DE69625513T2

DE69625513T2 - Transferrinrezeptor protein aus moraxella

Info

Publication number: DE69625513T2
Application number: DE69625513T
Authority: DE
Inventors: E Harkness; H Klein; E Myers; Yan-Ping Yang
Original assignee: Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1995-10-11
Filing date: 1996-10-11
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2016-10-12
Also published as: HK1017695A1; US6290970B1; BR9610872A; CN1204344A; BR9610872B8; CA2234409C; US6190668B1; EP0866803B1; JP4005634B2; EP0866803A1; CN1318446C; ATE229979T1; DE69625513D1; CA2234409A1; JP2007291128A; WO1997013785A1; AU711791B2; JPH11500744A; AU7208296A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und beschäftigt sich insbesondere mit Transferrinrezeptorprotein von Moraxella, Verfahren zur Herstellung und Anwendungen davon.

Hintergrund der Erfindung

Otitis media bzw. Mittelohrentzündung ist die häufigste Erkrankung in der frühen Kindheit, wobei ungefähr 80% aller Kinder mindestens einen Anfall von Mittelohrentzündung vor dem Alter von drei erleiden (Ref. 1 - Überall in dieser Anmeldung wird auf verschiedene Bezugstellen in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, welchen diese Erfindung betrifft. Die volle bibliographische Information für jedes Zitat findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorausgehend zu den Ansprüchen. Die Offenbarungen dieser Bezugstellen sind hierin durch den Bezug darauf in der vorliegenden Beschreibung einbezogen). Chronische Mittelohrentzündung kann zur Beeinträchtigung des Hörens, Sprechens und der Wahrnehmung bei Kindern führen. Sie wird durch eine bakterielle Infektion mit Streptococcus pneumoniae (ungefähr 50%), nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae (ungefähr 30%) und Moraxella (Branhamella) catarrhalis (ungefähr 20%) verursacht. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Mittelohrentzündung zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und chirurgische Eingriffe, wie Tonsillektomien, Adenoidektomien und Insertion von Tympanostomie-Schläuchen. Weil Mittelohrentzündung in einem Lebensabschnitt auftritt, bei dem sich das Sprachvermögen in raschem Fortschritt entfaltet, sind Entwicklungsstörungen, die spezifisch das Lernen und die Hörwahrnehmung betreffen, bei Heranwachsenden mit häufiger Mittelohrentzündung dokumentiert worden.
M. catarrhalis besiedelt hauptsächlich den respiratorischen Trakt und ist vorwiegend ein Schleimhautpathogen. Untersuchungen unter Verwendung von Kulturen aus Mittelohr-Fluid, erhalten durch Tympanozentese, haben gezeigt, dass M. catarrhalis ungefähr 20% der Fälle von Mittelohrentzündung verursacht (Ref. 2).
Lange als ein oppotunisitisches Pathogen angesehen, wird jetzt erkannt, dass B. catarrhalis eine Vielzahl von potentiell schwächenden Krankheiten beim Menschen als Ergebnis von lokalisierter oder, seltener, systemischer Infektion verursacht.
M. catarrhalis ist eine bedeutende Ursache von Infektionen der unteren Atemwege in Erwachsenen, insbesondere beim Ausbruch von chronischer Bronchitis und Emphysem (Ref. 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9). M. catarrhalis verursacht auch Sinusitis bei Kindern und Erwachsenen (Ref. 10, 11, 12, 13 und 14) und verursacht gelegentlich eine invasive Erkrankung (Ref. 15, 16, 17, 18, 19 und 20). In der Hospitalumgebung bestand der Verdacht auf M. catarrhalis in Ausbrüchen von Krankenhaus-Infektion (Ref. 21).
Das Vorkommen von durch M. catarrhalis verursachter Mittelohrentzündung ist zunehmend. Mit der Entwicklung von Wegen zur Verhinderung von durch Pneumococcus und nicht-typisierbarem H. influenzae verursachter Mittelohrentzündung kann man erwarten, dass die relative Bedeutung von KL catarrhalis als einer Ursache von Mittelohrentzündung weiter wächst. Auch wird Antibiotika-Resistenz in klinischen Isolaten von M. catarrhalis üblich (Ref. 22). So sind vor 1970 keine β-Lactamase erzeugenden M. catarrhalis-Stämme berichtet worden, aber seit Mitte der siebziger Jahre sind β-Lactamase exprimierende Stämme mit einer stetig zunehmenden Häufigkeit unter den Isolaten nachgewiesen worden. Kürzliche Überprüfungen legen nahe, dass 75% der klinischen Isolate β-Lactamase herstellen.
Die Eisen-Beschränkung ist ein allgemeiner Wirts-Verteidigungsmechanismus gegen mikrobielle Pathogene, allerdings ist sie nicht notwendigerweise Wachstumsraten-beschränkend für alle Pathogene (Ref. 23). Eine Anzahl von Bakterienarten, einschließlich Neisseria menigitidis (Ref. 24), N. gonorrhoeae (Ref. 25) und Haemophilus influenzae (Ref. 26) exprimiert zwei Außenmembranproteine, welche spezifisch humanes Transferrin binden (Ref. 27, 28). Die Expression dieser Proteine wird durch die Menge an Eisen in der Wachstumsumgebung gesteuert. Anders als die Rezeptoren von anderen Bakterienarten, haben die M. catarrhalis- Rezeptoren eine bevorzugte Affinität für eisenbeladenes (d. h. Ferri-)Transferrin (Ref. 29). Die zwei M. catarrhalis-Transferrinrezeptoren (TfR) besitzen Molekularmassen von 115 kDa (TfR1) und etwa 80 bis 90 kDa (TfR2) (Ref. 27).
Das Außenmembranprotein OMP B2 (Ref. 30, 31) hat eine zu der von TfR2 ähnliche Molekularmasse, und es ist berichtet worden, dass die Expression von OMP B2 eisenreguliert ist (Ref. 32).
Yu und Schryvers (Ref. 29) beschreiben ein Verfahren zur Reinigung der Transferrinrezeptorproteine TfR1 und TfR2 aus M. catarrhalis durch selektive Elution aus einer Transferrin- Sepharose-Affinitätssäule unter Verwendung des denaturierenden Mittels Guanidin-HCl.
In diesem Verfahren der präparativen Isolation von Rezeptorproteinen wurde eine Suspension von eisenleeren Roh-M. catarrhalis-Membranen durch die Zugabe von EDTA zu 20 mM und Sarkosyl zu 0,75% solubilisiert und dann wurde die Mischung 15 Minuten lang bei 20000 · g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Zwanzig ml Fe&sub2;hTF-Sepharose (d. h. eine eisengesättigte Form von humanem Transferrin) wurden zum Überstand zugesetzt und dann unter Mischen bei Raumtemperatur 45 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wurde auf eine Säule aufgetragen, und nach Entfernung der Bindungslösung wurde das Harz mit zusätzlichen 250 ml eines Puffers aus 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,75% Sarkosyl, pH 8, enthaltend 250 mM Guanidin-HCl, gewaschen. Das TfR2-Protein wurde unter Verwendung eines Puffers (ohne Sarkosyl), enthaltend 1,5 M Guanidin-HCl, eluiert, und anschließend wurde das TfR1-Protein durch Anwendung eines Puffers, enthaltend 4 M Guanidin-HCl, eluiert. Die Fraktionen wurden gegen 50 mM Tris HCl, pH 8, über eine Dauer von 24 Stunden dialysiert.
In einer weiteren Modifikation dieser Vorgehensweise wurde apohTf-Sepharose mit der solubilisierten Membranpräparation gemischt, um TfR1 zu binden, und dann wurde die behandelte solubilisierte Membranpräparation an Fe&sub2;hTf-Sepharose ausgesetzt, um das restliche TfR2 zu binden. Die Affinitätsharze wurden anschließend gewaschen und die Rezeptorproteine wurden eluiert, wie obenstehend beschrieben.
Eine M. catarrhalis-Infektion kann zu einer schweren Krankheit führen. Es wäre vorteilhaft, nicht-denaturiertes Transferrinrezeptorprotein aus M. catarrhalis zur Verwendung als Antigene in immunogenen Präparationen, einschließlich Impfstoffen, Trägern für andere Antigene und Immunogene, und zur Erzeugung von diagnostischen Reagenzien vorzusehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung zielt auf die Bereitstellung eines gereinigten und isolierten Transferrinrezeptorproteins von Moraxella catarrhalis und anderen Moraxella-Stämmen mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis 90 kDa.
Gemäß eines Aspekts der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes, nicht denaturiertes Transferrinrezeptorprotein (TfR2) aus einem Moraxella-Stamm mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa, wie bestimmt mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), vorgesehen. Das Transferrinrezeptorprotein kann im wesentlichen in seiner nativen Konformation vorliegen (so dass im wesentlichen die charakteristische Immunogenität des Transferrinrezeptorproteins im Moraxella-Stamm beibehalten wird) und kann aus einem M. catarrhalis-Stamm, wie aus M. catarrhalis 4223, 5191 oder 135, isoliert sein. Ein solches isoliertes und gereinigtes Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa ist im wesentlichen frei von Nicht-80-bis-90-kDa-Moraxella-Proteinen, insbesondere dem OMP-B2-Protein und dem Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 105 kDa der Moraxella-Stämme, Phospholipiden und Lipopolysaccharid von Moraxella. Das etwa 80 bis etwa 90 kDa große Transferrinrezeptorprotein ist zu mindestens etwa 70 Gew.-% rein, vorzugsweise mindestens etwa 90 Gew.-% rein, und kann in Form einer wäßrigen Lösung davon vorliegen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch eine immunogene Zusammensetzung vor, umfassend eine immuneffektive Menge einer aktiven Komponente, welche das hierin vorgesehene Transferrinrezeptorprotein sein kann, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür. Die immunogene Zusammensetzung kann als ein Impfstoff für in vivo-Verabreichung an einen Wirt formuliert werden, um Schutz gegen durch einen Stamm von Moraxella, insbesondere M. catarrhalis, verursachte Krankheiten zu gewähren. Die immunogene Zusammensetzung kann als eine Mikroteilchen-Kapsel, ISCOM oder Liposomen-Präparation formuliert werden. Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Targeting- Molekül für die Zuführung an spezifische Zellen des Immunsystems oder an Schleimhautoberflächen eingesetzt werden. Einige Targeting-Moleküle schließen Stamm B 12- und Fragmente von bakteriellen Toxinen, wie beschrieben in der WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), und monoklonale Antikörper, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 194 254 (Barber et al.), ein. Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung (einschließlich Impfstoffen) können ferner mindestens ein weiteres immunogenes oder immun-stimulierendes Material umfassen, und das immun-stimulierende Material kann mindestens ein Adjuvanz sein. Geeignete Adjuvanzien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen (ohne darauf eingeschränkt zu sein) Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A, Derivate und Komponenten davon, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glycolipidanalog, einen Octadecylester einer Aminosäure, ein Muramyldipetid, Polyphosphazen und ein Lipoprotein ein Vorteilhafte Kombinationen von Adjuvanzien werden in der US-A-5 837 250 beschrieben. Die Erfindung schließt ferner einen für das hierin vorgesehene Transferrinrezeptorprotein spezifischen Antikörper ein, herstellbar durch Immunisieren eines Wirts mit einer immunogenen Zusammensetzung, wie hierin vorgesehen.
Die hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzungen kann formuliert werden, um mindestens ein zusätzliches Immunogen zu umfassen, welches umfassen oder abgeleitet sein kann aus einem Paramyxovirus, Chlamydia, Polio, Hepatitis B, Diphtherie-Toxoid, Tetanus- Toxoid, Influenza, Haemophilus, Pertussis, Pneumococcus, Mycobacteria und Hepatitis A.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Wirt vorgesehen, umfassend das Verabreichen einer immun-wirksamen Menge der immunogenen Zusammensetzung, wie hierin vorgesehen, an denselben. Die Immunantwort kann eine humorale oder eine zellvermittelte Immunantwort sein. Wirte, in denen ein Schutz gegen Krankheit gewährt werden kann, schließen Primaten einschließlich Menschen ein.
Die vorliegende Erfindung sieht, in einem zusätzlichen Aspekt davon, ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs vor, umfassend das Verabreichen einer hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzung an einen Testwirt zur Bestimmung der Menge und der Häufigkeit der Verabreichung des Transferrinrezeptorproteins, um Schutz gegen eine durch einen Stamm von Moraxella verursachte Krankheit zu gewähren, und das Formulieren des Transferrinrezeptorproteins in einer Form, die zur Verabreichung an einen behandelten Wirt gemäß der bestimmten Menge und Häufigkeit der Verabreichung geeignet ist. Der behandelte Wirt kann ein Mensch sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Antikörpern in einer Probe vor, die spezifisch mit einem Transferrinrezeptorprotein eines Stamms von Moraxella mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa reaktiv sind, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Transferrinrezeptorprotein, wie hierin vorgesehen, um Komplexe zu erzeugen, welche das Transferrinrezeptorprotein und irgendwelche der Antikörper, die in der Probe vorliegen, welche spezifisch damit reagieren, umfassen; und
(b) Feststellen der Erzeugung der Komplexe.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Feststellen des Vorliegens eines Transferrinrezeptorproteins eines Stamms von Moraxella mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa in einer Probe vorgesehen, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Immunisieren eines Subjekts mit der immunogenen Zusammensetzung, wie hierin vorgesehen, um Antikörper zu erzeugen, die für das Transferrinrezeptorprotein spezifisch sind;
(b) Inkontaktbringen der Probe mit den Antikörpern, um Komplexe zu erzeugen, welche jegliches Außenmembranprotein, das in der Probe vorliegt, und die Außenmembranprotein-spezifischen Antikörper umfassen; und
(c) Feststellen der Erzeugung der Komplexe.
Das Transferrinrezeptorprotein kann Teil eines Moraxella catarrhalis-Stamms sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Diagnosekit zur Feststellung des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch mit dem Transferrinrezeptorprotein eines Stamms von Moraxella mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa reagieren, vor, umfassend:
(a) das Transferrinrezeptorprotein, wie hierin vorgesehen;
(b) Mittel zum Inkontaktbringen des Transferrinrezeptorproteins mit der Probe, um Komplexe zu erzeugen, welche das Transferrinrezeptorprotein und jegliche Antikörper, die in der Probe vorliegen, umfassen; und
(c) Mittel zum Feststellen der Erzeugung der Komplexe.
Die Erfindung sieht auch ein Diagnosekit zur Feststellung des Vorliegens eines Transferrinrezeptorproteins eines Stamms von Moraxella mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa in einer Probe vor, umfassend:
(a) einen Antikörper, spezifisch für das etwa 80 bis etwa 90 kDa große Transferrinrezeptorprotein, wie hierin vorgesehen;
(b) Mittel zum Inkontaktbringen des Antikörpers mit der Probe, um einen Komplex zu erzeugen, welcher das Transferrinrezeptorprotein und für das Transferrinrezeptorprotein spezifischen Antikörper umfasst; und
(c) Mittel zum Feststellen der Erzeugung des Komplexes.
Die vorliegende Erfindung sieht, in einem weiteren Aspekt, ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs vor, umfassend das Verabreichen der hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzung an einen Testwirt zur Bestimmung der Menge und der Häufigkeit der Verabreichung davon, um Schutz gegen eine durch einen Moraxella-Stamm verursachte Krankheit zu gewähren, welcher ein Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE, oder ein Protein, fähig zur Induzierung von Antikörpern in einem Testwirt, welche spezifisch mit dem Transferrinprotein reagieren, erzeugt; und das Formulieren der immunogenen Zusammensetzung in einer Form, die geeignet ist zur Verabreichung an einen behandelten Wirt, einschließlich eines menschlichen Wirts, gemäß der bestimmten Menge und Häufigkeit der Verabreichung.
In einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper vorgesehen, spezifisch für ein Transferrinrezeptorprotein eines Moraxella-Stamms mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa, umfassend:
(a) Verabreichen des hierin vorgesehenen Transferrinrezeptorproteins an wenigstens eine Maus, um mindestens eine immunisierte Maus herzustellen,
(b) Entfernen von B-Lymphocyten aus der mindestens einen immunisierten Maus;
(c) Fusionieren der B-Lymphocyten aus der mindestens einen immunisierten Maus mit Myelomzellen, wodurch Hybridome erzeugt werden;
(d) Klonieren der Hybridome;
(e) Selektieren von Klonen, welche Anti-Transferrinrezeptorprotein-Antikörper herstellen;
(f) Kultivieren der Anti-Transferrinrezeptorprotein-Antikörper-herstellenden Klone; und dann
(g) Isolieren der Anti-Transferrinrezeptorprotein-Antikörper aus den Kulturen.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten und gereinigten, nicht denaturierten Transferrinrezeptorproteins aus einem Stamm von Moraxella, wie M. catarrhalis, mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa vorgesehen, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Zellmasse des Moraxella-Stammes;
(b) Selektives Extrahieren wäßriger löslicher Proteine aus der Zellmasse, um einen ersten Überstand und ein erstes Pellet bereitzustellen;
(c) Trennen des ersten Überstandes von dem ersten Pellet;
(d) selektives Solubilisieren wenigstens eines Transferrinrezeptorproteins mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa aus dem ersten Pellet, um einen zweiten Überstand und ein zweites Pellet bereitzustellen;
(e) Trennen des zweiten Überstandes von dem zweiten Pellet; und
(f) Reinigung des Transferrinrezeptorproteins mit einer Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa in dem zweiten Überstand, so dass es im wesentlichen frei ist von anderen Moraxella-Proteinen, welche aus dem ersten Pellet in dem selektiven Solubilisierungsschritt solubilisiert wurden.
Die in Wasser löslichen Proteine können selektiv aus der Zellmasse extrahiert werden durch Inkontaktbringen der Zellmasse mit einer gepufferten wäßrigen Lösung, welche etwa 50 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5 umfassen kann, Ultraschallbehandeln der Zellmasse, um selbige aufzubrechen, und Zentrifugation zur Bildung des ersten Pellets und des ersten Überstands. Der selektive Solubilisierungsschritt kann durch mindestens einmaliges Inkontaktbringen des ersten Pellets mit einer gepufferten wäßrigen Lösung, bei der es sich handeln kann um etwa 20 mM bis etwa 1 M Tris-HCl, umfassend ein Detergens, welches etwa 0,2 bis etwa 2 Gew.-% Triton X-100 (Warenzeichen für nicht-ionisches Detergens, welches Octadecylphenol(ethylenglykol) 10) sein kann, und ein Solubilisierungsmittel, welches etwa 2 bis etwa 20 mM EDTA sein kann, Ultraschallbehandeln des ersten Pellets, um selbige aufzubrechen, und Zentrifugation zur Bildung des zweiten Pellets und des zweiten Überstands erfolgen. Derartige Kontaktierungs-, Ultraschallbehandlungs- und Zentrifugations-Schritte können mindestens zweimal bewerkstelligt werden, und der Überstand aus jedem solchen Schritt wird dann vereinigt, um den zweiten Überstand bereitzustellen.
