DE69732304T2

DE69732304T2 - Verwendung von vegf zur herstellung eines medikaments zur behandlung oder verhinderung der intimalen hyperplasie und verabreichungsgerät

Info

Publication number: DE69732304T2
Application number: DE69732304T
Authority: DE
Inventors: John Francis Martin; Seppo Ylä-Herttuala; Stephen G. E. Barker
Original assignee: Ark Therapeutics Ltd
Current assignee: Ark Therapeutics Ltd
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2017-11-04
Also published as: NO326303B1; AU729420B2; JP4783797B2; HU223957B1; JP2012031196A; CA2270286A1; EP1488761A1; KR100695590B1; PL333272A1; ES2235227T3; KR20000052999A; US7320679B2; ATE287271T1; EP0941116A2; NO992106L; WO1998020027A3; HK1108845A1; PT941116E; US20030225020A1; DE69732304D1

Description

Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung eines vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors, insbesondere zur Behandlung und Prävention der Intimahyperplasie von Blutgefässen und anderer Zustände, insbesondere Bluthochdruck. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, die für die Verabreichung des aktiven Wirkstoffes verwendet werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Intimahyperplasie ist die Zunahme der Zellzahl zwischen dem Endothel und der Lamina elastica interna eines Blutgefässes, insbesondere in der dortigen Endothelschicht (Intima) oder in einer Arterie. Intimahyperplasie wird oft durch die Proliferation glatter Muskelzellen in der Blutgefäßwand ausgelöst.
Wenn eine Intimahyperplasie auftritt, kann diese zu einer De-novo-Verdickung der Endothelschicht oder der Gefäßwand, d. h. Stenose, führen. Dadurch kann das Blutgefäß verschlossen werden.
Ebenso kann, wenn eine Verengung in einem Blutgefäß beseitigt worden ist, eine postoperativ auftretende Intimahyperplasie dazu führen, daß sich die Arterie erneut verschließt. Dies ist als Restenose bekannt.
Eine Proliferation arterieller glatter Muskelzellen tritt gewöhnlich auf, wenn ein Blutgefäß, z. B. eine Arterie, während eines chirurgischen Eingriffs verformt oder zerstört wird. Zum Beispiel kann eine Intimahyperplasie zur De-novo-Stenose infolge von Bypassgrafts führen, in welchen eine Vene mit einer Arterie verbunden wird, und allgemein infolge chirurgischer Anastomose. Zwei Beispiele von chirurgischen Eingriffen, die zu Stenose führen können, sind koronare Bypassgrafts und femoro-popliteale arterielle Oberschenkel-Bypassgrafts.
Ähnlich kann Restenose infolge von Ballonangioplastie-Verfahren auftreten, die dazu verwendet werden, Verengungen in Blutgefässen zu beseitigen, beispielsweise Ballonangioplastie-Verfahren.
Intimahyperplasie, ob sie zu Stenose oder zu Restenose führt, bleibt ein Hauptproblem nach unterschiedlichen chirurgischen Verfahren.
Arteriosklerotische kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in Europa und Nordamerika und verursachen eine hoch signifikante Morbidität infolge Verschluß des Arterienlumens, den Blutfluß entweder verhindernd oder hemmend, einer Plaque mit überlagerter Thrombose mit eventueller distaler Embolisation, Schwächung der Arterienwand, die zur aneurysmatischen Erweiterung und eventuell zur Ruptur führen. Abhängig von Lokalisation und Krankheitsverlauf existieren mehrere Behandlungsmöglichkeiten, mit dem arteriellen Bypassgraft als den geläufigsten chirurgischen Eingriff. Für koronare Arterienerkrankungen ist dieser in den Vereinigten Staaten zum geläufigsten aller chirurgischen Verfahren geworden mit > 200,000 vorgenommenen Operationen jährlich seit 1990 und in Großbritannien mit > 20,000 vorgenommenen Operationen jährlich. In der Aorta, Nierengefäßen, mesenterialen und peripheren Gefäßen steigt die Last chirurgischer Bypassverfahren mit Operationsraten in den Vereinigten Staaten und Europa von 35–70 pro 100,000 Einwohner weiter an. Zusammen beträgt die Zahl der jährlich vorgenommenen chirurgischen Bypassverfahren annähernd eine Million.
In den ersten 24 Monaten nach der Operation schlägt eine sehr signifikante Anzahl arterieller Bypassgrafts fehl (verschließen). Zitierte Werte liegen im Bereich von 20% bis 30%. Dies bedeutet, daß für alle jährlich in Großbritannien vorgenommenen Herz- und peripheren arteriellen Bypassverfahren (in etwa 25,000 bis 30,000) davon ausgegangen werden kann, daß zwischen 6,000 und 7,000 innerhalb zwei Jahren fehlschlagen. Die Fehlschlagrate bei Wiederholungsverfahren liegen sogar noch höher. Die finanziellen Unkosten der Fehlschläge sind derart, daß in den Vereinigten Staaten berechnet wurde, daß selbst eine geringe Abnahme der Fehlschlagraten infolge koronarer Eingriffe von 33% auf 25% bis zu 750 Millionen $ des Gesundheitshaushaltes einsparen könnte.
Es gibt drei Hauptgründe dafür, daß Grafts in den fünf Jahren nach der Operation fehlschlagen. Der erste tritt bekanntlich früh, innerhalb 30 Tagen nach der Operation (< 5%), auf und stellt die technischen Fehler dar (z. B. dürftige Anastomosetechnik). Späteres Fehlschlagen, nach 24 Monaten, ist hauptsächlich das Ergebnis eines Fortschreitens des ursprünglichen Arterioskleroseprozesses. Dennoch sind es die Grafts, die zwischen einem und 24 Monaten verschließen, die die meisten Fehlschläge ausmachen (< 70%). In diesen Fällen ist es eine SMC-Intimahyperplasie, die für die schrittweise Verengung, z. B. Stenose, des Arterienlumens verantwortlich ist und eventuell einen kompletten Verschluß bewirkt. Typischerweise ist die SMC-Intimahyperplasie um die distale arterielle Anastomose und die native Gefäßwand gegenüber der Anastomose lokalisiert. Es handelt sich somit um eine primäre Pathologie an dieser Stelle und nicht um eine Restenose an der Stelle einer vorhergehenden Intimahyperplasie, wie es infolge Angioplastie der Fall sein kann. SMC-Intimahyperplasie kann an der proximaleren arteriellen Anastomose und entlang dem Graft selbst auftreten.
Restenose nach Angioplastie kann zu noch höheren Fehlschlagraten führen, von 20 bis 50% in den ersten 6 Monaten nach der Angioplastie. Stenose und Restenose stellen weiterhin beide bedeutende Probleme nach chirurgische Eingriffen dar.
Heutzutage sind zahlreiche Methoden zur Behandlung und Prävention der Intimahyperplasie getestet worden, aber keine war klinisch zufriedenstellend.
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktors (VEGF) ist ein natürlich vorkommendes Protein. Beim Menschen kommen mindestens vier Formen mit 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren vor. Die cDNA- und Aminosäuresequenzen der vier Formen von humanem VEGF sind in Houck et al, Molecular Endocrinology (1991) Vol 5, N° 12, Seiten 1806–1814 gegeben. Eine genomische Teilsequenz ist auch gegeben. Die cDNA-Sequenz des humanen VEGF ist auch in Leung et al, Science (1998) 246: 1306–1309, neben der cDNA-Sequenz des Rinder-VEGF gegeben.
Diese vier Formen werden hier mit VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 und VEGF-206 bezeichnet. Es sollte verstanden werden, daß sich diese Numerierung jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren des maturen Proteins bezieht. Das translatierte Protein umfaßt auch eine Präsequenz aus 26 Aminosäuren, die naturgemäß während der intrazellulären Prozessierung abgespalten wird.
VEGF ist dafür bekannt, in der Angiogenese eine Rolle zu spielen, wo es die Teilung vaskulärer endothelialer Zellen (EC) stimuliert, die endotheliale Permeabilität erhöht und als ein endothelialer "Überlebensfaktor" in Retinagefäßen wirkt. Beispielsweise kann VEGF in rekombinanter Form oder wenn von einem Vektor exprimiert die Entwicklung neuer Blutgefässe induzieren, wenn es intraarteriell in ischämische Extremitäten injiziert wird. Diese Eigenschaft hat zu seiner Verwendung bei der Reparatur von Arterien geführt, deren Endothele während chirurgischer Eingriffe verletzt wurden. So haben Asahara et al., Circulation (1995) 91: 2793 nach Angioplastie, durch die das Endothel der Arterie freigelegt wurde, mittels einer Kanüle VEGF in die Kopfschlagadern von Ratten verabreicht; es wurde festgestellt, daß VEGF die Reendothelisierung der Arterie stimuliert, die wiederum zur Unterdrückung von Intimahyperplasie beizutragen schien.
VEGF-Protein und Gen werden in WO-A-9013649 offenbart, und ihre Verwendung zur Behandlung von Verletzungen des vaskulären Epithels, diabetischer Ulzera und Verletzungen von Blutgefässen wurden vorgeschlagen. VEGF-Fragmente sind in WO-A-9102058 beschrieben sowie ihre Verwendung in der Angiogenese und Reendothelisierung innerer Gefäßwände, z. B. bei der Behandlung von Ulzera.
GB-A-2298577 offenbart ein nicht-restriktives poröses Außenstent für arteriovenöse Bypassgraftverfahren. Dieses Stent hat vorteilhafte Auswirkungen auf Lumengröße und auf Media- und Intimaverdickung.
WO-A-9423668 offenbart eine Vorrichtung für die lokale Verabreichung eines Wirkstoffes in ein Blutgefäß, die ein Reservoir umfaßt, das zwischen zwei ihrer Elemente gebildet wird. Ihr Gebrauch erfordert eine Implantation, d. h. Durchtrennen des Gefäßes und anschließendes Festmachen der Vorrichtung an den Gefäßwänden. Die Vorrichtung ist teilweise porös. Das Reservoir ist in direktem Kontakt mit dem Blutfluß im Lumen. Dies birgt das Risiko einer Infektion.
US-A-3797485 offenbart eine Vorrichtung für die Verabreichung eines Medikaments an die Adventitia eines Blutgefässes. Sie ist mit permanenten Wänden und transkutanen Sonden ausgestattet für die Verabreichung von Medikamenten in flüssiger Form. Ziel ist, daß das Medikament an eine andere Stelle gelangen soll.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, alle oben beschriebenen Zustände zu behandeln und/oder zu verhindern, sofern sie aus einer Intimahyperplasie hervorgehen. Überraschenderweise wurden Eigenschaften von VEGF aufgezeigt, die darauf hindeuten, daß er in verschiedener Weise gegen Intimahyperplasie eingesetzt werden kann.
Eine Manschette wurde außen um eine Kaninchenarterie gelegt. Dieses Vorgehen verursacht gewöhnlich eine Intimahyperplasie in der Kaninchenarterie, die zur Verdickung der Arterienwand führt, was mit der Stenose zu vergleichen ist, die in menschlichen Arterien nach Bypaßoperationen auftreten kann. Wenn die Manschette dazu verwendet wurde, DNA die für VEGF kodiert mittels eines Plasmid-/liposomalen Vektors an die Arterienwand zu liefern, so wurde das VEGF-Gen in der Arterienwand einschließlich der Endothelschicht überexprimiert. Eine Intimahyperplasie wurde unterdrückt. Es wurde gezeigt, daß die Adventitiamanschette für den arteriellen Gentransfer mit allen getesteten Gentransfersystemen geeignet ist.
Dies zeigt, daß VEGF neben der Stimulierung der Reendothelisierung in Fällen, in denen das Endothel verletzt ist, auch eine Intimahyperplasie zu unterdrücken vermag in Situationen, in denen eine Intimahyperplasie auftritt, wenn das Endothel ganz oder weitgehend intakt ist. Er ist deshalb nicht nur zur Unterdrückung von Restenose nach Angioplastie, sondern auch zur Behandlung und Prävention von De-novo-Stenose in anderen operativen Gegebenheiten potentiell geeignet. Somit gibt es einen Gegensatz zwischen den neuen Erkenntnissen und früheren Erkenntnissen, wonach gezeigt wurde, daß VEGF die Neuentwicklung oder Heilung des Endothels stimuliert. Die neuen Erkenntnisse scheinen auf einem anderen Wirkmechanismus des VEGF zu beruhen.
Die neuen Erkenntnisse zeigen außerdem, daß effektive Wirkstoffe an die äußere Wand von Blutgefäßen verabreicht werden können, um Intimahyperplasie zu behandeln. Dies hat mehrere Vorteile. Insbesondere wird der therapeutische Wirkstoff nicht mit dem Blutstrom vom Ort der Hyperplasie weggewaschen, wie es bei intraluminaler Verabreichung der Fall ist. Ein Lieferreservoir kann um das Blutgefäß beibehalten werden und es besteht kein Bedarf an irgendwelchen intraluminalen Manipulationen, die das Endothel des Blutgefäßes verletzen (und selbst Intimahyperplasie auslösen können).
Noch insbesonderer macht es die vorliegende Erfindung möglich, daß Wirkstoffe gegen SMC-Intimahyperplasie direkt an die Adventitia der Arterienwand verabreicht werden können (d. h. am nächsten zu den Zellen im äußeren Medium). Jeder verwendete Wirkstoff kann spezifisch an den Stellen verabreicht werden, die am wahrscheinlichsten eine Verletzung durch Intimahyperplasie entwickeln, da diese Stellen zum Zeitpunkt der Operation leicht zugänglich sind.
VEGF vermittelt seine bekannten Wirkungen über spezifische hochaffine Tyrosinkinase-Rezeptoren flk-1/KDR und flt-1, die nur auf EC und Monozyten exprimiert sind. Ohne an der Theorie festhalten zu wollen, wird für wahrscheinlich gehalten, daß die Wirkungen des VEGF in der Unterdrückung von Hyperplasie auch durch dieselben Rezeptoren vermittelt werden. Demgemäß erstreckt sich die Erfindung auch auf die Verwendung anderer Agonisten der Rezeptoren, an die VEGF bindet, oder auf andere Stoffe, die denselben Wirkmechanismus haben, um Intimahyperplasie zu behandeln oder zu verhindern.
Außerdem verleiht die spezifische Lokalisation der VEGF-Rezeptoren VEGF im Vergleich zu vielen anderen Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die für die Behandlung einer Intimaverdickung erwogen werden, einen Vorteil; die Wirkungen von VEGF sind spezifischer für EC, da in Abwesenheit von Monozyten hochaffine VEGF-Rezeptoren in der Arterienwand nur auf EC exprimiert sind.
Es wurde zum Beispiel gezeigt, daß der Mechanismus der Hemmung von Intimahyperplasie durch VEGF in Situationen, in denen das Endothel ganz oder weitgehend unverletzt ist, zumindest teilweise über den Stickoxid (NO)-Pathway geschieht, da die Verabreichung des NO-Synthese-Inhibitors L-NAME den Wirkungen des VEGF auf Intimahyperplasie in dem oben beschriebenen Manschetten-Modell entgegenwirkt. VEGF stimuliert also die NO-Produktion.
