DE69433523T2

DE69433523T2 - Makromolekulare Mikropartikel und Verfahren zur ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE69433523T2
Application number: DE69433523T
Authority: DE
Inventors: James E. Woiszwillo
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 1993-03-09
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2014-03-05
Also published as: ATE258685T1; EP0809110A1; DK0809110T3; PT809110E; CA2157793C; JPH08507806A; DE69408527D1; ES2215207T3; ATE163230T1; EP0688429A1; EP0688429B1; AU6358594A; JP2004323528A; JP2007297633A; WO1994020856A1; EP0809110B1; CA2157793A1; JP2007212464A; JP2006023297A; ES2113094T3

Description

Das vorliegende Verfahren betrifft das Gebiet der Biochemie, und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zur Verwendung in der Diagnostik, Therapeutik und Forschung.
Hintergrund der Erfindung
Mikropartikel, Mikrosphären und Mikrokapseln, die hier zusammen als "Mikropartikel" bezeichnet werden, sind feste Partikel mit einem Durchmesser von weniger als einem Millimeter, besonders bevorzugt weniger als 1 × 10^–4 m (100 Mikrometer), die aus verschiedenen Materialien gebildet werden können, einschließlich synthetischen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden. Mikropartikel sind bei vielen verschiedenen Anwendungen eingesetzt worden, primär bei Trennungen, Diagnosen und der Arzneimittelzuführung.
Die am besten bekannten Beispiele für Mikropartikel, die in der Trennungstechnik verwendet werden, sind solche, die aus Polymeren von entweder synthetischer oder Protein-Herkunft gebildet werden, wie beispielsweise Polyacrylamid, Hydroxylapatit oder Agarose, die verwendet werden, um Moleküle wie beispielsweise Proteine auf Basis ihres Molekulargewichts und/oder ihrer Ionenladung, oder durch Wechselwirkung mit Molekülen, die chemisch an die Mikropartikel gebunden sind, zu trennen.
Auf dem Gebiet der Diagnostik werden Mikropartikel häufig in Form eines Mikropartikels verwendet, das zur Immobilisierung eines Enzyms, Substrates für ein Enzym oder eines markierten Antikörpers dient, das/der dann mit einem zu detektierenden Molekül, entweder direkt oder indirekt, in Wechselwirkung gebracht wird.
Die GB 2,079,937 offenbart beispielsweise Mikrokapseln zur Verwendung bei immunologischen Tests, insbesondere Agglutinations-Reaktionen, die ein Antigen oder einen Antikörper umfassen, das/der mittels eines Vernetzungsmittels Mittels an funktionelle Gruppen auf einer Oberflächenwand der Mikrokapseln gebunden ist. Die EP 0106495 offenbart ein Reagenz zur Bestimmung eines Antivirus-Antikörpers, das Trägerpartikel umfaßt, die mit einem viralen Antigen sensibilisiert wurden. Die EP 0,414,223 offenbart ein Verfahren zur Messung eines immunologisch wirksamen Materials, bei dem dehydratisierte feste feine Partikel, wie beispielsweise Mikroorganismen, verwendet werden, die einen Antikörper aufweisen, der daran kovalent gebunden ist.
Auf dem Gebiet der kontrollierten Arzneimittelzufuhr werden Mikropartikel in Mischung mit Molekülen gebildet, die zur späteren Abgabe in die Mikropartikel eingeschlossen werden sollen. Eine Anzahl verschiedener Techniken, einschließlich Phasenseparation, Lösungsmittelverdampfung, Emulgierung und Sprühtrocknung, werden routinemäßig eingesetzt, um diese Mikropartikel aus synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden herzustellen.
Die GB 2,002,319 offenbart beispielsweise ein Verfahren zur Dehydratisierung einer kolloidalen Dispersion von Liposomen in einem wäßrigen flüssigen Medium, welches das Mischen der Liposomendispersion mit einer hydrophilen Verbindung und anschließendes Lyophilisieren der erhaltenen Mischung zur Bildung eines stabilen liposomenhaltigen Pulvers umfaßt. Die Liposomen können verwendet werden, um biologische wirksame Substanzen einzuschließen.
Mikropartikel können auch als Nebenprodukt der Trennungstechnik geschaffen werden, beispielsweise bei einigen Präzipitationsverfahren, wie der Präzipitation mit Ammoniumsulfat. In diesen Fällen wird das Präzipitat jedoch gesammelt und durch Zentrifugation und/oder Filtration kompaktiert, anschließend in einem Lösungsmittel rückgelöst, um das präzipitierende Mittel, das Salz, von dem mit dem Salz präzipitierten Molekül abzutrennen. Die Mikropartikel sind entsprechend instabil und fungieren ausschließlich als ein Zwischenprodukt, nicht als Endprodukt als solches.
Kugelförmige Perlen oder Partikel sind als Werkzeug für Biochemiker seit vielen Jahren kommerziell verfügbar. Beispielsweise werden Antikörper häufig an Perlen gebunden, um vergleichsweise große Partikel zu bilden, die spezifisch für bestimmte Liganden sind. Die großen antikörperbeschichteten Partikel werden routinemäßig eingesetzt, um Rezeptoren auf der Oberfläche einer Zelle zur Zellaktivierung zu vernetzen, werden zur Immunaffinitätsreinigung an eine feste Phase gebunden oder werden verwendet, um ein therapeutisches Mittel, das langsam über die Zeit an einen entfernten Ort abgegeben wird, zuzuführen, wobei gewebe- oder tumorspezifische Antikörper, die an die Partikel gebunden sind, verwendet werden, um das Mittel zielgerichtet an den gewünschten Ort zu befördern.
Das häufigste Verfahren, um Antikörper kovalent an eine Festphasenmatrix zu binden, besteht darin, eine Perle mit einem chemisch konjugierenden Mittel zu aktivieren und anschließend den Antikörper an die aktivierte Perle zu binden. Die Verwendung einer synthetischen Polymerperle statt eines Proteinmoleküls gestattet den Einsatz viel schärferer Aktivierungsbedingungen als viele Proteine vertragen können, ist relativ kostengünstig und erzielt eine Verknüpfung, die gegenüber einem weiten Bereich von Denaturierungsbedingungen stabil ist. Eine Reihe aktivierter Perlen ist kommerziell erhältlich, alle mit verschiedenen Bestandteilen und Größen. Aus synthetischen Polymeren wie Polyacrylamid, Polyacrylat, Polystyrol oder Latex gebildete Perlen sind von vielen Bezugsquellen kommerziell erhältlich, beispielsweise von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, und LKB Produkter, Stockholm, Schweden. Aus natürlichen Makromolekülen und Partikeln wie Agarose, vernetzter Agarose, Globulin, Desoxyribonukleinsäure und Liposomen gebildete Perlen sind kommerziell erhältlich von Bezugsquellen wie Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, Pharmacia, Piscataway, NY. und IBF (Frankreich). Aus Copolymeren von Polyacrylamid und Agarose gebildete Perlen sind von Bezugsquellen wie IBF und Pharmacia kommerziell erhältlich. Magnetische Perlen sind von Bezugsquellen wie Dynal Inc., Great Neck, NY, kommerziell erhältlich.
Wie die große Vielfalt von Materialien und Anwendungen zeigt, besteht ein anhaltender Bedarf für die Entwicklung neuer verfahren zur Herstellung und Verwendung von Mikropartikeln, insbesondere solcher, die für die Verwendung auf dem Gebiet der Trennung, Diagnostik und Arzneimittelzuführung, anstatt für nur eine Anwendung, angepaßt werden können.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, stabile Mikropartikel sowie ein Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel, das vergleichsweise einfach, schnell und kostengünstig ist, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mikropartikel bereitzustellen, die eine hohe Affinität und Spezifität für ein Zielmolekül aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mikropartikel bereitzustellen, die nicht absorbiert werden, wenn sie in vivo verabreicht werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mikropartikel zur Verwendung bei der Trennungstechnik, insbesondere der Affinitätschromatographie, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mikropartikel zur Verwendungen bei medizinischen und diagnostischen Anwendungen, wie der zielgerichteten Arzneimittelzufuhr und der histopathologischen oder In-vivo-Gewebe- oder Tumorbildgebung, bereitzustellen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Mikropartikel, Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zu deren Verwendung werden bereitgestellt auf der Basis von Verfahren zum "Dehydratisieren" von Makromolekülen wie Proteinen, Kohlenhydraten, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Viren, Viruspartikeln, organischen oder anorganischen synthetischen pharmazeutischen Arzneimitteln, oder jeglicher Mischung davon; und Bilden der Makromolekül-Mikropartikel durch Inkubation in Gegenwart von Hitze oder "Vernetzen" der Makromoleküle in der wäßrigen Phase. Die Makromoleküle werden unter Verwendung eines Mittels dehydratisiert, das alle Makromoleküle mit Ausnahme von "Taschen" von Makromolekülen, die in einer wäßrigen Phase gelöst oder suspendiert bleiben, wirksam dehydratisiert, zum Beispiel durch Dehydratisierung mit hohen Konzentrationen von linearen oder verzweigten Polymeren. Die Makromoleküle können aus Arzneimitteln, biologisch wirksamen Molekülen, Trägermolekülen, Affinitätsmolekülen oder Mischungen davon bestehen.
Die Mikropartikel werden durch Inkubation der dehydratisierten Makromoleküle bei einer Temperatur über Raumtemperatur für eine vorbestimmte Zeitspanne gebildet. Alternativ werden die Makromoleküle zur Bildung von Mikropartikeln, bei verschiedenen Temperaturen, unter Verwendung eines vernetzenden Mittels wie beispielsweise Glutaraldehyd oder anderer Mittel wie Aminen, multivalenter Ionen und multifunktionaler Moleküle, die eine "Affinität" für bestimmte reaktive Gruppen auf dem vernetzten Makromolekül aufweisen, vernetzt.
Die Mikropartikel werden dann von dem dehydratisierenden Mittel und dem überschüssigen Vernetzungsmittel, sofern vorhanden, durch Trennverfahren wie Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Die Mikropartikel können dann mit einem Quenching-Mittel gewaschen werden, das an jede nicht umgesetzte Bindungsstelle auf dem Vernetzungsmittel bindet, um jede nachfolgende unspezifische Bindung der Mikropartikel bei Reaktion mit einem Zielmolekül zu vermindern.
Die Mikropartikel sind geeignet für eine Vielfalt von Trennungs-, diagnostischen, therapeutischen und Forschungszwecken.
Unten werden spezifische Beispiele beschrieben, bei denen die Mikropartikel gebildet werden aus (1) Proteinen wie beispielsweise Antikörpern, die mit einer hohen Konzentrationen einer Mischung linearer Polymere dehydratisiert wurden, enthaltend Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol, die dann mit Glutaraldehyd vernetzt wurden; (2) Polysacchariden wie beispielsweise Alginat, gemischt mit biologisch wirksamen Molekülen, die mit einer hohen Konzentration einer Mischung linearer Polymere, enthaltend Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol, dehydratisiert und dann mit multivalenten Ionen wie Polyaminosäuren oder divalenten Kationen vernetzt wurden; (3) Peptidhormone wie beispielsweise Insulin, die im Anschluß an die Dehydratisierung mit einer Mischung aus Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol mit Glutaraldehyd vernetzt wurden; und (4) Proteinen wie beispielsweise Albumin, die mit einer Mischung linearer Polymere, enthaltend Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol dehydratisiert und in Gegenwart von Hitze inkubiert wurden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Grafik, die die Zählereignisse pro Minute ("Counts") von gebundenem radioaktiven carcinoembryonalen Antigen gegen Anti-Carcinoembryonales-Antigen-Mikropartikel zeigt.
2 ist eine Grafik, die den Antikörpertiter gegen die Wochen nach Immunisierung mit ersten und zweiten Dosen von Tetanustoxoid-Partikeln zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Bindung
Es werden Mikropartikel, Verfahren zu deren Herstellung sowie Kits für die diagnostische, therapeutische und Verwendung in der Forschung bereitgestellt. Die Mikropartikel sind vernetzte makromolekulare Strukturen, die eine große Oberfläche aufweisen. Die die Mikropartikel bildenden Makromoleküle schließen Proteine, Kohlenhydrate, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Viren, Viruspartikel, organische oder anorganische synthetische pharmazeutische Arzneimittel oder Mischungen davon ein, die in einer flüssigen Phase unter Dehydrierungsbedingungen vernetzt werden können, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Bildung von Polymer-Mikropartikeln
Das Mikropartikel wird durch Inkubieren von Makromolekülen in Lösung oder in flüssiger Phase in Gegenwart eines dehydratisierenden Mittels und Hitze oder eines Vernetzungsmittels für eine zur Bildung von Partikeln ausreichende Zeitspanne gebildet. Das Makromolekül wird zunächst in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst, dann wird entweder die Makromoleküllösung zu dem dehydratisierenden Mittel hinzu gefügt oder das dehydratisierende Mittel wird zu der Makromoleküllösung hinzugefügt, wobei letzteres bevorzugt ist. Die Lösung dehydratisierter Makromoleküle wird dann zur Bildung von Mikropartikeln vorzugsweise für eine vorbestimmte Zeitspanne erhitzt. Alternativ wird zur Mikropartikelbildung bei verschiedenen Temperaturen oberhalb, unterhalb oder bei Raumtemperatur ein quervernetzendes Mittel zu der Lösung dehydratisierter Makromoleküle hinzugegeben. Die erhaltenen Mikropartikel werden dann von den in der Inkubationsmischung vorhandenen nicht umgesetzten Bestandteilen durch physikalische Trennverfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, abgetrennt.
Makromolekül
