DE69718752T2

DE69718752T2 - Isolierung von nukleinsäure

Info

Publication number: DE69718752T2
Application number: DE69718752T
Authority: DE
Inventors: Philippe Cros; Abdelhamid Elaissari; Claude Mabilat; Christian Pichot; Marc Rodrigue; Lise Santoro
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2017-03-21
Also published as: ATE231875T1; CA2222192A1; JPH11505426A; JP4693944B2; EP0842184A1; WO1997034909A1; ES2188926T3; EP0842184B1; US6737235B1; DE69718752D1

Description

Die vorliegende Erfindung gehört zum Gebiet der Reinigung von Nukleinsäuren in wässrigem Milieu.
Gemäß dem Dokument WO-A-95/04140 ist ein Verfahren zum Reinigen von in einer Probe vorhandenen Nukleinsäuren in wässrigem Milieu bekannt, bei dem die Probe in Gegenwart einer chaotropen Substanz mit einem aus Partikeln bestehenden System, das aus Kieselsäurekugeln besteht, in Kontakt gebracht wird, anschließend werden die an die Kugeln fixierten Nukleinsäuren von der wässrigen Endlösung abgetrennt.
Gemäß dem Dokument F. MEUNIER et al., Polymers for Advanced Technologies, Vol. 6, Seiten 489-496 (1995), wird die Herstellung eines als PNIPAM bezeichneten Polymers durch Polymerisation von (1) N-Isopropylacrylamid, (2) N-N-Methylenbisacrylamid und (3) dem Chlorid von 2-Aminoethylmethacrylat in Gegenwart eines Polymerisationsbeschleunigers beschrieben. Das Verhalten dieses auf der Oberfläche funktionalisierten Polymers lässt es insbesondere als für eine kovalente Fixierung von biologischen Molekülen geeignet erscheinen.
Das Dokument EP-A-0 161 881 lehrt, dass ein wärmeempfindliches Polymer, wie eines der Polymere, die durch Copolymerisation von Monomeren von N-Alkyl- oder von N-Alkylenacrylamid oder Methacrylamid und von Monomeren von Acryl- oder Methacrylderivaten erhalten werden, dank dessen Fähigkeit in Abhängigkeit von der Temperatur seine Struktur zu verändern, zur Isolierung von biologischem Material verwendet werden kann. Bei niedriger Temperatur weist es eine ausgebreitete Struktur auf, die die Fixierung eines biologischen Materials erleichtert, und bei hoher Temperatur weist es eine zusammengezogene Struktur auf, die die Freisetzung des fixierten biologischen Materials ermöglicht. Die Kontrolle der Schritte der Fixierung und der Freisetzung des biologischen Materials kann folglich durch die Veränderung der Temperatur erfolgen. Für eine bessere Kontrolle kann außerdem der pH-Wert variiert werden.
Die in diesem Dokument vorgeschlagene Verwendung erstreckt sich auf die Isolierung von jeglichem in einer Probe vorhandenen biologischen Material, und insbesondere auf Nukleinsäurematerial und Proteinmaterial, ohne jegliche Spezifität.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt, um in einer Probe vorhandenes Nukleinsäurematerial selektiv zu isolieren. Selbst wenn es sich um eine komplexe Probe handelt und diese Proteinmaterial und/oder Inhibitoren enzymatischer Reaktionen enthält, macht das erfindungsgemäße Verfahren sogar jede Isolierung des Proteinmaterials und/oder der Inhibitoren überflüssig, während die Isolierung des Nukleinsäurematerials begünstigt wird.
Erfindungsgemäß weist ein Verfahren, um in wässriger Phase Nukleinsäurematerial zu isolieren, das in einer Probe vorhanden ist, folgende Schritte auf:
einen Erhalt des Adsorptionsreagens genannten Schritt (a), in dem ein Adsorptionsreagens bereitgestellt wird, das ein Sol aufweist, das durch eine wässrige kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche Phase des aus Partikeln bestehenden Trägers gebildet wird, der ein funktionalisiertes, aus Partikeln bestehendes Polymer umfasst, wobei das Polymer durch Polymerisation von (1) einem ersten wasserlöslichen Monomer von Acrylamid oder einem Acrylamidderivat, (2) wenigstens einem Vernetzungsreagens und (3) wenigstens einem zweiten funktionellen, kationischen und wasserlöslichen Monomer enthalten wird, wobei das Polymer eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) aufweist, die bei 25 bis 45ºC, und vorzugsweise bei 30 bis 40ºC liegt,
einen In-Kontakt-Bringen genannten Schritt (b), in dem das Adsorptionsreagens mit der das Nukleinsäurematerial enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird,
einen Adsorption genannten Schritt (c), in dem für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) wenigstens einer und vorzugsweise wenigstens zwei der folgenden Parameter für das Reaktionsmedium ausgewählt werden:
- pH-Wert nicht höher als 7,
- Ionenstärke nicht höher als 10&supmin;² M
- Temperatur unterhalb der LCST des Polymers,
einen Separation genannten Schritt (d), in dem die diskontinuierliche und insbesondere jene Phase, die das Nukleinsäurematerial adsorbiert hat, von der kontinuierlichen Phase getrennt wird, nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat,
einen Desorption genannten Schritt (e), in dem das Nukleinsäurematerial von dem aus Partikeln bestehenden Träger dissoziiert wird, indem die Ionenstärke bis auf eine Ionenstärke oberhalb von 10&supmin;² M erhöht wird.
Vorzugsweise kann für den Schritt (e) der Desorption unter anderem wenigstens einer der Parameter pH-Wert oder Temperatur wie folgt variiert werden:
- Erhöhung des pH-Wertes bis auf einen pH-Wert oberhalb von 7,
- Erhöhung der Temperatur bis auf eine Temperatur oberhalb des LCST des Polymers.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren, um in wässriger Phase Nukleinsäurematerial zu isolieren, das in einer Probe vorhanden ist, mit einem Schritt der Adsorption des Nukleinsäurematerials an einen aus Partikeln bestehenden Träger, wodurch eine Verwendung des Nukleinsäurematerials in ihrem an den aus Partikeln bestehenden Träger adsorbierten Zustand in einem späteren Analyseschritt ermöglicht wird. Dieses Verfahren weist die folgenden Schritte auf:
einen Erhalt des Adsorptionsreagens genannten Schritt (a), in dem ein Adsorptionsreagens bereitgestellt wird, das ein Sol aufweist, das durch eine wässrige kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche Phase des aus Partikeln bestehenden Trägers gebildet wird, der ein funktionalisiertes aus Partikeln bestehendes Polymer umfasst, wobei das Polymer durch Polymerisation von (1) einem ersten wasserlöslichen Monomer von Acrylamid oder einem Acrylamidderivat, (2) wenigstens einem Vernetzungsagens und (3) wenigstens einem zweiten funktionellen kationischen und wasserlöslichen Monomer erhalten wird, und das Polymer eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) aufweist, die bei 25 bis 45ºC liegt,
einen In-Kontakt-Bringen genannten Schritt (b), in dem das Adsorptionsreagens mit der das Nukleinsäurematerial enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird,