Der Reinigungsschritt kann durch mehrere Arbeitsschritte auf Chromatographiesäulen erfolgen, welche einschließen können:
(a) einen ersten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer ersten Chromatographiesäule, welche eine DEAE-Sephacel-Säule sein kann, durch welche der Transferrinrezeptor selektiv hindurchfließt und an welche kontaminierende Proteine binden, wie durch die Verwendung eines Puffers, umfassend etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5,
(b) einen zweiten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer zweiten Chromatographiesäule, welche eine Kationenaustauschermatrix, wie SE-Cellulose/D529, umfasst, durch welche der Transferrinrezeptor selektiv hindurchfließt und an welche kontaminierende Proteine binden, wie durch die Verwendung eines Puffers, umfassend etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5,
(c) einen dritten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer dritten Chromatographiesäule, wie Hydroxyapatit, an welche das Transferrinrezeptorprotein, bevorzugt vor dem OMP B2-Protein, selektiv gebunden wird; wie durch Beladen der Säule bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5, und
(d) Eluieren des Transferrinrezeptorproteins aus der dritten Chromatographiesäule, wie durch Verwendung einer Pufferlösung mit einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5, enthaltend etwa 100 bis etwa 250 mM KH&sub2;PO&sub4;.
Die hierin vorgesehene Herstellungsverfahrensweise führt zur Isolierung des Transferrinrezeptorproteins in einer gereinigten Form und in einer nicht denaturierten Form.
In dieser Anmeldung wird der Ausdruck "ein Transferrinrezeptorprotein (TfR2) aus einem Moraxella-Stamm mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa" verwendet, um eine Familie von Transferrinrezeptorproteinen aus M. catarrhalis mit einer Molekülmasse zwischen etwa 80 und etwa 90 kDa zu definieren und schließt Proteine ein, welche Variationen in ihren Aminosäuresequenzen aufweisen, einschließlich denjenigen, welche natürlich in verschiedenen Stämmen von Moraxella vorkommen.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen folgendes ein:
- ein Verfahren zur Isolierung von gereinigtem Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa aus einem Moraxella-Stamm, welcher das Transferrinrezeptorprotein erzeugt, einschließlich Moraxella catarrhalis;
- ein isoliertes und gereinigtes, nicht denaturiertes Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa, und isolierbar aus einem Moraxella- Stamm; und
- Diagnosekits und immunologische Reagenzien zur spezifischen Identifikation von Moraxella und damit infizierten Wirten.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die vorliegende Erfindung wird ferner aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren verstanden werden, in welchen:
die Fig. 1 ein Flußdiagramm eines Verfahrens zur Reinigung von Transferrinrezeptorprotein aus Moraxella catarrhalis gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist;
die Fig. 2 eine Analyse von isoliertem und gereinigtem Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa durch SDS-PAGE zeigt;
die Fig. 3 die Fähigkeit von gereinigtem Transferrinrezeptor zeigt, an humanes Transferrin zu binden;
die Fig. 4(a), 4(b) und 4(c) eine Immunoblot-Analyse von gereinigtem Transferrinrezeptorprotein zeigen; und
die Fig. 5(a) und 5(b) Immunoblots sind, um die Fähigkeit von Meerschweinchen-Anti- Tfr-Antiseren zu zeigen, welche hergestellt wurden durch Immunisierung mit isoliertem und gereinigtem Transferrinrezeptorprotein, spezifisch zwischen M. catarrhalis und anderen bakteriellen Pathogenen, welche Mittelohrentzündung verursachen, zu unterscheiden.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue Techniken, welche für die Herstellung von gereinigtem Transferrinrezeptorprotein Tfr1 aus M catarrhalis eingesetzt werden können. Jedweder M. catarrhalis-Stamm, der Tfr2 erzeugt, kann zweckdienlicherweise verwendet werden, um das isolierte und gereinigte Tfr2, wie hierin vorgesehen, bereitzustellen. Derartige Stämme sind im allgemeinen aus klinischen Quellen und aus Bakterien-Kultursammlungen erhältlich. Geeignete Stämme von M. catarrhalis können M. catarrhalis 5191, 135 und 4223 einschließen.
Unter Bezug auf die Fig. 1 wird ein Flußdiagramm eines Verfahrens zur Reinigung eines Transferrinproteins aus M. catarrhalis mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 bis etwa 90 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht. Die verschiedenen nachstehend beschriebenen Arbeitsschritte können bei Umgebungstemperaturen, im allgemeinen etwa 4º bis etwa 30ºC, erfolgen. Ganze Zellen werden mit einem wäßrigen Puffermedium, das etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5 enthalten kann, kontaktiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, um im Anschluß an Zentrifugation einen ersten Überstand (S1) und ein erstes Pellet (PPTL) zu bilden. Der Überstand (51) enthält einen wesentlichen Anteil des löslichen Proteins aus dem Zellpellet und wird verworfen. Das verbleibende Pellet (PPT1) wird selektiv mit Detergens extrahiert, um jedwede restlichen löslichen Proteine zu entfernen und Membranproteine, einschließlich des TfR2-Proteins, aus dem Pellet zu solubilisieren. Eine solche selektive Extraktion kann auf eine beliebige zweckmäßige Weise erfolgen. Eine derartige Verfahrensweise kann mehrfache Detergensextraktionen des Pellets beinhalten. Insbesondere kann eine erste Detergensextraktion unter Verwendung VOIl Triton X-100 und EDTA erfolgen, worauf eine Zentrifugation folgt, um ein zweites Pellet (PPT2) und einen zweiten Überstand (S2), der zurückbehalten wird, zu bilden. Im Anschluß an die Trennung des zweiten Überstands (S2) wird das verbleibende Pellet PPT2 erneut mit Detergens extrahiert, wobei Triton X-100 und EDTA verwendet werden, gefolgt von Zentrifugation. Der resultierende dritte Überstand (S3), folgend aus der Trennung vom zurückbleibenden dritten Pellet (PPT3), das verworfen wird, wird mit dem zweiten Überstand (S2) aus der ersten Extraktion vereinigt, um die vereinigten Überstände (TfR2-1) vorzusehen. Solche Extraktionen mit Triton-X-100 können unter Verwendung einer Lösung einer Konzentration von etwa 0,2 bis etwa 2 Gew. -% Triton X-100 und etwa 2 bis etwa 20 mM EDTA unter Pufferbedingungen, wie einem pH- Wert von etwa 7 bis etwa 8,5, unter Verwendung von etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris erfolgen.
Die vereinigten Überstände (TfR2-1) enthalten das TfR2-Protein sowie kontaminierende M catarrhalis-Proteine, einschließlich des OMP-B2-Proteins, welches dieselbe ungefähre Molekülmasse aufweist (siehe Spuren 3 und 5, Fig. 2). Die vereinigten Überstände (TfR2-1) werden verarbeitet, um derartige Verunreinigungen in einer Reihe von Säulenchromatographie- Arbeitsschritten zu entfernen.
In einem ersten derartigen Säulenchromatographie-Arbeitsschritt können die vereinigten Überstände (TfR2-1) auf eine DEAE-Sephacel-Säule oder eine andere geeignete Säule aufgetragen werden, welche geeignet gepuffert ist, wie mit etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5, um das Hindurchfließen des TfR2-Proteins durch die Säule zu erlauben, während Verunreinigungen an die Säule gebunden werden. Die DEAE-Sephacel- Säule kann vor einer weiteren Verarbeitung des Durchflusses gewaschen werden.
Der Durchfluß und die Waschung aus der DEAE-Sephacel-Säule (TfR2-2) kann dann auf eine Kationenaustauschsäule aufgetragen werden, zum Beispiel SE-Cellulose/D529 oder 5- Sepharose, welche geeignet gepuffert ist, wie mit etwa 10 mM bis etwa 1 M Tris-HCl bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5, um das Hindurchfließen des TfR2-Proteins durch die Säule zu gestatten, während Verunreinigungen an die Säulen - gebunden werden. Die Kationenaustauschsäule kann vor der weiteren Verarbeitung des Durchflusses gewaschen werden (siehe Spur 4, Fig. 2).
Der Durchfluß und die Waschung aus der Kationenaustauschsäule (TfR2-3), welcher noch das OMP-B2-Protein sowie kleine Mengen an restlichen proteinartigen Kontaminanten enthält, kann dann auf eine Hydroxyapatitsäule unter derartigen Pufferbedingungen aufgetragen werden, dass das TfR2-Protein an die Säule bevorzugt vor dem OMP-B2-Protein und anderen kontaminierenden Proteinen bindet, welche durch die Säule hindurchfließen. Solche Bedingungen können bereitgestellt werden, indem etwa 5 bis etwa 50 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von etwa 6 bis etwa 8,5 verwendet wird. Der Durchfluß enthält die kontaminierenden Proteine (siehe Spur 5, Fig. 2).
