DE69506686T2

DE69506686T2 - Verwendung von bis (amidinobenzidazolen) zur herstellung eines medikamentes für die hemmung der retroviral integrase

Info

Publication number: DE69506686T2
Application number: DE69506686T
Authority: DE
Inventors: Christine C. Chapel Hill Nc 27516 Dykstra; Ronald I. Chapel Hill Nc 27514 Swanstrom; Richard R. Chapel Hill Nc 27514 Tidwell
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 1994-01-20
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 1999-07-22
Anticipated expiration: 2015-01-19
Also published as: AU1679895A; ES2128043T3; JPH09508369A; EP0739202B1; CA2179015A1; DE69506686D1; WO1995019772A1; US6815461B1; JP3306830B2; EP0739202A1; CA2179015C; BR9506552A; NZ279619A; NZ335226A; AU675386B2; ATE174508T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung von dikationischen Bisbenzimidazolen der unten angegebenen Formel (I) oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen von retroviraler Integrase oder zum Bekämpfen einer retroviralen Infektion.

Hintergrund der Erfindung

Das Genom des typischen Retrovirus codiert drei primäre Enzyme, die im Virusreplikationszyklus eine Mittlerrolle spielen. Reverse Transkriptase wandelt das virale RNA-Genom in eine doppelsträngige DNA um. Die Integrase setzt diese DNA-Kopie nichtspezifisch in das Wirtszellengenom ein, und Protease spaltet virale strukturelle und nichtstrukturelle Proteine in ihre ausgereifte Form.
Ein notwendiger Schritt des retroviralen Lebenszyklus ist die Integration seiner doppelsträngigen DNA-Kopie in das Wirtsgenom. H. Sakai et al., J. Virol., Band 67 (1993), Seiten 1169-74. Dieser Vorgang erfordert ein hohes Maß an bewahrter Sequenzerkennung und Spaltungsschritte. Aus diesem Grund sollte ein therapeutisches Mittel, das diesen Vorgang unterbrechen kann, ein wirksames und spezifisches Antivirusmittel sein. Ein Protein am C-Terminus der viralen Polymerase, die Integrase (IN), ist das einzige virale Protein, das für diesen Vorgang nötig ist. R. LaFemina et al., J. Virol., Band 66 (1992), Seiten 7414-7419.
A. Fesen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 90 (1993), Seiten 2399-2403, diskutieren Untersuchungen unter Verwendung einer in-vitro-Integraseprüfung verschiedener chemischer Stoffe als potentieller Virustyp I (HIV-1) Integrase-Hemmer bei Immunmangel des Menschen. Der Artikel berichtet über verschiedene Topoisomerase-Hemmen wie Doxorubicin, Mitoxantrose, Ellipticine und Quercetin, als potentielle Inhibitoren. Obwohl einige Topoisomerase-Inhibitoren hervorragende Antiintegrasemittel waren, wurde keine Korrelation mit antiviralen Wirkungen beobachtet. Man glaubt, daß dies mindestens teilweise auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß eine Anzahl von Topoisomerase-Inhibitoren in Abhängigkeit ihrer Hemmmechanismen starke cytotoxische Wirkungen aufweisen.
R. LaFemina et al., J. Virology, Band 56 (1992), Seiten 7414- 7419, berichten über Studien zur Abschätzung der Nützlichkeit des Integraseenzyms als Ziel für spezifische HIV-1 antivirale Therapiemittel durch Bestimmen des absoluten Erfordernisses zur Bildung für eine produktive HIV-1 Infektion. Der Artikel berichtet über die Ergebnisse des Einführens einer speziellen Aminosäuresubstitution in rekombinante Integrase und bewertet die Fähigkeit der mutanten Proteine, in geeigneter Weise bei einer spezifischen oder nichtspezifischen Spaltung sowie der Integration mitzuwirken.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer wirksamen, die retrovirale Integrase hemmenden Menge einer Verbindung gemäß der Formel (I)
worin
R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylresten besteht, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen den Rest -(CH&sub2;)m- bedeuten, worin m eine Zahl von 2 bis 4 darstellt,
R&sub3; ein H oder einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;- Alkylrest bedeutet und
X einen gesättigten oder ungesättigten C&sub2;-Alkylrest mit bis zu einer Doppelbindung darstellt (zum Beispiel -(CH&sub2;)n-, worin n die Zahl 1 oder 2 bedeutet und wobei der Rest unsubstituiert oder durch einen oder zwei Niederalkylreste substituiert ist sowie gesättigt oder ungesättigt ist und bis zu einer Doppelbindung enthält),
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen von retroviraler Integrase bei einem Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bedeuten R&sub1; und R&sub3; jeweils H, R&sub2; bedeutet H oder einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylrest, und X ist aus der Gruppe der Reste -CH&sub2;-CH&sub2;- und -CH=CH- und irgendeinem anderen der vorstehenden Reste ausgewählt, die einmal oder zweimal durch einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylrest substituiert sind. Diese Ausführungsform beinhaltet auch pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon. Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen sind 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethan, 1,2- Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen und 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der Verbindungen der Formel I bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Bekämpfen einer retroviralen Infektion (z. B. in vitro oder in einem Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt). Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen sind 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethan, 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen, 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2- benzimidazolyl)ethen oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Verbindungen der Formel I oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze können in einer therapeutisch wirksamen Menge in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger eingearbeitet werden, um pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung zu stellen, wobei die therapeutisch wirksame Menge eine entsprechende Wirksamkeit hat, um die oben angegebenen Methoden anzuwenden.