einen Adsorption genannten Schritt (c), in dem für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) eine Ionenstärke nicht höher als 10&supmin;² M gewählt wird,
einen Separation genannten Schritt (d), in dem die diskontinuierliche Phase von der kontinuierlichen Phase getrennt wird, nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat, wobei in dem Verfahren der Desorptionsschritt fakultativ ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung des letzteren Verfahrens wird für den Schritt (c) der Adsorption u. a. für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) für das Reaktionsmedium wenigstens einer der folgenden Parameter ausgewählt:
- pH-Wert nicht höher als 7,
- Temperatur unterhalb der LCST des Polymers.
Selbstverständlich kann dieses Verfahren nach dem Schritt (d) der Separation einen Desorption genannten Schritt aufweisen, in dem das Nukleinsäurematerial von dem aus Partikeln bestehenden Träger durch Desorption dissoziiert wird, indem wenigstens einer der Parameter ausgewählt aus pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur wie folgt variiert wird:
- Erhöhung der Ionenstärke bis auf eine Ionenstärke oberhalb von 10&supmin;² M,
- Erhöhung des pH-Wertes bis auf einen pH-Wert oberhalb von 7,
- Erhöhung der Temperatur bis auf eine Temperatur oberhalb des LCST des Polymers.
Vorzugsweise kann zumindest die Ionenstärke variiert werden.
Die oben definierten erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise gemäß zweier Varianten betreffend Schritt (a) durchgeführt.
Nach einer ersten Variante, die in den Beispielen illustriert wird, besteht der aus Partikeln bestehende Träger aus dem aus Partikeln bestehenden Polymer, und in diesem Fall ist das oder sind die Vernetzungsagenzien (2) wasserlöslich.
Nach einer zweiten Variante weist der aus Partikeln bestehende Träger unter anderem einen organischen oder anorganischen Kern auf, der ganz oder teilweise mit dem aus Partikeln bestehenden Polymer bedeckt ist, wobei der Kern die Adsorptionseigenschaften des Polymers für das Nukleinsäurematerial nicht verändert. Der Kern oder die Teile des Kerns üben dann die Funktion des Vernetzungsagens (2) aus, wobei ein weiteres Vernetzungsagens vom Typ wasserlösliches Vernetzungsagens vorgesehen sein kann. Bspw. kann es sich bei dem Kern um einen Polysterolkern handeln, und/oder der Kern kann eine magnetische Verbindung aufweisen.
Nach einer besonderen und bevorzugten Ausführung dieser Verfahren wird vor dem Schritt (b) der Probe, oder nach dem Schritt (b) dem Reaktionsmedium, und insbesondere nach dem Schritt (c) oder dem Schritt (d) wenigstens eine Sonde und/oder ein Primer zugegeben, die/der vor oder nach dem Schritt (b) spezifisch mit dem Nukleinsäurematerial hybridisieren kann.
In einer weiteren besonderen Ausführung besteht das Nukleinsäurematerial aus einer Sonde oder einem Primer, und gemäß (b) und (c) wird das Adsorptionsreagens mit dem Nukleinsäurematerial in Kontakt gebracht, um ein Hybridisierungsreagens zu erhalten, anschließend gemäß (b'), nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat und das Hybridisierungsreagens von dem Reaktionsmedium getrennt wurde, wird das Hybridisierungsreagens unter Bedingungen, die für die Hybridisierung oder die Verlängerung des Primers geeignet sind, mit einem Medium in Kontakt gebracht, das wenigstens eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäurefragment enthält.
Das aus Partikeln bestehende Polymer wird vorzugsweise durch Radikalenpolymerisation in Gegenwart eines kationischen oder neutralen und wasserlöslichen Polymerisationsbeschleunigers erhalten.
Das erste Monomer (1) ist vorzugsweise aus den N- Alkylacrylamiden und den N,N-Dialkylacrylamiden, und insbesondere aus N-Isopropylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n- Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N- isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid ausgewählt, wobei das erste Monomer vorzugsweise N-Isopropylacrylamid (NIPAM) ist.
Das oder die zweiten funktionellen Monomere (3) sind vorzugsweise ausgewählt aus den Acrylderivaten und den Methacrylderivaten, dem Chlorid von 2-Aminoethylmethacrylat (AEM), den Derivaten von N-Vinylpyridin, den Derivaten von Trialkylammonium und den Derivaten von Isothiouroniumchlorid.
Vorzugsweise ist das wasserlösliche Vernetzungsagens (2) ausgewählt aus N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldimethacrylat, und der Polymerisationsbeschleuniger ist das Chlorid von 2,2'-Azobisamidinopropan (V50).
Der Schritt (d) der Separation wird vorzugsweise mittels einer Technik durchgeführt, die ausgewählt ist aus Zentrifugation, Filtration, Präzipitation, Sedimentation und Anlegung eines magnetischen Feldes.
Vor dem Schritt (d) der Separation kann ggf. beobachtet werden, dass die Adsorptionsreaktion erfolgt ist. Es kann bspw. HPLC-Technik oder Kapillarelektrophorese-Technik verwendet werden.
Bevor die Erfindung im Detail dargelegt wird, werden nachfolgend einige in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete Begriffe definiert:
Unter Isolierung von Nukleinsäurematerial wird erfindungsgemäß die Separation, Detektion dieses Materials, die Anreicherung einer Fraktion bezüglich des Nukleinsäurematerials gemäß einem Verfahren zur spezifischen oder unspezifischen Isolierung auf qualitative und/oder quantitative Art und Weise verstanden.
Ein Nukleinsäurematerial ist gemäß der Erfindung eine Nukleinsäure, ein Nukleinsäurefragment, ein Gemisch aus Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurefragmenten, oder eine Fraktion von Nukleinsäuren und/oder von Nukleinsäurefragmenten. Unter Nukleinsäure wird jede Nukleinsäure verstanden, in freier Form oder ggf. verbunden mit Proteinen, ungeachtet ihres zellulären, bakteriellen, viralen oder anderen Ursprungs. Es handelt sich gleichermaßen um eine Deoxyribonukleinsäure oder um eine Ribonukleinsäure, die durch eine Verkettung von natürlichen Nukleotiden gebildet wird, deren Grundelemente ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine stickstoffhaltige Base sind, die ausgewählt ist aus Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin, und/oder die von wenigstens in einem der drei Grundelemente modifizierten Nukleotiden gebildet wird; bspw. kann die Modifikation im Bereich der Basen vorgenommen werden, wodurch modifizierte Basen erzeugt werden, wie Inosin, Methyl-5-deoxycytidin, Deoxyuridin, Dimethylamino-5-deoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Bromo-5-deoxyuridin und solche Basen, die durch einen Indikator modifiziert wurden, der direkt oder indirekt durch dem Fachmann bekannte Techniken detektierbar ist, bspw. sind die Basen durch Biotin modifiziert; im Bereich des Zuckers, nämlich durch den Austausch von wenigstens einer Deoxyribose gegen ein Polyamid; und/oder im Bereich der Phosphatgruppe, bspw. deren Austausch gegen Ester, die insbesondere ausgewählt sind aus den Diphosphatestern, aus Alkyl- und Arylphosphonatestern und Al- kyl- und Arylphosphothionatestern. Die Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vollständig oder teilweise einzelsträngig und/oder zweisträngig, und kann insbesondere aus einem Duplex aus Sonde und Nukleinsäure, aus Sonde und einem Nukleinsäurefragment, aus Primer und Nukleinsäure oder aus Primer und einem Nukleinsäurefragment bestehen; das Duplex kann ein Homoduplex oder ein Heteroduplex sein.