Im Anschluß an wiederholtes Waschen mit dem Puffer, um auf der Säule zurückgehaltene Kontaminanten zu entfernen, wird das TfR2-Protein dann von der Hydroxyapatitsäule unter Verwendung eines geeigneten Puffers, wie etwa 150 bis etwa 250 mM Kaliumphosphatpufferlösung bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden aufgefangen, Aliquots werden mittels SDS-PAGE analysiert, und TfR2-enthaltende Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen können konzentriert werden, um eine TfR2- Protein-enthaltende Lösung vorzusehen (siehe Spur 6, Fig. 2). Mit dieser Vorgehensweise wird eine wäßrige Lösung eines isolierten und gereinigten, nicht denaturierten TfR2-Proteins vorgesehen. Die wäßrige TfR2-Lösung kann in irgendeiner zweckmäßigen Konzentration vorgesehen werden, konsistent mit der beabsichtigten Verwendung des Materials, im allgemeinen etwa 100 bis etwa 200 ug/ml.
Unter Bezugnahme aud die Fig. 2 wird eine Analyse der Reinheit des Transferrinrezeptorproteins durch SDS-PAGE-Analyse gezeigt, welches durch das hierin beschriebene Verfahren gereinigt wurde, wie typisch veranschaulicht durch jenes, welches schematisch in der Fig. 1 gezeigt ist. In der Fig. 2, Spur 1, wird das M. catarrhalis-Zelllysat gezeigt. Die Spur 2 zeigt die vereinigten Überstände (TfR2-1). Die Spur 3 zeigt die Durchlauffraktionen im Anschluß an DEAE-Sephacel-Säulenchromatographie (TfR2-2), und die Spur 4 zeigt die Durchlauffraktionen von SE-Cellulose/D529-Säulenchromatographie (TfR2-3). Die Spur 5 zeigt die Durchfluß-Fraktion von HTP und enthält das OMP-B2-Protein. Die Spur b zeigt die HTP- gebundene Fraktion, welche TfR2 enthält. Die Spur 7 zeigt das Transferrinrezeptorprotein TfR2, isoliert durch Affinitätschromatographie, im wesentlichen wie beschrieben in Ref. 29. Das Verfahren zur Reinigung von TfR2-Protein, wie hierin vorgesehen, erzeugt eine wenigstens 70% reine TfR2-Froteinpräparation. Die veranschaulichte Präparation in Spur 6 in der Fig. 2 ist zu wenigstens 95% rein, wie durch Densitometrie-Scanning bestimmt.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3 wird die Fähigkeit von gereinigtem TfR2 von M. catarrhalis, wie hierin vorgesehen, veranschaulicht, spezifisch humanes Transferrin zu binden. Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt, und die in vitro-Transferrinbindung wurde geprüft, im wesentlichen wie beschrieben in Ref. 27. Die Spur 1 enthält TfR2 von M. catarrhalis, isoliert durch Affinitätschromatographie, im wesentlichen wie beschrieben in Ref. 29. Die Spur 2 enthält TfR2 aus M. catarrhalis, gereinigt wie hierin beschrieben. Die Spur 3 enthält M. catarrhalis OMPB2-Protein. Wie aus der Fig. 3 ersehen werden kann, binden die Transferrinbindungsprotein-Präparationen spezifisch Transferrin. Diese Ergebnisse bestätigen die Isolierung von TfR2 aus M. catarrhalis durch das hierin vorgesehene Verfahren.
Um als eine Komponente von immunogenen Zusammensetzungen (einschließlich Impfstoffen) und als ein Antigen in diagnostischen Ausführungsformen nützlich zu sein, sollte das Transferrinrezeptorprotein, gereinigt wie hierin beschrieben, vorteilhafterweise fähig zur Erzeugung von Antikörpern sein, welche M. catarrhalis-Stämme erkennen oder neutralisieren, wobei eine Vielzahl davon eingeschloßen ist.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 4(a), 4(b) und 4(c) wird eine Immunoblot-Analyse von TfR2, wie hierin vorgesehen, gezeigt und es wird die spezifische Trennung von TfR2 von dem OMP-B2-Protein gezeigt. In jeder der Figuren enthält die Probe 1 OMP-B2-Protein und Probe 2 enthält TfR2-Protein. Die M. catarrhalis-Stämme waren a: Stamm 5191; b: Stamm 135; und c: Stamm 4223. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Probe 3 war gereinigtes TfR2. Die Fig. 4(a) zeigt ein mit Coomassie-Blau gefärbtes Gel. Die Fig. 4(b) zeigt einen Immunoblot unter Verwendung eines Anti-TfR2-Antiserums. Die Fig. 4(c) zeigt einen Immunoblot unter Verwendung eines Anti-OMP-B2-Antiserums. Die Ergebnisse von Fig. 4 bestätigen die spezifische Aufreinigung von Transferrinrezeptorprotein TfR2 aus M. catarrhalis durch das hierin vorgesehene Verfahren, und insbesondere, dass es im wesentlichen frei von OMBP2-Protein ist.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 5(b) wird ein Immunoblot veranschaulicht, welcher die Fähigkeit von Meerschweinchen-Anti-TfR-Antiseren, erzeugt durch Immunisieren von Meerschweinchen mit gereinigtem TfR-Protein, wie hierin vorgesehen, zeigt, TfR2-Protein aus M. catarrhalis zu erkennen, isoliert aus einer Vielzahl von Quellen. Die getesteten Proben waren wie folgend:
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das isolierte und gereinigte TfR2- Protein, wie hierin vorgesehen, nützlich zur Erzeugung von Antikörpern, welche verwendet werden können, um M. catarrhalis von anderen bakteriellen Pathogenen, welche Mittelohrentzündung verursachen, spezifisch zu unterscheiden. So wird unter Bezugnahme auf die Fig. 5(a) und 5(b) eine SDS-PAGE bzw. ein Immunoblot veranschaulicht, welcher die spezifische Reaktivität von Meerschweinchen-Anti-TfR2-Antiseren zeigt, hergestellt durch Immunisieren von Meerschweinchen mit TfR2-Protein, wie hierin vorgesehen. Die analysierten Proben waren die folgenden:
Die Ergebnisse, welche in Fig. 5(b) gezeigt sind, zeigen deutlich die Nützlichkeit von TfR2- spezifischen Antiseren, wie hierin vorgesehen, um zwischen bakteriellen Pathogenen zu unterscheiden, welche Krankheiten mit ähnlichen klinischen Symptomen erzeugen.
Die in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen die Fähigkeit von Meerschweinchen-Anti-TfR2-Antiseren, erzeugt durch Immunisieren mit TfR2-Protein, wie hierin vorgesehen, M. catarrhalis abzutöten. Die Ergebnisse zeigen, dass Antiseren, hergestellt durch Immunisieren mit TfR2-Protein, isoliert aus dem Stamm 4223, bakterizid gegen einen homologen, nicht-klumpenbildenden, aus dem Stamm 4223 abgeleiteten M. catarrhalis- Stamm RH408 waren. Die Fähigkeit des isolierten und gereinigten TfR2-Proteins, wie hierin vorgesehen, bakterizide Antikörper zu erzeugen, ist ein in vivo-Beweis der Nützlichkeit des TfR2-Proteins, wie hierin vorgesehen, als ein Impfstoff zum Schutz gegen von M. catarrhalis verursachte Krankheiten.
Somit wird gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff gegen Moraxella oder andere bakterielle Pathogene vorgesehen, welche TfR2-Protein erzeugen oder ein Protein erzeugen, welches in der Lage zur Induzierung von Antikörpern ist, welche TfR2 spezifisch erkennen, umfassend eine immunogenisch wirksame Menge von TfR2-Protein, wie hierin vorgesehen, und einen physiologisch annehmbaren Träger dafür. Das hierin vorgesehene TfR2-Protein kann auch als ein Trägerprotein für Hapten, Polysaccharide oder Peptide verwendet werden, um einen Konjugat-Impfstoff gegen antigenische Determinanten, welche nicht mit TfR2 verwandt sind, herzustellen.
Das hierin vorgesehene TfR2-Protein ist nützlich als ein diagnostisches Reagenz, als ein Antigen oder für die Erzeugung von Anti-TfR2-Antikörpern, oder Antigen zur Impfung gegen die Krankheiten, welche durch Arten von Moraxella verursacht werden.
In zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das TfR2-Protein, wie hierin vorgesehen, als ein Trägermolekül zur Herstellung von chimären Molekülen und Konjugat-Impfstoffen (einschließlich Glycokonjugaten) gegen pathogene Bakterien, einschließlich eingekapselten Bakterien, verwendet werden. Somit können Glycokonjugate der vorliegenden Erfindung beispielsweise verwendet werden, um einen Schutz gegen Krankheit und Infektion zu vermitteln, welche durch irgendwelche Bakterien mit Polysaccharid-Antigenen, einschließlich Lipooligosacchariden (LOS) und PRP, verursacht werden. Solche bakteriellen Pathogene können zum Beispiel Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutants, Cryptococcus neoformans, Klebsiella, Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa einschließen. Besondere Antigene, welche an TfR2-Protein konjugiert werden können, und Verfahren zum Erzielen derartiger Konjugationen werden in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/12641 beschrieben, übertragen an den Patentinhaber hiervon, wobei die Offenbarung davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die Trägerfunktion von TfR2-Protein verwendet werden, um beispielsweise Immunität gegen abnormale Polysaccharide von Tumorzellen zu induzieren oder Anti-Tumor-Antikörper herzustellen, welche an chemotherapeutische oder bioaktive Mittel konjugiert werden können.
Die vorliegende Erfindung überspannt das TfR2-Protein zur Verwendung als eine pharmazeutische Substanz, insbesondere als Wirkstoff in einem Impfstoff gegen Krankheiten, welche durch Infektion mit einem Stamm von Moraxella verursacht werden.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung des TfR2-Proteins für die Herstellung eines Medikamentes zur Immunisierung gegen Krankheiten vor, welche durch Infektion mit einem Stamm von Moraxella verursacht werden.
Es ist einem Fachmann deutlich offensichtlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung viele Anwendungen auf den Gebieten der Impfung, Diagnose, Behandlung von Moraxella-Infektionen und der Erzeugung von immunologischen Reagenzien haben. Eine fernere nicht-einschränkende Erörterung solcher Anwendungen wird nachstehend weiterhin dargestellt.