Es ist auch möglich, daß VEGF andere biologische Wirkungen hat, die zur Hemmung von Intimahyperplasie durch ihn beitragen. Insbesondere wurde gezeigt, daß die Überexpression von VEGF die Produktion von Prostazyklin, die Aktivierung von cytosolischer Phospholipase A und die Sekretion des von Willebrand Faktors durch EC stimuliert. Es mag der Fall sein, daß die Stimulierung der NO-Produktion durch VEGF und die Stimulierung der Prostazyklin-Produktion durch ihn nacheinander vorgehen, um die Intimahyperplasie zu unterdrücken.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Wirkstoff der ein VEGF-Protein ist, das die Fähigkeit besitzt, die Proliferation von Endothelzellen in vitro und/oder in vivo zu fördern, das die Funktion von humanem VEGF hat, oder eine für das Protein codierende Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von Intimahyperplasie eines Blutgefässes, z. B. Stenose, bei der das Endothel ganz oder weitgehend intakt ist, verwendet. Der Wirkstoff kann in Form eines Implantats verabreicht werden.
Gemäß eines zweiten Aspekts der Erfindung wird ein Implantat zum therapeutischen Gebrauch so ausgelegt, daß es an oder in Nähe der Stelle der zu behandelnden oder vorzubeugenden Hyperplasie plaziert wird, wo das Endothel ganz oder weitgehend intakt ist, und enthält einen Wirkstoff, wie er oben definiert ist. Das Implantat kann einen Träger umfassen, welcher dazu ausgelegt ist, eine Abdichtung um die Stelle zu gewährleisten, wobei der Wirkstoff in dem Träger gehalten wird, so daß er bei Verwendung in Kontakt mit der Adventitia des Blutgefässes kommt. Derartige Vorrichtungen können biologisch abbaubar sein und erfordern keine permanenten transkutanen Zuführsonden.
Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt und in den Beispielen veranschaulicht sind verschiedene Wirkstoffe für die Verwendung in der Erfindung geeignet. Der Wirkstoff wird hier oft als VEGF-Protein oder Nukleinsäure beschrieben und diese Verweise sowie Verweise auf VEGF selbst werden als Beispiele angeführt. Jede der oben beschriebenen Formen von VEGF kann im Sinne dieser Erfindung verwendet werden.
Verweise auf diese Proteinsequenzen des VEGF müssen so verstanden werden, daß sie sich sowohl auf Sequenzen beziehen, die die Präsequenz beinhalten, als auch auf Sequenzen, denen die Präsequenz fehlt. VEGF-Proteine mit oder ohne der Präsequenz sind für die Ausführung der Erfindung geeignet. Ähnlich beziehen sich Verweise auf Nukleinsäure (DNA und RNA)-Sequenzen des VEGF sowohl auf Sequenzen, die für die Präsequenz kodieren, als auch auf Sequenzen, die nicht für die Präsequenz kodieren.
Es sollte darauf hingewiesen werden, daß Houck et al., s. o., die Sequenz von VEGF-165 mit der Aminosäure Asparagin (N oder Asn) an Position 141 (115 in der Darstellung von Houck et al., die dem maturen Protein entspricht) angeben. Houck et al. geben diese Aminosäure als Lysin (K oder Lys) in VEGF-121, VEGF-189 und VEGF-206 an, und die in Houck et al. angeführte cDNA-Sequenz (von VEGF-206) unterstützt dies. Deshalb kann in der Erfindung die Aminosäure an Position 141 entweder Asparagin (N oder Asn) oder Lysin (K oder Lys) sein. Jede Aminosäure wird von dem zugehörigen Triplet in den Nukleinsäuresequenzen aus der Erfindung codiert (für DNA können diese Triplets AAA oder AAG für Lysin und AAT oder AAC für Asparagin sein). Dies gilt insbesondere für VEGF-165.
Die vier Formen werden von demselben Gen codiert aber durch alternatives Splicing (Spleißen) auf RNA-Niveau generiert. Es gibt somit eine lange Isoform von humanem VEGF und drei bekannte gekürzte Isoformen. VEGF-121 und VEGF-165 sind löslich und sind sezernierte Isoformen. Ebenso ist die Präsequenz aus 26 Aminosäuren hydrophob und es wird angenommen, daß sie die Löslichkeit des Proteins vermindert. VEGF-Formen ohne die Präsequenz werden also bevorzugt, da angenommen wird, daß sie eine höhere Löslichkeit haben. Alle VEGF-Formen sind für die Ausführung der Erfindung geeignet, wenngleich sezernierte Formen bevorzugt werden. Für die Ausführung der Erfindung geeignete VEGF-Proteine können auch von anderen Spezies stammen, wenngleich der humane VEGF bevorzugt wird. Zum Beispiel wurden VEGF aus Maus, Kaninchen und Rind geklont und ihre Sequenzen sind bekannt.
Es sei darauf verwiesen, daß VEGF-121, 165, 189 und 206 in der Fachliteratur auch mit VEGF-120, 164, 188 und 205 bezeichnet werden.
VEGF-Proteine und Nukleinsäuren (DNA und RNA) sind geeignete Wirkstoffe für die Ausführung der Erfindung.
Wenn VEGF-Protein verwendet wird, wird das VEGF-Protein bevorzugt, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 (VEGF-121), 4 (VEGF-165), 6 (VEGF-189) oder 8 (VEGF-206) aufweist. Sezernierte Formen von VEGF werden bevorzugt und somit werden VEGF-121 du VEGF-165 besonders bevorzugt.
Bei der Ausführung der Erfindung wird es bevorzugt, VEGF-DNA zu verwenden, die VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 oder VEGF-206 codiert, z. B. mit der Sequenz SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7. DNA-Sequenzen, die sezernierten Formen von VEGF kodieren werden bevorzugt. Somit werden die DNA-Sequenzen SEQ ID No. 1 und 3 besonders bevorzugt.
Für die Ausführung der Erfindung geeignete VEGF-DNA und Proteine sind jedoch nicht auf diese bestimmten Sequenzen beschränkt. Vielmehr läßt die Erfindung auch die Verwendung anderer nahe verwandter DNA- und Proteinsequenzen zu.
DNA-Sequenzen aus der Erfindung können mit der der SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 auf vielerlei Weise verwandt sein. Beispielsweise können für die Ausführung der Erfindung geeignete DNA-Sequenzen degenerierte Sequenzen sein, die dasselbe Protein codieren, das Protein der SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8.
Alternativ können DNA-Sequenzen aus der Erfindung wesentlich homolog zu der der SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 sein und ein Protein codieren, das sich in der Aminosäuresequenz von dem der SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 unterscheidet aber VEGF-Aktivität hat. Gewöhnlich haben DNA-Sequenzen für die Verwendung in der Erfindung mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, oder mindestens 99% Sequenzhomologie zu der Sequenz der SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7.
Ebenso können VEGF-DNA-Sequenzen für die Verwendung in der Erfindung Fragmente von VEGF codieren, die VEGF-Aktivität beibehalten. Sequenzen von Interesse sind mindestens 15 Aminosäuren lang, z. B. bis zu 40 oder mehr Aminosäuren. Beispiele geeigneter Fragmente sind 20 Aminosäuren lang, z. B. die Sequenzen 1–20, 11–30, 21–40, 31–50, 41–60, 51–70, 61–80, 71–90, 81–100, 91–110, 101–120, 111–130, 121–140, 131–150, 141–160, 151–170, 161–180, 171–190, 181–200, 191–210 und 196–215 des aktiven als SEQ ID No. 6 dargestellten VEGF-Proteins.
DNA-Sequenzen für die Verwendung in der Erfindung können zum Beispiel genomische DNAs oder cDNAs sein, oder Hybride aus genomischer DNA und cDNA, oder sie können synthetisch oder halbsynthetisch sein. Sie können von einer beliebigen Spezies stammen, wenngleich DNAs die den humanen VEGF codieren bevorzugt werden. Sie können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Genomische DNAs, welche die Proteine der SEQ ID No. 2, 4, 6 und 8 codieren werden besonders bevorzugt.
DNA-Sequenzen für die Verwendung in der Erfindung können sich von der in SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 dargestellten Sequenz durch die Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, vorausgesetzt sie codieren ein Protein das VEGF-Aktivität aufweist. Sie können ebenso in Bezug auf SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 gekürzt sein oder durch ein oder mehrere Nukleotide verlängert, vorausgesetzt sie codieren ein Protein das VEGF-Aktivität aufweist.
RNA-Sequenzen sind auch für die Ausführung der Erfindung geeignet. Die Erfindung läßt insbesondere die Verwendung der den SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 entsprechenden RNA-Sequenzen zu; dies sind bevorzugte RNA-Sequenzen. Die Erfindung läßt auch die Verwendung von RNA-Sequenzen zu, die mit diesen Sequenzen auf eine der oben für die DNA-Sequenzen beschriebenen Weisen mit diesen Sequenzen verwandt sind. RNA-Sequenzen für die Erfindung können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. RNAs aus der Erfindung können von beliebiger Herkunft sein. Sie können beispielsweise von einer beliebigen Spezies stammen, wenngleich RNAs bevorzugt werden, die den humanen VEGF codieren, insbesondere den humanen VEGF mit der in SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Sequenz. Synthetische DNAs können ebenso wie halbsynthetische RNAs auch verwendet werden. Ferner kann von Bakterienplasmiden in vivo oder in vitro transkribierte DNA verwendet werden.
Für den Fachmann ist verständlich, daß in den für die Ausführung der Erfindung geeigneten Sequenzen, die T-Reste durch U ersetzt werden.
VEGF-Proteine für die Verwendung in der Erfindung werden von DNA- oder RNA-Sequenzen aus der Erfindungen wie oben definiert codiert. Bevorzugte Proteine aus der Erfindung sind die Proteine der SEQ ID No. 2, 4, 6 und 8, wenngleich die Erfindung auch die Verwendung anderer Proteine mit nahe verwandten Sequenzen zuläßt, die sich von denen der SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 unterscheiden aber VEGF-Aktivität aufweisen.
Erfindungsgemäß ist VEGF-Aktivität, insofern sich die Erfindung auf die Behandlung oder Prävention von Intimahyperplasie bezieht, die Fähigkeit, vollständig oder teilweise eine Intimahyperplasie in einem Blutgefäß, insbesondere einer Arterie, zu hemmen oder ihr vorzubeugen. Proteine die sich in ihrer Sequenz leicht von natürlich vorkommendem VEGF unterscheiden, wie oben beschrieben, behalten diese Eigenschaft bei, wenngleich nicht unbedingt in gleichem Maße wie VEGF. Solche Proteine können ebenso eine stärkere VEGF-Aktivität ausüben als der natürlich vorkommende VEGF. Das gleiche trifft für Agonisten von VEGF, zum Beispiel Peptide, Peptoide oder andere kleine Moleküle zu.
Insofern sich die Erfindung auf andere Eigenschaften von VEGF bezieht, ist VEGF-Aktivität die Fähigkeit von von VEGF unterschiedlichen Molekülen, diese Eigenschaften nachzuvollziehen. Insofern sich zum Beispiel die Erfindung auf die VEGF-Aktivität gegen NO-gebundene Konditionen die NO-Produktion zu stimulieren bezieht, schließt VEGF-Aktivität die Fähigkeit ein, die NO-Produktion zu stimulieren. Insofern sich die Erfindung auf die VEGF-Aktivität gegen Prostazyklin-gebundene Konditionen bezieht, schließt VEGF-Aktivität die Fähigkeit ein, die Prostazyklinproduktion zu stimulieren. Für die Ausführung der Erfindung geeignete VEGF-Proteine weisen gewöhnlich auch eine oder mehrere der bereits aus dem Stand der Technik bekannten biologischen Eigenschaften des VEGF auf, wie zum Beispiel die Fähigkeit, die Proliferation arterieller EC in vitro und/oder in vivo zu stimulieren, oder die Fähigkeit, an die Rezeptoren zu binden, an die VEGF bindet und sie auf die gleiche Weise wie VEGF zu aktivieren.
Für die Ausführung der Erfindung geeignete VEGF-Proteine können wesentlich homolog zu dem VEGF der SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 sein, gewöhnlich mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, oder mindestens 99% homolog.
Für die Ausführung der Erfindung geeignete VEGF-Proteine können sich von der in SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Sequenz durch die Deletion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, vorausgesetzt sie weisen VEGF-Aktivität auf. Sie können ebenso in Bezug auf SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 um eine oder mehrere Aminosäuren gekürzt oder in Bezug auf SEQ ID No. 2, 4, 6 oder 8 durch eine oder mehrere Aminosäuren verlängert sein, vorausgesetzt sie weisen VEGF-Aktivität auf. Hinsichtlich der Substitutionen werden konservative Substitutionen bevorzugt. Gewöhnlich sind konservative Substitutionen Substitutionen, in denen die substituierte Aminosäure der im natürlich vorkommenden VEGF vorliegenden Aminosäure ähnlich ist, zum Beispiel hinsichtlich Ladung und/oder Größe und/oder Polarität und/oder hydrophobe Eigenschaft. Ebenso haben konservative Substitutionen gewöhnlich wenig oder keine Wirkung auf die VEGF-Aktivität des Proteins.
VEGF-Proteine für die Verwendung in der Erfindung, die sich in der Sequenz von natürlich vorkommendem VEGF unterscheiden, können so konstruiert werden, daß sie sich in ihrer Aktivität vom natürlich vorkommenden VEGF unterscheiden. Sie können zum Beispiel so konstruiert werden, daß sie eine höhere VEGF-Aktivität aufweisen. Derartige Vorgehensweisen werden gewöhnlich auf Nukleinsäure-Niveau mittels rekombinanter, aus dem Stand der Technik bekannten Techniken durchgeführt.
Als Alternative zur Verwendung eines VEGF-Proteins wie oben beschrieben, ist es möglich, einen Agonisten zu verwenden. Dies trifft auf alle hier beschriebenen medizinischen Anwendungen, insbesondere die Behandlung von Arteriosklerose zu.
Allgemein ist ein VEGF-Agonist ein Molekül, das an einen Rezeptor bindet, an den VEGF bindet und das im wesentlichen die gleichen Wirkungen hat, was zu VEGF-Aktivität, wie hier beschrieben, führt. Insbesondere kann ein Agonist an die flk-1/KDR oder flt-1-Rezeptoren binden. Agonisten aus der Erfindung werden also sowohl als Agonisten von VEGF als auch von den Rezeptoren, an die VEGF bindet bezeichnet.