Die Erfindung wird natürlich auf die Isolierung von wie oben definierten Nukleinsäurefragmenten oder Oligonukleotiden (ODN) von variablen Größen angewendet.
Das Nukleinsäurematerial kann natürlichen Ursprungs sein und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese erhalten werden, es kann bspw. aus einer Sonde oder einem Primer bestehen.
Die vorliegende Erfindung wird auf die unspezifische Isolierung einer Fraktion von Nukleinsäuren und/oder von Nukleinsäurefragmenten angewendet, die in einer Probe vorhanden sind, aber auch auf die spezifische Isolierung einer Nukleinsäure oder eines Nukleinsäurefragmentes oder eines Gemischs von Nukleinsäuren oder von Nukleinsäurefragmenten, die in einer Probe vorhanden sind.
Eine erfindungsgemäß verstandene Probe umfasst jede Probe, die Nukleinsäurematerial enthalten kann, insbesondere eine biologische Probe, die ausgehend von einer biologischen Flüssigkeit erhalten wurde, und eine Nahrungsmittelprobe. Die Probe besteht vollständig oder teilweise aus einer Probe, sie kann insbesondere aus einem Aliquot, einer Verdünnung bestehen. Die Probe kann ggf. einer vorherigen Behandlung unterzogen worden sein, insbesondere einer Reinigung oder Lyse, um die Freisetzung von Nukleinsäuren zu erleichtern.
Die LCST eines Polymers wie jenes, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, wird insbesondere mittels Techniken definiert und gemessen, die in den folgenden Dokumenten beschrieben wurden: Hiroshi Inomata et al., Macromolecules 1994, 27, 6459-6464.
Bei einer Sonde handelt es sich um ein Nukleinsäurefragment, das unter bestimmten Bedingungen eine Hybridisierungsspezifität aufweist, um einen Hybridisierungskomplex mit einem Nukleinsäurefragment zu bilden. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Sonde wird vorzugsweise eine Fängersonde sein, ohne andere Sondentypen von diesem Rahmen auszuschließen.
Unter Primer wird erfindungsgemäß eine Sonde verständen, die unter bestimmten Bedingungen zur Initiation einer enzymatischen Reaktion eine Hybridisierungsspezifität aufweist, bspw. in einer Amplifizierungstechnik wie der PCR (Polymerase Chain Reaction), der sogenannten NASBA-Technik ("Nucleic Acid Sequence-Based Amplification") oder auch der sogenannten TMA- Technik (Transcription Mediated Amplification), in einem Elongationsverfahren, wie der Sequenzierung, in einem Verfahren der reversen Transkription oder Entsprechendem.
Unter Acrylamid-Derivat wird erfindungsgemäß ein polymerisierbares Monomer verstanden, das der Formel R&sup0;-CH=C(R¹)-CONR²R³ entspricht, in der R&sup0;, R¹, R² und R³ eine unabhängige Gruppe darstellen, die ausgewählt ist aus Wasserstoff, den linearen oder verzweigten, aliphatischen oder cyclischen niedrigen Kohlenwasserstoffen, den Gruppen stickstoffhaltiger Heterocyclen wie Imidazol.
Die Adsorption des Nukleinsäurematerials wird erfindungsgemäß wie nachfolgend definiert verstanden: ein Nukleinsäurematerial ist an einen aus Partikeln bestehenden Träger adsorbiert, sofern nach einer Zeit des In-Kontakt-Tretens von dem Material und Träger wenigstens eine der Gruppen, die zu den Grundelementen des Nukleinsäurematerials gehören, an die Oberfläche des Trägers fixiert ist; die Adsorption resultiert aus ionischen Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbindungen und ggf. hydrophoben Wechselwirkungen, jedoch nicht aus jeglichen kovalenten Bindungen zwischen dem Material und dem Träger.
Schließlich wird unter funktionalisiertem Polymer ein Polymer verstanden, das wenigstens eine Grenzfläche aufweist, die funktionelle Gruppen trägt, die mit den Gruppen der Grundbestandteile des Nukleinsäurematerials eine der Interaktionen und/oder Bindungen bilden können, die in das Phänomen der Adsorption involviert sind. Vorzugsweise sind diese funktionellen Gruppen ausgewählt aus NH&sub3;&spplus;; NH&sub4;&spplus;; NR&sub3;&spplus;, wobei R für eine gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder cyclische kohlenwasserstoffhaltige Gruppe steht, NR&sub3;&spplus; kann für die Pyridinium- Gruppe stehen; und der Isothiouronium-Gruppe.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Beispiele 1 bis 6 und die im Anschluss gezeigten Fig. 1 bis 7 beschrieben:
Fig. 1 stellt die Veränderung der Grenzfläche des Polymers in Abhängigkeit des pH-Wertes und der Temperatur dar;
Fig. 2 stellt den Effekt des pH-Wertes und der Temperatur auf die Adsorption von RNA dar,
Fig. 3 stellt den Effekt des pH-Wertes bei 40ºC auf die Adsorption von BSA dar;
Fig. 4 stellt den Effekt der Ionenstärke und der Temperatur auf die Adsorption der RNA dar,
Fig. 5 stellt den Effekt des pH-Wertes bei 20ºC auf die Desorption von RNA dar,
Fig. 6 stellt den Effekt des pH-Wertes bei 40ºC auf die Desorption von RNA dar, und
Fig. 7 stellt den Effekt der Ionenstärke bei pH 9,2 und bei 20ºC auf die Desorption von RNA dar.
In den Fig. 2 bis 4 entspricht der Ns-Wert der Menge des biologischen Gebildes, das an das Polymer fixiert ist, und wird ausgedrückt in Milligramm fixierte biologische Moleküle pro Milligramm Polymer.
In den Fig. 5 bis 7 entspricht der Ns-Wert dem prozentualen Anteil an freigesetzter RNA (freie Ns) oder nicht freigesetzter RNA (restliche Ns) im Vergleich zu der RNA-Menge, die zuvor an die Partikel gemäß Beispiel 2 adsorbiert wurde.
Wie die nachfolgenden Beispiele illustrieren, sind während des Schrittes (c) der Adsorption die Bedingungen bezüglich des pH-Wertes, der Ionenstärke und/oder der Temperatur entscheidend. In der Tat zeigt das Polymer, wie in Fig. 1 zu sehen ist, bei einem pH-Wert von 7 und einer Temperatur unterhalb der LCST des Polymers eine geladene hydrophile knäuelartige Struktur, wohingegen das Polymer bei einem pH-Wert von 7 und einer Temperatur, die oberhalb der LCST des Polymers liegt, eine hydrophobe und neutrale zusammengezogene Konformation, was eine abnehmende Adsorption von Nukleinsäuren und zugleich eine zunehmende Adsorption von Proteinen bewirkt.