1. Impfstoff-Herstellung und -Verwendung

Immunogene Zusammensetzungen, geeignet zur Verwendung als Impfstoffe, können aus immunogenen Transferrinrezeptorproteinen oder Analogen, wie hierin offenbart, hergestellt werden. Vorzugsweise wird das antigene Material gründlich dialysiert, um unerwünschte Moleküle von kleinem Molekulargewicht zu entfernen, und/oder zur einfacheren Formulierung in ein gewünschtes Vehikel lyophilisiert. Die immunogene Zusammensetzung ruft eine Immunantwort hervor, welche Antikörper erzeugt, einschließlich Anti-Transferrinrezeptor-Antikörpern und Antikörpern, welche opsonisieren (der Phagozytose zuführen) oder bakterizid sind. Sollt das geimpfte Subjekt von Moraxella oder anderen Bakterien, welche einen Transferrinrezeptor herstellen, herausgefordert werden, binden die Antikörper an den Transferrinrezeptor und verhindern dadurch den Zugang der Bakterien zu einer Eisenquelle, welche für ihre Lebensfähigkeit benötigt wird. Weiterhin können opsonisierende oder bakterizide Anti-TfR- Antikörper auch einen Schutz durch alternative Mechanismen vorsehen.
Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, können als injizierbare Formen, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Das Transferrinrezeptorprotein kann mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten gemischt werden, welche damit kompatibel sind. Derartige Exzipienten bzw. Träger können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und Kombinationen hiervon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner zur Erhöhung ihrer Effektivität Hilfssubstanzen enthalten, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-puffernde Mittel oder Adjuvantien. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral durch Injektion subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Alternativ dazu können die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten immunogenen Zusammensetzungen auf eine Weise formuliert und zugeführt werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Somit kann die immunogene Zusammensetzung an Schleimhautoberflächen beispielsweise auf den nasalen oder oralen (intragastrischen) Wegen verabreicht werden. Alternativ dazu können andere Arten der Verabreichung, einschließlich Suppositorien und oraler Formulierungen, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkalenglykole oder Triglyceride einschließen. Derartige Suppositorien können aus Mischungen gebildet werden, enthaltend den/die aktiven Bestandteil(e) im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10%, vorzugsweise etwa 1 bis 2%. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Träger bzw. Inzipienten einschließen, wie beispielsweise pharmazeutische Reinheitsklassen von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern einnehmen und etwa 1 bis 95%, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 75% Transferrinrezeptorprotein enthalten.
Die immunogenen Präparationen und Impfstoffe werden auf eine mit der Dosierungsformulierung kompatible Weise und in einer solchen Menge verabreicht, dass sie therapeutisch wirksam, schützend und immunogen sein werden. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelden Subjekt ab, einschließlich beispielsweise der Kapazität des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem gewünschten Grad an Schutz, und, falls benötigt, der Hervorzubringung einer zellvermittelten Immunantwort. Die zur Verabreichung erforderlichen, genauen Mengen des aktiven Bestandteils hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Jedoch sind geeignete Dosierungsbereiche ohne weiteres durch den Fachmann bestimmbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm des Transferrinrezeptorproteins pro Impfung liegen. Geeignete Zeitpläne für anfängliche Verabreichung und Booster-Dosierungen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Verabreichungen, einschließen. Die Dosierung kann auch vom Verabreichungsweg abhängen und wird gemäß der Größe des Wirtes variieren.
Die Konzentration des Transferrinrezeptorproteins in einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung beträgt im allgemeinen etwa 1 bis 95%. Ein Impfstoff, welcher antigenes Material von nur einem Pathogen enthält, ist ein monovalenter Impfstoff. Impfstoffe, welche antigenes Material von mehreren Pathogenen enthalten, sind kombinierte Impfstoffe und gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung. Derartige kombinierte Impfstoffe enthalten beispielsweise Material aus verschiedenen Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen des gleichen Pathogens oder aus Kombinationen von verschiedenen Pathogenen.
Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene mit Adjuvantien co-verabreicht werden, üblicherweise verwendet als eine etwa 0,05- bis 0,1-prozentige Lösung in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Adjuvantien verstärken die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen. Adjuvantien können durch örtliches Zurückhalten des Antigens nahe der Verabreichungsstelle zur Hervorrufung eines Depoteffektes wirken, welcher eine langsame, andauernde Abgabe von Antigen an Zellen des Immunsystems erleichtert. Adjuvantien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot anlocken und solche Zellen zur Hervorbringung von Immunantworten stimulieren.
Immunstimulatorische Mittel oder Adjuvantien sind viele Jahre lang verwendet worden, um die Wirt-Immunantworten beispielsweise gegen Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Adjuvantien, wie Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Komponenten der als Impfstoffe verwendeten, abgetöteten oder attenuierten Bakterien. Extrinsische Adjuvantien sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent an Antigene gebunden sind und formuliert sind, um die Wirtsimmunantworten zu verstärken. Somit sind Adjuvantien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral zugeführte Antigene verstärken. Einige dieser Adjuvantien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebeneffekte verursachen, was sie ungeeignet zur Verwendung in Menschen und bei vielen Tieren macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gemeinsam üblicherweise als Alum bezeichnet) routinemäßig als Adjuvantien in Menschen- und Tiermedizin-Impfstoffen verwendet. Die Effektivität von Alum bei der Erhöhung von Antikörperantworten gegen Diptherie- und Tetanus-Toxoide ist gut etabliert, und ein HBsAg-Impfstoff ist mit Alum als Adjuvans versetzt worden. Wenngleich die Nützlichkeit von Alum für manche Anwendungen gut etabliert ist, besitzt sie Einschränkungen. Zum Beispiel ist Alum für Influenza-Impfung unwirksam und ruft eine Zell-vermittelte Immunantwort in inkonsistenter Weise hervor. Die durch mit Alum-Adjuvans versetzte Antigene hervorgerufenen Antikörper sind in der Maus hauptsächlich vom IgG1-Isotyp, der zum Schutz durch einige Impfungsmittel nicht optimal sein kann.
Ein breiter Bereich von extrinsischen Adjuvantien kann wirkungsvolle Immunantworten gegen Antigene hervorrufen. Diese schließen Saponine, komplexiert an Membranproteinantigene (immunstimulierende Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien in Mineralöl, Freundsches vollständiges Adjuvans, bakterielle Produkte, wie Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), sowie Lipid A, und Liposomen ein.
Um humorale Immunantworten (HIR) und Zell-vermittelte Immunität (CMI) effizient zu induzieren, werden Immunogene oft in Adjuvantien emulgiert. Viele Adjuvantien sind toxisch, wobei sie Granulome, akute und chronische Entzündungen (Freundsches komplettes Adjuvans, FCA), Cytolyse (Saponine und Pluronic-Polymere) und Pyrogenität bzw. Fiebererzeugung, Arthritis und anteriore Uveitis (LPS und MDP) herbeiführen. Obwohl FCA ein hervorragendes Adjuvans ist und in der Forschung in weitem Umfang eingesetzt wird, ist es zur Verwendung bei Impfstoffen für den Menschen oder die Tiermedizin aufgrund seiner Toxizität nicht zugelassen.
Wünschenswerte Merkmale von idealen Adjuvantien schließen ein:
(1) Fehlen von Toxizität;
(2) Fähigkeit zur Stimulierung einer lang andauernden Immunantwort;
(3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei der Langzeitaufbewahrung;
(4) Fähigkeit zur Hervorrufung von sowohl CMI als auch HIR gegen auf verschiedenen Wegen verabreichte Antigene, falls erforderlich;
(5) Synergie mit anderen Adjuvantien;
(6) Fähigkeit zur selektiven Wechselwirkung mit Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC);
(7) Fähigkeit zur spezifischen Hervorrufung von angemessenen TH1- oder TH2-Zell-spezifischen Immunantworten; und
(8) Fähigkeit zur selektiven Erhöhung von passenden Antikörper-Isotypspiegeln (zum Beispiel IgA) gegen Antigene.
Das an Lockhoff et al. am 8. August 1989 erteilte U.S.-Patent Nr. 4 855 283, das hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, lehrt Glykolipid-Analoge, einschließlich N-Glykosylamiden, N-Glykosylharnstoffen und N-Glykosylcarbamaten, von denen jedes am Zuckerrest mit einer Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren oder Adjuvantien. So berichteten Lockhoff et al. (U.S.-Patent Nr. 4 855 283 und Ref. 33), dass N-Glykolipid-Analoge, welche strukturelle Ähnlichkeiten zu den natürlich vorkommenden Glykolipiden, wie Glykosphingolipiden und Glykoglyzerolipiden, aufzeigten, in der Lage zur Hervorrufung starker Immunantworten sowohl bei Herpes-simplex-Virus-Impfstoff als auch Pseudorabies-Virus-Impfstoff sind. Einige Glykolipide sind aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren, welche direkt mit den Zuckern über das anomere Kohlenstoffatom verknüpft sind, synthetisiert worden, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
Das an Moloney erteilte U.S.-Patent Nr. 4 258 029, übertragen an den Patentinhaber hiervon und hierin durch den Bezug darauf einbezogen, lehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Adjuvans fungierte, wenn es mit Tetanus-Toxoid und Formalin-inaktiviertem Typ I-, II- und III-Poliomyelitis-Virus-Impfstoff komplexiert wurde. Auch Nixon-George et al. (Ref. 34) berichteten, dass Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, komplexiert mit einem rekombinanten Hepatitis B-Oberflächenantigen, die Wirtsimmunantworten gegen das Hepatitis B-Virus verstärkten.

2. Immunoassays

Das Transferrinrezeptorprotein der vorliegenden Erfindung ist als ein Immunogen für die Erzeugung von Anti-Transferrinrezeptorprotein-Antikörpern, als ein Antigen in Immunoassays, einschließlich "Enzyme-linked Immunosorbent-Assays" (ELISA), RIAs und anderen nicht- Enzym-verknüpften Antikörperbindungs-Assays oder -Verfahrensweisen, welche im Fachgebiet bekannt sind, für den Nachweis von antibakteriellen, Anti-Moraxella- und Anti-TfR- Antikörpern nützlich. In ELISA-Assays wird das Transferrinrezeptorprotein auf eine ausgewählte Oberfläche immobilisiert, beispielsweise eine zur Bindung von Proteinen fähige Oberfläche, wie den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach Waschen zur Entfernung von unvollständig adsorbiertem Transferrinrezeptorprotein, kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), das bekanntermaßen hinsichtlich der Testprobe antigenisch neutral ist, an die ausgewählte Oberfläche gebunden werden. Dies ermöglicht die Blockierung von nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und verringert somit den durch nicht-spezifische Bindungen von Antiseren auf die Oberfläche erzeugten Hintergrund.
Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer Probe kontaktiert, wie klinischen oder biologischen Materialien, die auf eine Weise zu testen ist, welche zur Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) führt. Dies kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie Lösungen von BSA, Rinder-Gamma-Globulin (BGG) und/oder Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)/Tween einschließen. Man läßt die Probe dann 2 bis 4 Stunden lang bei Temperaturen, wie in der Größenordnung von etwa 25º bis 37ºC, inkubieren. Im Anschluß an die Inkubation wird die mit der Probe kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-immunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschverfahren kann Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Borat-Puffer einschließen. Im Anschluß an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Transferrinrezeptorprotein, und dem anschließenden Waschen, können das Vorliegen und sogar die Menge der Immunkomplex-Bildung bestimmt werden, indem man den Immunkomplex einem zweiten Antikörper aussetzt, der Spezifität für den ersten Antikörper aufweist. Wenn die Testprobe von menschlichem Ursprung ist, handelt es sich bei dem zweiten Antikörper um einen Antikörper mit Spezifität für humane Immunglobuline und im allgemeinen IgG. Um ein Nachweismittel vorzusehen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität, wie eine enzymatische Aktivität, haben, welche z. B. eine Farbentwicklung bei der Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Die Quantifizierung kann dann erreicht werden, indem der Grad der Farberzeugung unter Verwendung z. B. eines Spektrophotometers gemessen wird.

