antitubulin), antileukämische und antitumorale Eigenschaften zugeschrieben. Einige Rifamycine zeigen auch eine Antitumor- und Antivirusaktivität, aber nur in hohen Konzentrationen. Der biologische Effekt scheint so unspezifisch zu sein.
  • Trotz der großen strukturellen Varietät der Ansamycine scheint ihre Biosynthese durch einen metabolischen Weg stattzufinden, der viele gemeinsame Elemente enthält (Ghisalba et al. Biotechnology of Industrial Antibiotics, E. J. Vandamme, Herausgeber, Decker Inc. New York (1984), 281-327). Der aromatische Kern für alle Ansamycine wird möglicherweise ausgehend von 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure aufgebaut. Ausgehend von diesem Molekül, das vermutlich als Coenzym A aktiviert wird, wird die gesamte aliphatische Brücke durch eine multifunktionale Polyketidsyntase synthetisiert. Die Länge der Brücke und die Prozessierung der Ketogruppen, die anfänglich durch die Kondensationsschritte gebildet werden, werden durch die Polyketidsynthase kontrolliert. Um die vollständige aliphatische Brücke für Rifamycine aufzubauen, sind 10 Kondensationsschritte, 2 mit Acetat und 8 mit Propionat als Bausteine erforderlich. Die Sequenz dieser einzelnen Kondensationsschritte wird ähnlich durch die Polyketidsynthase bestimmt. Strukturvergleiche und Untersuchungen mit dem Einbau von radioaktivem Acetat und Propionat haben gezeigt, dass die Sequenz aus Acetat- und Propionateinbau für die verschiedenen Ansamycine gemäß einem Schema stattfindet, das in den ersten Kondensationsschritten identisch oder sehr ähnlich zu sein scheint. Daher zweigt die Synthese der verschiedenen Ansamycine von einem gemeinsamen Syntheseschema der Ansamycinpolyketidsynthasen (dem Rifamycinsyntheseschema) früher oder später gemäß ihrer Strukturunterschiede von der Rifamycinstruktur in die Seitenäste der Synthese ab (Ghisalba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics, E. J. Vandamme, Dekker Inc. New York (1984), 281-327).
  • Aufgrund der großen strukturellen Vielzahl der Rifamycine und ihrem spezifischen und interessanten biologischen Effekt besteht ein großes Interesse, die genetische Basis ihrer Synthese zu verstehen, um die Möglichkeit zu generieren, diese spezifisch zu beeinflussen. Dies ist insbesondere erwünscht, da, wie oben erklärt, viele Gemeinsamkeiten zwischen der Synthese der Rifamycine und der von anderen Ansamycinen bestehen. Diese Ähnlichkeit in der Biosynthese, die sich möglicherweise von einem gemeinsamen evolutorischen Ursprung dieses Biosynthesewegs ableitet, hat naturgemäß eine genetische Basis.
  • Die genetische Basis der Biosynthese der Sekundärmetaboliten existiert im wesentlichen in den Genen, die für die einzelnen Biosynthesenzyme kodieren und in den regulatorischen Elementen, die die Expression der Biosynthesegene kontrollieren. Die Synthesegene der sekundären Metaboliten der Actinomyceten wurden in allen untersuchten Systemen als Cluster von benachbarten Genen gefunden. Die Größe solcher antiobiotischer Gencluster erstreckt sich von etwa 10 Kilobasen (kb) bis mehr als 100 kb. Die Cluster enthalten oft spezifische Regulatorgene und Gene für die Resistenz des Produktionsorganismus gegenüber dem eigenen Antibiotikum (Chater, Ciba Found. Symp. (1992), 171, 144-162).
  • Die hierin beschriebene Erfindung hat es nun durch die Identifizierung und Klonierung von Genen der Rifamycinbiosynthese geschafft, die genetische Basis zur Synthese von Rifamycinanaloga oder neuen Ansamycinen durch genetische Verfahren zu schaffen, die Strukturelemente von Rifamycin mit anderen Ansamycinen kombiniert. Dies schafft auch die Basis zur Herstellung von neuen Substanzsammlungen auf der Basis der Rifamycinbiosynthesegencluster durch kombinatorische Biosynthese.
  • Es war in einem ersten Schritt möglich, ein DNA Fragment aus dem Genom von A. mediterranei zu identifizieren und zu klonieren, das eine Homologie mit bekannten Polyketidsynthasegenen zeigt. Nach dem Erhalt der Sequenzinformation aus dem DNA Fragment, die eine typische Sequenz für Polyketidsynthasen bestätigt, war es möglich, eine Cosmidgenbank von A. mediterranei mit spezifischen DNA Sonden, die sich von diesem Fragment ableiten, in einem Screeningprogramm für weitere DNA Fragmente zu screenen, die im Rifamycingencluster beteiligt sind. Als Ergebnis wird das vollständige Rifamycinpolyketidsynthasegencluster identifiziert und einer Sequenzbestimmung unterzogen (siehe SEQ ID Nr. 3). Das Gencluster umfasst 6 offene Leserahmen, die hierin als ORF A, B, C, D, E und F bezeichnet werden und die für die in SEQ ID Nr. 4 bis 9 gezeigten Proteine und Polypeptide kodieren.
  • Das auf diese Weise isolierte und charakterisierte Gencluster stellt beispielsweise die Basis für eine gezielte Optimierung der Produktion von Rifamycin, Ansamycinen oder Analoga hiervon dar Beispiele für Techniken und mögliche Anwendungsgebiete, die in diesem Zusammenhang erhältlich sind, sind folgende:
    • • Überexpression von einzelnen Genen in Produktionsstämmen mit Plasmidvektoren oder durch den Einbau in das Chromosom
    • • Untersuchung der Expression und Transkriptionsregulation des Genclusters während der Fermentation mit verschiedenen Produktionsstämmen und die Optimierung hiervon durch physiologische Parameter und geeignete Fermentationsbedingungen
    • • Identifizieurng der regulatorischen Gene und der DNA Bindungsstellen der entsprechenden regulatorischen Proteine im Gencluster. Die Charakterisierung des Effekts dieser regulatorischen Elemente bei der Produktion von Rifamycinen oder Ansamycinen und deren Beeinflussung durch spezifische Mutation dieser Gene oder der DNA Bindungsstellen
    • • Duplikation des kompletten Genclusters oder von Teilen hiervon in Produktionsstämmen Neben diesen Anwendungen des Genclusters zur Verbesserung der Produktion durch Fermentation, wie dies oben beschrieben ist, kann es ähnlich zur biosynthetischen Herstellung von neuen Rifamycinanaloga oder neuen Ansamycinen oder Ansamycin-ähnlichen Verbindungen verwendet werden, worin die aliphatische Brücke nur an einem Ende des aromatischen Kerns gebunden ist. Die folgenden Möglichkeiten kommen hierfür in Betracht, wie beispielsweise:
    • • Inaktivierung der einzelnen Schritte der Biosynthese, beispielsweise durch Genzerstörung
    • • Mutation von einzelnen Schritten in der Biosynthese, beispielsweise durch Genaustausch Verwendung des Clusters oder von Fragmenten hiervon als DNA Sonde, um andere natürliche Mikroorganismen zu isolieren, die einzelne Metaboliten produzieren, die zu Rifamycin oder Ansamycinen ähnlich sind.
    • • Austausch von einzelnen Elementen in diesem Gencluster durch die von anderen Genclustern.
    • • Verwendung von modifizierten Polyketidsynthasen zum Aufbau von Genbanken für verschiedene Rifamycinanaloga oder Ansamycine, die dann auf ihre Aktivität getestet werden (Jackie & Khosala, Chemistry & Biology (1995), 2, 355-362).
    • • Konstruktion von mutierten Actinomycetenstämmen, aus denen das natürliche Rifamycin- oder Ansamycinbiosynthesegencluster im Chromosom teilweise oder vollständig deletiert wurde und die so zur Expression von genetisch modifizierten Genclustern verwendet werden können.
    • • Austausch von einzelnen Elementen innerhalb des Genclusters
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein DNA Fragment aus dem Genom von Amycolatopsis mediterranei, das eine DNA Region umfasst, die direkt oder indirekt im Gencluster beteiligt ist, das für die Rifamycinsynthese verantwortlich ist, und die benachbarten DNA Regionen und funktionellen Bestandteile oder Domänen hiervon.
  • Die erfindungsgemäßen DNA Fragmente der Erfindung können darüber hinaus regulatorische Sequenzen umfassen, wie Promotoren, Repressor- oder Aktivatorbindungsstellen, Repressor- oder Aktivatorgene, Terminatoren oder Strukturgene. Ebenfalls sind ein Teil der Erfindung alle Kombinationen dieser DNA Fragmente miteinander oder mit anderen DNA Fragmenten, beispielsweise Kombinationen von Promotoren, Repressor- oder Aktivatorbindungsstellen und/oder Repressor oder Aktivatorgenen aus einem Ansamycingencluster, insbesondere aus dem Rifamycingencluster mit fremden Strukturgenen oder Kombinationen von Strukturgenen aus dem Ansamycingencluster, speziell dem Rifamycingencluster mit fremden Promotoren und Kombinationen von Strukturgenen miteinander oder mit Genfragmenten, die für enzymatisch aktive Domänen kodieren und von verschiedenen Ansamycinbiosynthesesystemen stammen. Fremde Strukturgene und fremde Genfragmente, die für enzymatisch aktive Domänen kodieren, kodieren beispielsweise für Proteine, die bei der Biosynthese von anderen Ansamycinen beteiligt sind.
  • Ein bevorzugtes DNA Fragment ist eines, das direkt oder indirekt im Gencluster beteiligt ist, das für die Rifamycinsynthese verantwortlich ist.
  • Das Gencluster oder die DNA Region, die oben beschrieben sind, enthält beispielsweise die Gene, welche für die einzelnen Enzyme kodieren, die bei der Biosynthese von Ansamycinen beteiligt sind, insbesondere von Rifamycin, und die regulatorischen Elemente, die die Expression der Biosynthesegene kontrollieren. Die Größe solcher antibiotischen Gencluster erstreckt sich von etwa 10 Kilobasen (kb) bis über 100 kb. Die Gencluster umfassen normalerweise spezifische regulatorische Gene und Gene für die Resistenz des Produktionsorganismus gegenüber seinem eigenen Antibiotikum. Beispiele, was durch Enzyme oder enzymatisch aktive Domänen gemeint ist, die bei dieser Biosynthese beteiligt sind, sind die, welche zur Synthese der Ansamycine, wie Rifamycin ausgehend von 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure erforderlich sind, beispielsweise Polyketidsynthasen, Acyltransferasen, Dehydratasen, Ketoreduktasen, Acylcarrierproteine oder Ketoacylsynthasen.
  • Daher ist die vollständige Sequenz des Genclusters, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, wie auch DNA Fragmente, die Sequenzteile enthalten, welche für eine Polyketidsynthase oder eine enzymatisch aktive Domäne hiervon kodieren, besonders bevorzugt. Beispiele für solche bevorzugten DNA Fragmente sind beispielsweise jene, die für ein oder mehrere Proteine und Polypeptide kodieren, die in den SEQ ID Nr. 4, 5, 6, 7, 8 und 9 gezeigt sind oder funktionelle Derivate hiervon, die beispielsweise 15 oder mehr aufeinandertolgende Nukleotide umfassen. Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen DNA Regionen des Genclusters gemäß der Erfindung oder von Fragmenten hiervon, wie jene, die in den hinterlegten Klonen pNE95, pRi44-2 und pNE112 vorkommen oder hiervon abgeleitet sind. Weitere bevorzugte DNA Fragmente sind jene, die Sequenzteile umfassen, die Homologien mit den Sequenzen zeigen, die in den Klonen pNE95, pRi44-2 und/oder pNE112 enthalten sind oder mit SEQ ID Nr. 1 und/oder 3 und können daher als Hybridisierungssonde innerhalb einer genomischen Genbank von Ansamycin-, insbesondere Rifamycin-bildendem Organismus verwendet werden, um Bestandteile des entsprechenden Genclusters aufzufinden. Das DNA Fragment kann darüberhinaus beispielsweise ausschließlich genomische DNA umfassen. Ein besonders bevorzugtes DNA Fragment ist eines, das die in SEQ ID Nr. 1 oder 3 gezeigte Nukleotidsequenz oder partielle Sequenzen hiervon umfasst, das aufgrund der Homologien als Struktur- oder Funktionsäquivalent zu dieser Sequenz oder der partiellen Sequenz hiervon betrachtet werden kann und das daher zur Hybridisierung mit dieser Sequenz fähig ist.