Die vorstehenden und andere Aufgabenstellungen und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung im einzelnen erläutert. Gemäß der WO 9408580 wurden einige der vorliegenden Erfindung kürzlich bei der Behandlung von Pneumocystis carinii pneumonia eingesetzt. Gemäß der WO 9508540 können Bis(amidinobenzimidazolyl)alkane (insbesondere die Methane) verwendet werden, um AIDS und verwandte Krankheiten zu behandeln.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Wirksamkeit von CEM-Zellen, einer menschlichen T-Lymphona-Zelllinie (A. H. Kaplan et al., J. Virol., Band 67 (1993), Seiten 4050-5) in der Kulturschale, behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen (Verbindung B) (30 umol, 100 umol und 300 umol), wobei die X-Achse die Expositionszeit in Tagen und die Y-Achse die lebensfähigen Zellen pro Milliliter (ml) angeben, und
Fig. 2 zeigt die Wachstumsgeschwindigkeit von Magic- Zellen (J. Kimpton et al., J. Virol., Band 66 (1992), Seiten 2232-2239) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen (Verbindung B) (10 umol, 30 umol und 100 umol), wobei die X-Achse die Expositionszeit in Tagen und die Y-Achse die Anzahl der Zellen wiedergibt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der hier benutzte Ausdruck "Niederalkyl" bezieht sich auf lineare oder verzweigte C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylreste, wie die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isopropyl-, s-Butyl- und t- Butylgruppe. Die Methyl- und die Ethylgruppe sind bevorzugt.
Die mit den Methoden der vorliegenden Erfindung zu behandelnden Subjekte sind Tiere, z. B. Wirbeltiere, einschließlich Säugetiere (z. B. Mensch, Katze, Hund, Rind, Pferd, Schaf, Schwein, Affen unterschiedlicher Art usw.) und Vögel (z. B. Huhn, Truthahn, Ente, Gans, Wachtel, Fasan usw.).
Die Erfindung findet allgemein auf Retroviren, d. h. auf die ganze Virusfamilie der Retroviridae, Anwendung. Die Familie umfaßt alle Viren, die ein RNA-Genom enthalten und eine enzymatische Aktivität bezüglich einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase (einer reversen Transkriptase) aufweisen. Die Familie wird in drei Unterfamilien eingeteilt: (1) Oncovirinae, z. B alle onkogenen Mitglieder und viele nahe Verwandten nichtonkogenen Viren; (2) Lentivirinae, die "langsamen" Viren, wie visna virus; und (3) Spumavirinae, die "schaumartigen" Viren, die hartnäckige Infektionen ohne irgendeine klinische Erkrankung auslösen. Interessierende Retroviren sind z. B. menschliche Retroviren, wie der Immunomangel-Virustyp 1 (HIV-1), Vogel-Retroviren, wie Vogelsarkom- und -leukoseviren bei Hühnern (ASLVs), endogene Viren bestimmter Fasan- und Wachtelarten, der Retikuloendotheliosevirus von Truthühnern und verwandte Viren von Enten und Hühnern sowie lymphoproliferierende Krankheitsviren von Truthühnern; die C-Typ-Retroviren bei Katzen, einschließlich des Leukämievirus bei Katzen (FeLV) und des Sarkomvirus bei Katzen (FeSV) sowie endogene Retroviren (RD 114 und CCC-Isolate); C-Typ-Retroviren bei Nerzen, einschließlich des Leukämievirus bei Nerzen (MiLV); die C-Typ-Retroviren bei Schweinen; die C-Typ-Retroviren bei Pferden, einschließlich des für Pferde infektiösen Anämievirus (EIAV); der C-Typ-Retrovirus beim Rind, einschließlich der Leukose oder des Lymphsarkoms bei Rindern; die C-Typ-Retroviren bei Schafen; und die Primaten- Retroviren, einschließlich der Affen-C-Typ-Retroviren, die Affensarkom- und der Gibbonaffen-Leukämie-C-Typ-Retroviren, die Pavian-C-Typ-Retroviren, die Makakaaffen-C-Typ- Retroviren, die Eulenaffen-C-Typ-Retroviren, die Seidenaffen- C-Typ-Retroviren, der Mason-Pfizer-Affen-D-Typ-Retrovirus, der Schlankaffen-D-Typ-Retrovirus und der Totenkopfäffchen-D- Typ-Retrovirus. Siehe N. Teich, Taxonomy of Retroviruses in "Molecular Biology of Tumor Viruses", R. Weiss, N. Teich, H. Varmus und J. Coffin als Herausgeber, Cold spring Harbor Laboratory, New York (2. Auflage 1984), Seiten 26-207).
Wie oben angegeben, enthalten die pharmazeutischen Formulierungen die vorgenannten Verbindungen der Formel I oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon in pharmazeutisch annehmbaren Trägern, vorzugsweise für eine Verabreichung als Aerosol und zur oralen sowie parenteralen Verabreichung, wie unten mehr im einzelnen besprochen wird. Die vorliegenden Verbindungen oder ihre Salze können auch lyophilisiert sein und dann wieder in den früheren Zustand zurückversetzt werden, um pharmazeutisch annehmbare Formulierungen zur Verabreichung, z. B. für eine intravenöse oder intramuskuläre Injektion, zu bilden.
Die therapeutisch wirksame Dosis irgendeiner speziellen Verbindung, deren Verwendung innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegt, variiert etwas von Verbindung zu Verbindung und von Patient zu Patient. Auch hängt sie vom Zustand des Patienten und dem Verabreichungsweg ab. Als eine allgemeine Empfehlung ist zu sagen, daß eine Dosis von 0,1 bis 20 mg/kg eine therapeutische Wirkung hat, wobei noch höhere Dosen bei einer oralen Verabreichung oder einer Aerosol-Verabreichung angewandt werden können. Bei den größeren Mengen können Toxizitätsüberlegungen im Falle intravenöser Dosen auf eine geringere Menge, z. B. auf bis zu etwa 10 mg/kg, einschränken. Dabei werden alle Gewichte auf der Grundlage des Gewichts der aktiven Basisverbindung berechnet, einschließlich der Fälle, in denen ein Salz angewandt wird. Im Normalfall benutzt man eine Dosis von 0,56 mg/kg bis 5 mg/kg. Unter gewissen Umständen können auch höhere oder geringere Dosen geeignet sein. Die Dauer der Behandlung kann einmal pro Tag während eines Zeitraums von 2 bis 3 Wochen betragen und bis zu einem Zeitraum von Monaten oder sogar Jahren, z. B. bei der Behandlung chronischer Zustände, fortgesetzt werden. Es können niedrigere Dosen, die weniger häufig verabreicht werden, benutzt werden, um die Häufigkeit oder die Wiederkehr der Infektion zu verhindern oder zu reduzieren. Die tägliche Dosis kann entweder als Einzeldosis in Form einer Einzeldosiseinheit oder in Form von mehreren kleineren Dosiseinheiten oder durch mehrmalige Verabreichung von unterteilten Dosen in bestimmten Zeitabständen verabreicht werden.