BEISPIELE

Die obige Beschreibung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein kompletteres Verstehen kann durch den Bezug auf die nachfolgenden spezifischen Beispiele erreicht werden. Diese Beispiele werden allein zum Zwecke der Veranschaulichung beschrieben und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken. Änderungen in Form und Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wie es die Umstände nahe legen oder sie erforderlich machen. Obgleich spezifische Ausdrücke hierin angewendet worden sind, sind solche Begriffe im beschreibenden Sinne gemeint und nicht zum Zwecke der Beschränkung.
Methoden der Molekulargenetik, Proteinbiochemie und Immunologie, die in dieser Beschreibung und diesen Beispielen verwendet werden, jedoch nicht explizit in dieser Offenbarung beschrieben werden, sind ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben und liegen gut im Vermögen der Fachleute im Fachbereich.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht das Wachstum von M. catarrhalis.
Die verwendeten M. catarrhalis-Stämme waren 135, 4223 (Ref. 35), 5191 (Ref. 35) (alles Mittelohrisolate), ATCC 25240, Q8 (Expektorat-Isolat) und RH408.
Um Zellen zur Isolierung von TfR2 bereitzustellen, wurden M. catarrhalis-Stämme routinemäßig auf Schokoladen-Agar-Platten (BBL) gehalten.
M. catarrhalis-Stamm 4223 wurde in 20 ml Gehirn-Herz-Infusions(BHI)-Brühe inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht mit Belüftung bei 37ºC inkubiert. Für das Wachstum unter Eisenbeschränkten Bedingungen wurde 1 ml der Über-Nacht-Kultur in 20 ml BHI-Brühe, die 25 uM EDDA enthielt, inokuliert und die Kultur wurde bei 37ºC etwa 3 bis 4 Stunden lang wachsen gelassen. Zellen, die zur Mittel-Log-Phase wachsen gelassen wurden (A&sub5;&sub7;&sub8;> 0,5) wurden mittels Zentrifugation bei 10 000 · g für 20 Min geerntet. Das Pellet wurde zur Extraktion vom Transferrinrezeptor(TfR2)-Protein, wie unten in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.

Beispiel 2

Dieses Beispiele veranschaulicht die Erzeugung eines nicht-klumpenden Stammes (RH408) von M. catarrhalis.
M. catarrhalis-Stamm 4223 wurde in mehreren Kolben, die 20 ml BHI-Brühe enthielten, inokuliert, und die Kulturen wurden unter Schütteln (170 UpM) über Nacht bei 37ºC inkubiert. 5 ml jeder Über-Nacht-Kultur wurden zu einzelnen 1 ml großen Röhrchen überführt und ohne Störung bei Raumtemperatur 3 bis 8 Stunden lang stehen gelassen, um es den Bakterien zu ermöglichen, zu sedimentieren. 100 ul der geklärten oberen Phase jedes Kulturmediums wurden verwendet, um 25 ml BHI-Brühe zu inokulieren und Kulturen wurden über Nacht bei 37ºC, wie oben beschrieben, inkubiert. Dieses Durchlaufen wurde sechsmal wiederholt, und zwar unter Verwendung von 25 ul geklärtem Medium, um 25 ml BHI für jede Über-Nacht- Kultur zu mokulieren. Nicht-klumpende Bakterienkulturen wurden identifiziert, indem der A&sub5;&sub7;&sub8;-Wert bei Intervallen über einen 3-stündigen Zeitraum gemessen wurde, um die Sedimentationsraten der durchgelaufenen Stämme zu dem der ursprünglichen M. catarrhalis-Stamm- 4223-Kultur zu vergleichen. Nicht-klumpende Mutanten, einschließlich M. catarrhalis RH408 aggregiert nicht während dieser Zeitdauer von 3 Stunden. Auf BHI-Agar-Platten besaß der Stamm RH408 eine Koloniemorphologie, die für alle nicht-klumpenden Stämme typisch ist. Der Stamm RH408 ist bei der "American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A., unter den Richtlinien des Budapester Vertrags am 13. Dezember 1994 hinterlegt worden, und ihm wurde die ATCC-Zugangsnr. 55637 gegeben.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion vom Transferrinrezeptorprotein TfR2 durch Affinitätsreinigung.
Durch Affinität gereinigtes TfR2 wurde aus Gesamtmembranen, wie in Referenz 29 beschrieben, gereinigt, und zwar unter Verwendung von Sepharose 4B (Pharmacia)-konjugiertem Humantransferrin (Sigma). Bakterielle Rezeptorproteine, die an der Affinitätsmatrix gebunden waren, wurden selektiv unter Verwendung eines Puffers aus 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% Natriumlaurylsarkosinat, 2 M Guanidin eluiert. Eluierte Proteine wurden gegen 50 mM Tris-HCl pH 8,0 dialysiert.

Beispiel 4

Dieses Beispiele veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von Transferrinrezeptorprotein TfR2.
Transferrinrezeptorprotein wurde aus M. catarrhalis durch die Vorgehensweise, die allgemein in Fig. 1 beschrieben ist, isoliert.
Ein Zell-Pellet aus Eisenbeschränkten Über-Nacht-Kulturen von M. catarrhalis wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, erneut suspendiert und durch Ultraschall aufgebrochen. Die Ultraschallmischung wurde bei 20 000 · g 30 Minuten lang zentrifugiert, und der resultierende Überstand (S1), welcher lösliche Proteine enthielt, wurde verworfen. Das Pellet (PPT1) wurde in 50 mM Tris, pH 8,0, das 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, suspendiert. Dieser Extraktionsschritt solubilisierte TfR2. Die Suspension wurde bei 20 000 · g 20 Minuten lang zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen, und der Überstand wurde auf eine DEAE-Sephacel (Pharmacia)-Säule aufgetragen, die in 50 mM HCl-Puffer, pH 8,0, equilibriert wurde. TfR2 wurde in der Durchflussfraktion rückgewonnen und wurde weiter unter Verwendung einer in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, equilibrierten SE-Cellulose-D529-Säule gereinigt. Die TfR2 enthaltende Durchflussfraktion wurde auf eine in 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, equilibrierten Hydroxyapatit (HTP)-Säule geladen. Dieser Schritt separierte OMP B2 (in der HTP-Durchflussfraktion vorliegend) von TfR2, welches an dem HTP gebunden blieb. Nach ausgiebigem Waschen der HTP-Säule mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, wurde TfR2 von der Matrix mit einem 200 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, eluiert. Die Reinheit von TfR2 wurde mittels SDS-PAGE-Analyse bestimmt.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von Außenmembranprotein B2 OMP B2 von M. catarrhalis.
Die Durchflussfraktion der HTP-Säule wurde mittels 12,5% SDS-PAGE analysiert. Nach der Elektrophorese wurde ein Gelstreifen, der der OMP B2-Proteinbande entsprach, aus dem Gel herausgeschnitten. Protein wurde aus dem Gelstreifen durch Elektroelution während 12 Stunden bei 100 Volt in Elutionspuffer (15 mM NH4CO&sub3;/0,1% SDS) gewonnen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunisierung von Meerschweinchen.
Meerschweinchen (Charles River, Quebec) wurden intramuskulär (i.m.) am Tag 1 mit einer 5 ug-Dosis von entweder TfR2- oder OMP B2-Protein, emulgiert in kompletten Freund'schen Adjuvanz (CFA), immunisiert. Tiere wurden geboostet an den Tagen +14 und +28 mit der gleichen Dosis an in inkomplettem Freund'schen Adjuvanz (IFA) emulgiertem Protein. Blutproben wurden am Tag +42 genommen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 7

Diese Beispiel beschreibt die Analyse von gereinigtem TfR2 und OMP B2-Proteinen.
Proteine wurden durch SDS-PAGE, wie durch Lugtenberg et al. (Ref. 36) unter Verwendung von 11,5% oder 12,5% (w/v) Acrylamid (BRL) in Trenngelen getrennt. Proteine wurden visualisiert, indem Gele mit Coomassie-Brilliant-Blau (BioRad) gefärbt wurden. Protein- Standardmolekülmassen-Marker waren von BioRad und Pharmacia.
Durch SDS-PAGE separierte Proteine wurden durch das Verfahren von Towbin et al. (Ref. 37) auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (PVDF, Millipore) elektrogeplottet. Für Immuno- Plots wurden Antiseren bei Verdünnungen von 1 : 1 000 verwendet. Rekombinantes Protein G- Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (Zymed) wurde als ein Reporter bei einer Verdünnung von 1 : 4 000 verwendet. Plots wurden unter Verwendung entweder einer kolorimetrischen Reaktion (4CN/DAB; Pierce) oder einer chemilumineszenten Reaktion (LumiGlo; Kirkegaard und Perry) entwickelt. Die von den Herstellern empfohlenen Arbeitsprozeduren wurden für beide Nachweisverfahren nachvollzogen. Vorgefärbte Molekülmassenmarker wurden von BioRad gekauft.
Die in-vitro-Transferrin-Bindungs-Aktivität der gereinigten Proteine wurden nach dem von Schryvers und Lee (Ref. 27) beschriebenen Verfahren mit einigen Modifikationen bestimmt. Kurz gesagt, wurden Proteinproben mittels SDS-PAGE getrennt und dann elektrophoretisch zu PCDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Meerrettich-Peroxidasekonjugiertem Humantransferrin (1 : 50-Verdünnung; Jackson ImmunoResearch) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Plots wurden unter Verwendung der LumiGlo-Chemilumineszenz-Reaktion, oben beschrieben, entwickelt.