  • Die erfindungsgemäßen DNA Fragmente umfassen beispielsweise Sequenzteile, die Homologien mit dem oben beschriebenen Enzymen, Enzymdomänen oder Fragmenten hiervon aufweisen.
  • Der Ausdruck Homologien und Struktur- und/oder Funktionsäquivalente bezieht sich primär auf DNA und Aminosäuresequenzen mit wenigen oder minimalen Differenzen zwischen den relevanten Sequenzen. Diese Unterschiede können sehr unterschiedliche Ursachen haben. Dies kann beispielsweise Mutationen oder Stamm-spezifische Unterschiede umfassen, die natürlich vorkommen oder künstlich induziert sind. Oder die aus der gegenüber der anfänglichen Sequenz beobachteten Unterschiede stammen von einer gezielten Modifikation, die beispielsweise während einer chemischen Synthese eingeführt werden kann.
  • Funktionale Unterschiede können als minimal betrachtet werden, falls beispielsweise die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid oder eine Proteinsequenz kodiert, im wesentlichen dieselben charakterstischen Eigenschaften aufweist, wie die anfängliche Sequenz, ob in Bezug auf die enzymatische Aktivität, die immunologische Reaktivität oder im Fall einer Nukleotidsequenz, in Bezug auf die Genregulation.
  • Strukturunterschiede können als minimal betrachtet werden, solange eine signifikante Überlappung oder Ähnlichkeit zwischen den verschiedenen Sequenzen besteht oder sie haben zumindest ähnliche physikalische Eigenschaften. Die letzteren umfassen beispielsweise die elektrophoretische Mobilität, chromatographische Ähnlichkeiten, Sedimentationskoeffizienten, spektrophotometrische Eigenschaften usw.
  • Im Fall der Nukleotidsequenzen sollte die Übereinstimmung mindestens 70 %, aber vorzugsweise 80 % und vor allem 90 % oder mehr betragen. Im Fall der Aminosäuresequenz sollten die entsprechenden Zahlen zumindest 50 %, aber vorzugsweise 60 % und vor allem 70 % sein. 90 % Übereinstimmung ist äußerst bevorzugt.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Klonierung eines der oben beschriebenen DNA Fragmente. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst beispielsweise die folgenden Schritte:
    • a) Aufbau einer genomischen Genbank,
    • b) Screennen dieser Genbank mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA Sequenzen, und
    • c) Isolierung der als positiv identifizierten Klone.
  • Ein allgemeines Verfahren zur Identifizierung von DNA Fragmenten, die bei der Biosynthese von Ansamycinen beteiligt sind, umfasst beispielsweise die folgenden Schritte:
    • 1) Klonierung eines DNA Fragments, das eine Homologie mit bekannten Polyketidsynthasegenen zeigt a) Das Vorkommen von DNA Fragmenten, die eine Homologie mit den erfindungsgemäßen Polyketidsynthasegenen aufweisen, wird in den zu untersuchenden Stämmen durch ein Southernexperiment mit der chromosomalen DNA dieses Stamms detektiert. Die Größe solcher homologer DNA Fragmente kann durch den Verdau der DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym bestimmt werden. b) Herstellung einer Plasmidgenbank, die die oben verdauten chromosomalen Fragmente umfasst. Normalerweise werden einzelne Klone dieser Genbank erneut auf eine Homologie mit den Polyketidsynthasegenen gemäß der Erfindung getestet. Die Klone mit rekombinanten Plasmiden, die Fragmente umfassen, welche eine Homologie mit der Polyketidsonde aufweisen, werden dann normalerweise auf der Grundlage dieser Homologie isoliert.
    • 2) Analyse der klonierten Region a) Restriktionsanalyse der isolierten rekombinanten Plasmide und Überprüfung der Identität dieser klonierten Fragmente miteinander. b) Durch einen chromosomalen Southern Blot mit DNA des ursprünglichen Mikroorganismus und des isolierten DNA Fragments als Sonde kann gezeigt werden, dass das klonierte Fragment ein ursprüngliches chromosomales DNA Fragment aus dem ursprünglichen Mikroorganismus ist. c) Es ist als Option möglich, eine signifikante Homologie des klonierten DNA Fragments mit einer chromosomalen DNA aus anderen Ansamycinproduzenten zu zeigen (Streptovaricin, Tolypomycin, Geldanamycin, Ansamitocin). Dies würde bestätigen, dass die klonierte DNA für die Gencluster der Ansamycinbiosynthese und so auch der Rifamycinbiosynthese typisch ist. d) DNA Sequenzierung als internes Restriktionsfragment und Demonstration durch vergleichende Sequenzanalyse, dass die klonierte Region eine typische DNA Sequenz von Polyketidsynthasen ist, die für die Biosynthese von Polyketidantibiotika aus Actinomyceten kodiert.
    • 3) Isolierung und Charakterisierung von benachbarten DNA Regionen a) Konstruktion einer Kosmidgenbank aus dem ursprünglichen Mikroorganismus und Analyse hiervon auf Homologie mit den isolierten Fragmenten. Isolierung von Cosmiden, die eine Homologie mit diesem Fragment aufweisen. b) Demonstration durch Restriktionsanalyse, dass die isolierten Cosmidklone eine DNA Region des ursprünglichen Mikkoorganismus umfassen, die mit dem ursprünglichen Fragment überlappt.
  • Wie oben beschrieben, ist der erste Schritt bei der Isolierung der erfindungsgemäßen DNA Fragmente normalerweise das Erstellen von genomischen Genbanken aus dem Organismus von Interesse, der das erforderliche Ansamycin, speziell Rifamycin synthetisiert.
  • Die genomische DNA kann aus einem Wirtsorganismus auf verschiedenen Wegen erhalten werden, beispielsweise durch Extraktion aus der Kernfraktion und Reinigung der extrahierten DNA durch bekannte Verfahren.
  • Die Fragmentierung, die zur Erstellung einer repräsentativen Genbank erforderlich ist, der zu klonierenden genomischen DNA auf eine Größe, die zur Insertion in einem Klonierungsvektor geeignet ist, kann entweder durch mechanische Scherkräfte oder sonstiges, vorzugsweise durch Schneiden mit geeigneten Restriktionsenzymen stattfinden.
  • Geeignete Klonierungsvektoren, die sich bereits in einer Routineverwendung zur Herstellung von genomischen Genbanken befinden, sind beispielsweise Cosmidvektoren, Plasmidvektoren oder Phagenvektoren.
  • Es ist dann in einem Screeningprogramm möglich, geeignete Klone zu erhalten, die die erforderlichen Gene oder Genfragmente aus den auf diese Weise hergestellten Genbanken umfassen.
  • Eine Möglichkeit zur Identifizierung der erforderlichen DNA Region besteht beispielsweise durch die Verwendung der oben beschriebenen Genbank zur Transformation von Stämmen, die aufgrund eines blockierten Synthesewegs nicht mehr zur Bildung von Ansamycinen fähig sind, und der Identifizierung der Klone, die nach der Transformation erneut zur Bildung von Ansamycin fähig sind (Revertanden). Die Vektoren, die zu Revertanden führen, umfassen ein DNA Fragment, das für eine Ansamycinsynthese erforderlich ist.
  • Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung der erforderlichen DNA Region basiert beispielsweise auf der Verwendung von geeigneten Sondenmolekülen (DNA Sonde), die beispielsweise wie oben beschrieben erhalten werden. Es sind verschiedene Standardverfahren zur Identifizierung geeigneter Klone erhältlich, wie Differentialkoloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung.
  • Es ist möglich, als Sondenmolekül ein vorher isoliertes DNA Fragment aus demselben oder einem strukturell verwandten Gen oder Gencluster zu verwenden, das aufgrund der vorhandenen Homologien zur Hybridisierung mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt innerhalb des erforderlichen Gens oder Genclusters fähig ist, das identifiziert werden soll. Vorzugsweise wird als Sondenmolekül für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein DNA Fragment verwendet, das aus einem Gen oder einer DNA Sequenz erhältlich ist, die bei der Synthese von Polyketiden beteiligt ist, wie Ansamycinen oder Soraphenen.
  • Falls die Nukleotidsequenz des zu isolierenden Gens oder zumindest Teile dieser Sequenz bekannt sind, ist es in einer alternativen Ausführungsform möglich, aufgrund dieser Sequenzinformation eine entsprechend synthetisierte DNA Sequenz für die Hybridisierungen oder PCR Amplifikationen zu verwenden.
  • Um die Detektierbarkeit des erforderlichen Gens oder Teile des erforderlichen Gens zu erleichtern, kann eine der oben beschriebenen DNA Sondenmoleküle mit einer geeigneten, leicht detektierbaren Gruppe markiert werden. Eine detektierbare Gruppe meint für die Zwecke der Erfindung jedes Material, das bestimmte, leicht detektierbare physikalische oder chemische Eigenschaft aufweist.
  • An dieser Stelle können enzymatisch aktive Gruppen besonders erwähnt werden, wie Enzyme, Enzymsubstrate, Coenzyme und Enzyminhibitoren, ferner fluoreszente und lumineszente Mittel, Chromophore und Radioisotope, wie 3H, 35S, 32P, 125I und 14C. Die leichte Detektierbarkeit dieser Marker basiert andererseits auf ihren intrinsischen physikalischen Eigenschaften (beispielsweise Fluoreszenzmarkern, Chromophoren, Radioisotopen) oder andererseits auf ihren Reaktions- und Bindeeigenschaften (beispielsweise Enzyme, Substrate, Coenzyme, Inhibitoren). Materialien dieser Typen werden breit insbesondere in Immuntests verwendet und können in den meisten Fällen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Allgemeine Methoden, die sich auf die DNA Hybridisierung beziehen, sind beispielsweise von T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982) beschrieben.
  • Die Klone innerhalb der vorher beschriebenen Genbanken, die zur Hybridisierung mit einem Sondenmolekül fähig sind und die durch eine der oben erwähnten Detektionsmethoden identifiziert werden können, können dann weiter analysiert werden, um das Ausmaß und die Art der kodierenden Sequenz im Detail zu bestimmen.
  • Ein alternatives Verfahren zur Identifizierung klonierter Gene basiert auf der Konstruktion einer Genbank, die aus Plasmid- oder Expressionsvektoren besteht. Das heißt in Analogie zu den vorher beschriebenen Verfahren, dass die genomische DNA, die das erforderliche Gen enthält, anfänglich isoliert und dann in einen geeigneten Plasmid- oder Expressionsvektor kloniert wird. Die auf diese Weise hergestellten Genbanken können dann durch geeignete Verfahren gecreent werden, beispielsweise durch die Verwendung von Komplementationsstudien und die Klone, die das erforderliche Gen oder zumindest einen Teil dieses Gens als Insert enthalten, können selektiert werden.