Das Makromolekül, das das Mikropartikel bildet, ist jedes Molekül, das in der Lage ist, in wäßriger Phase vernetzt zu werden. Besonders bevorzugt ist das Makromolekül ein Biomolekül wie beispielsweise ein Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel, oder eine Mischung davon. Das Makromolekül kann auch eine natürliche oder synthetische pharmazeutische Verbindung sein, die in der Lage ist, vernetzt zu werden. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß eine Verbindung, die nicht in der Lage ist, vernetzt zu werden, durch Aufnehmen der Verbindung in ein Trägermolekül, das dann gemäß den hier bereitgestellten Verfahren vernetzt wird, zu einem Mikropartikel geformt werden kann. Dem Fachmann ist ebenfalls ersichtlich, daß das Makromolekül auch ein Teil eines Moleküls sein kann, das die erforderliche Aktivität aufweist, um an einen Liganden wie beispielsweise ein Peptid, ein einzelsträngiges Segment eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls oder ein Viruspartikel zu binden oder damit zu interagieren. Es ist dem Fachmann ebenso ersichtlich, daß der Begriff "Makromolekül" mehrere Makromoleküle einschließt sowie Kombinationen verschiedener Makromoleküle, wie eine Kombination einer pharmazeutischen Verbindung und eines Affinitätsmoleküls zur zielgerichteten Zuführung der pharmazeutischen Verbindung an ein behandlungsbedürftiges Gewebe, Organ oder einen behandlungsbedürftigen Tumor einschließt.
Dem Fachmann ist weiterhin ersichtlich, daß ein Affinitäts-Makromolekül entweder der Rezeptoranteil oder der Ligandenanteil einer Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung sein kann. Beispiele für Liganden, die mit anderen Biomolekülen wechselwirken, beinhalten Viren, Bakterien, Polysaccharide oder Toxine, die als Antigene zur Erzeugung einer Immunantwort bei Verabreichung an ein Tier fungieren und die Bildung von Antikörpern verursachen.
Die Konzentration des Makromoleküls in der Inkubationsmischung liegt, abhängig von den Inkubationsbedingungen, vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 mg/ml.
Markierte Makromoleküle
Das Makromolekül kann mit einem nachweisbaren Marker markiert werden. Die verschiedenen Arten von Markern und Verfahren zur Markierung von Proteinen und Nukleinsäurenmolekülen sind dem Fachmann wohlbekannt. Es dem Fachmann ersichtlich, daß eine magnetische Substanz, wie beispielsweise ein Metall, von der Definition des Begriffs Marker umfaßt ist. Beispielsweise kann das Makromolekül mit einer metallischen Substanz, wie beispielsweise einem Metall, markiert werden, so daß die Mikropartikel von anderen Substanzen in einer Lösung mit Hilfe einer magnetischen Vorrichtung abgetrennt werden können.
Verschiedene andere spezifische Marker oder Reportergruppen werden unten aufgeführt.
Zum Beispiel kann die Markierung eine Radiomarkierung, wie beispielsweise ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I oder ¹³¹I sein, ist aber nicht auf diese beschränkt. Eine ³²P-Markierung kann mit einem konjugierenden Reagenz an ein Protein gebunden sein oder in eine Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls durch Nick-Translation, Endmarkierung oder Aufnahme eines markierten Nukleotids aufgenommen werden. Eine ³H-, ¹⁴C- oder ³⁵S-Markierung kann beispielsweise durch Aufnahme eines markierten Vorläufers oder durch chemische Modifikation in eine Nukleotidsequenz aufgenommen werden, wohingegen eine ¹²⁵I oder ¹³¹I-Markierung im allgemeinen durch chemische Modifikation in eine Nukleotidsequenz aufgenommen wird. Die Feststellung einer Markierung kann durch Verfahren wie Szintillationszählung, Gammastrahlenspektrometrie oder Autoradiographie erfolgen.
Die Markierung kann auch eine Massen- oder Kernmagnet-Resonanz(NMR)-Markierung wie zum Beispiel ¹³C, ¹⁵N oder ¹⁹O sein. Die Detektion solcher Markierungen kann durch Massenspektrometrie oder NMR vorgenommen werden.
Farbstoffe, chemilumineszierende Mittel und Fluorogene können auch zur Markierung des Makromoleküls verwendet werden. Beispiele für Farbstoffe, die zur Markierung von Nukleinsäuren geeignet sind, schließen Ethidiumbromid, Aktidine, Propidium und andere interkalierende Färbemittel und 4',6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder andere geschützte Nukleinsäurefärbemittel ein. Beispiele für Fluorogene beinhalten Fluoreszein und Derivate, Phycoerythrin, Allo-Phycocyanin, Texas- Rot oder andere geschützte Fluorogene. Die Fluorogene werden im allgemeinen durch chemische Modifikation gebunden. Die Farbstoffmarkierungen können durch ein Spektralphotometer detektiert werden und die Fluorogene können durch einen Fluoreszenzdetektor detektiert werden.
Das Makromolekül kann alternativ mit einem Chromogen (Enzymsubstrat) markiert werden, um eine Enzym- oder Affinitätsmarkierung, oder ein Enzym bereitzustellen. Zum Beispiel kann das Makromolekül biotinyliert werden, so daß es in einer Biotin-Avidin-Reaktion verwendet werden kann, die ebenfalls an eine Markierung wie beispielsweise ein Enzym oder Fluorogen gekoppelt werden kann. Das Makromolekül kann mit Peroxidase, alkalische Phosphatase oder anderen Enzymen markiert sein, die eine chromogene oder fluorogene Reaktion auf Zugabe von Substrat ergeben. Zum Beispiel können Zusätze wie 5-Amino-2,3,-Dihydro-1,4-phthalazindion (auch bekannt als Luminol^TM) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) und Geschwindigkeitsbeschleuniger wie beispielsweise p-Hydroxybiphenyl (auch bekannt als p-Phenylphenol) (Sigma Chemical Co., St., MO), verwendet werden, um Enzyme wie beispielsweise die Meerrettich-Peroxidase durch eine Fluoreszenzreaktion zu amplifizieren; und luminogene oder fluorogene Dioxetan-Derivate von Enzymsubstraten können ebenfalls verwendet werden.
Erkennungsstellen für Enzyme, beispielsweise Schnittstellen von Restriktionsenzymen auf Nukleinsäuremolekülen, können ebenfalls zur Bereitstellung einer feststellbaren Markierung in ein Makromolekül aufgenommen werden. Eine Markierung kann auch hergestellt werden durch Aufnehmen einer modifizierten Base, Aminosäure, oder eines Vorläufers, der irgendeine Markierung enthält, Aufnahme einer modifizierten Base oder Aminosäure enthaltend eine che mische Gruppe, die durch spezifische Antikörper erkennbar ist, oder durch Feststellen eines gebundenen Antikörperkomplexes durch verschiedene Mittel, einschließlich Immunfluoreszenz- oder immun-enzymatischer Reaktionen. Solche Markierungen können unter Verwendung von enzymgekoppelten Immunassays (ELISA) oder durch Detektion einer Farbänderung mit Hilfe eines Spektralphotometers festgestellt werden.
Dehydratisierungsmittel
Das Dehydratisierungsmittel ist eine chemische Verbindung oder Mischung von Verbindungen, die in der Lage ist, Wasser von dem Makromolekül zu einem stark ionischen Medium abzuziehen. Geeignete Dehydratisierungsmittel beinhalten wasserlösliche nicht-ionisierbare lineare oder verzweigte Polymere von hohem Molekulargewicht.
Bevorzugt ist das Dehydratisierungsmittel eine Mischung aus zwei oder mehr löslichen, linearen Polymeren wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol. Solch eine Polymermischung kann nach bekannten Methoden hergestellt werden. Es für den Fachmann ersichtlich, daß andere lösliche, lineare Polymere, wie beispielsweise Dextran, Nonylphenolethoxylate, Polyvinylalkohol und Mischungen davon zusätzlich zu PVP und PEG oder anstatt entweder BVG oder PEG verwendet werden könnten.
PVP ist ein nichtionogenes, hydrophiles Polymer mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 10.000 bis 700.000 und der chemischen Formel (C₆H₉NO)_n. PVP ist auch als Poly[1-(2-Oxo-1-pyrrolidinyl)ethylen], Povidon^TM, Polyvidon^TM, RP 143^TM, Kollidon^TM, Peregal ST^TM, Periston^TM, Plasdone^TM, Plasmosan^TM, Protagent^TM, Subtosan und Vinisil^TM bekannt. PVP ist nicht toxisch, stark hygroskopisch und löst sich leicht in Wasser oder organischen Lösungsmitteln.
Polyethylenglykol (PEG), auch bekannt als Poly(oxyethylen)glykol, ist ein Kondensationspolymer aus Ethylenoxid und Wasser mit der allgemeinen chemischen Formel OH (CH₂CH₂O)_nH.
Dextran ist ein Begriff, der auf Polysaccharide angewendet wird, die von Bakterien gebildet werden, die auf einem Saccharosesubstrat wachsen. von Bakterien wie beispielsweise Leuconostoc mesenteroides und Lactobacteria dextranicum gebildete native Dextrane haben üblicherweise ein hohes Molekulargewicht.
Nonylphenolethoxylate (NPEs) stellen eine Klasse von langkettigen Verbindungen dar, die häufig als oberflächenaktive Mittel verwendet werden. Sie sind üblicherweise derivatisiert, um den gewünschten Löslichkeitserfordernissen zu entsprechen.
Polyvinylalkohol (PVA) ist ein Polymer, das aus Polyvinylacetaten durch Ersetzung der Acetatgruppe mit Hydroxylgruppen hergestellt wird und die Formel (CH₂CHOH)_n aufweist. Die meisten Polyvinylalkohole sind in Wasser löslich.
PEG, Dextran, PVA und PVP sind kommerziell von Chemielieferanten wie beispielsweise Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhältlich. NPEs erfordern eine Synthese auf Anforderung und können von speziellen Chemikalienherstellern bezogen werden.
Am meisten bevorzugt ist das Dehydratisierungsmittel eine Polymermischung, die eine wäßrige Lösung von PVP mit einem Molekulargewicht zwischen 10.000 und 360.000, am meisten bevorzugt 40.000, und PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 35.000 enthält. Bevorzugt VP weist PVP ein Molekulargewicht von 40.000 und PEG ein Molekulargewicht von 3500 auf. Alternativ wird PVP mit einem Molekulargewicht von 360.000 bevorzugt, um Mikropartikel mit einer einheitlichen Größe zu erhalten. Vorzugsweise ist das PVP in einem Acetatpuffer gelöst und PEG wird zu der wäßrigen PVP-Lösung hinzugegeben. Die Konzentration jedes Polymers liegt, abhängig vom Molekulargewicht jedes Polymers, vorzugsweise zwischen 1 und 40 g/100 ml. Am meisten bevorzugt beträgt die Konzentration jedes Polymers 24 g/100 ml oder 24%. Gleiche Konzentrationen von PVP und PEG liefern in der Regel die geeignetste Polymermatrix für die Bildung eines Polymer-Mikropartikels. Das Volumen von zu dem Makromolekül hinzugefügten Polymer variiert in Abhängigkeit von der Größe und Menge des Makromoleküls. Vorzugsweise werden drei Volumen der Polymermischung zu einem Volumen einer Lösung mit dem Makromolekül hinzugefügt.
Inkubationsbedingungen unter Verwendung von Hitze
Mikropartikel werden durch Inkubieren des Makromoleküls und der Dehydratisierungsmittel-Mischung für eine vorbestimmte Zeitdauer bei einer Temperatur über Raumtemperatur gebildet. Vorzugsweise wird die Mischung für eine Zeit zwischen ungefähr fünf Minuten und zwei Stunden bei einer Temperatur von größer oder gleich 37°C und weniger als oder gleich 80°C in einem Wasserbad inkubiert. Am meisten bevorzugt wird die Mischung für 15–30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 50°C und 70°C inkubiert.
Die Mikropartikelgröße kann durch Anpassung der Inkubationsbedingungen kontrolliert werden. zum Beispiel kann die Inkubationstemperatur allmählich oder schrittweise von Raumtemperatur auf die gewünschte erhöhte Inkubationstemperatur angehoben werden oder die Gesamtinkubationszeit kann erhöht werden. Darüber hinaus kann der Umfang der Mikropartikel-Aggregation durch Variieren der Konzentration, des Volumens oder der Zusammensetzung des Dehydratisierungsmittels kontrolliert werden.
Vernetzungsmittel
Mikropartikel werden alternativ durch Zufügen eines Vernetzungsmittels zur Vernetzung der dehydratisierten Makromoleküle gebildet. Das Vernetzungsmittel ist ein bi- oder multifunktionales chemisches Reagenz, daß die Makromoleküle und, in einigen Fällen, das dehydratisierende Mittel körperlich verbindet. Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel beinhalten Dialdehyde oder andere Mittel wie beispielsweise Amine, multivalente Ionen und multifunktionale Moleküle, die eine "Affinität" für bestimmte reaktive Gruppen auf dem vernetzten Makromolekül aufweisen.
In der bevorzugten Ausführungsform verbindet das Vernetzungsmittel die Makromoleküle kovalent zu einer stabilen dreidimensionalen Struktur. Am meisten bevorzugt ist das vernetzungsmittel ein bifunktionales Reagenz wie beispielsweise Glutaraldehyd; p,p'-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon; Hexamethylendiisocyanat; n,n'-(1,3-Phenylen)-bis-maleimid; n,n'-Ethylen-bis-iodacetamid; 3,6-bis-(Mercurimethyl)dioxan; bis-Diazobenzidin; Woodward's K; bis-Oxirane; Dimethyladipimidat; Dimethylsuberimidat; Diethylmalonimidat; Phenol-2,4-disulfonylchlorid; Divinylsulfon; und Carbodiimide.
Am meisten bevorzugt ist das Vernetzungsmittel ein Dialdehyd wie beispielsweise Glutaraldehyd, das mit primären Aminen eine Schiffsche Base bildet, die durch Reduktion mit Borhydrid unter milden Bedingungen stabile sekundäre Amine ergeben.
Ein Beispiel für einen anderen Typ von Vernetzungsmittel sind die N-substituierten Maleimide, die unter milden Bedingungen spezifisch für Sulfhydrilgruppen sind. Verschiedene N-Aryl- und N-Alkyl-bis-maleimide sind kommerziell erhältlich, einschließlich Azophenyldimaleimid. Diese sind in Wasser unlöslich und werden im allgemeinen in stöchiometrischen Mengen als Feststoff zu einer wäßrigen Lösung der Reaktanden bei pH 7 bis 8 hinzugefügt.