Ein VEGF-Agonist kann eine beliebige chemische Struktur aufweisen. Zum Beispiel kann ein VEGF-Agonist ein Peptid oder Polypeptid von beispielsweise bis zu 10, bis zu 20, bis zu 50 oder bis zu 100 Aminosäuren sein. Ein Agonist kann ebenso ein modifiziertes Peptid oder ein Peptoid sein. Es kann jede beliebige geeignete Modifikation durchgeführt werden, einschließlich Glykosylierung, Sulfatierung, C-terminale Amidierung sowie Acetylierung, z. B. N-terminale Acetylierung. Zudem, oder alternativ, können modifizierte Aminosäuren und/oder L-Aminosäuren vorliegen.
Einige bevorzugte Agonisten sind Fragmente von VEGF, die fakultativ gemäß obiger Beschreibung modifiziert wurden und die VEGF-Aktivität aufweisen. Ein besonders bevorzugtes agonistisches VEGF-Fragment besteht aus den Aminosäuren 1 bis 20 (M ... H) der SEQ ID No. 4; dieses Peptid soll laut Ahmed et al, Lab. Invest. (1997) 76: 779 ein Agonist des Flt-1-Rezeptors in humanen Trophoblastzellen sein.
Weitere verwandte Agonisten können auch von der N-terminalen Region von VEGF abgeleitet sein. Peptidagonisten von VEGF können zum Beispiel, in Bezug auf SEQ ID No. 4, den N-Terminus von VEGF (Aminosäure No. 1) enthalten und die Aminosäuresequenz von VEGF bis hin zu einer Aminosäure im Bereich 25 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 oder 50 bis 100 aufweisen. Bevorzugte Agonisten können ebenso von der N-terminalen Region von VEGF abgeleitet sein aber eine gekürzte Version des N-Terminus enthalten. Zum Beispiel können sie, statt an Aminosäure No. 1 in SEQ ID No. 4 zu beginnen, an Aminosäure No. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 der SEQ ID No. 4 beginnen und die Aminosäuresequenz von VEGF bis hin zu einer Aminosäure im Bereich 25 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 oder 50 bis 100 aufweisen.
Peptidagonisten aus der Erfindung können auch von anderen Bereichen der VEGF-Sequenz abgeleitet sein. Zum Beispiel ist ein weiterer bevorzugter Peptidagonist ein Peptid, das aus den Aminosäuren 145 bis 169 (R ... P) der VEGF-189-Sequenz aus SEQ ID No. 6 besteht.
Weitere verwandte Agonisten können auch von dieser Region des VEGF abgeleitet sein. Peptidagonisten von VEGF können zum Beispiel, in Bezug auf SEQ ID No. 6, die Aminosäuresequenz von VEGF von einer Aminosäure im Bereich von 135 bis 155 bis zu einer Aminosäure im Bereich von 160 bis 180 aufweisen. Zum Beispiel können Peptidagonisten, die von dieser Region abgeleitet sind die Sequenz von VEGF von einer Aminosäure im Bereich von 135 bis 140, 140 bis 145 oder 145 bis 150 bis zu einer Aminosäure im Bereich von 160 bis 165, 165 bis 170 oder 170 bis 175 aufweisen.
Peptidfragmente von VEGF gemäß obiger Definition haben bevorzugt eine Gesamtlänge von 10 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 40 oder 40 bis 50 Aminosäuren.
Weitere bevorzugte Agonisten sind Fragmente des HIV Tat-Proteins. Das HIV Tat-Protein imitiert die agonistischen Aktivitäten von VEGF und kann die Angiogenese in Endothelzellen stimulieren indem es über den Flk-1/KDR-Rezeptor wirkt; siehe Albini et al, Oncogene (1996) 12: 289–297, und Nature Medicine (1996) 2 (12): 1321–1375. Es wurde gezeigt, daß Peptide, die von der HIV-1 Tat-Sequenz abgeleitet sind, wie etwa die Aminosäuren 46–60 des HIV-1 Tat-Proteins, das Wachstum und die Migration von Endothelzellen stimulieren; siehe Albini et al, Oncogene (1996) 12: 289–297. Das Peptid, das aus den Aminosäuren 41 bis 65 des HIV-1 Tat-Proteins besteht ist ein weiterer bevorzugter Peptidagonist der Erfindung.
Agonisten aus der Erfindung können auch Aminosäuresequenzen aufweisen, die sich von der des natürlich vorkommenden VEGF auf eine der oben für VEGF-Proteine beschriebenen Weisen unterscheiden, vorausgesetzt ihre agonistischen Eigenschaften werden erhalten.
Handelt es sich bei den Agonisten aus der Erfindung um Peptide, so können sie in vivo von Nukleinsäuresequenzen generiert werden, die sie codieren, um eine Behandlung gemäß der Erfindung durchzuführen. Agonisten-codierende Nukleinsäuren können, wie nachfolgend beschrieben, durch Gentherapie bereitgestellt werden.
Bei Ausführung der Erfindung können VEGF, eine Nukleinsäure, die VEGF codiert oder ein VEGF-Agonist oder eine Nukleinsäure, die einen VEGF-Agonisten codiert einem Blutgefäß, bevorzugt einer Arterie, in beliebiger geeigneter Form zugeführt werden. Nukleinsäuren können in "nackter" Form, ohne mit einem Vektor assoziiert zu sein oder anhand eines Gentherapievektors zugeführt werden. Es wird bevorzugt, sie anhand eines beliebigen geeigneten Gentherapievektors zuzuführen. Insbesondere können virale und nicht-virale Vektoren verwendet werden.
Geeignete virale Vektoren umfassen Adenoviren, Retroviren, pseudotypisierte Retroviren, Herpesviren, Vacciniaviren und Baculoviren. Geeignete nicht-virale Vektoren umfassen Oligonukleotide, Plasmide, Liposomen, kationische Liposomen, pH-sensitive Liposomen, Liposomen-Protein-Komplexe, Immunoliposomen, Liposomen-Protein-Polylysin-Derivate, Wasser-Öl-Emulsionen, Polyethylenimine und Dendrimere. Bevorzugte Vektoren umfassen Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV)-abgeleitete Retroviren, pseudotypisierte vesicular stomatitis virus protein-G (VSV-G)-beinhaltende Retroviren, Adenoviren, Plasmide und Plasmid/Liposomen-Komplexe.
Wenn angebracht können zwei oder mehrere Vektortypen gemeinsam verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Plasmidvektor in Verbindung mit Liposomen verwendet werden. Geeignete Liposomen umfassen beispielsweise die, die Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) oder das kationische Lipid N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA) enthalten.
Virale Vektoren aus der Erfindung sind bevorzugt unschädlich gemacht, z. B. replikationsdefizient. Das heißt ihnen fehlt ein oder mehrere funktionelle Gene, die für ihre Replikation erforderlich sind, was ihre unkontrollierte Proliferation in vivo verhindert und unerwünschte Nebenwirkungen einer viralen Infektion vermeidet. Bevorzugt wird das gesamte virale Genom entfernt mit Ausnahme der minimalen Genomelemente, die für die Verpackung des die VEGF-Nukleinsäure enthaltenden viralen Genoms in die Virushülle oder Capsid erforderlich sind. Zum Beispiel ist es wünschenswert, das gesamte virale Genom mit Ausnahme der Long Terminal Repeats (LTRs) und einem Verpackungssignal zu entfernen. Im Fall von Adenoviren werden Deletionen gewöhnlich in der E1-Region vorgenommen und fakultativ in einer oder mehreren der E2, E3 und/oder E4-Regionen.
Viren aus der Erfindung können mittels jeder beliebigen Technik unschädlich gemacht werden. Zum Beispiel können genomische Deletionen die vollständige Entfernung von Genen, die für die Replikation erforderlich sind, oder nur eine teilweise Entfernung umfassen. Eine vollständige Entfernung wird bevorzugt. Im Allgemeinen werden bevorzugt Gene deletiert, die für die frühe Transkription viraler Gene erforderlich sind.
Replikationskompetente selbstlimitierende oder selbstzerstörende virale Vektoren können ebenso verwendet werden.
Im Allgemeinen wird die in der Erfindung verwendete VEGF-Nukleinsäure in einem Expressionskonstrukt enthalten sein, das ihre Expression in vivo gewährleistet nachdem sie der Arterie zugeführt wurden, bevorzugt durch einen Vektor, wie er oben definiert wurde. Derartige Konstrukte umfassen gewöhnlich einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression der VEGF-Nukleinsäure zu steuern (und fakultativ ein regulatorisches Promotorelement), ein Translationsstartcodon und, funktionsfähig mit dem Promotor verbunden, die VEGF-Nukleinsäure. Diese Komponenten sind bevorzugt in 5'-3'-Richtung angeordnet.
Das Konstrukt kann auch beliebige andere Komponenten umfassen. Zum Beispiel kann das Konstrukt eine Nukleinsäure umfassen, die eine Signalsequenz kodiert, die derart bezüglich der VEGF-Nukleinsäure positioniert ist, daß sie, wenn sie umgeschrieben wird, das exprimierte VEGF-Protein in einen gegebenen Zelltyp oder ein gegebenes Zellkompartiment lenken kann. Jede beliebige derartige Signalsequenz wird gewöhnlich unmittelbar 3' oder unmittelbar 5' von der VEGF-Nukleinsäure positioniert sein, so daß die Signalsequenz und das VEGF-Protein als ein einziges Fusionsprotein, mit der Signalsequenz am C- oder N-Terminus, umgeschrieben werden.
Das Konstrukt kann auch einen Enhancer enthalten, der den vom Promotor erbrachten Expressionsgrad erhöht. Jeder beliebige Enhancer, der die vom gewählten Promotor erbrachte Expression erhöht kann verwendet werden. Zum Beispiel kann im Fall des CMV early Promotors der CMV early Enhancer verwendet werden.
Das Konstrukt kann fakultativ einen Transkriptionsterminator 3' von der VEGF-Nukleinsäure enthalten. Es kann jeder beliebige geeignete Transkriptionsterminator verwendet werden.
Das Konstrukt kann fakultativ ein Polyadenylierungssignal enthalten, das funktionsfähig mit dem 3'-Ende der VEGF-Nukleinsäure verbunden ist.
Das Konstrukt kann fakultativ einen oder mehrere wählbare Markergene, z. B. für Antibiotikaresistenz, enthalten, um die Selektion transformierter Zellen in Kultur zu erlauben. Zum Beispiel können Zellen nach Antibiotikaresistenz in Reihe selektioniert werden.
Das Konstrukt kann fakultativ ein oder mehrere Introns oder andere nicht-codierende Sequenzen, zum Beispiel 3' oder 5' der VEGF-Nukleinsäure, enthalten.
Es kann ein beliebiger Promotor dazu verwendet werden, die Expression der Nukleinsäure aus der Erfindung zu kontrollieren. Allgemein wird es bevorzugt, einen viralen Promotor oder einen Promotor, der für die Funktion in der Spezies des zu behandelnden Subjekts angepaßt ist zu verwenden. Im Fall eines menschlichen Subjekts wird es bevorzugt, virale Promotoren, insbesondere Promotoren, die von Viren stammen, die Menschen infizieren, oder Promotoren, die von menschlichen Genen stammen zu verwenden. Fakultativ kann ein Promotor in Verbindung mit einem beliebigen geeigneten Enhancer verwendet werden.
Wünschenswerterweise wird ein "starker" Promotor verwendet, d. h. ein Promotor, der hohe Expressionsniveaus des VEGF-Proteins aus der Erfindung gewährleistet. Promotoren, die eine Überexpression des VEGF-Proteins erzielen sind wünschenswert. Bevorzugte Promotoren umfassen den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, fakultativ in Verbindung mit dem CMV-Enhancer; den humanen β-Actin-Promotor; den frühen Simian-Virus 40 (SV40)-Promotor; den Rous Sarcoma Virus (RSV)-Promotor; und den retroviralen long terminal repeat (LTR)-Promotor.
Promotoren und andere Konstruktkomponenten sind funktionsfähig mit der VEGF-Nukleinsäure verbunden. Sie sind derart positioniert, daß sie ihre Wirkung auf die Expression der VEGF-Nukleinsäure ausüben können. Zum Beispiel ist, im Fall eines Promotors, der Promotor derart bezüglich der VEGF-Nukleinsäure positioniert, daß er die Expression der VEGF-Nukleinsäure steuern kann. Wünschenswerterweise sind Konstruktkomponenten derart positioniert, daß sie eine maximale Wirkung auf die Expression ausüben können.
Die in der Erfindung verwendeten VEGF-Nukleinsäuren oder Konstrukte können durch ein beliebiges geeignetes, aus dem Stand der Technik bekanntem Mittel in virale Genome integriert werden. Virale Genome können dann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren in Virushüllen oder Capside verpackt werden. Insbesondere kann eine beliebige geeignete Verpackungszelllinie dazu verwendet werden, virale Vektoren für die Verwendung in der Erfindung herzustellen. Diese Verpackungszelllinien komplementieren die replikationsdefizienten viralen Genome aus der Erfindung, da sie, typischerweise in ihre Genome integriert, die Gene umfassen, die in dem replikationsdefizienten Genom deletiert wurden. Die Verwendung von Verpackungszelllinien erlaubt somit die Herstellung viraler Vektoren aus der Erfindung in Kultur. Geeignete Verpackungszelllinien umfassen Derivate von PA317-Zellen, ψ-2-Zellen, CRE-Zellen, CRIP-Zellen, E-82-GP-Zellen, Fliegenzellen, 293-Zellen und 293GP-Zellen.
Im Fall nicht-viraler Vektoren kann die Nukleinsäure durch ein beliebiges geeignetes, aus dem Stand der Technik bekanntem Mittel in die nicht-viralen Vektoren integriert werden.
Nach Wunsch können Vektoren, insbesondere virale Vektoren, so gewählt werden, daß die Integration der Nukleinsäure oder des Konstrukts in das Genom der Zellen des zu behandelnden Subjekts erreicht wird, oder so, daß die Nukleinsäure oder das Konstrukt frei im Cytoplasma gelassen wird. Integrative Vektoren werden bevorzugt.
VEGF-Proteine oder VEGF-Nukleinsäuren für die Verwendung in der Erfindung, die, wie oben beschrieben, bevorzugt mit einem viralen oder nicht-viralen Vektor verbunden sind, können zur Behandlung von Hyperplasie auf beliebige geeignete Weise Arterien zugeführt werden. Zum Beispiel können VEGF oder eine VEGF-codierende Nukleinsäure der Außenwand des Blutgefässes, z. B. Arterie, oder dem Blutgefäßendothel, z. B. dem arteriellen Endothel, beispielsweise über das Lumen zugeführt werden. Lokaler Gentransfer scheint gegenüber der Zuführung von rekombinantem VEGF-Protein von Vorteil, da eingebrachte Komponenten vom Blutfluß und durch die kurze Halbwertszeit schnell weggespült werden.
Einmal bereitgestellt werden die VEGF-Nukleinsäuren aus der Erfindung exprimiert, um VEGF-Proteine zu produzieren, die wiederum die Behandlung oder Prävention der Intimahyperplasie ausführen. Die Expression kann in einem beliebigen Zelltyp oder beliebigen Zelltypen der Blutgefäßwand, z. B. der arteriellen, stattfinden.