BEISPIEL 1: HERSTELLUNG EINES POLYMERS AUF NIPAM-BASIS

Zur Herstellung dieses Polymers wurden drei Polymerisationstechniken verwendet: 1) Polymerisation im Batch (oder Verfahren in geschlossenem Reaktionsgefäß); 2) semikontinuierliche Polymerisation und 3) Polymerisation auf einem Polymerisationskeim. In jeder dieser Techniken wurden dieselben nachfolgenden Reagenzien verwendet:
- Erstes Monomer: N-Isopropylacrylamid (NIPAM), erhältlich bei Kodak,
- Vernetzer: N-N-Methylenbisacrylamid (MBA), zu beziehen bei Aldrich,
- Beschleuniger: Chlorid von 2,2'-Azobisamidinopropan (V50), erhältlich bei Wako,
- Salz zum Einstellen der Ionenstärke: NaCl (Prolabo),
- zweites funktionelles Monomer: Chlorid von 2-Aminoethylmethacrylat (AEM), erhältlich bei Kodak.

1) Polymerisation im Batch

Das erste Monomer (NIPAM), das zweite funktionelle Monomer (AEM) und der Vernetzer (MBA) werden in einem Schritt zusammengegeben, bevor die Polymerisation durch Zugabe des Beschleunigers (V50) gestartet wird, der sich unter dem Einfluss von Hitze zersetzt, indem er freie Radikale bildet. Die Dauer der Polymerisation beträgt 30 min.
Die Formulierung des erhaltenen Polymers, für das die Referenz PNIPAM42 verwendet wird, ist Folgende:
Gesamtvolumen(a) 250 ml
NIPAM 48,51 mmol
MBA 3 mmol
AEM 0,48 mmol
V50 0,30 mmol
Temperatur 70ºC
(a) gekochtes und entgastes Wasser
Die Eigenschaften des erhaltenen Polymers sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben: Tabelle I
(a) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 20ºC
(b) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 40ºC
(c) Durchmesser gemessen mittels Transmissionselektronenmikroskopie
(d) Ladungsdichte ausgedrückt in umol (primäres Amin)/g des Polymers
(e) untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST), bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit der Temperatur
(f) kritische Koagulationskonzentration (CCC) bei 20ºC, bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit des Salzgehaltes (NaCl).

2) Semikontinuierliche Polymerisation

Ein Teil des zweiten funktionellen Monomers wird über einen Zeitraum in das Reaktionsgefäß eingebracht, der zwischen dem Beginn der Polymerisation und dem Ende der vollständigen Umwandlung des Polymers liegt, in das Reaktionsgefäß eingebracht. Diese Zugabe kann bei konstanter Injektionsgeschwindigkeit (Polymerisation durch kontinuierliche Zugabe) erfolgen, oder entsprechend einer sorgfältig kontrollierten Zugabe in regelmäßigen Intervallen (semikontinuierliche Polymerisation). Das Ziel dieser Polymerisationsmethode besteht darin, die Inkorporation des zweiten funktionellen (geladenen) Monomers zu erhöhen, ohne den prozentualen Anteil des wasserlöslichen Polymers in dem Reaktionsmedium zu erhöhen, was den Verlauf der Polymerisation stören könnte.
Die Formulierung des erhaltenen Polymers, für das die Referenz PNIPAM45 verwendet wird, ist Folgende:
Gesamtvolumen(a) 250 ml
NIPAM 48,51 mmol
MBA 3 mmol
AEM 0,48 mmol
V50 0,30 mmol
Temperatur 70ºC
Zugaben bei 3 bis 6 min
(a) gekochtes und entgastes Wasser
Die Eigenschaften des erhaltenen Polymers PNIPAM45 sind in folgender Tabelle II wiedergegeben: Tabelle II
(a) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 20ºC
(b) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 40ºC
(c) Durchmesser gemessen mittels Transmissionselektronenmikroskopie
(d) Ladungsdichte ausgedrückt in umol (primäres Amin)/g des Polymers
(e) untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST), bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit der Temperatur
(f) kritische Koagulationskonzentration (CCC) bei 20ºC, bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit des Salzgehaltes (NaCl).

3) Polymerisation auf einem Polymerisationskeim

Diese Technik besteht aus dem Einbringen des zweiten funktionellen Monomers in ein Reaktionsmedium, das ein zuvor hergestelltes und vollkommen charakterisiertes Polymer enthält. Das zweite funktionelle Monomer kann allein oder im Gemisch mit dem Monomer oder den Monomeren oder den Comonomeren in einem Schritt oder semikontinuierlich hinzugegeben werden.
Die Formulierung des erhaltenen Polymers, für das die Referenz PNIPAM94 verwendet wird, ist Folgende:
Es wurde ein Volumen von 40 ml des Polymerisationskeims mit einem Festigkeitsgrad von 4, 5% verwendet. Die Reagenzien wurden, in einem Volumen vom 5 ml Wasser verdünnt, hinzugegeben. Die molekularen Anteile von in dem zweiten Schritt zugegebenem NIPAM, MBA und V50 sind mit denen des Polymerisationskeims identisch (vgl. 1). Andererseits wird die Konzentration des zweiten funktionellen Monomers kontrolliert (erhöht oder erniedrigt, je nach gewünschter Ladungsdichte); in diesem Fall werden 10% (mol) AEM in Bezug auf das erste Monomer NIPAM zugegeben.
Die Eigenschaften des Polymers PNIPAM94, das nach dem Aufbringen auf den Polymerisationskeim erhalten wurde, der unter der Referenz PNIPAM93 geführt wird, und der gemäß dem Arbeitsverfahren, das in 1) beschrieben wird, erhalten wurde, werden in folgender Tabelle III wiedergegeben: Tabelle III
(a) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 20ºC
(b) Durchmesser gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung bei 40ºC
(c) Durchmesser gemessen mittels Transmissionselektronenmikroskopie
(d) Ladungsdichte ausgedrückt in umol (primäres Amin)/g des Polymers
(e) untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST), bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit der Temperatur
(f) kritische Koagulationskonzentration (CCC) bei 20ºC, bestimmt durch Messung der Trübung in Abhängigkeit des Salzgehaltes (NaCl).
Am Ende der Polymerisation werden die Partikel durch einfache Zentrifugation gesammelt und in Wasser oder in einem gewünschten Medium resuspendiert.
Die Eigenschaften des Polymers, das nach einer der Techniken 1) bis 3) erhalten wurde, sind Folgende:
- Ladungsdichte (kationisch) bei 5 bis 150 umol/g des Polymers
- die Spanne der Partikelgröße liegt bei 0,05 bis 2 um, die Partikeldurchmesser wurden mittels dynamischer Lichtstreuung bei 20ºC gemessen
- die Spanne der kritischen Koagulationskonzentration (CCC) bei 0,001 bis 1,5 mol/l NaCl bei 20ºC, und bei 0,01 bis 0,9 mol/l NaCl bei 40ºC.