Bifunktionale Alkylhalide reagieren primären mit Thiol-, Imidazol- und Aminogruppen. Bei neutralem oder leicht alkalischem pH läuft bevorzugt die Reaktion mit Sulfhydrilgruppen ab, während bei höheren pH-Werten die Reaktion mit Aminogruppen bevorzugt abläuft. Andere Verbindungen beinhalten Alkylhalide wie beispielsweise 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol, die in Wasser unlöslich sind und bevorzugt mit Aminogruppen und phenolischen Tyrosingruppen reagieren, die aber auch mit Sulfhydril- und Imidazolgruppen reagieren. Für eine schnelle Reaktion sind vergleichsweise hohe pH-Werte erforderlich. Das Reagenz wird im allgemeinen als eine konzentrierte Aceton-Lösung zu einer wäßrigen Lösung der Reaktanden hinzugefügt und Produktbildung. Isocyanate reagieren mit Aminen und bilden substituierte Harnstoffe, mit Alkoholen und bilden Urethane, und mit Wasser und bilden Amine und Kohlendioxid. Bei alkalischem pH läuft die Reaktion mit Aminen bevorzugt ab. 2,2-Dicarboxy-4,4'-azophenyldiisocyanat ist wasserlöslich und weist den Vorteil auf, daß die Verbindung, die es bildet, rasch durch Reduktion der Azogruppe mittels Dithionit gespalten werden kann. Acylierende Mittel können ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise viele der aliphatischen oder aromatischen Dicarbon- oder Disulfonsäuren, die aktiviert werden, um bifunktionale acylierende Mittel zu bilden, die in der Lage sind, unter milden Bedingungen zu reagieren. Die Nitrophenylester von Dicarbonsäuren und die aromatischen bis-Sulfonylchloride sind Beispiele dafür. Diese sind in Wasser unlöslich und hydrolysieren rasch. Die bis-Sulfonylchloride reagieren mit Aminogruppen zur Bildung stabiler Sulfonamid-Bindungen, die anschließend mit HBr in Eisessig gespalten werden können. Bifunktionale Imidoester, die in Wasser löslich sind und mit Aminogruppen unter milden Bedingungen und mit hohem Grad an Spezifität reagieren, können ebenfalls verwendet werden. Dimethylsuberimidat kann in einem 0,2 M Triethanolamin-HCl-Puffer, pH 8,5, für drei Stunden bei Raumtemperatur verwendet werden. Das erhaltene Amid ist gegenüber Säurehydrolyse stabil, kann aber mit Ammonium gespalten werden. Vinylsulfone, die primär mit Aminogruppen reagieren, bei hohen pHs aber mit Kohlenhydraten, Phenol und Alkoholen reagieren, können verwendet werden.
Die Konzentration des Vernetzungsmittels in der Inkubationsmischung sollte ausreichen, alle aktiven Gruppen der Makromoleküle zu binden. Es gibt eine direkte Beziehung zwischen der Konzentration des Vernetzungsmittels und der Zahl der nach der Inkubation gebildeten Mikropartikel. Generell werden mehr Mikropartikel gebildet, wenn die Konzentration von Vernetzungsmittel in der Inkubationsmischung erhöht wird. Bevorzugt liegt die Konzentration des Vernetzungsmittel in der Inkubationsmischung zwischen ungefähr 5 und 200 Mikrolitern einer 25% Glutaraldehyd-Lösung pro Milliliter Inkubationsmischung.
Inkubationsbedingungen für die Vernetzung
Bevorzugt ist das Dehydratisierungsmittel eine Polymerlösung, wobei das Makromolekül, Polymer und die Vernetzungsmittelmischung, beispielsweise durch Verwirbeln ("Vortexing"), kräftig vermischt werden, um eine ausreichende Wechselwirkung zwischen den Makromolekülen, Polymeren und dem Vernetzungsmittel zu ermöglichen, und bei Raumtemperatur (20°C) oder bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur für eine ausreichende Zeitspanne unter Mischen inkubiert werden, um die maximale Bildung von Mikropartikeln zu ermöglichen. Alternativ können die Mikropartikel unter Verwendung einer Kombination von vernetzungsmittel und Hitze gebildet werden, vorzugsweise durch Inkubation bei einer Temperatur größer als oder gleich 37°C und weniger als oder gleich 80°C.
Die Dauer der Inkubationszeit hängt von den entsprechenden Konzentrationen des Polymers und Affinitätsmoleküls und der Inkubationstemperatur ab. Vorzugsweise werden die Polymermischung und die Makromoleküle zwischen 30 Minuten und 24 Stunden inkubiert.
Am meisten bevorzugt werden die Polymermischung und die Makromoleküle durch Rühren oder Schütteln für 120 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann bei 4°C über Nacht ohne Schütteln stehengelassen.
Der pH der Inkubationsmischung wird im allgemeinen durch den pH des Dehydratisierungsmittel bestimmt und kann durch zufügen einer geeigneten Menge eines sauren oder basischen Puffers entweder zur Dehydratisierungsmittel- oder Makromoleküllösung, oder zu beidem, eingestellt werden, be vor sie gemischt werden. Wenn das die Dehydratisierungsmittel eine Lösung linearer Polymere ist, besteht eine direkte Beziehung zwischen der Größe der am Ende des Inkubationsschrittes gebildeten Mikropartikel und dem pH der Inkubationsmischung. Bei einem höheren (mehr basischen) pH werden größere Mikropartikel gebildet. Bei einem niedrigeren pH sind die gebildeten Mikropartikel kleiner. Der pH der Inkubationsmischung linearer Polymere liegt vorzugsweise zwischen etwa 5 und 8.
Quenching der Bindungsstellen
Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß nach der Inkubation ein Quenching-Mittel zu den erhaltenen Mikropartikeln hinzugefügt werden kann, um nicht umgesetzte Bindungsstellen des Vernetzungsmittels zu blockieren, um eine anschließende unspezifische Bindung zu vermindern. Für den Fall, daß das Dehydratisierungsmittel eine Lösung linearer Polymere wie beispielsweise PVP/PEG ist, sind geeignete Quenching-Mittel Verbindungen wie beispielsweise Aminosäuren oder Albumin, die wesentliche Anzahlen von Aminogruppen enthalten. Vorzugsweise ist das Abschreckungsmittel eine Lösung, die Lysin oder Glycin enthält. Am meisten bevorzugt ist das Abschreckungsmittel die Aminosäure Glycin in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,5 M.
Aufreinigung der Mikropartikel
Die gebildeten Mikropartikel werden von nicht umgesetzten Verbindungen der Inkubationsmischung durch konventionelle Trennverfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, abgetrennt. Vorzugsweise wird die Inkubationsmischung zentrifugiert, so daß die Mikropartikel auf den Boden des Zentrifugenröhrchens fallen und die nicht umgesetzten Bestandteile im überstand verbleiben, der dann dekantiert teile im überstand verbleiben, der dann dekantiert wird. Alternativ wird die Inkubationsmischung, die die gebildeten Mikropartikel enthält, filtriert, so daß die Mikropartikel auf dem Filter verbleiben und die nicht umgesetzten Bestandteile das Filter passieren.
Eine weitere Aufreinigung der Mikropartikel wird durch Waschen in einem geeigneten Volumen einer Waschlösung erreicht. Die bevorzugte Waschlösung ist ein Puffer, am meisten bevorzugt eine phosphatgepufferte Salzlösung, die das Abschreckungsmittel enthält. Wiederholte Waschungen können, falls erforderlich, durchgeführt werden.
Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß einige der Dehydratisierungsmittel in die Makromolekülstruktur aufgenommen werden können und einen Teil der molekularen Zusammensetzung jedes Mikropartikels bilden können.
Mikropartikeleigenschaften
Die durch das vorstehende Verfahren gebildeten Mikropartikel können, abhängig von der Temperatur, Polymergröße und -mischung und der Proteinkonzentration, in ihrer Gestalt kugelförmig oder nicht-kugelförmig sein, mit einem oder mehreren aktiven Stellen auf der Oberfläche jedes Mikropartikels. Die elliptische Gestalt und Granularität der Mikropartikel schafft ein Partikel, die eine größere Oberfläche aufweisen als kugelförmige Mikropartikelperlen, und erlaubt die Aufnahme einer größeren Anzahl von Makromolekülen pro Mikropartikel als dies bei konventionellen kugelförmigen Perlen erreicht werden könnte.
Darüber hinaus sind die Mikropartikel in dem Beispiel, bei dem die Mikropartikel aus Makromolekülen wie beispielsweise Immunglobulin, vernetzt mit Glutaraldehyd in Gegenwart von PVP/PEG, gebildet werden, bei alkalischem und sauren pH stabil und werden bei Verabreichung in vivo nicht absorbiert.
Die Mikropartikel sind für einen weiten Bereich von diagnostischen, therapeutischen und forscherischen Zwecken geeignet, wie dies in größerer Ausführlichkeit unten beschrieben ist. Für In-vivo-Diagnosezwecke können die Mikropartikel zum Beispiel ein Makromolekül wie beispielsweise ein Immunglobulin oder einen Zellrezeptor beinhalten, das/der mit einem feststellbaren Marker markiert ist. Die Injektion eines markierten Mikropartikels in einen Patienten schafft ein Bildgebungsmittel für die Diagnose einer proliferativen Erkrankung wie beispielsweise Krebs oder ein Werkzeug für die Beurteilung des Erfolgs eines therapeutischen Mittels bei der Reduzierung der Proliferation einer bestimmten schädlichen Zelle oder eines schädlichen Organismus. Für In-vitro-Diagnosen werden die Mikropartikel, die ein Makromolekül wie beispielsweise ein Immunglobulin, einen Zellrezeptor oder eine für die zu untersuchende Zelle oder den zu untersuchenden Organismus spezifische Oligonukleotidsonde enthalten, mit einer Testprobe zusammengebracht, die Mikropartikel werden von allen nicht gebundenen Bestandteilen der Probe abgetrennt und gebundene Moleküle werden durch konventionelle Verfahren detektiert. Die Mikropartikel sind als therapeutische Mittel geeignet, wenn die Mikropartikel ein therapeutisches Arzneimittel enthalten, und werden für die langsame Abgabe oder zielgerichtete Zuführung des Arzneimittels an die behandlungsbedürftige Stelle in einen Patienten injiziert.
Die Mikropartikel sind auch geeignet zur Reinigung von Molekülen aus einer komplexen Mischung, als Reagenz zur Bestimmung oder Quantifizierung eines spezifischen Moleküls oder für die Herstellung von Molekülen wie beispielsweise Antikörpern. Zum Beispiel können Mikropartikel, die ein Makromolekül wie beispielsweise ein Immunglobulin enthalten, an eine Chromatographiesäule gebunden werden und bei der Immunaffinitätschromatographie zur Trennung eines Liganden aus einer komplexen Mischung verwendet werden. Alternativ können Mikropartikel, die ein markiertes Makromolekül oder eine Mischung von markierten Makromolekülen enthalten, die für verschiedene Zellen oder Biomoleküle, wie beispielsweise Zellrezeptoren, spezifisch sind, verwendet werden, um unter Verwendung von Techniken wie der Durchflußzytometrie eine Änderung in der Zahl von Zellen oder Biomolekülen in Reaktion auf eine bestimmte Testbedingung festzustellen. Darüber hinaus können die Mikropartikel als Adjuvanzien zur Impfstoffherstellung verwendet werden, wobei antigenhaltige Mikropartikel in ein Versuchstier, beispielsweise eine Maus oder ein Kaninchen, injiziert werden, um eine verbesserte Immunantwort zur Herstellung von Antikörpern gegen das Antigen auszulösen.
In-vitro-Diagnostik
In-vitro-Tests
Die beschriebenen Mikropartikel sind verwendbar als Festphasenpartikel in einem Test, beispielsweise einem enzymgekoppelten Immunassay, Dot-Blot oder Western-Blot, zur Bestimmung eines bestimmten Zielobjekts wie beispielsweise einer Zelle, eines Biomoleküls oder Arzneimittels in einer biologischen Probe. Die für diesen Zweck angepaßten Mikropartikel sind aus Affinitätsmolekülen zusammengesetzt, die spezifisch für das Zielmolekül sind. Beispielsweise ist das Makromolekül ein Immunglobulin, Zellrezeptor oder eine Oli gonukleotidsonde und ist an ein Teströhrchen oder eine Mikrotiterplatte gebunden.
Zur Bestimmung oder Quantifizierung eines interessierenden Zielmoleküls wird eine Probe mit einer die Mikropartikel enthaltenden Lösung zusammengebracht, die Makromoleküle auf den Mikropartikeln werden mit den Zielmolekülen in Reaktion gebracht, die Mikropartikel werden von allen nicht gebundenen Bestandteilen der Probe abgetrennt, und die Mikropartikel, die gebundene Moleküle enthalten, werden mit Hilfe konventioneller Methoden bestimmt. Fluoreszenzmarkierte Mikropartikel sind besonders gut geeignet für die durchflußzytometrische Analyse gemäß Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Histopathologie
Die vorliegend beschriebenen Mikropartikel sind geeignet als sichtbare Sonden oder Marker einer Erkrankung in einer histologischen Probe. Die Makromoleküle der für diese Verwendung angepaßten Mikropartikel sind spezifisch für Biomoleküle, die während eines bestimmten krankhaften Zustandes exprimiert werden, und sind mit einer detektierbaren Markierung markiert. Zum Beispiel ist das Makromolekül ein Immunglobulin, Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde, die für eine anormale Zelle, beispielsweise eine rasch proliferierende Zelle oder einen pathologischen Organismus, zum Beispiel einen Virus, spezifisch ist.
Zur Feststellung eines pathogenen Zustands wird eine histologische Probe mit einer Lösung, die Mikropartikel enthält, zusammengebracht, die markierten Makromoleküle auf den Mikropartikeln werden mit dem interessierenden Zielmolekül in Reaktion gebracht und gebundene Mikropartikel wer den durch Bestimmung der Markierung nach Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, bestimmt.
In-vivo-Diagnostik – Bildgebung
In gleicher Weise wie oben in Bezug auf die Verwendung der Mikropartikel für die Histopathologie beschrieben, sind die hier beschriebenen Mikropartikel als Bildgebungsmittel für eine In-vivo-Lokalisierung eines bestimmten Moleküls, Zelltyps oder eines krankhaften Zustandes geeignet. Die Makromoleküle auf den für diese Verwendung angepaßten Mikropartikeln sind spezifisch für Moleküle, eine durch eine bestimmte Zelle oder einen pathologischen Organismus exprimiert werden, und sind mit einer detektierbaren Markierung markiert. Zum Beispiel ist das Makromolekül ein Immunglobulin, Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde, die spezifisch ist für eine Tumorzelle oder einen pathologischen Organismus, wie beispielsweise einen Virus.