Bevorzugt erfolgt die Expression an einem Ort, von dem das exprimierte VEGF in der Lage ist, zum Endothel des Blutgefässes, z. B. der Arterie, zugelangen. Zum Beispiel kann die Expression in den glatten Muskelzellen und/oder im Endothel erfolgen. Am bevorzugtesten findet die Expression zumindest im Endothel des Blutgefässes, z. B. Arterie, statt.
Zum Beispiel können VEGF-Protein oder Nukleinsäure der äußeren Wand des Blutgefässes, z. B. Arterie, durch direkte Injektion in den Bereich um die Stelle der zu behandelnden oder vorzubeugenden Hyperplasie, oder durch Injektion in das Lumen des Blutgefässes, z. B. Arterie, zugeführt werden.
Bevorzugter wird das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure mittels eines außerhalb des Blutgefäß, z. B. Arterie, plazierten Implantats in Nähe der Stelle der zu behandelnden Hyperplasie gebracht. Ein derartiges Implantat enthält das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure oder den Vektor und stellt ein Reservoir des Wirkstoffes bereit. Das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure (bevorzugt in Verbindung mit einem Vektor) kann in das Implantat eingebracht werden, bevor oder nachdem das Implantat in das zu behandelnde Subjekt eingebracht wird. Beispielsweise kann das Implantat in die Umgebung des Blutgefässes eingesetzt werden und das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure anschließend, z. B. durch Injektion, in das Implantat eingebracht werden.
Das Implantat ist bevorzugt in direktem Kontakt zum Blutgefäß, z. B. Arterie, plaziert. Dies ist insbesondere dann bevorzugt, wenn retrovirale Vektoren verwendet werden, um VEGF-Nukleinsäuren zuzuführen, da die physikalische Verformung des Blutgefässes die Proliferation von glatten Muskelzellen induzieren kann, was die Effizienz eines Gentransfers durch retrovirale Vektoren erhöht. Diese Proliferation wird, wie auch die durch die Intimahyperplasie selbst induzierte Proliferation, durch die Zuführung des VEGF-Proteins oder der VEGF-Nukleinsäure behoben oder zumindest verbessert. Es wird ebenso bevorzugt, daß das Implantat in Kontakt mit der Arterie steht, wenn andere Vektoren verwendet werden, die eine erhöhte Gentransfereffizienz aufweisen, wenn ihre Zielzellen proliferieren. Zellproliferation kann zum Beispiel auch die Gentransfereffizienz mit Plasmid/Liposomen-Komplexen erhöhen.
Derartige Implantate können in beliebiger geeigneter Form vorliegen. Das Implantat hat bevorzugt die Form einer Manschette, welche die Arterie teilweise oder ganz, bevorzugt ganz, an oder in Nähe der Stelle der zu behandelnden oder vorzubeugenden Hyperplasie umgibt.
Extravaskulärer Gentransfer vermeidet Verfahren, wie etwa Ballonkatheterisierung oder Hochdruckfluid (bzw. High Pressure Fluid), die zur Verletzung oder Freilegung des Endothels führen können. Die transfizierten Gene werden bevorzugt mittels eines Silastik-Implantats oder eines biologisch abbaubaren Implantats zugeführt, bevorzugt einer Manschette, die neben der äußeren Wand des Blutgefässes und bevorzugt um sie herum plaziert ist. Das Endothel erleidet wenig oder keinen Schaden. Dies ist ein Hauptvorteil von dieser Form des Gentransfers.
Werden Vektoren erfindungsgemäß in einer Manschette direkt auf die Adventitia-Oberfläche eines Blutgefässes aufgebracht, wird enger Kontakt mit der Adventitia bewahrt. In Kaninchenarterien führt eine Manschette allein gewöhnlich innerhalb 7–14 Tagen nach der Operation zur Bildung einer Neointima. Ebenso hält die Manschette eine hohe Vektorkonzentration auf der Adventitia-Oberfläche aufrecht.
Implantate, bevorzugt Manschetten, können aus einem beliebigen geeigneten Material beschaffen sein. Silastik-Implantate, z. B. Implantate, die Silikongummis umfassen sind eine bevorzugte Alternative. Biologisch abbaubare Implantate werden am meisten bevorzugt. Es kann ein beliebiges geeignetes biologisch abbaubares Material verwendet werden.
Im Implantat, z. B. Manschette, kann das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure in beliebiger geeigneter Weise enthalten sein. Die Struktur des Implantats ist bevorzugt so gewählt, daß das VEGF-Protein oder die VEGF-Nukleinsäure in direktem Kontakt mit der Blutgefäßwand gehalten wird. In einer Ausführungsart läßt die Struktur des Implantats einen Raum zwischen der Blutgefäßwand und der Wand des Implantats frei. Im Fall einer Manschette formt das Implantat einen hohlen Behälter um das Blutgefäß. In diesen Raum können VEGF-Nukleinsäuren oder VEGF-Proteine eingeführt werden, so daß sie in Kontakt mit der Blutgefäßwand stehen. Bevorzugt stehen die Enden des Implantats in Kontakt mit der Blutgefäßwand, so daß das Entweichen der VEGF-Nukleinsäure oder des VEGF-Proteins vermieden wird. Die Außenwand der Manschette ist bevorzugt undurchlässig, oder weitgehend undurchlässig, für VEGF-Nukleinsäure oder VEGF-Protein, so daß ihr Entweichen in das umliegende Gewebe vermieden, oder zumindest eingeschränkt, und ihre Zuführung zum Blutgefäß gewährleistet werden.
Fakultativ kann der die VEGF-Nukleinsäure oder das VEGF-Protein enthaltende Raum durch eine oder mehrere Schichten aus einem für VEGF oder VEGF-Nukleinsäure durchlässigen oder semipermeablen Material von der Blutgefäßwand getrennt sein. Dies kann dann erwünscht sein, wenn eine schrittweise Zuführung beabsichtigt ist und die Rate, mit der VEGF-Protein oder VEGF-Nukleinsäure der Blutgefäßwand zugeführt wird begrenzt werden soll.
Fakultativ kann das Implantat, z. B. Manschette, so ausgelegt sein, daß es als eine osmotische Pumpe wirkt.
Fakultativ kann das VEGF in einem, z. B. festen oder gelartigen, Medium in der Manschette enthalten sein. Dies kann helfen, ein Entweichen des VEGF-Proteins oder der VEGF- Nukleinsäure ins Gewebe zu verhindern. In diesem Fall braucht die Außenwand der Manschette nicht mit dem Blutgefäß am Ende des Implantats in Kontakt stehen.
Alternativ können die VEGF-Nukleinsäure oder das VEGF-Protein die Oberfläche des Implantats beschichten, das bei Verwendung in Kontakt mit dem Blutgefäß steht. Anderenfalls können die VEGF-Nukleinsäure oder das VEGF-Protein im gesamten Implantat verteilt sein.
Einige Vorteile der derartigen Verwendung von Implantaten, insbesondere Manschetten, sind (i) sie stellen ein Lieferreservoir bereit, das eine fortwährende Zulieferung erlaubt; (ii) es sind keine intraluminalen Manipulationen erforderlich und das arterielle Endothel bleibt intakt; und (iii) die Verformung durch das Implantat (z. B. Einschnürung im Fall einer Manschette) kann die Effizienz des Gentransfers erhöhen, wie oben beschrieben.
Eine Vorrichtung der Erfindung umfaßt im Allgemeinen einen Körper, der wenigstens einen im wesentlichen undurchlässigen ersten Abschnitt des Körpers umfaßt, der derart gestaltet ist, daß er sich bei Verwendung entlang eines ersten Blutgefässes erstreckt und dies zumindest teilweise umgibt, wobei der erste Abschnitt des Körpers in Längsrichtung beabstandete Dichtungsabschnitte umfaßt, die so ausgelegt sind, daß sie bei Verwendung zur Adventitia-Oberfläche des ersten Blutgefässes hin abdichten, und einen Zwischenabschnitt zwischen den Dichtungsabschnitten, der dazu ausgelegt ist, bei Verwendung den wenigstens einen Wirkstoff zu enthalten und der Adventitia-Oberfläche des ersten Blutgefässes zuzuführen.
Bevorzugte Ausführungsformen erfindungsgemäßer Vorrichtungen werden nachfolgend anhand von Beispielen und in Bezug auf die angefügten Abbildungen beschrieben, in welchen:
1 eine schematische Längsschnittdarstellung einer um ein Blutgefäß gelegenen Vorrichtung aus der Erfindung ist;
2 eine schematische Koronalschnittdarstellung desselben Ausführungsbeispiels entlang der in 1 gezeigten Linie A-A ist;
3 eine schematische perspektivische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer um eine End-zu-End-Anastomose positionierten Vorrichtung zeigt;
4 eine Längsquerschnittdarstellung in der vertikalen Ebene des Ausführungsbeispiels aus 3 ist;
5 eine der 4 ähnliche Darstellung ist, die aber eine modifizierte Form dieses Ausführungsbeispiels zeigt; mit einer alternativen Ausführung seiner Dichtungsabschnitte;
6 eine schematische perspektivische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer um eine End-zu-End-Anastomose positionierten Vorrichtung zeigt;
7 eine Längsquerschnittdarstellung in der vertikalen Ebene des Ausführungsbeispiels aus 6 ist;
8 eine schematische perspektivische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels einer um eine End-zu-End-Anastomose positionierten Vorrichtung zeigt;
9 eine Längsquerschnittdarstellung in der vertikalen Ebene des Ausführungsbeispiels aus 8 ist;
10 eine schematische perspektivische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels einer um eine End-zu-End-Anastomose positionierten Vorrichtung zeigt, die ein teilweise eingebettetes Blutgefäß zeigt; und
11 eine Längsquerschnittdarstellung in der vertikalen Ebene des Ausführungsbeispiels aus 10 ist.
Zur Hintergrunderläuterung: arterielle Bypassgrafts werden allgemein dazu verwendet, den Blutfluß zu Geweben wiederherzustellen oder zu verbessern wenn die nativen Gefäße, gewöhnlich durch Atheroma, verschlossen oder bedeutend stenosiert sind. Ob autologe Venen oder Arterien, oder ein synthetisches Material wie etwa Dacron oder PTFE verwendet werden, werden Grafts allgemein auf einen von drei Wegen an die nativen Gefäße anastomosiert: "End-zu-End" (4); "End-zu-Seit" (7); oder "Seit-zu-Seit" (9). Von diesen Techniken sind die "End-zu-Seit" und "Seit-zu-Seit" sehr viel geläufiger als die "End-zu-End". Die Richtung des Blutflusses ist durch die Pfeile dargestellt.
Die 1 und 2 zeigen Blut 1 innerhalb einer Gefäßwand 2, und eine Adventitiamanschette, die einen durch eine Wand 4, z. B. aus biologisch abbaubarem Material, definierten Hohlraum 3 einschließt. Eine Manschette 5 berührt die Gefäßwand an ihren Enden. Dieses Ausführungsbeispiel kann auf die gleiche Art wie nachstehend für andere Ausführungsbeispiele beschrieben verwendet werden.
Das in den 3 und 4 dargestellte Ausführungsbeispiel wird auf eine End-zu-End-Anastomose angewandt dargestellt. Die Vorrichtung umfaßt einen im Allgemeinen röhrenförmigen Körper 12, der sich bei Verwendung entlang des Blutgefässes erstreckt und dieses umgibt, das durch die End-zu-End-Anastomose eines Grafts 13 an ein natives Blutgefäß 14 gebildet wird.
Wie aus 4 am deutlichsten ersichtlich, ist der Körper 12 der Vorrichtung an seinen entgegengesetzten Enden mit Dichtungsabschnitten 15 versehen, die über die Länge beabstandet sind. Wenn die Vorrichtung bei Verwendung über der Stelle 16 der End-zu-End-Anastomose positioniert ist, dichten diese Dichtungsabschnitte 15 zur Adventitia-Oberfläche des Grafts 13 und des nativen Blutgefässes 14 hin ab. Die Stärke des Materials des Körpers 12 ist an den Dichtungsabschnitten 15 größer als in einem Zwischenabschnitt 17. Folglich, wenn die Dichtungsabschnitte 15 zu den Adventitia-Oberflächen des Grafts 13 und des nativen Blutgefässes 14 hin abdichten, wird zwischen dem Inneren des Körpers 12 der Vorrichtung und den Adventitia-Oberflächen der eingeschlossenen Enden des Grafts 13 und des Gefäßes 14 ein Raum gebildet. Dieser Raum stellt ein abgedichtetes Reservoir 18 dar und wird entlang der Anastomose 16 ausgerichtet gezeigt.
Dieses Reservoir erlaubt es, eine pharmazeutische Formulierung, die einen oder mehrere Wirkstoffe enthält, an der Stelle der Anastomose 16 in Kontakt mit der Adventitia-Oberfläche des Grafts 13 und des Gefäßes 14 zu bringen. Liegt die Formulierung in Form einer Flüssigkeit oder eines Gels vor, so kann sie zum Beispiel mit einer hypodermischen Nadel und Spritze durch die Wand des Körpers 12 in das abgedichtete Reservoir 18 injiziert werden. Die in der Formulierung enthaltenen Wirkstoffe haben vorteilhafterweise eine antiproliferative Wirkung, um der Intimahyperplasie glatter Muskelzellen an der Stelle der Anastomose 16 und an sie angrenzenden Bereichen entgegenzuwirken.
Die pharmazeutische Formulierung braucht nicht in flüssiger oder gelartiger Form vorzuliegen, sie kann beispielsweise eine flüssige Paste sein, die eine zahnpastaähnliche Konsistenz hat. Sie bleibt dann in Kontakt mit der pulsierenden, das Gefäß einengenden Adventitia-Oberfläche, der sie ausgesetzt ist.
Um die Vorrichtung über die Stelle der Anastomose 16 zu positionieren, kann der zylindrische Körper 12 axial über den Graft 13 oder das Blutgefäß 14 geschoben werden, bevor sie anastomosiert werden. Der Chirurg kann dann den Graft 13 und das Gefäß 14 an der Stelle der Anastomose 16 miteinander verbinden und der Körper 12 kann dann über die Stelle der Anastomose 16 zurückgeschoben werden, so daß er die in 4 gezeigte Position einnimmt, um die Abdichtung der Dichtungsabschnitte 15 gegen die entsprechenden Adventitia-Oberflächen zu ermöglichen.
Alternativ kann der Körper 12 der Vorrichtung, wie gezeigt, mit einem länglichen Schnitt 19 über seine gesamte Länge versehen sein. Auf diese Weise kann der Chirurg den Graft 13 und das Gefäß 14 anastomosieren, ohne die Vorrichtung 12 in den Körper des Patienten einzusetzen. Wurde die Anastomose erfolgreich abgeschlossen, so kann der Chirurg einen Körper 12 von geeigneter Größe wählen und ihn um den anastomosierten Graft und das Gefäß anzubringen, indem der flexible Körper 12 entlang dem Schlitz 19 geöffnet und über den anastomosierten Graft und das Gefäß 13, 14 geschoben wird, und dann die entgegengesetzten Längskanten des Körpers am Schlitz 19 miteinander verklebt werden, beispielsweise durch Verwendung eines herkömmlichen "Gewebeklebers", wie etwa dem unter dem Namen Tisseal verkauften Thrombinkleber oder einem Kleber auf Basis von Cyanmethacrylat.