BEISPIEL 2: ADSORPTION VON RNA ODER VON BSA (RINDERSERUMALBUMIN) AN DIE GEMÄß BEISPIEL 1 HERGESTELLTEN PNIPAM-POLYMERPARTIKEL

Das folgende Protokoll stellt das allgemeine Arbeitsverfahren für die Adsorptionsreaktionen dar:
Das Reaktionsgemisch besteht aus 10 ul RNA (4 mg/ml) oder aus 50 ul BSA (5 mg/ml) und aus 50 ul NIPAM-Partikeln (45 g/l). Das Endvolumen von einem Milliliter wird durch Zugabe von Phosphatpuffer (10 mM pH 4,6 oder 9,2) und NaCl (5 M) erhalten, um den gewünschten pH-Wert und die gewünschte Ionenstärke zu erreichen.
Das molekulare Gebilde (RNA oder BSA) wird während 2 Stunden (bei 20 oder 40ºC) unter vorbestimmten Bedingungen (pH- Wert, Ionenstärke) an die Partikel adsorbiert: Das Gemisch wird für 20 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen, durch Millipore-Filter Millex- GV13 (0,22 um) filtriert, um in Suspension befindliche Polymerpartikel zu entfernen. Die Menge des an den Polymerträger gebundenen biologischen Gebildes wird über die einfache Differenz zwischen der ursprünglich eingebrachten Menge und der verbleibenden und freien Menge bestimmt (gemessen im Überstand): Diese Menge wird ausgedrückt in Milligramm biologischer Moleküle pro Milligramm Polymer (Ns). Die Konzentrationen von RNA oder von BSA werden mittels UV-Spektrophotometrie (Kontron Instrument) bei einer Wellenlänge von 260 nm bzw. 280 nm abgeschätzt.
Die Tests wurden mit 16S und 23S ribosomaler RNA von E. coli (Boehringer) und BSA (Sigma Artikel-Nr. A0281) durchgeführt, die ohne vorherige Reinigung verwendet wurden.
Bei den verwendeten Partikeln handelt es sich um thermosensible PNIPAM94-Partikel. Diese Partikel sind bei Raumtemperatur sehr hydrophil und bei einer Temperatur oberhalb des LCST (32ºC) sind sie hydrophob. Diese wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert.
Die sauren (10 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 4,6) und basischen (10 mM K&sub2;HPO&sub4;, pH 9,2) Phosphatpuffer wurden für die Adsorptionsreaktionen und zur Kontrolle des pH-Wertes der Reaktionen verwendet.
NaCl (5 M) wurde zur Kontrolle der Ionenstärke der Reaktionen verwendet.
Das in sämtlichen Reaktionen verwendete Wasser wurde mit einem Millipore-Milli-Q-Reinigungssystem gereinigt.
Die Inkubationen wurden in einem Thermomixer (Eppendorf 5436) durchgeführt.
Sämtliche Reaktionen wurden in Eppendorf-Gefäßen von 1,5 ml durchgeführt.

1) Studie über den Einfluss des pH-Wertes und der Temperatur auf die Adsorption

Gemäß Fig. 2 wird bei saurem pH-Wert eine bessere Adsorption von RNA beobachtet als bei basischem pH-Wert. Bei saurem pH-Wert sind die Partikel stark positiv geladen und die negativ geladenen Nukleinsäuren binden an die Partikel über elektrostatische Kräfte. Die Bindung ist bei 20ºC stärker als bei 40ºC. Die Ergebnisse bei 40ºC illustrieren eine Abnahme der Adsorption.
Gemäß Fig. 3 ist die Adsorption von BSA bei 40ºC an die Partikel ohne den Einfluss des pH-Wertes möglich. Bei 20ºC wird aufgrund der hydrophilen Eigenschaft der Partikel bei dieser Temperatur keinerlei Bindung beobachtet.

2) Studie über den Einfluss der Ionenstärke und der Temperatur auf die Adsorption

Gemäß Fig. 4 nehmen die elektrostatischen Anziehungskräfte zwischen der negativ geladenen RNA und der positiv geladenen Polymeroberfläche mit der Erhöhung der Ionenstärke mit der Folge einer Verringerung der Bindung von RNA ab.
Unter denselben experimentellen Bedingungen wurde verifiziert, dass die Erhöhung der Ionenstärke die Bindung des BSA an die Partikel nicht begünstigt.
Abschließend werden die Nukleinsäuren vorzugsweise an die Partikel bei einer Temperatur unterhalb der LCST (20ºC) bei geringer Ionenstärke und saurem pH-Wert adsorbiert. Unter diesen Bedingungen wird die Adsorption von Proteinen (wie dem BSA) nicht begünstigt.

BEISPIEL 3: DESORPTION VON AN DIE PNIPAM-POLYMERPARTIKEL ADSORBIERTER RNA

Die verwendeten Reagenzien sind die gleichen wie jene, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Das folgende Protokoll stellt das allgemeine Arbeitsverfahren für die Desorptionsreaktionen dar:
Nach einem Adsorptionsschritt, der wie in Beispiel 2 durchgeführt wird, erfolgt nach einem Zentrifugationsschritt bei 14.000 Umdrehungen pro Minute die Desorptionsreaktion. Der Überstand wird entfernt und durch einen Milliliter Desorptionspuffer (Phosphat (10 mM, pH 4,6 oder 9,2) und NaCl (5 M)) ersetzt, um den gewünschten pH-Wert und die gewünschte Ionenstärke zu erreichen. Die Desorption erfolgt während 2 Stunden bei 20ºC oder 40ºC. Das Gemisch wird anschließend für 20 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen, durch einen Millipore-Filter Millex- GV13 (0,22 um) filtriert, um die in Suspension befindlichen Polymerpartikel zu entfernen. Die Menge an freigesetzter RNA wird mittels UV-Spektrophotometrie (Kontron Instrument) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Die zurückgewonnene Nukleinsäure kann für andere Analysen verwendet werden.

1) Studie über den Einfluss des pH-Wertes und der Temperatur auf die Desorption von RNA

Gemäß Fig. 5 ist die Desorption der Nukleinsäuren bei basischem pH-Wert aufgrund der Abnahme der Ladung auf dem Polymer verstärkt; bei saurem pH-Wert ist die Menge freigesetzter Nukleinsäuren wesentlich schwächer, denn die Partikel sind dann positiv geladen.
Gemäß Fig. 6 ist wie zuvor die Desorption von Nukleinsäuren bei basischem pH-Wert begünstigt. Sie ist gleichermaßen durch die Erhöhung der Temperatur begünstigt, denn bei einer Temperatur oberhalb der LCST (32ºC) ziehen sich die Partikel zusammen.

2) Studie über den Einfluss der Ionenstärke auf die Desorption von RNA

Gemäß Fig. 7 nehmen mit Erhöhung der Ionenstärke die elektrostatischen Anziehungswechselwirkungen zwischen der RNA und der Polymeroberfläche nach und nach ab.
Abschließend erfolgt die Desorption der Nukleinsäuren vorzugsweise bei 40ºC bei hoher Ionenstärke und basischem pH-Wert.
Darüber hinaus kann die Eigenschaft der Partikel, sich bei 40ºC (Temperatur oberhalb der LCST) zusammenzuziehen, dazu genutzt werden, um eine Lösung von Nukleinsäuren zu konzentrieren. In der Tat ziehen sich die Partikel, an die die Nukleinsäuren adsorbiert werden, nach der Adsorption der Nukleinsäuren und der Erhöhung der Temperatur über den LCST zusammen und nehmen so ein geringeres Volumen als im relaxierten Zustand ein und ermöglichen nach einer Zentrifugation die Aufnahme der Partikel in ein kleineres Endvolumen.