Die Mikropartikel werden verwendet, um entweder einen pathologischen Zustand festzustellen oder den Erfolg einer Therapie, beispielsweise einer Chemotherapie oder Operation, zu überwachen, um sicherzustellen, daß die Größe eines anormalen Gewebetumors sich verringert hat oder vollständig entfernt wurde. Für diese Verwendung erhält ein Patient eine vorzugsweise intravenöse Verabreichung einer Mikropartikellösung, den markierten Makromolekülen auf den Mikropartikeln wird eine ausreichende Zeit zur Verfügung gestellt, das betroffene Organ oder die betroffene Region des Körpers zu lokalisieren, das Makromolekül wird mit einem Zielmolekül, das durch die untersuchte Zelle oder den untersuchten Organismus exprimiert wird, in Reaktion gebracht, und gebundene Mikropartikel werden durch Detektion der Markierung mittels konventioneller Bildgebungstechni ken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, beispielsweise Röntgenstrahlen, bestimmt.
Therapeutika – Arzneimittel-Zuführsysteme
Die Mikropartikel sind geeignet für eine Therapie, wenn sie aus einer vernetzten pharmazeutischen Verbindung oder einem vernetzten Träger, wie beispielsweise Albumin, der ein therapeutisches Mittel enthält, zusammengesetzt sind. Die Mikropartikel können entweder für die langsame Abgabe des Mittels an den Körper sorgen oder die Mikropartikel können eine Affinitätsmoleküle enthalten, das spezifisch für ein Zielgewebe oder einen Tumor ist, und in einen Patienten injiziert werden, um das therapeutische Mittel, beispielsweise ein Antitumor-, Antiviren-, antibakterielles, antiparasitisches oder antiarthritisches Mittel, ein Zytokin, Hormon oder Insulin zielgerichtet direkt an den therapiebedürftigen Ort zuzuführen.
Forschungsanwendungen
Die Mikropartikel sind auch als Forschungswerkzeuge für die Aufreinigung eines Biomoleküls aus einer komplexen Mischung, als Reagenz für die Bestimmung oder Quantifizierung eines Biomoleküls oder für die Herstellung von Biomolekülen, wie beispielsweise Antikörpern, geeignet.
Zum Beispiel werden in Mikropartikel, die aus einem Makromolekül, beispielsweise einem Immunglobulin, zusammengesetzt sind, an eine Chromatographiesäule gebunden und bei der Immunaffinitätschromatographie zur Trennung eines Liganden aus einer komplexen Mischung verwendet. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß Mikropartikel zur Verwendung in der Hochdruck-Flüssigchromatographie zunächst an eine nicht kompressible Festphasen-Kugeln oder -perlen gebunden werden sollten, so daß die Säulenpackung ihre feste Struktur unter Druck beibehält.
Alternativ werden Mikropartikel, die ein markiertes Makromolekül oder eine Mischung markierter Makromoleküle enthalten, die spezifisch für verschiedene Zellen oder zellrezeptoren sind, verwendet, um unter Verwendung von Techniken wie beispielsweise der Durchflußzytometrie Änderungen in der Zahl der Zellen oder Zelloberflächenrezeptoren als Reaktion auf eine bestimmte Testbedingung festzustellen.
Darüber hinaus sind die Mikropartikel geeignete Adjuvanzien für die Antikörperbildung, wobei antigenhaltige Mikropartikel in ein Tier, beispielsweise eine Maus oder ein Kaninchen, injiziert werden, um Impfstoff herzustellen, oder einen Menschen, um Immunität gegenüber einem Antigen zu induzieren, um eine verstärkte Immunantwort zur Herstellung von Antikörpern gegenüber dem Antigen auszulösen.
Kit zur Herstellung von Mikropartikeln
Ein Kit zur Herstellung von Mikropartikeln wird bereitgestellt. Der Kit enthält die folgenden Reagenzien: ein Dehydratisierungsmittel und ein vernetzungsmittel. Der Anwender des Kits kann den Kit für die Herstellung von kundenspezifischen Mikropartikeln verwenden, wobei der Benutzer die Makromoleküle liefert, aus denen die Mikropartikel gebildet werden. Alternativ kann der Kit ein oder mehrere Makromoleküle, in Lösung oder in lyophilisierter Form, zur Herstellung von interessierenden Mikropartikeln für den Benutzer enthalten. Die gebildeten Mikropartikel können dann wie oben beschrieben für die Forschung, die Therapeutik oder Diagnostik verwendet werden. Der Kit enthält vorzugsweise auch einen Puffer wie beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösung, der ein Quenching-Mittel, beispielsweise Glycin, enthält, um unspezifische Bindung durch das quervernetzende Mittel zu verhindern. Eine detektierbare Markierung oder ein vormarkiertes Makromolekül können ebenfalls in dem Kit enthalten sein, um Mittel bereitzustellen, die Anwesenheit des Mikropartikels in einer Probe oder einem Patienten festzustellen.
Die oben beschriebenen Polymerpartikel und Verfahren werden mit Bezug auf die folgenden nicht limitierenden Beispielen besser verstanden werden.
Beispiel 1: Herstellung von Mikropartikeln mit Gammaglobulin und einer Polymermischung aus Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol, und eine Stabilitätsanalyse davon
Mikropartikelbildung
Die Mikropartikel wurden durch Zusammenbringen von Gammaglobulin, einer von fünf Molekulargewichts-Zubereitungen (MG 10.000 bis 360.000) einer 5–25% Polyvinylpyrrolidon-Lösung, und einer Zubereitung konstanten Molekulargewichts (MG 3.500) einer 25% Polyethylenglykol-Lösung (beide zubereitet wie unten in Beispiel 2 beschrieben) in Gegenwart von Glutaraldehyd bei einem Reaktions-pH im Bereich zwischen 6,9 und 7,75 durch das folgende Verfahren gebildet. Die Mikropartikel waren sowohl in sauren als auch basischen Lösungen stabil.
Fünf Polymermischungen, von denen jede eine andere Molekulargewichts-Zubereitung von Polyvinylpyrrolidon enthielt, wurden wie in Tabelle 1 unten angegebenen herge stellt. 20 Mikroliter Glutaraldehyd (25%, Sigma Chemical, Company, St. Louis, MO) wurden zu jeder Polymermischung hinzugefügt. Ein Milliliter gereinigtes Ziegen-Gammaglobulin (Sigma Chemical, St. Louis, MO), gereinigt gemäß bekannter Verfahren, wurden mit jedem der fünf Polymermischungen durch kurzes Verwirbeln ("Vortexen") in Reaktion gebracht. Die Reaktionslösungen wurden für 40 Minuten bei 20°C gemischt und dann bei 4°C über Nacht inkubiert.
Alle fünf Reaktionslösungen wurden auf 20°C aufgewärmt, 100 μl DL-Lysin (Chemical Company, St. Louis, MO) wurden zu jeder Lösung hinzugefügt und die Lösung wurde für 90 Minuten bei 20°C gemischt.
Die Lösung wurde bei 5000 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen und die Niederschläge in 1 ml einer Pufferlösung, enthaltend 1,0 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,2% Tween (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), resuspendiert.
Einhundert Mikroliter jedes resuspendierten Niederschlags wurden mit 100 μl einer 1 : 2000-Verdünnung von Anti-Ziegen-IgG-Peroxidase-Konjugat für 15 Minuten bei 20°C in Reaktion gebracht. Ein ml des PBS/Tween-Puffers wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugefügt und die Mischung wurde bei 4°C über Nacht inkubiert.
Die Proben wurden zentrifugiert, 100 μl des überstand wurden jeweils entfernt und mit 300 μl TM Blue in Reaktion gebracht. Die verbleibenden überstände wurden vorsichtig abgegossen und die Niederschläge wurden in 1 ml der PBS/Tween-Lösung resuspendiert.
Die resuspendierten Proben wurden erneut zentrifugiert, 100 μl wurden entfernt und mit 300 μl TM Blue in Reaktion gebracht, die Überstände dekantiert und die Niederschläge in 1 ml PBS/Tween resuspendiert. Ein 100-μl-Aliquot des resuspendierten Niederschlags wurde mit 300 μl TM Blue in Reaktion gebracht.
Die resuspendierten Proben wurden erneut zentrifugiert, 100 μl wurden entfernt und mit 300 μl TM Blue in Reaktion gebracht, die Überstände dekantiert und die Niederschläge in 1 ml PBS/Tween resuspendiert. Ein 100-μl-Aliquot des resuspendierten Niederschlags wurde mit 300 μl TM Blue in Reaktion gebracht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und 2 dargestellt.
Tabelle 1: Menge und Eigenschaften von Mikropartikeln, die mit fünf verschiedenen MG-Zubereitungen von PVP gebildet wurden
Tabelle 2: Relative Gammaglobulin-Konzentration in Überstands- und Niederschlags-Fraktionen nach Mikropartikelbildung und -waschung
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Mikropartikel für alle fünf Lösungen mit verschiedenen Molekulargewichts-Zubereitungen von PVP in Gegenwart von Glutaraldehyd gebildet werden.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das Gammaglobulin selbst nach drei Waschungen an die im Niederschlag vorhandenen Mikropartikel angeheftet war.
Mikropartikel-Stabilitätsanalyse
Drei Reaktionen wurden für den ersten resuspendierten Niederschlag aus Reaktion #3 durchgeführt, um die Wirkung von sauren oder basischen Lösungen auf die Stabilität von Mikropartikeln wie folgt zu analysieren.
Einhundert Mikroliter des ersten resuspendierten Niederschlags aus Reaktion #3 wurden in drei Teströhrchen gegeben. Zweihundert Mikroliter entionisiertes Wasser wurden zum ersten Teströhrchen hinzugegeben. Die Partikel wurde beobachtet. Zweihundert Mikroliter 1 N Essigsäure wurden zu dem zweiten Teströhrchen hinzugegeben. Es wurden Partikel beobachtet, die dieselbe Größe wie indem ersten Teströhrchen aufwiesen. Zweihundert Mikroliter 1% NaOH wurden in das dritte Teströhrchen gegeben. Es wurden Partikel beobachtet, die dieselbe Größe aufwiesen wie in dem ersten Teströhrchen.
Alle Röhrchen wurden bei 4°C über Nacht stehengelassen und über den folgenden Tag erneut beobachtet. Röhrchen 1 und 2 veränderte sich nicht. Röhrchen 3 schien kleinere Partikel aufzuweisen als die Röhrchen 1 oder 2.
Die Ergebnisse zeigen, das ein saurer oder basischer pH die Stabilität der Partikel nicht änderte.
Beispiel 2: Herstellung und In-vitro-Analyse der Bindung von Anti-CEA-Mikropartikeln an radioaktives CEA
Anti-CEA(carcinogenic embryonic antigen)-Mikropartikel wurden, wie allgemein für Reaktion #3 in Beispiel 1 und weiter unten detaillierter beschrieben, gebildet. Die erhaltenen Mikropartikel wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen von radioaktivem CEA zusammengebracht, um festzustellen, ob die in die Mikropartikel aufgenommenen Anti-CEA-Antikörper ihre Affinität für den CEA- Liganden behielten.
Zubereitung von Anti-CEA-Mikropartikeln
Eine 14,3% Lösung jedes Polymers, Polyvinylpyrrolidon (MG 40.000) und Polyethylenglykol (MG 3.500), erhalten von Sigma, St. Louis, wurde durch Hinzufügen von 14,3 Gramm Polymer zu 100 ml destillierten Wassers hergestellt. Der pH jeder 14,3%-Polymer-Lösung wurde auf einen pH von ungefähr 6,25 eingestellt. Die Polymer-Lösungen wurden 1 : 1 gemischt, um eine PVP/PEG-Polymer-Mischung herzustellen.
Als Kontrollen wurde ein 0,45-ml-Aliquot von gereinigtem Ziegen-Anti-CEA-Gammaglobulin, mit 3,6 ml der PVP/PEG-Polymer-Mischung durch Verwirbeln in Reaktion gebracht, während die Polymermischung in Abwesenheit von Glutaraldehyd zu dem Gammaglobulin zugefügt wurde. Die Reaktanden wurden für drei 30 Minuten bei 3°C stehengelassen. Die Reaktanden wurden bei 2300 UPM für 60 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die überstände wurden dekantiert und die Niederschläge in 0,9 ml phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert.
Die resuspendierten Niederschläge wurden mit 1,8 ml der Polymermischung gewaschen, auf pH 6,25 voreingestellt, für 20 Minuten bei 3°C stehengelassen und bei 5000 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert.
0,9 ml gereinigtes Ziegen-Anti-CEA-Gammaglobulin wurden mit 2 ml der PVP/PEG-Polymer-Mischung, pH 6,25, enthaltend 20 μl Glutaraldehyd, durch Verwirbeln in Reaktion gebracht, während die Polymermischung/Glutaraldehyd zu dem Gammaglobulin hinzugefügt wurde. Die Reaktanden wurden bei 20°C für 90 Minuten gemischt. Die Reaktanden wurden bei 2300 UPM für 20 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und der Niederschlag in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. 80 Mikroliter DL-Lysin wurden zu dem resuspendierten Niederschlag hinzugegeben und gemischt. Die Reaktanden wurden bei 4°C über Nacht stehengelassen.
Die Reaktanden wurden bei 5000 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die Probe wurde dann für 60 Stunden bei 4°C stehengelassen und erneut zentrifugiert. Der Überstand erschien klar und wurde dekantiert. Der Niederschlag, der die Anti-CEA-Mikropartikel enthielt, wurde in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (1 ×) resuspendiert.
Bindungsanalyse
Radioaktives CEA (I¹²⁵) wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 10% flüssige Fisch-Glatine, verdünnt. Das verdünnte I¹²⁵-CEA enthielt 39.313 Counts pro 100 μl.
10 Reaktionsröhrchen, die jeweils 100 μl des verdünnten I¹²⁵-CEA enthielten, wurden wie unten in Tabelle 3 angegeben durch Hinzufügen des geeigneten Volumens von resuspendierten Anti-CEA-Mikropartikeln vorbereitet.
Die Radioaktives-CEA/Anti-CEA-Mikropartikel-Mischungen in den Röhrchen 1–5 wurden für 2 Stunden im Kühlschrank unter Schütteln inkubiert. Die Radioaktives-CEA/Anti-CEA-Mikropartikel-Mischungen in den Röhrchen 6–9 wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Reaktanden wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend 10% flüssige Fisch-Gelatine gewaschen, 1 min in einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge zentrifugiert, und in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Ergebnisse zeigen, daß die Anti-CEA-Mikropartikel immunologisch wirksam sind und mit CEA, wie zahlenmäßig in Tabelle 3 und grafisch in 1 dargestellt, reagieren.
Tabelle 3: Quantitative Analyse der Bindung von Anti-CEA-Mikropartikeln an radioaktives CEA
Beispiel 3: Wirkung des pH auf die Bildung von Mikropartikeln
Dieser Versuch demonstriert die Wirkung des pH auf die Fähigkeit zur Bildung von IgG-Mikropartikeln.
Versuchdurchführung
Eine Polymermischung von PVP/PEG wurde wie allgemein in Beispiel 2 beschrieben hergestellt (48% Gesamtpolymere) und auf den in Tabelle 4 angegebenen pH eingestellt. Ein Milliliter jeder Lösung wurde in jeweils 7 Zentrifugenröhrchen gegeben: Tabelle 4