Die Verbindungen der Formel (I) können per se oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes verabfolgt werden. Wenn die Salze der Verbindungen der Formel (I) in einem Arzneimittel verwendet werden, sollen sie sowohl pharmakologisch als auch pharmazeutisch annehmbar sein. Jedoch können pharmazeutisch nicht annehmbare Salze bequem eingesetzt werden, um die freie aktive Verbindung oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon herzustellen, und sind deshalb aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung nicht ausgeschlossen. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbaren Salze sind, ohne darin eine Begrenzung zu sehen, beispielsweise jene, die aus den folgenden Säuren hergestellt wurden: Salzsäure, Milchsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, p- Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Citronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalin- 2-sulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Auch können pharmazeutisch annehmbare Salze als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, z. B. als Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, der Carbonsäuregruppe hergestellt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Formulierungen sowohl für den Einsatz in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin zur Verfügung. Diese Formulierungen enthalten das Hemmmittel für die retrovirale Integrase zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern hierfür sowie gegebenenfalls irgendwelchen anderen therapeutischen Bestandteilen. Der oder die Träger müssen in dem Sinn pharmazeutisch annehmbar sein, daß sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und gegenüber dem Empfänger nicht zu sehr schädlich sind.
Die Formulierungen sind beispielsweise solche, die für eine orale, rektale, topische, nasale, ophthalmische oder parenterale (einschließlich einer subcutanen, intramuskulären und intravenösen) Verabreichung geeignet sind. Geeignete Formulierungen für eine orale und parenterale Verabreichung sowie eine Aerosolverabreichung sind bevorzugt.
Die Formulierungen können bequem in Form von Einheitsdosen angeboten und durch irgendeine auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannte Methode hergestellt werden. Alle Methoden beinhalten die Stufe des Zusammenbringens der aktiven Verbindung mit einem Träger, der aus einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen besteht. Im allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Zusammenführen der aktiven Verbindung mit einem flüssigen Träger, mit einem fein zerteilten festen Träger oder mit beiden sowie, falls nötig, durch anschließendes Überführen des Produkts in die gewünschten Formulierungsformen hergestellt.
Für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen der vorliegenden Erfindung können als einzelne Einheiten, wie Kapseln, Cachets, Tabletten oder Pastillen angeboten werden, die jeweils eine vorgegebene Menge des integrasehemmenden Mittels als Pulver oder Granulat enthalten. Die Formulierungen können auch in Form einer Suspension in einer wäßrigen oder nichtwäßrigen Flüssigkeit, z. B. als Syrup, Elixier, Emulsion oder Trank, zur Verfügung gestellt werden.
Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Zusatzstoffen, hergestellt werden. Gepreßte Tabletten können durch Pressen in einer geeigneten Maschine erhalten werden, wobei die aktive Verbindung in einer freifließenden Form, z. B. als Pulver oder Granulat, vorliegt, die gegebenenfalls mit einem Bindemittel, Zerfallsmittel, Gleitmittel, einem inerten Verdünnungsmittel, einem oberflächenaktiven Mittel oder einem Dispergiermittel gemischt werden. Geformte Tabletten, die aus einem Gemisch der pulverförmigen aktiven Verbindung mit einem geeigneten Träger bestehen, können durch einen Formungsvorgang in einer geeigneten Maschine erhalten werden.
Ein Syrup kann durch Zugeben der aktiven Verbindung zu einer konzentrierten wäßrigen Lösung eines Zuckers, z. B. von Saccharose, hergestellt werden, der auch irgendein Zusatzstoff oder Zusatzstoffe zugesetzt werden können. Ein derartiger Zusatzstoff oder solche Zusatzstoffe sind beispielsweise Geschmacksstoffe, geeignete Konservierungsstoffe, ein Mittel zur Verzögerung der Zuckerkristallisation und ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit irgendeines anderen Bestandteils, wie ein mehrwertiger Alkohol, z. B. Glycerin oder Sorbit.
Geeignete Formulierungen für eine parenterale Verabreichung enthalten zweckmäßigerweise eine sterile wäßrige Zubereitung der aktiven Verbindung. Die Zubereitung ist vorzugsweise, bezüglich des Bluts des Empfängers isotonisch sowie pyrogenfrei.