BEISPIEL 4: ADSORPTION UND DESORPTION VON RNA AUSGEHEND VON EINER GEMISCHTEN LÖSUNG AUS DNA UND BSA, WOBEI NIPAM- PARTIKEL VERWENDET WERDEN

Die Lösung von DNA von Staphylococcus epidermidis wird ausgehend von isolierten Bakterienkolonien gemäß dem Protokoll extrahiert und gereinigt, das von D. TRECO in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ed: Harvard. Medical School, 1992, Seiten 2-4/2-7, beschrieben wird.
Es wird eine 10%ige (w/v) BSA-(Rinderserumalbumin)Lösung (Intergen 3210-01) in MilliQ-Wasser verwendet.
PCR-Protokoll: bei der nachfolgenden PCR-Technik handelt es sich um jene, die von Goodman in PCR Strategies, Ed: Innis, Gelfand und Sninsky, Academic Press, 1995, Seiten 17-31, beschrieben wird. Es wurden zwei Amplifizierungsprimer verwendet; diese weisen folgende Sequenzen auf:
Primer 1: 5' ATCTTGACATCCTCTGACC 3' → SEQ ID Nr. 1
Primer 2: 5' TCGACGGCTAGCTCCAAAT 3' → SEQ ID Nr. 2
Im Amplifizierungsprotokoll wurden folgende Temperaturzyklen verwendet:
10 ul des Amplifizierungsproduktes wurden auf ein 0,8%iges Agarosegel (FMC 50003) gegeben, das zuvor mit Ethidiumbromid gefärbt wurde. Nach 45 Minuten elektrophoretischer Migration bei 180 V wurden die Nukleinsäurebanden mittels ultravioletter Bestrahlung sichtbar gemacht (D. VOYTAS in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ed: Harvard Medical School, 1992, Seiten 2-13/2-14).

1) Adsorption und Desorption von DNA an bzw. von den Partikeln und Detektion von freigesetzter DNA nach der PCR-Technik

Eine DNA-Lösung (10¹&sup0; Kopien pro ml) wurde an die Partikel bei 20ºC, pH-Wert von 4,6, für zwei Stunden adsorbiert, anschließend wurden diese für 15 Minuten bei 41ºC, pH-Wert von 8,3, Ionenstärke von 0,05 M einem Desorptionsschritt unterzogen, wie in den Beispielen 2 bzw. 3 beschrieben. Nach dem Desorptionsschritt und einer Zentrifugation wurde das in 50 ul Überstand aufgenommene Material mittels PCR amplifiziert und auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert. Auf dem Gel wird eine Bande mit erwarteter Größe (490 bp) detektiert. Darüber hinaus entspricht die nach der PCR detektierte DNA-Menge wenigstens jener Menge, die nach der Amplifikation mittels PCR von 10&sup6; Kopien pro ml DNA, die nicht zuvor an Partikel adsorbiert wurde, detektiert wird.
Die NIPAM94-Partikel können demnach ebenfalls zur Adsorption von DNA verwendet werden. Nach der Desorption kann die DNA in einer Amplifizierungsreaktion vom PCR-Typ verwendet werden.

2) Adsorption von DNA ausgehend von einer gemischten Lösung aus DNA und BSA, und Detektion von durch Desorption freigesetzter DNA nach der PCR-Technik

Eine DNA-Lösung (10¹&sup0; Kopien pro ml) wird in Gegenwart von 10% (w/v) BSA einem Schritt der Adsorption und der Desorption, wie in Beispiel 4-1 beschrieben, unterzogen. Es werden dieselben Techniken der Amplifizierung und der Detektion verwendet. Im Gel wird DNA mit erwarteter Größe (490 bp) detektiert. Die Intensität der sichtbar gemachten DNA-Bande ist in Gegenwart oder in Abwesenheit von BSA gleich.
Die NIPAM94-Partikel ermöglichen es DNA zu adsorbieren und durch Desorption freizusetzen, die aus einer gemischten Lösung von DNA und 10% BSA stammt. Das Vorhandensein von BSA in der Ausgangslösung stört nicht die Adsorption von DNA an die Partikel.

BEISPIEL 5: REINIGUNG VON NUKLEINSÄUREN, DIE AUS EINEM BAKTERIENLYSAT (Staphylococcus epidermidis) STAMMEN, WOBEI NIPAM-PARTIKEL VERWENDET WERDEN

1) Herstellung des Bakterienlysats

Es wird eine Über-Nacht-Kultur von Staphylococcus epidermidis bei 37ºC angelegt. Die Anzahl der in der Suspension enthaltenen Bakterien wird über die Messung der optischen Dichte bei 550 nm abgeschätzt. Durch 3-minütige Zentrifugation bei 14.000 Umdrehungen werden in 1,5-ml-Röhrchen Bakterienpellets, die 2·10&sup6;, 2·10&sup4; bzw. 2·10¹ Bakterien enthalten, hergestellt. Der Überstand wird entfernt und das Bakterienpellet wird gemäß der unten beschriebenen Technik lysiert (Anpassung von Arora et al., J. Dairy Sci. 1990, 73, 264-273).
Das Pellet wird in 1 ml Puffer (30 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,2) mit 6 mg/ml Proteinase K (Boehringer) und 300 ul Glaskugeln aufgenommen. Dieses Gemisch wird auf einem Vortex für 15 Minuten bei 37ºC geschüttelt. Nach einem Zentrifugationsschritt (3 Minuten bei 14.000 Umdrehungen) wird der Überstand, der die Nukleinsäuren enthält, für die späteren Schritte abgenommen.

2) Reinigung von Nukleinsäuren

Bei den verwendeten Partikeln handelt es sich um die thermosensiblen PNIPAM94-Partikel, deren Synthese in Beispiel 1 beschrieben ist.
Das nachfolgende Protokoll stellt das allgemeine Arbeitsverfahren für die Reinigungsreaktionen dar.
Das Reaktionsgemisch besteht aus 50 ul Bakterienlysat, das 10&sup5;, 10³ bzw. 10&sup6; Bakterien enthält, und aus 2 mg Partikeln. Das Endvolumen von einem Milliliter wird erhalten, indem das Reaktionsvolumen mit Phosphatpuffer (10 mM, pH 4,6) ergänzt wird. Die Reaktion wird für 30 Minuten bei 20ºC in einem Thermomixer (Eppendorf 5436) inkubiert. Nach einem Schritt der Zentrifugation für 20 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute wird der Überstand entfernt. Die Desorption der an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren erfolgt über den Effekt der Ionenstärke, indem 50 ml Elutionspuffer (0,5 M KCl, pH 8,3) zugegeben werden; die Reaktion wird für 15 Minuten bei 42ºC in dem Thermomixer inkubiert. Nach einem erneuten Schritt der Zentrifugation für 20 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute wird der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand abgenommen; 10 ul werden für einen Schritt der Amplifizierung von DNA (PCR) und 5 ul für einen Schritt der Amplifizierung von RNA (NASBA) verwendet.