  • Daher ist es mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren möglich, ein Gen, mehrere Gene oder ein Gencluster zu isolieren, das für ein oder mehrere bestimmte Genprodukte kodiert.
  • Für die weitere Charakterisierung werden die DNA Sequenzen auf die oben beschriebene Weise gereinigt und isoliert und einer Restriktionsanalyse und Sequenzanalyse unterzogen.
  • Für die Sequenzanalyse werden die vorher isolierten DNA Fragmente zuerst mittels geeigneter Restriktionsenzyme fragmentiert und dann in geeignete Klonierungsvektoren kloniert. Um Fehler bei der Sequenzierung zu vermeiden, ist es vorteilhaft, beide DNA Stränge vollständig zu sequenzieren.
  • Es sind verschiedene Alternativen zur Analyse des klonierten DNA Fragments in Bezug auf dessen Funktion innerhalb der Ansamycinbiosynthese erhältlich.
  • So ist es beispielsweise möglich in Komplementationsexperimenten mit defekten Mutanten nicht nur die prinzipielle Beteiligung eines Gens oder Genfragments bei der Biosynthese sekundärer Metaboliten zu zeigen, sondern auch spezifisch den Syntheseschritt zu verifizieren, in dem dieses DNA Fragment beteiligt ist.
  • In einem alternativen Analyseverfahren wird die Evidenz auf genau die entgegengesetzte Weise erhalten. Ein Transfer von Plasmiden, die DNA Abschnitte enthalten, welche Homologien mit geeigneten Abschnitten auf dem Genom enthalten, führt zur Integration der homologen DNA Abschnitte über eine homologe Rekombination. Wenn wie im vorliegenden Fall der homologe DNA Abschnitt eine Region innerhalb eines offenen Leserahmens eines Genclusters ist, führt die Plasmidintegration zu einer Inaktivierung des Gens durch eine sogenannte Genzerstörung und daher zu einer Unterbrechung der Produktion des sekundären Metaboliten. Es wird derzeit angenommen, dass eine homologe Region, die zumindest 100 bp, aber vorzugsweise mehr als 1000 bp aufweist, ausreicht, um das erforderliche Rekombinationsereignis herbeizuführen.
  • Jedoch ist eine homologe Region bevorzugt, die sich über einen Bereich von 0,3 bis 4 kb, insbesondere über einen Bereich von 1 bis 3 kb erstreckt.
  • Um geeignete Plasmide herzustellen, die eine ausreichende Homologie für die Integration über homologe Rekombination aufweisen, geht vorzugsweise ein Subklonierungsschritt voraus, worin die vorher isolierte DNA verdaut wird und Fragmente mit geeigneter Größe isoliert und anschließend in ein geeignetes Plasmid kloniert werden. Beispiele für geeignete Plasmide sind die Plasmide, die allgemein für genetische Manipulationen in Streptomyceten oder E. coli verwendet werden.
  • Es ist im Prinzip möglich, zur Herstellung und Vermehrung der vorher beschriebenen Konstrukte alle herkömmlichen Klonierungsvektoren, wie Plasmid- oder Bakteriophagenvektoren zu verwenden, solange sie Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer Spezies stammen, welche mit der Wirtszelle kompatibel ist.
  • Der Klonierungsvektor weist gewöhnlich einen Replikationsursprung plus spezifische Gene auf, die zu phänotypischen Selektionsmerkmalen in der transformierten Wirtszelle führen, insbesondere Resistenzen gegenüber Antibiotika. Die transformierten Vektoren können auf der Grundlage dieser phänotypischen Marker nach einer Transformation in eine Wirtszelle selektiert werden.
  • Selektierbare phänotypische Marker, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise ohne Beschränkung des Gegenstands der Erfindung Resistenzen gegenüber Thiostrepton, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Hygromycin, G418, Kanamycin, Neomycin und Bleomycin. Ein weiterer Selektionsmarker kann beispielsweise eine Prototrophie insbesondere für Aminosäuren sein.
  • Hauptsächlich bevorzugt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Streptomyceten und E. coli Plasmide, beispielsweise die Plasmide, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Wirtszellen, die primär für die vorher beschriebene Klonierung für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, sind Prokaryonten, einschließlich bakterielle Wirte, wie Streptomyceten, Actinomyceten, E. coli oder Pseudomonaden.
  • E. coli Wirte sind besonderes bevorzugt, beispielsweise der E. coli Stamm HB101 oder X-1 Blue MR® (Stratagene) oder Streptomyceten, wie die plasmidfreien Stämme von Streptomyces lividans TK23 und TK24.
  • Kompetente Zellen des E. coli Stamms HB101 werden durch die Verfahren hergestellt, die normalerweise zur Transformation von E. coli verwendet werden. Die Transformationsmethode von Hopwood et al. (Genetic manipulation of streptomyces, A laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich (1985)) wird normalerweise für Streptomyces verwendet.
  • Nach der Transformation und anschließenden Inkubation auf einem geeigneten Medium werden die entstehenden Kolonien einem Differentialscreening durch Plattieren auf Selektivmedien unterzogen. Es ist dann möglich, die geeignete Plasmid DNA aus diesen Kolonien zu isolieren, die Plasmide mit hierin klonierten DNA Fragmenten umfassen.
  • Das erfindungsgemäße DNA Fragment, das eine DNA Region umfasst, die direkt oder indirekt bei der Biosynthese von Ansamycin beteiligt ist und auf die vorher beschriebene Weise aus dem Ansamycinbiosynthesegencluster erhalten werden kann, kann auch als Ausgangsklon zur Identifizierung und Isolierung von anderen benachbarten Regionen verwendet werden, die hiermit aus diesem Gencluster überlappen.
  • Dies kann beispielsweise durch die Ausführung eines so genannten „Chromosomwalking" innerhalb einer Genbank, die aus DNA Fragmenten mit gemeinsam überlappenden DNA Regionen besteht, unter Verwendung des vorher isolierten DNA Fragments oder ähnlichem insbesondere der an den 5' und 3' Enden liegenden Sequenzen ausgeführt werden. Die Verfahren für ein Chromosomwalking sind dem Fachmann bekannt. Details finden sich beispielsweise in den Publikationen von Smith et al. (Methods Enzymol. (1987), 151, 461-489) und Wahl et al (Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1987), 84, 2160-2164).
  • Die Voraussetzung für das Chromosomwalking ist das Vorkommen von Klonen mit kohärenten DNA Fragmenten, die so lange wie möglich sind und gemeinsam innerhalb einer Genbank überlappen und ein geeigneter Ausgangsklon, der ein Fragment umfasst, das in der Nähe liegt oder dergleichen, vorzugsweise in der zu analysierenden Region. Falls die exakte Lage des Ausgangsklons unbekannt ist, wird das Walking vorzugsweise in beide Richtungen ausgeführt.
  • Der eigentliche Walkingschritt beginnt durch die Verwendung des identifizierten und isolierten Ausgangsklons als Sonde in einer der vorher beschriebenen Hybridisierungsreaktionen, um benachbarte Klone zu detektieren, die mit dem Ausgangsklon überlappende Regionen aufweisen. Es ist durch Hybridisierungsanalyse möglich, festzustellen, welches Fragment am weitesten über die überlappende Region hinausgeht. Dies wird dann als Ausgangsklon für den 2. Walkingschritt verwendet, wobei ein Fragment etabliert wird, das mit dem 2. Klon in dieselbe Richtung überlappt. Ein kontinuierliches Fortfahren auf diese Weise auf dem Chromosom führt zu einer Sammlung aus überlappenden DNA Klonen, die eine große DNA Region abdecken. Diese kann dann, wo dies geeignet ist, nach einem oder mehreren Subklonierungsschritten durch bekannte Verfahren unter Bildung eines Fragments zusammenligiert werden, das Teile oder dergleichen umfasst, vorzugsweise alle Bestandteile, die für eine Ansamycinbiosynthese essentiell sind.
  • Die Hybridisierungsreaktion zur Etablierung von Klonen mit marginal überlappenden Regionen verwendet vorzugsweise nicht das sehr große und fast vollständige Fragment, sondern an dessen Stelle ein partielles Fragment aus der linken oder rechten Randregion, die in einem Subklonierungsschritt erhalten werden kann. Aufgrund der geringeren Größe des partiellen Fragments führt die Hybridisierungsreaktion zu weniger positiven Hybridisierungssignalen, so dass der analytische Aufwand deutlich geringer ist, wie wenn man das gesamte Fragment verwendet. Es ist ferner ratsam, das partielle Fragment im Detail zu analysieren, um auszuschließen, dass es größere Mengen an repetitiven Sequenzen umfasst, die über das gesamte Genom verteilt sein können und dies so eine gezielte Abfolge von Walkingschritten stark überschreiten würde.
  • Da das Gencluster, das für die Ansamycinbiosynthese verantwortlich ist, eine relativ große Region des Genoms umfasst, kann es auch vorteilhaft sein, ein sogenanntes Largestep-Walking oder Cosmidwalking auszuführen. Es ist in diesen Fällen unter Verwendung von Cosmidvektoren, die die Klonieung von sehr großen DNA Fragmenten erlauben, möglich, eine sehr große DNA Region abzudecken, die in einem einzigen Walkingschritt bis zu 42 kb umfassen kann.
  • In einer möglichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise zur Konstruktion einer Cosmidgenbank von Streptomycetes oder Actinomycetes die gesamte DNA isoliert, wobei die Größe der DNA Fragmente im Bereich von etwa 100 kb liegt, und anschließend partiell mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut.
  • Die verdaute DNA wird dann auf herkömmliche Weise extrahiert, um die Endonuklease zu entfernen, die immer noch vorhanden ist und gefällt und schließlich konzentriert. Das entstehende Fragmentkonzentrat wird dann gemäß der Größe der einzelnen Fragmente fraktioniert, beispielsweise durch Dichtegradientenzentrifugation. Nachdem die auf diese Weise erhaltenen Fragmente dialysiert wurden, können sie auf einem Agarosegel analysiert werden. Die Fraktionen, welche Fragmente einer geeigneten Größe enthalten, werden gepoolt und für eine weitere Verarbeitung konzentriert. Die Fragmente, die als teilweise für die Zwecke der Erfindung geeignet betrachtet werden können, haben eine Größe von 30 kb bis 42 kb, aber vorzugsweise 35 kb bis 40 kb.
  • Parallel zur oben beschriebenen Fragmentierung oder später wird beispielsweise ein geeigneter Cosmidvektor pWE15® (Stratagene) vollständig mit einem geeigneten Restriktionsenzym, beispielsweise BamHI, für die anschließende Ligasereaktion verdaut.
  • Die Ligation der Cosmid DNA an die Streptomyces oder Actinomycetes Fragmente, die gemäß ihrer Größe fraktioniert wurden, kann mittels einer T4 DNA Ligase ausgeführt werden. Das auf diese Weise erhältliche Ligationsgemisch wird nach einer ausreichenden Inkubationszeit durch allgemein bekannte Verfahren in λ Phagen gepackt.
  • Die entstehenden Phagenpartikel werden dann zur Infektion eines geeigneten Wirtsstamms verwendet. Ein recA– E. coli Stamm ist bevorzugt, wie E. coli/HB 101 oder X-1 Blue® (Stratagene). Die Selektion von transfizierten Klonen und die Isolierung der Plasmid DNA kann durch allgemein bekannte Verfahren ausgeführt werden.
  • Das Screenen der Genbank auf DNA Fragmente, die bei der Ansamycinbiosynthese beteiligt sind, wird beispielsweise mittels einer spezifischen Hybridisierungssonde ausgeführt, von der angenommen wird (beispielsweise auf der Grundlage der DNA Sequenz oder DNA Homologie oder Komplementationstests oder Genzerstörung oder der Funktion hiervon in anderen Organismen), dass sie DNA Regionen aus dem Ansamycingencluster umfasst.