Röhrchen # pH von PVP/PEG

1 4,6

2 5,2

3 5,8

4 6,6

5 7,4

6 8,1

7 9,2
100 μl einer 5,0% Glutaraldehyd-(Sigma, St. Louis, MO)Lösung in entionisiertem Wasser wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben und gut gemischt.
300 μl einer 3 ×-konzentrierten Probe von aus menschlichem Plasma gereinigten menschlichem IgG wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben unter Verwirbelung hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 20°C für eine Stunde gemischt und das Material bei 3800 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Partikel in fünf ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer gewaschen, dann für 60 Minuten bei 20°C gemischt und bei 3800 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Partikel in 5 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS gewaschen.
Beobachtungen
Nach Zugabe des gereinigten IgG gegen zu den Röhrchen und Mischen für 20 Minuten wurde ein Trend bei der Aggregatgröße beobachtet. Mit dem pH der PVP/PEG-Mischung erhöhte sich auch die Größe der gebildeten Aggregate.
Erste Niederschläge
Wenn der pH der PVP/PEG-Mischung anstieg, wurden die Niederschläge kleiner, nasser und verfärbten sich orange. Ein feststellbarer Unterschied trat bei pH 6,6 auf.
Röhrchen #7 mußte sehr vorsichtig behandelt werden, da der Niederschlag nicht an der Wandung des Röhrchens anhaftete. 90% des Überstandes wurden vorsichtig mit Hilfe einer Einweg-Pipette entfernt.
Erste Resuspension
Es gibt eine direkte Beziehung zwischen dem pH der PVP/PEG-Mischung und der Größe der gebildeten Partikel. Mit steigendem pH stieg die Partikelgröße an. Bei pH 6,6 waren die Partikel feststellbar größer als bei pH 5,8.
Zweite Niederschläge
Bei pH 6,6 und höher hafteten die Niederschläge nicht an der Wandung des Röhrchens an und glitten leicht an der Seite des Röhrchens herab. Mit steigendem pH veränderte sich die Farbe der Niederschläge von Gelb zu Orange.
Zweite Resuspension
Identischen zur ersten Resuspension.
Die Partikel wurden auf Raumtemperatur gebracht, gut gemischt und dann bei 2600 UPM bei 20°C für 30 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Niederschläge in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer, pH 5,6, resuspendiert. Der Waschvorgang wurde dann drei weitere Male wiederholt, bis die Überstände klar waren.
Schlußfolgerungen
Als der pH der PVP/PEG-Mischung von 9,2 auf 4,6 herabgesetzt wurden, wurde die Größe der durch die quervernetzende Wirkung von Glutaraldehyd gebildeten Partikel kleiner und einheitlicher in der Größe.
Beispiel 4: Herstellung von enzymmarkierten Albumin-Mikropartikeln

1. Sechzig Milligramm Hühnerei-Albumin wurden in 2 ml einer Polymer-Mischung aus PVP/PEG, hergestellt wie in Beispiel 2, gelöst. Der pH wurde mit 1 N HCl auf 4,5 eingestellt. 200 μl affinitätsgereinigter Cappell-Kaninchen-Anti-Ziege-IgG-Meerrettich-Peroxidase(horse radish peroxidase, HRP)-Konjugat wurde zugefügt.
2. Die Mischung wurde für 30 Minuten durch Rotieren umgewälzt.
3. Eine 10% Glutaraldehyd-Lösung wurde 1 : 4 verdünnt und 200 μl wurden zu der Mischung zugefügt.
4. Die Mischung wurde für 30 Minuten durch Rotieren umgewälzt.
5. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 20°C bei 1500 UPM zentrifugiert und der Überstand entfernt.
6. Der Überstand wurde in Glycin-Puffer resuspendiert und 2 Mal durch Zentrifugieren bei 1500 UPM für 10 Minuten bei 20°C gewaschen.
7. Der Niederschlag wurde in 0,15 M Tris-Salzlösung, pH 7,4, enthaltend 1% Fischgelatine, 2 ml Gesamtvolumen, resuspendiert und enthielt Partikel.

Analyse

1. 4 Tropfen HRP-Substrat wurden zu zwei Glasröhrchen hinzugegeben.
2. 4 Tropfen des resuspendierten Niederschlags aus dem obigen Schritt 7 wurden zu einem Röhrchen hinzugegeben und gemischt.
3. 4 Tropfen des Überstandes aus dem obigen Schritt 5 wurden in ein anderes Glasröhrchen gegeben und gemischt.

Ergebnisse

1. Das Röhrchen, das den Überstand aus Schritt 5 enthielt, war klar (keine Farbe).
2. Das Röhrchen, das den resuspendierten Niederschlag aus Schritt 7 enthielt, war innerhalb von 5 Minuten marineblau in der Farbe, was darauf hindeutet, daß die Partikel mit HRP markiert waren.

Beispiel 5: In-vivo-Verabreichung von Anti-HCG-Polymer-Mikropartikeln
Fluoreszenzmarkiertes Anti-Human-Choriongonadotropin(Anti-HCG)-Mikropartikeln wurden in eine Balb/c-Maus injiziert, um die Clearance zu untersuchen:
Eine weibliche Maus, die von 35 g wog, wurde mit Phenobarbital für 5 Minuten injiziert. Die Bauchhöhle wurde operativ exponiert und 100 Mikroliter des fluoreszenzmar kierten Anti-HCG wurden unter Verwendung einer 27½-Gauge-Nadel in die Aorta injiziert.
Fünf Minuten später wurden 50 μl Blut entfernt.
10 Minuten später wurden 50 μl Blut entfernt.
Es sei darauf hingewiesen, daß das Tier zur Zeit der Blutentnahme noch lebendig war, wobei das Herz stark schlug.
Die Maus wurde dann durch die zervikale Dislokation getötet.
Analyse

1. Ein Tropfen Blut (5 Min und 10 Min) wurde auf einen Glas-Objektträger mit einer Ausnehmung für die Probe aufgebracht, und die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt. Ein Tropfen Öl wurde auf das Deckglas aufgebracht.
2. Die Blutprobe wurde unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss IIIRS) unter Verwendung hoher Leistung untersucht.
3. Um die Zellen der 5-Minuten-Probe herum wurde starke Fluoreszenz beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Mikropartikel von den Tieren nicht rasch absorbiert wurden.
4. Bei der 10-Minuten-Probe wurde eine schwache Fluoreszenz beobachtet.

Beispiel 6: Wirkung der Konzentration der Polymer-Mischung auf die Bildung von fluoreszenzmarkierten Human-IgG-Mikropartikeln
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung der Konzentration einer PVP/PEG-Polymermischung auf die Bildung von Antikörper-Mikropartikeln zu bestimmen.
Durchführung
Ein Volumen der PVP/PEG-Polymermischung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, um eine Polymermischung mit einer Polymerkonzentration von 53,3%, eingestellt auf pH 4,8, zu erhalten. Es wurden Polymerverbindungen wie in Tabelle 5 angegeben unter Verwendung von 0,1 M Natriumactetat bei pH 5,0 hergestellt:
Tabelle 5: Volumen und Prozent Polymermischung
1 ml von jeder der in Tabelle 5 angegebenen Verdünnungen wurde in ein Zentrifugeröhrchen gegeben. Jedes Röhrchen erhielt dann 100 μl einer 5% Glutaraldehyd-Lösung, hergestellt durch Hinzufügen von 400 μl 25% Glutaraldehyd zu 2,0 ml H₂O und Mischen. Die Polymermischung/Glutaraldehyd-Lösung wurde gründlich verwirbelt.
Die Röhrchen wurden dann mit 300 μl fluoreszenzmarkiertem Human-IgG in Reaktion gebracht. Die gereinigten menschlichen Antikörper wurden in einer 0,1 M Glycin-Lösung in PBS-Puffer bei pH 11,0 3 × auf konzentriert und mit Fluoreszein-Isothiocyanat in dem 0,1 M Glycin-Puffer bei einer Konzentration von 3 mg/ml markiert. Der Antikörper wurde zu den Polymermischungsverdünnungen unter Verwirbeln hinzugefügt, die Röhrchen wurden für eine Stunde gemischt und anschließend 30 Minuten bei 2500 UPM bei 20°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren wurden die Überstände dekantiert und die Niederschläge in 0,5 M Glycin in PBS resuspendiert. Die Niederschläge wurden aufgebrochen und gut geschüttelt. Sie wurden dann für 30 Minuten bei 30°C, 2500 UPM, zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde viermal wiederholt.
Ergebnisse
Jedes Röhrchen wies vom Beginn der Reaktion an ein anderes Erscheinungsbild auf. Das Röhrchen mit 5,3% Polymer wies lediglich einen leichten Niederschlag auf, von dem der Großteil an der Wanderung des Röhrchens zusammenklumpte. Das Röhrchen, welches 53,3% Polymer enthielt, wies sehr feine Partikel auf, die nicht untereinander oder an der Wanderung des Röhrchens klebten.
Insgesamt wurde der niedergeschlagene Stoff mit zunehmender Polymerkonzentration feiner und weniger klebrig.
Nach der Zentrifugation stieg die Größe des Niederschlags in direktem Verhältnis zur Polymerkonzentration an. Die Intensität der orangen Farbe des Niederschlags war umgekehrt proportional zur Polymerkonzentration.
Der Kontroll-Niederschlag war sehr klein und wies eine intensive orange Farbe auf, wie auch die Röhrchen mit sehr niedrigen Polymerkonzentrationen. Die Leichtigkeit, mit der die Niederschläge in dem 0,5 M Glycin-Waschpuffer aufgebrochen wurden, stand ebenfalls mit der Polymerkonzentrationen in Beziehung. Der Niederschlag der Röhrchen, die lediglich 5,3% Polymermischung enthielten, war klebrig und schwer aufzubrechen, in jedem nachfolgenden Röhrchen waren die Partikel dagegen weniger klebrig. Bei einer Polymerkonzentration von 31,8% oder höher trennten sich die Teilchen sehr leicht.
Nach der ersten Waschung und Zentrifugation bestand nach wie vor ein Farbintensitäts-Gradienten in den Niederschlägen, obwohl der Unterschied von geringerer Größenordnung war. Die Überstände wiesen eine leicht orange Farbe auf, weil Fluoreszein-Isothiocyanat aus der Probe ausgewaschen wurde. Nach der dritten Waschungen waren die Überstände klar und die Farbe der Niederschläge war einheitlich. Die Größenunterschiede zwischen den Niederschlägen änderten sich nicht.
Schlußfolgerung
Die Polymerkonzentration spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Eigenschaften der Antikörper-Partikel, die mit der Polymermischung hergestellt werden. Polymerkonzentrationen von 40% und darüber führen zu sehr feinen Partikeln, die nicht kleben. Darüber hinaus ist die Zahl der Antikörper-Partikel, die gebildet werden können, um so größer, je höher die Konzentration von Polymeren in der Polymermischung ist.
Beispiel 7: Wirkung des pH auf die Bildung von Gammaglobulin-Mikropartikeln
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung des pH der Polymermischung auf die Bildung von Antikörperpartikeln zu bestimmen.
Durchführung
8 Zentrifugeröhrchen erhielten jeweils eine 1-ml-Teilmenge von Ziegenserum. Das Serum wurde 15 Minuten mit einer 1,8% Triton/3% Brij(Sigma, St. Louis, MO)-Lösung inkubiert. Darauf schloß sich eine Reaktion mit 2 ml einer 40% Polymermischung an. Die Zugabe der Polymermischung wurde unter Verwirbeln durchgeführt und die Röhrchen wurden für dreißig Minuten gemischt. Die Röhrchen wurden dann für 30 Minuten bei 3600 UPM, 20°C, zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Niederschläge in 1 ml 0,5 M Imidazol (Baker Chemical Co.) resuspendiert. Alle Proben resuspendierten leicht und klar.
Nach 15-minütiger Inkubation in der Imidazol-Lösung erhielten die Proben unter Verwirbeln 1 ml der Polymermischung. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten gemischt und wurden für 30 Minuten bei 20°C, 3600 UPM, zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Niederschläge wurden leicht und klar in 1 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Die Proben wurden mit einem pH-Gradienten der Polymermischung in Reaktion gebracht, wobei der pH mit Salzsäu re herabgesenkt und mit 3 M Imidazol heraufgesetzt wurde. Die eingestellten pH-Werte sind wie in Tabelle 6 angegeben: Tabelle 6: Eingestellter pH jeder Probe

Röhrchen # pH von PVP/PEG

1 4,1

2 4,8

3 5,8

4 6,6

5 7,2

6 8,0

7 8,7

8 9,3
1 ml der pH-eingestellte Polymermischung wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben und anschließend für 10 Minuten gemischt. Nach dem Mischen erhielt jedes Röhrchen 40 μl 20% Glutaraldehyd, 1 : 10 mit entionisiertem Wasser verdünnt. Die Röhrchen wurden erneut für 10 Minuten gemischt und für 30 Minuten bei 20°C, 3600 UPM, zentrifugiert. Die Röhrchen wurden dekantiert und die Partikel in 1 ml 1 × PBS resuspendiert.
Ergebnisse
Nach dem Zentrifugieren zeigten die Proben in Bezug auf den pH einen klaren Gradienten sowohl für die Größe also die Farbe. Vor der Resuspension im 1 × PBS waren die Niederschläge in den Proben 1,2 und 7 geringfügig kleiner als die in den anderen Röhrchen. In der Probe mit pH 9,3 ergab sich kein sichtbarer Niederschlag, da die hohe Basizität die Fähigkeit der Polymermischung hemmt, Proteine zu präzipitieren. Die Proben mit saurem pH waren weiß, wobei die Proben über den Gradienten zunehmend gelb-orange wurden. Die Partikelgröße war darüber hinaus direkt proportional zum pH, wobei die Partikel in Probe 1 sehr fein waren. Mit steigendem pH wurden die Partikel größer und neigten dazu, stärker zu klumpen.
Schlußfolgerung
Die Größe der Antikörper-Partikel kann leicht durch Veränderung des pH der Polymermischung beeinflußt werden. Bei hohem pH bildet Glutaraldehyd sehr starke Bindungen mit den Aminogruppen von Proteinen, was für die gelb-orange Farbe und die Klebrigkeit der zunehmend basischen Proben verantwortlich ist. Bei sauren pH-Werten sind die Wirkungen des Glutaraldehyds jedoch verringert. Es können sich noch Partikel bilden, sie sind aber sehr viel feiner mit einer geringeren Tendenz zu klumpen, als die Partikel, die mit der basischen Polymermischung hergestellt wurden.
Beispiel 8: Wirkung der Glutaraldehyd-Konzentration auf die Bildung von IgG-Mikropartikeln
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung einer steigenden Menge von Glutaraldehyd auf die Bildung von IgG-Mikropartikeln zu zeigen.
Versuchdurchführung
1 ml der in Beispiel 2 beschriebenen Polymermischung, enthaltend 48% Gesamt-Polymere, pH 4,8, wurde in 7 Zentrifugenröhrchen gegeben. Verschiedene Volumina von Glutaraldehyd wurden, wie in Tabelle 7 angegeben, zu jedem Röhrchen hinzugegeben: Tabelle 7: Konzentration von Glutaraldehyd pro Röhrchen