3) Detektion von Nukleinsäuren

Nach einem Schritt der enzymatischen Amplifikation (PCR für DNA und NASBA für RNA) werden die gereinigten Nukleinsäuren analysiert. Die Amplifizierungsprodukte werden anschließend mittels ELOSA-Technik (Enzyme Linked Oligo Sorbent Assay) in Mikroplatten (NASBA) oder VIDAS (PCR) aufgedeckt.
PCR-Protokoll: Das folgende Protokoll ist das Gleiche wie jenes, das in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Amplifizierungsprodukte (90 ul) werden in dem Vidas-Immunoanalyseautomat (bioMérieux) gemäß dem Protokoll analysiert, das von Mabilat et al., J. Clin Microbiol.; 1994, 32, 2702-2705, beschrieben wird; die Fänger- und Detektionssonden sind Folgende:
Fängersonde:
5' ACCACCTGTCACTCTGTCCC 3' SEQ ID Nr. 3
Detektionssonde:
5' GGAAGGGGAAAACTCTATCTC 3' SEQ ID Nr. 4
Die Detektionssonde ist mit alkalischer Phosphatase konjugiert.
NASBA-Protokoll: Das folgende Protokoll ist das Gleiche wie jenes, das von Kievits et al., J. Virol. Methods (1991) 35, 273-286, beschrieben wird. Die verwendeten Primer weisen folgende Sequenzen auf:
Primer 1:
5' TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA 3' SEQ ID Nr. 5
Primer 2:
5' AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGTT TGTCACCGGC AGTCAACTTA GA 3' SEQ ID Nr. 6
Die Amplifizierungsprodukte (5 ul) werden mit einer ELOSA- Technik im Mikroplattenformat gemäß dem Protokoll analysiert, das von Mallet et al., J. Clin. Microbiol. (1993) 31, 1444- 1449, beschrieben wird. Die Fänger- und Detektionssonden weisen folgende Sequenzen auf:
Fängersonde:
5' GATAGAGTTTTCCCCTTC 3' SEQ ID Nr. 7
Detektionssonde:
5' GACATCCTCTGACCCCTCTA 3' SEQ ID Nr. 8
Die Detektionssonde ist mit der Meerrettichperoxydase konjugiert.
Proteinase K ist ein bekannter Inhibitor von Amplifizierungsreaktionen; es werden Verdünnungen von 1/10 bis 1/10 hergestellt, um den Grad der erhaltenen Reinigung zu quantifizieren.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV im Anhang zusammengestellt.
Die Inhibitionsfähigkeit der Proteinase K wird überprüft, da die Probe vor dem Amplifizierungsschritt 1/1000 verdünnt werden muss. Nach dem Reinigungsschritt wird die Probe vor dem Amplifizierungsschritt nur noch 1/10 verdünnt, was eine Zunahme um den Faktor 100 bedeutet. Die Partikel ermöglichen es, in einer Probe vorhandene RNA und DNA gemeinsam zu reinigen. Diese Nukleinsäuren sind mit den Schritten der enzymatischen Amplifizierung kompatibel.

BEISPIEL 6: REINIGUNG VON AUS EINEM BAKTERIENLYSAT (Staphylococcus epidermidis) STAMMENDEN NUKLEINSÄUREN, WOBEI DAS AUF EINEN MAGNETKERN GEPFROPFTE NIPAM-POLYMER VERWENDET WIRD

Die in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Partikel haben den Nachteil, dass nach den Adsorptions- und Desorptionsschritten Zentrifugationsschritte erforderlich sind. Diese Schritte dauern lang (2 Mal 20 Minuten) und sind schwierig zu automatisieren. Eine mögliche Alternative stellt das Pfropfen des NIPAM-Polymers auf kationische magnetische Träger dar. Einer der getesteten Träger ist das kationische magnetische Latex R95-07 (Estapor, Rhône-Poulenc), dessen Partikel polydispers sind.
Die Reinigungskapazität der so erhaltenen Partikel wurde getestet.

1) Synthese der magnetischen NIPAM-Partikel

Die kationischen Estapor-Partikel R95-07 wurden verkapselt. Vor jeder Verkapselung wurden die Partikel 3 Mal mit einer 0,005 M Salzsäurelösung gewaschen.
1 g der Polymerisationskeim-Partikel wird in 40 ml MilliQ- Wasser verdünnt, das zuvor gekocht und mit Stickstoff entgast wurde.
Styrol: 100 ug
NIPAM: 0,3254 g
BAM: 0,0274 g
MAE: 0,0740 g
Triton X-405 : 0,14 g
V50 : 0,0061 g
Für den Schritt des Vorquellens (2 Stunden bei 70ºC) werden 100 ug Styrol, NIPAM, BAM und MAE in 10 ul Wasser gelöst und auf den Polymerisationskeim (Estapor-Latex) aufgebracht. Der in 1 ml Wasser gelöste Beschleuniger wird zugegeben, um die Polymerisation um die Polymerisationskeim-Partikel zu ermöglichen. Die Polymerisation erfolgt in Stickstoffatmosphäre bei 70ºC.
Diese Partikel tragen dann eine Beladung von 220 und 82 umol NH&sub2;/g von Partikeln, ohne die Größenverteilung der Partikel zu verändern.

2) Reinigung von Nukleinsäuren

Bei dem verwendeten Protokoll handelt es sich um das gleiche, das in Beispiel 5 beschrieben wird, mit nachfolgenden Modifikationen.
- es wurden 200 ug Partikel verwendet,
- die Schritte der Zentrifugation, um die Partikel von den Überständen abzutrennen, wurden weggelassen und durch Schritte zur Abtrennung durch Einwirkung eines Magnetfeldes (Vorrichtung zur magnetischen Abtrennung, Promega® Z5342) ersetzt.
Alle anderen Schritte bleiben unverändert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V im Anhang zusammengestellt.
Die Inhibitionsfähigkeit der Proteinase K wird aufgespürt, da die Probe vor dem Amplifizierungsschritt 1/1000 verdünnt werden muss. Nach dem Reinigungsschritt kann die Probe vor dem Reinigungsschritt 1/10 (PCR) oder 1/100 (NASBA) verdünnt werden, was eine Zunahme um den Faktor 10 bis 100 bedeutet. Diese Partikel ermöglichen es gleichermaßen, in einer Probe vorhandene RNA und DNA gemeinsam zu reinigen. Diese Nukleinsäuren sind mit den Schritten der enzymatischen Amplifikation kompatibel. TABELLE IV
ºneg: negativ
*nt: nicht getestet
§RFV: relativer Fluoreszenzwert
#OD: optische Dichte TABELLE V
ºneg: negativ
*nt: nicht getestet
§RFV: relativer Fluoreszenzwert
#OD: optische Dichte