  • Ein Plasmid, das ein zusätzliches Fragment der erforderlichen Größe aufweist oder auf der Grundlage von Hybridisierungen identifiziert wurde, kann dann aus dem Gel auf die vorher beschriebene Weise isoliert werden. Die Identität dieses zusätzlichen Fragments mit dem erforderlichen Fragment auf dem vorher selektierten Cosmid kann dann durch Southerntransfer und Hybridisierung bestätigt werden.
  • Die Funktionsanalyse der auf diese Weise isolierten DNA Fragmente kann in einem Genzerstö rungsexperiment ausgeführt werden, wie dies oben beschrieben ist.
  • Eine andere mögliche Verwendung der erfindungsgemäßen DNA Fragmente ist, Enzyme oder Domänen, die bei der Ansamycin- und insbesondere Rifamycinbiosynthese beteiligt sind, zu modifizieren oder zu inaktivieren, um Oligonukleotide zu synthetisieren, die dann wiederum zur Auffindung von homologen Sequenzen bei der PCR Amplifizierung verwendet werden können.
  • Neben den erfindungsgemäßen DNA Fragmenten als solche, wird auch ihre Verwendung vor allem zur Herstellung von Rifamycin, Rifamycinanaloga oder Vorläufern hiervon und zur biosynthetischen Produktion von neuen Ansamycinen oder Vorläufern hiervon beansprucht. In diesem Zusammenhang enthalten sind jene Moleküle, bei denen die aliphatische Brücke nur an einem Ende des aromatischen Nukleus gebunden ist.
  • Die erfindungsgemäßen DNA Fragmente erlauben beispielsweise durch die Kombination von DNA Fragmenten aus anderen Biosynthesewegen oder durch Inaktivierung oder Modifikation hiervon die Biosynthese von neuen Hybridverbindungen, insbesondere von neuen Ansamycin- oder Rifamycinanaloga. Die Schritte, die hierfür erforderlich sind, sind im allgemeinen bekannt und beispielsweise beschrieben in Hopwod, Current Opinion in Biotechnol. (1993), 4, 531-537.
  • Die Erfindung betriff ferner die Verwendung der DNA Fragmente der Erfindung zur Ausführung der neuen Technologie der kombinatorischen Biosynthese zur biosynthetischen Herstellung von Banken aus Polyketidsynthasen auf der Grundlage der Rifamycin- und Ansamycinbiosynthesegene. Falls beispielsweise mehrere Sätze an Modifikationen hergestellt werden, ist es auf diese Weise auch möglich durch Biosynthesen eine Bank aus Polyketiden, beispielsweise Ansamycin- oder Rifamycinanaloga herzustellen, die dann nur auf die Aktivität der auf diese Weise hergestellten Verbindungen getestet werden muss. Die hierfür erforderlichen Schritte sind im allgemeinen bekannt und beispielsweise in Tsoi und Khosla, Chemistry & Biology (1995), 2, 355-362 und WO 95 08 548 A beschrieben.
  • Neben dem DNA Fragment als solches wird auch dessen Verwendung zur genetischen Konstruktion von mutierten Actinomycetenstämmen beansprucht, aus denen die natürlichen Rifamycin- oder Ansamycinbiosynthesegencluster im Chromosom teilweise oder vollständig deletiert wurden und die so zur Expression von genetisch modifizierten Ansamycin- oder Rifamycinbiosynthesegenclustern verwendet werden können.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen Hybridvektor, der zumindest ein erfindungsgemäßes DNA Fragment umfasst, beispielsweise einen Promotor, eine Repressor- oder Aktivatorbindungsstelle, ein Repressor- oder Aktivatorgen, ein Strukturgen, einen Terminator oder einen funktionellen Teil hiervon.
  • Der Hybridvektor umfasst beispielsweise eine Expressionskassette, die ein erfindungsgemäßes DNA Fragment umfasst, das zur Expression von einem oder mehreren Proteinen fähig ist, die bei der Ansamycinbiosynthese beteiligt sind, insbesondere in der Rifamycinbiosynthese oder ein funktionelles Fragment hiervon. Die Erfindung betrifft in ähnlicher Weise einen Wirtsorganismus, der den oben beschriebenen Hybridvektor umfasst.
  • Geeignete Vektoren, die den Ausgangspunkt der erfindungsgemäßen Hybridvektoren darstellen, und geeignete Wirtsorganismen, wie Bakterien oder Hefezellen, sind allgemein bekannt.
  • Der Wirtsorganismus kann durch im allgemeinen herkömmliche Verfahren transformiert werden, wie durch Protoplasten, Ca2+, Cs+, Polyethylenglycol, Elektroporation, Viren, Lipidvesikel oder einer Partikelkanone. Die erfindungsgemäßen DNA Fragmente können dann sowohl als extrachromosomale Bestandteile im Wirtsorganismus vorkommen als auch über geeignete Sequenzabschnitte in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert werden.
  • Die Erfindung betrifft auch Polyketidsynthasen, die die erfindungsgemäßen DNA Fragmente umfassen, insbesondere die von Amycolatopsis mediterranei, die direkt oder indirekt bei der Rifamycinsynthese beteiligt sind, und funktionelle Bestandteile hiervon, beispielsweise enzymatisch aktive Domänen.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Hybridisierungssonde, die ein erfindungsgemäßes DNA Fragment umfasst und die Verwendung hiervon, insbesondere zur Identifizierung von DNA Fragmenten, die bei der Biosynthese von Ansamycinen beteiligt sind.
  • Um unzweifelhafte Signale bei der Hybridisierung zu erhalten, wird die DNA an das Filter (beispielsweise hergestellt aus Nylon oder Nitrocellulose) gebundene DNA bei 55-65°C in 0,2 × SSC (1 × SSC = 0,15 M Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat) gewaschen.
  • Beispiele
  • Allgemein
  • Allgemeine molekulargenetische Techniken, wie DNA Isolierung und Reinigung, Restriktionsverdau von DNA, Agarosegelelektrophorese von DNA Ligation von Restriktionsfragmenten, Kultivierung und Transformation von E. coli und Plasmidisolierung aus E. coli werden ausgeführt, wie dies in Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982) beschrieben ist.
  • Die Kulturbedingungen und molekulargenetischen Techniken mit A. mediterranei und anderen Actinomyceten werden ausgeführt, wie dies von Hopwood et al. beschrieben ist (Genetic manipulation of streptomycetes a laboratory manual, The John Innen Foundation, Norwich, 1985). Alle flüssigen Kulturen von A. mediterranei und anderen Actinomyceten werden in Erlenmeyerkolben bei 28°C in einem Schüttler bei 250 Upm ausgeführt.
  • Verwendete Medien:
    • LB: Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982)
    • NL: Schupp + Divers FEMS Microbiology Lett. 36, 159-162 (1986) (NL 148 = NL148G ohne Glycin)
    • R2YE: Hopwood et al. (Genetic manipulation of streptomyces a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, 1985).
    • TB: 12 g/l Bacto Trypton 24 g/l Bacto Hefeextrakt 4 ml/l Glycerin
  • Beispiel 1: Detektion von chromosomalen DNA Fragmenten von A. mediterranei mit einer Homologie zu Polyketidsynthasegenen anderer Bakterien
  • Um eine genomische DNA als A. mediterranei zu erhalten, werden Zellen des Stamms A. mediterranei WT3136 (=LBGA 3136, ETH Stammsammlung) in NL 148 Medium für 48 Stunden kultiviert. 1 ml dieser Kultur wird dann in 50 ml NL 148 Medium (+2,5 g/l Glycin) in einem 200 ml Erlenmeyerkolben überführt und die Kultur wird für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen werden aus dem Medium durch Zentrifugation bei 3000 × g für 10 Minuten entfernt und in 5 ml SET (75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5) resuspendiert. Es wird eine hochmolekulare DNA durch das Verfahren von Pospiech und Neumann (Trends in Genetics (1995), 11, 217-218) extrahiert.
  • Um einzelne Fragmente aus der isolierten A. mediterranei DNA, die eine Homologie mit Polyketidsynthasegenen aufweisen, mittels Southern Blot zu detektieren, wird eine radioaktive DNA Sonde aus einem bekannten Polyketidsynthasegencluster hergestellt. Um dies auszuführen, wird das PvuI Fragment mit einer Größe von 3,8 kb aus dem rekombinanten Plasmid p98/1 (Schupp et al., J. of Bacteriol. (1995), 177, 3673-3679) isoliert, das eine DNA Region mit einer Größe von etwa 32 kb aus der Polyketidsynthase für das Antibiotikum Soraphen A umfasst. Es werden etwa 0,5 μg des isolierten 3,8 kb PvuI DNA Fragments mit 32P-dCTP durch das Nicktranslationssystem von Gibco/BRL (Basel) gemäß den Anleitungen des Herstellers radioaktiv markiert.
  • Für den Southern Blot werden etwa 2 μg der genomischen DNA, die oben aus A. mediterranei isoliert wurde, vollständig mit dem Restriktionsenzym BglII (Boehringer Mannheim) verdaut und die entstehenden Fragmente werden auf einem 0,8 % Agarosegel fraktioniert. Ein Southern Blot mit diesem Agarosegel und der oben isolierten DNA Sonde (3,8 kb PvuI Fragment) detektiert ein BglII geschnittenes DNA Fragment mit einer Größe von etwa 13 kb aus der genomischen DNA von A. mediterranei, das eine Homologie mit der verwendeten DNA Sonde aufweist. Es kann auf der Grundlage dieser Homologie geschlossen werden, dass das detektierte DNA Fragment aus A. mediterranei eine genetische Region ist, die für eine Polyketidsynthase kodiert und so bei der Synthese eines Polyketidantibiotikums beteiligt ist.
  • Beispiel 2: Herstellung einer spezifischen rekombinanten Plasmidsammlung, die BglII verdaute chromosomale Fragmente von A. mediterranei mit einer Größe von 12-16 kb umfasst
  • Der E. coli Positivselektionsvektor pIJ4642 (Derivat von pIJ666, Kieser & Melton, Gene (1988), 65, 83-91), der am John Innes Centre (Norwich, UK) entwickelt wurde, wird zur Herstellung einer Plasmidgenbank verwendet. Dieses Plasmid wird zuerst mit BamHI geschnitten und die zwei entstehenden Fragmente werden auf einem Agarosegel fraktioniert. Das kleinere der zwei Fragmente ist das Füllfragment des Vektors und das größere ist der Vektorteil, der bei einer Selbstligation nach der Deletion des Füllfragments aufgrund der flankierenden Terminationssequenzen ein perfektes Palindrom bildet, was bedeutet, dass das Plasmid als solches nicht in E. coli gehalten werden kann. Der Vektorteil mit einer Größe von 3,8 kb wird aus dem Agarosegel durch Elektroelution isoliert, wie dies auf Seite 164-165 von Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982) beschrieben ist.
  • Um die mit BglII geschnittenen DNA Fragmente von A. mediterranei herzustellen, wird die hochmolekulare, genomische DNA verwendet, die in Beispiel 1 hergestellt wurde. Etwa 10 μg dieser DNA werden vollständig mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut und anschließend auf einem 0,8 % Agarosegel fraktioniert. Die DNA Fragmente mit ein er Größe von etwa 12-16 kb werden aus dem Gel ausgeschnitten und aus dem Gelblock durch Elektroelution entfernt (siehe oben). Etwa 1 μg der auf diese Weise isolierten BglII Fragmente wird an etwa 0,1 μg des oben isolierten BamHI Teils des Vektors pIJ4642 ligiert. Das auf diese Weise erhaltene Ligationsgemisch wird dann in den E. coli Stamm HB 101 (Stratagene) transformiert. Es werden etwa 150 transformierte Kolonien aus dem Transformationsgemisch auf LB Agar mit 30 μg pro ml Chloramphenicol selektiert. Diese Kolonien enthalten rekombinante Plasmide mit BglII-geschnittenen genomischen DNA Fragmenten von A. mediterranei im Größenbereich von 12 bis 16 kb.