Glutaraldehyd-Volumen Röhrchen #

2 μl 1

5 μl 2

10 μl 3

20 μl 4

50 μl 5

100 μl 6

200 μl 7
Jedes Röhrchen wurde gut gemischt und 300 μl gereinigtes IgG, 3 × konzentriert in 0,1 M Glycin-Puffer, pH 11,2, enthaltend 2 ng/ml Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Alle Röhrchen wurden für eine Stunde bei 20°C gemischt, dann für 30 Minuten bei 3600 UPM und 20°C zentrifugiert.
Die Überstände wurden dekantiert und die Partikel in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Gemischt für 30 Minuten bei 20°C. Zentrifugiert für 30 Minuten bei 2600 UPM und 20°C. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt.
Die Partikel wurden in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer, pH 7,0, aufbewahrt.
Beobachtungen
Mit steigender Menge von Glutaraldehyd stieg die Anzahl der Partikel und es wurde eine stärker orange Farbe festgestellt.
Die Partikel wurden wiederholt gewaschen, bis die Überstände klar erschienen.
Die letzte Zentrifugation führte zu Niederschlägen, die nicht vollständig an der Röhrchenwandung hafteten. Die Überstände mußten vorsichtig mit einer Einwegpipette entfernt werden und 1,0 ml Puffer blieben zurück.
Schlußfolgerungen
Es existiert eine direkte Beziehung zwischen einer zu der Polymermischung (48% Gesamt-Polymere) hinzugegeben ansteigenden Menge von Glutaraldehyd und einem Anstieg in der Menge der gebildeten Partikel. Die Menge von Glutaraldehyd (zwischen 2 μl und 200 μl einer wäßrigen 25% Lösung) schien keinen Effekt auf eine Zunahme oder Abnahme der Partikelgröße zu haben.
Beispiel 9: Zubereitung und In-vitro-Analyse der Bindung von Anti-HCG-monoklonale-Antikörper-Mikropartikeln an iodiertes HCG
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um Human-Choriongonadotropin(HCG)-spezifische Monoklonale-Antikörper-Mikropartikel mit einer PVP/PEG-Polymermischung und verschiedenen Konzentrationen von Glutaraldehyd zu bilden und die Fähigkeit der Mikropartikel zu demonstrieren, HCG-indizierte Antigene in einem Immunassay zu binden.
Versuchdurchführung
Zwei aufgetaute Ein-ml-Proben von gereinigtem HCG-Antikörper, hergestellt nach den in Beispiel 2 spezifizierten Verfahren, zusammengemischt. Gut gemischt. Zunehmend kleinere Prozent-Lösungen von Glutaraldehyd (aus einer 25% wäßrigen Lösung), wie in Tabelle 8 angegeben, hergestellt.
Tabelle 8: Endgültiger Prozentanteil von Glutaraldehyd pro Röhrchen
150 μl der gepoolten HCG-Probe wurde zu jedem Röhrchen, enthaltend 100 μl der Glutaraldehyd-Prozent-Lösungen unter Verwirbeln hinzugefügt.
0,5 ml der Polymermischung (40% Gesamt-Polymere, pH 6,6) wurden rasch zu jedem Röhrchen zugegeben und für 30 Minuten bei 20°C gemischt. Drei Minuten bei 3500 UPM und 4°C zentrifugiert. Für 45 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Überstände dekantiert. 2 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS, pH 7,0, zu jedem Röhrchen zugefügt und 30 Minuten bei 20°C gemischt. Für 30 Minuten bei 3000 UPM und 4°C zentrifugiert. Überstände dekantiert und Partikel in 2,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS resuspendiert. Kurz, aber gut gemischt. Für 30 Minuten bei 3000 UPM und 4°C zentrifugiert. Waschvorgang einmal wiederholt. Über Nacht bei 4°C stehengelassen. Partikel bei 3000 UPM und 4°C für 12 Minuten zentri fugiert. Überstände dekantiert und Partikel in 2,0 ml 1 × PBS resuspendiert.
Beobachtungen
Es wurde eine Tendenz in der Größe der Partikel beobachtet. Mit abnehmender Glutaraldehyd-Konzentration verminderte sich die Zahl der Partikel, die Größe der Partikel steht jedoch an. In Röhrchen #7 (Kontrolle) wurden keine Partikel beobachtet.
Immunassay
50 μl jeder Probe mit den wie oben hergestellten Partikeln wurden in drei Sätze zu sechs Röhrchen (A, B & C) gegeben (insgesamt 18 Röhrchen).
Zu den Röhrchen 1–6 in Satz A und zu einem Röhrchen mit HCG-Antikörper-Kontrolle für die Gesamt-Impulse (Gesamt-"Counts") wurden 25 μl HCG-Tracer (iodiertes HCG-Antigen, Becton Dickinson, San Jose, CA) zugegeben.
Zu den Röhrchen 1–6 in Satz B und zu einem Röhrchen mit FSH-Antikörper-Kontrolle für die Gesamt-Impulse wurden 25 μl Follikelstimulierendes-Hormon(FSH)-Tracer (iodiertes FSH-Antigen) zugegeben.
Zu den Röhrchen 1–6 in Satz C und zu einem Röhrchen mit Estradiol-Antikörper-Kontrolle für die Gesamt-Impulse wurden 25 μl Estradiol-Tracer (iodiertes Estradiol-Antigen) zugegeben.
Alle Röhrchen kurz verwirbelt und für 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 2,0 ml entionisiertes Wasser hinzugegeben, gemischt und für 30 Minuten bei 3000 UPM zentrifugiert. Röhrchen vorsichtig dekantiert (ungefähr 100 Mikroliter restliches Wasser wurde in den Röhrchen zurückgelassen).
Alle Röhrchen wurden für 1 Minute in einem Szintillationszähler gezählt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 9 wiedergegeben.
Tabelle 8: Bindung von radioaktivem Antigen an Anti-HCG-Mikropartikel
Schlußfolgerung
Mit abnehmender Konzentration von Glutaraldehyd werden weniger Anti-HCG-monoklonale-Antikörper-Mikropartikel gebildet, aber diese Partikel sind größer. Die Anti-HCG-Mikropartikel sind in der Lage, iodiertes HCG-Antigen in einem Immunassay zu binden. Die Anti-HCG-Mikropartikel sind nicht zu einer unspezifischen Bindung von anderen iodiertes Antigenen wie beispielsweise FSH und Estradiol in einem Immunassay einer Lage.
Beispiel 10: Herstellung von Tetanustoxoid-Mikropartikeln
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um Tetanustoxoid-Mikropartikel mit einer Polymermischung aus PVP und PEG und Glutaraldehyd herzustellen.
Versuchdurchführung
1,0 ml einer 54% Polymermischung aus PVP/PEG wurde in zwei Zentrifugeröhrchen gegeben. 100 μl Glutaraldehyd (wäßrige 25% Lösung) wurden zu einem Röhrchen und 10 μl Glutaraldehyd zu dem anderen Röhrchen gegeben und gründlich verwirbelt.
0,5 ml Tetanustoxoid (1,0 mg pro ml) (Dept. of Public Health) in beide Röhrchen gespritzt und gründlich gemischt.
Für vier Stunden und 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Für 30 Minuten bei 3000 UPM und 4°C zentrifugiert. Überstände dekantiert und resuspendierte Partikel in 2,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer resuspendiert. Über Nacht bei 4°C stehengelassen.
Waschvorgang zweimal wiederholt. Die Partikel wurden schließlich in 0,5 ml 1 × PBS-Puffer resuspendiert.
Beobachtungen
Die Reaktion mit 100 μl Glutaraldehyd enthielt mehr Partikel als die Reaktion mit 10 μl Glutaraldehyd. Die Partikel beider Reaktionen waren vergleichbar in der Größe. Die Partikel erschienen bei Betrachtung mit dem Auge sehr klein.
Beispiel 11: Herstellung von Rinderserumalbumin-Polymer-Mikropartikeln
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die Bildung von Rinderserumalbumin(BSA)-Mikropartikeln mit einer Polymermischung aus PVP/PEG und Glutaraldehyd zu zeigen und die Wirkung der bei diesem Verfahren verwendeten verschiedenen Volumen von Glutaraldehyd zu beobachten.
Versuchdurchführung
110 mg BSA wurden in 11 ml 0,1 M Tris^TM-Base, pH 9,0, gegeben. 11 mg FITC zugegeben, auf pH 9,5 mit Base eingestellt, für 30 Minuten bei 20°C zur Bildung von fluoreszenzmarkiertem BSA gemischt.
8 Röhrchen mit jeweils 1 ml der Polymermischung (pH 5,0, 48% Gesamtpolymere) wurden vorbereitet und die folgenden Mengen von Glutaraldehyd (wäßrige 25% Lösung) wie in Tabelle 10 angegeben zugegeben. Tabelle 10: Konzentration von Glutaraldehyd pro Röhrchen

Röhrchen #1 Volumen von Glutaraldehyd

1 200 μl

2 100 μl

3 50 μl

4 25 μl

5 12 μl

6 6 μl

7 3 μl

8 1 μl
Kurz, aber gründlich durch Verwirbeln gemischt. 300 ml BSA-FITC-Lösung zugegeben. Für 7,5 Stunden gemischt.
Schlußfolgerung
Rinderserumalbumin-Mikropartikel wurden in jedem Röhrchen in gebildet. Mit abnehmender Glutaraldehydmenge wurden Aggregate von größerer Größe zusätzlich zu kleinen feinen Partikeln gebildet, die bei allen Volumen von Glutaraldehyd (1 μl bis 200 μl) beobachtet wurden. Ebenso stieg die Zahl der kleinen feinen Partikeln mit dem Anstieg der Glutaraldehydmenge an.
Beispiel 12: Herstellung von Immunglobulin-Mikropartikeln mit gesättigtem Ammoniumsulfat als Dehydratisierungsmittel
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um Immunglobulin-Mikropartikel unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat, über einen pH Gradienten, als Dehydratisierungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel herzustellen.
Versuchdurchführung
100 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurden durch Zugegeben von 76,1 Gramm Ammoniumsulfat (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in bis zu 100 ml entionisiertem Wasser, pH 5,2, hergestellt.
Lösungen von gesättigtem Ammoniumsulfat mit verschiedenen pHS wurden durch Einstellen von Teilmengen der oben hergestellten Lösung mit Eisessig für niedrige pH Werte und mit 2 N Natriumhydroxid für höhere pH-Werte, wie in Tabelle 11 angegeben, hergestellt. Tabelle 11: Eingestellter pH der gesättigten Ammoniumsulfatlösung pro Röhrchen

pH Röhrchen-Nummer

4,2 1

5,2 2

6,5 3

7,1 4

8,1 5

9,2 6
Ein 0,3-ml-Aliquot jeder gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
50 ml Glutaraldehyd (wäßrige 25% Lösung) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben und gut gemischt.
0,3 ml Probe von gereinigtem IgG aus menschlichem Plasma, gereinigt unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren, wurde zu jedem Röhrchen zugegeben. Alle Röhrchen wurden dann für etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die Bildung von Partikeln wurde sofort nach der Zugabe der gereinigten IgG-Proben beobachtet.
5,0 ml von 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer, pH 7,0, wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden gemischt und dann für 30 Minuten bei 2600 UPM und 20°C zentrifugiert.
Überstand dekantiert und Partikel in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Für 30 Minuten bei 20°C gemischt und dann für 30 Minuten bei 2600 UPM und 20°C zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde drei weitere Male wiederholt.
Beobachtungen
Unmittelbar nachdem das gereinigte IgG zu der (gesättigten) Ammoniumsulfatlösung mit Glutaraldehyd zugegeben worden war, wurden beim Mischen der Röhrchen Partikel beobachtet.
Es wurde eine direkte Beziehung zwischen dem Anstieg des pH der gesättigten Ammoniumsulfatlösung und einem Anstieg in der Menge von gebildeten Partikeln gefunden.
Die Größe der Partikel unterschied sich nicht innerhalb des pH-Bereichs der gesättigten Ammoniumsulfatlösung.
Beispiel 13: Herstellung von Immunglobulin-Mikropartikeln mit einer Mischung aus gesättigtem Ammoniumsulfat und Polyethylenglykol als Dehydratisierungsmittel.
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um Immunglobulin-Mikropartikel unter Verwendung einer Mischung von gesättigtem Ammoniumsulfat und Polyethylenglykol (PEG) als Dehydratisierungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel herzustellen.
Versuchdurchführung
Ein Volumen von 100 ml der gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellt. Eine 20%ige Lösung von coli Ethylenglykol (Sigma, St. Louis, MO) in 0,1 M Natriumactetat, pH 4,8, wurde ebenfalls hergestellt. Die Ammoniumsulfatlösung wurde in kleinen Intervallen zu 10 ml der PEG-Lösung hinzugegeben, bis das Ammoniumsulfat ausfiel. Das größte Volumen von Ammoniumsulfat, das gelöst bliebe, betrug 1,2 ml. Ein ml dieser Ammoniumsulfat/PEG-Lösung wurde in jedes 8 Röhrchen gegeben. Die Röhrchen erhielten dann 25% Glutaraldehyd (Sigma, St. Louis, MO) in den in der Tabelle 12 unten angegebenen Mengen. Tabelle 12: Menge Glutaraldehyd, die zur Ammoniumsulfat/PEG-Lösung zugegeben wurde