Um die Wirkung der innerhalb des Reservoirs 18 enthaltenen pharmazeutischen Formulierung zu verstärken und ein Entweichen seiner Wirkstoffe in das umliegende Gewebe zu vermeiden, ist der Körper 12 für die Formulierung im wesentlichen undurchlässig. Das Material ist außerdem vorteilhafterweise über einen bestimmten Zeitverlauf biologisch abbaubar, zum Beispiel einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen, in welchem die aktiven Wirkstoffe in der Formulierung voraussichtlich aufgebraucht worden sind. Das Material wird außerdem so gewählt, daß es eine Reaktion des umliegenden Gewebes nicht zu stark begünstigt. Beispiele geeigneter Materialien für den Körper umfassen Gelatine, Alginat oder Kollagen. Diese Materialien erlauben auch eine Flexibilität des Körpers und ermöglichen die Herstellung der Vorrichtung durch Modellieren oder Giessen.
Das Wandmaterial des Körpers 12 kann vorteilhafterweise auch selbstdichtend sein, so daß, wenn ein Einstich mit einer hypodermischen Nadel erforderlich ist, die Integrität des abgedichteten Reservoirs 18 bewahrt wird. Alternativ oder zusätzlich kann jede undichte Stelle in der Wand, die nach Entfernen der Nadel entdeckt wird mit "Gewebekleber" oder ähnlichem verschlossen werden.
Eine Reihe unterschiedlich großer Körper 12 kann dafür bereitgestellt werden, über unterschiedlich große Gefäße angepaßt zu werden. Die Gefäße der unteren Gliedmaßen haben gewöhnlich einen Außendurchmesser von ungefähr 6–8 mm. Herzkranzgefäße haben gewöhnlich einen Außendurchmesser von ungefähr 3–5 mm. Dementsprechend können eine Reihe unterschiedlich großer Körper von ungefähr 3–10 mm Durchmesser in sterilisierten Verpackungen für den Chirurgen erhältlich sein. Außerdem kann die Größe des Körpers verändert werden, um das Volumen des Reservoirs 18 zu beeinflussen. Eine geeignete Größe für das Reservoir 18 ist bis zu 10 ml, bevorzugt 2–5 ml.
Um die Ausdehnung des Blutgefässes 13, 14 durch pulsierenden Blutfluß aufzufangen, können vorteilhafterweise zumindest die Dichtungsabschnitte 15 so gedehnt werden, daß die Ausdehnung der Gefäßwände aufgefangen wird. Es ist äußerst wünschenswert, die Einengung der Gefäßwände durch die Vorrichtung zu vermeiden und zugleich die Dichtungen intakt zu halten.
5 stellt unterschiedliche Dichtungsabschnitte dar. Die Stärke des Materials des Körpers 12 entlang dem Körper ist konstant, und der Zwischenabschnitt 17 ist im Verhältnis zum Innendurchmesser des Körpers 12 an den Dichtungsabschnitten 15 angeschwollen. Beide Dichtungsabschnitte 15 sind mit Enden ausgebildet, die sich in Längsrichtung erstrecken, so daß sie beispielsweise über eine Länge "X", von ungefähr 8–15 mm, in axialer Richtung die jeweiligen Adventitia-Oberflächen des Grafts 13 und des Gefäßes 14 kontaktieren. Diese langen Enden für die Dichtungsabschnitte 15 können so ausgelegt werden, daß sie wie "Klappenventile" funktionieren, um das Reservoir 18 abdichten zu helfen, wenngleich eindeutig kein Fluß durch das Klappenventil erwünscht ist. Alternativ können die Enden nach innen gefaltet sein (nicht gezeigt), um die Dicke des Körpers an seinen Enden zu verdoppeln, so daß Dichtungsabschnitte gebildet werden, deren Stärke größer ist als die des Zwischenabschnitts, ähnlich wie in 4 gezeigt. Um flüssigkeitsdichte Dichtungen zu bilden oder bilden zu helfen kann der Chirurg die Dichtungsabschnitte 15 an den Adventitia-Oberflächen festkleben, beispielsweise indem er einen Klebstoff vom oben erwähnten Typ, zum Beispiel einen "Gewebekleber", verwendet. Dies muß jedoch nicht erforderlich sein. Ist zum Beispiel die Größe des Körpers 12 an den Dichtungsabschnitten 15 so gewählt, daß sie dem Umfang der Gefäße 13, 14 entspricht, ist es nicht erforderlich, einen Klebstoff zu verwenden. Der Chirurg kann sich statt dessen auf den radialen Eingriff zwischen dem Innendurchmesser des Körpers 12 an den Dichtungsabschnitten 15 und dem Durchmesser der Adventitia-Oberflächen stützen. Dies ist insbesondere der Fall für das Ausführungsbeispiel der mit langen Enden versehenen Dichtungsabschnitte aus 5. Die Dichtungsabschnitte sollten jedoch nicht so dicht am Gefäß sein, daß sie dieses einengen.
Die 6 und 7 veranschaulichen ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, die in Verbindung mit einer End-zu-Seit-Anastomose verwendet wird. Diese Bilder zeigen einen Körper 20 mit einem ersten Abschnitt 21 und einem zweiten Abschnitt 22, der in einem Winkel von weniger als 90° daraus abzweigt, so daß ein Y-förmiger Körper gebildet wird. Es ist einsichtig, daß der erste und zweite Abschnitt 21, 22 des Körpers miteinander in anderen Verzweigungswinkeln von über und einschließlich 90° verzweigt sein können, wobei in letzterem Fall der Körper T-förmig ist. Der Chirurg kann vorteilhafterweise über eine Reihe unterschiedlich großer und unterschiedlich geformter Körper verfügen, aus denen er die für Aufbau und Größe der anastomosierten Gefäße bestgeeignete Anordnung wählen kann. Der erste Abschnitt 21 des Körpers kann beispielsweise ungefähr eine Länge von 1–10 cm aufweisen; der zweite Abschnitt 22 des Körpers kann 1–5 cm lang sein.
Der erste Abschnitt 21 des Körpers ist im Allgemeinen röhrenförmig und umgibt in der Darstellung ein natives Blutgefäß 23. Der zweite Abschnitt 22 des Körpers ist auch im Allgemeinen röhrenförmig und umgibt in der Darstellung ein Graft 24, das auf End-zu-Seit-Art an der Anastomosestelle 29 an das native Blutgefäß 23 anastomosiert ist. Wie aus 7 ersichtlich sind die entgegengesetzten Enden des ersten Abschnitten 21 des Körpers mit Dichtungsabschnitten 25 versehen und das äußere Ende des zweiten Abschnittes 22 des Körpers ist mit einem Dichtungsabschnitt 26 versehen. Wie in dem vorherigen Ausführungsbeispiel können diese Dichtungsabschnitte 25, 26 vorteilhafterweise unter Verwendung eines "Gewebeklebers" an die jeweiligen Adventitia-Oberflächen des Blutgefässes 23 und des Grafts 24 geklebt werden.
7 zeigt ein abgedichtetes Reservoir 27, das zwischen dem Inneren des ersten Abschnittes 21 des Körpers und der Adventitia-Oberfläche des Blutgefässes 23 ausgebildet ist. Das Reservoir 27 erstreckt sich ins Innere des zweiten Abschnittes 22 des Körpers. Dieses abgedichtete Reservoir 27 ist somit nach der Anastomosestelle 29 ausgerichtet. In das Reservoir 27 kann vorteilhafterweise unter Verwendung einer hypodermischen Nadel und Spritze eine flüssige pharmazeutische Formulierung injiziert werden, die aktive Wirkstoffe enthält.
Um die Anpassung der Vorrichtung an das Gefäß 23 und den Graft 24 zu erleichtern, kann der Körper 20 der Vorrichtung dem Chirurgen in einer sterilen Verpackung bereitgestellt werden, die zwei symmetrische Hälften beinhaltet, die geschlitz und symmetrisch zum in 7 dargestellten Abschnitt sind. In so einem Fall ist es erforderlich, daß der Chirurg die beiden identischen Körperhälften zusammenfügt, nachdem er den Graft 24 an das Gefäß 23 anastomosiert hat, und die gegenüberliegenden Kanten der identischen Hälften, beispielsweise wie vorhergehend beschrieben durch Verwendung eines Klebers, miteinander verklebt.
Alternativ kann nur der erste Abschnitt 21 des Körpers mit einem Längsschlitz 28 versehen sein, wie in 6 gezeigt. In diesem Fall kann der Chirurg den zweiten Abschnitt 22 des Körpers über das Ende des Grafts 24 schieben. Der Chirurg kann dann das freie Ende des Grafts 24 an das Blutgefäß 23 anastomosieren und dann den zweiten Abschnitt 22 des Körpers an dem Graft 24 herunter zurückschieben, um die Anastomosestelle 29 zu überdecken, wobei er den Schlitz 28 dazu verwendet, das Blutgefäß 23 in die Mitte des ersten Abschnittes 21 des Körpers einzuführen, so daß es von diesem umgeben wird. Der Chirurg kann dann die gegenüberliegenden Längskanten des ersten Abschnittes 21 des Körpers am Schlitz 28 miteinander verkleben, so daß darin das abgedichtete Reservoir 27 gebildet wird.
Es ist einsichtig, daß für die Abschnitte 21 und 22 des Körpers andere Konfigurationen verwendet werden können. Beispielsweise können der erste und zweite Abschnitt 21 und 22 des Körpers jeweils einzeln bereitgestellt werden und erst in situ im Patienten aneinander befestigt werden, um das abgedichtete Reservoir 27 zu bilden.
Die 8 und 9 veranschaulichen ein Ausführungsbeispiel einer für die Verwendung im Fall einer Seit-zu-Seit-Anastomose geeigneten Vorrichtung. Der Körper 30 der Vorrichtung umfaßt in der Darstellung einen ersten Abschnitt 31, von dem ein zweiter und dritter Abschnitt 32, 33 abzweigen. Durch die Verzweigung entsteht ein im Allgemeinen X-förmiger Körper, wie in 8 gezeigt.
Alle drei Abschnitte 31, 32, 33 des Körpers sind im Allgemeinen röhrenförmig. Die Vorrichtung ist im Allgemeinen ähnlich der in den 6 und 7 gezeigten, mit Ausnahme des zusätzlichen dritten Abschnittes 33 des Körpers.
Der erste Abschnitt 31 des Körpers umgibt das verschlossene native Blutgefäß 24 und ist durch Dichtungsabschnitte 35 an dessen Adventitia-Oberfläche befestigt. Der zweite und dritte Abschnitt 32, 33 des Körpers umgeben den Graft 36 und sind an jeweiligen Dichtungsabschnitten 37, 38 an der Adventitia-Oberfläche des Grafts befestigt. Wie in 9 am deutlichsten ersichtlich, ist die Auswirkung der Dichtungsabschnitte 35, 37, 38 die, ein abgedichtetes Reservoir 39 zwischen dem Inneren des Körpers 30 und den Adventitia-Oberflächen der eingeschlossenen Gefäße zu bilden, welches zumindest teilweise mit einer pharmazeutischen Formulierung auf die oben beschriebene Weise gefüllt werden kann.
Um die Anpassung der in den 8 und 9 gezeigten Vorrichtung zu erleichtern, wird die Vorrichtung dem Chirurgen vorteilhafterweise in wenigstens zwei Teilen bereitgestellt. Beispielsweise kann der erste Abschnitt 31 des Körpers getrennt von einer zweiten, einen zweiten und dritten Abschnitt 32, 33 des Körpers umfassenden Komponente, bereitgestellt werden. Durch das Versehen der Abschnitte des Körpers mit Längsschlitzen (nicht gezeigt) können die Abschnitte des Körpers so angepaßt werden, daß sie die Gefäße 34 und den Graft 36 umgeben und können dann entlang diesen Längsschlitzen und miteinander entlang einer Kontaktlinie verklebt werden um das abgedichtete Reservoir 39 um die Anastomosestelle 40 zu bilden.
Die 10 und 11 zeigen eine Abwandlung der in den 8 und 9 gezeigten Vorrichtung (und verwenden für gemeinsame Teile die gleichen Bezugsziffern). Eine besonders geeignete Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist die in der Bypassgraft-Chirurgie an Herzkranzgefässen. In einer derartigen Situation kann das erste Blutgefäß 34, wie gezeigt, eine Koronararterie sein, die teilweise in die Herzwand 50 eingebettet ist. Eine Vorrichtung der in den 8 und 9 gezeigten Form könnte nicht an eine teilweise eingebettete Koronararterie 34 angepaßt werden, da der erste Abschnitt des Körpers sich nicht vollständig um die Arterie 34 ausdehnen könnte. Dementsprechend beschreibt der erste Abschnitt 51 des Körpers 31 in den Ausführungsbeispielen der 10 und 11, wenn er im Querschnitt quer zu seiner Längsachse gezeigt wird, nicht einen vollständigen Kreis; statt dessen ist er im Allgemeinen bogenförmig. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel beschreibt er einen Bogen von annähernd 180°. Dies ermöglicht das Anpassen des ersten Abschnittes 51 des Körpers allein über den freiliegenden Abschnitt der teilweise eingebetteten Koronararterie 34, so daß diese nur teilweise umgeben wird. In dieser Anordnung werden die sich in Längsrichtung erstreckenden Enden 41 des ersten Abschnittes 51 des Körpers vom Chirurgen entweder an die Adventitiawand der Koronararterie 34 oder, wie gezeigt, an die Oberfläche der Herzwand 50 geklebt, beispielsweise durch Verwendung von Gewebekleber.
Die Vorrichtung der 10 und 11 ist auch für andere chirurgische Verfahren geeignet, bei denen das erste Blutgefäß eine Arterie ist, die teilweise in eine Wand des von ihm versorgten Organs eingebettet ist. Solche Organe umfassen Gehirn, Blase und Uterus.
Selbst wenn sich die dargestellten Ausführungsbeispiele auf die Verwendung der Vorrichtung zur Zuführung von Wirkstoffen an Blutgefässe an Anastomosestellen sowie an daran angrenzende Stellen konzentriert haben, so beschränkt sich die Erfindung nicht auf derartige Verwendungen. Die Vorrichtung kann beispielsweise allgemeiner dazu verwendet werden, Wirkstoffe der Adventitia-Oberfläche von nicht-anastomosierten Blutgefässen zuzuführen. Zum Beispiel kann, im Anschluß an eine Ballonangioplastie, eine Vorrichtung der in den 3 bis 5 gezeigten Form um das Äußere einer Arterie im Bereich der Ballonangioplastiestelle plaziert werden, um dorthin einen oder mehrere Wirkstoffe über die Adventitia-Oberfläche der Arterie zuzuführen.