  • Beispiel 3: Klonierung und Charakterisierung der chromosomalen A. mediterranei DNA Fragmente mit einer Homologie zu bakteriellen Polyketidsynthasegenen
  • 150 der Plasmidklone, die in Beispiel 2 hergestellt wurden, werden durch Koloniehybridisierung mittels eines Nitrocellulosefilters (Schleicher & Schuell) analysiert, wie dies auf den Seiten 318-319 von Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1. Ausgabe, Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982) beschrieben ist. Die verwendete DNA Sonde ist das 3,8 kb PvuI Fragment von Plasmid p98/1, das mit 32P-dCTP radioaktiv markiert ist und in Beispiel 1 isoliert wurde. Die Plasmide werden aus 5 Plasmidklonen isoliert, die ein Hybrisierungssignal zeigen und werden durch zwei Restriktionsverdaus mit den Enzymen HindIII oder KpnI charakterisiert. HindIII schneidet zweimal im Vektorteil der Klone, 0,3 kb rechts und links der BamHI Spaltstelle, in die die A. mediterranei DNA integriert wurde. KpnI schneidet nicht im pIJ4642 Vektorteil. Diese Restriktionsanalyse zeigt, dass die untersuchten Klone sowohl identische HindIII Fragmente mit etwa 14 und 3,1 kb und identische KpnI Fragmente mit einer Größe von etwa 11,4 kb und 5,7 kb aufweisen. Dies zeigt, dass diese Klone dasselbe genomische BgIII Fragment von A. mediterranei umfassen und dass das letzte eine Größe von etwa 13 kb aufweist. Es kann zusätzlich aus dieser Restriktionsanalyse geschlossen werden, dass das klonierte BglII Fragment keine interne HindIII Schnittstelle aufweist, sondern 2 KpnI Schnittstellen aufweist, die ein internes KpnI Fragment mit einer Größe von 5,7 kb ergeben.
  • Die Plasmid DNA der obigen 5 Klone mit identischen Restriktionsfragmenten wird ferner durch einen Southern Blot charakterisiert. Für diesen Zweck werden die Plasmide mit HindIII und KpnI geschnitten und die verwendete DNA Sonde ist das mit 32P radioaktiv markierte 3,8 kb PvuI Fragment von Plasmid p98/1, das oben verwendet wird. Dieses Experiment bestätigt, dass die 5 Plasmide identische A. mediterranei DNA Fragmente enthalten und dass diese eine signifikante Homologie mit der DNA Sonde aufweisen, die für bakterielle Polyketidsynthasegene charakteristisch ist. Zusätzlich zeigt der Southern Blot, dass das interne KpnI Fragment mit einer Größe von 5,7 kb auch eine signifikante Homologie mit der verwendeten DNA Sonde aufweist. Das pRi7-3 genannte Plasmid wird aus den 5 Plasmiden zur weiteren Prozessierung ausgewählt.
  • Um zu demonstrieren, dass das klonierte BglII Fragment mit einer Größe von etwa 13 kb von A. mediterranei ein ursprüngliches chromosomales DNA Fragment ist, wird ein weiterer Southern Blot aus geführt. Chromosomale DNA aus A. mediterranei, die mit BglII, KpnI oder BamHI geschnitten wurde, wird in diesem Blot verwendet. Es werden zwei BamHI Fragmente, die etwa 1,8 und 1,9 kb groß sind und im 5,7 kb KpnI Fragment von pRi7-3 vorkommen, als radioaktiv markierte Sonde verwendet. Dieses Experiment bestätigt, dass das BglII DNA Fragment mit einer Größe von etwa 13 kb, das in das rekombinante Plasmid pRi7-3 kloniert wurde, ein authentisches genomisches DNA Fragment von A. mediterranei ist. Zusätzlich bestätigt dieses Experiment, dass das klonierte Fragment ein internes KpnI Fragment mit einer Größe von 5,7 kb und zwei BamHI Fragment mit einer Größe von 1,8 und 1,9 kb umfasst und dass diese DNA Fragmente ebenfalls authentische genomische DNA Fragmente von A. mediterranei sind.
  • Beispiel 4: Demonstration einer signifikanten Homologie mit dem klonierten genomischen 13 kb BglII Fragment von A. mediterranei mit chromosomaler DNA von anderen Actinomyceten, die Ansamycine bilden
  • Es findet eine Demonstration einer signifikanten Homologie zwischen der klonierten chromosomalen DNA Region von A. mediterranei und der chromosomalen DNA von anderen Ansamycin-bildenden Actinomyceten durch ein Southern Blot Experiment statt. Es werden die folgenden Ansamycin-bildenden Stämme für diesen Zweck verwendet (die durch diese Stämme gebildeten Ansamycine sind in Klammern angegeben): Streptomyces spectabilis (Streptovaricine), Streptomyces tolypophorus (Tolypomycine), Streptomyces hygroscopicus (Geldanamycine), Nocardia species ATCC 31281 (Ansamitocine). Die genomische DNA aus diesen Stämmen wird wie in Beispiel 1 für A. mediterranei beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut und die auf diese Weise erhaltenen Restriktionsfragmente werden auf einem Agarosegel für den Southern Blot fraktioniert. Zwei BamHI Fragmente mit einer Größe von etwa 1,8 und 1,9 kb von A. mediterranei, die in Beispiel 3 verwendet und aus dem Plasmid pRi7-3 isoliert wurden, werden als radioaktive Sonde verwendet. Dieses Experiment zeigt, dass diese Ansamycinbildenden Stämme eine signifikante DNA Homologie mit der verwendeten DNA Sonde und somit mit der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei aufweisen. Es wird in diesem Zusammenhang beobachtet, dass die Homologie im Fall von Ansamycinbildnern mit einem Naphthochinoidringsystem (Streptovaricin, Tolypomycin) größer ist als bei denen mit einem Benzochinoidringsystem (Geldanamycin, Ansamitocin). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die klonierte chromosomale DNA Region von A. mediterranei für Ansamycinbiosynthesecluster und speziell von Genclustern von Ansamycinen mit Naphthochinoidringsystemen typisch ist, die den Ringsystemen der Rifamycine entsprechen.
  • Beispiel 5: DNA Sequenzbestimmung des KpnI Fragments mit einer Größe von 5,7 kb, das innerhalb des klonierten 13 kb BglII Fragments liegt
  • Zur Sequenzierung wird das 5,7 kb KpnI Fragment aus dem Plasmid pRi7-3 (DSM 11114) (Maniatis et al. 1992) isoliert und in die KpnI Schnittstelle des Vektors pBRKanf4 subkloniert, der für die DNA Sequenzierung geeignet ist, was die Plasmide pTS004 und pTS005 ergibt. Der Vektor pBRKanf4 (abgeleitet von pBRKanf1, Bhat, Gene (1993) 134, 83-87) ist zur Erführung von sequenziellen Deletionen von Sau3A Fragmenten im klonierten Insertfragment geeignet, da dieser Vektor selbst keine GATC Nukleotidsequenz aufweist. Zusätzlich werden die BamHI Fragmente mit einer Größe von 1,9 und 1,8 kb, die im 5,7 kb KpnI Fragment vorkommen, in die BamHI Schnittstelle von pBRKanf4 subkloniert, was jeweils zu den Plasmiden pTS006 und pTS007 und pTS008 und pTS009 führt.
  • Um Subklone herzustellen, die sequenziell durch Sau3A Fragmente für die DNA Sequenzierung verkürzt sind, werden die Plasmide pTS004 bis pTS009 partiell mit Sau3A verdaut und vollständig mit XbaI oder HindIII (einer Schnittstelle in der Mehrfachklonierungsregion des Vektors) verdaut. Die auf diese Weise erhaltene DNA (besteht aus dem linearisierten Vektor mit inserierten DNA Fragmenten, die um Sau3A Fragmente verkürzt sind) wird an den Enden mittels Klenowpolymerase (Fragment der Polymerase I, siehe Maniatis et al., Seiten 113-114) aufgefüllt, mit T4 DNA Ligase selbstligiert und in E. coli DH5a transformiert. Die Plasmid DNA, die den Plasmiden pTS004 bis pTS009 entspricht, aber DNA Regionen enthält, die von einer Seite um Sau3A Fragmente verkürzt sind und aus den ursprünglich integrierten Fragmenten von A. mediterranei abgeleitet sind, wird aus den auf diese Weise erhaltenen einzeln transformierten Klonen isoliert.
  • Die DNA Sequenzierung wird mit den auf diese Weise erhaltenen Plasmiden und mit pTS004 bis pTS009 mittels des Reaktionskits von Perkin-Elmer/Applied Biosystems mit Farbstoff-markierten Terminatorreagenzien (Kit Nr. 402122) und einem Universalprimer oder einem T7 Primer ausgeführt. Ein Standardzyklussequenzierprotokoll mit einem Thermocycler (MJ Research DNA Engine Thermocycler, Modell 225) wird verwendet und die Sequenzierungsreaktionen werden durch das automatische DNA Sequenziergerät von Applied Biosystems (Modell 373 oder 377) gemäß den Anleitungen des Herstellers analysiert. Um diese Ergebnisse zu analysieren werden die folgenden Computerprogramme (Software) verwendet: Applied Biosystems DNA Analysesoftware, Unix Solaris CDE Software, DNA Zusammensetzungs- und Analysepaket GAP, das von R. Staden (Nucleic Acid Research (1995) 23, 1406-1410) und Blast (NCBI) lizensiert ist.
  • Die oben beschriebenen Verfahren können zur vollständigen Sequenzierung beider DNA Stränge des 5,7 kb KpnI Fragments von A. mediterranei Stamm Wt3136 verwendet werden. Die DNA Sequenz des 5,7 kb Fragments mit einer Länge von 5676 Basenpaaren ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
  • Beispiel 6: Analyse der Protein-kodierenden Regionen (Gene) auf dem 5,7 kb KpnI Fragment von A. mediterranei
  • Die Nukleotidsequenz des 5,7 kb KpnI Fragments wird mittels des Codonpreference Computerprogramms (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994) analysiert. Diese Analyse zeigt, dass dieses Fragment über die gesamte Länge eine Protein-kodierende Region aufweist und so einen größeren Teil des offenen Leserahmens (ORF) bildet. Die verwendeten Codons in diesem ORF sind für Gene von Streptomycetes und Actinomycetes typisch. Die Aminosäuresequenz, die von der DNA Sequenz dieses ORF abgeleitet ist, ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
  • Die Polyketidsynthasen für Makrolidantibiotika (wie Erythromycin, Rapamycin) sind sehr große multifunktionelle Proteine, die mehrere enzymatisch aktive Domänen aufweisen, die jetzt gut charakterisiert sind (Hopwood und Khosala, Ciba Foundation Symposium (1992), 171, 88-112, Donadio und Katz, Gene (1992), 111, 51-60, Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92 (17), 7839-7843). Der Vergleich der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz mit der sehr gut charakterisierten Erythromycinpolyketidsynthase eryA ORF1 (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, DNA Sequenz Gen/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 2-325 ist zu 40 % identisch zu der Acyltransferasedomäne von Modul 2 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 325-470 ist zu 43 % identisch zu der Dehydratasedomäne von Modul 4 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 762-940 ist zu 48 % identisch zu der Ketoreduktasedomäne von Modul 2 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 1024-1109 ist zu 57 % identisch zu der Acyicarrierproteindomäne von Modul 2 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 1126-1584 ist zu 59 % identisch zu der Ketoacylsynthasedomäne von Modul 2 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
  • Die sehr großen Ähnlichkeiten, die in der Aminosäuresequenz und der Größe und Zusammensetzungen der enzymatischen Domänen gefunden werden, legen nahe, dass die klonierte KpnI Region mit einer Größe von 5,7 kb von A. mediterranei für einen Teil einer Polyketidsynthase kodiert, die für Polyketide des Makrolidtyps typisch ist.