Röhrchen-Nummer Glutaraldehyd

1 0 μl

2 2 μl

3 5 μl

4 10 μl

5 20 μl

6 50 μl

7 100 μl

8 200 μl
Die Röhrchen 5–8 wiesen eine Farbreaktion auf, die in der Stärke über den Gradienten anstieg. Die Intensität der Farbe stieg ebenfalls über die Zeit an. Dies war auf die Reaktion des Glutaraldehyds mit dem Ammoniumsulfat zurückzuführen. Die Röhrchen 1–4 veränderten ihre Farbe nicht, weil die Glutaraldehyd-Konzentration in diesen Röhrchen sehr niedrig war.
Ein 300-μl-Aliquot von dreifach konzentriertem gereinigtem Schweine-IgG-Antikörper wurde zu jedem Röhrchen unter Verwirbeln zugefügt. Die Röhrchen wurden dann für 60 Minuten gemischt und für 30 Minuten bei 3600 UPM bei 20°C zentrifugiert.
Die Überstände wurden dekantiert und 10 ml 0,5 M Glycin (Sigma, St. Louis, MO), pH 7,0, in phosphatgepufferter Salzlösung, und zu jedem Niederschlag zugegeben. Die Röhrchen wurden gut geschüttelt, um die Niederschläge aufzubrechen, und über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Am nächsten Morgen wurden die Röhrchen für 30 Minuten bei 3600 UPM und 20°C zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Niederschläge mit 5 ml der 0,5 M Glycin-Pufferlösung gewaschen. Nachdem sie gut geschüttelt worden waren, wurden die Röhrchen für 30 Minuten bei 3600 UPM und 20°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände dekantiert und die Niederschläge erhielten 5 ml des 0,5 M Glycin-Puffers. Die Röhrchen wurden gut geschüttelt.
Ergebnisse
Nach der ersten Zentrifugation unterschieden sich die Niederschläge in ihrer Farbe, wobei die Niederschläge mit steigender Glutaraldehyd-Konzentration größer und dunkler wurden. Nach dem Aufbrechen der Niederschläge und gutem Mischen waren die Partikel in allen Röhrchen, mit Ausnahme von Röhrchen #1, welches kein Glutaraldehyd erhielt, sichtbar. Feine Partikel mit anscheinend einheitlicher Größe wurden in den Röhrchen 2–7 beobachtet. Die Partikel waren jedoch klebrig und tendierten in allen Röhrchen dazu, zu verklumpen. In den Röhrchen, die weniger als 20 μl Glutaraldehyd erhielten, schien der Anteil des Verklumpens im Vergleich zur Menge der Partikel in dem Röhrchen größer zu sein. Diese Ergebnisse waren über die letzten zwei Waschungen konstant.
Beispiel 14: Herstellung von Insulin-Mikropartikel
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um Insulin-Mikropartikel mit einer Polymermischung aus PVG und PEG und Glutaraldehyd herzustellen, die Konzentration der gebildeten Mikropartikel zu messen und ihre immunologische Wirksamkeit zu bestimmen.
Herstellung von Mikropartikeln
30 mg Insulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aus Rinder-Pankreas wurden in 3,0 ml 3 M HCl gegeben, um das getrocknete Insulin zu lösen. Der pH wurde unter Verwendung von 25-μl-Inkrementen 2 N NaOH zwischen 8,4 und 9,0 eingestellt.
Ein 1,0-ml-Aliquot der 54% Polymermischung aus PVP/PEG, pH 5,0, wurde in drei Zentrifugenröhrchen gegeben. Die folgenden Mengen von Glutaraldehyd (Güteklasse II, wäßrige 25% Lösung, Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben: 25 μl Glutaraldehyd in Röhrchen A, 50 μl Glutaraldehyd in Röhrchen B und 100 μl Glutaraldehyd in Röhrchen C.
1,0 ml des gelösten Insulins wurde unter Verwirbeln zu jedem Röhrchen zugegeben. Für sechs bis acht Stunden bei 20°C gemischt und über Nacht stehengelassen.
Die Partikel wurden neunmal unter Verwendung von 5,0 ml Lysin-Lösung, pH 9,4, enthaltend 1 mg/ml Natriumazid (10 mg Lysin/ml entionisiertes Wasser) gewaschen. Der Waschvorgang bestand aus dem Zufügen von 5,0 ml Lysin-Lösung zu den Partikeln und kurzem, aber gutem Mischen. Zentrifugiert für 30 Minuten bei 2300 UPM und 20°C. Überstand abgesaugt und den Vorgang wiederholt. Partikel in der Lysin-Lösung über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Partikel zentrifugiert, Überstand abgesaugt und Partikel in 5,0 ml 1 × phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, resuspendiert. Der pH jeder Suspension war wie folgt: Röhrchen A pH 9,2, Röhrchen B pH 9,2 und Röhrchen C pH 8,8.
Partikel zentrifugiert, Überstand abgesaugt und Partikel in 5,0 ml 1 × phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, resuspendiert. Der pH jeder Suspension war wie folgt: Röhrchen A pH 8,0, Röhrchen B pH 7,4 und Röhrchen C pH 7,2.
Partikel zentrifugiert, Überstand abgesaugt und Partikel in 5,0 ml 1 × phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, resuspendiert. Der endgültige pH jeder Suspension war wie folgt: Röhrchen A pH 7,4, Röhrchen B pH 7,2 und Röhr chen C pH 7,2.
Ergebnisse
Die gebildeten Partikel waren sehr klein und fein. während der Zentrifugation in der Lysin Lösung waren die Partikel nicht in der Lage, vollständig zu kompaktieren. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung waren die Partikel in einem größeren Maß in der Lage, zu kompaktieren und bildeten auch Aggregate von Partikeln.
Röhrchen C wies die größte Menge von Partikeln auf. Röhrchen B wies mehr Partikel auf als Röhrchen A. Die Partikelbildung verstärkte sich daher mit der Menge des zu jedem Röhrchen zugegebenen Glutaraldehyds.
Schaf-Anti-Insulin-Peroxidase-Assay
Die immunologische Aktivität der Insulin-Mikropartikel wurde durch Messung der Fähigkeit der Mikropartikel, Anti-Schaf-Insulin in einem Schaf-Anti-Insulin-Peroxidase-Test zu binden, bestimmt.
Drei Reihen von jeweils vier Röhrchen wurden vorbereitet. Die folgenden Volumen der Insulinpartikel aus jedem der obigen Röhrchen A, B und C wurden, wie unten in Tabelle 13 angegebenen, in das entsprechende Röhrchen für jede Reihe gegeben.
Zu jedem Röhrchen wurde die entsprechende Menge von 1 × phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, zu einem Endvolumen von 1,0 ml zugegeben. Alle Röhrchen wurden gut, aber kurz, gemischt. 100 μl Schaf-Anti-Insulin-Peroxidase (Bio design International, Kennebunkport, ME, 5 mg/ml Protein) wurden zugegeben. Gut gemischt. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für vier Stunden und 10 Minuten inkubiert. Die Röhrchen wurden bei 4°C über Nacht stehengelassen.
Alle Röhrchen in allen Reihen wurden bei 3000 UPM für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Lediglich 90% des Überstandes wurden vorsichtig entfernt, um versehentlichen Verlust der Partikel zu verhindern. Zu den abgesaugten Röhrchen wurden 1,0 ml 0,2% Tween^TM-Detergenz in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung zugegeben und durch Verwirbeln gemischt. 100 μl von jedem überstand wurden mit 0,5 ml des Chromogens TM Blue^TM (Tetramethylenbenzidin, Center for Diagnostic Products, Milford, MA) in Reaktion gebracht. Alle Überstände waren positiv. Um alle überschüssige ungebundene Schaf-Anti-Insulin-Peroxidase zu entfernen, wurde der ganze Waschvorgang zweimal mehr wiederholt.
Nach der letzten Waschung wurden 90% des Überstandes abgesaugt und 50 μl der Partikel aus jedem Röhrchen entfernt und mit 0,2 ml des TM-Blue^TM-Chromogens in Reaktion gebracht.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, dargestellt unten in Tabelle 13, zeigen, daß die Insulin-Mikropartikel in der Lage sind, Anti-Schaf-Insulin zu binden, was darauf hindeutet, daß diese Partikel immunologisch wirksam sind.
Tabelle 13: Fähigkeit von Insulin-Partikeln, die unter Verwendung verschiedener Mengen von Glutaraldehyd gebildet wurden, Anti-Schaf-Insulin zu binden
Hemm-Test
Die immunologische Wirksamkeit der Insulin-Mikropartikel wurde durch Messung der Fähigkeit der Mikropartikel, Anti-Schaf-Insulin in einem Hemm-Test zu binden, bestimmt.
Zwei Reihen von je 5 Röhrchen wurden wie folgt vorbereitet. Die folgenden Volumen von Insulinpartikeln, aus den obigen Reaktionen A und C, wurden in die entsprechenden Zentrifugeröhrchen, wie unten in Tabelle 14 dargestellt, gegeben.
100 μl Immunophase Insulin Tracer^TM (iodiertes Insulin, Ciba Corning) wurden zu allen Röhrchen in beiden Reihen zugegeben. Verwirbelt. 1,0 μl Immunophase^TM-Insulin-Antikörper (Ciba Corning) hinzugefügt. Gemischt. Für vier Stunden und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Für 30 Minuten bei 3000 UPM und 20°C zentrifugiert.
Die Röhrchen für eine Minute in einem Gamma-Szintillationszähler gezählt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, unten in Tabelle 14 dargestellt, zeigen, daß die Insulin-Mikropartikel bei Verwendung eines Hemm-Tests in der Lage sind, Anti-Schaf-Insulin zu binden, was zeigt, daß diese Partikel immunologisch wirksam sind.
Tabelle 14: Fähigkeit von Insulin-Partikeln, die unter Verwendung verschiedener Mengen von Glutaraldehyd gebildet wurden, Anti-Schaf-Insulin in Gegenwart von radioaktivem Insulin zu binden
Beispiel 15: Immunisierung von Mäusen mit Tetanustoxoid-Mikropartikel
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die In-vivo-Wirkungen der Immunisierung mit Tetanustoxoid-Mikropartikeln zu bestimmen.
Die Durchführung, Ergebnisse und Schlußfolgerungen des Versuchs sind wie folgt:
Durchführung
Tetanustoxoid-Mikropartikel wurden wie oben allgemein in Beispiel 10 beschrieben wie folgt hergestellt:
Eine 27%-Lösung von jedem Polymer, Polyvinylpyrrolidon (MG 40.000) und Polyethylenglykol (MG 3500), erhalten von Sigma, St. Louis, MO, wurde durch Zufügen von 27 Gramm Polymer zu 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Der pH der jeweiligen Polymerlösung wurde auf einen pH von ungefähr 6,25 eingestellt. Die Polymerlösung wurde 1 : 1 gemischt, um eine PVP/PEG-Polymer-Mischung herzustellen (54% Gesamtpolymere).
100 μl einer 5,0-%-Glutaraldehyd(Sigma, St. Louis, MO)-Lösung, in entionisiertem Wasser, wurden zu 1,0 ml der PVP/PEG-Polymer-Mischung zugegeben und gründlich verwirbelt.
0,5 ml Tetanustoxoid (1,0 mg/ml), erhalten vom Dept. Of Public Health, wurden zu der PVP/PEG-Glutaraldehyd-Mischung zugegeben und gründlich verwirbelt.
Die Kombination wurde für 4 Stunden und 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann bei 3000 UPM für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert, die Partikel im 2,0 ml 0,5 M Glycin in 1 × PBS-Puffer resuspendiert und über Nacht bei 4°C stehengelassen.
Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Die Tetanustoxoid-Partikel wurden schließlich in 0,5 ml 1 × PBS-Puffer resuspendiert. Die Partikel besaßen eine Partikelgröße zwischen ungefähr 50 und 100 Mikrometer.
Jeder aus einer Gruppe von zweiunddreißig Mäusen wurde nach einem FDA-Protokoll subkutan eine erste Dosis, enthaltend 2 μg der Tetanustoxoid-Partikel, injiziert. Eine zweite Injektion, enthaltend 2 μg der Tetanustoxoid- Partikel, wurde sieben Wochen nach der ersten Injektion verabreicht. Blutproben wurden aus den Mäusen 2, 4, 5, 8 und 10 Wochen nach der ersten Injektion entnommen und die Antikörpertiter dem Blut wurden mittels Immunassay bestimmt. Vierzehn Wochen nach der ersten Injektion wurden die Mäuse mit einer letalen Dosis Tetanustoxoid konfrontiert.
Ergebnisse
Wie in 2 dargestellt, stiegen die Antikörpertiter von ungefähr 10, 4 Wochen nach der ersten Injektion, auf ungefähr 3000, 10 Wochen nach der ersten Injektion, an. Die gepunktete Linie zeigt Titer an, die durch zwei Tetanustoxoid-Antitoxin-Schutz-Einheiten vermittelt werden. Titer oberhalb der gepunkteten Linie zeigen gemäß FDA-Standards eine positive Immunantwort an. Wie in 2 dargestellt, wiesen die Mäuse bereits vier Wochen nach der Injektion der Tetanustoxoid-Mikropartikel eine positive Immunantwort auf. Der Anstieg im Antikörpertiter von der vierten zur zehnten Woche zeigt an, daß die Mikropartikel für eine langsame Abgabe des Tetanustoxoid-Antigens sorgen.
100% der Mäuse überlebten nach der Provokation mit der in der vierzehnten Woche verabreichten letalen Tetanustoxoid-Dosis. Es trat keine sichtbare Entzündung oder Vernarbung am Injektionsrot und kein wesentlicher Gewichtsverlust nach der Inokulation auf. Die Tetanustoxoid-Mikropartikel waren daher grundsätzlich bei subkutaner Verabreichung nicht toxisch.
Dieser Versuch stellt In-vivo-Daten bereit, die zeigen, daß die Verabreichung von Tetanustoxoid Mikropartikeln, hergestellt nach dem oben beschriebenen Verfahren, eine langsame Abgabe von Tetanustoxoid-Antigen bereitstellt, eine positive Immunantwort verursacht und gegen letale Provokationen durch Tetanustoxoid ohne nachteilige Wirkungen schützt.
Beispiel 16: Herstellung von Albumin-Mikropartikel unter Verwendung linearer Polymere und Hitze
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um Albumin- Mikropartikel durch Inkubieren von Albumin mit einer Polymermischung aus PVP und PEG bei verschiedenen Temperaturen herzustellen.
Versuchdurchführung
1 ml einer Rinderserumalbumin-FITC-Lösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) plus 10 μl dialysiertes Fluoreszein-Isothiocyanat(FITC)-Albumin, wurden in jeweils vier Reaktionsröhrchen gegeben. 2,0 ml der Polymermischung, enthaltend 8,0% PVP und 20% PEG in 0,1 M Natriumactetat, pH 5,0, wurden zu jedem Röhrchen unter Verwirbeln hinzugegeben.
Reaktion 1 wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gemischt. Reaktion 2 wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gemischt, dann für 30 Minuten bei 58°C in einem Wasserbad inkubiert. Reaktion 3 wurde sofort für 30 Minuten in einem Wasserbad von 58°C plaziert. Reaktion 4 wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gemischt, dann für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37°C inkubiert, dann für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 58°C in inkubiert.
2,0 ml 10% Ethanol wurden zu jeder Reaktionsmischung hinzugegeben und kurz gemischt. Für 30 Minuten bei 3000 UPM und 20°C zentrifugiert. Überstände vorsichtig abgesaugt. Niederschläge im 2,0 ml Ethanol resuspendiert. Reaktionsmischung 1 war klar, während 2, 3 und 4 trüb waren. In 2,0 ml entionisiertem Wasser zentrifugiert und resuspendiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Ergebnisse
In Reaktionsmischung 1 wurden keine Mikropartikel gefunden. Reaktionsmischung 2 enthielt nicht-aggregierte Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen ungefähr 1 und 10 μm. Reaktionsmischung 3 enthielt nicht-aggregierte Mikropartikel mit einem Durchmesser von ungefähr 10 μm, mit vielen Mikropartikeln, die einen Durchmesser von weniger als 1 μm aufwiesen. Reaktionsmischung 4 enthielt nicht-aggregierte Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen ungefähr 10 und vom 20 μm, mit einigen Mikropartikeln, die einen Durchmesser von weniger als 1 μm aufwiesen.
Versuchsdurchführung
1 ml einer Rinderserumalbumin-FITC-Lösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) plus 10 μl dialysiertes Fluoreszein-Isothiocyanat(FITC)-Albumin, wurden in jedes von zwei Reihen aus sechs Reaktionsröhrchen gegeben. 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml oder 5,0 ml einer Polymermischung, enthaltend 8,0% PVP (MG 90000) und 20% PEG (MG 8350), pH 5,0, wurden zu jedem Röhrchen der Serie A unter Verwirbeln hinzugegeben. 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml oder 5,0 ml einer Polymermischung, enthaltend 20% PVP (MG 40000) und 20% PEG (MG 3350), pH 5,0, wurden zu jedem Röhrchen der Serie B unter Verwirbeln hinzugegeben.
Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wurden die Röhrchen für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 37–40°C gestellt, dann wurden die Röhrchen für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 56–60°C transferiert. 2 ml 10% Ethanol wurden zugegeben und bei 3000 UPM für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände wurden abgesaugt und die Mikropartikel in 2,0 ml 10% Ethanol resuspendiert. Erneut für 15 Minuten zentrifugiert, in 2,0 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Ergebnisse
Serie A (8,0% PVP/20% PEG)
Die unter Verwendung von 0,5 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren überwiegend einheitlich, mit einem Durchmesserbereich zwischen 1 und 3 μm. Kleine Haufen wurden beobachtet. Wenige große Mikropartikel mit einem Durchmesser von ungefähr 25 μm wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren weniger einheitlich als die unter Verwendung von 0,5 ml hergestellten, und wiesen einen Durchmesserbereich zwischen weniger als 1 und 10 μm auf. weniger Haufen als oben wurden beobachtet. Keine großen Mikropartikel wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 2,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren weniger einheitlich als die, die unter Verwendung von 0,5 ml gebildet wurden, und wiesen einen Durchmesserbereich zwischen weniger als 1 und 15 μm auf. Sehr wenige Haufen wurden beobachtet. Keine großen Mikropartikel von festgestellt.
Die unter Verwendung von 3,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren weniger einheitlich als die, die unter Verwendung von 0,5 ml gebildet wurden, und wiesen einen Durchmesserbereich zwischen weniger als 1 μ und 20 μm auf. Sehr wenige Haufen wurden beobachtet. Keine großen Mikropartikel wurden festgestellt.
Die unter Verwendung von 4,0 ml der Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren weniger einheitlich als die, die unter Verwendung von 0,5 ml gebildet wurden, und wiesen einen Durchmesserbereich zwischen weniger als 1 und 25 μm auf. Keine Haufen oder großen Mikropartikel wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 5,0 ml der Polymermischung gebildeten Mikropartikel waren weniger einheitlich als die, die unter Verwendung von 0,5 ml gebildet wurden, und wiesen einen Durchmesserbereich zwischen weniger als 1 und 30 μm auf. Keine Haufen oder große Mikropartikel wurden beobachtet.
Serie B (20% PVP/20% PEG)
Die unter Verwendung von 0,5 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form kleiner Aggregate auf, enthaltend zwischen 10 und 20 Mikropartikel auf, die jeweils einen Durchmesser von weniger als 1 μm aufwiesen. Einige große Mikropartikel mit einem Durchmesser von ungefähr zwischen 25 μm wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von kleinen Aggregaten auf, die zwischen 10 und 20 Mikropartikel enthielten, die jeweils einen Durchmesser von weniger als 1 μm aufwiesen. Große Mikropartikel mit einem Durchmesser von ungefähr zwischen 5 und 50 μm wurden häufig beobachtet.
Die unter Verwendung von 2,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von großen Aggregaten auf, die Mikropartikel mit einem Durchmesser im Submikrometer-Bereich enthielten. Einige Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 10 μm wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 3,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von großen und kleinen Aggregaten auf. Gelegentlich wurden einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von ungefähr 5 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 4,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von kleinen Aggregaten auf, die 10–20 Mikropartikel enthielten, die jeweils einen Durchmesser aufwiesen, der kleiner war als die, die bei Verwendung der 0,5-ml-Polymermischung beobachtet wurden. Einzelne Mikropartikel wurden nicht beobachtet.
Die unter Verwendung von 5,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von kleinen und großen Aggregaten auf, die sehr kleine Mikropartikel enthielten. Einzelne Mikropartikel wurden nicht beobachtet.
Versuchdurchführung
1,0 ml einer Rinderserumalbumin-FITC-Lösung wurde in jedes von sieben Reaktionsröhrchen gegeben. 0,5 ml, 0,75 ml, 1,0 ml, 1,25 ml, 1,5 ml, 1,75 ml oder 2,0 ml einer Polymermischung, enthaltend 20% PVP (MG 40000) und 20% PEG (MG 3350) in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0, wurden zu jedem Röhrchen unter Verwirbeln hinzugegeben.
Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wurden die Röhrchen für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 37 bis 40°C gestellt, dann wurden die Röhrchen für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 56 bis 60°C transferiert. 2 ml 10% Ethanol wurden zugegeben und bei 3000 UPM für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände wurden abgesaugt und die Mikropartikel in 2,0 ml 10% Ethanol resuspendiert. Erneut für 15 Minuten zentrifugiert, in 2,0 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Ergebnisse
Die unter Verwendung von 0,5 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von kleinen Aggregaten aus winzigen Mikropartikeln von weniger als 1 μm im Durchmesser auf, mit ungefähr zwischen 10 und 20 je Aggregat. Gelegentlich wurden größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 10 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 0,75 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel wiesen die Form von kleinen Aggregaten mit ungefähr zwischen 1 und 10 Mikropartikeln je Aggregat auf. Gelegentlich wurden größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 und 10 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel bildeten große haftende Aggregate während der Inkubation bei 37 bis 40°C. Die Aggregate enthielten ungefähr zwischen 1 und 5 Mikropartikel pro Aggre gat. Gelegentlich wurden größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 5 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,25 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel bildeten Aggregate während der Inkubation bei 56 bis 60°C. Die Aggregate enthielten ungefähr zwischen 1 und 5 Mikropartikel pro Aggregat. Gelegentlich wurden größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 10 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,5 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel bildeten Aggregate während der Inkubation bei 56 bis 60°C. Die Aggregate enthielten ungefähr zwischen 1 und 5 Mikropartikel pro Aggregat. Etliche größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 10 μm beobachtet.
Die unter Verwendung von 1,75 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel bildeten während der Inkubation bei 56 bis 60°C. Aufgrund ihrer geringen Größe war es schwierig, festzustellen, ob die Mikropartikel als Aggregate vorlagen. Etliche größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser zwischen 1 und 10 μm wurden beobachtet.
Die unter Verwendung von 2,0 ml Polymermischung gebildeten Mikropartikel bildeten große Aggregate von 10 bis 100 Mikropartikeln pro Aggregat. Einige einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von 1 μm wurden beobachtet.
Dieses Experiment zeigt, daß Albumin-Mikropartikel durch Inkubieren von Albumin und einer PVP/PEG-Mischung bei einer Temperatur zwischen 37°C und 60°C für ungefähr 30 Minuten hergestellt werden konnten. Die Größe der Mikropartikel und das Ausmaß der Aggregatbildung konnte durch Än dern der Zusammensetzung oder des Volumens der zu dem Albumin zugefügten PVP/PEG-Polymermischung geändert werden.