In den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen werden die abgedichteten Reservoirs in Form eines radialen Raumes oder einer Aussparung zwischen der Adventitia-Oberfläche des Blutgefässes und dem Inneren zumindest des ersten Abschnittes des Körpers dargestellt, wobei dieser Raum bei Verwendung zumindest teilweise mit einer pharmazeutischen Formulierung gefüllt ist. Ein derartiger Raum ist jedoch nicht unerläßlich. Zum Beispiel kann, in einem abgewandelten Ausführungsbeispiel, der Körper eine im Allgemeinen undurchlässige flexible Außenschicht und eine flexible Innenschicht aufweisen, die mit der Formulierung beschichtet ist und so ausgelegt ist, daß sie bei Verwendung in Kontakt mit der Adventitia-Oberfläche steht.
Die Außenschicht kann zum Beispiel aus festem Kollagen und die Innerschicht aus dazu quervernetztem schwammähnlichen Kollagen zusammengesetzt sein, wobei die schwammähnliche Schicht mit der pharmazeutischen Formulierung beschichtet sein kann, die den zuzuführenden Wirkstoff enthaltet. In einer derartigen Situation kann die Vorrichtung dem Chirurgen zur Anpassung bereits mit der Formulierung beschichtet bereitgestellt werden oder sie kann nach Anpassung mit der Formulierung befeuchtet werden, beispielsweise indem sie wie vorhergehend beschrieben injiziert wird.
Alternativ kann der Wirkstoff auf eine Innenfläche des Körpers aufgetragen werden, die bei Verwendung gerade mit dem Blutgefäß in Kontakt steht.
Wünschenswerterweise sollte der Körper der Vorrichtung fest genug sein, um Drehkräften zu widerstehen. Zu diesem Zweck kann der Körper zum Beispiel aus einer Innenschicht, z. B. einem Kollagenfilm, oder aus Längs-, Quer- oder spiralförmigen Lamellen geformt sein. Es können Lamellen bereitgestellt werden, die das Reservoir in Fächer unterteilen und zusätzliche Stabilität verleihen.
Die Proteine oder Nukleinsäuren können zur Behandlung oder Prävention von Intimahyperplasie infolge jedweder klinischer Umstände verwendet werden. Zum Beispiel ist es möglich, eine Intimahyperplasie zu behandeln, die infolge jedweder Art klinischen Eingriffes entstanden ist, einschließlich Angioplastie, zum Beispiel Ballonangioplastie; Bypaßchirurgie, wie etwa koronare Bypaßchirurgie, bei der eine Vene an eine Arterie anastomosiert wird; andere Anastomoseverfahren, zum Beispiel Anastomose in den Beinen; und Endarteriektomie, zum Beispiel Endarteriektomie der Halsschlagader. Es ist auch möglich, Intimahyperplasie in Verbindung mit arterieller Schädigung zu behandeln, zum Beispiel Bluthochdruck der Lungenarterien. Die Erfindung läßt die Behandlung von Intimahyperplasie in jedweder Art von Blutgefäß zu, z. B. in einer Arterie oder Vene, bevorzugt einer Arterie.
Gemäß der Erfindung ist es möglich, eine festgestellte Intimahyperplasie zu behandeln oder zu verbessern oder dem Auftreten einer Intimahyperplasie vorzubeugen. Ebenso ist es möglich, die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Intimahyperplasie zu verringern, oder den Grad einer festgestellten Intimahyperplasie oder einer potentiell auftretenden Intimahyperplasie zu verringern. Die Behandlung gemäß der Erfindung kann vor, während oder nach einem chirurgischen Eingriff erfolgen, zum Beispiel um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Hyperplasie nach dem Eingriff zu verringern.
Vorzugsweise werden die VEGF-Nukleinsäure oder das VEGF-Protein in der Absicht verabreicht, einer De-novo-Stenose vorzubeugen oder sie zu behandeln. Sie können jedoch auch verwendet werden, um eine Restenose zu behandeln oder ihr vorzubeugen.
Die Proteine oder Nukleinsäuren aus der Erfindung werden bevorzugt in Form einer pharmazeutischen Formulierung verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Es kann eine beliebige geeignete pharmazeutische Formulierung verwendet werden.
Zum Beispiel können geeignete Formulierungen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen einschließen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika, bakterizide Antibiotika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Stellmittel und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Unit-Dose oder in Multi-Dose Verpackungen, zum Beispiel versiegelten Ampullen und Phiolen, dargereicht werden und können in gefrorener oder gefriergetrockneter (lyophilisierter) Form gelagert werden, und erfordern allein die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Wasser für die Injektion, unmittelbar vor Gebrauch.
Es sollte klar sein, daß Formulierungen dieser Erfindung, neben den oben ausdrücklich erwähnten Inhaltsstoffen, auch andere, aus dem Stand der Technik schon bekannte Wirkstoffe umfassen können, jeweils mit Bezug zur betrachteten Formulierung. Von den möglichen Formulierungen werden sterile pyrogenfreie wäßrige und nicht-wäßrige Lösungen bevorzugt.
Die Proteine, Nukleinsäuren und Vektoren können in beliebiger geeigneter Dosierung und mittels eines beliebigen geeigneten Dosierungsbereichs verabreicht werden. Der Fachmann versteht, daß die Dosierung und der Bereich so angepaßt werden können, daß eine optimale Behandlung der zu behandelnden gegebenen Bedingung, abhängig von zahlreichen Faktoren, gewährleistet wird. Einige dieser Faktoren können das Alter, das Geschlecht und der klinische Zustand des zu behandelnden Subjekts sein.
Für die Zuführung nackter VEGF-codierender Nukleinsäuren oder von Konstrukten, die derartige Nukleinsäuren enthalten sind typische Dosierungen von 0.1 bis 5000 μg, zum Beispiel 50–2000 μg, wie etwa 50–100 μg, 100–500 μg oder 500–2000 μg pro Dosis. Für die Zuführung von VEGF-Protein schließen geeignete Dosierungen Dosen von 1 bis 1000 μg, zum Beispiel von 1 bis 10 μg, von 10 bis 100 μg, von 100 bis 500 μg oder von 500 bis 1000 μg ein.
Die für die Zuführung von VEGF-Nukleinsäuren mittels viraler oder nicht-viraler Vektoren verwendete Dosierung ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich der Effizienz mit der die Vektoren VEGF-Nukleinsäuren an Zellen liefern, und der Effizienz mit der die VEGF-Nukleinsäuren in den Zellen exprimiert werden.
Zum Beispiel können virale Vektoren in Dosen von 10⁴ bis 10¹⁴ cfu oder pfu/ml, zum Beispiel 10⁴ bis 10⁶, 10⁶ bis 10⁸, 10⁸ bis 10¹⁰, 10¹⁰ bis 10¹², oder 10¹² bis 10¹⁴ cfu oder pfu/ml zugeführt werden. Dosen im Bereich von 10⁵ bis 10⁹ cfu oder pfu/ml werden bevorzugt. Die Bezeichnung pfu(plaque-forming unit) wird auf bestimmte Viren, Adenoviren inbegriffen, angewandt und entspricht der Infektiosität einer Viruslösung, und wird durch die Infektion einer geeigneten Zellkultur und die Messung, im Allgemeinen nach 48 Stunden, der Anzahl an Plaques der infizierten Zellen bestimmt. Die Bezeichnung cfu (colony-forming unit) wird auf andere Viren, Retroviren inbegriffen, angewandt und durch im Stand der Technik bekannte Mittel, im Allgemeinen nach einer 14-tägigen Inkubation mit einem selektierbaren Marker bestimmt. Die Techniken zur Bestimmung der cfu-oder pfu-Titer einer Viruslösung sind im Stand der Technik bekannt.
Für Retroviren werden Dosierungen im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ cfu/ml besonders bevorzugt. Für pseudotypisierte Retroviren werden Dosierungen im Bereich von 10⁷ cfu/ml besonders bevorzugt. Für Adenoviren werden Dosierungen im Bereich von 10⁹ pfu/ml besonders bevorzugt.
Ebenso können solche Dosen für die schrittweise Zuführung in Implantaten der Erfindung enthalten sein.
VEGF-Nukleinsäuren in Verbindung mit nicht-viralen Vektoren können auch in beliebiger geeigneter Dosierung, mittels eines beliebigen Verabreichungsmittels wie oben beschrieben zugeführt werden, oder schrittweise durch ein Implantat. Geeignete Dosen sind typischerweise 0.1 bis 1000 μg Nukleinsäure, zum Beispiel 1 bis 100 μg, 100 bis 500 μg oder 500 bis 1000 μg, 1000 bis 2000 μg, 2000 bis 3000 μg oder 3000 bis 5000 μg. Bevorzugte Dosen liegen im Bereich von 5 bis 50 μg, zum Beispiel 10 bis 20 μg.
Die Dosierungsschemen variieren außerdem in Abhängigkeit von beispielsweise dem Verabreichungsweg und der Art und Beschaffenheit des Behältnisses. Es sind jedoch Single-Dosen und Multi-Dosen vorgesehen, die sich über Tage, Wochen oder Monate erstrecken. Außerdem kann die Zuführung von VEGF-Proteinen und Nukleinsäuren, wie oben erläutert, mittels eines Implantats erfolgen, das um ein Blutgefäß, bevorzugt eine Arterie angepaßt werden kann; das Implantat hat vorzugsweise Manschettenform. Ein derartiges Implantat wird eine schrittweise Zuführung bewirken. Die Zuführung kann beispielsweise über Stunden, Tage, Wochen oder Monate erfolgen.
Proteine und Nukleinsäuren der Erfindung können in beliebiger Verabreichungsform verabreicht werden, zum Beispiel durch topische, kutane, parenterale, intramuskuläre, subkutane oder transdermale Verabreichung, oder durch direkte Injektion in den Blutstrom, direkte Injektion in oder um die Arterienwand oder durch direkte Applikation auf die Schleimhäute. Die Verabreichung erfolgt bevorzugt mittels eines Implantats, wie oben beschrieben.
Die Proteine, Nukleinsäuren und Vektoren der Erfindung können zur Behandlung von Intimahyperplasie in einem beliebigen Säugetier verwendet werden. Die Behandlung von menschlichen Patienten wird bevorzugt.
Die Implantate der Erfindung, insbesondere Implantate in Manschettenform, wie oben beschrieben, können auch dazu verwendet werden, andere Wirkstoffe als VEGF Blutgefässen, z. B. Arterien, zuzuführen. Ein beliebiger Wirkstoff kann auf diesem Weg zugeführt werden, um ein beliebiges erwünschtes therapeutisches Ziel zu erreichen.
Es wurde beobachtet, daß Plasmid/Liposomen-Komplexe, MMLV-Retroviren, VSV-G Retroviren und Adenoviren zur Expression in mit Manschetten eingefaßten Arterien führen. Die Gentransfereffizienz war mit Adenoviren am höchsten, und pseudotypisierte VSV-G-Retroviren erzielten ebenfalls eine relativ hohe Transfektionseffizienz. Der Nutzen von replikationsdefizienten VSV-G-Retroviren im arteriellen Gentransfer wurde zuvor noch nicht gezeigt. Eine Expression wurde in einigen Endothelzellen der Adenovirus-infizierten Arterien gesehen. Da ein Vordringen von der Adventitia zur Intima erfolgt war, heben diese Ergebnisse die generelle Möglichkeit hervor, die Endothelfunktion bei menschlichen Erkrankungen durch extraluminalen Gentransfer unter der Verwendung anderer Gene als VEGF zu verändern. Dies kann auch bei der Expression diffusionsfähiger oder sezernierter Genprodukte in der Adventitia und im Außenmedium von Nutzen sein, die dann an anderer Stelle in der Arterienwand wirken. Vorzugsweise bewirkt eine derartige Zuführung die Behandlung einer Intimahyperplasie, wie oben definiert, sie kann jedoch auch weitere oder alternative therapeutische Ziele verfolgen.
Vorzugsweise liegen die therapeutischen Wirkstoffe in Form einer Nukleinsäure vor, die ein pharmazeutisch aktives Polypeptid oder Protein codiert. Bevorzugter ist diese Nukleinsäure, wie oben definiert, in einem Konstrukt enthalten. Noch bevorzugter wird die Nukleinsäure oder das Konstrukt der Arterie, wie oben definiert, mittels eines Vektors, zum Beispiel mittels eines viralen oder nicht-viralen Vektors, zugeführt.
Extraarterieller Gentransfer kann also für die Zuführung von genetischem Material in die Wand von Blutgefässen, bevorzugt Arterien, verwendet werden. Aus den Bespielen ist ersichtlich, daß Veränderungen der medialen glatten Muskelzellen (SMC) und selbst Endothelveränderungen von der Adventitiaseite erreicht werden können, was die Entwicklung neuer Methoden zur Behandlung der Erkrankung von Blutgefässen, z. B. arterieller Blutgefässe, erlaubt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

BSA –	Bovines Serumalbumin
DMEM –	Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium
FCS –	Fetales Kälberserum
HUVEC –	humane umbilikale venöse Endothelzellen
IgG –	Immunglobulin G
MAP kinase –	Mitogenaktivierte Proteinkinase
mAk –	monoklonaler Antikörper
PBS –	Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PGI₂ –	Prostazyklin
cPLA₂ –	cytosolische Phospholipase A₂
PIGF –	Plazenta-Wachstumsfaktor
SDS PAGE –	Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
VEGF –	vascular endothelial growth factor
vWF –	von Willebrand Faktor
VSMC –	glatte Gefäßmuskelzellen (= vascular smooth muscle cells)

Beispiel 1
Die Wirkung von Endothelzell (EC)-spezifischem VEGF-Gentransfer auf eine Intimaverdickung wurde untersucht, indem eine um Halsschlagadern eingesetzte Silikonmanschette verwendet wurde, die sowohl als der Gegenstand fungiert, der das Wachstum der intimalen glatten Muskelzellen bewirkt, als auch als ein Reservoir für Gen und Vektor. Das Modell bewahrte die Integrität der EC und erlaubte einen direkten extravaskulären Gentransfer ohne jegliche intravaskuläre Manipulation.
Beispiel 1.1
Gentransfer: Eine Intimaverdickung wurde in den Halsschlagadern von zweiunddreißig New Zealand White Kaninchen durch Einsetzen, unter Vollnarkose, einer inerten Silikonmanschette um die Arterien induziert (Booth et al, Atherosclerosis (1989) 76: 257–268). Fünf Tage nach Einsetzen der Manschette wurde der Gentransfer durch vorsichtiges Öffnen der Manschette unter Narkose und Injektion von 500 μl Plasmid/Liposomen-Komplexe in die Manschette (d. h. auf die Adventitia-Oberfläche der Arterie) vorgenommen. In keinem der Versuchsschritte waren intravaskuläre Manipulationen erforderlich.