Beispiel 8

Dieses Beispiel veranschaulicht das bakterielle Assay gegenüber B. Catarrhalis.
Proben (25 ul) an Antiserum wurden auf 56ºC 30 Minuten lang erhitzt, um Komplementaktivität zu entfernen, und es wurde 1 : 8 in veronalem Puffer (NaCl 8,0 g/l, NaHCO&sub3; 0,25 g/l, Na- Barbiturat 0,30 g/l, Barbitursäure 0,45 g/l, MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,1 g/l, CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,05 g/l), enthaltend 0,1% BSA (VBS), verdünnt, und sie wurden dann der ersten Vertiefung einer Nung- Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen hinzugesetzt. Zweifache Reihenverdünnungen von Antiseren in VBS wurden in die verbliebenen Vertiefungen getan. Bakterielle Zellen, die auf einen OD&sub5;&sub7;&sub8;-Wert > 0,5 gewachsen waren, wurden auf 1 : 200 000 in VBS verdünnt, und 25 ul große Portionen der bakteriellen Suspension wurden jeder Vertiefung hinzugesetzt. Ein Meerschweinchen-Komplement (Biowhittaker, Walkersville, MD) wurden 1 : 10 in VBS verdünnt, und 25 ul der Lösung wurden jeder Vertiefung hinzugesetzt, um Reaktion zu initiieren. Die Platten wurden bei 37ºC 60 Minuten lang inkubiert, und 50 ul jeder Reaktionsmischung wurde dann auf eine Mueller-Hinton-Agar-Platte, enthaltend 2,2% Mueller-Hinton-Brühe und 1,5% Agar, plattiert. Nach der Inkubation bei 37ºC während 48 Stunden wurden die Kolonien gezählt, um den bakteriellen Titer zu bestimmen (der reziproke Wert der höchsten Verdünnung an Antiserum, die in der Lage war, mehr als 50% an Bakterien zu töten, und zwar im Vergleich mit den Pre-Immun-Seren enthaltenden Kontrollen). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

ZUSAMMENFASSUNG DER BESCHREIBUNG

Bezüglich der Zusammenfassung dieser Beschreibung sieht die vorliegende Erfindung ein Transferrinrezeptorprotein mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 80 kDa bis etwa 90 kDa und isoliert aus M. catarrhalis, Verfahren zur Herstellung desselben und Anwendung davon als immunogene Zusammensetzungen und diagnostische Ausführungsformen vor. Modifikationen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich.

TABELLE 1

Anti-TfR2-Antikörper-Titer und bakterielle Aktivität von Meerschweinchen-Antiseren, erhalten durch Immunisierung mit Transferrinrezeptorprotein (TfR2) aus M. catarrhalis 4223
1 Bakterizide Titer: ausgedrückt in Log&sub2; als Verdünnung vom Antiserum, die in der Lage war, 50% an Zellen von M. catarrhalis 4223 zu töten.
2 Anti-TfR2-Titer: ausgedrückt als Log&sub2; (Titer/100)

REFERENZEN

1. Bluestone, C. D., Clin. Infect. Dis. 14 (Suppl): S. 197-5.203 (1992)
2. Van Hare, G. F., P. A. Shurin, C. D. Marchant, N. A. Cartelli, C. E. Johnson, D. Fulton, S. Carlin und C. H. Kim. Acute otitis media caused by Branhamella catarrhalis: biology and therapy. Rev. Infect. Dis. 9: 16-27.
3. Chapman, A. J., D. M. Musher, S. Jonsson, J. E. Clarridge und R. J. Wallace. 1985. Development of bactericidal antibody during Branhamella catarrhalis infection. J. Infect. Dis. 151: 878-882.
4. Hager, H., A. Verghese, S. Alvarez und S. L. Berk. 1987. Branhamella catarrhalis respiratory infections. Rev. Infect. Dis. 9: 1140-1149.
5. MoLeod, D. T., F. Ahmad, M. J. Croughan und M. A. Calder. 1986. Bronchopulmonary infection due to M. catarrhalis. Clinical features and therapeutic response. Drugs 31 (Supp 1.3): 109-112.
6. Nicotra, B., M. Rivera, J. I. Luman und R. J. Wallace. 1986. Branhamella catarrhalis as a lower respiratory tract pathogen in patients with chronic lung disease. Arch.Intern.Med. 14: 890-893.
7. Ninane, G., J. Joly und M. Kraytman. 1978. Bronchopulmonary infection due to Branhamella catarrhalis 11 cases assessed by transtracheal puncture. Br. Med. Jr. 1: 276-278.
8. Srinivasan, G., M. J. Raff, W. C. Templeton, S. J. Givens, R. C. Graves und J. C. Mel. 1981. Branhamella catarrhalis pneumonia. Report of two cases and review of the literature. Am. Rev. Respir. Dis. 123: 553-555.
9. West, M., S. L. Berk und J. K. Smith. 1982. Branhamella catarrhalis pneumonia. South. Med. J. 75: 1021-1023.
10. Brorson, J-E., A. Axelsson und S. E. Holm. 1976. Studies an Branhamella catarrhalis (Neisseria catarrhalis) with special reference to maxillary sinusitis. Scan. J. Infect. Dis. 8: 151-155.
11. Evans, F. O., Jr., J. B. Sydnor, W. E. C. Moore, G. R. Moore, J. L. Manwaring, A. H. Brill, R. T. Jackson, S. Hanna, J. S. Skaar, L. V. Holdeman, G. S. Fitz-Hugh, M. A. Sande und J. M. Gwaltney, Jr. 1975. Sinusitis of the maxillary antrum. N. Engl. J. Med. 293: 735-739.
12. Tinkelman, D. G. und H. J. Silk. 1989. Clinical and bacteriologic features of chronic sinusitis in children. Am. J. Dis. Child. 143: 938-942.
13. Wald, E. R., C. Byers, N. Guerra, M. Casselbrant und D. Beste. 1989. Subacute sinusitis in children. J. Pediatr. 115: 28-32.
14. Wald, E. R., G. J. Milmoe, A. Bowen, J. Ledeslna-Medina, N. Salamon und C. D. Bluestone. 1981. Acute maxillary sinusitis in children. N. Engl. J. Med. 304: 749-754.
15. Christensen, J. J. und B. Bruun. 1985. Bacteraemia caused by a beta-lactamase producing strain of Branhamella catarrhalis. Acta. Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect.B 93: 273-275.
16. Craig, D. B. und P. A. Wehrle. 1983. Branhamella catarrhalis septic arthritis. J. Rheumatol. 10: 985-986.
17. Gray, L. D., R. E. Van Scoy, J. P. Anhalt und P. K. W. Yu. 1989. Wound infection caused by Branhamella catarrhalis. J. Clin. Microbiol. 27: 818-820.
18. Guthrie, R., K. Bakenhaster, R. Nelson und R. Woskobnick. 1988. Branhamella catarrhalis sepsis: a case report and review of the literature. J. Infect. Dis. 158: 907-908.
19. Hiroshi, S., E. J. Anaissie, N. Khardori und G. P. Bodey. 1988. Branhamella catarrhalis septicemia in patients with leukemia. Cancer 61: 2315-2317.
20. O'Neill, J. H. und P. W. Mathieson. 1987. Meningitis due to Branhamella catarrhalis. Aust. N. Z. J. Med. 17: 241-242.
21. Morgan, M. G., McKenzie, H, Enright, M. C., Bain, M. und Emmanuel, F. X. S. (1992) Use of molecular methods to characterize Moraxella catarrhalis strains in a suspected outbreak of nosocomial infection. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 305-312.
22. Wallace, M. R., Oldfield, B. C., 1990, Arch. Intern. Med. 150: 1332-1334.
23. Otto, B. R., Verweij-van, Vught A. M. J. J. MacLaren, D. M. 1992, Crit. Rev. Microbiol. 18: 217-233.
24. Schryvers, A. B. und Morris, L. J. 1988 Identification and Characterization of the transferring receptor from Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol. 2: 281-288.
25. Lee, B. C., Schryvers, A. S. Specificity of the lactoferrin and transferrin receptors in Neisseria gonorrhoeae. Mol. Microbiol. 1988; 2-827-9.
26. Schryvers, A. B. Characterization of the human transferrin and lactoferrin receptors in Haemophilus influenzae. Mol. Microbiol. 1988; 2: 467-72.
27. Schryvers, A. B. und Lee, B. C. (1988) Comparative analysis of the transferrin and lactoferrin binding proteins in the family Neisseriaceae, Can. J. Microbiol. 35, 409-415.
28. Schryvers, A. B. und Gonzalez, G. C.1989. Comparison of abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infect. Immun. 57: 2425-2429.
29. Yu, R. und Schryvers, A. B., 1993. The interaction between human transferrin and transferrin binding protein 2 from Moraxella (Branhamella) catarrhalis differs from that of other human pathogens. Microbiol. Pathogenesis, 15: 433-445.
30. Sethi S., Hill, S. L., Murphy, T. F. 1995, Infect. Immun.. 63: 1516-1520.
31. Helimen, M. E., Maciver, L, Latimer, J. L., Cope, L. D., McCracken, G. H und Jansen, E. J., 1993. A major outer membrane protein of Moraxella catarrhalis is a target antibodies that enhance pulmonary clearance of the pathogen in an animal model. Infect. Immuno. 61, 2003-2010.
32. Campagnari, A. A., Shanks, K. L., Dyer D. W. 1994, Infect. Immun. 62: 4909-4914.
33. Lockhoff, O. Glycolipids as Immunomodulators: Synthesis und Properties. 1991. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1611-1620.
34. Nixon-George et al. (1990), J. Immunology, 144: 4798-4802.
35. Sarwar, J., Campagnari, A. A., Kirkham, C. und Murphy, T. F. (1992). Characterization of an antigenically conserved heat-modifiable major outer membrane protein Branhamella catarrhalis. Infect. Immun. 60, 804-809.
36. Lugtenberg, B., Meijers, J., Peters, R., von der Hoek, P. und von Alphen, L. (1975). Electrophoretic resolution of the major outer membrane proteins of Escherichia coli into four bands. FEBS Lett. 58, 254-258.
37. Towbin H., Staehelin, T., Gordon, J. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4354.