Nasensprayformulierungen enthalten gereinigte wäßrige Lösungen der aktiven Verbindung mit Konservierungsmitteln und isotonischen Mitteln. Solche Formulierungen werden vorzugsweise auf einen pH-Wert und einen isotonischen Zustand eingestellt, der mit den Nasenschleimhautmembranen verträglich ist.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als ein Suppositorium mit einem geeigneten Träger, wie Kakaobutter, hydrierten Fetten oder hydrierten Fettsäuren, dargeboten werden.
Formulierungen auf dem Gebiet der Ophthalmologie werden auf eine ähnliche Weise wie das Nasenspray hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der pH-Wert und isotonische Faktoren vorzugsweise derart eingestellt werden, daß sie für das Auge passen.
Topische Formulierungen enthalten die aktive Verbindung gelöst oder suspendiert in einem oder mehreren Medien, z. B. in Mineralöl, Erdöl, mehrwertigen Alkoholen oder in anderen Grundstoffen, die für topische pharmazeutische Formulierungen benutzt werden. Die Zugabe anderer Zusatzstoffe (siehe unten) kann erwünscht sein.
Zusätzlich zu den vorgenannten Bestandteilen können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung ferner einen oder meh rere Zusatzstoffe enthalten, die aus Verdünnungsmitteln, Puffermitteln, Geschmackstoffen, Bindemitteln, Zerfallstoffen, oberflächenaktiven Stoffen, Verdickungsmitteln, Gleitmitteln, Konservierungsmitteln (einschließlich Antioxidantien) usw. ausgewählt werden.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens kann eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oral oder durch Inhalieren als ein Feststoff oder intramuskulär oder intravenös als Lösung, Suspension oder Emulsion verabreicht werden. Alternativ kann die Verbindung oder das Salz auch durch Inhalieren oder durch intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung als liposomale Suspension verabfolgt werden. Wenn die Verbindung oder das Salz durch Inhalieren verabreicht wird, soll sie bzw. es in Form einer Mehrzahl von festen Teilchen oder Tröpfchen mit einer Teilchengröße von 0,5 bis 5 um, vorzugsweise von 1 bis 2 um, vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die für eine intravenöse oder intramuskuläre Injektion geeignet sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon in irgendeinem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Wenn eine Lösung erwünscht ist, ist Wasser der Träger der Wahl bei wasserlöslichen Verbindungen oder Salzen, oder es kann ein organischer Träger, wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol oder ein Gemisch aus diesen Stoffen geeignet sein. Im letzteren Fall kann der organische Träger eine deutliche Menge Wasser enthalten. In jedem Fall kann die Lösung dann auf irgendeine geeignete Weise sterilisiert werden, vorzugsweise durch Filtrieren durch einen Filter von 0,22 Mikron. Nach der Sterilisation kann die Lösung in geeignete Behälter eingefüllt werden, z. B. in pyrogenfrei gemachte Fläschchen. Natürlich soll das Einfüllen mittels einer aseptischen Methode erfolgen.
Dann können sterilisierte Verschlüsse auf die Fläschchen aufgesetzt werden. Gewünschtenfalls kann der Fläschcheninhalt jeweils lyophilisiert werden.
Zusätzlich zu Verbindungen der Formel I oder ihren Salzen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen andere Zusatzstoffe, wie Zusatzstoffe zur Einstellung des pH-Werts, enthalten. Insbesondere sind nützliche Stoffe zur Einstellung des pH-Werts beispielsweise Säuren, Basen oder Puffer, wie Natriumlactat, Natriumacetat oder Natriumgluconat. Ferner können die Zusammensetzungen mikrobielle Konservierungsstoffe enthalten. Nützliche mikrobielle Konservierungsstoffe sind beispielsweise Methylbaraben, Propylparaben und Benzylalkohol. Der mikrobielle Konservierungsstoff wird normalerweise eingesetzt, wenn die Formulierung in ein Fläschchen abgefüllt wird, das für einen Gebrauch mit mehreren Dosen bestimmt ist. Wie angegeben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung natürlich unter Anwendung der auf dem Fachgebiet gut bekannten Techniken lyophilisiert werden.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine injizierbare, stabile, sterile Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, bei der eine Verbindung der Formel I oder ein Salz hiervon in Form einer Einheitsdosis in einem verschlossenen Behälter vorliegt. Die Verbindung oder das Salz wird in Form eines Lyophilisats bereitgestellt, das mit einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger wieder in die frühere Form gebracht werden kann und dabei eine flüssige Zusammensetzung bildet, die für eine Injektion bei dem Patienten geeignet ist. Die Form der Einheitsdosis enthält normalerweise etwa 10 mg bis etwa 10 g der Verbindung oder des Salzes. Wenn die Verbindung oder das Salz im wesentlichen wasserunlöslich ist, kann eine ausreichende Menge eines Emulgiermittels, das physiologisch annehmbar ist, in einer ausreichenden Menge angewandt werden, um die Verbindung oder das Salz in einem wäßrigen Träger zu emulgieren. Ein solches nützliches Emulgiermittel ist Phosphatidylcholin.