Plasmid/Liposomen-Komplexe: 25 μg pCMVS-VEGF-164 Plasmid, das cDNA von Maus-VEGF enthält (Breier et al., Development (1992) 114: 521–532; Nukleotide 1–583) wurde mit 25 μl Lipofektin (BRL) complexiert und mit Ringer-Lösung auf 500 μl verdünnt. Die Komplexe wurden vor dem Gentransfer mindestens 15 min bei Raumtemperatur belassen. Es wurde zuvor bestimmt, daß Plasmid/Lipofektin-Komplexe in einer Konzentration, wie sie in der vorliegenden Studie verwendet wird, für Aortenendothelzellen des Kaninchens in vitro nicht toxisch sind. Kontrollarterien wurden mit einem ähnlichen Plasmid/Liposomen-Komplex transfiziert, der ein E. coli lacZ cDNA-Expressionsplasmid (Kalnins et al, siehe oben) (Nukleotide 1–3100) enthält. Die für die Studie verwendeten Plasmide wurden aus E. coli-Kulturen (DH5α) mittels Qiagen Mega Säulen isoliert und durch drei Phenol/Chloroform-Extraktionen und eine Ethanolpräzipitation gereinigt (Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1991) 4.2.3–4.2.4), auf 1 μg/μl gebracht und daraufhin untersucht, daß sie frei von mikrobiologischen oder Endotoxinkontaminationen sind (Limulus-Assay, Detektionsgrenze 0.2 ng). Die Tiere wurden 3 (n = 8), 7 (n = 12) und 14 (n = 12) Tage nach dem Gentransfer geopfert; die Arterien wurden vorsichtig entnommen und in drei gleiche Abschnitte geteilt: das proximale Drittel wurde 15 min in 4% Paraformaldehyd/PBS immersionsfixiert und in OCT-Compound (Miles Scientific) (Ylä-Herttuala et al: J. Clin. Invest. (1995) 95: 2692–2698) eingebettet. Das mittlere Drittel wurde wie oben 4 Stunden fixiert, 48 Stunden in 15% Saccharose gewaschen und in Paraffin eingebettet. Das distale Drittel wurde direkt in OCT-Compound eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das distale Drittel von vier Arterien wurde für die Isolierung der mRNA und RT-PCR verwendet (siehe unten). Zehn zufällig gewählte Abschnitte des Mittelstücks wurden für die Bestimmung des Verhältnisses Intima/Media-Dicke (Ylä-Herttuala et al (1986) 6; 230–236) durch zwei unabhängige Beobachter ohne Wissen der Herkunft der Proben verwendet. Die Mittelwerte der zwei unabhängigen Messungen wurden zur Berechnung der Ergebnisse verwendet (Mittel ± SD). Unterschiede in den Verhältnissen Intima/Media-Dicke zwischen den beiden Gruppen wurden mittels ANOVA analysiert, gefolgt von einem modifizierten t-Test (* p < 0.05).
RT-PCR: Die 7 Tage nach dem Gentransfer entnommenen distalen Abschnitte der VEGF (n = 2) und lacZ (n = 2) transfizierten Arterien wurden für die Isolierung der mRNA verwendet (Micro-Fast Track, Invitrogen) und wurden unter Verwendung von AMVL Reverser Transkriptase (5U pro Reaktion, Boehringer) und Random Hexamer-Primern (cDNA cycle Kit, Invitrogen) wie beschrieben (Hiltunen et al: Circulation (1995) 92: 3297–3303) in einzelsträngige cDNA revers transkribiert. Eine PCR mit 35 Zyklen wurde mit Taq Polymerase (Boehringer) und mit für das transfizierte pCMV5-VEGF-164-Konstrukt spezifischen Primern (5'-Primer: SEQ ID No. 9; 3'-Primer SEQ: ID No. 10; Parameter der PCR-Zyklen: 1 min 90°C, 1 min 60°C; 1 min 72°C, ausgenommen dem letzten Reaktionszyklus 5 min) vorgenommen. Ein amplifiziertes Fragment mit einer erwarteten Länge (547 nt) war in den VEGF-transfizierten Arterien zu sehen. DNA-Molekulargewichtsmarker (1 kb-Leiter, BRL) werden auf beiden Seiten des Gels gezeigt.
Es wurden Mikrographien genommen, welche die Eigenschaften der Halsschlagadern der Kaninchen 7 Tage nach VEGF- oder lacZ-Gentransfer zeigen. Immunfärbungen der transfizierten Arterien zeigten: Die Kontrollarterie, die mit lacZ-Plasmid/Liposomen transfiziert wurde (SMC-spezifischer MAk HHF-35, 1 : 500 Verdünnung, Enzo Diagnostics) zeigte eine typische Intimaverdickung. Die mit VEGF-Plasmid/Liposomen transfizierte Arterie (SMC-spezifischer MAk HHF-35) zeigte nur eine begrenzte Intimaverdickung; In allen untersuchten Gefäßabschnitten lag Endothel vor (Serienschnitt zu A, EC-spezifischer MAk CD31, 1 : 50 Verdünnung, DAKO); Es war kein Anzeichen einer Inflammation in VEGF- und lacZ-transfizierten Arterien zu erkennen (Makrophagen-spezifische MAk RAM-11, 1 : 500 Verdünnung, DAKO); 14 Tage nach dem Gentransfer war eine Neovaskularisation in der Adventitia der VEGF-transfizierten Arterien zu sehen (Hämatoxylin-Eosin-Färbung).
Das Avidin-Biotin Meerrettich-Peroxidase-Verfahren (Vector Elite, Vector Labs) wurde für die Immunfärbungen verwendet (Ylä-Herttuala et al, PNAS (1990) 87: 6959–6963). Kontrollen für die Immunfärbungen umfaßten Inkubationen mit irrelevanten klassen- und speziesangepaßten Immunglobulinen und Inkubationen, bei denen die primären Antikörper ausgelassen wurden. In situ-Hybridisierungen wurden unter Verwendung einer anti-sense VEGF-Riboprobe (583 nt) vorgenommen, die aus pBluescript SK-Plasmid (Stratagene) wie beschrieben (Ylä-Herttuala et al (1990), siehe oben) synthetisiert wurde. In Paraffin eingebettete Schnitte werden mit Proteinase K vorbehandelt, acetyliert und unter Verwendung von 35-S-UTP (DuPont, NEN)-markierten Riboproben (6 × 10⁶ cpm/ml) bei 52°C 16 Stunden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde abschließend mit 0.1 × SSC bei 60°C 30 min gewaschen. Die Signalerkennung geschah mittels Autoradiographie (Eastman-Kodak NAB-2). Kontrollhybridisierungen mit einer nicht-hybridisierten sense-Riboprobe (Ylä-Herttuala et al (1990), siehe oben) ergaben negative Ergebnisse. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Beispiel 1.2
Der Gentransfer wurde wie in Beispiel 1.1 beschrieben vorgenommen. Den Kaninchen wurde einen Tag vor dem VEGF (n = 5) oder lacZ (n = 5) Gentransfer beginnend L-NAME (70 mg/kg/Tag) mit dem Trinkwasser verabreicht. Die Tiere wurden 7 Tage nach dem Gentransfer geopfert und wie oben beschrieben hinsichtlich dem Verhältnis Intima/Media-Dicke und der Histologie analysiert (Ylä-Herttuala et al, Arteriosclerosis (1986) 6: 230–236; Ylä-Herttuala et al (1990), siehe oben). Der Unterschied in der Intimaverdickung war aufgehoben.
Beispiel 1.3
Konfluente Kulturen von HUVEC wurden zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und mit diesem Medium entweder 15 min mit den angegebenen Konzentrationen an rekombinantem humanen VEGF oder die angegebenen Zeiten mit 10 ng/ml VEGF inkubiert. In einigen Versuchen wurden die Zellen 1 Stunde mit 100 μM L-NAME vorbehandelt und dann 10 min entweder mit oder ohne 10 ng/ml VEGF behandelt. Das Medium wurde entfernt und die Zellen schnell bei 4°C durch Zugabe von 10 mM Tris/HCl (pH 7.6), 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 30 mM Natriumpyrophosphat, 50 mM NaF, 0.1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF und 1% Triton X-100 (Lysepuffer) lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation 10 min bei 15000 × g geklärt, und Immunpräzipitationen wurden durch Inkubation der geklärten Lysate mit PY20 Anti-Phosphotyrosin mAk für 2 Stunden bei 40°C vorgenommen. Die Immunpräzipitate wurden gewonnen, indem die Lysate eine weiter Stunde mit Protein A-Agarose inkubiert wurden. Die Immunpräzipitate wurden dreimal mit Lysepuffer gewaschen und die Proteine dann mit 2 × SDS-PAGE Probenpuffer extrahiert. Nach der SDS-PAGE wurden die immunpräzipitierten Proteine auf Membranen übertragen und dann mit PY20 mAk immungeblottet. Dies zeigt, daß VEGF die Phosphorylation eines 205 kDa Hauptproteins induziert, das dem VEGF-Rezeptor entspricht (hauptsächliche tyrosinphosphorylierte Proteine an 100, 125, 145, 190 und 205). L-NAME hebt die Antwort auf VEGF auf.
Rekombinantes VEGF wurde in einer Konzentration von 25 ng/ml für Zeiten bis zu 2 Stunden (die Nitritproduktion wurde vom Intimaniveau von c. 16 μM erhöht und bei 1.8–2 μM gehalten) oder in den angegebenen Konzentrationen von 0, 2.5, 25 ng/ml für 10 min zugegeben. Die Wirkung von einer Vorbehandlung (1 Stunde) mit L-NAME (100 μM) auf die VEGF-Antwort wurde nach Zugabe von 25 ng/ml VEGF für 10 min gemessen. Die Nitritproduktion wurde mittels einem kapillaren Detektionsverfahren (Leone et al, in Methods in Nitric Oxide Research, Feelisch und Stanler, eds. John Wiley & Sons, New York (1996) 499–508) bestimmt. Das Niveau erhöhte sich auf c. 19 und c. 2.1 μM in Gegenwart von VEGF; es wurde durch Zugabe von L-NAME auf das Kontrollniveau (c. 17 μM) reduziert.
Ergebnisse: Es wurde gezeigt, daß im Vergleich zu lacZ-transfizierten Arterien, VEGF-Gentransfer die Intimaverdickung eine Woche nach der Operation deutlich reduzierte (Intima/Media-Verhältnis 0.3 vs 1.1, < 0.05). Die Wirkung war nach zwei Wochen geschwächt, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, daß der Gentransfer über Plasmid/Liposomen typischerweise nur eine zeitweise Expression des transfizierten Gens bewirkt, mit einer maximalen Proteinexpression zwischen 2 und 3 Tagen nach dem Gentransfer (Nabel et al, Ann. Rev. Physiol. (1994) 56: 741–761).
Die immunhistochemische Analyse der Arterien zeigte, daß die Intimaverdickung fast ausschließlich aus SMC bestand. In allen untersuchten Abschnitten lag eine Endothelschicht vor. Keine Nebenwirkungen noch Inflammation wurden in den transfizierten Arterien aufgezeigt.
Die Expression des transfizierten VEGF wurde durch RT-PCR mit für das Transgen spezifischen Primern und durch in situ-Hybridisierung bestätigt. Die Expression von VEGF und lacZ erfolgte größtenteils in der Adventitia und im Außenmedium in Fibroblasten und SMCs. Eine Neovaskularisation der Adventitia war 14 Tage nach dem Gentransfer in drei der VEGF-transfizierten Arterien zu sehen. Keine Neovaskularisation war in lacZ-transfizierten Arterien zu sehen.
Es wurde gezeigt, daß der lacZ-Plasmid/Liposomen-Gentransfer mittels dem Manschettenmodell zu einem lokalen Gentransfer in 0.05% der arteriellen Zellen führt. Trotz der geringen Gentransfereffizienz führt die in der Manschette produzierte sezernierte Form von VEGF zu biologischen Wirkungen in der lokalen arteriellen Mikroumgebung, wie durch das Vorliegen von Neovaskularisation in drei VEGF-transfizierten Arterien 14 Tage nach dem Gentransfer gezeigt. Wie bei akuter Hypoxie wird angenommen, daß das sezernierte VEGF die EC durch Diffusion erreicht und an VEGF-Rezeptoren auf EC bindet.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die inhibitorischen Wirkungen von VEGF auf die Intimaverdickung entweder auf eine(n) direkt oder indirekt VEGF-induzierten EC-abstammenden Faktor oder Aktivität zurückzuführen seien, der (die) seinerseits (ihrerseits) die SMC-Proliferation inhibieren kann. Insbesondere wurde die Hypothese aufgestellt, daß die Wirkungen von VEGF auf die Intimaverdickung über den NO-pathway vermittelt werden. Diese Hypothese wurde in einer Untergruppe New Zealand White Kaninchen (n = 8) getestet, indem den Tieren während der Gentransferversuche NO-Synthaseinhibitor L-NAME verabreicht wird. Es wurde gezeigt, daß L-NAME den Unterschied in der Intimaverdickung zwischen VEGF- und lacZ-transfizierten Arterien aufhebt. Die Hauptzielzellen für VEGF in der Arterienwand sind EC. Die einzigen anderen Zelltypen, die VEGF-Rezeptoren besitzen, sind Monozyten, wie aber aus Immunzytochemie mit spezifischen Antikörpern geschlossen werden konnte, liegen unter diesen Bedingungen keine Monozyten in den mit Manschetten versehenen Halsschlagadern vor.
Diese Ergebnisse (die Fähigkeiten zur unterschiedlichen Intimaverdickung) waren mit der VEGF-induzierten Inhibition der Intimaverdickung durch die Stimulierung der NO-Produktion vereinbar. Es wurde somit untersucht, ob VEGF die NO-Produktion in EC-Kulturen direkt stimulieren kann. VEGF induziert im Konzentrationsbereich 1–25 ng/ml die Tyrosinphosphorylation eines 205 kDa Hauptproteins, das dem VEGF-Rezeptor entspricht. Die Zugabe von VEGF zu humanen umbilikalen venösen Endothelzellen (HUVEC) in Kultur bewirkte, wie durch Messung des Nitritniveaus überwacht, einen zeit- und konzentrationsabhängigen Anstieg der NO-Produktion. Die Wirkung von VEGF auf die NO-Produktion war bereits 30 Sekunden nach der Zugabe von VEGF zu sehen, erreichte ein Maximum nach 5 min und hielt bis zu 2 Stunden an. Die halbmaximale Wirkung von VEGF wurde bei 5 ng/ml erreicht. Die VEGF-induzierte Phosphorylation und NO-Produktion wurden in Gegenwart von 100 μM L-NAME vollständig aufgehoben. Wahrscheinlich stimuliert der VEGF-Gentransfer die NO-Produktion in EC in den transfizierten Arterien und schränkt die SMC-Proliferation zumindest teilweise über einen NO-vermittelten Mechanismus ein. Diese Schlüsse stimmen mit den früheren Beobachtungen überein, daß die Transfektion von Arterien mit der cDNA der endothelialen NO-Synthase die Intimaverdickung verringert (Von der Leyon et al, PNAS (1995) 92: 1137–1141).