Claims

1. Ein isoliertes und gereinigtes nicht denaturiertes Transferrinrezeptorprotein eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), von 80 bis 90 kDa.

2. Das Protein, welches in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei der Moraxella- Stamm Moraxella catarrhalis ist.

3. Das Protein, das in Anspruch 1 oder 2 beansprucht wird, wobei der Stamm Moraxella catarrhalis 4223, 5191 oder 135 ist.

4. Das Protein, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, welches zu wenigstens 70 Gew.-% rein ist.

5. Das Protein, das in Anspruch 4 beansprucht wird, welches zu wenigstens 90 Gew.-% rein ist.

6. Das Protein, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht wird, in Form seiner wässrigen Lösung.

7. Das Protein, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht wird, welches von dem OMP B2-Protein des Moraxella-Stammes im wesentlichen frei ist.

8. Das Protein, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht wird, welches von dem Transferrinrezeptorprotein des Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 105 kDa im wesentlichen frei ist.

9. Eine immunogene Zusammensetzung, welche eine immunologisch wirksame Menge des Proteins, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird, umfasst.

10. Ein isoliertes und gereinigtes nicht denaturiertes Transferrinrezeptorprotein eines Moraxella-Stammes wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht, wenn es als ein Medikament verwendet wird.

11. Die Verwendung eines isolierten und gereinigten nicht denaturierten Transferrinrezeptorproteins eines Moraxella-Stammes wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht bei der Herstellung eines Medikaments zur in vivo-Verarbreichung an einen Wirt, um Schutz gegen eine Krankheit zu verleihen, die durch Moraxella verursacht wird.

12. Ein Antikörper, welcher für ein Transferrinrezeptorprotein von Moraxella spezifisch ist, der dadurch herstellbar ist, dass ein Wirt mit der immunogenen Zusammensetzung nach Anspruch 9 immunisiert wird.

13. Ein Verfahren zum Feststellen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, welche spezifisch mit einem Transferrinrezeptorprotein eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 80 bis 90 kDa reagieren können, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Protein, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird, um Komplexe zu erzeugen, welche das Protein und irgendwelche der Antikörper, die in der Probe vorliegen, welche spezifisch damit reagieren, umfassen; und

(b) Feststellen der Erzeugung der Komplexe.

14. Ein Verfahren zum Feststellen des Vorliegens eines Transferrinrezeptorproteins eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 80 bis 90 kDa in einer Probe, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Immunisieren eines Objekts mit der immunogenen Zusammensetzung, die in Anspruch 9 beansprucht wird, um Antikörper zu erzeugen, die für das Transferrinrezeptorprotein spezifisch sind;

(b) Inkontaktbringen der Probe mit den Antikörpern, um Komplexe zu erzeugen, welche jegliches Transferrinrezeptorprotein, das in der Probe vorliegt, und die transferrinrezeptorproteinspezifischen Antikörper umfassen; und

(c) Feststellen der Erzeugung der Komplexe.

15. Ein Diagnosekit zur Feststellung des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch mit einem Transferrinrezeptorprotein eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 80 bis 90 kDa reagieren, umfassend:

(a) das Transferrinrezeptorprotein, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird;

(b) Mittel zum Inkontaktbringen des Transferrinrezeptorproteins mit der Probe, um Komplexe zu erzeugen, welche das Transferrinrezeptorprotein und jegliche Antikörper, die in der Probe vorliegen, umfassen; und

(c) Mittel zum Feststellen der Erzeugung der Komplexe.

16. Ein Diagnosekit zum Feststellen des Vorliegens eines Transferrinrezeptorproteins eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 80 bis 90 kDa Protein in einer Probe, umfassend:

(a) einen Antikörper wie in Anspruch 12 beansprucht;

(b) Mittel zum Inkontaktbringen des Antikörpers mit der Probe, um einen Komplex zu erzeugen, welcher das Transferrinrezeptorprotein und einen für das Transferrinrezeptorprotein spezifischen Antikörper umfasst; und

(c) Mittel zum Feststellen der Erzeugung des Komplexes.

17. Ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten und gereinigten nicht denaturierten Transferrinrezeptorproteins eines Moraxella-Stammes mit einer apparenten Molekülmasse von 80 bis 90 kDa, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Zellmasse des Moraxella-Stammes;

(b) selektives Extrahieren von wässrigen löslichen Proteinen aus der Zellmasse, um einen ersten Überstand und ein erstes Pellet bereitzustellen;

(c) Trennen des ersten Überstands von dem ersten Pellet;

(d) selektives Solubilisieren wenigstens eines Transferrinrezeptorproteins mit einer Molekülmasse von 80 bis 90 kDa aus dem ersten Pellet, um einen zweiten Überstand und ein zweites Pellet bereitzustellen;

(e) Trennen des zweiten Überstands von dem zweiten Pellet; und

(f) Reinigen des Transferrinrezeptorproteins mit einer Molekülmasse von 80 bis 90 kDa in dem zweiten Überstand, so dass es im wesentlichen frei ist von anderen Moraxella-Proteinen, welche aus dem ersten Pellet in dem selektiven Solubilisierungsschritt solubilisiert wurden.

18. Das Verfahren, das in Anspruch 17 beansprucht wird, wobei die wässrigen löslichen Proteine selektiv aus der Zellmasse extrahiert werden, indem die Zellmasse mit einer ersten gepufferten wässrigen Lösung in Kontakt gebracht wird, die Zellmasse mit Ultraschall behandelt wird, um dieselbe aufzubrechen, und zentrifugiert wird, um das erste Pellet und den ersten Überstand zu bilden.

19. Das Verfahren, dass in Anspruch 18 beansprucht wird, wobei die erste gepufferte wässrige Lösung 50 mM bis 1 M Tris-HCl bei einem pH von 7 bis 8,5 umfasst.

20. Das Verfahren, dass in irgendeinem der Ansprüche 17 bis 19 beansprucht wird, wobei der selektive Solubilisierungsschritt bewirkt wird, indem das erste Pellet wenigstens einmal mit einer zweiten gepufferten wässrigen Lösung, welche ein Detergenz und ein Solubilisierungsmittel umfasst, in Kontakt gebracht wird, das erste Pellet mit Ultraschall behandelt wird, um dieses aufzubrechen, und zentrifugiert wird, um das zweite Pellet und den zweiten Überstand zu bilden.

21. Das Verfahren, das in Anspruch 20 beansprucht wird, wobei die zweite gepufferte wässrige Lösung einen pH von 7 bis 8,5 aufweist und 10 mM bis 1 M Tris-HCl, 0,2 bis 2 Gew.-% Detergenz und 2 bis 20 mM EDTA umfasst.

22. Das Verfahren, das in Anspruch 21 beansprucht wird, wobei das Detergenz Triton X-100 ist.

23. Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 20 bis 22 beansprucht wird, wobei die Schritte des Inkontaktbringens, des mit Ultraschall Behandelns und des Zentrifugierens wenigstens zweimal durchgeführt werden und der Überstand aus jedem dieser Schritte vereinigt wird, um den zweiten Überstand bereitzustellen.

24. Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 17 bis 23 beansprucht wird, wobei der Reinigungsschritt durch mehrere Arbeitsschritte mit Chromatographiesäulen durchgeführt wird.

25. Das Verfahren, das in Anspruch 24 beansprucht wird, wobei die mehreren Arbeitsschritte auf Chromatographiesäulen umfassen:

(a) einen ersten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer ersten Chromatographiesäule, durch welche das Transferrinrezeptorprotein selektiv hindurchfließt und an welche kontaminierende Proteine binden;

(b) einen zweiten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer zweiten Chromatographiesäule, welche eine Kationenaustauschermatrix umfasst, durch welche das Transferrinrezeptorprotein selektiv hindurchfließt und an welche kontaminierende Proteine binden;

(c) einen dritten chromatographischen Arbeitsschritt auf einer dritten Chromatographiesäule, an welche das Transferrinrezeptorprotein, bevorzugt vor dem OMP B2-Protein, selektiv gebunden wird; und

(d) Eluieren des Transferrinrezeptorproteins aus der dritten Chromatographiesäule.

26. Das Verfahren, das in Anspruch 25 beansprucht wird, wobei der erste chromatographische Arbeitsschritt ausgeführt wird, indem 10 mM bis 1 M Tris-HCl und ein pH von 7 bis 8,5 auf einer DEAE-Sephacelsäule verwendet werden.

27. Das Verfahren, das in Anspruch 25 oder 26 beansprucht wird, wobei der zweite chromatographische Arbeitsschritt durchgeführt wird, indem 10 mM bis 1 M Tris- HCl bei einem pH von 7 bis 8,5 auf einer SE-Cellulosesäule verwendet werden.

28. Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 25 bis 27 beansprucht wird, wobei der dritte chromatographische Arbeitsschritt durchgeführt wird, indem die dritte Chromatographiesäule, welche Hydroxylapatit ist, unter Verwendung von 5 bis 50 mM KH&sub2;PO&sub4;-Pufferlösung bei einem pH von 7 bis 8,5 beladen wird und der Elutionsschritt durchgeführt wird, indem die beladene Säule unter Verwendung einer Pufferlösung mit einem pH von 7 bis 8,5, welche 150 bis 250 mM KH&sub2;PO&sub4; enthält, eluiert wird.