Aus den wasserunlöslichen Verbindungen der Formel I oder deren Salzen können andere pharmazeutische Zusammensetzungen, z. B. Emulsionen auf wäßriger Basis, hergestellt werden. In einem solchen Fall enthält die Zusammensetzung eine ausreichende Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Emulgiermittels, um die gewünschte Menge der Verbindung der Formel I oder des Salzes hiervon zu emulgieren. Besonders nützliche Emulgiermittel sind beispielsweise Phosphatidylcholine und Lecithin.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung liposomale Formulierungen der Verbindungen der Formel I und ihrer Salze zur Verfügung. Die Technologie zur Bildung liposomaler Suspensionen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Wenn die Verbindung der Formel I oder ihr Salz ein wasserlösliches Salz ist, kann sie bzw. es unter Anwendung der üblichen Liposomtechnologie in Lipidbläschen eingearbeitet werden. In einem solchen Fall wird die Verbindung oder das Salz aufgrund ihrer bzw. seiner Wasserlöslichkeit im wesentlichen in der hydrophilen Mitte oder dem Kern der Liposomen aufgenommen. Die eingesetzte Lipidschicht kann aus irgendeiner üblichen Zusammensetzung bestehen und entweder cholesterinhaltig oder cholesterinfrei sein. Wenn die interessierende Verbindung oder das interessierende Salz wasserunlöslich ist und wiederum eine übliche Technologie zur Liposombildung angewandt wird, kann das Salz im wesentlichen innerhalb der hydrophoben Lipiddoppelschicht aufgenommen werden, welche die Struktur des Liposoms bildet. In jedem Fall kann die Größe der gebildeten Liposomen vermindert sein, z. B. durch Anwendung einer üblichen Schallbehandlung und von Homogenisierungstechniken.
Natürlich können die liposomalen Formulierungen, welche die Verbindungen der Formel I oder Salze hiervon enthalten, lyo philisiert werden, um ein Lyophilisat herzustellen, das mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Wasser, wieder in den früheren Zustand versetzt werden kann, um erneut eine liposomale Suspension zu erzeugen.
Es werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die als Aerosol für eine Verabreichung durch Inhalieren geeignet sind. Diese Formulierungen enthalten eine Lösung oder Suspension der gewünschten Verbindung der Formel I oder eines Salzes hiervon oder eine Mehrzahl von festen Teilchen der Verbindung oder des Salzes. Die gewünschte Formulierung kann in eine kleine Kammer eingebracht und zerstäubt werden. Das Zerstäuben kann mittels Druckluft oder Ultraschallenergie erfolgen, um eine Vielzahl von flüssigen Tröpfchen oder festen Teilchen zu bilden, welche die Verbindungen oder Salze enthalten. Die flüssigen Tröpfchen oder festen Teilchen sollen eine Teilchengröße im Bereich von 0,5 bis 5 um aufweisen. Die festen Teilchen können durch Verarbeiten der festen Verbindung der Formel I oder eines Salzes hiervon in irgendeiner geeigneten bekannten Weise, z. B. durch Behandeln in einer Strahlmühle, erhalten werden. Es ist besonders bevorzugt, wenn die Größe der festen Teilchen oder Tröpfchen bei 1 bis 2 um liegen. In dieser Hinsicht stehen handelsübliche Strahlmühlen zur Verfügung, um diesen Zweck zu erreichen. Wenn die pharmazeutische Formulierung, die für eine Verabreichung als Aerosol geeignet ist, in Form einer Flüssigkeit vorliegt, enthält die Formulierung vorzugsweise eine wasserlösliche Verbindung der Formel I oder ein Salz hiervon in einem wasserhaltigen Träger. Es kann ein oberflächenaktives Mittel vorliegen, das die Oberflächenspannung der Formulierung ausreichend herabsetzt, um Tröpfchen innerhalb des gewünschten Größenbereichs zu bilden, wenn die Behandlung in der Strahlmühle erfolgt.
Wie angegeben, stellt die vorliegende Erfindung sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Verbindungen und Salze zur Verfügung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "wasserlöslich" irgendeine Zusammensetzung, die in Wasser in einer Menge von etwa 50 mg/ml oder in einer größeren Menge löslich ist. Ferner bezeichnet im Rahmen der Erfindung der Ausdruck "wasserunlöslich" irgendeine Zusammensetzung, die eine Löslichkeit in Wasser von weniger als etwa 20 mg/ml aufweist. Für gewisse Anwendungen können wasserlösliche Verbindungen oder Salze erwünscht sein, während für andere Anwendungen wasserunlösliche Verbindungen oder Salze in entsprechender Weise bevorzugt sind.
Beispiele für Verbindungen der obigen Formel (I), die aber keine Beschränkung darstellen, sind nachfolgend angegeben:
(A) 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen;
(B) 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen;
(AA) 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethan;
(BB) 1,2-Bis[5-(2-imidazolyl)-2-benzimidazolyl]ethan;
(CC) 1,2-Bis[5-(2-imidazolyl)-2-benzimidazolyl]ethen;
(DD) 1-(5-Amidino-2-benzimidazolyl)-[5'-(2-imidazolinyl)- 2'-benzimidazolyl)ethan;
(EE) 1-(5-Amidino-2-benzimidazolyl)-[5'-(2-imidazolinyl)- 2'-benzimidazolyl)ethen; und
(GG) 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethan;
Zusätzliche Verbindungen zur Erläuterung der Formel (I), die den vorgenannten Verbindungen analog sind, können durch Einsetzen eines 2-Pyrimidylrestes anstelle des 2-Imidazolylrestes hergestellt werden.
Die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzten Verbindungen sind entweder bekannt oder können nach Techniken, welche den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 4933347, dessen gesamte Offenbarung hiermit durch Inbezugnahme mitaufgenommen wird), insbesondere im Lichte der unten angegebenen Offenbarung.
Wie angegeben, können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen als pharmazeutisch annehmbare Salze vorliegen. Solche Salze sind z. B. das Gluconat, Lactat, Acetat, Tartrat, Citrat, Phosphat, Borat, Nitrat, Sulfat und Hydrochlorid.
Die Salze der vorliegenden Erfindung können im allgemeinen durch Umsetzen von zwei Äquivalenten der Amidinbase mit der gewünschten Säure in einer Lösung hergestellt werden. Nachdem die Reaktion vollständig ist, werden die Salze durch Zugabe einer geeigneten Menge eines Lösungsmittels, in dem das jeweilige Salz unlöslich ist, aus der Lösung auskristallisiert.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert. Darin bedeuten "g" Gramm, "mg" Milligramm, "ug" Mikrogramm, "mmol" Millimol, "h" Stunden, "ml" Milliliter, "m" molar, "mmol" millimolar, "UV" ultraviolett, "HCl" Chlorwasserstoff, "NaCl" Natriumchlorid, "EDTA" Ethylendiamintetraessigsäure, "Fp." Schmelzpunkt und "ºC" Grad Celsius.