  • Beispiel 7: Konstruktion der Cosmidgenbank von A. mediterranei
  • Der verwendete Cosmidvektor ist das Plasmid pWE15, das gekauft werden kann (Stratagene, La Jolla, CA, USA). pWE15 wird vollständig mit dem Enzym BamHI geschnitten (Maniatis et al., 1989) und mit Ethanol gefällt. Zur Ligation an die Cosmid DNA wird die chromosomale DNA aus A. mediterranei wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3A (Boehringer Mannheim) unter Bildung von DNA Fragmenten verdaut, von denen die meisten eine Größe von 20 bis 40 kb aufweisen. Die auf diese Weise vorbehandelte DNA wird nach Fragmentgröße durch Zentrifugation (83 000 × g, 20°C) auf einem 10 % bis 40 % Saccharosedichtegradienten für 18 Stunden fraktioniert. Der Gradient wird in 0,5 ml Aliquots fraktioniert und dialysiert und Proben mit 10 μl werden auf einem 0,3 % Agarosegel mit einem DNA Größenstandard analysiert. Fraktionen mit einer chromosomalen DNA mit einer Größe von 25-40 kb werden vereinigt, mit Ethanol gefällt und in einem kleinen Volumen Wasser resuspendiert.
  • Die Ligation der Cosmid DNA an die A. mediterranei Sau3A Fragmente, die gemäß ihrer Größe (siehe oben) isoliert wurden, findet mit Hilfe einer T4 DNA Ligase statt. Etwa 3 μg jeder der zwei DNA Ausgangsmaterialien werden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl verwendet und die Ligation wird bei 12°C für 15 Stunden ausgeführt. 4 ml dieses Ligationsgemisches werden in Lambdaphagen mittels des in vitro Verpackungskits verpackt (gemäß den Angaben des Herstellers), der von Stratagene (La Jolla, CA, USA) bezogen wird. Die entstehenden Phagen werden durch Infektion in den E. coli Stamm X-1 BlueMR® (Stratagene) eingeführt. Die Titration dieses Phagenmaterials ergibt etwa 20 000 Phagenpartikel pro ml, wobei eine Analyse von 12 Cosmidklonen zeigt, dass alle Klone Plasmid DNA Insertionen mit einer Größe von 25 bis 40 kb enthalten.
  • Beispiel 8: Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung der chromosomalen A. mediterranei DNA Region, die benachbart zum klonierten 5,7 kb KpnI Fragment liegt
  • Um die chromosomale A. mediterranei DNA Region zu identifizieren und zu klonieren, die benachbart zum oben in den Beispielen 3 und 5 beschriebenen 5,7 kb KpnI Fragment liegt, wird zuerst eine radioaktive DNA Sonde aus diesem 5,7 kb KpnI Fragment hergestellt. Dies wird durch radioaktive Markierung von etwa 0,5 μg des isolierten DNA Fragments mit 32P-dCTP durch das Nicktranslationssystem von Gibco/BRL (Basel) gemäß den Anleitungen des Herstellers ausgeführt.
  • Die Infektion von E. coli X-1 Blue MR (Stratagene) mit einem Aliquot der in vitro verpackten Lambdaphagen (siehe Beispiel 7) führt zu mehr als 2000 Klonen auf mehreren LB + Ampicillin (50 μg/ml) Platten. Diese Klone werden durch Koloniehybridisierung auf Nitrocellulosefilter (siehe Beispiel 3 bezüglich des Verfahrens) getestet. Die verwendete DNA Sonde ist das 5,7 kb KpnI DNA Fragment von A. mediterranei, die mit 32P-dCTP radioaktiv markiert ist und oben hergestellt wurde.
  • Es werden 5 Cosmidklone gefunden, die signifikantes Signal mit der DNA Sonde zeigen. Die Plasmid DNA dieser Cosmide wird isoliert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), mit KpnI verdaut und auf einem Agarosegel analysiert. Eine Analyse zeigt, dass alle 5 Plasmide eine integrierte chromosomale A. mediterranei DNA mit einer Größe in der Größenordnung von etwa 25-35 kb aufweisen und alle das 5,7 kb KpnI Fragment enthalten.
  • Um die chromosomale A. mediterranei DNA Region zu charakterisieren, die benachbart zum klonierten KpnI Fragment liegt, wird die Plasmid DNA eines der 5 Cosmidklone einer Restriktionsanalyse unterzogen. Das ausgewählte Plasmid des Cosmidklons hat die Nummer pNE112 und umfasst ebenfalls das 13 kb BglII Fragment, das in Beispiel 3 beschrieben wurde.
  • Der Verdau des Plasmids pNE112 mit den Restriktionsenzymen BamHI, BglII, HindIII (einzeln und in Kombination) erlaubt die Erstellung einer Restriktionskarte der klonierten Region von A. mediterranei und dies erlaubt die Charakterisierung dieser etwa 26 kb großen Region im Chromosom von A. mediterranei. Diese Region wird durch die folgenden Restriktionsschnittstellen mit dem angegebenen Abstand in kb von einem Ende charakterisiert: BamHI in Position 3,2 kb, HindIII in Position 6,6 kb, BglII in Position 11,5 kb, BamHI in Position 16,6 kb, BamHI in Position 17,3 kb, BamHI in Position 21 kb und BglII in Position 24 kb.
  • Beispiel 9: Bestimmung der Sequenz der chromosomalen A. mediterranei DNA Region, die im Plasmid pNE112 vorkommt und mit dem klonierten 5,7 kb KpnI Fragment überlappt
  • Die Plasmid pNE112 DNA wird in die Fragmente mittels eines Aero-Mist Verneblers (CIS-US Inc., Bedford, MA, USA) unter einem Stickstoffdruck von 8-12 Pfund pro Quadratinch gespalten. Diese zufälligen DNA Fragmente werden mit T4 DNA Polymerase, T4 DNA Kinase und E. coli DNA Polymerase in Gegenwart der 4 dNTPs behandelt, um stumpfe Enden an den doppelsträngigen DNA Fragmenten zu erzeugen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Sping Harbor, NY, 1989). Die Fragmente werden dann in 0,8 % bei niedrigen Temperaturen schmelzender Agarose (FMC Sea Plaque Agarose, Katalognummer 50113) fraktioniert und es werden Fragmente mit einer Größe von 1,5-2 kb durch heiße Phenolextraktion extrahiert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die auf diese Weise erhaltenen DNA Fragmente werden dann mit Hilfe der T4 DNA Ligase an den Plasmidvektor pBRKanf4 (siehe Beispiel 5) oder pBlueScript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ligiert, der jeweils mit stumpfen Enden durch einen geeigneten Restriktionsverdau geschnitten wird (Smal für pBRKanf4 und EcoRV für pBlueScript KS+) und an den Enden durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert (Boehrunger Mannheim). Das Ligationsgemisch wird dann in E. coli DH5a transformiert und die Zellen werden über Nacht auf LB Agar mit dem geeigneten Antibiotikum (Kanamycin 40 μg/ml für pBRKanf4, Ampicillin 100 μg/ml für pBlueScript KS+) inkubiert. Die gewachsenen Kolonien werden einzeln in 1,25 ml flüssiges TB Medium mit Antibiotikum in Platten mit 96 Vertiefungen und Vertiefungen mit einem Volumen von 2 ml überführt und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Matrizen DNA für die Sequenzierung wird direkt aus diesen Kulturen durch alkalische Lyse (Birnboim, Methods in Enzymology (1983) 100, 243-255) hergestellt. Die DNA Sequenzierung findet mittels des Perkin Elmer/Applied Biosystems Reaktionskits mit Farbstoff-markierten Terminatorreagenzien (Kit Nr. 402122) und Universalprimern M13 mp 18/19 oder T3, T7 Primern oder mit Primern statt, die hergestellt wurden, um an interne Sequenzen zu binden. Ein Standardzyklusprotokoll mit 20 Zyklen wird mittels eines Thermocyclers (MJ Research DNA Engine Thermocycler, Modell 225) verwendet. Die Sequenzierungsreaktionen werden mit Ethanol gefällt, in Formamidauftragspuffer resuspendiert und fraktioniert und analysiert durch eine Elektrophorese unter Verwendung des automatischen Applied Biosystems DNA Sequenziergeräts (Modell 377) gemäß den Anleitungen des Herstellers. Es werden Sequenzdateien mit Hilfe des Applied Biosystems DNA Analyse Software Computerprogramms erstellt und auf einen SUN UltraSpark Computer zur weiteren Analyse überführt. Die folgenden Computerprogramme (Software) werden zur Analyse der Ergebnisse verwendet: DNA Zusammensetzungs- und Analysepaket GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, R. Staden, Cambridge University, UK) und die vier Programme: Phred, Cross-Matched, Phrad und Consed (P. Green, University of Washington, B. Ewing und D. Gordon, Washington University in Saint Louis). Nachdem die ursprünglichen Sequenzen miteinander unter Bildung von längeren kohärenten Sequenzen verbunden wurden (Contigs), werden die fehlenden DNA Abschnitte spezifisch mit Hilfe von neuen Primern (Bindung an die sequenzierten Abschnitte) oder durch längeres Sequenzieren oder Sequenzieren des anderen Strangs sequenziert.
  • Es ist möglich mit dem oben beschriebenen Verfahren die gesamte chromosomale DNA Region mit einer Größe von 26 kb aus A. mediterranei zu sequenzieren, die in pNE112 kloniert ist. Die DNA Sequenz ist in SEQ ID Nr. 3 im Basenpaarabschnitt 27801-53789 gezeigt. Die DNA Sequenz des in Beispiel 5 beschriebenen 5,7 kb KpnI Fragments kommt in pNE112 vor und ist in SEQ ID Nr. 3 in der Basenpaarregion 43093 bis 48768 gezeigt.
  • Beispiel 10: Identifizierung und Charakterisierung von Cosmidklonen mit chromosomalen DNA Fragmenten von A. mediterranei, die mit einem Ende der 26 kb A. mediterranei Region von pNE112 überlappen
  • Um Cosmidklone zu identifizieren, die chromosomale DNA Fragmente von A. mediterranei umfassen, die direkt vor der 26 kb Region von pNE112 liegen, wird das Plasmid pNE112 mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten und das entstehende BamHI Fragment mit einer Größe von 3,2 kb wird aus den anderen BamHI Fragmenten in einem Agarosegel abgetrennt und aus dem Gel isoliert. Dieses BamHI Fragment liegt an einem Ende der in pNE112 eingebauten A. mediterranei DNA (siehe Beispiel 8) und kann so als DNA Sonde für die Auffindung der erforderlichen Cosmidklone verwendet werden. Etwa 0,5 μg des isolierten 3,2 kb BamHI DNA Fragments werden mit 32P-dCTP durch das Nicktranslationsystem aus Gibco/BRL (Basel) gemäß den Anleitungen des Herstellers radioaktiv markiert.