Claims

1. Verfahren, um in wässriger Phase Nukleinsäurematerial zu isolieren, das in einer Probe vorhanden ist, mit einem Schritt der Adsorption des Nukleinsäurematerials an einem aus Partikeln bestehenden Träger, dadurch gekennzeichnet, dass:

- in einem Erhalt des Adsorptionsreagenz genannten Schritt (a) ein Adsorptionsreagenz bereitgestellt wird, das ein Sol aufweist, das durch eine wässrige kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche Phase des aus Partikeln bestehenden Trägers gebildet wird, der ein funktionalisiertes, aus Partikeln bestehendes Polymer umfasst, wobei das Polymer durch Polymerisation von (1) einem ersten wasserlöslichen Monomer von Acrylamid oder einem Acrylamidderivat, (2) wenigstens einem Vernetzungsreagenz und (3) wenigstens einem zweiten funktionellen, kationischen und wasserlöslichen Monomer erhalten wird, und das Polymer eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) aufweist, die bei 25 bis 45ºC liegt,

- in einem In-Kontakt-Bringen genannten Schritt (b) das Adsorptionsreagenz mit der das Nukleinsäurematerial enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird,

- in einem Adsorption genannten Schritt (c) für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) wenigstens einer der folgenden Parameter für das Reaktionsmedium ausgewählt wird:

-- pH-Wert nicht höher als 7,

-- Ionenstärke nicht höher als 10&supmin;² M,

-- Temperatur unterhalb der LCST des Polymers,

- in einem Separation genannten Schritt (d) die diskontinuierliche Phase von der kontinuierlichen Phase getrennt wird, nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat, und

- in einem Desorption genannten Schritt (e) das Nukleinsäurematerial von dem aus Partikeln bestehenden Träger dissoziiert wird, indem die Ionenstärke bis auf eine Ionenstärke oberhalb von 10&supmin;² M erhöht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für den Schritt (e) der Desorption u. a. wenigstens einer der Parameter pH-Wert oder Temperatur wie folgt variiert wird:

- Erhöhung des pH-Wertes bis auf einen pH-Wert oberhalb von 7,

- Erhöhung der Temperatur bis auf eine Temperatur oberhalb des LCST des Polymers.

3. Verfahren, um in wässriger Phase Nukleinsäurematerial zu isolieren, das in einer Probe vorhanden ist, mit einem Schritt der Adsorption des Nukleinsäurematerials an einen aus Partikeln bestehenden Träger, dadurch gekennzeichnet, dass:

- in einem Adsorption genannten Schritt (c) für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) für das Reaktionsmedium eine Ionenstärke nicht höher als 10&supmin;² M gewählt wird,

- in einem Separation genannten Schritt (d) die diskontinuierliche Phase von der kontinuierlichen Phase getrennt wird, nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für den Schritt (c) der Adsorption u. a. für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) für das Reaktionsmedium wenigstens einer der folgenden Parameter ausgewählt wird:

- pH-Wert nicht höher als 7,

- Temperatur unterhalb der LCST des Polymers.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der aus Partikeln bestehende Träger aus einem aus Partikeln bestehenden funktionalisierten Polymer besteht, das durch Polymerisation von (1) einem wasserlöslichen ersten Monomer von Acrylamid oder einem Acrylamidderivat, von (2) wenigstens einem wasserlöslichen Vernetzungsreagenz und von (3) wenigstens einem zweiten funktionellen, kationischen und wasserlöslichen Monomer erhalten wird, und das Polymer eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) aufweist, die bei 25 bis 45ºC liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der aus Partikeln bestehende Träger u. a. einen ganz oder teilweise mit dem aus Partikeln bestehenden Polymer bedeckten Kern umfasst, wobei der Kern die Adsorptionseigenschaften des Polymers für das Nukleinsäurematerial nicht verändert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern ein magnetischer Kern aus Polystyrol ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe vor dem Schritt (b) oder dem Reaktionsmedium nach dem Schritt (b) und insbesondere nach dem Schritt (c) oder dem Schritt (d) wenigstens eine Sonde und/oder ein Primer zugegeben wird, die/der spezifisch mit dem Nukleinsäurematerial hybridisieren kann.

9. Verfahren, um in flüssiger Phase Nukleinsäurematerial zu isolieren, das in einer Probe vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, dass:

- in einem In-Kontakt-Bringen genannten Schritt (b) das Adsorptionsreagenz mit einer Sonde oder einem Primer in Kontakt gebracht wird,

- in einem Adsorption genannten Schritt (c) für das In- Kontakt-Bringen gemäß (b) für das Reaktionsmedium wenigstens einer der folgenden Parameter ausgewählt wird:

-- pH-Wert nicht höher als 7,

-- Ionenstärke nicht höher als 10&supmin;² M,

-- Temperatur unterhalb der LCST des Polymers,

um ein Hybridisierungsreagenz zu erhalten,

- in einem Separation genannten Schritt (d) die diskontinuierliche Phase von der kontinuierlichen Phase getrennt wird, nachdem ggf. beobachtet wurde, dass die Adsorption stattgefunden hat,

- in einem Erhalt eines Hybridisierungskomplexes genannten Schritt (b') das Hybridisierungsreagenz mit dem Nukleinsäurematerial in Kontakt gebracht wird, und

- in einem Desorption genannten Schritt (e) der Hybridisierungskomplex durch Desorption von dem aus Partikeln bestehenden Träger dissoziiert wird, indem die Ionenstärke bis auf eine Ionenstärke oberhalb von 10&supmin;² M erhöht wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die LCST des Polymers bei 30 bis 40ºC liegt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Monomer (1) ausgewählt ist aus den N-Alkylacrylamiden und den N,N-Dialkylacrylamiden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Monomer (1) ausgewählt ist aus N-Isopropylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N- isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid, wobei das erste Monomer vorzugsweise N-Isopropylacrylamid (NIPAM) ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten funktionellen Monomere (3) ausgewählt sind aus den Acrylderivaten und den Methacrylderivaten, dem Chlorid von 2-Aminoethylmethacrylat (AEM), den Derivaten von N-Vinylpyridin, den Derivaten von Trialkylammonium und den Derivaten von Isothiouroniumchlorid.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Vernetzungsreagenz (2) ausgewählt ist aus N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglycoldimethacrylat.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) das Polymer durch Radikalenpolymerisation in Gegenwart eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt wird, der ausgewählt ist aus den neutralen und kationischen, wasserlöslichen Beschleunigern wie beispielsweise das Chlorid von 2,2'-Azobisamidinopropan (V50).

16. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Schritt (d) der Separation einen Desorption genannten Schritt umfasst, in dem das Nukleinsäurematerial durch Desorption von dem aus Partikeln bestehenden Träger dissoziiert wird, indem wenigstens einer der Parameter Ionenstärke, pH-Wert und Temperatur wie folgt verändert wird:

- Erhöhung der Ionenstärke bis auf eine Ionenstärke oberhalb von 10&supmin;² M,

- Erhöhung des pH-Wertes bis auf einen pH-Wert oberhalb von 7,

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (d) der Separation mittels einer Technik durchgeführt wird, die ausgewählt ist aus Zentrifugation, Filtration, Präzipitation, Sedimentation und Anlegung eines magnetischen Feldes.