BEISPIEL 1

Herstellung von Verbindungen

Die Strukturen der Verbindungen, die in den unten beschriebenen Untersuchungen der Hemmung verwendet wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. Alle Verbindungen wurden nach früher veröffentlichten Methoden synthetisiert. Siehe R. Tidwell et al., Antimicrob. Agents and Chemother., Band 38 (1993), 000-000; T. Fairley, J. Med. Chem., Band 36 (1993), Seiten 1746-1753. TABELLE 1 Strukturen der integrasehemmenden Verbindungen

BEISPIEL 2

Herstellung und Prüfung des Integraseproteins

Reinigung des Integraseproteins. Integrase wurde in E. coli aus einem induzierbaren Plasmid im Überschuß hergestellt, das die Integraseseguenz unter Steuerung einer lacl-regulierten T7 Polymerase enthielt, wobei die für Integrase codierende Domäne vom HXB2 Klon der HIV-1 DNA (L. Ratner et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, Band 3 (1987), Seiten 57-69), pT7fll- IN verwendet wurde. Eine Kultur von einem Liter bei einer O. D. von 0,6 wurde durch die Zugabe von IPT6 bis 0,5 mmol induziert. Nach drei Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, und die Pellets wurden bei -70ºC gelagert.
Das Integraseprotein wurde durch eine Modifizierung - der Methode von Sherman und Fyfe gereinigt (P. Sherman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 87 (1990), Seiten 5119-23). Die Zellen wurden durch Auftauen in einem Puffer (50 mmol Tris-HCl, pH 7,5; 5 mmol Dithiothreitol, 1 mmol EDTA, 1 mg/ml Lysozym) auf Eis bei 6 ml/g bakteriellem Pellet während 30. Minuten und anschließendes Inkubieren bei 37ºC während 5 Minuten lysiert. Das Lysat wurde 1 Stunde bei 12000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5, 1 mmol Dithiothreitol, 1 mmol EDTA, 1m NaCl (4 ml/g Originalbakterien) resuspendiert. Das Homogenat wurde 30 Minuten bei 4ºC gerührt und 30 Minuten bei 12000 g rezentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 0,8 m Ammoniumsulfat versetzt, wobei das Pulver langsam unter Rühren während eines Zeitraums von 30 Minuten zugegeben wurde. Der Extrakt wurde dann zentrifugiert, um jeden Niederschlag abzutrennen, und auf eine Phenylsepharose-Säule gegeben. Nach einem Waschen mit 50 ml eines stark salzhaltigen Puffers (50 mmol Tris-HCl, 1 mmol EDTA, 5 mmol DTT, 2 m NaCl) wurde das Protein mit einem Puffer eluiert, der einen Gradienten von hohem Salzgehalt bis zu einem Salzgehalt von 0 aufwies und 10% (Gewicht/Volumen) Glycerin enthielt. Ein weiteres Reinigen erfolgte durch eine G75-Sephadex-Säule, um Hintergrundnuclease abzutrennen. Eine Kultur von einem Liter erzeugt genügend Integraseaktivität, um über 1000 Arzneimittelhemmprüfungen durchzuführen.
Prüfungen der Integraseaktivität. Die Enzymreinigungsschritte wurden durch eine Endonuclease/Nicking-Prüfung und Western- Blots überwacht, wobei ein bezüglich Integrase monoklonaler Antikörper benutzt wurde, der von W. Osheroff und R. Swanstrom an der UNC-Chapel Hill erzeugt worden ist. Superhelix pBluescriptKS+II (0,3 ug) wurde 30 Minuten bei 37ºC mit Säulenfraktionen in einem Puffer inkubiert, der 20 mmol Tris- HCl, pH 8, 0, 5 mmol 2-Mercaptoethanol und 2 mmol MnCl&sub2; enthielt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SD5 bis 1% gestoppt. Eine Spaltung des DNA-Substrats wurde durch Elektrophorese durch ein 0,8%-iges Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt war, festgestellt und unter UV-Beleuchtung fotografiert.
Die Spaltung spezieller Stellen wird festgestellt, wie in der obengenannten Druckschrift von Sherman et al. beschrieben worden ist, mit der Ausnahme, daß der Prüfungspuffer der gleiche war, von dem Chow et al., Science, Band 255 (1992), Seiten 723-6, berichtet hat. Einzelne 20-mer Oligonucleotide, die entweder dem US- oder dem U3-Ende von HIV-1 entsprechen, werden mit ³²P endmarkiert, mit seinem Komplement erhitzt, gereinigt und unter den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Endonuclease-Prüfung beschrieben sind, verwendet. Die Reaktionsprodukte werden mit Formamid denaturiert, einer Elektrophorese durch 20prozentige denaturierende Polyacrylamidgele unterworfen und durch Audioradiografie sichtbar gemacht. Sowohl die Spaltung als auch die Ligationsaktivität können aus einem Gel festgestellt werden. Um die Ligationsaktivität allein festzustellen, wurde für einige Experimente auch ein "vorgespaltenes" Substrat eingesetzt, bei dem die 2-Spaltung durch Verwendung eines radiomarkierten 18-mer Oligonucleotids künstlich erzeugt worden ist.

BEISPIEL 3

Virus- und Zellkulturen

Die eingesetzten Zellinien waren CEM-Zellen, eine menschliche T-Zelle Lymphonazellinie, A. Kaplan et al., J. Virol., Band 67 (1993), Seiten 4050-5, und Magic-Zellen, J. Kimpton et al., J. Virol., Band 66 (1992), Seiten 2232-2239, eingesetzt. Die CEM-Zellen wurden in einem RPM1-1640-Medium, das mit 5% FCS ergänzt war, gezüchtet. Die Magic-Zellen, ein HELA- Derivat, wurden in DMEM/H gezüchtet, das mit 5% FCS, G418 (20 mg/ml) und Hygromycin (10 mg/ml) ergänzt worden ist. Das HIV- Isolat war der Stamm HXB2, ursprünglich von Lee Ratner im Labor von Robert Gallo an den National Institutes of Health.

BEISPIEL 4

Toxizitätsprüfungen

Es wurden drei verschiedene Toxizitätstests an den Zellinien durchgeführt, die verwendet wurden, um die Virusinfektiosität zu messen.
Für den Anfangstest der Toxizität benutzte man die XTT-Prüfung, wie sie von Weislow et al., J. Natl. Cancer Inst., Band 81 (1989), Seiten 577-586, beschrieben worden ist. Dies ist die Standardprüfung, die ursprünglich benutzt wurde, um die Zelltoxizität durch potentielle Inhibitoren der reversen Transcriptase zu messen. Kurz gesagt, Zellen werden bis Zellen/ml gezüchtet, und dem Medium werden Arzneimittelverdünnungen zugesetzt. Nach zweitägiger Inkubation wird das XTT- Reagenz zugefügt, und die Inkubation wird 4 h bei 37ºC fortgesetzt. Nach der Inkubation werden die Platten bei 450 minus 650 nm abgelesen (der Wert von 650 ist der Hintergrundwert, der automatisch abgezogen wird), mit Kontrollproben des Mediums + XTT-Reagens ohne Zellen sowie Zellen + Medium ohne Reagens. Auch eine Kontrollprobe aus Zellen + Medium + XTT- Reagens wurde für jede Platte eingesetzt.
Das Medium ohne Phenolrot wurde eingesetzt, um die Hintergrundfarbe zu minimieren, da sich das XTT-Reagens von farblos (unreduziert) nach orange (reduziert) ändert. Das XTT-Reagens wurde am Tag der Prüfung wie folgt frisch hergestellt: 1 mg/ml XTT in 0,01 m Phenazinmethosulfat. Die Phenazinmethosulfatlösung wurde vorher hergestellt und in einer dunklen Flasche bei 4ºC gelagert. Das XTT-Reagens wird den Microtiter-Behältern mit 24 ul pro 100 ul Medium zugegeben. Der O. D.-Wert wurde auf einem Vmax-Plattenleser von Molecular Devices Co. mit Datenreduktion gemessen. Die Ergebnisse werden als Prozentsaz der unbehandelten Kontrollproben ausgedrückt. Die am wenigsten toxischen Verbindungen waren die Verbindungen A, B und F mit Toxizitätswerten von 500 umol oder höher.
Dann wurde mit einem Ausbeutetest in der Schale die Fähigkeit der Zelle, nach der Inkubation mit einem Arzneistoff während einer Anzahl von Tagen zu wachsen, gemessen. Magic-Zellen wurden mit einer anfänglichen Zellkonzentration von 0,8 · 104 mit oder ohne verschiedenen Konzentrationen von Testverbindungen während 6 Tagen gezüchtet. Die Fähigkeit der Zellen in der Schale wurde durch Ausplattieren von Verdünnungen einer jeden Kultur auf Kunststoff festgestellt. Nach einem Wachstum von 2 bis 4 Tagen wurden koloniebildende Einheiten durch Zählen der Kolonien nach dem Anfärben der Platten bestimmt. Jede Probe wurde doppelt ausplattiert, und von der Anzahl der Kolonien wurde ein Durchschnitt gebildet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Der dritte Test zur Zelltoxizität bestimmte die Wachstumsgeschwindigkeit in Gegenwart der Testverbindung gegenüber einer Kontrollkultur. Man ließ Magic-Zellen über einen Zeitraum von 15 Tagen mit oder ohne Verdünnungen der Testverbindung wachsen. Jeden Tag wurden gleiche Mengen entnommen und die Zellen wurden in einem Hemocytometer gezählt. Die Ergebnisse sind hier in der Fig. 2 angegeben (siehe auch Tabelle 2 unten).