Callow et al (siehe oben) und Asahara et al (siehe oben) kamen zu dem Ergebnis, daß die Verabreichung von VEGF-Protein die EC-Proliferation in freigelegten Arterien stimuliert, aber die aktuellen Mechanismen, die bei der Inhibition der Intimaverdickung mitwirken, wurden nicht untersucht. In der mit Manschette versehenen Halsschlagader ist die Intimaverdickung in Gegenwart eines anatomisch intakten Endothels stimuliert. Deshalb ist es unwahrscheinlich, daß die inhibitorische Wirkung von arteriellem VEGF-Gentransfer auf die hier berichtete Intimaverdickung auf eine VEGF-stimulierte Reendothelisierung zurückzuführen ist. Gemäß diesen Ergebnissen kann VEGF die NO-Produktion in HUVEC direkt stimulieren, so daß dies ein Mechanismus ist, durch den VEGF die Intimaverdickung inhibieren kann. VEGF kann auch die Produktion anderer Faktoren stimulieren, welche die SMC-Proliferation negativ regulieren können, einschließlich TGF-β oder Prostazyklin.
Beispiel 2
Unter Verwendung von Plasmid/Liposomen-Komplexen für den Gentransfer, werden Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV)-abgeleitete Retroviren, pseudotypisierte vesicular stomatitis virus protein-G (VSV-G)-beinhaltende Retroviren und Adenoviren mit einer an die Adventita angelegten Silastik-Manschette in die Halsschlagader von Kaninchen verabreicht. Die Manschette wird deshalb verwendet, weil 1) sie ein Reservoir für den Gentransfer bietet; 2) keine intraluminalen Manipulationen vorgenommen werden und das Endothel durchwegs anatomisch intakt bleibt; und 3) das Einsetzen der Manschette die Proliferation der arteriellen glatten Muskelzellen (SMC) induziert und die Effizienz des retroviralen Gentransfers erhöht, wo eine Proliferation der Zielzellen erfordert ist.
Gentransfer: Es werden New Zealand White Kaninchen (1.8–2.5 kg) verwendet. Das Narkotikum war Fentanyl-Fluanison (0.3 ml/kg)/Midazolam (1 mg/kg) (Ylä-Herttuala et al, J. Clin. Invest. (1995) 95: 2692–2698). Eine mediale Inzision in den Hals legt die linke Halsschlagader frei. Eine biologisch inerte 2 cm Silastikmanschette (MediGene Oy, Kuopio, Finnland) wurde so um die Halsschlagader positioniert, daß sie die Adventitia an jedem Ende leicht berührt (Booth et al, siehe oben). Der Gentransfer wurde 4–5 Tage nach dem Eingriff zum Einsetzen der Manschette vorgenommen. Für den Gentransfer wurden die Tiere erneut betäubt. Die Manschette, die operativ frei gelegt worden ist, wurde vorsichtig geöffnet und mit 500 μl der Gentransferlösung (siehe unten) gefüllt. Die Inzision wurde verschlossen und die Arterien später auf die Gentransfereffizienz hin untersucht.
Histologische Untersuchung: Die mit Manschetten versehen Arterien wurden vorsichtig entnommen und in drei gleiche Abschnitte geteilt: das proximale Drittel wurde 15 min in 4% Paraformaldehyd/PBS (pH 7.4) immersionsfixiert und dann in OCT-Compound (Miles Scientific, USA) eingebettet. Das mittlere Drittel wurde 4 Stunden in 4% Paraformaldehyd/PBS (pH 7.4) immersionsfixiert, 48 Stunden in 15% Saccharose (pH 7.4) gewaschen und in Paraffin eingebettet. Das distale Drittel wurde in OCT-Compound eingebettet und zu Gefrierschnitten verarbeitet. Zehn zufällig gewählte Abschnitte wurden mit X-Gal 12 Stunden auf β-Galaktosidaseaktivität gefärbt und zur Bestimmung der Gentransfereffizienz verwendet (Nabel et al, Science (1990) 249: 1285–1288; Ylä-Herttuala et al (1995), siehe oben). Die Gentransfereffizienz wurde als der prozentuale Anteil der β-Galaktosidase-enthaltenden Zellen als Anteil der Gesamtzahl der Zellkerne in 20 zufällig gewählten 100X Feldern berechnet. Zufällig gewählte Schnitte jeden dritten Abschnittes der mit Manschetten versehenen Arterien wurden für Immunzytochemie und Analyse der Zelltypen und/oder der Verhältnisse Intima/Media-Dicke verwendet (Booth et al, siehe oben).
Die Zelltypen wurden unter Verwendung der folgenden Antikörper identifiziert: SMC : HHF-35 mAk (1 : 500 Verdünnung; Enzo Diagnostics, USA), α-Actin mAk (1 : 1000 Verdünnung; Sigma Chemical Co.); Makrophagen : RAM-11 mAk (1 : 1000 Verdünnung; Dako, USA), Anti-CD68 mAk (1 : 250 Verdünnung; Dako); Endothelzellen Anti-CD31 mAk (1 : 50 Verdünnung; Dako); Polymorphonukleäre Leukozyten Anti-CD45 mAk (1 : 100 Verdünnung; Dako); und Anti-Kaninchen T-Zellen: MCA 805 mAk (1 : 1000 Verdünnung; Dako). Das Avidin-Biotin Meerrettich-Peroxidase-Verfahren wurde für die Signaldetektion verwendet (Vector laboratories) (Ylä-Herttuala et al (1995), siehe oben). Nach der Immunfärbung wurden die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Bestimmung des Proliferationsindex: Der Proliferationsindex in den mit Manschetten versehenen Arterien wurde durch 5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)-Markierung bestimmt (Soma et al, Arterioscler. Thromb. (1993) 13: 571–578). New Zealand White Kaninchen (n = 12) wird 3 Stunden vor ihrer Opferung BrdU (40 mg/kg Körpergewicht) injiziert. Die Halsschlagadern werden über Nacht in 70% Ethanol fixiert und in Paraffin eingebettet. Serienschnitte (20 Schnitte pro Tier) wurden nach Propidiumiodidfärbung der Zellkerne mit FITC-markiertem Anti-Maus IgG (Dako) zur Detektion des BrdU gefärbt. Der Labelling-Index wurde als der prozentuale Anteil der BrdU-positiven Zellkerne berechnet. Die kontralateralen Halsschlagadern wurden scheinoperiert und als Kontrollen verwendet.
Plasmid/Liposomen: pCMV-β-Galaktosidase (lacZ)-Expressionsplasmid (Promega) wurde mit Lipofektinreagenz (BRL) wie folgt komplexiert 25 μg Plasmid wurden langsam mit 25 μl Lipofektinreagenz vermischt und mit Ringer-Lösung auf 500 μl verdünnt. In der Plasmid/Lipofektin-Lösung waren keine Niederschläge zu sehen. Die Mischung wurde mindestens 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und innerhalb zwei Stunden für den Gentransfer verwendet. Plasmidpräparationen wurden auf die Abwesenheit einer Lipopolysaccharidkontamination hin kontrolliert (Limulus Assay, Sigma Chemical Co.).
Retroviren: LacZ-enthaltende pLZRNL MMLV Retroviren (Ylä-Herttuala et al (1995), siehe oben; Miyanohara et al, PNAS (1988) 85: 6538–6542) oder LacZ VSV-G pseudotypisierte Retroviren (Yee et al, PNAS (1994) 91: 9564–9568) wurden für die Studien verwendet. In beiden wird die Expression von lacZ durch die 5'LTR gesteuert. Replikationsdefiziente LZRNL amphotrope Retroviren wurden in PA317-Zellen verpackt und mit einem Titer von 5 × 10⁵ cfu/ml wie beschrieben verwendet (Ylä-Herttuala et al (1995), siehe oben). Replikationsdefiziente VSV-G pseudotypisierte Retroviren wurden in 293 GP-Zellen mittels transienter Transfektion hergestellt (Yee et al, siehe oben). Pseudotypisierte Retroviren wurden mittels Ultrazentrifugation konzentriert und mit einem Titer von 1 × 10⁷ cfu/ml verwendet. Vor Gebrauch wurden die retroviralen Präparationen auf die Abwesenheit jeglicher bakterieller Kontaminationen oder Helferviren hin kontrolliert (Yee et al, siehe oben).
Adenovirale Vektoren: Replikationsdefiziente E1-deletierte Adenoviren wurden für die Studien verwendet (Gosh-Choudhury et al, Gene (1986) 50: 161–171; Simari et al, J. Clin. Invest. (1996) 98: 225–235). Kern-gerichtete β-Galaktosidase unter einem β-Actin-Promotor und einem CMV-Enhancer wurde mittels homologer Rekombination in den E1-deletierten Bereich des adenoviralen Genoms kloniert (Gosh-Choudhury et al, siehe oben; Simari et al, siehe oben). Replikationsdefiziente Adenoviren wurden in 293-Zellen hergestellt und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Titer von 1 × 10⁹ cfu/ml wurden für die Gentransferversuche verwendet. Die adenoviralen Präparationen wurden auf die Abwesenheit von Helferviren oder bakteriellen Kontaminationen hin analysiert (Gosh-Choudhury et al, siehe oben).
Ergebnisse: Die Adventitia-Manschette führte zu einer neointimalen Hyperplasie 7–14 Tage nach der Operation. Das Endothel blieb über die Dauer der Studien hinweg anatomisch intakt. Die BrdU-Markierung ließ einen Peak des Proliferationsindex von 23% 3 Tage nach der Operation erkennen. Die Neointima bestand ausschließlich aus SMC. Plasmid/Liposomen-Komplexe führten zu einem detektierbaren Gentransfer in die Adventitia und das Außenmedium, mit einer Effizienz von unter 0.01%. Nicht transfizierte oder Liposomen-behandelte mit Manschetten versehene Arterien zeigten keine Färbung für β-Galaktosidase-Aktivität.
Der adventitielle retrovirale Gentransfer war weniger wirksam ohne die Manschette, wahrscheinlich deshalb, weil retroviraler Gentransfer nur in proliferierenden Zellen erfolgt. Die Gentransfereffizienz mit replikationsdefizienten MMLV-Retroviren war gering (unter 0.01%). Die Gentransfereffizienz mit VSV-G pseudotypisierten Retroviren war 0.1%. Bei der Verwendung von MMLV- und VSV-G-Retroviren war in der Adventitia und im Außenmedium eine β-Galaktosidase-Färbung zu sehen.
Replikationsdefiziente Adenoviren ergaben einen wirksamen Gentransfer mit einer in der Adventitia und im Außenmedium detektierten β-Galaktosidase-Färbung. Interessanterweise war auch in einigen Endothelzellen und in einigen Intimazellen eine Färbung zu sehen. Da das lacZ-Adenoviruskonstrukt ein Kernlokalisierungssignal für β-Galaktosidase enthielt, war eine intensive X-gal-Färbung in den Zellkernen der transfizierten Zellen lokalisiert. Die Gentransfereffizienz war, aus der Gesamtzahl der gefärbten Zellkerne in den analysierten Schnitten geschätzt, ungefähr 10%. Einige inflammatorische Zellen waren in VSV-G-Retrovirus- und Adenovirustransfizierten Arterien zu sehen. Keine inflammatorischen Zellen waren in den Plasmid/Liposomentransfizierten Arterien zu sehen.
In diesem Beispiel erfolgte der Transfer des β-Galaktosidase (lacZ)-Markergens in die Adventitia und Außenmembran mit allen Gentransfersystemen. Adenoviren übertrugen das Gen für β-Galaktosidase auch an einige Endothelzellen. Nach fünf Tagen erbrachten adenovirale Vektoren die höchste Gentransfereffizienz mit einer β-Galaktosidase-Aktivität für bis zu 10% der Zellen. Pseudotypisierte VSV-G-Retroviren waren auch wirksam, indem sie den Gentransfer in 0.1% der Zellen in der Adventita und Außenmembran erzielten. Plasmid/Liposomen-Komplexe und MMLV-Retroviren infizierten < 0.01% der Zellen. Mit keinem der Gentransfersysteme waren Nebenreaktionen im Gewebe zu sehen.
Replikationsdefiziente Adenoviren, VSV-G pseudotypisierte Retroviren und Plasmid/Liposomen-Komplexe können somit für den Gentransfer zur Arterienwand mittels des Manschettenverfahrens verwendet werden. Wirkungen auf mediale SMC und selbst das Endothel können von der adventitiellen Seite her erreicht werden.
SEQUENZ AUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Wirkstoffes, der ein VEGF-Protein ist, das die Fähigkeit besitzt, die Proliferation von Endothelzellen in vitro und/oder in vivo zu fördern, oder eine das Protein codierende Nukleinsäure, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Intimahyperplasie eines Blutgefässes, bei der das Endothel ganz oder weitgehend intakt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Blutgefäß eine Arterie ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, zur Behandlung oder Prävention einer Stenose, die durch einen operativen Eingriff hervorgerufen wurde oder mit einer Pulmonal-Arteriellen Hypertension verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 3, in welcher es sich beim operativen Eingriff um Angioplastie, koronare Bypass-Operation, operative Anastomose oder Endarteriektomie handelt.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung oder Prävention einer Stenose der Blutgefäße.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung oder Prävention einer Restenose der Blutgefäße.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in der das Protein die Sequenz SEQ ID Nr. 2, 4, 6 oder 8, oder ein aktives Fragment daraus aufweist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welcher der Wirkstoff eine Nukleinsäure in Verbindung mit einem viralen oder nicht-viralen Vektor ist.
Ein Implantat zum therapeutischen Gebrauch, das so ausgelegt ist, daß es an oder in Nähe der Stelle der zu behandelnden oder zu verhindernden Intimahyperplasie plaziert wird, in der das Endothel ganz oder weitgehend intakt ist, und das einen Wirkstoff gemäß einem der vorstehenden Ansprüche enthält.
Ein Implantat nach Anspruch 9, das ein Silastik-Implantat oder ein biologisch abbaubares Implantat ist.
Ein Implantat nach Anspruch 9 oder 10 in Form einer Manschette, welche um ein Blutgefäß an oder in Nähe der Stelle der zu behandelnden oder zu verhindernden Hyperplasie angepaßt wird.
Ein Implantat nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dessen Außenwand für den in ihm enthaltenen Wirkstoff im wesentlichen undurchlässig ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, zur Verwendung bei der Zuführung des Wirkstoffes in ein Blutgefäß in einem Patienten, bei welcher der Wirkstoff in einem Träger bereitgestellt wird, der dazu ausgelegt ist, eine Abdichtung um das Gefäß zu gewährleisten, wobei der Wirkstoff in der Vorrichtung gehalten wird oder damit verbunden ist, so daß er bei Verwendung in Kontakt mit der Adventitia-Oberfläche kommt.