  • Die Cosmidgenbank von A. mediterranei, die in Beispiel 7 beschrieben ist, wird dann durch Koloniehybridisierung (Verfahren von Beispiel 3) mittels der 3,2 kb DNA Sonde für Klone mit Überlappungen verwendet. Zwei Cosmidklone mit einem starken Hybridisierungssignal können auf diese Weise identifiziert werden und ihnen werden die Nummern pNE95 und pRi44-2 gegeben. Es ist durch Restriktionsanalyse und Southern Blot möglich, zu bestätigen, dass die Plasmide pNE95 und pRi44-2 die chromosomalen DNA Fragmente von A. mediterranei enthalten, die mit dem 3,2 kb BamHI Fragment von pNE112 überlappen und zusammen eine 35 kb große chromosomale Region von A. mediterranei abdecken, die direkt an das 26 kb A. mediterranei Fragment von pNE112 benachbart liegt, die in pNE112 kloniert ist.
  • Beispiel 11: Restriktionsanalyse der chromosomalen A. mediterranei DNA Region, die mit den Cosmidklonen pNE112, pNE95 und pRi44-2 kloniert wurde
  • Die chromosomale A. mediterranei DNA Region, die mit den Cosmidklonen pNE112, pNE95 und pRi44-2 kloniert wurde, wird durch Ausführung einer Restriktionsanalyse charakterisiert. Der Verdau der Plasmid DNA der drei Cosmide mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BglII und HindIII (einzeln und in Kombination) liefert eine grobe Restriktionskarte der klonierten Region von A. mediterranei. Es werden auf diese Weise überlappende Fragmente der 3 Plasmide etabliert und durch Southern Blot bestätigt. Diese chromosomale Region von A. mediterranei hat eine Größe von etwa 61 kb und wird durch die folgenden Restriktionsschnittstellen mit dem angegebenen Abstand in kb von einem Ende charakterisiert: EcoRI in Position 7,2 kb, HindIII in Position 21 kb, BglII in Position 31 kb, HindIII in Position 42 kb, BglII in Position 47 kb und BglII in Position 59 kb. In dieser Region im A. mediterranei Chromosom deckt das Plasmid pRi44-2 eine Region von Position 1 bis etwa 37 kb ab, das Plasmid pNE95 deckt eine Region etwa von Position 9 kb bis 51 kb ab und das Plasmid pNE112 deckt eine Region etwa von Position 35 kb bis 61 kb ab.
  • Beispiel 12: Bestimmung der Sequenz der chromosomalen A. mediterranei DNA Region, die in Beispiel 11 beschrieben wurde, von der EcoRI Schnittstelle an der Position 7,2 kb bis zum 61 kb Ende
  • Die Bestimmung der DNA Sequenz der in Beispiel 11 beschriebenen chromosomalen Region von A. mediterranei (EcoRI Schnittstelle an der Position 7,2 kb bis 51 kb) wird mit den Plasmiden pRi44-2 und pNE95 unter Verwendung desselben Verfahrens ausgeführt, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Analyse der auf diese Weise erhaltenen DNA Sequenz bestätigt die grobe Restriktionskarte, die in Beispiel 11 beschrieben wurde, und überlappt mit den klonierten A. mediterranei Fragmenten in den Plasmiden pNE112, pNE95 und pRi44-2.
  • Die DNA Sequenz der chromosomalen A. mediterranei DNA Region, die in Beispiel 11 beschrieben ist, von der EcoRI Schnittstelle an der Position 7,2 kb bis zum Ende bei 61 kb ist in SEQ ID Nr. 3 beschrieben (Länge 53789 Basenpaare).
  • Beispiel 13: Analyse einer ersten für ein Protein kodierenden Region (ORFA) der klonierten in SEQ ID Nr. 3 gezeigten chromosomalen Region von A. mediterranei
  • Die in SEQ ID Nr. 3 gezeigte Nukleotidsequenz wird mit dem Codenpräferenzcomputerprogramm (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994) analysiert. Diese Analyse zeigt, dass ein sehr großer offener Leserahmen (ORF A), der für ein Protein kodiert, im ersten Drittel der Sequenz vorkommt (Position 1825 bis 15543 einschließlich des Stopcodons in SEQ ID Nr. 3). Die in ORF A verwendeten Codons sind für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt typisch.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF A (SEQ ID Nr. 4, Größe 4572 Aminosäuren) mit anderen Polyketidsynthasen und speziell mit der sehr gut charakterisierten Polyketidsynthase von Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991), 252, 675-679, DNA Sequenz Gen/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 370 bis 451 ist zu 50 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 469 bis 889 ist zu 65 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 982 bis 1292 ist zu 54 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 1324 bis 1442 ist zu 42 % identisch zur Dehydratasedomäne von Modul 4 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 1664 bis 1840 ist zu 56 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 1929 bis 2000 ist zu 53 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 2032 bis 2453 ist zu 64 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 2554 bis 2865 ist zu 37 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 2918 bis 2991 ist zu 54 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 3009 bis 3431 ist zu 65 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 3532 bis 3847 ist zu 53 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 4142 bis 4307 ist zu 43 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 4405 bis 4490 ist zu 50 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
  • Zusätzlich zu diesen signifikanten Homologien mit der eryA Polyketidsynthase von S. erythraea ist die Region von ORF A, SEQ ID Nr. 4, Aminosäuren 1 bis 356 zu 53 % identisch zur postulierten Starteinheitsaktivierungsdomäne der Rapamycinpolyketidsynthase von Streptomyces hygroscopicus (Aparicio et al., GENE (1996), 169, 9-16).
  • Die großen Ähnlichkeiten, die in der Aminosäuresequenz der enzymatischen Domänen gefunden werden, legen unzweifelhaft nahe, dass die für das Protein kodierende Region (ORF A) der chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, für eine typische modulate Polyketidsynthase (Typ 1) kodiert. Diese sehr große A. mediterranei Polyketidsynthase, die von ORF A kodiert wird, umfasst drei komplette bioaktive Module, die jeweils für die Kondensation einer C2 Einheit im Makrolidring des Moleküls und die korrekte Modifikation der anfänglich gebildeten β-Ketogruppen verantwortlich sind. Aufgrund der Homologie mit den Aktivierungsdomänen der Rapamycinpolyketidsynthase umfasst das erste oben beschriebenen Modul sehr wahrscheinlich eine enzymatische Domäne zur Aktivierung der aromatischen Starteinheit der Rifamycinbiosynthese, nämlich 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure (Ghisalba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics, E.J. Vandamme, Herausgeber, Decker Inc. New York, (1984) 281-327).
  • Beispiel 14: Analyse einer zweiten für Protein kodierenden Region (ORF B) der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist
  • Die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 3 wird mittels des Codonpräferenzcomputerprogramms (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994) analysiert. Diese Analyse zeigt, dass ein weiterer großer offener Leserahmen (ORF B), der für ein Protein kodiert, in der mittleren Region der Sequenz vorkommt (Position 15550 bis 30759 einschließlich des Stopcodons der SEQ ID Nr. 3). Die in ORF B verwendeten Codons sind für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt typisch.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF B (SEQ ID Nr. 5, Länge 5069 Aminosäuren) mit anderen Polyketidsynthasen und speziell mit der sehr gut charakterisierten Polyketidsynthase von Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science (1991), 252, 675-679, DNA Sequenz Gen/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 44 bis 468 ist zu 62 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 571 bis 889 ist zu 56 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 921 bis 1055 ist zu 47 % identisch zur Dehydratasedomäne von Modul 4 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 1353 bis 1525 ist zu 49 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 1621 bis 1706 ist zu 53 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 1726 bis 2148 ist zu 62 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 2251 bis 2560 ist zu 55 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 2961 bis 3132 ist zu 49 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 3228 bis 3313 ist zu 52 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 3332 bis 3755 ist zu 63 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 3857 bis 4173 ist zu 52 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 4664 bis 4799 ist zu 47 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
    • Die Region ORF B, SEQ ID Nr. 5, Aminosäuren 4929 bis 5014 ist zu 52 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharospolyspora erythraea.
  • Beispiel 15: Analyse einer dritten für Protein kodierenden Region (ORF C) der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist
  • Die Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 3 wird mittels des Codonpräferenzcomputerprogramms (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994) analysiert. Diese Analyse zeigt, dass ein großer offener Leserahmen (ORF C), der für ein Protein kodiert, in der mittleren Region der Sequenz vorkommt (Position 30895 bis 36060 einschließlich des in SEQ ID Nr. 3 verwendeten Stopcodons). Die in ORF C verwendeten Codons sind für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt typisch.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF C (SEQ ID Nr. 6, Länge 1721 Aminosäuren) mit anderen Polyketidsynthasen und insbesondere der sehr gut charakterisierten Polyketidsynthase von Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, DNA Sequenz Gen/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region von Ort C, SEQ ID Nr. 6, Aminosäuren 1 bis 414 ist zu 63 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Orf C, SEQ ID Nr. 6, Aminosäuren 514 bis 828 ist zu 54 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Ort C, SEQ ID Nr. 6, Aminosäuren 1290 bis 1399 ist zu 49 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Ort C, SEQ ID Nr. 6, Aminosäuren 1563 bis 1648 ist zu 55 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
  • Beispiel 16: Analyse einer vierten für Protein kodierenden Region (ORF D) der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist
  • Die Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 3 wird mittels des Codonpräferenzcomputerprogramms (Genetics Computer Group, University of Wiskonsin, 1994) analysiert. Diese Analyse zeigt, dass ein großer offener Leserahmen (ORF D), der für ein Protein kodiert, in der mittleren Region der Sequenz vorkommt (Position 36259 bis 41325 einschließlich des Stopcodons in SEQ ID Nr. 3). Die in ORF D verwendeten Codons sind für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt typisch.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF D (SEQ ID Nr. 7, Länge 1688 Aminosäuren) mit anderen Polyketidsynthasen und speziell mit der sehr gut charakterisierten Polyketidsynthase von Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, DNA Sequenz Gene/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region von Orf D, SEQ ID Nr. 7, Aminosäuren 1 bis 418 ist zu 64 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Orf D, SEQ ID Nr. 7, Aminosäuren 524 bis 841 ist zu 54 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Orf D, SEQ ID Nr. 7, Aminosäuren 1260 bis 1432 ist zu 51 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von Ort D, SEQ ID Nr. 7, Aminosäuren 1523 bis 1608 ist zu 53 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
  • Beispiel 17: Analyse einer fünften für Protein kodierenden Region (ORF E) der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist
  • Die Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 3 wird mittels des Codonpräferenzcomputerprogramms analysiert (Genetics Computer Group, Wisconsin, 1994). Diese Analyse zeigt, dass ein großer offener Leserahmen (ORF E), der für ein Protein kodiert, in der hinteren Region der Sequenz vorkommt (Position 41373 bis 51614 einschließlich des Stopcodons in SEQ ID Nr. 3). Die in ORF E verwendeten Codons sind für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt typisch.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF E (SEQ ID Nr. 8, Länge 3413 Aminosäuren) mit anderen Polyketidsynthasen und insbesondere der sehr gut charakterisierten Polyketidsynthase von Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science (1991), 252, 675-679, DNA Sequenz Gen/EMBL Hinterlegungsnummer M63676) ergibt die folgenden Ergebnisse:
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 31 bis 451 ist zu 64 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 555 bis 874 ist zu 37 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 907 bis 1036 ist zu 49 % identisch zur Dehydratasedomäne von Modul 4 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 1336 bis 1500 ist zu 52 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 1598 bis 1683 ist zu 51 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 1702 bis 2124 ist zu 62 % identisch zur Ketoacylsynthasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 2229 bis 2543 ist zu 53 % identisch zur Acyltransferasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 2573 bis 2700 ist zu 47 % identisch zur Dehydratasedomäne von Modul 4 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 3054 bis 3227 ist zu 52 % identisch zur Ketoreduktasedomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
    • Die Region von ORF E, SEQ ID Nr. 8, Aminosäuren 3324 bis 3405 ist zu 51 % identisch zur Acylcarrierproteindomäne von Modul 1 des eryA Lokus von Saccharopolyspora erythraea.