BEISPIEL 5

Integrasehemmprüfungen

Prüfen als Integrasehemmer. Im Überschuß in E. coli hergestellte Integrase wurde gereinigt, wie oben gemäß Sherman et al. beschrieben worden ist, und in Arzneistoffhemmprüfungen verwendet. Das für diese Untersuchungen benutzte Integrasepräparat war extrem rein und enthielt keinerlei Nucleaseaktivität. Verdünnungen der Hemmverbindungen, die oben in Beispiel 1 beschrieben worden sind, wurden vor der Zugabe des Enzyms mit dem Substrat gemischt. Die Prüfung war die gleiche, wie sie im Beispiel 2 beschrieben worden ist, und erfolgte mit dem in Beispiel 2 angegebenen Substrat. Jede Prüfung wurde zweifach durchgeführt. Die Radioaktivität in Bändern auf getrockneten Gelen wurde mit Hilfe eines Phosphor-Bilderzeugers quantifiziert, um die Wirkungen des Arzneistoffs auf die Spaltung, die Nuclease und die Ligationsprodukte festzustellen. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für die Integrasehemmung wurden sowohl für die Spaltungs- als auch die Verbindungsteile der Integrasereaktion nach dem Bestimmen des Prozentsatzes der Hemmung der Kontrollreaktion für eine Reihe von Arzneistoffkonzentrationen berechnet. Diese Ergebnisse werden unten in der Tabelle 2 angegeben. Die Verbindungen A, B, C und D hatten ähnliche Wirkungen auf die Integraseaktivität. Jedoch verursachte die Verbindung A eine Aggregation des Substrats, beginnend bei relativ niedrigen Konzentrationen (10 umol), was ihre Überprüfung komplizierte. TABELLE 2
¹ Die Aktivität wurde gemessen beim Prozentsatz der Spaltung des Substrats, verglichen mit der Kontrollprobe.
² Dieser Arzneistoff verursachte eine Aggregation des Substrats und fiel bei höheren Arzneistoffkonzentrationen aus dem Kulturmedium aus.
Ohne an eine Theorie oder Erklärung der Erfindung gebunden sein zu wollen, wird derzeit angenommen, daß diese Verbindungen mit einer Neigung bezüglich AT in der kleineren Furche der doppelsträngigen DNA gebunden werden (siehe. T. Fairley et al., J. Med. Chem., Band 36 (1993), Seiten 1746-1753), und es ist sehr wahrscheinlich, daß diese Verbindungen die Integrase dadurch hemmen, daß sie eine Bindung der Integrase an ihre Erkennungssequenzen an der Wiederholungseinheit am langen Ende ("LTR") des Virus verhindern. Dieser vorgeschlagene Mechanismus wird durch die Beobachtung gestützt, daß sowohl die Spaltung als auch die Integration in gleicher Weise durch die Verbindungen bewirkt wird. Gegenwärtig wird auch angenommen, daß entweder die spezifische Eigenschaft der DNA-Sequenz und/oder direkte Wechselwirkungen mit dem Integraseprotein möglicherweise in den Verbindungsmechanismus eingebunden sind. Da die Integrase als ein Multimer fungiert, K. S. Jones et al., J. Biol. Chem., Band 267 (1992), Seiten 16037-40, ist es auch möglich, daß das Binden der DNA durch die Verbindungen gewisse Wirkungen auf das Multimergleichgewicht hat.
Die Ergebnisse zeigen jedoch, daß die DNA-Bindungsstärke allein nicht der bestimmende Faktor ist. Man glaubt derzeit auch, daß möglicherweise entweder die speziellen Eigenschaften der DNA-Sequenz und/oder direkte Wechselwirkungen mit dem Integraseprotein möglicherweise involviert sind. Da gezeigt wurde, daß Nucleosomen genau am 5' LTR-Ende des HIV-1 angeordnet sind, A. Fesen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 90 (1993), Seiten 2399-2403, könnte diese Phasenbildung eine andere Möglichkeit dafür sein, daß sich die dikationischen, an den Furchen sich bindenden Arzneistoffe mit der Integrasewirkung überlagern.