Claims

Mikropartikel-Zusammensetzung umfassend Makromoleküle in Nebeneinanderstellung mit einem Dehydratisierungsmittel, wobei das Dehydratisierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus löslichen linearen oder verzweigten Polymeren besteht, und wobei die Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubieren des Makromoleküls mit dem Dehydratisierungsmittel bei einer Temperatur über der Raumtemperatur oder in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung von Mikropartikeln erhältlich ist.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Makromolekül aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel, pharmazeu tischen Arzneimittel und Mischungen derselben besteht.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Protein aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Immunglobulin, Antigen und Zellrezeptor besteht.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, die des weiteren ein therapeutisches Molekül umfaßt.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das therapeutische Molekül aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus chemotherapeutischen Mitteln, antiviralen Mitteln, antibakteriell wirkenden Mitteln, Antiparasitika, Immunsuppressiva, Zytokinen, Hormonen, Enzymen und Mischungen derselben besteht.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, die des weiteren eine magnetische Substanz umfaßt.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Makromolekül mit feststellbarer Markierung markiert ist.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die feststellbare Markierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Fluorochrom, Chemilumineszenz-Label, magnetischen Partikeln, einem Enzym, Enzymsubstrat und einer radioaktiven Markierung besteht.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Mikropartikel in vitro und in vivo beständig ist.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dehydratisierungsmittel ein lösliches lineares Polymer ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Dextran, Nonylphenolethoxylaten, Polyvinylalkohol und Mischungen und Derivate derselben besteht.
Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Makromoleküle mit einer Verbindung vernetzt sind, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Dialdehyden, Aminen, mehrwertigen Ionen, multifunktionellen Molekülen mit einer Affinität für spezifische reaktive Gruppen an dem zu vernetzenden Makromolekül, N-substituierten Maleimiden, bifunktionellen Alkylhalogeniden, Arylhalogeniden, Isocyanaten, aliphatischen oder aromatischen Dicarbonsäuren, aliphatischen oder aromatischen Disulfonsäuren, bifunktionellen Imidoestern, Carbodiimiden und Vinylsulfonen besteht, die in die Inkubationsmischungen eingearbeitet wird.
Verfahren zur Herstellung einer Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, die die folgenden Schritte umfaßt: (a) das Inkubieren eines Makromoleküls mit einem Dehydratisierungsmittel bei einer Temperatur oberhalb der Raumtemperatur oder in Gegenwart eines Vernetzungsmittels für eine ausreichende Zeitspanne für die Bildung von Mikropartikeln, wobei das Dehydratisierungsmittel unter löslichen linearen und verzweigten Polymeren ausgewählt wird und (b) Trennen der Partikel von der Inkubierungsmischung.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Inkubierungstemperatur über oder bei 37°C und unter oder bei 80°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Inkubierungsmischung 5 Minuten bis 24 Stunden lang inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Inkubierungstemperatur unter oder bei der Raumtemperatur liegt, wenn ein Vernetzungsmittel vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, die des weiteren den Schritt des Waschens der Partikel mit einem Puffer umfaßt, der ein Quenching-Mittel enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Inkubierungsschritt bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Dehydratisierungsmittel ein lösliches lineares Polymer ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Dextran, Nonylphenolethoxylaten, Polyvinylalkohol und Mischungen und Derivaten derselben besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Vernetzungsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Dialdehyden, Aminen, mehrwertigen Ionen, multifunktionellen Molekülen mit einer Affinität für spezifische reaktive Gruppen an dem zu vernetzenden Makromolekül, N-substituierten Maleimiden, bifunktionellen Alkylhalogeniden, Arylhalogeniden, Isocyanaten, aliphatischen oder aromatischen Dicarbonsäuren, aliphatischen oder aromatischen Disulfonsäuren, bifunktionellen Imidoestern, Carbodiimiden und Vinylsulfonen besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Makromolekül aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel, pharmazeutischen Arzneimittel und Mischungen derselben besteht.
Verfahren zum Isolieren eines Zielmoleküls aus einer das Molekül enthaltenden komplexen Mischung, die die folgenden Schritte umfaßt: (a) Mischen der komplexen Mischung mit einer makromolekularen Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit einer Affinität für das Zielmolekül, für eine ausreichende Zeitspanne, um es dem Zielmolekül zu erlauben, sich an das Makromolekül zu binden, wobei die Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubieren des Makromoleküls mit einem Dehydratisierungsmittel bei einer Temperatur über der Raumtemperatur oder in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung von Mikropartikeln erhältlich ist, wobei das Dehydratisierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus löslichen linearen und verzweigten Polymeren besteht, und wobei das Makromolekül ein für das Zielmolekül spezifisches Affinitätsmolekül umfaßt und (b) Trennen des gebundenen Zielmoleküls von der komplexen Mischung.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Mikropartikel immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Zielmolekül aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Protein, Kohlenhydrat, Nucleinsäuremolekül, Virus und Zellen besteht.
Verfahren für das Erfassen eines Zielbiomoleküls in einer Probe, die Folgendes umfaßt: (a) Kombinieren einer Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit der Probe, wobei die Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubieren des Makromoleküls mit einem Dehydratisierungsmittel bei einer Temperatur über der Raumtemperatur oder in Anwesenheit eines Vernetzungsmittel für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung von Mikropartikeln erhältlich ist, wobei das Dehydratisierungsmittel unter löslichen linearen und verzweigten Polymeren ausgewählt wird und wobei das Makromolekül ein für das Zielbiomolekül spezifisches Affinitätsmolekül umfaßt, das mit einem erfaßbaren Bildgebungsmittel markiert ist und (b) Erfassen des erfaßbaren Bildgebungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das erfaßbare Bildgebungsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Fluorochrom, Chemilumineszenz-Label, magnetischen Partikeln, einem Enzym, Enzymsubstrat und einer radioaktiven Markierung besteht.