  • Beispiel 18: Analyse einer sechsten für Protein kodierenden Region (ORF F) der klonierten chromosomalen Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist
  • Die Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 3 wird mittels des Codonpräferenzcomputerprogramms analysiert (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994). Die Analyse zeigt, dass ein offener Leserahmen (ORF F), der für ein Protein kodiert, in der hinteren Region der Sequenz vorkommt (Position 51713 bis 52393 einschließlich des Stopcodons in SEQ ID Nr. 3). Die verwendeten Codons in ORF F sind typisch für Actinomycetengene mit einem hohen G + C Gehalt.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ORF F (SEQ ID Nr. 9, Länge 226 Aminosäuren) mit Proteinen aus der EMBL Datenbank (Heidelberg) zeigt eine große Ähnlichkeit mit der N-Hydroxyarylamin-O-acyltransferase von Salmonella typhimurium (29 % Identität über eine Region von 134 Aminosäuren). Es besteht auch eine signifikante Homologie mit Arylaminacyltransferasen aus anderen Organismen. Es kann aus diesen Übereinstimmungen geschlossen werden, dass der ORF F, der in A. mediterranei in SEQ ID Nr. 3 gefunden wird, für eine Arylaminacyltransferase kodiert und es kann angenommen werden, dass dieses Enzym für die Anbindung der langkettigen Acylkette, die durch die Polyketidsynthase gebildet wird, an die Aminogruppe des Ausgangsmoleküls 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure verantwortlich ist. Diese Reaktion würde das Rifamycinringsystem korrekt nach der Vervollständigung der Kondensationsschritte durch die Polyketidsynthase schließen.
  • Beispiel 19: Zusammenfassende Evaluierung der Funktion der Proteine, die durch ORF A bis F in SEQ ID Nr. 3 kodiert werden und ihre Rolle in der Biosynthese von Rifamycin
  • Die 5 für Protein kodierenden Regionen (ORF A bis E), die in den Beispielen 13 bis 17 der SEQ ID Nr. 3 beschrieben sind, umfassen Proteine mit einer sehr großen Ähnlichkeit (in der Aminosäuresequenz und der Anordnung der enzymatischen Domänen) zu Polyketidsynthasen für Polyketide vom Makrolidtyp. Zusammengenommen umfassen diese 5 multifunktionellen Enzyme 10 Polyketidsynthasemoleküle, die für einen Kondensationsschritt in der Polyketidsynthese verantwortlich sind. Es sind ebenfalls 10 solcher Kondensationsschritte für die Rifamycinbiosynthese erforderlich (Ghiselba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics, E.J. Vandamme, Decker Inc. New York, (1984) 281-327). Die Prozessierung der bestimmten Ketogruppen, die von den enzymatischen Domänen innerhalb der Module erforderlich sind, entsprechen im wesentlichen der Aktivität, die für das Rifamycinmolekül erforderlich ist, falls angenommen wird, dass die Polyketidsynthese „colinear" mit der Anordnung der Module im Gencluster von A. mediterranei stattfindet (dies ist der Fall für andere Makrolidantibiotika, wie Erythromycin und Rapamycin). Es kann hier angefügt werden, dass es nicht sicher ist, ob die Transkription der 5 ORFs zu 5 Proteinen führt, wobei insbesondere ORF C und ORF D möglicherweise in ein größeres Protein translatiert werden.
  • Eine enzymatische Domäne, die sehr wahrscheinlich für die Aktivierung des Startmoleküls 3-Hydroxy-5-aminobenzoesäure der Rifamycinbiosynthese ist, kann am N-Terminus des ORF A, dem Beginn der Polyketidsynthase, gefunden werden. Direkt hinter dem beschriebenen Rifamycinpolyketidsynthasegencluster liegt ein Gen (ORF F), das sehr wahrscheinlich für ein Protein kodiert, das den Ringschluss des Rifamycinmoleküls nach der Vervollständigung der Kondensationsschritte durch die Polyketidsynthase herbeiführt.
  • Es kann auf der Grundlage dieser Feststellungen geschlossen werden, dass die chromosomale Region von A. mediterranei, die in SEQ ID Nr. 3 beschrieben ist, für die zehn Kondensationsschritte verantwortlich ist, die für die Rifamycinpolyketidsynthese erforderlich sind, einschließlich der Aktivierung des Startmoleküls 3-Hydroxy-5-aminobenzoesäure und dem abschließenden Ringschluss.
  • Hinterlegte Mikroorganismen
  • Die folgenden Mikroorganismen und Plasmide wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig gemäß den Anforderungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
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    Sequenzliste
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    Figure 01810001
    • (1) Wenn Regel 6.4 (d) zutrifft, das Datum ist das Datum, an dem der Status der internationalen Hinterlegung erhalten wurde Formblatt DSMZ-BP/4 (eine Seite) 0196
  • Figure 01820001
    • (1) Angabe des Originalhinterlegungsdatums oder falls eine neue Hinterlegung oder ein Transfer durchgeführt wurde, das relevante jüngste Datum (Datum der neuen Hinterlegung oder Datum des Transfers)
    • (2) In den Fällen, die sich auf Regel 10.2 (a) (ii) und (iii) beziehen, Angabe der jüngsten Lebensfähigkeitstests
    • (3) Markierung mit einem Kreuz im zutreffenden Kästchen
    • (4) Ausfüllen, falls die Information angefordert wurde oder falls die Ergebnisse des Tests negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzelne Seite) 0196
  • Figure 01830001
    • (1) Wenn Regel 6.4 (d) zutrifft, das Datum ist das Datum, an dem der Status der internationalen Hinterlegung erhalten wurde Formblatt DSMZ-BP/4 (eine Seite) 0196
  • Figure 01840001
    • (1) Angabe des Originalhinterlegungsdatums oder falls eine neue Hinterlegung oder ein Transfer durchgeführt wurde, das relevante jüngste Datum (Datum der neuen Hinterlegung oder Datum des Transfers)
    • (2) In den Fällen, die sich auf Regel 10.2 (a) (ii) und (iii) beziehen, Angabe der jüngsten Lebensfähigkeitstests
    • (3) Markierung mit einem Kreuz im zutreffenden Kästchen
    • (4) Ausfüllen, falls die Information angefordert wurde oder falls die Ergebnisse des Tests negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzelne Seite) 0196
  • Figure 01850001
    • (1) Wenn Regel 6.4 (d) zutrifft, das Datum ist das Datum, an dem der Status der internationalen Hinterlegung erhalten wurde Formblatt DSMZ-BP/4 (eine Seite) 0196
  • Figure 01860001
    • (1) Angabe des Originalhinterlegungsdatums oder falls eine neue Hinterlegung oder ein Transfer durchgeführt wurde, das relevante jüngste Datum (Datum der neuen Hinterlegung oder Datum des Transfers)
    • (2) In den Fällen, die sich auf Regel 10.2 (a) (ii) und (iii) beziehen, Angabe der jüngsten Lebensfähigkeitstests
    • (3) Markierung mit einem Kreuz im zutreffenden Kästchen
    • (4) Ausfüllen, falls die Information angefordert wurde oder falls die Ergebnisse des Tests negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzelne Seite) 0196
  • Figure 01870001
    • (1) Wenn Regel 6.4 (d) zutrifft, das Datum ist das Datum, an dem der Status der internationalen Hinterlegung erhalten wurde Formblatt DSMZ-BP/4 (eine Seite) 0196
  • Figure 01880001
    • (1) Angabe des Originalhinterlegungsdatums oder falls eine neue Hinterlegung oder ein Transfer durchgeführt wurde, das relevante jüngste Datum (Datum der neuen Hinterlegung oder Datum des Transfers)
    • (2) In den Fällen, die sich auf Regel 10.2 (a) (ii) und (iii) beziehen, Angabe der jüngsten Lebensfähigkeitstests
    • (3) Markierung mit einem Kreuz im zutreffenden Kästchen
    • (4) Ausfüllen, falls die Information angefordert wurde oder falls die Ergebnisse des Tests negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzelne Seite) 0196

Claims (17)

  1. Isolierte DNA, die entweder ist (i) das für die Rifamycinbiosynthese verantwortliche Gencluster in Amycolatopsis mediterranei, das die SEQ ID Nr. 3 umfasst, (ii) ein DNA Teil, der (i) für eine Polyketidsynthase oder eine enzymatisch aktive Domäne hiervon kodiert, (iii) ein DNA Teil der SEQ ID Nr. 3, der zumindest 15 aufeinanderfolgende Nukleotide hiervon aufweist und der als Hybridisierungssonde innerhalb einer Genbank des Rifamycin-bildenden Organismus zum Auffinden von Bestandteilen des entsprechenden Genclusters verwendet werden kann, (iv) eine DNA, die zumindest 70 % Identitität zur DNA von (ii) aufweist und die für ein Polypeptid kodiert, das dieselbe Polyketidsynthaseaktivität aufweist, wie sie von der DNA von (ii) kodiert wird.
  2. Isolierte DNA nach Anspruch 1, worin die DNA entweder (i) eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus – ORF A, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 1825 bis 15543 reicht, – ORF B, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 15550 bis 30759 reicht, – ORF C, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 30895 bis 36060 reicht, – ORF D, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 36259 bis 41325 reicht, – ORF E, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 41373 bis 51614 reicht, und – ORF F, der aus einem Fragment von SEQ ID Nr. 3 besteht und von den Nukleotidpositionen 51713 bis 52393 reicht, oder (ii) für ein oder mehrere der Proteine oder Polypeptide der SEQ ID Nr. 4 bis 9 kodiert.
  3. Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Klonierung einer isolierten DNA nach Anspruch 1 aus einem Organismus, der Rifamycin synthetisiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: – Erstellen einer Genbank aus dem Organismus, der Rifamycin synthetisiert, – Screenen dieser Genbank mit Hilfe der DNA von Anspruch 1, – Isolierung der als positiv identifizierten Klone.
  4. Verwendung der DNA nach Anspruch 1, zur Herstellung von Ansamycinen oder Vorläufern hiervon, einschließlich derer, worin die aliphatische Brücke nur an einem Ende des aromatischen Kerns gebunden ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Ansamycin Rifamycin ist.
  6. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 zur Inaktivierung oder Modifizierung von Genen der Ansamycinbiosynthese.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Ansamycin Rifamycin ist.
  8. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 zur Konstruktion mutierter Actinomycetes Stämme, aus denen das natürliche Rifamycin- oder Ansamycinbiosynthesegencluster im Chromosom teilweise oder vollständig deletiert wurde.
  9. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 zur Zusammenstellung einer Genbank aus Polyketidsynthasen.
  10. Polyketidsynthase aus Amycolatopsis mediterranei, die bei der Rifamycinsynthese oder einer enzymatisch aktiven Domäne hiervon beteiligt ist, worin die Polyketidsynthase durch eine DNA nach Anspruch 1 kodiert wird.
  11. Verwendung der Polyketidsynthase nach Anspruch 10 zur Synthese von Ansamycinen.
  12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Synthese einer Genbank von Ansamycinen.
  13. Hybridvektor, der die DNA nach Anspruch 1 umfasst.
  14. Hybridvektor, der einen Expressionsvektor umfasst, welcher die DNA nach Anspruch 1 enthält.
  15. Wirtsorganismus, der den Hybridvektor nach Anspruch 14 umfasst.
  16. Hybridisierungssonde, die die DNA nach Anspruch 1 umfasst.
  17. Verwendung der Hybridisierungssonde nach Anspruch 16 zur Identifizierung von DNA Fragmenten, die bei der Biosynthese von Ansamycinen beteiligt sind.
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