BEISPIEL 6

HIV-1-Hemmprüfungen

Die von Kimpton et al. beschriebene Magic-Zellenprüfung, siehe oben, wurde wie beschrieben angewandt. Diese Prüfung identifiziert individuelle Zellen, die mit HIV-1 infiziert sind, durch die Expression von tat, das eine endogene Kopie des HIV-1 LTR transaktiviert, welches nach der Integration mit dem lac2 Reportergen verknüpft ist, wodurch eine β- Gallactosidaseexpression induziert wird, wenn x-gal dem Zellmedium zugefügt wird. Jede Zelle mit integriertem HIV-1 wird blau. Somit stellt diese Prüfung einen bequemen Weg dar, die Wirkung von HIV-Hemmern in jeder frühen Stufe durch die Expression von tat zu bestimmen, einschließlich der Hemmung der Integration.
Die Magic-Zellen werden in 12-Behälter-Schalen einen Tag vor der Infektion eingebracht. Die Standardprüfung beinhaltet eine Infektion mit etwa 200 infektiösen Einheiten von HIV-1.
Dies ergibt ein Verhältnis von etwa 20 zu 1 des Signals zum Hintergrund und eine ausreichende Anzahl von Infektionsvorgängen, um Trübungseffekte (dim effects) zu quantifizieren. Die Zellen werden vor der Virusinfektion 4 h von dem Arzneistoff durchdrungen, und die Virusadsorption findet eine Stunde lang statt. Die Zellen werden mit reinem Medium gewaschen, und dann wird Medium mit dem Hemmstoff auf die Zellen gegeben. Zwei Tage später sind die Zellen nach der Integration mit x-gal, dem Indikatorreagens für die β- Galactosidaseproduktion, fixiert. Die Anzahl der β- Galactosidase exprimierenden Zellen wird durch Lichtmikroskopie quantifiziert.
Die Ergebnisse der Vergleiche von infektiösen Einheiten mit oder ohne verschiedenen Konzentrationen von Bisbenzimidazolen als Arzneistoff in der Prüfung der Magic-Zelle werden als IC&sub5;&sub0;-Werte ausgedrückt und sind in der obigen Tabelle 2 aufgeführt. Es ist zu beachten, daß die beste Anti-HIV-Verbindung B auch der beste Integrasehemmer war, ausgenommen die Verbindung A, die wegen ihrer Eigenschaft der Substrataggregation nicht genau gemessen werden konnte.
Zusätzlich wurde für die Verbindung B die antivirale Aktivität, gemessen durch die Prüfung der Standardreinfektion, bestimmt. Der IC&sub5;&sub0;-Wert für die Verbindung B betrug in dieser Prüfung 10 bis 30 umol. Dies bestätigt, daß die Prüfung der Magic-Zelle für das Vorauswählen potentieller Integrasehemmer mit guter antiviraler Aktivität geeignet ist.
Ein anderer Test bezüglich Zellwirkungen durch die Verbindungen war die Bestimmung der Ausbeute der Zellen in der Schale nach der Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Teststoffen. Dabei wird das tatsächliche Abtöten der Zellen durch die Arzneistoffe bestimmt. Man erwartet, daß die IC&sub5;&sub0;-Werte in diesem Test viel höher liegen. Die Ergebnisse zeigen, daß die beste Anti-HIV- Verbindung B bei Konzentrationen, bei denen antivirale Wirkungen beobachtet wurden, auf die Ausbeute der Magic-Zelle in der Schale keine Wirkung hatte.
Der empfindlichste Test benutzte Messungen der Wachstumsgeschwindigkeiten der Zellen in Gegenwart der Testverbindung. Obwohl die angewandte Antiviralprüfung eine Prüfung war, die frühe Zeiten des viralen Lebenszyklus erfaßte, wurde dieser Test 15 Tage lang durchgeführt, wobei während dieser Zeit an jedem Tag ein Zählen der Anzahl der Zellen in den Kulturen erfolgte. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß bis zu zwei Wochen lang die Konzentration der Verbindung B, welche 50% der viralen Integrationsvorgänge hemmte, keine Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellinie hatte. Jedoch hatten höhere Konzentrationen einen Einfluß auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel I

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon, worin

R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylresten besteht, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen den Rest -(CH&sub2;)m- bedeuten, worin m eine Zahl von 2 bis 4 darstellt,

R&sub3; ein H oder einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylrest bedeutet und

X einen gesättigten oder ungesättigten C&sub2;-Alkylrest mit bis zu einer Doppelbindung darstellt,

zur Herstellung eines Medikaments für das Hemmen von retroviraler Integrase in einem Subjekt, das einer derartigen Behandlung bedarf.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils H bedeuten.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin R&sub1; und R&sub2; zusammen den Rest -CH&sub2;-CH&sub2;- und R&sub3; ein H bedeuten.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin X den Rest -(CH&sub2;)n- bedeutet, in dem n die Zahl 2 darstellt und der unsubstituiert oder ein- bis zweifach durch einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylrest substituiert ist und gesättigt oder ungesättigt ist sowie bis zu einer Doppelbindung enthält.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten -CH&sub2;-CH&sub2;-, -CH=CH- und irgendeinem der vorgenannten Reste, die durch einen oder zwei lineare oder verzweigte C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylreste substituiert sind, besteht.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

(A) 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen,

(B) 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen

und pharmazeutisch annehmbaren Salzen hiervon besteht.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung der Formel I 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethan oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung der Formel I 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Subjekt ein Säugetier ist.

10. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Subjekt ein Vogel ist.

21. Verwendung einer Verbindung der Formel I

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon, worin

R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylresten besteht, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen den Rest -(CH&sub2;)m- bedeuten, worin m eine Zahl von 2 bis 4 darstellt,

für die Herstellung eines Medikaments zum Bekämpfen einer retroviralen Infektion in einem Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils ein H bedeuten.

13. Verwendung nach Anspruch 11, worin R&sub1; und R&sub2; zusammen den Rest -CH&sub2;-CH&sub2;- und R&sub3; ein H bedeuten.

14. Verwendung nach Anspruch 11, worin X unsubstituiert oder ein- bis zweifach durch einen linearen oder verzweigten C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylrest substituiert ist.

15. Verwendung nach Anspruch 11, worin die genannte Verbindung aus

(A) 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen,

(B) 1,2-Bis(5-isopropylamidino-2-benzimidazolyl)ethen

und pharmazeutisch annehmbaren Salzen hiervon ausgewählt ist.

16. Verwendung nach Anspruch 11, worin die genannte Verbindung der Formel I 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethan oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.

17. Verwendung nach Anspruch 11, worin die genannte Verbindung der Formel I 1,2-Bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)ethen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.

18. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Subjekt ein Säugetier ist.

19. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Subjekt ein Vogel ist.